CN117396226A - 包含t细胞重定向治疗剂和抗cd44治疗剂的组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂，并且公开了其用于杀死癌细胞的用途。

Description

包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月18日提交的美国临时申请63/189,737的权益，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及利用T细胞重定向治疗剂的组合物和癌症治疗。

以电子方式提交的参考序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。创建于2022年2月28日的所述ASCII副本命名为JBI6553WOPCT1_SeqListing.txt并且大小为24,576字节。

背景技术

尽管有多种治疗方案，但目前还没有治愈急性髓性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)的方法。即使达到较高(50％-80％)的完全血液学缓解(CR)，定义为骨髓(BM)中存在≤5％的白血病细胞(AML)或浆细胞(MM)(1,2)，大多数AML或MM患者仍会复发(3-5)。复发与微小残留病变(MRD)有关，即少量的癌症干细胞(CSC)或其他恶性祖细胞未能被清除，甚至在治疗后仍然存在(6)。需要找到更好的策略来防止复发和寻找AML和MM的治愈方法以消除MRD。

与造血干细胞(HSC)一样，AML和MM中的癌症干细胞(CSC)存在并且优先持续存在于BM生态位中(7,8)。BM生态位通过分泌可溶性生长因子和细胞与细胞之间的相互作用来提供一专门的微环境，其对造血干细胞有保护作用(9)。此外，BM生态位具有免疫抑制作用，并且被认为是稳态下的免疫赦免位点，以允许正常的造血和免疫细胞生成(10)。BM生态位的这些方面提供了抵抗和最小化多种抗癌药物功效的抗性，包括化疗、靶向小分子抑制剂和基于抗体的疗法(11-14)。

T细胞能够特异性地裂解肿瘤细胞，并分泌细胞因子来积聚和提升对癌症的免疫力，这使得它们成为一种有吸引力的治疗选项。已经有若干种方法开始利用该策略，诸如双特异性T细胞啮合剂(小型双特异性生物制剂)、嵌合抗原受体(CARs)和双特异性抗体等(15)。双特异性T细胞啮合剂和抗体介导的重定向通过接触肿瘤细胞上的特定表位和T细胞上的CD3使T细胞与肿瘤细胞交联，导致T细胞被激活，并分泌穿孔素和颗粒酶，最终杀死肿瘤细胞。随着CD19×CD3(blinatumomab)被批准用于治疗急性淋巴细胞性淋巴瘤(ALL)，这些CD3重定向疗法已被验证为临床上有效的抗癌策略(16)。然而，BM生态位的免疫抑制和保护性质可能对T细胞重定向疗法构成重大障碍。

例如，如本文所示，使用针对特定肿瘤抗原(CD123)和CD3的双特异性抗体，观察到AML细胞系与BM基质细胞的共同培养，其在体外显著保护了癌细胞免受双特异性T细胞介导的裂解。CD3重定向细胞毒性受损与T细胞效应反应减少有关，从而提供了一种解释双特异性抗体活性丧失的机制。

发明内容

本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂，其中，所述T细胞重定向治疗剂包括免疫特异性地结合T细胞表面抗原的第一结合区和免疫特异性地结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结合区。

在该药物组合物的一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原是CD3。

在该药物组合物的另一个实施方案中，肿瘤相关抗原(TAA)选自由CD123、BCMA、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是CD123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。在一个实施方案中，CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中HC1和LC1配对以形成第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成第二抗原结合位点。在一个实施方案中，HC1包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，LC1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，HC2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且LC2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。在一个实施方案中，BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中HC1和LC1配对以形成第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成第二抗原结合位点。在一个实施方案中，HC1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，LC1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，HC2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且LC2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在该药物组合物的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂是抗CD44抗体或其抗原结合片段。

在该药物组合物的另一个实施方案中，抗CD44抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂是CD44拮抗剂。

在该药物组合物的另一个实施方案中，组合物还包含VLA-4粘附途径抑制剂。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

在该药物组合物的另一个实施方案中，抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4拮抗剂选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组。

本文还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如上文提供的药物组合物。

在该方法的一个实施方案中，受试者患有新诊断的癌症。

在该方法的另一个实施方案中，受试者对于先前的抗癌疗法具有复发性或难治性。

在该方法的另一个实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

在该方法的另一个实施方案中，受试者患有AML或MM。

在该方法的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂同时或依次施用。

在该方法的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

在该方法的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

在该方法的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

在该方法的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

在该方法的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

在该方法的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

在该方法的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂在施用VLA-4粘附途径抑制剂之前施用。

在该方法的另一个实施方案中，抗CD44治疗剂在施用VLA-4粘附途径抑制剂之后施用。

本文进一步提供了一种包含如上文提供的药物组合物的试剂盒。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本申请的实施方案和详细描述。然而，应当理解，本发明并不限于本文所公开的精确叙述。

图1A和图1B是示出当人T细胞(8×10⁴个细胞/孔)与CFSE标记的KG-1或HL-60(4×10⁴个细胞/孔)在不存在(正方形)或存在(黑色圆圈)基质细胞(4×10⁴个细胞/孔)的情况下共培养时细胞毒性和T细胞活化速率的图。以100nM(15μg/mL)开始并稀释10倍至每个后续剂量的条件，在剂量反应中添加CD123×CD3双特异性抗体48小时(共培养后24小时)。通过计算死亡的CFSE⁺靶细胞的百分比来评估细胞毒性(图1A)，其通过流式细胞术进行定量。T细胞活化(图1B)以活CD45⁺/CD3⁺/CD25⁺T细胞的百分比进行评估。将3个单独的T细胞供体的剂量滴定作图，并用4参数非线性回归曲线拟合进行分析。在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试了3个健康供体的T细胞。将平均值±SD作图，代表两个实验。MSC：间充质干细胞。

图2是示出当BM基质细胞与KG-1细胞共培养时由CD123×CD3双特异性抗体介导的分泌的细胞因子的变化的柱状图。在MAP试剂盒中评估来自与KG-1细胞的72小时共培养测定的上清液中的人细胞因子IL-1β(a.)、IL-1ra(b.)、IL-2(c.)、IL-3(d.)、TNF-α(e.)、IFN-γ(f.)以及趋化因子G-CSF(g.)和VEGF(h.)。条件包括KG-1细胞+T细胞(“无基质”)或KG-1细胞+T细胞+BM基质细胞(“BM基质”)。合并来自两次实验的每个T细胞供体的上清液，一式两份，并以平均值±SD作图。

图3是示出当BM基质细胞与HL-60细胞共培养时由CD123×CD3双特异性抗体介导的分泌的细胞因子的变化的柱状图。在MAP试剂盒中评估来自与HL-60细胞的72小时共培养测定的上清液中的人细胞因子IL-1β(a.)、IL-1ra(b.)、IL-2(c.)、IL-3(d.)、TNF-α(e.)、IFN-γ(f.)以及趋化因子G-CSF(g.)和VEGF(h.)。条件包括KG-1细胞+T细胞(“无基质”)或KG-1细胞+T细胞+BM基质细胞(“BM基质”)。合并来自两次实验的每个T细胞供体的上清液，一式两份，并以平均值±SD作图。

