TW202305006A

TW202305006A - 與ｃｄ４７及ｐｄ—ｌ１特異性結合的雙特異性抗體

Info

Publication number: TW202305006A
Application number: TW111117203A
Authority: TW
Inventors: 金成鎬; 金正國; 朴智顯; 崔智叡; 田雅羅; 朴智恩; 崔至慧; 申熙旭; 宋善光; 柳賢碩; 金興泰
Original assignee: 南韓商益免安協公司
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2023-02-01
Also published as: JP2024518411A; IL308395A; KR20220152172A; CA3219221A1; AU2022270543A1; EP4335872A1; BR112023023270A2; WO2022235127A1; CN117279948A

Abstract

本發明涉及雙特異性抗體。本發明的雙特異性抗體具有很高的與表現PD-L1和/或CD47的腫瘤細胞的結合力，發揮優秀的抗腫瘤效果並顯出最小化的血凝副作用。

Description

與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體

本發明涉及雙特異性抗體。具體地，本發明涉及與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體、其用途及製備方法。

體內的免疫功能通過抗原識別及與之同時發生的共刺激(co-stimulatory)和共抑制(co-inhibitory)的信號來調節。但是，癌細胞通過改變腫瘤微環境或抑制免疫功能來回避免疫攻擊。這樣的回避戰略之一就是通過改變免疫檢查點功能來抑制免疫細胞的功能。例如，癌細胞通過表現PD-L1或CD47之類的特定細胞表面蛋白使它們與T細胞或巨噬細胞之類的免疫細胞結合來抑制免疫細胞的功能。

隨著上述機制的發現，通過阻斷上述特定細胞表面蛋白之類的免疫檢查點蛋白的活性來活化免疫細胞以攻擊癌細胞的免疫檢查點抑制劑的開發正活躍地進行著，作為PD-L1抑制劑的阿特珠單抗(Atezolizumab)、杜法魯單抗(Durvalumab)、阿維魯單抗(Avelumab)等多種抗-PD-L1單株抗體獲得美國食品藥品安全局(FDA)的認證在市面上出售或已進入臨床階段。並且，多種抗-CD47單株抗體也正在研究或已進入臨床階段。

然而，免疫檢查點抑制劑具有患者反應率不充分或者具有副作用或低生物體利用率的問題，因此仍需要開發新型的免疫檢查點抑制劑。

發明所欲解決之問題

本發明的目的在於解決上述所有問題。

本發明的一目的在於，提供與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體。

本發明的再一目的在於，提供與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體的用於預防或治療癌症的用途。

本發明的還有一目的在於，提供與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體的用來製備用於預防或治療癌症的藥劑的用途。

本發明的另一目的在於，提供包含與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體的藥物組合物。

本發明的又一目的在於，提供預防或治療癌症的方法，包括向對象給藥與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體的步驟。

本發明的又一目的在於，提供用於製備與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體的多核苷酸、表現載體、宿主細胞或方法。

本發明的目的不限於上述提及的目的。本發明的目的將通過下述說明得以進一步明確，並通過發明要求保護範圍記載的手段及其組合來實現。解決問題之技術手段

用來實現上述目的的本發明的代表性結構如下。

根據本發明的一實施方式，提供一種包含與CD47特異性結合的第一抗原結合結構域及與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，上述第一抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，上述重鏈可變區包含：包含序列17的胺基酸序列的CDR1；包含序列19的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列21的胺基酸序列的CDR3，上述輕鏈可變區包含：包含序列23的胺基酸序列的CDR1；包含序列25的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列27的胺基酸序列的CDR3，上述第二抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，上述重鏈可變區包含：包含序列29的胺基酸序列的CDR1；包含序列31的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列33的胺基酸序列的CDR3，上述輕鏈可變區包含：包含序列35的胺基酸序列的CDR1；包含序列37的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列39的胺基酸序列的CDR3。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含：包含序列1的重鏈可變區及序列3的輕鏈可變區的第一抗原結合結構域；以及包含序列5的重鏈可變區及序列7的輕鏈可變區的第二抗原結合結構域。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含：Fc區域、包含與CD47特異性結合的抗原結合結構域的第一抗體片段(例如Fab片段)；以及包含與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的第二抗體片段(例如scFv片段)。

根據特定實施方式，在雙特異性抗體中，第二抗體片段(例如scFv片段)通過肽連接子融合於Fc區域的C-末端。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含：Fc區域、包含與CD47特異性結合的抗原結合結構域的兩個Fab片段；以及包含與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的兩個scFv片段。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含含有與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的單鏈可變片段(scFv)。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含含有與CD47特異性結合的抗原結合結構域的Fab片段。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含源自IgG1的重鏈恆定區(CH)的Fc區域。

根據特定實施方式，雙特異性抗體的Fc區域包含源自IgG1的重鏈恆定區CH1、CH2及CH3，CH3以序列11為基準包含E239D及M241L的胺基酸取代。上述Fc區域通過作用於效應細胞(effector cell)來顯出免疫活化效果，尤其可以顯出增加的免疫活化效果。

根據特定實施方式，雙特異性抗體包含含有與上述PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的抗體片段，上述抗體片段通過肽連接子與上述Fc區域的C-末端融合。

根據特定實施方式，雙特異性抗體的單鏈可變片段(scFV)包含序列9的胺基酸序列。

根據特定實施方式，雙特異性抗體的Fc區域包含序列11的胺基酸序列。

根據特定實施方式，雙特異性抗體與表現PD-L1、CD47或者兩者都表現的癌細胞特異性結合。

根據本發明的再一實施方式，提供將本發明的雙特異性抗體用於預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌的用途。

根據本發明的還有一實施方式，提供包含本發明的雙特異性抗體的用於預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤、T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌的藥物組合物。

根據本發明的另一實施方式，本發明的雙特異性抗體可以與化學療法、放射線療法和/或其他免疫療法並用。

根據本發明的又一實施方式，提供預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌的方法，包括向需要預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌的對象給藥有效量的本發明的雙特異性抗體的步驟。

根據本發明的又一實施方式，提供在對象中抑制腫瘤細胞生長的方法，包括向對象給藥有效量的本發明的雙特異性抗體的步驟。

根據本發明的又一實施方式，提供編碼本發明的雙特異性抗體的多核苷酸。

根據本發明的又一實施方式，提供包含編碼本發明的雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞。

根據本發明的又一實施方式，提供製備本發明的雙特異性抗體的方法，包括：在適於上述雙特異性抗體表現的條件下培養包含編碼雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞的步驟；以及從培養物中回收雙特異性抗體的步驟。對照先前技術之功效

根據本發明，與CD47和/或PD-L1特異性結合的雙特異性抗體可以有效用於預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤、T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌。具體地，與抗-CD47抗體和/或抗-PD-L1抗體相比，本發明的雙特異性抗體具有優秀的抗原結合能力，尤其在對CD47抗原具有異常突出的結合能力的同時保持對紅細胞(RBC)的低結合能力。因此，確認本發明的雙特異性抗體通過對表現CD47和/或PD-L1的腫瘤細胞具有高結合力來發揮優異的抗腫瘤效果，並且因與紅細胞的低結合能力而表現出最小化的血凝副作用。並且，本發明的雙特異性抗體通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC，Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity)活性評估在表現PD-L1和/或CD47的細胞中顯出癌症抑制效果和自然殺傷(NK)細胞及T細胞的活化效果。進而，本發明的雙特異性抗體在利用缺失後天免疫細胞的BALB/c裸小鼠乳癌細胞株Xenograft模型與利用BALB/c-hPD-1/hSIRPα小鼠的大腸癌CT26-hPD-L1/hCD47細胞株Syngenic模型中證明具有癌細胞生長抑制效果，並且證明具有抑制因記憶T細胞的生成而引起的腫瘤復發的效果。因此，本發明的雙特異性抗體可以通過癌細胞生長抑制效果和免疫細胞活化效果來有效用於預防、改善或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤、T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌。

後述本發明的詳細說明將參照特定附圖來記述能夠實施本發明的特定實例，但本發明不限定於這些實例，恰當地說，本發明應由與請求項主張的內容同等的所有範圍通過隨附的請求項來限定。除非另有定義，否則本說明書使用的技術及學術術語具有本發明所屬技術領域中通常使用的含義。出於解釋本說明書的目的採用下述定義，在適當情況下，以單數使用的術語包括複數形式，反之亦可。定義

本說明書中使用術語“抗原結合分子”使之與抗原決定因子特異性結合的分子。抗原結合分子的例包括抗體、抗體片段及抗原結合支架蛋白，但不限定於此。

術語“抗體”已非常廣泛的含義來使用，包括多種抗體結構物，例如單株抗體、多株抗體、單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、具有抗原結合活性的抗體片段及抗體融合體(例如抗體與(多)肽的融合體或抗體與化合物的融合體)，但不限定於此。在本說明書中，詞頭“抗-”在與抗原相關的情況下，表示該抗體與該抗原具有反應性。與特定抗原具有反應性的抗體可以在噬菌體或類似的載體中通過重組抗體文庫的篩選之類的合成和/或重組方法，或者通過使用抗原或抗原-編碼核酸的動物的免疫化來生成，但不限定於此。代表性的IgG抗體是由通過二硫鍵結合的兩個相同的重鏈及兩個相同的輕鏈構成的。各個重鏈及輕鏈包含恆定區及可變區。重鏈可變區(HVR)及輕鏈可變區(LVR)分別包含稱為“互補決定區(CDR)”或“超變區”的三個片段，這些主要有關於與抗原表位的結合。這些從N-末端依次標上數字稱為CDR1、CDR2及CDR3。在CDR外部的可變區中，保存得更為完好的區域稱為“骨架區(FR)”。在本說明書中，抗體可以為例如動物抗體、嵌合體抗體、人類化抗體或人類抗體。

術語“單株抗體”是指從實質上同種的抗體集團中獲得的抗體。即，上述集團所包含的個體抗體，除微量存在的可能的變異抗體(例如，在製備單株抗體時出現的具有天然發生的突變的抗體)以外，彼此相同或相同的表位結合。與典型的包含對不同的決定因子(表位)誘導的不同的抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑的各單株抗體只對抗原上的單個決定因子誘導。

術語“單特異性”抗體是指各結合部位具有與相同的抗原的相同表位結合一個以上的結合部位的抗體。術語“雙特異性”是指抗原結合分子能夠與兩個以上的不同抗原決定因子特異性結合。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合部位，它們分別對不同的抗原決定因子具有特異性。在一部分實例中，雙特異性抗原結合分子可以同時與兩個抗原決定因子，例如同時與兩個不同細胞上表現的兩個抗原決定因子結合。並且，本申請中記載的雙特異性抗原結合分子可以形成多特異性抗體的一部分。

術語“抗體片段”是指具有對抗原的特異性結合能力的抗體的一部分或包含其的多肽。抗體片段的包括例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙體、三體、四體、交叉-Fab片段、線型抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)、由抗體片段與單結構域抗體形成的多特異性抗體，但不限定於此。

術語“單鏈可變片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重鏈(VH)及輕鏈(VL)的可變區通過共價鍵合形成VH-VL異二聚體的融合蛋白。上述重鏈(VH)與輕鏈(VL)直接連接，或者通過連接重鏈的N-末端與輕鏈的C-末端或連接重鏈的C-末端與輕鏈的N-末端的肽連接子來連接。

術語“抗原結合結構域”是指與抗原決定因子特異性結合的抗原結合分子的部分。抗原結合結構域可以通過例如一個以上的可變區來提供。優選地，抗原結合結構域可以包含抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區。

