CN117916261A - 与靶向fap的cd40激动剂的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合疗法，其采用：靶向FAP的CD40激动剂，特别是双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域；以及放射疗法。

Description

与靶向FAP的CD40激动剂的组合疗法
技术领域
本发明涉及组合疗法，其采用：靶向FAP的CD40激动剂，特别是双特异性抗原结合分子，这些双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域；以及放射疗法，以及涉及这些组合疗法用于治疗实体瘤的用途和使用这些组合疗法的方法。
背景技术
癌症是世界范围内导致死亡的主要原因之一。尽管在治疗选项方面已取得进展，但患有晚期癌症的患者的预后仍然较差。因此，对于用以增加癌症患者的存活期而不引起不可接受的毒性的最佳疗法存在持续且紧迫的医疗需求。临床试验的最新结果已表明，免疫疗法可以延长癌症患者的总存活期并产生持久的应答。尽管取得了这些有希望的结果，但目前基于免疫的疗法仅对一部分患者有效，并且需要组合策略来改善治疗效果。
放射疗法(RT)是针对局部肿瘤的重要治疗方式。RT通常主要诱导有丝分裂细胞死亡，但也会导致细胞凋亡[9]和对肿瘤微环境的复杂影响，这可以促进抗原呈递细胞和效应T细胞二者的归巢。亚致死剂量的电离辐射已被描述为可直接刺激主要组织相容性复合体(MHC)表达，以使肿瘤细胞对通过特异性T细胞进行的检测和裂解更敏感。
头颈部癌每年新发病例超过800,000例，是全球第七大常见癌症。吸烟、饮酒和人乳头瘤病毒(HPV)感染代表HNSCC发展的主要危险因素(Chow,Head and Neck Cancer,N.Engl.J.Med.2020,382(1),60-72)。HPV相关头颈部鳞状细胞癌(HPV+HNSCC)代表一个独特的头颈部癌亚组，其与HPV阴性HNSCC相比，预后有所改善。这是由HPV+HNSCC的特有生物学特点和有利的患者特征(诸如年龄较小以及烟草和酒精滥用的次要作用)相组合引起。这些患者已显示出来自放射疗法的增强和持久的益处，并且目前正在进行剂量递减试验(Ventz等人,Clin.Cancer Res.2019,25(24),7281-7286)。然而，仍然需要通过整合新的组合策略来进一步优化治疗以提高治疗指数和限制毒性。在这些新选项中，当HNSCC活检中的肿瘤微环境表征表明其是十大免疫浸润癌症之一时，免疫调节似乎是一个有希望的目标。在这方面，大分割放射疗法的经证实的免疫刺激特性使这种治疗方式成为免疫疗法的良好组合搭配疗法(Lhuillier等人,Genome Med.2019；11(1),40)。
尽管HPV+头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者在放射疗法后表现出良好的预后，但随着时间的推移，大多数患者会经历肿瘤复发。因此，仍然需要进一步优化包括新组合方法的治疗，以及降低疗法相关的毒性。
在几个共刺激分子中，TNFR家族成员CD40通过诱导抗原呈递细胞(APC)的成熟、存活、抗原呈递、细胞因子生产和共刺激分子的表达来在触发免疫应答中起关键作用，其接着通过促炎性细胞因子驱动抗原特异性T细胞应答。CD40调节针对感染、肿瘤和自身抗原的免疫应答，并且其表达已在APC(诸如B细胞、树突状细胞(DC)、单核细胞和巨噬细胞以及血小板)和非造血来源的细胞(诸如成肌纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞)的表面上得到证实(Elgueta R.等人,Immunol Rev.2009；229(1):152-72)。CD40配体CD40L在活化的CD4+辅助T细胞、血小板、单核细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表达(Carbone E.等人,J Exp Med.1997；185(12):2053–2060，或Elgueta R.等人,ImmunolRev.2009；229(1):152-72)。响应于各种免疫刺激信号，CD40和CD40L的表达强烈上调，并且APC与CD4+T细胞之间的CD40–CD40L相互作用有助于增加APC活化和抗原特异性CD8+T细胞应答(Bevan MJ.，Nat Rev Immunol.2014；4(8):595-602)。通过使用CD40激动性抗体观察到相似的免疫刺激结果(Vonderheide RH和Glennie MJ.，Clin Cancer Res.2013；19(5):1035-43)。
因此，采用可以模拟这种所谓的APC许可(licensing)的激动性抗CD40抗体代表了癌症免疫疗法背景下的一种有希望的策略。特别是，抗CD40分子活化DC并随后增加肿瘤特异性T细胞(交叉)引发的能力使这些分子对于进行临床开发有吸引力。在过去几年中已开发了许多激动性抗CD40抗体：Chi Lob 7/4(CD40激动性IgG1嵌合mAb；Cancer ResearchUK；Chowdhury F.等人,Cancer Immunol Res.2013；2:229–40)、ADC1013(完全人、CD40激动性IgG1抗体；Alligator Bioscience and Johnson&Johnson；Mangsbo SM.等人,ClinCancer Res.2015年3月1日；21(5):1115-26)、APX-005(完全人源化、CD40激动性IgG1 mAb；Apexigen；Bjorck P.等人J Immunother Cancer.2015；3(增刊2):第198页)、SEA-CD40(CD40激动性IgG1嵌合mAb；Seattle Genetics；Gardai SJ.等人AACR 106th AnnualMeeting 2015；4月18-22日,摘要2472)以及RO7009789(完全人、CD40超激动性IgG2 mAb)正在或已在临床I期研究中进行研究，并且达西组单抗(dacetuzumab)(CD40部分激动性IgG1嵌合mAb；Seattle Genetics；Khubchandani S.