图4A和图4B是示出CD44在AML和HS-5基质细胞上表达并且在原发性AML患者样品上显著增加的图。(图4A)通过流式细胞术评估AML细胞系和HS-5基质细胞的细胞表面标志物以确认CD44、CD123、VLA-4、VLA-5、CXCR4、FLT3和CD3抗原用作阴性对照。顶部：未染色；中间：同种型；底部：染色。(图4B)公共数据集(GSE15061)的生物信息学分析显示在AML、MDS和非白血病骨髓样品(正常)上的表达。mRNA表达以log₂标度绘制在y轴上(AML，n＝202；MDS，n＝164，正常，n＝69)。采用Tukey多重比较检验(α＝0.05)进行单向ANOVA以比较各组，****p<0.0001；ns，没有显著差异。图4A代表3次实验重复。

图5是示出CD123×CD3双特异性抗体对杀伤的基质介导的抑制被抗CD44抗体恢复的图。将人T细胞(80,000个细胞/孔)与CFSE标记的AML(KG-1、HL-60、MV4-11、MOLM-13、SKNO-1)和带有抗CD44(20μg/mL)的HS-5基质细胞(40,000个细胞/孔；黑线)共培养。24小时后，在剂量反应中添加CD123×CD3双特异性抗体，从100nM(15μg/mL)开始并稀释10倍以用于后续剂量，再持续48小时。通过计算死亡CFSE⁺靶细胞的百分比来评估细胞毒性；T细胞活化以CD25⁺和PD-1⁺T细胞的百分比进行评估，并通过流式细胞术进行定量。在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试了3个健康供体的T细胞。将平均值±SD作图，并且是至少三次或更多次实验的代表性图。NS＝无基质。

图6是示出CD44、VLA-4和CXCR-4在KG-1细胞、T细胞和基质细胞上表达的图。通过流式细胞术评估KG-1细胞、T细胞、原代骨髓(BM)基质细胞和HS-5基质细胞的细胞表面标志物，以评估CD44、VLA-4和CXCR4表达。基质细胞系表达非常高水平的CD44，而KG-1和T细胞上表达的水平适度较低。在所有测试的细胞中观察到均一水平的VLA-4。CXCR4在KG-1细胞上以较低水平表达，而在T细胞和基质细胞上以较高水平表达。显示的数据代表2次实验重复。顶部：同种型；底部：染色。

图7是示出在与KG-1细胞共培养中的CD123×CD3双特异性抗体的HS-5基质介导的抑制被抗CD44抗体恢复的图。在MAP试剂盒中评估72小时共培养测定的上清液中的人细胞因子IL-2、IL-3、TNF-α、IFN-γ。条件包括KG-1细胞+T细胞(无基质)+/-抗CD44抗体或KG-1细胞+T细胞+HS-5基质细胞+/-抗CD44抗体，或单独的细胞。合并来自两次实验的每个T细胞供体的上清液，一式两份，并以平均值±SD作图。

图8是示出在KG-1和HS-5CD44 KO细胞系中检测不到CD44的图。CD44从KG-1和HS-5基质细胞系中敲除，并通过有限稀释产生克隆群体。通过流式细胞术评估细胞的细胞表面标志物，以确认CD44的敲除，并且其他细胞表面标志物CD123、VLA-4、VLA-5、CXCR4和FLT3未改变。CD3抗原用作阴性对照。数据代表3次实验。顶部：未染色；中间：同种型；底部：染色。

图9是示出阻断KG-1和HS-5细胞中的CD44恢复了CD123×CD3双特异性抗体对细胞毒性和T细胞活化的基质介导的抑制的图。在不存在或存在带有抗CD44抗体(20μg/mL)的HS-5^wt或HS-5^CD44KO基质细胞(4×10⁴个细胞/孔)的情况下，将人T细胞(8×10⁴个细胞/孔)与CFSE标记的AML(KG-1^wt或KG-1^CD44KO)共培养。24小时后，添加0.001nM(0.045μg/mL)的CD123×CD3双特异性抗体，再持续24小时。通过计算死亡CFSE⁺靶细胞的百分比来评估细胞毒性；T细胞活化以CD25⁺T细胞的百分比进行评估，并通过流式细胞术进行定量。将平均值±SD作图，并且是两个实验的代表性图。与HS-5细胞培养的KG-1细胞证实了在实验中观察到的最大抑制。在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试了3个健康供体的T细胞。将平均值±SD作图，并且是两个实验的代表性图。

图10是示出阻断CD44增强颗粒酶B水平并增加PD-1表达的图。将人T细胞(8×10⁴个细胞/孔)与CFSE标记的AML(KG-1^wt或KG-1^CD44KO)和带有抗CD44(20μg/mL)的HS-5^wt或HS-5^CD44KO基质细胞(4×10⁴个细胞/孔)共培养。24小时后，添加0.001nM(0.045μg/mL)的CD123×CD3，再持续24小时。T细胞中的颗粒酶B水平以及T细胞早期活化以PD-1⁺T细胞的百分比进行评估，并通过流式细胞术进行定量。在T细胞重定向测定中用指定细胞系测试了3个健康供体的T细胞。将平均值±SD作图，并且是至少两次或更多次实验的代表性图。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均关于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同方案。此类等同方案旨在由本发明所涵盖。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。

字词“右”、“左”、“下”和“上”指定附图中的方向，以此作为参照。

还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。

如本文所用，术语“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果该组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染或转导的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染或转导的细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。

本文所使用的术语“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。根据重链恒定结构域氨基酸序列，每个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，按以下顺序从氨基-羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，免疫球蛋白可分配到五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体中获得的抗体，即，除了可能熟知的改变(诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。

如本文所用的术语“人类抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。因为用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，所以体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人类抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公开号WO2009/085462中描述的)。“人抗体”的定义中不包括至少一个CDR源自非人物种的抗体。

本文所使用的术语“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人类物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。

术语“分离的抗体”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的抗体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。

本文所使用的术语“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指免疫球蛋白分子的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程改造的多肽，并且含有VH、VL、VH和VL、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、驼峰化VH结构域、由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047。

术语“双特异性”是指特异性地结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca cynomolgus)(cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。

本文所使用的术语“多特异性”是指特异性结合地至少两个不同抗原或同一抗原内的至少两个不同表位的抗体。多特异性抗体可结合例如两个、三个、四个或五个不同抗原或同一抗原内的不同表位。

当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性结合”或“免疫特异性结合”或其衍生术语表示通过由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样品中的其他分子。通常，抗体与同源抗原结合的K_d小于约1×10^-8M，其为通过表面等离子体共振试验或细胞结合试验测得。

术语“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。

本文所使用的术语“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。

本文所使用的术语“增强”或“增强的”是指当与对照分子相比时一种测试分子的一种或多种功能增强，或当与一个或多个对照分子相比时测试分子组合的一种或多种功能增强。可测量的示例性功能是肿瘤细胞杀死、T细胞活化、相对或绝对T细胞数、Fc介导的效应功能(例如ADCC、CDC和/或ADCP)或与Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。“增强的”可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的增强，或统计意义上显著的增强。

本文所使用的术语“突变”是指与参考序列相比，多肽或多核苷酸序列中工程化或天然存在的改变。该改变可以是一个或多个氨基酸或多核苷酸的置换、插入或缺失。

本文所使用的术语“非固定组合”是指在非特定间隔时间限制下同时、并行或顺序地作为独立实体施用的T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的单独药物组合，其中此类施用在受试者体内提供有效水平的两种化合物。