術語“Fc區域”表示免疫球蛋白的重鏈的C-末端區域，是指各鏈中由鉸鏈區的一部分、CH2及CH3結構域形成的同型二聚體。Fc區域表示通過使用木瓜蛋白酶的消化來生產的無損抗體(例如IgG的一部分)。在一實例中，“Fc區域”可以為天然序列Fc區域或變異體Fc區域。“天然序列Fc區域”表示與通常在自然中發現的Fc區域的胺基酸序列相同的胺基酸序列。在本發明中，Fc區域只要具有與天然型實質上相同的效果或提高的效果，可以為只排除免疫球蛋白的重鏈與輕鏈可變區而包含一部分或全部重鏈恆定區1(CH1)和/或輕鏈恆定區1(CL1)的擴張的Fc區域。並且，也可以為排除相當於CH2和/或CH3的相當長的一部分胺基酸序列的區域。例如，在本發明中，Fc區域可以為1)CH1、CH2及CH3；2)CH1及CH2；3)CH1及CH3；4)CH2及CH3；5)CH1至CH3中一個或兩個或更多個的結構域與免疫球蛋白鉸鏈區(鉸鏈區的一部分)的組合；或者6)重鏈恆定區的各結構域與輕鏈恆定區的二聚體。並且，在本發明中，Fc區域不僅包括天然型胺基酸序列，還包括該序列的變異體。胺基酸序列變異體是指天然胺基酸序列中的一個以上的胺基酸殘基通過缺失、插入、非保守或保守性取代或者它們的組合來具有不同的序列的含義。

術語“CD47”已知為存在於癌細胞表面的蛋白質，是指已知為通過與巨噬細胞的SIRPα結合發出“不要吃我(Do-not-eat-me)”信號來阻斷巨噬細胞的吞噬作用的蛋白質。

術語“PD-L1”已知為存在於癌細胞表面的蛋白質，是指通過與T細胞表面的蛋白質PD-1結合來使T細胞無法攻擊癌細胞的蛋白質。

術語“連接子”可以指具有1個至100個，具體地，具有2個至50個，更具體地，具有5個至30個胺基酸長度的肽連接子。上述連接子可以包含例如選自由Gly、Asn、Ser、Thr、Ala、Asp等組成的組中的一種以上的胺基酸，但不限定於此。作為一例，上述連接子可以由(GGGGS)n來表示，上述n為(GGGGS)單元的重複次數，考慮到雙特異性抗體的功效，n可以為1至10，具體地，可以為1至5。再舉一例，上述連接子可以為已知能夠連接抗體片段結構域的肽片段，例如，可以具有GGGGSGGGGSGGGGS的胺基酸序列。

術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”可以相互替換來使用，包括去氧核糖核酸(DNA)分子(例如，互補去氧核糖核酸(cDNA)或基因組去氧核糖核酸)、核糖核酸(RNA)分子(例如信使核糖核酸(mRNA))、利用核酸類似物生成的去氧核糖核酸或核糖核酸類似物(例如，肽核酸及非自然生成的核酸類似物)以及它們的雜交物。核酸分子可以為單鏈或雙鏈。在一實例中，本發明的核酸分子包括編碼抗體或其片段、衍生物、突變體或變異體的連續開放讀取框架。

術語“對象”可以與“患者”交換來使用，可以為需要預防或治療癌症的哺乳動物，例如靈長類(例如人類)、寵物(例如狗、貓)、家畜(例如牛、豬、馬、羊、山羊等)及實驗動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。本發明的在一實例中，對象為人類。

術語“治療”通常是指獲得所預期的藥理學效果和/或生理學效果。上述效果在部分或完全治癒疾病和/或由上述疾病引起的副作用方面具有治療效果。優選的治療效果包括疾病發生或再發的防止、症狀的好轉、疾病的任意直接或間接的病理學結果的縮小、轉移的防止、疾病進展速度的減小、疾病狀態的好轉或緩解以及好轉或改善的預後，但不限定於此。優選地，“治療”可以指對已经存在的疾病或障礙的治療性介入。

術語“預防”是指獲得預防性治療，即，比起治療疾病，更傾向於預防的效果。從部分或完全預防疾病或其症狀的方面來說，“預防”是指獲得所預期的預防性的藥理學效果和/或生理學效果。

術語“給藥”是指向對象提供達到預防或治療目的的物質(例如本發明的雙特異性抗體)。本發明的雙特異性抗體

本發明提供包含與CD47特異性結合第一抗原結合結構域及與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域的新型雙特異性抗體。上述抗體可以與表現CD47、PD-L1或者二者都表現的癌細胞特異性結合，具有結合親和度、生物學活性、免疫細胞活化、靶化功效、抑制腫瘤復發的能力及減少的副作用之類的特別有利的特徵。

根據本發明的一實施方式，提供一種包含與CD47特異性結合第一抗原結合結構域及與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，上述第一抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，上述重鏈可變區包含：包含序列17的胺基酸序列的CDR1；包含序列19的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列21的胺基酸序列的CDR3，上述輕鏈可變區包含：包含序列23的胺基酸序列的CDR1；包含序列25的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列27的胺基酸序列的CDR3，上述第二抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，上述重鏈可變區包含：包含序列29的胺基酸序列的CDR1；包含序列31的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列33的胺基酸序列的CDR3，上述輕鏈可變區包含：包含序列35的胺基酸序列的CDR1；包含序列37的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列39的胺基酸序列的CDR3。

在一部分實例中，與CD47特異性結合的第一抗原結合結構域可以包含序列1的重鏈可變區及序列3的輕鏈可變區，和/或與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域可以包含序列5的重鏈可變區及序列7的輕鏈可變區。尤其，與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域可以包含序列9的單鏈可變片段(scFv)。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體可以包含：Fc區域；包含與上述CD47特異性結合的抗原結合結構域的第一抗體片段；以及包含與上述PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的第二抗體片段。

在一部分實例中，上述第一抗體片段可以為Fab片段。

在一部分實例中，上述第二抗體片段可以為單鏈可變片段(scFv)。

在一部分實例中，上述Fc區域可以通過作用於效應細胞(effector cell)來顯出免疫活化效果。優選地，上述Fc區域可以源自IgG1的重鏈恆定區(CH)。更優選地，上述Fc區域可以包含源自IgG1的重鏈恆定區CH1、CH2及CH3或者源自IgG1的重鏈恆定區CH2及CH3。最優選地，上述Fc區域的CH3能夠以序列11為基準包含E239D及M241L的胺基酸取代。

在一部分實例中，上述Fc區域可以包含序列11的胺基酸序列。

在一部分實例中，上述第二抗體片段可以融合於上述Fc區域的C-末端。更具體地，上述第二抗體片段可以通過重鏈可變區(即，第二抗體片段的N-末端)融合於Fc區域的C-末端(參照圖1)。在此情況下，第二抗體片段可以通過連接子融合於Fc區域的C-末端。上述連接子可以為肽連接子，可以具有例如GGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GSGSGSGSGSGSGSGSGS的胺基酸序列。

在一部分實例中，上述第二抗體片段的上述第二結構域可以包含重鏈可變區與輕鏈可變區通過連接子連接的可變區(例如，單鏈可變片段scFv)。作為一例，上述連接子可以為由(GGGGS)n表示的肽連接子，上述n為(GGGGS)單元重複的次數，考慮到雙特異性抗體的功效，n可以為1至10，具體地，可以為1至5。優選地，上述第二抗體片段可以為scFv片段。更優選地，上述scFv片段可以包含序列9的胺基酸序列。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體可以包含：Fc區域、包含與CD47特異性結合的抗原結合結構域的兩個Fab片段；以及包含與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的兩個scFv片段。在此情況下，各scFv片段的重鏈可變結構域可以通過肽連接子融合於(連接於各Fab片段的重鏈的)Fc區域的C-末端。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體包含與CD47特異性結合且含有兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈的全長抗體以及含有與PD-L1特異性結合的重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體片段(例如scFv片段)，上述抗體片段的重鏈可變區可以直接或通過肽連接子融合于上述全長抗體的重鏈的C-末端。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體可以包含與上述CDR序列、重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列具有80%以上的序列同源性，優選地，具有90%以上的序列同源性，更優選地，具有95%以上的序列同源性，最優選地，具有98%以上的序列同源性的序列。

在特定實例中，可以考慮本發明雙特異性抗體的胺基酸序列變異體。例如，能夠以改善抗體的結合親和度和/或其他生物學特性為佳。抗體的胺基酸序列變異體可以通過向編碼分子的核苷酸序列內倒入適當的變形或者通過肽合成來製備。上述變形包括例如上述抗體的胺基酸序列的殘基的缺失和/或向上述胺基酸序列內插入殘基和/或在上述胺基酸序列內的殘基的取代。可以通過進行包括缺失、插入及取代在內的多種變更的任意組合來達成最終的結構物，但最終結構物應保有所希望的特性，例如抗原-結合特性。與用於取代突變誘發相關的部位包括重鏈可變區(HVR)及骨架區(FR)。保守性取代在表1的“優選取代”項下提供，以下，進一步記述關於胺基酸側鏈種類(1)至(6)的內容。可以將胺基酸取代引入所關心的分子及篩選的產物中以獲得所希望的活性，例如，根據保持/改善的抗原結合、減少的免疫原性，或者改善的ADCC或CDC。表1

原來的殘基	例示性的取代	優選取代
Ala(A)	Val;Leu; Ile	Val
Arg(R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn(N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp(D)	Glu; Asn	Glu
Cys(C)	Ser; Ala	Ser
Gln(Q)	Asn; Glu	Asn
Glu(E)	Asp; Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine	Leu
Leu(L)	Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met(M)	Leu; Phe; Ile	Ile
Phe(F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val; Ser	Ser
Trp(W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val(V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala;正亮胺酸(Norleucine)	Leu

胺基酸可以根據通常的側鏈性質進行如下分組：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)給鏈的方向帶來影響的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代可以伴之以上述種類中的一種被其他種類取代。

在本說明書中，術語“胺基酸序列變異體”包括母抗體結合分子(例如，人類化或人類抗體)的一個以上的超變區殘基存在胺基酸取代的實質上的變異體。通常，為追加研究而選擇生成的變異體與母抗原結合分子相比，具有特定的生物學特性的變形，例如改善(例如增加的親和度、減少的免疫原性)和/或實質上保持抗原結合分子的特定生物學特性。例示性的取代變異體為親和度成熟抗體，可以通過例如本發明所屬技術領域中公知的基於噬菌體展示的親和度成熟方法來方便地生成。簡單來說，一個以上的重鏈可變區殘基突變，變異體抗原結合分子在噬菌體上展示來篩選特定生物活性(例如結合親和度)。在特定實例中，取代、插入或缺失能夠以上述變更不實質上減少與抗原結合的抗原結合分子的能力的方式在一個以上的重鏈可變區內發生。例如，可以在重鏈可變區中實現不實質上減少結合親和度的保守性變更(例如本說明書中提供的保守性取代)。

胺基酸序列插入不僅包括向序列內插入單個或多個胺基酸殘基，還可以包括從包含一個殘基到一百個殘基以上的多肽範圍內的氨基-末端和/或羧基-末端融合。末端插入的例包括具有N-末端甲硫胺酸殘基的抗體。分子的其他插入變異體可以包括增加抗體的血清半衰期的與多肽的N-末端或C-末端的融合。並且，分子的其他插入變異體還可以包括用來易於通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的多肽的N-末端或C-末端的融合。核酸、載體、宿主細胞及製備方法

可以通過本發明所屬技術領域已知的任意抗體生成技術來製備本發明的雙特異性抗體。

根據本發明的再一實施方式，本發明提供編碼本發明中記述的雙特異性抗體或其片段的分離核酸(例如多核苷酸)。上述核酸可以編碼包含上述雙特異性抗體的重鏈可變區或重鏈CDR區域的胺基酸序列和/或包含輕鏈可變區或輕鏈CDR區域的胺基酸序列。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體可以通過編碼整個抗原結合分子的單個多核苷酸或共表現的多個多核苷酸來表現。通過多個多核苷酸編碼的多肽可以通過例如二硫鍵合或形成功能性抗原結合分子的其他手段來結合。例如，免疫球蛋白的輕鏈部分可以通過從免疫球蛋白的重鏈部分分離出來的多核苷酸來編碼。在共表現的情況下，上述重鏈多肽與用於形成免疫球蛋白的輕鏈多肽結合。

在一實例中，上述多核苷酸可以包含序列2的序列及序列4的序列。並且，上述多核苷酸序列可以包含序列12的序列。

在再一實例中，上述多核苷酸可以包含序列6的序列及序列8的序列。並且，上述多核苷酸序列可以包含序列10的序列。

在還有一實例中，上述多核苷酸可以為序列15的序列和/或序列16的序列或者包含上述序列。

在另一實例中，上述多核苷酸可以包含與編碼本發明的雙特異性抗體多核苷酸具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或約100%的同源性的核酸序列。