等人,Curr Opin Investig Drugs.2009；10,579–87)已在临床II期研究中进行了研究。符合这些研究条件的患者患有实体瘤、经典型霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或惰性淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤)。尽管激动性CD40抗体的临床开发已提供了有希望的初步结果，但也揭示了抗CD40激动剂治疗的主要挑战。在不同的临床研究中，观察到剂量限制性副作用，诸如细胞因子释放综合征和肝毒性，以及血栓栓塞事件，以致在所使用的剂量方案和施用途径下，可能仅能实现有限的临床疗效以及抗体的局部施用。缺乏单一药剂应答的部分原因是由于CD40广泛表达引起的严重的上靶/离靶肿瘤效应，这导致剂量限制性毒性(例如，细胞因子释放综合征)。当将CD40通过肿瘤特异性靶标交联时，特异性活化APC的激动性CD40抗体的开发可以减少副作用并减少剂量限制，从而提供新治疗选项，并有可能产生有效的持久抗癌免疫力。
能够与CD40和成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的双特异性抗原结合分子描述于WO 2018/185045 A1、WO 2020/070041 A1或WO 2020/070035A1中。这些分子将能够与FAP结合的部分与能够与CD40激动性结合的部分组合，其中通过经由在肿瘤基质细胞上表达的FAP以及还可能经由在次级淋巴组织中中间表达的FAP的交联来提供经由CD40的APC活化。与能够与CD40以及与活化T细胞上的免疫检查点受体(诸如，CTLA-4或PD-1)特异性结合的双特异性抗原结合分子相反，靶向肿瘤靶标诸如FAP可使CD40介导的APC活化主要在肿瘤基质和肿瘤引流淋巴结中发生，其中与其他组织相比，成纤维细胞表达的FAP水平升高。靶向FAP的激动性CD40抗原结合分子可因此不仅能够有效地而且还能够非常有选择性地在所需位点触发CD40受体，同时克服了FcγR交联的需求，从而减少了副作用。
本文在此描述一种新组合疗法，其采用：靶向FAP的CD40激动剂，特别是双特异性抗原结合分子，这些双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域(FAP-CD40双特异性抗体)；以及放射疗法，特别是局部大分割放射疗法。
发明内容
本发明涉及双特异性激动性CD40抗原结合分子，特别是包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD40抗原结合分子，以及这些分子与放射疗法组合的用途，特别是涉及这些分子在治疗个体，特别是人类的实体瘤的方法中的用途。已经发现本文所述的组合疗法在抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面比使用单独的双特异性激动性CD40抗原结合分子或单独的放射疗法治疗更有效。
因此，提供一种用于在治疗个体的实体瘤中使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中该双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法组合使用，并且其中该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。特别地，肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于与放射疗法同时或依次施用。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于在放射疗法后施用。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于在放射后单次施用。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于在放射后一天单次施用。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于在放射结束后一天施用。在一些方面，放射疗法包括局部放射疗法。在一些方面，局部放射疗法选自外照射放射疗法或近距离放射疗法。在一个方面，放射疗法为外照射放射疗法。在另一方面，放射疗法为近距离放射疗法。在一些方面，放射疗法包括剂量在1.8至20Gy范围内、优选地在5至20Gy范围内的局部大分割放射。在一些方面，放射疗法包括剂量为6Gy、优选地2x 6Gy的局部大分割放射。在一些方面，放射疗法包括剂量在1.8至2.2Gy范围内、优选地为2Gy的局部大分割放射。
在一些方面，提供一种用于在治疗个体的实体瘤中使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，并且其中该实体瘤选自由以下项组成的组：头颈部癌、黑素瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌和胶质母细胞瘤。在一些方面，肿瘤相关抗原为FAP并且肿瘤的特征为表达FAP的基质。在一些方面，待治疗的实体瘤是头颈部癌或肺癌。特别地，实体瘤是头颈部癌，更具体地是HPV+头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在另一具体方面，实体瘤是肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些方面，用于在治疗个体的实体瘤中使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子为包含IgG Fc结构域、具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域的抗原结合分子，并且其中该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗体与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含人IgG1亚类的Fc结构域，其具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，用于在治疗个体的实体瘤中使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子为包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。