本文所使用的术语“药物组合物”是指包含活性成分和药学上可接受的载体的组合物。

本文所使用的术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是指药物组合物中除活性成分之外的成分，该成分对受试者无毒。

本文所使用的术语“重组体”是指当将来自不同来源的片段连接以产生重组DNA、抗体或蛋白质时，通过重组手段制备、表达、形成或分离的DNA、抗体和其他蛋白质。

本文所使用的术语“降低”或“降低的”是指当与一种或多种对照分子相比时，与对照分子或测试分子的组合相比，测试分子的一种或多种功能的降低。可测量的示例性功能是肿瘤细胞杀死、T细胞活化、相对或绝对T细胞数、Fc介导的效应功能(例如ADCC、CDC和/或ADCP)或与Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。“降低的”可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的降低，或统计意义上显著的降低。

本文所使用的术语“难治性”是指不适于外科手术干预并且初始对治疗无响应的癌症。

本文所使用的术语“复发性”是指对治疗反应但然后返回的癌症。

本文所使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物，“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另外指出，术语“患者”或“受试者”可互换使用。

本文所使用的术语“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效的治疗剂或治疗剂的组合的示例性指标包括例如改善患者的健康。

本文所使用的术语“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或障碍的个体以及易患病症或障碍的个体或者要预防病症或障碍的个体。

本文所使用的术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。

T细胞重定向治疗剂

本文公开的T细胞重定向治疗剂(在本申请中也被称为“T细胞重定向双特异性抗体”或“双特异性抗体”)是指包含两个或更多个结合区的分子，其中结合区中的一个结合区特异性地结合靶细胞或组织上的细胞表面抗原(诸如肿瘤相关抗原(TAA))，并且其中该分子的第二结合区特异性地结合T细胞表面抗原(诸如CD3)。这种双靶/多靶结合能力将T细胞募集到靶细胞或组织，从而根除靶细胞或组织。

本文使用的T细胞重定向治疗剂可以是抗体、抗体衍生的蛋白质，或例如表现出抗原结合位点的重组蛋白。在一个实施方案中，本文使用的T细胞重定向治疗剂是双特异性抗体，包括“整个”抗体，诸如整个IgG或IgG样分子，以及小型重组形式，诸如串联单链可变片段分子(taFvs)、双价抗体(Dbs)、单链双价抗体(scDbs)及其各种其他衍生物(参见：ByrneH.等人(2013)Trends Biotech,31(11):621-632所述的双特异性抗体形式，其中图2显示各种双特异性抗体格式；Weidle U.H.等人(2013)Cancer Genomics and Proteomics 10:1-18，特别地图1显示各种双特异性抗体格式；以及Chan,A.C.和Carter,P.J.(2010)Nat RevImmu 10:301-316，其中图3显示各种双特异性抗体形式)。双特异性抗体格式的示例包括但不限于：四价体瘤、化学耦合Fab(片段抗原结合)和(双特异性T细胞吞噬者)。

在一个实施方案中，本文使用的双特异性抗体可选自包括以下项的组：Triomab；混合杂交瘤(四价体瘤)；多特异性anticalin平台(Pieris)；双价抗体(Diabodies)；单链双价抗体；串联单链Fv片段；TandAbs，三特异性抗体(Affimed)(105-110kDa)；Darts(双亲和重靶向；Macrogenics)；双特异性Xmabs(Xencor)；双特异性T细胞衔接子(Bites；Amgen；55kDa)；三重抗体(Triplebodies)；三价抗体(Tribody)＝Fab-scFv融合蛋白(CreativeBiolabs)多功能重组抗体衍生物(110kDa)；Duobody平台(Genmab)；Dock和lock平台；Knob into hole(KIH)平台；人源化双特异性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Mab2双特异性抗体(F-Star)；DVD-Ig＝双可变域免疫球蛋白(Abbvie)；kappa-lambda体；四价双特异性串联Ig；和CrossMab。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性IgG样抗体(BsIgG)，其包括CrossMab；DAF(二合一(two-in-one))；DAF(四合一(four-in-one))；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes common LC；Knobs-in-holes assembly；电荷对；Fab-arm交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-body；和Orthogonal Fab。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)MolecularImmunology 67:95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自附有IgG的抗体，其额外的抗原结合分子包括DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；和DVI-IgG(四合一(four-in-one))。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性抗体片段，其包括Nanobody；Nanobody-HAS；BiTE；Diabody；DART；TandAb；scDiabody；sc-Diabody-CH3；Diabody-CH3；Triple Body；Miniantibody；Minibody；TriBi minibody；scFv-CH3 KIH；Fab-scFv；scFv-CH-CL-scFv；F(ab’)2；F(ab’)2-scFv2；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；Tetravalent HCAb；scDiabody-Fc；Diabody-Fc；Tandem scFv-Fc；和Intrabody。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性融合蛋白，其包括Dock and Lock；ImmTAC；HSAbody；scDiabody-HAS；和Tandem scFv-Toxin。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性抗体缀合物，其包括IgG-IgG；Cov-X-Body；和scFv1-PEG-scFv2。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可基于任意免疫球蛋白类(例如，IgA、IgG、IgM等)和亚类(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)。在一方面，本文所使用的双特异性抗体可具有IgG样形式(基于IgG，也称为“IgG类型”)，其通常包括两条重链和两条轻链。具有IgG样格式的抗体的示例包括四价体瘤和各种IgG-scFv格式(参见：ByrneH.等人(2013)Trends Biotech,31(11):621-632；FIG.2A-2E)，其中优选四价体瘤，其优选地通过两种不同杂交瘤的融合产生。在IgG类中，双特异性抗体可基于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体是IgG样抗体形式，其包括例如混合杂交瘤(四价体瘤)、具有共同轻链的knobs-into-holes、各种IgG-scFv形格式、各种scFv-IgG格式、二合一(two-in-one)IgG、双V域IgG、IgG-V和V-IgG，其例如在Chan,A.C.和Carter,P.J.(2010)Nat Rev Immu 10:301-316的图3c中示出并且在所述文章中描述。另外的示例性双特异性IgG样抗体格式包括例如DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv和Fv2-Fc，其在Weidle U.H.等人(2013)Cancer Genomics andProteomics 10:1-18的图1A中示出并在所述文章中描述。更进一步的示例性双特异性IgG样抗体格式包括DAF(二合一(two-in-one))；DAF(四合一(four-in-one))；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes assembly；电荷对；Fab-arm交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-body；Orthogonal Fab；DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；以及DVI-IgG(四合一(four-in-one)，如在例如Spiess C.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1和对应描述(例如，第95-101页)中所示和所描述的(四合一(four-in-one))。