在又一實例中，上述多核苷酸可以編碼本發明雙特異性抗體所包含的多肽。

根據本發明的又一實施方式，本發明提供包含上述核酸的一個以上的載體(例如表現載體)。術語“載體”為可以用於將連接於核酸的另一核酸導入細胞的核酸。載體的一種類型為指稱能夠結紮追加核酸片段的線型或環型雙鏈去氧核糖核酸分子的“質粒”。另一類型的載體為病毒載體(例如不可複製的逆轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)，在此情況下，可以將追加的去氧核糖核酸片段導入病毒基因組。特定載體可以在它們導入的宿主細胞內自我複製(例如包含細菌複製起始點的細菌載體及附加體哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加體哺乳動物載體)在導入宿主細胞時與宿主細胞整合，與上述宿主的基因組一同複製。“表現載體”為能夠誘導選擇的多核苷酸的表現的載體的一種類型。

根據本發明的又一實施方式，本發明提供包含一種以上的編碼本發明的雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞。上述宿主細胞可以為原核或真核細胞。例如，上述宿主細胞中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞。在不需要糖化等的情況下，可以在細菌中製備抗體。

根據本發明的又一實施方式，本發明提供製備本發明雙特異性抗體的方法，包括：在適合表現本發明的雙特異性抗體的條件下培養上述宿主細胞的步驟；以及從培養物中回收雙特異性抗體的步驟。

為了雙特異性抗體的重組生產，例如，可以在分離上述編碼雙特異性抗體的多核苷酸後，插入一個以上的載體內來在宿主細胞內追加選殖和/或在宿主細胞內部表現。上述核酸可以通過本發明所屬技術領域中通常的過程進行分離或測序。

培養上述轉化的細胞的方法可以利用本發明所屬技術領域中廣為人知的方法來進行。例如，可以通過在培養基中培養上述轉化體來大量生產雙特異性抗體，可以根據宿主細胞來適當選擇常用的培養基和培養條件。培養時為了適合細胞的生育及蛋白質的大量生產，可以適當調節溫度、培養基的pH及培養時間等條件。

為了回收上述雙特異性抗體，為了免疫球蛋白的純化，可以使用本發明所屬技術領域中公知的任意方法，例如色譜法(離子交換、親和性(例如蛋白A(protein A))、尺寸排除等)、離心分離、梯度溶解度或者用於蛋白質純化的其他標準技術。預防或治療方法

根據本發明的又一實施方式，可以在預防或治療方法中使用本發明的雙特異性抗體。

在一部分實例中，治療的疾病為增殖性障礙，尤其可以使癌症。尤其，本發明的雙特異性抗體可以用於抑制癌症的增殖、存活、轉移及再發。

在一部分實例中，提供在對象中抑制腫瘤細胞生長的方法，包括向具有腫瘤細胞的對象給藥有效量的本發明的雙特異性抗體的步驟。在一部分實例中，提供用於預防或治療癌症的方法，包括向需要預防或治療癌症的對象給藥有效量的本發明的雙特異性抗體的步驟。

在一部分實例中，上述癌症可以為固體癌或血液癌。

在一部分實例中，上述癌症可以選自由卵巢癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、骨髓瘤、神經母細胞-誘導的中樞神經系統腫瘤、單核細胞白血病、B-細胞誘導的白血病、T-細胞誘導的白血病、B-細胞誘導的淋巴瘤、T-細胞誘導的淋巴瘤及肥大細胞誘導的腫瘤組成的組中，但不限定於此。優選地，上述癌症可以為選自由卵巢癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤組成的組中的任一種。

本發明的雙特異性抗體可以根據是否希望進行局部或全身治療以及治療的區域來以多種方式給藥。向對象給藥雙特異性抗體的方法可根據給要目的、發病部位、對象的狀態等的不同而不同。給藥途徑可以為胃腸外、吸入、外用或局部給藥(例如病變內給藥)。例如，胃腸外給藥可以包括靜脈內、皮下、腹腔內、肺內、動脈內、肌肉內、直腸、陰道內、關節內、前列腺內、鼻內、眼球內、膀胱內、脊髓腔內給藥或心室內給藥(例如腦室內給藥)，但不限定於此。並且，在並用的情況下，本發明的雙特異性抗體可以與追加免疫抗癌劑以相同的途徑或不同的途徑給藥。

在上述方法中，本發明雙特異性抗體的有效量可以根據個體(患者)的年齡、性別、體重的不同而不同，每kg體重給藥約0.01mg至100mg或5mg至約50mg，可以一天給藥一次至分為數次給藥。但有效量可以根據給藥途徑及期間、疾病的嚴重程度、性別、體重、年齡等進行增減，本發明的範圍不限定於此。

在一部分實例中，本發明的雙特異性抗體可以與抗癌化療劑、放射線治療和/或其他免疫抗癌劑(例如抗PD-1、抗CTLA-4抗體等)一同使用或聯合給藥。上述並用治療法包括聯合給藥(兩種以上的治療性製劑包含於同一或單獨組合物中的給藥)及單獨給藥，在這種情況下，雙特異性抗體的給藥可以在追加治療劑/治療法的給藥/使用之前、同時和/或依次進行。藥物組合物

根據本發明的又一實施方式，本發明提供包含本發明的雙特異性抗體的藥物組合物。組合物能夠以預防性或治療性有效量包含上述雙特異性抗體。

在一部分實例中，可以為抑制癌症的增殖、存活、轉移及再發而向對象給藥上述藥物組合物。因此，可以為預防或治療癌症而向對象給藥上述藥物組合物。在此情況下，上述藥物組合物可以與抗癌化療劑、放射線治療和/或其他免疫抗癌劑(例如抗PD-1、抗CTLA-4抗體等)一同使用或聯合給藥。上述並用治療法包括聯合給藥(兩種以上的治療性製劑包含於同一或單獨組合物中的給藥)及單獨給藥，在這種情況下，雙特異性抗體的給藥可以在追加治療劑/治療法的給藥/使用之前、同時和/或依次進行。

在一部分實例中，上述癌症可以為固體癌或血液癌。

為了製備本發明的藥物組合物，本發明的雙特異性抗體可以與製藥上可接受的載體和/或賦形劑混合。藥物組合物可以製備為冷凍乾燥製劑或水性溶液的形態。例如，可以參照文獻[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)]。

可接受的載體和/或賦形劑(包括穩定劑)應在所使用的劑量及濃度方面對對象無毒性，可以包括：緩衝液(例如磷酸、檸檬酸或其他有機酸)；抗氧化劑(例如抗壞血酸或甲硫胺酸)；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(約10以下的殘基)多肽；蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；胺基酸(例如離胺酸、穀胺醯胺、天冬胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸)；單糖類、二糖類及其他碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；糖(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；鹽形成反離子(例如鈉)；金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物)；以及(或者)非離子類表面活性劑(例如TWEEN(注冊商標)、PLURONICS(注冊商標)或聚乙二醇(PEG))，但不限定於此。

本發明的藥物組合物可以根據給藥途徑配製為本發明所屬技術領域公知的適當形態。

在本說明書中，術語“預防性或治療性有效量”或“有效量”為預防和治療對象的癌症時有效的組合物的有效成分的量，是指醫學處置上可能起作用的以合理的收益/危險比例預防或治療癌症的充分且不引起副作用的量。上述有效量的水準可以根據包括患者的健康狀態、疾病的種類、疾病的嚴重程度、藥物的活性、對藥物的敏感度、給藥方法、給藥時間、給藥途徑及代謝比例、治療期間、配合或同時使用的藥物在內的因素及其他醫學領域中熟知的因素來決定。在此情況下，在考慮上述所有因素後能夠以副作用最小或無副作用的最小的量來獲得最大的效果的量是至關重要的，這可以通過普通的技術人員輕易做出決定。

具體地，在本發明的藥物組合物中，有效成分的有效量可以根據個體(患者)的年齡、性別、體重的不同而不同，通常，每kg體重給藥約0.0001mg至100mg、0.001mg至50mg或5mg至約50mg，可以一天給藥一次至分為數次給藥。但有效量可以根據給藥途徑及期間、疾病的嚴重程度、性別、體重、年齡等進行增減，本發明的範圍不限定於此。

以下，通過下述實施例更為詳細地說明本發明。下述實施例僅為幫助理解本發明而提出，無論何種方式，都不出於限制本發明的目的，不應解釋為限定本發明。實施例1．製備針對CD47及PD-L1的雙特異性抗體實施例1.1．製備用於製備針對CD47及PD-L1的雙特異性抗體的序列及包含其的載體

為了製備具有如圖1所示結構的抗體，依靠Fusion Antibodies plc.(位於北愛爾蘭貝爾法斯特)製備分別含有這樣的抗體的重鏈的核苷酸序列(序列15)及輕鏈的核苷酸序列(序列16)的載體。實施例1.2．生產及純化針對CD47及PD-L1的雙特異性抗體

在中國倉鼠亂草細胞株中進行實施例1.1中製備的載體的臨時轉染。分批培養後，從細胞培養上清液中純化表現的抗體。然後，為了確認是否滿足如下述表2所示的指定標準，對純化的抗體完成質量控制(QC)分析。表2

指定標準
純度:	＞95%
內毒素(EU/mg):	＜0.25
必要的量(mg):	300
濃度(mg/ml):	＞2
其他：	分析用尺寸排阻分析(SEC)

有關上述轉染、純化及質量控制分析的具體步驟如下。在作為哺乳動物臨時表現質粒的pETE V2(融合抗體(Fusion antibodies))中選殖實施例1.1中製備的載體。使用基於中國倉鼠卵巢的臨時表現系統表現抗體後，對生成的包含抗體的細胞培養上清液進行離心分離及過濾來純化。通過親和度色譜法從細胞培養上清液中純化抗體(使用最新的AKTA色譜法設備)。將純化的抗體在磷酸鹽緩衝溶液內進行緩衝液更換。通過還原和變性十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠判斷，確認抗體的純度＞95%(圖2)。在圖2中，各泳道如下述表3所示。表3

泳道號	樣品	批號	量(mg)	條件*
1	PageRuler(Thermo Fisher公司)	NA	NA	R/NR
2	本實施例的抗體	120520	2	R/NR
3	空白	NA	NA	NA
4	本實施例的抗體	120520	2	R/NR
NA=不可用 *R=還原，NR=非還原

通過尺寸排阻色譜法(SEC)分析抗體來獲得色譜(圖3)。色譜顯出一個主要波峰(總面積超過95%)。有關圖3所示的色譜的積分結果如下述表4所示(以對照蛋白質的滯留體積(資料未顯示)為基準)。與單體部分相應的波峰為＞98%。表4

波峰	滯留(ml)	面積(ml*mAU)	面積%
A	11.19	83.87	100.00

使用Endosafe®-PTS系統及Endosafe®-PTS試劑盒(Charles River Laboratories公司)確定細菌內毒素水準。抗體濃度在280nm的波長下測量吸光度，通過使用1.0mg/ml=1.63的A280的理論吸光係數計算來確定。有關提供的純化抗體產物的詳細事項如表5所示。表5

樣品	批號	濃度 (mg/ml)	體積 (ml)	全部 (mg)	單分散度 (%)	*純度	內毒素 (EU/mg)
Ab 1159.1	120520	1.83	822	516.06	100	＞95	＜0.2
*純度通過考馬斯染色的還原和變性十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠(相對條帶強度)分析來確定

通過表5可知，所希望的抗體以滿足指定標準的程度成功地表現並純化。以下，這樣製備的與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體也稱為“IMC-201”。

如上製備的抗體具有如下的重鏈及輕鏈可變區及CDR序列。Fc區域具有序列11的胺基酸序列(參照序列表)。表6

	結構域	胺基酸序列	序列
與CD47特異性結合的結構域	重鏈可變區	全部	Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser	1
CDR1	Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr	17
CDR2	Asn Pro Ser Gly Gly Ser	19
CDR3	Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr	21
輕鏈可變區	全部	Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Ser Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His Asn Tyr Val SerTrp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Arg Asn Arg Pro SerGly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Gly Ser Arg Thr Tyr ValPhe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu	3
CDR1	Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His Asn Tyr Val Ser	23
CDR2	Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser	25
CDR3	Asn Ser Tyr Thr Gly Ser Arg Thr Tyr Val	27
與PD-L1特異性結合的結構域	重鏈可變區	全部	Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser	5
CDR1	Ser Tyr Ala Tyr Ser	29
CDR2	Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln	31
CDR3	Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr	33
輕鏈可變區	全部	Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys	7
CDR1	Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His	35
CDR2	Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser	37
CDR3	Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile	39