特别地，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在进一步的方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在另外其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
因此，在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列。
在另一方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列。
在一些方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，其在N末端处与所述Fc区的C末端融合。
在一些方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其与所述Fc区的C末端融合。
在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其中该交叉fab片段的VH-Cκ链与Fc区的C末端融合。在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合。在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40二价结合和与FAP单价结合。
在另一方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40四价或三价结合和与FAP单价结合。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40四价结合和与FAP单价结合。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含四个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其中每两个Fab片段彼此融合并且在其C末端处与Fc区的N末端融合。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子用于治疗实体瘤，其中(i)个体当用治疗有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法组合治疗时，与接受双特异性激动性CD40抗原结合分子作为单一疗法或接受放射疗法作为单一疗法的个体相比，存活增加，或者(ii)其中个体中的实体瘤的尺寸的减小量大于通过使用用作单一疗法的双特异性激动性CD40抗原结合分子和用作单一疗法的放射疗法治疗来减小尺寸的加和量。
在另一方面，提供一种药物组合物，其包含用于在实体瘤的治疗中使用的药物有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中治疗包括与放射疗法的组合并且双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。特别地，肿瘤相关抗原为FAP。
在一些方面，提供一种药物组合物，其包含用于在治疗个体的实体瘤中使用的药物有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子；以及放射疗法，其中双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。特别地，肿瘤相关抗原是FAP。
在另一方面，提供双特异性激动性CD40抗原结合分子在制备用于治疗个体的实体瘤的药物中的用途，其中双特异性激动性CD40抗原结合分子用于与放射疗法组合并且包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
在另一方面，提供一种用于治疗个体的实体瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子和有效量的放射疗法，其中双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
在所有这些方面，个体优选是人。
附图说明
图1A至图1D显示了与人CD40特异性结合的抗原结合分子的示意图。图1A显示了4+1形式的双特异性FAP-CD40抗体的示意图，该抗体由与一个作为交换型fab片段的FAP结合部分组合的四个CD40结合部分组成，其中VL-CH1链在Fc杵链的C末端处融合(对于CD40为四价结合，而对于FAP为单价结合)。在具有相同结构的对照分子中，FAP结合部分被种系对照DP47的VH和VL结构域替换。图1B显示了呈4+1形式的双特异性FAP-CD40抗体的示意图，该抗体由四个CD40结合部分与一个FAP结合部分组合作为VH和VL结构域组成，其中VH结构域在其N末端处与Fc杵链的C末端融合并且VL结构域在其N末端处与Fc臼链的C末端融合(对于CD40为四价结合，而对于FAP为单价结合)。在对照分子中，FAP结合部分被种系对照DP47的VH和VL结构域替换。图1C显示了双特异性CD40抗体的示意图，该抗体具有Fc结构域，其在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)(对于CD40为二价结合)。图1D显示了2+1形式的双特异性FAP-CD40抗体的示意图，该抗体由与一个作为交换型fab片段的FAP结合部分组合的两个CD40结合部分组成，其中VL-CH1链在Fc杵链的C末端处融合(对于CD40为二价，而对于FAP为单价)。黑点象征杵臼结构突变。在对照分子中，FAP结合部分被种系对照DP47的VH和VL结构域替换。