例如，双特异性抗体可通过三种不同方法产生：(i)化学缀合，其涉及化学交联；(ii)两种不同杂交瘤细胞系的融合；或(iii)涉及重组DNA技术的遗传方法。两个不同的杂交瘤融合产生一个混合杂交瘤(或“四价体瘤”)，其分泌包括双特异性分子的异质性抗体群。替代方法包括两个不同的mAb和/或更小的抗体片段的化学缀合。将两个不同的抗体或抗体片段连接起来的氧化再结合策略被视作低效，因为在多个本地二硫键的再氧化过程中存在副反应。当前用于化学缀合的方法主要是使用同源或异源双功能交联试剂。通过对基因的人工操作，重组DNA技术已经产出最大范围的双特异性抗体，并且代表了用于产生双特异性抗体的最多样化的方法(在过去二十年中有45种格式；参见Byrne H.等人(2013)Trends Biotech,31(11):621-632)。

特别是通过使用这种重组DNA技术，最近也出现了多种进一步的多特异性抗体。术语“多特异性抗体”是指具有一个以上的补位并能与两个或多个不同表位结合的蛋白质。因此，术语“多特异性抗体”包括如上定义的双特异性抗体，但通常也包括蛋白质，如抗体，支架，特别是与三个或更多不同的表位结合，即具有三个或更多补位的抗体。这种多特异性蛋白，特别是具有三个或更多补位的蛋白，通常通过重组DNA技术来实现。在本发明的背景下，该抗体可特别具有两个以上的特异性，因此具有两个以上的补位，因为根据本发明至少需要两个补位，例如一个用于靶细胞，另一个用于T细胞。因此，根据本发明，除了两个补位之外，使用的抗体可具有另外的补位，特别是与进一步的特异性有关的补位。因此，本发明还包括多特异性抗体。因此应当理解，本发明不局限于双特异性抗体，尽管这里特别提到了代表最低要求的双特异性抗体。因此，本文所述的关于双特异性抗体的内容也可适用于多特异性抗体。

如上文所定义的双特异性抗体和多特异性抗体，能够针对在疾病过程中起关键作用的靶细胞来重定向效应细胞。特别地，本文使用的T细胞重定向双特异性抗体可以例如与T细胞受体(TCR)复合物结合，并将T细胞“重定向”到靶细胞，诸如例如肿瘤细胞。为此，本文使用的这种双特异性抗体通常具有至少一个特异性，例如至少一个补位，用于募集T细胞，该补位对T细胞具有特异性，优选地对于T细胞表面抗原具有特异性，例如CD3，以及至少一个其他特异性，例如至少一个补位，用于将T细胞引导到肿瘤细胞，该补位对肿瘤细胞具有特异性，优选地对肿瘤细胞上的TAA具有特异性。通过T细胞重定向双特异性抗体将T细胞“重定向”到肿瘤细胞，通常会导致由T细胞介导的对肿瘤细胞的杀死。

在一个实施方案中，本文所使用的T细胞重定向治疗剂包括对T细胞表面抗原具有特异性的第一结合区和对肿瘤细胞上TAA局域特异性的第二结合区。

在又一实施方案中，T细胞表面抗原可选自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C。或者，T细胞表面抗原是CD3。

在另一个实施方案中，TAA可选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD10、CD21、CD22、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD52、CD133、ROR1、B7-H6、B7-H3、HM1.24、SLAMF7、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3、CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2、Her3、IGFR、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白、卷曲蛋白1-10、VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8或Tie2。肿瘤细胞上的其他示例性TAA包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、de2-7、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关的细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)、hK2、TAG-72或肿瘤细胞新抗原。或者，TAA可选自BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7。或者，TAA可选自BCMA或CD123。或者，TAA可以是CD123。

在一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是一种CD123×CD3双特异性抗体，其能免疫特异性地与CD123⁺AML细胞和CD3 T细胞结合。CD123×CD3双特异性抗体可为US9,850,310中公开的双特异性抗体，其全部内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，CD123×CD3抗体包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LC2，其中HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

在一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是一种BCMA×CD3双特异性抗体，其能免疫特异性地与BCMA⁺MM细胞和CD3 T细胞结合。BCMA×CD3双特异性抗体可选自WO2007117600、WO2009132058、WO2012066058、WO2012143498、WO2013072406、WO2013072415、WO2014122144和US10,072,088中公开的抗体，其全部内容以引用方式并入本文。

在一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其包括具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一重链(HC1)、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第一轻链(LC1)、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第二重链(HC2)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的第二轻链(LC2)，其中HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

抗CD44治疗剂

CD44抗原是参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。在人类中，CD44抗原由11号染色体上的CD44基因编码。CD44已被证明有助于造血干细胞(HSC)和白血病干细胞(LSC)的粘附性质(参见例如Schroeder等人，“mesenchymal Stromal Cells inMyeloid Malignancies”,Blood Research，第51卷第4期，2016年12月和Pleyer等人，“Mesenchymal Stem and Progenitor Cells in Normal and DysplasticHematopoiesis–Masters of Survival and Clonality”,Int.J.Mol.Sci.2016,17,1009)。在AML中，CD44在AML母细胞和LSC上被上调并且通过多种途径用作存活信号(参见例如Gul-Uludag等人，“Polymeric nanoparticle-mediated silencing of CD44 receptor inCD34+acute myeloid leukemia cells”,Leukemia research.2014；38(11):1299-1308；Garg等人，“Antigen expression on a putative leukemic stem cell population andAML blast”,Int J Hematol.2016；103(5):567-571；Chen等人，“Bone marrow stromalcells protect acute myeloid leukemia cells from anti-CD44 therapy partlythrough regulating PI3K/Akt-p27(Kip1)axis”,Mol Carcinog.2015；54(12):1678-1685；以及Gadhoum等人，“Anti-CD44 antibodies inhibit both mTORC1 and mTORC2:anew rationale supporting CD44-induced AML differentiation therapy”,Leukemia.2016；30(12):2397-2401)。并且如下文实施例部分中所提供的，CD44蛋白在各种AML细胞系中一致地表达(图4A)。还评估了原代AML细胞(n＝202)中的CD44 mRNA表达，并且与骨髓增生异常综合征(MDS；n＝164)和正常对照(n＝69；图4B)相比观察到显著上调。这与CD44表达可能在从MDS到AML疾病的疾病进展中发挥重要作用的观点一致。

本文可使用任何合适的抗CD44治疗剂，包括但不限于所公开的抗CD44抗体或源自其的CD44结合片段、CD44拮抗剂等。

在一个实施方案中，本文使用的抗CD44治疗剂可以是抗CD44抗体或源自其的CD44结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；并且由一条重链和一条轻链组成的二聚体也在本文考虑之列。此类抗体片段可通过化学方法生产，例如通过用蛋白酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶来裂解完整的抗体，或经由重组DNA技术生产，例如通过使用用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞。重链和轻链单体类似地可通过用还原剂诸如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇处理完整的抗体，或通过使用用DNA编码期望重链或轻链或这两者(或者诸如其单克隆抗体或抗体片段)而转化的宿主细胞来生产。

本文可以使用能够阻断CD44功能性的任何合适的抗CD44抗体或CD44结合片段，其包括但不限于RG7356、抗CD44 ab克隆A3D8、抗CD44 ab克隆H90、抗CD44 ab克隆515。合适的抗CD44抗体还可选自US7361347、US20140308301、US20070237761、US20090004103、US20100092484和US20050214283中公开的那些。