製備例1．製備抗-PD-L1單株抗體及抗-CD47單株抗體

本製備例中製備的單株抗體是指不包含內在性污染物質的同種重組多肽。

首先，為了製備抗-PD-L1單株抗體，使用了美國專利第10118963號的可變區序列(序列1及序列2)。通過連接人類IgG1恆定區序列完成輕鏈及重鏈抗體序列後，使用本發明所屬技術領域中公知的任意的表現系統製備上述抗體。具體地，對在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株中使用包含編碼抗體的核酸的重組表現載體通過臨時表現從宿主細胞中回收的上清液進行蛋白A純化來製備上述抗體。

然後，為了製備抗-CD47單株抗體而使用了美國專利第10035855號公開的可變區序列(序列22及序列8)。通過連接人類IgG4恆定區序列完成輕鏈及重鏈抗體序列後，使用本發明所屬技術領域中公知的任意的表現系統製備上述抗體。具體地，對在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株中使用包含編碼抗體的核酸的重組表現載體通過臨時表現從宿主細胞中回收的上清液進行蛋白A純化來製備上述抗體。

以下，將如上製備的抗-PD-L1單株抗體及抗-CD47單株抗體分別稱為“IMC-001”及“IMC-002”。實施例2．評估IMC-201的抗原結合能力及活性(體外( in vitro)) 實施例2.1．通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)確認配體結合能力

首先，以如下方式通過ELISA檢測IMC-201的單配體(PD-L1)結合力。連續稀釋(0.01ng/ml至600ng/ml，3倍稀釋)IMC-201及IMC-001後，與事先以75ng/well的濃度塗敷于培養板的人類PD-L1一同培養。在IMC-201及IMC-001的檢測中使用辣根過氧化物酶(HRP)-接合抗人類IgG Fcγ片段特異性抗體(Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ fragment specific(#109-035-098)，Jackson IR Lab公司)。

然後，通過ELISA檢測IMC-201的單配體(CD47)結合力。連續稀釋(0.01ng/ml至600ng/ml，3倍稀釋)IMC-201及IMC-001後，與事先以50ng/well的濃度塗敷于培養板的人類CD47一同培養。在IMC-201及IMC-001的檢測中使用辣根過氧化物酶-接合抗人類IgG Fcγ片段特異性抗體。

然後，以如下方式通過ELISA檢測IMC-201的雙配體(PD-L1與CD47)同時結合力。連續稀釋(0.09ng/ml至1800ng/ml，3倍稀釋)IMC-201、IMC-001及IMC-002後，分別以100μL的量與事先以50ng/well的濃度塗敷于培養板的重組人類CD47-fc一同培養。洗滌後以50ng/well的濃度與重組人類PD-L1-his一同培養後，在IMC-201、IMC-001及IMC-002的檢測中使用辣根過氧化物酶-接合抗人類his片段特異性抗體。

結果，作為PD-L1單株抗體的IMC-001的EC ₅₀值(ng/ml)測量為0.989，IMC-201測量為7.240(圖4a的左圖)。並且，作為CD47單株抗體的IMC-002的EC ₅₀值測量為2.769，IMC-201測量為4.091(圖4a的右圖)。另一方面，IMC-201的雙配體同時結合力的測量結果確認，只有IMC-201雙抗體同時與CD47及PD-L1特異性結合(EC ₅₀：17.380ng/ml，圖4b)。作為結論，確認IMC-201顯出與作為單株抗體的IMC-001及IMC-002相似的結合能力。實施例2.2．確認對腫瘤細胞的結合能力

通過如下方式測量IMC-201對腫瘤細胞的細胞結合能力。

在4℃的溫度下，將PD-L1表現高的H1975細胞株(ATCC #CRL-5908)及CD47表現高的Jurkat細胞株(ATCC #TIB-152)分別與3倍稀釋的IMC-201、IMC-001及IMC-002一同培養1小時後，通過流式細胞分析(BD #LSRFortessa X-20)測量它們的結合強度。

結果與ELISA的結果不同，確認到與IMC-001及IMC-002相比，IMC-201對細胞的結合力更有優勢(圖5)。實施例2.3．確認對敲除(KO)細胞株的結合能力

通過如下方式測量IMC-201對敲除穩定細胞株的細胞結合力。

在4℃的溫度下，將利用MDA-MB-231(ATCC #HTB-26)和CRISPR-Cas9敲除獲得的PD-L1(Sigma公司)KO、CD47(Sigma公司)KO及PD-L1及CD47雙KO細胞分別與3倍稀釋的IMC-201、IMC-001及IMC-002一同培養1小時。通過流式細胞分析測量結合強度。

結果，在CD47KO細胞中檢測到IMC-201的結合能力與作為母抗體的IMC-001相似，但在PD-L1KO細胞中檢測到IMC-201的結合能力顯著高於作為母抗體的IMC-002。作為結論，如上述實施例2.2中確認的，與IMC-001及IMC-002相比，IMC-201對腫瘤細胞的結合力更有優勢，其原因可以確認是由於IMC-201具有比對CD47的單株抗體高出很多的對CD47的結合力(圖6a至圖6d)。實施例2.4．檢驗紅細胞結合能力

通過如下方式測量IMC-201對人類紅細胞的細胞表面結合。在此情況下，將作為抗-CD47抗體的IMC-002及Hu5F9(根據文獻[Liu J，et al. Pre-clinical development of a humanized anti-CD47 antibody with anti-cancer therapeutic potential. PLoS One. 2015;10(9):e0137345]製備)用作比較抗體。

將從健康的供體(n=3)獲得的人類紅細胞(5×10 ⁵細胞)與3倍稀釋的IMC-201或其他比較抗體(IMC-002及Hu5F9)一同培養後，利用流式細胞分析測量抗-人類IgG(H+L)二次抗體的幾何學平均螢光強度(MFI)來確定它們的結合強度。以300μg/ml的濃度處理hIgG1(Sigma公司，#I5029)及hIgG4(Biolegend公司，#403702)處理來作為同型對照。對各供體的實驗進行兩次，使用誤差線以图形方式示出3名供體的幾何學平均螢光強度。使用GraphPad Prism 5通過非線性回歸計算EC ₅₀值。

結果，作為比較抗體的Hu5F9顯出高的紅細胞結合力，與之相反，IMC-201幾乎未顯出紅細胞結合力，這與作為同型對照及單株抗體的IMC-002沒有差異。因此，確認IMC-201雖然對癌細胞的結合力高(圖5)，但對紅細胞的結合力低(圖7)。實施例2.5．檢驗血凝

使用1X杜氏磷酸鹽緩衝溶液(DPBS)將健康供體(n=3)的人類紅細胞稀釋為十分之一，在37℃的溫度下與標示濃度的IMC-201及其他比較抗體(IMC-002及Hu5F9)過夜培養。

結果，作為比較抗體的Hu5F9顯出高的血凝度，與之相反，IMC-201幾乎未顯出血凝度。確認到在與作為對照組的空白組、同型對照比較時，也顯出相似的結果，與作為單株抗體的IMC-002的結果也相似。確認到在此確認的IMC-201幾乎不顯出凝血度反映除在上述實施例2.4中確認的對紅細胞的低結合力(圖8)。實施例2.6．確認吞噬作用(phagocytosis)

在抗體的存在下，以1∶1的比例將單核細胞來源巨噬細胞(monocyte-derived macrophage，MDM)分別與CFSE-標記MDA-MB-231、H1975、Raji(ATCC#CCL-86)及SR786(DSMZ#ACC369)細胞共同培養2小時。在MDA-MB-231細胞的情況下，以5μg/ml、10μg/ml的濃度處理IMC-002及IMC-201，在H1975細胞的情況下，以0.37μg/ml、1.11μg/ml、3.33μg/ml的濃度處理IMC-002及IMC-201。在Raji細胞的情況下，以0.04μg/ml、0.12μg/ml、0.37μg/ml的濃度處理IMC-002及IMC-201，在R786細胞的情況下，以0.01μg/ml、0.04μg/ml、0.12μg/ml的濃度處理IMC-002及IMC-201。

在試驗抗體的存在下通過流式細胞分析評估巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。巨噬細胞定義為存活的CD11b+細胞。吞噬作用%定義為作為CFSE+的巨噬細胞的百分比。

結果，在4種細胞中都確認到IMC-201的吞噬作用與IMC-002相比為同等或以上，尤其在MDA-MB-231細胞與H1975細胞中，IMC-201顯出顯著高的吞噬作用(圖9)。實施例2.7．評估腫瘤細胞的ADCC活性

利用ADCC assay kit(Promega_G7018)評估ADCC活性。在試驗當天塗敷靶細胞Raji，而靶細胞MDA-MB-231則是事先過夜塗敷在培養板上。在抗體(IMC-201、IMC-001、IMC-002或Avelumab)的存在下，在4℃的溫度下共同培養ADCC生物測定靶細胞1小時。在此情況下，在Raji細胞中連續稀釋4倍來處理抗體，在MDA-MB-231細胞中連續稀釋7倍來處理抗體。通過洗滌完全去除未與靶細胞結合的抗體後，在5%CO ₂的恒溫箱中與效應細胞共同培養6小時。使用Bio-Glo試劑定量螢光素酶。

結果，顯出在表現CD47的細胞(Raji)中只有IMC-201表現出ADCC效果的驚人結果(圖10a)。並且，在同時表現PD-L1與CD47的細胞(MDA-MB-231)中，IMC-201顯出最高的效果(圖10b)。實施例2.8．評估初級自然殺傷細胞(primary NK cell)的ADCC活性

通過CD107a脫顆粒評估來評估初級自然殺傷細胞的ADCC。以0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml濃度向作為初級自然殺傷細胞靶細胞的MDA-MB-231細胞預處理抗體(IMC-001、IMC-201)30分鐘後，在37℃、5%的CO ₂的恒溫箱中以1∶1的比例(靶細胞∶效應細胞)與CD56+NK細胞(效應細胞)共同培養4小時。共同培養開始時染色CD107a，1小時後處理GolgiStop蛋白轉運抑制劑(Protein Transport Inhibitor)(包含莫能菌素，購買處：BD Biosciences公司)。然後，染色NK細胞標記物，通過流式細胞分析使用存活的自然殺傷細胞細胞(CD3-CD56+)內的CD107a%來評估ADCC。

結果，確認到通過IMC-201的自然殺傷細胞的活性與競爭藥物相同(未出示資料)，與IMC-001相比，在所有濃度中都顯著優異(圖11)。自然殺傷細胞的活性增加表明通過IMC-201增加了先天免疫(innate immunity)活性。實施例2.9．確認通過抗體的T細胞活性(混合淋巴細胞反應(MLR)分析)

通過利用樹突狀細胞和T細胞的混合淋巴細胞反應(MLR，Mixed Lymphocyte Reaction)分析確認通過抗體的T細胞的活性。在CD14+單核細胞中分化出單核細胞衍生的樹突狀細胞(Monocyte derived dendritic cells，moDC)後，在外周血單個核細胞(PBMC，Peripheral blood mononuclear cells)中使用分離用試劑盒(stem cell#17952)分離CD4+T細胞來確保。在IMC-001或IMC-201(0.001μg/mL至10μg/mL，10倍稀釋)的存在下以1∶10的比例一同培養單核細胞衍生樹突狀細胞與CD4+T細胞5天，在確保的細胞培養液中通過ELISA確認γ干擾素(IFN-γ)的表現。

結果，確認到IMC-201濃度依賴性地增加濃度γ干擾素(圖12)。IMC-201顯出與作為母抗體的IMC-001相似的功效，在混合淋巴細胞反應分析中的γ干擾素的表現增加暗示在腫瘤微環境中通過增加對癌細胞的細胞毒性來抑制癌症的可能性。實施例3．確認IMC-201的效果(體內( in vivo)) 實施例3.1．在乳癌細胞株 Xenograft模型中的癌細胞生長抑制效果