图2A至图2H显示了在具有表达FAP的基质的原位头颈部肿瘤小鼠模型(mEERL95)中单独或与放射疗法(RT)组合的双特异性FAP-CD40抗体(P1AD9139，图1B)的功效。图2A为显示应用于已建立的颏下mEERL95小鼠肿瘤的治疗计划表的方案。图2B显示了与未治疗组(p＝0.233)相比，作为对数秩检验，经受包括对照抗体DP47-CD40((P1AE2425)的指定治疗的携带mEERL95肿瘤的小鼠的存活率。单独的放射疗法(2x 6Gy)(p＝0.001)以及使用单独FAP-CD40的疗法(p＝0.024)并没有太大增加存活概率，而RT(2x 6Gy)与FAP-CD40治疗的组合产生高存活概率(p＝0.0006)。对数秩检验用于比较指定组与未治疗的小鼠的统计分析。n＝5-6只小鼠/组。图2C至图2H显示了指定治疗组经历的mEERL95肿瘤生长曲线(表示为肿瘤体积)。指示每组排斥肿瘤的小鼠数量(图2C：未治疗的小鼠，图2D：用对照DP47-CD40治疗的小鼠，图2E：用FAP-CD40治疗的小鼠，图2F：用RT(2x 6Gy)治疗的小鼠，图2G：用RT(2x6Gy)和DP47-CD40治疗的小鼠，图2H：用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40治疗的小鼠)。图2I至图2K显示了进一步实验的mEERL95肿瘤生长曲线(表示为肿瘤体积)，其中单次剂量(图2K)或两次剂量的抗FAP-CD40(图2L)与大分割放射疗法组合，并与无治疗(图2I)和单独的放射疗法(图2J)进行相互比较。
图3A至图3G涉及比较双特异性FAP-CD40抗体疗法与使用常规抗CD40激动性抗体的疗法的第二个实验。关于经受指定治疗的小鼠的mEERL95肿瘤生长曲线，这些指定治疗包括非靶向抗CD40(FGK4.5)mAb和相应的IgG匹配对照抗体(IgG Ctr)。图3A：用IgG Ctr治疗的小鼠，图3B：用抗CD40 mAb治疗的小鼠，图3C：用抗CD40 mAb和RT(2x 6Gy)治疗的小鼠，图3D：用IgG Ctr和RT(2x 6Gy)治疗的小鼠，图3E：用FAP-CD40治疗的小鼠，图3F：用RT(2x6Gy)和FAP-CD40治疗的小鼠。单因素ANOVA检验用于与对照组相比，在指定治疗后小鼠体重的差异。n＝5-10只小鼠/组。在指定治疗后72h时体重增加/减轻的百分比在图3G中显示。
图4A至图4K显示了研究肿瘤床中成纤维细胞表达FAP对FAP-CD40效率的影响的实验的结果。在图4A中，显示了接种后10天时TC-1肿瘤细胞和mEERL95颏下肿瘤细胞中DAPI、FAP和αSMA免疫荧光染色的比较。通过qPCR测量的来自mEERL95和TC-1颏下肿瘤的FAP mRNA水平在图4B中显示，而图4C显示通过qPCR测量的来自mEERL95和TC-1颏下肿瘤的CD40 mRNA水平。图4D至图4G显示了按照图2A中的计划表经受指定治疗的小鼠的TC-1肿瘤生长曲线(表示为肿瘤体积)。每组都指示了排斥肿瘤的小鼠数量。图4D：未治疗的小鼠，图4E：用FAP-CD40治疗的小鼠，图4F：用RT(2x 6Gy)治疗的小鼠，图4G：用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40治疗的小鼠。图4H示出了FAP-CD40双特异性如何在TC-1肿瘤和mEERL95肿瘤中积聚。显示了从肿瘤获得的荧光的定量。FI：荧光强度。n＝2-3只小鼠/组。在颏下区域接种mEERL95和TC-1细胞后10天，在颈部淋巴结中进行的FAP的IHC结果在图4I中显示。还示出了接种后10天来自未治疗的携带mEERL95和TC-1肿瘤的小鼠的颈部淋巴结在FRC(gp38+CD31-)上通过流式细胞术测量的FAP阳性细胞的百分比(图4J)和FAP的MFI(图4K)。MFI：荧光平均值。Mann-Whitney检验；***：p<0.001；n＝5-10只小鼠/组。
肿瘤再攻击实验的结果在图5A至图5E中显示。图5A为显示对使用RT(2x 6Gy)和抗FAP-CD40的组合治疗的长期应答者的依序肿瘤再攻击的计划表的方案分别显示了在右侧(1x106个细胞)和左侧(1x105个细胞)依序重新攻击时用mEERL95肿瘤细胞(图5B)和TC-1肿瘤细胞(图5C)重新攻击后的肿瘤生长曲线。在组合治疗的情况下观察到肿瘤特异性记忆的产生。图5D显示了来自用E7肽再刺激8天的经治愈小鼠的PMBC的四聚体阳性CD8 T细胞的百分比。图5E显示了在指定治疗后6天获得的来自携带mEERL95的小鼠的TIL上四聚体阳性CD8T细胞的百分比。**：p<0.01，***：p<0.001；Kruskal Wallis检验用于统计分析。平均值±SEM.；n＝5-8只小鼠/组。
图6A至图6F涉及使用表达人CD40受体(huCD40 Tg小鼠)和呈2+1形式的抗人FAP-CD40(P1AE2302)的转基因小鼠进行的进一步实验。图6A为显示应用于携带mEERL95肿瘤的huCD40 Tg小鼠的治疗计划表的方案。图6B总结了在指定治疗后携带mEERL95的huCD40转基因小鼠的存活百分比。排斥肿瘤的小鼠的数量显示在每组上。对数秩检验；ns：不显著，**：p<0.01，***：p<0.001；n＝10只小鼠/组。针对未治疗的小鼠(图6C)、用抗人FAP-huCD40治疗的小鼠(图6D)、仅用RT(2x 6Gy)治疗的小鼠(图6E)以及针对用RT(2x 6Gy)和抗人FAP-huCD40的组合治疗的小鼠(图6F)治疗的小鼠，显示在指定治疗后携带MEERL95的huCD40转基因小鼠的肿瘤生长曲线。
图7A至图7H显示了与图2A中描述的实验的治疗抗肿瘤作用相关联的细胞和分子免疫组分的分析。在mEERL95肿瘤细胞接种后第18天(即FAP-CD40治疗后7天)对肿瘤中指定免疫群的流式细胞术分析。分别显示了每mg肿瘤的CD45+细胞(图7A)、CD8 T细胞(图7B)、调节性T细胞(Treg，图7C)、CD4 T细胞(图7F)、树突状细胞(图7G)和NK细胞(图7H)的免疫细胞数量。CD8/Treg的比率和CD8/巨噬细胞的比率分别显示在图7D和图7E中。