VLA-4粘附途径抑制剂

极迟抗原-4(VLA-4)，也被称为α4β1，是细胞表面受体β1整合素家族的成员。VLA-4包含一条α4链和一条β1链，并且参与细胞与细胞之间的相互作用。其表达主要限于淋巴细胞和骨髓细胞。它在细胞粘附中起关键作用。研究还表明，VLA-4在介导BM中AML/MM-基质的相互作用中起重要作用。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)(由成骨细胞和内皮细胞表达)和纤连蛋白(细胞外基质的组成部分)是VLA-4的两个配体。

本文所使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的任何分子。

例如，本文使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是抗VLA-4抗体或源自其的VLA-4结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；并且由一条重链和一条轻链组成的二聚体也在本文考虑之列。此类抗体片段可通过化学方法生产，例如通过用蛋白酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶来裂解完整的抗体，或经由重组DNA技术生产，例如通过使用用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞。重链和轻链单体类似地可通过用还原剂诸如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇处理完整的抗体，或通过使用用DNA编码期望重链或轻链或这两者(或者诸如其单克隆抗体或抗体片段)而转化的宿主细胞来生产。

能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的任何合适的抗VLA-4抗体或VLA-4结合片段都可在本文中使用，其包括但不限于那他珠单抗(natalizumab)和那些在美国专利号6,602,503和美国专利申请公开号US20140161794A1中公开的抗体，其全部内容以引用方式并入本文。

在某些实施方案中，本文所使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的VLA-4拮抗剂。本文所使用的示例性VLA-4拮抗剂包括但不限于来自Tocris Bioscience的VLA-4拮抗剂(例如BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035)。

由于VCAM-1和纤连蛋白是VLA-4的配体，VLA-4粘附途径抑制剂也可包括VCAM-1或纤连蛋白的拮抗剂(包括抗体)。

药物组合物

本文还公开了包括如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的抗CD44治疗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞以及包含它们的组合物还可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。在某些实施方案中，药物组合物是包含如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的抗CD44治疗剂和药学上可接受的载体的独立组合物。在其他实施方案中，药物组合物不是包含如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的抗CD44治疗剂和药学上可接受的载体的独立组合物。

在一个实施方案中，本文公开的药物组合物还可包含如上文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。在一个方面，药物组合物是包含T细胞重定向治疗剂、抗CD44治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的独立组合物。在另一方面，药物组合物是包含第一组合物和第二组合物的独立组合物，该第一组合物包含T细胞重定向治疗剂，并且该第二组合物包含抗CD44治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂。在另一方面，药物组合物不是独立组合物，并且药物组合物包含T细胞重定向治疗剂、抗CD44治疗剂、VLA-4粘附途径抑制剂和药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据具体实施方案，根据本公开，适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。

药物活性成分与药学上可接受的载体的制剂为本领域中已知的，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。

在本公开的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。

在一个实施方案中，药物组合物可被配制为可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。注射可以例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送。

在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。

使用方法

在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、抗CD44治疗剂的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物还可包含如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。

在另一个一般方面，本发明涉及一种杀死癌细胞的方法，该方法包括让癌细胞接受包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂的组合物。在一个实施方案中，药物组合物还可包含如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。

受试者可能患有新诊断的癌症或者在经过先前的抗癌疗法后是复发性的或难治性的。癌症可以是血液恶性肿瘤或实体瘤。

根据本发明的实施方案，药物组合物包含治疗有效量的如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、抗CD44治疗剂和任选的VLA-4粘附途径抑制剂。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。

如本文参考T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂所用，治疗有效量意指T细胞重定向治疗剂与抗CD44治疗剂联合用于调节有需要的受试者的免疫应答的量。此外，如本文参考T细胞重定向治疗剂所用，治疗有效量意指具有抗CD44治疗剂的T细胞重定向治疗剂用于实现以下目的的量：治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或者减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关联的症状。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如要治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、是否施用了其他药物，并且无论治疗是预防性的还是治疗性的。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。

如本文所用，术语“处理”和“治疗”均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选地癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。

根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的药物组合物。对于癌症疗法，所提供的药物组合物可以与另一种治疗联合使用，该另一种治疗包括但不限于化学疗法、抗CD20mAb、抗TIM-3mAb、抗LAG-3mAb、抗EGFR mAb、抗HER-2mAb、抗CD19 mAb、抗CD33 mAb、抗CD47mAb、抗CD73 mAb、抗DLL-3mAb、抗apelin mAb、抗TIP-1mAb、抗FOLR1 mAb、抗CTLA-4mAb、抗PD-L1 mAb、抗PD-1mAb、其他免疫-肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物缀合物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。

根据具体实施方案，治疗有需要的受试者的癌症的方法包括向受试者施用如本文所公开的T细胞重定向治疗剂与抗CD44治疗剂和任选的VLA-4粘附途径抑制剂的联合。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的T细胞重定向治疗剂)可在第二疗法(例如，VLA-4粘附途径抑制剂)施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

试剂盒

在另一个一般方面，本文提供了试剂盒、单位剂量和制品，其包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、如本文所公开的抗CD44治疗剂、任选的如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和任选的药物载体。在某些实施方案中，试剂盒优选地提供其使用说明。

在另一个特定方面，本文提供了试剂盒，其包含(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和(2)如本文所公开的抗CD44治疗剂。

在另一个特定方面，本文提供了试剂盒，其包含(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、(2)如本文所公开的抗CD44治疗剂和(3)如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。

在另一个具体方面，本文提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、(2)如本文所公开的抗CD44治疗剂和(3)药学上可接受的载体。

在另一个具体方面，本文提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、(2)如本文所公开的抗CD44治疗剂、(3)如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和(4)药学上可接受的载体。

实施方案

本发明的实施方案1包括药物组合物，所述药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂，其中，所述T细胞重定向治疗剂包括免疫特异性地结合T细胞表面抗原的第一结合区和免疫特异性地结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结合区。

本发明的实施方案2包括根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

本发明的实施方案3包括根据实施方案1或2所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

本发明的实施方案4包括根据实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

本发明的实施方案5包括根据实施方案4所述的药物组合物，其中所述T细胞表面抗原是CD3。

本发明的实施方案6包括根据实施方案1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述TAA选自由CD123、BCMA、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7组成的组。

本发明的实施方案7包括根据实施方案6所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是CD123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

本发明的实施方案8包括根据实施方案7所述的药物组合物，其中所述CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，其中所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

本发明的实施方案9包括根据实施方案8所述的药物组合物，其中所述HC1包含SEQID NO:1的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO:4氨基酸序列。

本发明的实施方案10包括根据实施方案6所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

本发明的实施方案11包括根据实施方案10所述的药物组合物，其中所述BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，其中所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

本发明的实施方案12包括根据实施方案11所述的药物组合物，其中所述HC1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO:8氨基酸序列。

本发明的实施方案13包括根据实施方案1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗CD44治疗剂是抗CD44抗体或其抗原结合片段。

本发明的实施方案14包括根据实施方案13所述的药物组合物，其中所述抗CD44抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

本发明的实施方案15包括根据实施方案1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗CD44治疗剂是CD44拮抗剂。

本发明的实施方案16包括根据实施方案1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含VLA-4粘附途径抑制剂。

本发明的实施方案17包括根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

本发明的实施方案18包括根据实施方案17所述的药物组合物，其中所述抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