為了IMC-201的生物體內功效研究，解凍及培養MDA-MB-231乳癌細胞株，將該細胞以1×10 ⁷細胞/200μl的濃度分別皮下接種於40只後天免疫細胞缺失的BALB/c裸小鼠(購買處：Chemon公司)的如圖13所示的部位1。

接種細胞後的第17天，當平均腫瘤大小到達90.89mm ³時，將小鼠隨機分為如圖7所示的5個組。各組包括8只小鼠。試驗物質的給藥從第0天(D0)開始。一週一次(共5次)向腹腔內給藥試驗物質。

在D0、D4、D7、D11、D14、D18、D21、D25、D28、D32、D39、D46及D53測量腫瘤體積和體重。通過下述式計算腫瘤體積及並以mm ³表示：TV=0.5a×b ²(其中，a與b分別為腫瘤的長直徑和短直徑)。

資料以平均值±標準誤(Mean±SEM)的方式表示。為了兩組之間的比較，進行獨立標本T檢驗(Independent-Samples T test)。使用SPSS的18.0版本分析所有資料。將P＜0.05看做統計學顯著性。

移植乳癌細胞株的功效研究設計如下。表7

組	No.	試驗物品	給藥量(mg/kg)	給藥方法	頻度	給藥期間
G1	8	IgG1對照組	21.4	i.p	QW	5w
G2	8	IMC-001	2.1	i.p	QW	5w
G3	8	IMC-002	2.1	i.p	QW	5w
G4	8	IMC-001+IMC-002	2.1+2.1	i.p	QW	5w
G5	8	IMC-201	3	i.p	QW	5w
注釋：G，組；No，動物數量；i.p，腹腔內；QW，一週一次

與進行功效研究的結果相關地，以腫瘤生長曲線為基準的腫瘤生長抑制如圖14所示。

通過上述結果確認到如下事項。在作為功效研究終點的第65天，與同型對照(G1、IgG1 kappa、21.4 mpk、QW×5w)相比，IMC-001(G2，2.1 mpk，QW×5w)組中的腫瘤體積(TGItv=42.70%)無顯著差異。相反，與對照組相比，IMC-002(G3，2.1 mpk，QW×5w)組中的腫瘤體積(TGItv=51.12%)顯出顯著差異(P＜0.05*)。並且，在IMC-001與IMC-002的並用-處理組(G4，2.1 mpk+2.1 mpk，QW×5w)及IMC-201-處理組(G5，3 mpk，QW×5w)中，有關腫瘤體積的TGI值分別為67.14%、92.78%，顯出顯著差異(P＜0.01**)。尤其，IMC-201-處理組最顯出組顯著的腫瘤生長抑制效果。實施例3.2．在大腸癌細胞株Xenograft模型中的癌細胞生長抑制效果

用於IMC-201的生物體內功效研究的癌細胞株為CT26-hPD-L1/hCD47，這是通過流式細胞分析確認到該細胞通過敲除CT26 WT細胞(Kerafast公司，Cat No：ENH204)的小鼠PD-L1及CD47基因並插入恒常表現的人類PD-L1及CD47基因來生成。

解凍並傳代培養CT26-hPD-L1/hCD47細胞後，將該細胞以2×10 ⁶細胞/100μl的濃度分別皮下接種於48只BALB/c-hPD-1/hSIRPα小鼠(購買處：GemPharmatech Co.，Ltd)的如圖13所示的部位3。

接種細胞後的第7天，當平均腫瘤大小到達99.92mm ³時，將小鼠隨機分為如圖8所示的5個組。各組包括8只小鼠。分組當天表示為第0天(D0).試驗物質的給藥從第0天(D0)開始。一周2次(共4次)向腹腔內給藥試驗物質。在D0、D4、D7、D11、D14、D18、D21、D25、D28、D32、D39、D46及D53測量腫瘤體積及體重。通過下述式計算腫瘤體積及並以mm ³表示：TV=0.5a×b ²(其中，a與b分別為腫瘤的長直徑和短直徑)。

資料以平均值±標準誤的方式表示。為了兩組之間的比較，進行獨立標本T檢驗。使用SPSS的18.0版本分析所有資料。將P＜0.05看做統計學顯著性。

移植大腸癌細胞株的功效研究設計如下。表8

組	No.	試驗物品	給藥量(mg/kg)	給藥方法	頻度	給藥期間
G1	8	同型對照	21.4	i.p	BIW	2w
G2	8	IMC-001	2.1	i.p	BIW	2w
G3	8	IMC-002	2.1	i.p	BIW	2w
G4	8	IMC-001+IMC-002	2.1	i.p	BIW	2w
G5	8	IMC-201	3	i.p	BIW	2w
注釋：G，組；No，動物數量；i.p，腹腔內；QW，一周2次

在上述試驗物品中，同型對照為IgG1 kappa(Crownbio公司)。

與進行功效研究的結果相關地，以腫瘤生長曲線為基準的腫瘤生長抑制如圖15所示。

通過上述結果確認如下事項。在功效研究終點，與同型對照(G1、IgG1 kappa、21.4 mpk、QW×2w)相比，G3(IMC-002給藥組，2.1 mpk，BIW×2w)組中的腫瘤體積(TGItv D28=27.08%)及腫瘤重量(TGItw=21.11%)顯出不顯著的差異。並且，與G1相比，G4(IMC-001+IMC-002並用處理組，2.1 mpk，BIW×2w)的腫瘤體積(TGItv D28=27.37%)及腫瘤重量(TGItw=26.93%)也顯出不顯著的差異。與之相反，與G1相比，IMC-001處理組(G2，2.1 mpk，BIW×2w)的腫瘤體積(TGItv D28=38.60%)及腫瘤重量(TGItw=41.43%)顯出顯著差異(P＜0.05*)。而且，G5(IMC-201，3 mpk，BIW×2w)的腫瘤體積(TGItv D28=83.57%)及腫瘤重量(TGItw=82.98%)在統計學上顯出很高的顯著性(P＜0.001***)。在所有治療劑給藥組中均未觀察到異常的體重變化，通過給藥IMC-201觀察到顯著水準的癌症生長抑制，作為母抗體的IMC-001和IMC-002的單獨處理組及並用處理組相比，確認到高水準的癌細胞生長抑制效果。實施例3.3．復發研究

復發研究是在實施例3.2的功效研究分組後第53天將CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤細胞以2×10 ⁶細胞/100μL的濃度皮下接種與各小鼠的如圖13所示的部位4來進行的。復發研究的終點估計在第88天。在復發研究終點，拍攝小鼠和腫瘤的照片並測量腫瘤重量。與進行復發研究的結果相關地，多個組隨著時間的平均腫瘤體積變化如圖16所示。

通過上述結果確認到下述事項。在作為研究終點的第88天，G1(G1：BALB/c-hPD-1/hSIRPα小鼠)、G5(3 mpk(BIW×2w)IMC-201處理的腫瘤退行小鼠)的平均腫瘤體積分別為3233.74mm ³及0mm ³。與對照組(G1)相比，G5(3 mpk(BIW×2w)IMC-201處理的腫瘤退行小鼠)組顯出顯著的腫瘤抑制效果。對於在功效研究分組第53天不給藥IMC-201抗體的小鼠(G1)有發生腫瘤生長。與之相反，通過IMC-201抗體抑制腫瘤的小鼠(G5)在之前移植部位相反部位再次移植癌細胞後，確認到即使不再給藥抗體，腫瘤也不再生長，在6只小鼠中觀察到完全緩解(Complete Remission，CR)。