如通过细胞内FACS染色所测量，在用mEERL95肿瘤细胞再刺激16h后，肿瘤浸润性CD8淋巴细胞的IFNγ、TNFα和颗粒酶B产量在未治疗的小鼠组和用RT和FAP-CD40的组合治疗的小鼠组之间的比较分别在图8A、图8B和图8C中显示。图8D、图8E和图8F分别显示了肿瘤浸润性CD4淋巴细胞的IFNγ、TNFα和颗粒酶B产量。图8G显示了Ki67阳性细胞的频率，并且图8H显示了在不同治疗后浸润肿瘤的CD8 T细胞群中的PD1表达。在图8I中显示了来自颈部淋巴结的CD8 T细胞群中CD62LCD44双阳性细胞(记忆表型)的频率。
图9A、图9B和图9C分别显示了通过多重测量的使用不同疗法治疗后第8天在肿瘤微环境中趋化因子CXCL9和CXCL10以及细胞因子(INFγ)的水平。图9D和图9E显示了在指定治疗后第4天来自mEERL95肿瘤的分别表达指定表面成熟标志物CD80和CD86的树突状细胞(CD11c+MHCII+)的百分比。Mann-Whitney检验、单因素ANOVA或Kruskal Wallis检验用于统计分析。平均值±SEM。*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。N＝3-6个样品/组。图9G显示了在指定治疗后7天，mEERL95肿瘤中不同条件下FAP+区域和位置的定量。图9H为与在指定治疗后四天在肿瘤微环境中差异表达的DC成熟相关联的基因特征的热图。
在图10A和图10B中，在组合疗法施用前48h开始，使用抗CD8β、抗CD4或相应的同种型对照抗体耗尽携带mEERL95肿瘤的小鼠的T淋巴细胞。显示CD8 T淋巴细胞的耗尽导致在组合疗法后观察到的疗效消除。耗尽CD4 T淋巴细胞的小鼠经历了肿瘤复发，表明CD4 T细胞在形成持久抗肿瘤应答中的重要作用。图10A至图10D显示了在无治疗(图10A)和未耗尽时用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40的组合治疗(图10B)后和当耗尽CD8(图10C)或CD4 T细胞(图10D)时的mEERL95肿瘤生长曲线(表示为肿瘤体积)。图10E显示了经过包括指定的耗尽抗体在内的组合治疗的小鼠的存活。对数秩检验；ns：不显著，**：p<0.01，***：p<0.001；n＝7只小鼠/组。
在图10F至图10I中研究了在交叉引发DC不存在的情况下的组合疗法。图10F和图10G显示了未治疗或用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40的组合治疗的Batf3-/-小鼠(其缺乏cDC1)中的mEERL95肿瘤生长曲线。图10H和图10I分别显示了未治疗或用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40的组合治疗的荷瘤野生型小鼠的mEERL95肿瘤生长曲线，表明FAP-CD40介导的稳健保护性应答需要交叉引发DC。
未治疗或用RT(2x 6Gy)和FAP-CD40以及额外的IL-12阻断抗体或相应的同种型匹配对照的组合疗法治疗的小鼠的mEERL95肿瘤生长曲线分别在图11A、图11B和图11C中显示。在每个治疗组中指示了小鼠的数量和排斥肿瘤的小鼠的数量。在肿瘤注射后21天，在这些治疗组中的每个中通过多重测量的小鼠血清中的相应趋化因子水平在图11D(CXCL9水平)、图11E(CXCL10水平)、图11F(CCL4水平)和图11G(CCL22水平)中显示。单因素ANOVA或Kruskal Wallis检验用于统计分析。平均值±SEM。*：p<0.05，**：p<0.01。n＝5-9个样品/组。
图12A至图2C显示了在具有表达FAP的基质的原位SV2-OVA肺肿瘤模型中单独的双特异性FAP-CD40抗体(P1AD9139，图1B)或与放射疗法(RT)组合的功效。图12A为显示应用于建立的SV2-OVA小鼠肿瘤的治疗计划表的方案。图12B显示了每个治疗组的正常肺容积的以％为单位的减少。在接受放射疗法(RT,2x 6Gy)的小鼠组(n＝7)中观察到肺容积的减少比未治疗的动物(n＝7)晚得多。对于接受RT(2x 6Gy)和FAP-CD40治疗(在第14天和第18天2次)二者的组，仅在第41天后才观察到肺容积减少，这与在单独的RT的情况下晚得多。图12C显示了与未治疗组相比，作为对数秩检验，经受包括对照抗体DP47-CD40((P1AE2425)的指定治疗的携带SV2-OVA肿瘤的小鼠的存活率。单独的放射疗法(2x 6Gy)确实增加了存活概率，但RT(2x 6Gy)与FAP-CD40治疗的组合产生高得多的存活概率。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合结构域能够将与其附接的实体(例如CD40激动剂)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。特别地，靶细胞抗原为FAP。
关于抗体或其片段，术语“能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性地结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。特别地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在另一方面，“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”也可以是Fab片段或交叉Fab片段。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够与至少两种独特的抗原决定簇特异性结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。如本文所述的双特异性抗原结合分子还可形成多特异性抗体的一部分。