本发明的实施方案19包括根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

本发明的实施方案20包括根据实施方案19所述的药物组合物，其中所述VLA-4拮抗剂选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组。

本发明的实施方案21包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案22包括根据实施方案21所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案23包括根据实施方案22所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案24包括根据实施方案22所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案25包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案26包括根据实施方案25所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案27包括根据实施方案26所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案28包括根据实施方案26所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案29包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案30包括根据实施方案29所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案31包括根据实施方案30所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案32包括根据实施方案30所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案33包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触并增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案34包括根据实施方案33所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案35包括根据实施方案34所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案36包括根据实施方案34所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案37包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案38包括根据实施方案37所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案39包括根据实施方案38所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案40包括根据实施方案38所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案41包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使所述肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案42包括根据实施方案41所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案43包括根据实施方案42所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案44包括根据实施方案42所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案45包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案46包括根据实施方案45所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案47包括根据实施方案46所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案48包括根据实施方案46所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案49包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触并增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案50包括根据实施方案49所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案51包括根据实施方案50所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案52包括根据实施方案50所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案53包括治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物。

本发明的实施方案54包括根据实施方案53所述的方法，其中所述受试者患有新诊断的癌症。

本发明的实施方案55包括根据实施方案53所述的方法，其中所述受试者在经过先前的抗癌疗法后是复发性的或难治性的。

本发明的实施方案56包括根据实施方案53-55中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

本发明的实施方案57包括根据实施方案57所述的方法，其中所述受试者患有AML或MM。

本发明的实施方案58包括根据实施方案53-57中任一项所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

本发明的实施方案59包括根据实施方案58所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案60包括根据实施方案58所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案61包括试剂盒，所述试剂盒包括根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物单独包装。

本发明的实施方案62包括试剂盒，所述试剂盒包括根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包装在一起。

本发明的实施方案63包括根据实施方案21-60中任一项所述的方法，所述方法还包括施用VLA-4粘附途径抑制剂。

本发明的实施方案64包括根据实施方案63所述的方法，其中参考治疗有效量的根据实施方案1-20中任一项所述的药物组合物，同时或依次施用所述VLA-4粘附途径抑制剂。

实施例

材料和方法

抗体设计

生产靶向人类CD123和CD3的双特异性抗体，其中抗CD123抗体和抗CD3抗体通过使用Genmab技术产生受控片段抗原结合臂交换来在纯化后接合在一起(17、18)。这导致形成单价结合的双功能抗体，其能特异性地与人类CD123+AML细胞和CD3 T细胞结合。为了最小化抗体介导的效应功能，在Fc结构域中引入突变以减少与Fcγ受体的相互作用。以下实验中使用的CD123×CD3双特异性包括第一重链(HC1)、第二重链(HC2)、第一轻链(LC1)和第二轻链(LC2)，其中HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。以下实施例中使用的CD123×CD3双特异性包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LC2。

体外细胞毒性测定

对肿瘤细胞系(KG-1、HL-60、MOLM-13、MV4-11和SKNO-1)进行计数并用DPBS^-/-(不含钙或镁)洗涤两次，然后用含有活染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；重新悬浮于150μL二甲基亚砜中并以1:10,000稀释)的5mL-15mL DPBS^-/-在室温(RT)处避光孵育8分钟。用等量热灭活(HI)的胎牛血清(FBS)淬灭染色。将AML靶细胞在完全培养基中洗涤两次，然后以3×10⁵个细胞/mL重新悬浮于完全培养基中。收获HS-5基质细胞并用完全培养基洗涤，并在完全培养基中重新悬浮至3×10⁵个细胞/mL。将冷冻的原代脂肪细胞、BM基质、MSC、T细胞和成骨细胞解冻，在完全培养基中洗涤一次并在完全培养基中重新悬浮(基质细胞：3×10⁵个细胞/mL和T细胞：6×10⁵个细胞/mL)。将等体积(67μL)的AML、基质和T细胞添加到96孔TC处理的U底板中[效应子:靶标:基质(2:1:1)]。在没有基质细胞的对照孔中，添加67μL的完全培养基。接下来，添加从Southern Biotech(Birmingham,Alabama)获得的0.5mg/mL无菌、无叠氮化物、低内毒素的人免疫球蛋白(IgG)作为Fc块。将96孔板在37℃处用5％CO₂孵育过夜。

将CD123×CD3双特异性抗体在完全培养基中稀释至100nM的最终起始浓度，并进一步稀释10倍并添加到适当的孔中。将所有板在37℃处用5％CO₂再孵育24-48小时。然后用DPBS洗涤细胞，并用含有LIVE/DEAD Near-IR的各种标志物在室温处染色30分钟。最后，洗涤细胞并重新悬浮于染色缓冲液中。

含有抗CD44抗体的研究获自R&D Systems(Minneapolis,Minnesota)，在DPBS^-/-中重构并以20μg/mL添加到添加细胞时指示的条件(添加CD123×CD3前24小时)。

流式细胞术分析

在KG-1^wt、KG-1^{CD44 KO}、MV4-11^wt、MV4-11^{CD44 KO}、HL-60^wt、HL-60^{CD44 KO}、HS-5^wt和HS-5^{CD44 KO}细胞系上评估CD44、VLA-4、VLA-5、CXCR4、CD123、CD54、CD3和Flt3[抗体购自Biolegend(San Diego,California)]的表面表达。AML细胞系在完全培养基中生长至～70％汇合，收获并洗涤一次，并在DPBS^-/-中重新悬浮至1×10⁶个细胞/mL。将HS-5基质细胞系在完全培养基中培养，洗涤一次并重新悬浮于DPBS^-/-中。

将所有细胞系以100μL/孔(1×10⁵个细胞/孔)添加到96U底板中。将板离心，并弃去上清液。在室温处，在DPBS^-/-中用LIVE/DEAD染料对细胞的每种抗原或同种型进行单独染色。

AML和MDS样品的CD44表达

根据Mills Heme(GSE15061)研究对AML、骨髓增生异常综合征(MDS)和正常对照中的CD44表达进行评估，并使用GraphPad Prism版本9(San Diego,California)作图。

统计方法

所有数据均通过GraphPad软件Prism版本9进行分析。图1和图5采用非线性回归(四参数)曲线拟合。EC₅₀和最大细胞毒性值来源于上述分析。通过比较最大参数(α＝0.05)对4参数非线性拟合进行F检验分析，以评估图1的统计显著性。通过多重比较检验(α＝0.05)对图4b(Tukey多重比较检验，*100nM条件分析)、图5(100nM评估，Tukey多重比较检验)、图9和图10(Dunnett多重比较检验)进行ANOVA分析。

细胞因子分析

使用测量人类细胞因子和趋化因子的Millipore Sigma MAP KIT(Burlington,Massachusetts)对图1和图5的上清液分析。将上清液在湿冰上解冻，在4℃处以500×重力(g)离心5分钟，然后置于冰上。样品以纯(无稀释)浓度使用。按照制造商的方案使用磁珠板试剂盒。通过系列稀释所提供的校准品并在RPMI介质中重构来制备标准曲线。将每种样品或标准品的25μL等分试样直接添加到技术重复的板中。随后的孵育和洗涤均按照制造商的方案使用手持式磁铁进行。在FLEXMAP系统上读取测定板。在程序FLEXMAP软件中进行分析，以确定每个样品的细胞因子浓度。最后，使用Prism版本9进行数据可视化。