通過此確認，IMC-201(3 mpk)在相同腫瘤復發研究中具有因記憶T細胞的生成而抑制復發的效果。 [序列表自由文本] ＜110＞南韓商益免安協公司 (IMMUNE ONCIA THERAPEUTICS INC.) ＜120＞與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體＜130＞ KC22038 ＜150＞ KR 10-2021-0059596 ＜151＞ 2021-05-07 ＜160＞ 40 ＜170＞ KoPatentIn 3.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 119 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之重鏈可變區＜400＞ 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 ＜210＞ 2 ＜211＞ 357 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之重鏈可變區＜400＞ 2 caagtccaac tagtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgttaaggtg 60 tcatgcaagg caagcggcta tactttcaca agctattaca tgcattgggt tagacaggcc 120 ccaggacagg gcctggagtg gatgggtata attaatccta gtgggggatc tacttcctac 180 gcccaaaaat tccagggaag ggtcacaatg accagggata cctccaccag taccgtatac 240 atggagctgt caagtctgcg aagcgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttctacc 300 ctgtgggtgt cagaattcga ttattgggga caggggaccc tggttacagt cagtagt 357 ＜210＞ 3 ＜211＞ 110 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈可變區＜400＞ 3 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Ser Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Gly Ser 85 90 95 Arg Thr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 ＜210＞ 4 ＜211＞ 330 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈可變區＜400＞ 4 cagtccgccc tgacccagcc tgcatctgta agcggttccc caggccaaag tatctccata 60 tcttgcactg gcactagttc tgacgtcggc ggccataact atgtctcatg gtaccagcag 120 catccaggaa aagcccccaa gctcatgatc tatgatgtcc gcaacagacc gtctggggtg 180 agcaaccgat ttagcgggag caaatccgga tccacggcat cattaacaat ttctggattg 240 cagactgagg atgaagctga ctattactgt aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc 300 ttcgggagcg ggacaaagct cacagtgctg 330 ＜210＞ 5 ＜211＞ 121 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Hv) ＜400＞ 5 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 ＜210＞ 6 ＜211＞ 363 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Hv) ＜400＞ 6 cagatgcagc tcgtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc caggctcctc tgtaaaggtt 60 tcctgcaaag ccagcggtgg aacctttagc tcttacgcat atagctgggt tagacaagct 120 ccaggacagg gccttgaatg gatgggtggc ataatcccct cgtttggtac tgctaactac 180 gcacagaagt ttcagggccg cgtgactatc actgcagatg agtccacgtc cactgcatat 240 atggagctgt caagtctacg gtctgaagac accgcagtgt actactgcgc ccgcgggcct 300 atcgtggcta ccataacccc actggattat tggggccaag gtacactagt gacagtctcc 360 tct 363 ＜210＞ 7 ＜211＞ 112 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Lv) ＜400＞ 7 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 ＜210＞ 8 ＜211＞ 336 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Lv) ＜400＞ 8 tcttatgtcc tcacccagcc accatccgtc tcggtggctc ccgggaaaac cgctacgatt 60 gcctgtgggg gcgaaaacat cggccggaag acagttcact ggtatcagca gaaacctggc 120 caggccccag tgcttgtgat ctactacgat tccgacaggc caagtggcat ccccgagagg 180 ttttcaggat ctaattctgg gaatacagct actctgacta ttagcagagt cgaagctgga 240 gatgaagcgg actactattg tctggtatgg gatagttcct cagaccatag aattttcggt 300 ggaggcacta agttaactgt gctgggccaa cctaaa 336 ＜210＞ 9 ＜211＞ 248 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之全scFv ＜400＞ 9 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly 145 150 155 160 Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 245 ＜210＞ 10 ＜211＞ 744 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之全scFv ＜400＞ 10 cagatgcagc tcgtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc caggctcctc tgtaaaggtt 60 tcctgcaaag ccagcggtgg aacctttagc tcttacgcat atagctgggt tagacaagct 120 ccaggacagg gccttgaatg gatgggtggc ataatcccct cgtttggtac tgctaactac 180 gcacagaagt ttcagggccg cgtgactatc actgcagatg agtccacgtc cactgcatat 240 atggagctgt caagtctacg gtctgaagac accgcagtgt actactgcgc ccgcgggcct 300 atcgtggcta ccataacccc actggattat tggggccaag gtacactagt gacagtctcc 360 tctggagggg gtgggtcagg cggtggggga agcggcggag gtggatcatc ttatgtcctc 420 acccagccac catccgtctc ggtggctccc gggaaaaccg ctacgattgc ctgtgggggc 480 gaaaacatcg gccggaagac agttcactgg tatcagcaga aacctggcca ggccccagtg 540 cttgtgatct actacgattc cgacaggcca agtggcatcc ccgagaggtt ttcaggatct 600 aattctggga atacagctac tctgactatt agcagagtcg aagctggaga tgaagcggac 660 tactattgtc tggtatggga tagttcctca gaccatagaa ttttcggtgg aggcactaag 720 ttaactgtgc tgggccaacc taaa 744 ＜210＞ 11 ＜211＞ 340 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之Fc區域＜400＞ 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Ala Gly Gly Ser 325 330 335 Gly Gly Asp Ser 340 ＜210＞ 12 ＜211＞ 1020 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之Fc區域＜400＞ 12 gcctctacaa aaggcccttc agtgtttcca ctagctccct cctcaaaatc tacaagcggc 60 ggcacagccg cgctcgggtg cttagtcaag gactatttcc ctgagccagt gactgtgagc 120 tggaatagcg gggcccttac atcgggggtt cacacattcc ccgctgtctt gcaaagcagt 180 ggtttgtata gtttgtcatc agtggtcacc gtccctagca gctctttggg cacgcagacg 240 tacatttgca acgtgaatca taagccatcg aacacaaaag ttgataaaaa ggttgaaccg 300 aagtcctgtg acaaaacgca cacctgtccc ccgtgtcctg ctcccgaact tttgggtggt 360 cctagtgtct ttcttttccc tccaaagccc aaggacacac tgatgatttc tcggacccca 420 gaggttactt gcgtagttgt agacgtaagc cacgaggatc ctgaagtcaa atttaattgg 480 tacgtggacg gagtcgaggt acacaatgct aagaccaaac cccgcgagga acaatacaat 540 tccacttacc gcgtcgtttc ggtgctgact gtgctccatc aggactggct gaacggcaaa 600 gaatacaaat gcaaggtaag caacaaggcc ctccccgccc caatcgagaa aaccatctcc 660 aaggccaagg gccagcctcg ggagccccag gtgtataccc tcccccccag ccgagatgaa 720 ctgaccaaaa accaggtgag cctgacttgt ctggtgaagg gattttatcc tagtgatatc 780 gccgtggagt gggagtctaa cggacagccc gagaacaact ataagaccac accgcctgtc 840 cttgactccg acggttcttt cttcctgtac agcaagctca ccgtggacaa gtctcgatgg 900 cagcagggca atgtgttctc ttgctccgtg atgcacgagg cactccataa ccactacaca 960 cagaaaagcc tctctttgtc acccggcaag gggagtgctg gcggctccgg tggagactcc 1020 ＜210＞ 13 ＜211＞ 106 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈恆定區＜400＞ 13 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 ＜210＞ 14 ＜211＞ 318 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈恆定區＜400＞ 14 ggccaaccca aagctgcgcc cagtgtaacc cttttccctc cctctagcga ggaactgcag 60 gctaataaag ctaccctggt ttgcctcatc tcagattttt accccggcgc cgttaccgtg 120 gcctggaagg cagacagctc acctgttaag gccggtgtgg agacaacaac ccctagcaag 180 cagagcaaca ataaatacgc cgcatccagt tacctgtcac taactccaga acaatggaag 240 tctcacaggt cctacagttg tcaggtgacg cacgagggaa gtacagtgga gaagactgtg 300 gctccaaccg aatgctcg 318 ＜210＞ 15 ＜211＞ 2121 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201的經密碼子優化之重鏈＜400＞ 15 caagtccaac tagtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgttaaggtg 60 tcatgcaagg caagcggcta tactttcaca agctattaca tgcattgggt tagacaggcc 120 ccaggacagg gcctggagtg gatgggtata attaatccta gtgggggatc tacttcctac 180 gcccaaaaat tccagggaag ggtcacaatg accagggata cctccaccag taccgtatac 240 atggagctgt caagtctgcg aagcgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttctacc 300 ctgtgggtgt cagaattcga ttattgggga caggggaccc tggttacagt cagtagtgcc 360 tctacaaaag gcccttcagt gtttccacta gctccctcct caaaatctac aagcggcggc 420 acagccgcgc tcgggtgctt agtcaaggac tatttccctg agccagtgac tgtgagctgg 480 aatagcgggg cccttacatc gggggttcac acattccccg ctgtcttgca aagcagtggt 540 ttgtatagtt tgtcatcagt ggtcaccgtc cctagcagct ctttgggcac gcagacgtac 600 atttgcaacg tgaatcataa gccatcgaac acaaaagttg ataaaaaggt tgaaccgaag 660 tcctgtgaca aaacgcacac ctgtcccccg tgtcctgctc ccgaactttt gggtggtcct 720 agtgtctttc ttttccctcc aaagcccaag gacacactga tgatttctcg gaccccagag 780 gttacttgcg tagttgtaga cgtaagccac gaggatcctg aagtcaaatt taattggtac 840 gtggacggag tcgaggtaca caatgctaag accaaacccc gcgaggaaca atacaattcc 900 acttaccgcg tcgtttcggt gctgactgtg ctccatcagg actggctgaa cggcaaagaa 960 tacaaatgca aggtaagcaa caaggccctc cccgccccaa tcgagaaaac catctccaag 1020 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tataccctcc cccccagccg agatgaactg 1080 accaaaaacc aggtgagcct gacttgtctg gtgaagggat tttatcctag tgatatcgcc 1140 gtggagtggg agtctaacgg acagcccgag aacaactata agaccacacc gcctgtcctt 1200 gactccgacg gttctttctt cctgtacagc aagctcaccg tggacaagtc tcgatggcag 1260 cagggcaatg tgttctcttg ctccgtgatg cacgaggcac tccataacca ctacacacag 1320 aaaagcctct ctttgtcacc cggcaagggg agtgctggcg gctccggtgg agactcccag 1380 atgcagctcg tgcagtccgg ggccgaggtg aagaagccag gctcctctgt aaaggtttcc 1440 tgcaaagcca gcggtggaac ctttagctct tacgcatata gctgggttag acaagctcca 1500 ggacagggcc ttgaatggat gggtggcata atcccctcgt ttggtactgc taactacgca 1560 cagaagtttc agggccgcgt gactatcact gcagatgagt ccacgtccac tgcatatatg 1620 gagctgtcaa gtctacggtc tgaagacacc gcagtgtact actgcgcccg cgggcctatc 1680 gtggctacca taaccccact ggattattgg ggccaaggta cactagtgac agtctcctct 1740 ggagggggtg ggtcaggcgg tgggggaagc ggcggaggtg gatcatctta tgtcctcacc 1800 cagccaccat ccgtctcggt ggctcccggg aaaaccgcta cgattgcctg tgggggcgaa 1860 aacatcggcc ggaagacagt tcactggtat cagcagaaac ctggccaggc cccagtgctt 1920 gtgatctact acgattccga caggccaagt ggcatccccg agaggttttc aggatctaat 1980 tctgggaata cagctactct gactattagc agagtcgaag ctggagatga agcggactac 2040 tattgtctgg tatgggatag ttcctcagac catagaattt tcggtggagg cactaagtta 2100 actgtgctgg gccaacctaa a 2121 ＜210＞ 16 ＜211＞ 648 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201的經密碼子優化之輕鏈＜400＞ 16 cagtccgccc tgacccagcc tgcatctgta agcggttccc caggccaaag tatctccata 60 tcttgcactg gcactagttc tgacgtcggc ggccataact atgtctcatg gtaccagcag 120 catccaggaa aagcccccaa gctcatgatc tatgatgtcc gcaacagacc gtctggggtg 180 agcaaccgat ttagcgggag caaatccgga tccacggcat cattaacaat ttctggattg 240 cagactgagg atgaagctga ctattactgt aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc 300 ttcgggagcg ggacaaagct cacagtgctg ggccaaccca aagctgcgcc cagtgtaacc 360 cttttccctc cctctagcga ggaactgcag gctaataaag ctaccctggt ttgcctcatc 420 tcagattttt accccggcgc cgttaccgtg gcctggaagg cagacagctc acctgttaag 480 gccggtgtgg agacaacaac ccctagcaag cagagcaaca ataaatacgc cgcatccagt 540 tacctgtcac taactccaga acaatggaag tctcacaggt cctacagttg tcaggtgacg 600 cacgagggaa gtacagtgga gaagactgtg gctccaaccg aatgctcg 648 ＜210＞ 17 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 17 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 ＜210＞ 18 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 18 ggctatactt tcacaagcta t 21 ＜210＞ 19 ＜211＞ 6 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 19 Asn Pro Ser Gly Gly Ser 1 5 ＜210＞ 20 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 20 aatcctagtg ggggatct 18 ＜210＞ 21 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 21 Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 ＜210＞ 22 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 22 tctaccctgt gggtgtcaga attcgattat 30 ＜210＞ 23 ＜211＞ 14 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 23 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His Asn Tyr Val Ser 1 5 10 ＜210＞ 24 ＜211＞ 42 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 24 actggcacta gttctgacgt cggcggccat aactatgtct ca 42 ＜210＞ 25 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 25 Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser 1 5 ＜210＞ 26 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 26 gatgtccgca acagaccgtc t 21 ＜210＞ 27 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 27 Asn Ser Tyr Thr Gly Ser Arg Thr Tyr Val 1 5 10 ＜210＞ 28 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 28 aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc 30 ＜210＞ 29 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 29 Ser Tyr Ala Tyr Ser 1 5 ＜210＞ 30 ＜211＞ 15 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 30 tcttacgcat atagc 15 ＜210＞ 31 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 31 Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 ＜210＞ 32 ＜211＞ 48 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 32 ggcataatcc cctcgtttgg tactgctaac tacgcacaga agtttcag 48 ＜210＞ 33 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 33 Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 ＜210＞ 34 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 34 gggcctatcg tggctaccat aaccccactg gattat 36 ＜210＞ 35 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 35 Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His 1 5 10 ＜210＞ 36 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR1 ＜400＞ 36 gggggcgaaa acatcggccg gaagacagtt cac 33 ＜210＞ 37 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 37 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 ＜210＞ 38 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR2 ＜400＞ 38 tacgattccg acaggccaag t 21 ＜210＞ 39 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 39 Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile 1 5 10 ＜210＞ 40 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR3 ＜400＞ 40 ctggtatggg atagttcctc agaccataga att 33

(無)

圖1為示出本發明的針對CD47及PD-L1的雙特異性抗體的簡要示意圖。圖2示出實施例1.2中製備的抗體在4%至20%變性、還原和非還原的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析中的結果。分子量標記以千道爾頓表示。圖3示出用來觀察實施例1.2中製備的抗體的分析用凝膠-過濾洗脫輪廓(色譜柱：Superdex 200 increase 10/300 GL；吸收波長：214nm；緩衝液：磷酸鹽緩衝溶液(PBS)；溫度(℃)：19；流量(ml/min)：0.75；使用的SOP/WI：WI PP 24.0；批號：120520)。圖4a及圖4b分別示出通過ELISA分析雙特異性抗體針對CD47及PD-L1的單或雙配體結合力的結果。圖5分別示出雙特異性抗體對富含(enriched)PD-L1腫瘤細胞及富含CD47腫瘤細胞的結合力。圖6a至圖6d分別示出雙特異性抗體對MDA-MB-231的WT、PD-L1 KO、CD47KO及PD-L1/CD47雙KO細胞的結合力。圖7示出對雙特異性抗體進行紅細胞結合檢驗的結果。圖8示出對雙特異性抗體進行血凝(hemagglutination)檢驗的結果。圖9示出雙特異性抗體對4種細胞(MDA-MB-231、H1975、Raji及SR786)的吞噬作用結果。圖10a及圖10b示出分別在Raji細胞及MDA-MB-231細胞中對雙特異性抗體進行(ADCC NFAT—Luc)測定的結果。圖11示出在MDA-MB-231細胞中對雙特異性抗體進行自然殺傷細胞NK細胞的ADCC測定的結果。圖12示出為確認雙特異性抗體的T細胞活化效果而進行混合淋巴細胞反應分析的結果。圖13示出在實施例3.1至實施例3.3中提及的小鼠的腫瘤接種部位。圖14為在移植人MDA-MB-231細胞株的BALB/c裸小鼠中確認雙特異性抗體癌細胞生長抑制功效的研究結果。圖15為在CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤同種移植BALB/c-hPD-1/hSIRPα小鼠中確認雙特異性抗體的癌細胞生長抑制功效的研究結果。圖16示出與實施例3.3的復發研究相關的，在BALB/c-hPD-1/hSIRPα小鼠的CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤同種移植模型的處理中的腫瘤體積曲線。資料以平均數±標準誤(SEM)的方式示出。