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价、三价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点、三个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体(intact antibody)”和“全抗体”(wholeantibody)”在本文中可互换使用，以指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，该五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文该。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含VL结构域和轻链恒定结构域(CL)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基团。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。该交换型Fab分子也称为交叉Fab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。该交换型Fab分子也称为交叉Fab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中该接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中该接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过十至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal of ImmunologicalMethods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，可转运小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见Biochim BiophysActa 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化改造以与抗原结合。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组A结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白附接于细胞骨架的蛋白家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，该恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，该微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中该抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。作为参考分子的“不结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子未使参考分子与其抗原的结合阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子未使抗原结合分子与其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原较大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术)(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR或CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用，“肿瘤相关抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，特别地肿瘤中的靶细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。特别地，肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够与人、小鼠和/或食蟹猴FAP特异性结合。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(149版，SEQ ID NO:34)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外结构域(ECD)从26位的氨基酸延伸至760位的氨基酸。His标记的人FAP ECD的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:35中。小鼠FAP的氨基酸序列示出于UniProt登录号P97321(126版，SEQ ID NO:36)或NCBI RefSeqNP_032012.1中。小鼠FAP的细胞外结构域(ECD)从26位的氨基酸延伸至761位的氨基酸。SEQID NO:37示出His标记的小鼠FAP ECD的氨基酸序列。SEQ ID NO:38示出His标记的食蟹猴FAP ECD的氨基酸序列。优选地，本发明的抗FAP结合分子与FAP的细胞外结构域结合。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式是这些抗体，该抗体相对于原始抗体，恒定区已经经额外的修饰或改变以产生根据本发明该的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约231位的氨基酸残基延伸至约340位的氨基酸残基。