结果

原代骨髓基质细胞在体外降低CD123×CD3抗体针对KG-1细胞的功效

骨髓由免疫细胞和基质细胞的异源群体组成。BM基质细胞的组分之一是间充质干细胞(MSC)，它可分化为成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞。先前已证明，BM基质成纤维细胞可经由涉及VLA-4的细胞-细胞相互作用抑制T细胞重定向介导的细胞毒性(Nair-Gupta P等人，Blockade of VLA4 sensitizes leukemic and myeloma tumor cells to CD3redirection in the bone marrow microenvironment.Blood Cancer Journal.2020；10(6))。为了测试BM的其他组分是否可以降低T细胞募集抗体的细胞毒性作用，在健康对照(HC)泛CD3⁺T细胞和各种BM基质细胞类型存在的情况下，针对CD123⁺AML细胞测试了CD123×CD3双特异性抗体。(Nair-Gupta P等人，Blockade of VLA4 sensitizes leukemic andmyeloma tumor cells to CD3 redirection in the bone marrowmicroenvironment.Blood Cancer Journal.2020；10(6)；Gaudet F等人，Development ofa CD123xCD3 Bispecific Antibody(JNJ-63709178)for the Treatment of AcuteMyeloid Leukemia(AML).Blood.2016；128(22):2824)。在不存在基质细胞的情况下，CD123×CD3双特异性抗体可有效杀死KG-1细胞(78％最大细胞毒性，CD123^高；骨髓来源(图1))。相比之下，HS-5基质细胞的存在导致KG-1细胞的杀伤的显著减少(38％-50％；图1和表1)。用其他BM基质组分诸如原代BM基质细胞、间充质干细胞、人成骨细胞和脂肪细胞观察到类似结果，表明BM的几种组分可抑制T细胞介导的细胞毒性(图1和表1)。KG-1细胞系最初是从白血病患者的BM中分离出来的，并且可能更容易受到基质相互作用的影响(Mrozek K等人，Molecular cytogenetic characterization of the KG-1and KG-1a acute myeloidleukemia cell lines by use of spectral karyotyping and fluorescence in situhybridization.Genes Chromosomes Cancer.2003；38(3):249-252)。为了评估不是源自BM的CD123⁺细胞系是否会类似地受BM基质细胞影响，在存在HL-60细胞(CD123^低)的情况下评估了这些基质细胞的影响，这些HL-60细胞源自早幼粒细胞白血病的外周血并且可能潜在地不太依赖于基质相互作用(Collins SJ等人，Terminal differentiation of humanpromyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polarcompounds.Proc Natl Acad Sci U S A.1978；75(5):2458-2462)。事实上，虽然CD123×CD3双特异性抗体能够杀死HL-60细胞，但是BM基质细胞没有显著地影响细胞毒性活性(5％-22％降低；表2和表3)。有趣的是，当与基质细胞(成骨细胞除外)共培养时，KG-1细胞中的T细胞活化(如使用CD25细胞表面标志物评估的)仅受到中度影响，而HL-60细胞没有显著改变(图1和表1)。在存在基质细胞的情况下观察到的CD25表达的减少也与细胞因子分泌的减少相关(图2和图3)。这些结果表明，基质细胞的存在可抑制T细胞功能，从而减少对靶细胞的杀伤。

表1.基质对EC₅₀值和最大细胞毒性百分比的影响

EC，有效浓度；NS，未添加基质细胞；BM，骨髓基质细胞；MSC，间充质干细胞；EC₅₀值来自48小时时间点；并且％Max表示来自4参数非线性拟合曲线的最大值。

表2.抗CD44对EC₅₀值和最大细胞毒性百分比的影响

EC，有效浓度；NS，无基质。

EC50值来自48小时时间点，并且％Max表示来自4参数非线性拟合曲线的最大值。

表3.HS-5介导的CD123×CD3细胞毒性抑制和用抗CD44恢复的统计学分析

上文显示的P值表示HS-5介导的CD123×CD3细胞毒性或T细胞活化(CD25或PD-1)的抑制的统计显著性和抗CD44添加到每个相应AML细胞系的恢复效果。用Tukey多重比较检验评估CD123×CD3(100nM)的单向ANOVA(α＝0.05)。P值>0.05，没有显著差异。

Ab，抗体；NS，无基质细胞。

CD44在AML细胞上被上调

已经证明，VLA-4可介导肿瘤细胞与基质细胞(成纤维细胞)之间的相互作用，从而导致T细胞抑制，而阻断VLA-4可恢复从T细胞重定向剂的杀伤(Nair-Gupta P等人，Blockade of VLA4 sensitizes leukemic and myeloma tumor cells to CD3redirection in the bone marrow microenvironment.Blood Cancer Journal.2020；10(6))。为了鉴定可以介导这种抑制的其他蛋白质，考虑了在AML中涉及细胞-细胞表面相互作用的各种候选蛋白质。一种特定的蛋白质CD44已被证明有助于HSC和LSCs的粘附性质(Schroeder T等人，Mesenchymal stromal cells in myeloid malignancies.BloodRes.2016；51(4):225-232；Pleyer L等人，Mesenchymal Stem and Progenitor Cells inNormal and Dysplastic Hematopoiesis-Masters of Survival and Clonality.Int JMol Sci.2016；17(7))。在AML中，CD44在AML母细胞和LSC上被上调并且通过多种途径用作存活信号(Gul-Uludag H等人，Polymeric nanoparticle-mediated silencing of CD44receptor in CD34+acute myeloid leukemia cells.Leukemia research.2014；38(11):1299-1308；Garg S等人，Antigen expression on a putative leukemic stem cellpopulation and AML blast.Int J Hematol.2016；103(5):567-571；Chen P等人，Bonemarrow stromal cells protect acute myeloid leukemia cells from anti-CD44therapy partly through regulating PI3K/Akt-p27(Kip1)axis.Mol Carcinog.2015；54(12):1678-1685；以及Gadhoum SZ等人，Anti-CD44 antibodies inhibit both mTORC1and mTORC2:a new rationale supporting CD44-induced AML differentiationtherapy.Leukemia.2016；30(12):2397-2401)。评估了各种AML细胞系中的CD44蛋白表达，并且发现其表达一致(图4A)。接下来，评估了原代AML细胞(n＝202)中的CD44 mRNA表达，并且发现与骨髓增生异常综合征(MDS；n＝164)和正常对照(n＝69；图4B)相比有显著上调(Mills KI等人，Microarray-based classifiers and prognosis models identifysubgroups with distinct clinical outcomes and high risk of AML transformationof myelodysplastic syndrome.Blood.2009；114(5):1063-1072)。这与CD44表达可能在从MDS到AML疾病的疾病进展中发挥重要作用的观点一致。