<![CDATA[<110>    南韓商益免安協公司 (IMMUNE ONCIA THERAPEUTICS INC.)]]>
          <![CDATA[<120>    與CD47及PD-L1特異性結合的雙特異性抗體]]>
          <![CDATA[<140>    TW 111117203]]>
          <![CDATA[<141>    2022-05-06]]>
          <![CDATA[<150>    KR 10-2021-0059596]]>
          <![CDATA[<151>    2021-05-07]]>
          <![CDATA[<160>    40]]>
          <![CDATA[<170>    KoPatentIn 3.0]]>
          <![CDATA[<210>    1]]>
          <![CDATA[<211>    119]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之重鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>    1]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
                       20                  25                  30 
          Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                   35                  40                  45 
          Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
               50                  55                  60 
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Arg Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
                      100                 105                 110 
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                  115                
          <![CDATA[<210>    2]]>
          <![CDATA[<211>    357]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之重鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>    2]]>
          caagtccaac tagtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgttaaggtg         60
          tcatgcaagg caagcggcta tactttcaca agctattaca tgcattgggt tagacaggcc        120
          ccaggacagg gcctggagtg gatgggtata attaatccta gtgggggatc tacttcctac        180
          gcccaaaaat tccagggaag ggtcacaatg accagggata cctccaccag taccgtatac        240
          atggagctgt caagtctgcg aagcgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttctacc        300
          ctgtgggtgt cagaattcga ttattgggga caggggaccc tggttacagt cagtagt           357
          <![CDATA[<210>    3]]>
          <![CDATA[<211>    110]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>    3]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
            1               5                  10                  15 
          Ser Ile Ser Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His
                       20                  25                  30 
          Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
                   35                  40                  45 
          Met Ile Tyr Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
               50                  55                  60 
          Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
           65                  70                  75                  80 
          Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Gly Ser
                           85                  90                  95 
          Arg Thr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
                      100                 105                 110
          <![CDATA[<210>    4]]>
          <![CDATA[<211>    330]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>    4]]>
          cagtccgccc tgacccagcc tgcatctgta agcggttccc caggccaaag tatctccata         60
          tcttgcactg gcactagttc tgacgtcggc ggccataact atgtctcatg gtaccagcag        120
          catccaggaa aagcccccaa gctcatgatc tatgatgtcc gcaacagacc gtctggggtg        180
          agcaaccgat ttagcgggag caaatccgga tccacggcat cattaacaat ttctggattg        240
          cagactgagg atgaagctga ctattactgt aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc        300
          ttcgggagcg ggacaaagct cacagtgctg                                         330
          <![CDATA[<210>    5]]>
          <![CDATA[<211>    121]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Hv)]]>
          <![CDATA[<400>    5]]>
          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
                       20                  25                  30 
          Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                   35                  40                  45 
          Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
               50                  55                  60 
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
                      100                 105                 110 
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                  115                 120    
          <![CDATA[<210>    6]]>
          <![CDATA[<211>    363]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Hv)]]>
          <![CDATA[<400>    6]]>
          cagatgcagc tcgtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc caggctcctc tgtaaaggtt         60
          tcctgcaaag ccagcggtgg aacctttagc tcttacgcat atagctgggt tagacaagct        120
          ccaggacagg gccttgaatg gatgggtggc ataatcccct cgtttggtac tgctaactac        180
          gcacagaagt ttcagggccg cgtgactatc actgcagatg agtccacgtc cactgcatat        240
          atggagctgt caagtctacg gtctgaagac accgcagtgt actactgcgc ccgcgggcct        300
          atcgtggcta ccataacccc actggattat tggggccaag gtacactagt gacagtctcc        360
          tct                                                                      363
          <![CDATA[<210>    7]]>
          <![CDATA[<211>    112]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Lv)]]>
          <![CDATA[<400>    7]]>
          Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
            1               5                  10                  15 
          Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val
                       20                  25                  30 
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
                   35                  40                  45 
          Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
               50                  55                  60 
          Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
           65                  70                  75                  80 
          Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
                           85                  90                  95 
          Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>    8]]>
          <![CDATA[<211>    336]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之scFv (Lv)]]>
          <![CDATA[<400>    8]]>
          tcttatgtcc tcacccagcc accatccgtc tcggtggctc ccgggaaaac cgctacgatt         60
          gcctgtgggg gcgaaaacat cggccggaag acagttcact ggtatcagca gaaacctggc        120
          caggccccag tgcttgtgat ctactacgat tccgacaggc caagtggcat ccccgagagg        180
          ttttcaggat ctaattctgg gaatacagct actctgacta ttagcagagt cgaagctgga        240
          gatgaagcgg actactattg tctggtatgg gatagttcct cagaccatag aattttcggt        300
          ggaggcacta agttaactgt gctgggccaa cctaaa                                  336
          <![CDATA[<210>    9]]>
          <![CDATA[<211>    248]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的經密碼子優化之全scFv]]>
          <![CDATA[<400>    9]]>
          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
            1               5                  10                  15 
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
                       20                  25                  30 
          Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
                   35                  40                  45 
          Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
               50                  55                  60 
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
           65                  70                  75                  80 
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                           85                  90                  95 
          Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
                      100                 105                 110 
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
                  115                 120                 125 
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro
              130                 135                 140 
          Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly
          145                 150                 155                 160 
          Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                          165                 170                 175 
          Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly
                      180                 185                 190 
          Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
                  195                 200                 205 
          Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
              210                 215                 220 
          Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
                          245            
          <![CDATA[<210>    10]]>
          <![CDATA[<211>    744]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二]]>結構域的經密碼子優化之全scFv
          <![CDATA[<400>    10]]>
          cagatgcagc tcgtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc caggctcctc tgtaaaggtt         60
          tcctgcaaag ccagcggtgg aacctttagc tcttacgcat atagctgggt tagacaagct        120
          ccaggacagg gccttgaatg gatgggtggc ataatcccct cgtttggtac tgctaactac        180
          gcacagaagt ttcagggccg cgtgactatc actgcagatg agtccacgtc cactgcatat        240
          atggagctgt caagtctacg gtctgaagac accgcagtgt actactgcgc ccgcgggcct        300
          atcgtggcta ccataacccc actggattat tggggccaag gtacactagt gacagtctcc        360
          tctggagggg gtgggtcagg cggtggggga agcggcggag gtggatcatc ttatgtcctc        420
          acccagccac catccgtctc ggtggctccc gggaaaaccg ctacgattgc ctgtgggggc        480
          gaaaacatcg gccggaagac agttcactgg tatcagcaga aacctggcca ggccccagtg        540
          cttgtgatct actacgattc cgacaggcca agtggcatcc ccgagaggtt ttcaggatct        600
          aattctggga atacagctac tctgactatt agcagagtcg aagctggaga tgaagcggac        660
          tactattgtc tggtatggga tagttcctca gaccatagaa ttttcggtgg aggcactaag        720
          ttaactgtgc tgggccaacc taaa                                               744
          <![CDATA[<210>    11]]>
          <![CDATA[<211>    340]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之Fc區域]]>
          <![CDATA[<400>    11]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
            1               5                  10                  15 
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                       20                  25                  30 
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
                   35                  40                  45 
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
               50                  55                  60 
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
           65                  70                  75                  80 
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                           85                  90                  95 
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                      100                 105                 110 
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
                  115                 120                 125 
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
              130                 135                 140 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                          165                 170                 175 
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                      180                 185                 190 
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                  195                 200                 205 
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
              210                 215                 220 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                          245                 250                 255 
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                      260                 265                 270 
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
                  275                 280                 285 
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
              290                 295                 300 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Ala Gly Gly Ser
                          325                 330                 335 
          Gly Gly Asp Ser
                      340
          <![CDATA[<210>    12]]>
          <![CDATA[<211>    1020]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之Fc區域]]>
          <![CDATA[<400>    12]]>
          gcctctacaa aaggcccttc agtgtttcca ctagctccct cctcaaaatc tacaagcggc         60
          ggcacagccg cgctcgggtg cttagtcaag gactatttcc ctgagccagt gactgtgagc        120
          tggaatagcg gggcccttac atcgggggtt cacacattcc ccgctgtctt gcaaagcagt        180
          ggtttgtata gtttgtcatc agtggtcacc gtccctagca gctctttggg cacgcagacg        240
          tacatttgca acgtgaatca taagccatcg aacacaaaag ttgataaaaa ggttgaaccg        300
          aagtcctgtg acaaaacgca cacctgtccc ccgtgtcctg ctcccgaact tttgggtggt        360
          cctagtgtct ttcttttccc tccaaagccc aaggacacac tgatgatttc tcggacccca        420
          gaggttactt gcgtagttgt agacgtaagc cacgaggatc ctgaagtcaa atttaattgg        480
          tacgtggacg gagtcgaggt acacaatgct aagaccaaac cccgcgagga acaatacaat        540
          tccacttacc gcgtcgtttc ggtgctgact gtgctccatc aggactggct gaacggcaaa        600
          gaatacaaat gcaaggtaag caacaaggcc ctccccgccc caatcgagaa aaccatctcc        660
          aaggccaagg gccagcctcg ggagccccag gtgtataccc tcccccccag ccgagatgaa        720
          ctgaccaaaa accaggtgag cctgacttgt ctggtgaagg gattttatcc tagtgatatc        780
          gccgtggagt gggagtctaa cggacagccc gagaacaact ataagaccac accgcctgtc        840
          cttgactccg acggttcttt cttcctgtac agcaagctca ccgtggacaa gtctcgatgg        900
          cagcagggca atgtgttctc ttgctccgtg atgcacgagg cactccataa ccactacaca        960
          cagaaaagcc tctctttgtc acccggcaag gggagtgctg gcggctccgg tggagactcc       1020
                                                                                  1020
          <![CDATA[<210>    13]]>
          <![CDATA[<211>    106]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈恆定區]]>
          <![CDATA[<400>    13]]>
          Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
            1               5                  10                  15 
          Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
                       20                  25                  30 
          Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
                   35                  40                  45 
          Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
               50                  55                  60 
          Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
           65                  70                  75                  80 
          Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                           85                  90                  95 
          Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
                      100                 105    
          <![CDATA[<210>    14]]>
          <![CDATA[<211>    318]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的經密碼子優化之輕鏈恆定區]]>
          <![CDATA[<400>    14]]>
          ggccaaccca aagctgcgcc cagtgtaacc cttttccctc cctctagcga ggaactgcag         60
          gctaataaag ctaccctggt ttgcctcatc tcagattttt accccggcgc cgttaccgtg        120
          gcctggaagg cagacagctc acctgttaag gccggtgtgg agacaacaac ccctagcaag        180
          cagagcaaca ataaatacgc cgcatccagt tacctgtcac taactccaga acaatggaag        240
          tctcacaggt cctacagttg tcaggtgacg cacgagggaa gtacagtgga gaagactgtg        300
          gctccaaccg aatgctcg                                                      318
          <![CDATA[<210>    15]]>
          <![CDATA[<211>    2121]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201的經密碼子優化之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>    15]]>
          caagtccaac tagtgcagtc cggggccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgttaaggtg         60
          tcatgcaagg caagcggcta tactttcaca agctattaca tgcattgggt tagacaggcc        120
          ccaggacagg gcctggagtg gatgggtata attaatccta gtgggggatc tacttcctac        180
          gcccaaaaat tccagggaag ggtcacaatg accagggata cctccaccag taccgtatac        240
          atggagctgt caagtctgcg aagcgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttctacc        300
          ctgtgggtgt cagaattcga ttattgggga caggggaccc tggttacagt cagtagtgcc        360
          tctacaaaag gcccttcagt gtttccacta gctccctcct caaaatctac aagcggcggc        420
          acagccgcgc tcgggtgctt agtcaaggac tatttccctg agccagtgac tgtgagctgg        480
          aatagcgggg cccttacatc gggggttcac acattccccg ctgtcttgca aagcagtggt        540
          ttgtatagtt tgtcatcagt ggtcaccgtc cctagcagct ctttgggcac gcagacgtac        600
          atttgcaacg tgaatcataa gccatcgaac acaaaagttg ataaaaaggt tgaaccgaag        660
          tcctgtgaca aaacgcacac ctgtcccccg tgtcctgctc ccgaactttt gggtggtcct        720
          agtgtctttc ttttccctcc aaagcccaag gacacactga tgatttctcg gaccccagag        780
          gttacttgcg tagttgtaga cgtaagccac gaggatcctg aagtcaaatt taattggtac        840
          gtggacggag tcgaggtaca caatgctaag accaaacccc gcgaggaaca atacaattcc        900
          acttaccgcg tcgtttcggt gctgactgtg ctccatcagg actggctgaa cggcaaagaa        960
          tacaaatgca aggtaagcaa caaggccctc cccgccccaa tcgagaaaac catctccaag       1020
          gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tataccctcc cccccagccg agatgaactg       1080
          accaaaaacc aggtgagcct gacttgtctg gtgaagggat tttatcctag tgatatcgcc       1140
          gtggagtggg agtctaacgg acagcccgag aacaactata agaccacacc gcctgtcctt       1200
          gactccgacg gttctttctt cctgtacagc aagctcaccg tggacaagtc tcgatggcag       1260
          cagggcaatg tgttctcttg ctccgtgatg cacgaggcac tccataacca ctacacacag       1320
          aaaagcctct ctttgtcacc cggcaagggg agtgctggcg gctccggtgg agactcccag       1380
          atgcagctcg tgcagtccgg ggccgaggtg aagaagccag gctcctctgt aaaggtttcc       1440
          tgcaaagcca gcggtggaac ctttagctct tacgcatata gctgggttag acaagctcca       1500
          ggacagggcc ttgaatggat gggtggcata atcccctcgt ttggtactgc taactacgca       1560
          cagaagtttc agggccgcgt gactatcact gcagatgagt ccacgtccac tgcatatatg       1620
          gagctgtcaa gtctacggtc tgaagacacc gcagtgtact actgcgcccg cgggcctatc       1680
          gtggctacca taaccccact ggattattgg ggccaaggta cactagtgac agtctcctct       1740
          ggagggggtg ggtcaggcgg tgggggaagc ggcggaggtg gatcatctta tgtcctcacc       1800
          cagccaccat ccgtctcggt ggctcccggg aaaaccgcta cgattgcctg tgggggcgaa       1860
          aacatcggcc ggaagacagt tcactggtat cagcagaaac ctggccaggc cccagtgctt       1920
          gtgatctact acgattccga caggccaagt ggcatccccg agaggttttc aggatctaat       1980
          tctgggaata cagctactct gactattagc agagtcgaag ctggagatga agcggactac       2040
          tattgtctgg tatgggatag ttcctcagac catagaattt tcggtggagg cactaagtta       2100
          actgtgctgg gccaacctaa a                                                 2121
          <![CDATA[<210>    16]]>
          <![CDATA[<211>    648]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>   IMC-201的經密碼子優化之輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>    16]]>
          cagtccgccc tgacccagcc tgcatctgta agcggttccc caggccaaag tatctccata         60
          tcttgcactg gcactagttc tgacgtcggc ggccataact atgtctcatg gtaccagcag        120
          catccaggaa aagcccccaa gctcatgatc tatgatgtcc gcaacagacc gtctggggtg        180
          agcaaccgat ttagcgggag caaatccgga tccacggcat cattaacaat ttctggattg        240
          cagactgagg atgaagctga ctattactgt aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc        300
          ttcgggagcg ggacaaagct cacagtgctg ggccaaccca aagctgcgcc cagtgtaacc        360
          cttttccctc cctctagcga ggaactgcag gctaataaag ctaccctggt ttgcctcatc        420
          tcagattttt accccggcgc cgttaccgtg gcctggaagg cagacagctc acctgttaag        480
          gccggtgtgg agacaacaac ccctagcaag cagagcaaca ataaatacgc cgcatccagt        540
          tacctgtcac taactccaga acaatggaag tctcacaggt cctacagttg tcaggtgacg        600
          cacgagggaa gtacagtgga gaagactgtg gctccaaccg aatgctcg                     648
          <![CDATA[<210>    17]]>
          <![CDATA[<211>    7]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    17]]>
          Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            1               5        
          <![CDATA[<210>    18]]>
          <![CDATA[<211>    21]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<22]]>3>    IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR1]]&gt;
          <br/>
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;    18]]&gt;
          <br/><![CDATA[ggctatactt tcacaagcta t                                                   21
          <![CDATA[<210>    19]]>
          <![CDATA[<211>    6]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    19]]>
          Asn Pro Ser Gly Gly Ser
            1               5    
          <![CDATA[<210>    20]]>
          <![CDATA[<211>    18]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    20]]>
          aatcctagtg ggggatct                                                       18
          <![CDATA[<210>    21]]>
          <![CDATA[<211>    10]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的重鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    21]]>
          Ser Thr Leu Trp Val Ser Glu Phe Asp Tyr
            1               5                  10
          <![CDATA[<210>    22]]>
          <![CDATA[<211>    30]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的重鏈]]>可變區之CDR3
          <![CDATA[<400>    22]]>
          tctaccctgt gggtgtcaga attcgattat                                          30
          <![CDATA[<210>    23]]>
          <![CDATA[<211>    14]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    23]]>
          Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His Asn Tyr Val Ser
            1               5                  10                
          <![CDATA[<210>    ]]>24
          <![CDATA[<211>    42]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    24]]>
          actggcacta gttctgacgt cggcggccat aactatgtct ca                            42
          <![CDATA[<210>    25]]>
          <![CDATA[<211>    7]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    25]]>
          Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser
            1               5        
          <![CDATA[<210>    26]]>
          <![CDATA[<211>    21]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    26]]>
          gatgtccgca acagaccgtc t                                                   21
          <![CDATA[<210>    27]]>
          <![CDATA[<211>    10]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    27]]>
          Asn Ser Tyr Thr Gly Ser Arg Thr Tyr Val
            1               5                  10
          <![CDATA[<210>    28]]>
          <![CDATA[<211>    30]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第一結構域的輕鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    28]]>
          aattcctata ccggttcgcg gacctatgtc                                          30
          <![CDATA[<210>    29]]>
          <![CDATA[<211>    5]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    29]]>
          Ser Tyr Ala Tyr Ser
            1               5
          <![CDATA[<210>    30]]>
          <![CDATA[<211>    15]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    30]]>
          tcttacgcat atagc                                                          15
          <![CDATA[<210>    31]]>
          <![CDATA[<211>    16]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    31]]>
          Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
            1               5                  10                  15 
          <![CDATA[<210>    32]]>
          <![CDATA[<211>    48]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    32]]>
          ggcataatcc cctcgtttgg tactgctaac tacgcacaga agtttcag                      48
          <![CDATA[<210>    33]]>
          <![CDATA[<211>    12]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    33]]>
          Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr
            1               5                  10        
          <![CDATA[<210>    34]]>
          <![CDATA[<211>    36]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的重鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    34]]>
          gggcctatcg tggctaccat aaccccactg gattat                                   36
          <![CDATA[<210>    35]]>
          <![CDATA[<211>    11]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    35]]>
          Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His
            1               5                  10    
          <![CDATA[<210>    36]]>
          <![CDATA[<211>    33]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR1]]>
          <![CDATA[<400>    36]]>
          gggggcgaaa acatcggccg gaagacagtt cac                                      33
          <![CDATA[<210>    37]]>
          <![CDATA[<211>    7]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    37]]>
          Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser
            1               5        
          <![CDATA[<210>    38]]>
          <![CDATA[<211>    21]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR2]]>
          <![CDATA[<400>    38]]>
          tacgattccg acaggccaag t                                                   21
          <![CDATA[<210>    39]]>
          <![CDATA[<211>    11]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    39]]>
          Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile
            1               5                  10    
          <![CDATA[<210>    40]]>
          <![CDATA[<211>    33]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    IMC-201中之第二結構域的輕鏈可變區之CDR3]]>
          <![CDATA[<400>    40]]>
          ctggtatggg atagttcctc agaccataga att                                      33