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中C末端至CH2结构域的一段残基(即，从IgG的约341位处的氨基酸残基到约447位处的氨基酸残基)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“突起”(“杵”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文该的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“杵臼结构(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。举例而言，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞以及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.修订版，Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；以及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)的修饰，降低与FcγRI的结合。在233-236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应子细胞存在下本文所报道的抗体对靶细胞的裂解。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA)的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。特别地，测量与NK细胞上与FcγR的结合。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CD40”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD40，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD40，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD40。该术语还涵盖CD40的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人CD40的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:33(Uniprot P25942，版本200)中，并且示例性小鼠CD40的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:39(Uniprot P27512，版本160)中。CD40抗原是50kDa细胞表面糖蛋白，其属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族。(Stamenkovic等人(1989)，EMBO J.8:1403-10)。CD40在许多正常和肿瘤细胞类型中表达，其包括B淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、胸腺上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞。CD40在所有B淋巴瘤中和70％的所有实体瘤中表达，并通过成熟信号(诸如IFN-γ和GM-CSF)在抗原呈递细胞(APC)中上调。CD40活化还诱导单核细胞分化为功能性树突状细胞(DC)，并通过APC-CD40诱导的细胞因子增强NK细胞的溶细胞活性。因此，CD40通过诱导APC的成熟，辅助细胞因子的分泌，共刺激分子的上调以及效应子功能的增强，在引发和增强免疫应答中起着至关重要的作用。
如本文所用，术语“CD40激动剂”包括使CD40/CD40L相互作用激动的任何部分。如上下文所用，CD40优选是指人CD40，因此CD40激动剂优选为人CD40的激动剂。通常，该部分为激动性CD40抗体或抗体片段。
术语“抗CD40抗体”、“抗CD40”、“CD40抗体”和“与CD40特异性结合的抗体”是指能够以足够亲和力结合CD40的抗体，以便该抗体用作在靶向CD40中的诊断剂和/或治疗剂。在一个方面，例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗CD40抗体与不相关的非CD40蛋白的结合程度小于该抗体与CD40结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD40结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于2与4之间的数字，特别是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:40)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:42)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:43)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQID NO:44)、(G4S)3(SEQ ID NO:45)、(G4S)4(SEQ ID NO:46)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:47)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:48)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:49)、GGSGSG(SEQ ID NO:50)、GGSG(SEQID NO:51)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:52)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:53)和GGNGSG(SEQ ID NO:54)。