抗CD44恢复CD123×CD3对杀伤的基质介导的抑制

为了评估CD44是否参与CD123×CD3双特异性抗体对T细胞杀伤的基质介导的抑制，将抗CD44抗体添加到共培养物中以中和CD44。还测试了其他AML细胞系(MV4-11、MOLM-13和SKNO-1；所有CD123⁺)。如图5中所示，在不存在基质细胞的情况下，CD123×CD3双特异性抗体在所有测试的细胞系中产生了稳健且显著的细胞毒性活性(表3和表4)。在本文中，抗CD44抗体对细胞毒性活性或T细胞活化没有影响。相比之下，当AML细胞系与基质细胞共培养时，除CD44^低的HL-60细胞之外，抗CD44抗体、细胞毒性作用和T细胞活化在所有测试的细胞系中恢复到不同程度(图5)。所有测试的细胞均显示表达CD44(图6)。这些结果进一步证实，先前关于其他CD123⁺AML细胞的发现表明CD44在AML中的作用可能更广泛。进一步评估了上清液中的细胞因子，发现其与细胞毒性相关。具体地，在不存在基质的情况下添加CD123×CD3双特异性抗体导致在所测试的CD123×CD3双特异性抗体的两个最高浓度下有效释放IFN-γ、IL-2、IL-3和TNF-α；然而，添加HS-5细胞减弱了细胞因子的释放。添加抗CD44导致IFN-γ、IL-3和TNF-α水平相似，但将IL-2水平降低至接近背景。当将抗CD44添加到含有HS-5细胞的共培养物中时，IFN-γ水平完全恢复，而IL-2、IL-3和TNF-α水平部分恢复(图7)。总之，这些结果表明，在存在基质细胞的情况下，CD44表达可以降低对T细胞重定向治疗剂的敏感性，并且用抗体阻断CD44可以恢复这种活性。

表4.基质细胞对比无基质细胞对针对KG-1和HL-60细胞的CD123×CD3细胞毒性的 统计学分析

上面显示的P值表示将各个基质细胞与无基质细胞条件进行比较的CD123×CD3细胞细胞毒性的统计学显著性。通过比较顶部参数(α＝0.05)，在4参数非线性曲线拟合内进行额外的平方和F检验分析。P值>0.05，没有显著差异。

BM，骨髓基质细胞；MSC，间充质干细胞。

CD44 KO细胞系对HS-5基质介导的CD123×CD3的抑制具有抗性

由于向共培养物中添加抗CD44抗体恢复了CD123×CD3双特异性抗体的功能，因此假设CD44在抑制CD123×CD3双特异性抗体对T细胞介导的杀伤中发挥重要作用。CD44在HS-5基质细胞和KG-1AML细胞上表达。为了确定抗CD44抗体的影响是否源于CD44对基质细胞或肿瘤细胞(或两者)的阻断，在HS-5细胞和肿瘤细胞中产生CD44的KO。如图8所示，成功地生成了不再表达CD44的细胞(而对照VLA-4和CXCR4的水平保持不变)。然后，在存在CD123×CD3双特异性抗体的情况下，将这些细胞用于细胞毒性测定，以评估CD44缺失对任一细胞类型的表面的影响。图9示出，当在共培养系统中使用HS-5CD44KO或KG-1CD44KO细胞(表5)时，细胞毒性显著恢复。数据表明，无论CD44在肿瘤细胞中还是在基质细胞中缺失，其影响都是相似的。两种细胞类型中CD44的缺失不会导致任何附加结果。该数据表明，在HS-5和KG-1上表达的CD44可以有助于在HS-5细胞中观察到的抑制作用，并且任一细胞类型上的CD44缺失可以恢复CD123×CD3双特异性抗体的细胞毒性功能。这些发现与上述使用抗CD44的实验一致，并进一步确定CD44表达作为AML中T细胞重定向的抗性机制。

表5.采用抗CD44和/或CD44KO细胞系对比与HS-5^wt细胞共培养的KG-1细胞，对 CD123×CD3介导的细胞毒性、T细胞活化(CD25和PD-1)以及颗粒酶b水平的统计学分析

上面显示的P值表示每种细胞因子对于其各自比较的统计学显著性。用Dunnet多重比较检验评估CD123×CD3的单向ANOVA(α＝0.05)。P值>0.05，没有显著差异。KO，敲除；wt，野生型。

阻断CD44可增强颗粒酶B水平并增加PD-1表达

为了确定肿瘤细胞或基质细胞上的CD44的中和或消除是否直接影响T细胞功能，决定测定T细胞中颗粒酶B的水平，颗粒酶B在突触中由T细胞分泌并被肿瘤细胞摄取，从而诱导细胞凋亡。如图10和表5所示，在KG-1或HS-5细胞中添加抗CD44抗体或KO CD44导致T细胞中颗粒酶B的增加，这可以部分地解释更大的细胞毒性。令人惊讶的是，当T细胞与KG-1CD44 KO细胞一起孵育时，添加抗CD44也会导致颗粒酶B增加。当评估T细胞上的PD-1表达时发现了类似的结果(图10和表5)。这些结果表明，CD44表达可以通过除在肿瘤细胞上表达以外的机制抑制T细胞重定向抗体的细胞毒性。

讨论

AML初次化疗或自体造血干细胞移植后的最小残留疾病是复发的主要原因。由于BM是AML LSC的保护性微环境，因此这些癌细胞通常对二次疗法和治疗具有抗性。了解BM微环境中的抗性机制对于当前和未来疗法(包括免疫重定向方法)至关重要。

本文显示多种BM基质细胞类型可以抑制T细胞重定向抗体(CD123×CD3双特异性抗体)针对KG-1细胞的活性。而T细胞活化(CD25表达)受到的影响较小；细胞因子释放被与细胞毒性相关的原代BM基质细胞有效地抑制。

结果表明，BM基质细胞和肿瘤细胞上的CD44表达在CD123×CD3双特异性抗体的细胞毒性活性的BM基质抑制中发挥重要作用。在肿瘤细胞或基质细胞中，抗CD44抗体对CD44的抑制或CRISPR对CD44基因的KO在不同程度上挽救了基质介导的抑制，这取决于所使用的细胞系。CD44的抑制不仅恢复了我们的T细胞重定向剂CD123×CD3双特异性抗体的细胞毒性，而且还引起T细胞活化和细胞因子释放增加，这与肿瘤细胞杀伤一致。

序列表

<110> 杨森生物技术公司（JANSSEN BIOTECH, INC.）

<120> 包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂的组合物

<130> JBI6553WOPCT1

<150> US 63/189,737

<151> 2021-05-18

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

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1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

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Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

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275 280 285

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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Ala Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

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Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

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Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

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<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

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Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

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Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

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<220>

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Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

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<223> 合成肽

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20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 8

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims (27)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和抗CD44治疗剂，其中，所述T细胞重定向治疗剂包括免疫特异性地结合T细胞表面抗原的第一结合区和免疫特异性地结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结合区。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述T细胞表面抗原是CD3。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述TAA选自由CD123、BCMA、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7组成的组。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是CD123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述HC1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

10.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述HC1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗CD44治疗剂是抗CD44抗体或其抗原结合片段。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述抗CD44抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗CD44治疗剂是CD44拮抗剂。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含VLA-4粘附途径抑制剂。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。

19.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述VLA-4拮抗剂选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组。

21.一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的药物组合物。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症是AML或MM。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述T细胞重定向治疗剂和所述抗CD44治疗剂同时或依次施用。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗CD44治疗剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

27.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-20中任一项所述的药物组合物。