Claims

一種雙特異性抗體，包含與CD47特異性結合的第一抗原結合結構域及與PD-L1特異性結合的第二抗原結合結構域，其中，該第一抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列17的胺基酸序列的CDR1；包含序列19的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列21的胺基酸序列的CDR3，且該輕鏈可變區包含：包含序列23的胺基酸序列的CDR1；包含序列25的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列27的胺基酸序列的CDR3，且該第二抗原結合結構域包含重鏈可變區與輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列29的胺基酸序列的CDR1；包含序列31的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列33的胺基酸序列的CDR3，且該輕鏈可變區包含：包含序列35的胺基酸序列的CDR1；包含序列37的胺基酸序列的CDR2；以及包含序列39的胺基酸序列的CDR3。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該第一抗原結合結構域包含序列1的重鏈可變區及序列3的輕鏈可變區。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該第二抗原結合結構域包含： (i)序列5的重鏈可變區及序列7的輕鏈可變區；或者 (ii)序列9的單鏈可變片段(scFv)。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含： FC區域；包含與CD47特異性結合的抗原結合結構域的第一抗體片段；以及包含與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的第二抗體片段。
如請求項4之雙特異性抗體，其中，該第一抗體片段為Fab片段，該第二抗體片段為單鏈可變片段(scFv)。
如請求項4之雙特異性抗體，其中，該第二抗體片段通過肽連接子與該Fc區域的C-末端融合。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含： Fc區域；包含與CD47特異性結合的抗原結合結構域的兩個Fab片段；以及包含與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的兩個scFv片段。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含含有與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的單鏈可變片段(scFv)。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含含有與CD47特異性結合的抗原結合結構域的Fab片段。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含源自IgG1的重鏈恆定區(CH)的Fc區域。
如請求項10之雙特異性抗體，其中，該Fc區域包含源自IgG1的重鏈恆定區CH1、CH2及CH3，CH3以序列11為基準包含E239D及M241L的胺基酸取代。
如請求項10之雙特異性抗體，其中，該Fc區域通過作用於效應細胞(effector cell)來顯出免疫活化效果。
如請求項10之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含含有該與PD-L1特異性結合的抗原結合結構域的抗體片段，該抗體片段通過肽連接子與該Fc區域的C-末端融合。
如請求項8之雙特異性抗體，其中，該單鏈可變片段(scFv)包含序列9的胺基酸序列。
如請求項10之雙特異性抗體，其中，該Fc區域包含序列11的胺基酸序列。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體與表現PD-L1、CD47或者兩者都表現的癌細胞特異性結合。
如請求項1之雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體用於預防或治療選自由乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤組成的組中的癌。
一種用於預防或治療癌症的藥物組合物，其中，包含請求項1至17中任一項之雙特異性抗體。
如請求項18之藥物組合物，其中，該癌症選自由卵巢癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髓瘤、神經母細胞-誘導的中樞神經系統腫瘤、單核細胞白血病、B-細胞誘導的白血病、T-細胞誘導的白血病、B-細胞誘導的淋巴瘤、T-細胞誘導的淋巴瘤及肥大細胞誘導的腫瘤組成的組中。
如請求項18之藥物組合物，其中，該癌症選自由乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤組成的組中。
一種用於抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物，其中，包含請求項1至17中任一項之雙特異性抗體。
如請求項18之藥物組合物，其中，該雙特異性抗體與化學療法、放射線療法和/或其他免疫療法一同使用或聯合給藥。
一種雙特異性抗體的用途，其中，該雙特異性抗體為請求項1至17中任一項之雙特異性抗體，該雙特異性抗體用於預防或治療包括乳癌、肺癌、B-細胞誘導的淋巴瘤及T-細胞誘導的淋巴瘤在內的多種癌。
一種預防或治療癌症的方法，其中，包括向需要預防或治療癌症的對象給藥有效量的請求項1至17中任一項之雙特異性抗體。
一種在對象中抑制腫瘤細胞生長的方法，其中，包括向具有腫瘤細胞的對象給藥有效量的請求項1至17中任一項之雙特異性抗體。
一種多核苷酸，其中，編碼請求項1至17中任一項之雙特異性抗體。
一種宿主細胞，其中，包含請求項26之多核苷酸。
一種製備雙特異性抗體的方法，該雙特異性抗體為請求項1至17中任一項之雙特異性抗體，其中，包括：在適於該雙特異性抗體表現的條件下培養請求項27之宿主細胞；以及從培養物中回收該雙特異性抗體。