特定目标肽接头为(G4S)(SEQ ID NO:40)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)、(G4S)3(SEQ ID NO:45)和(G4S)4(SEQ ID NO:46)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如，抗体和Fab片段的重链)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为该序列同一性的一部分的情况下，与该参考多肽序列中的氨基酸残基相同的该候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从该源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，该UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施例中，考虑了本文提供的双特异性抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。双特异性抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过对编码分子的核苷酸序列引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如双特异性抗原结合分子的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终抗原结合分子，前提条件是最终抗原结合分子具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和框架(FR)。保守取代在表A中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085该。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与增加抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N末端或C末端的融合。
在某些实施例中，本文提供的抗原结合分子被改变以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当抗原结合分子包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了抗原结合分子的变体，其具有缺乏附接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的抗原结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中附接至Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施例中，可期望产生本发明的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中该形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基构成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。举例而言，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,在线发表于2017年6月12日,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码双特异性抗原结合分子或抗体的分离的核酸”是指编码双特异性抗原结合分子或抗体的重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单独地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导该基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，该表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
根据本发明的组合疗法具有协同作用。两种化合物的“协同作用”是其中两种药剂的组合作用大于它们各自作用的总和，并且在统计学上不同于对照和单一药物的一种作用。在另一个实施例中，本文公开的组合疗法具有累加作用。两种化合物的“累加作用”是其中两种药剂的组合作用是它们各自作用的总和，并且在统计学上不同于对照和/或单一药物的一种作用。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受控制为特征的生理状况，即增殖性疾病，诸如实体瘤或黑素瘤。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。如本文所用，术语“实体瘤”是指通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更特定的实例包括乳腺癌、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌("NSCLC"))、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、结肠癌、直肠癌，结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。在优选实施例中，癌症为头颈部癌。
将肿瘤或癌症称为“0期”、“I期”、“II期”、“III期”或“IV期”、以及此分类中的各个子阶段，表示使用本领域已知的整体分期(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)方法的肿瘤或癌症的分类。尽管癌症的实际阶段取决于癌症的类型，但总的来说，0期癌症是原位病变，I期癌症是小的局部肿瘤，II期和III期癌症是表现出局部淋巴结受累的局部晚期肿瘤，以及IV期癌症代表转移性癌症。每种类型的肿瘤的特定阶段是熟练的临床医生已知的。
“晚期”癌症是由于局部侵袭或转移而扩散到原发部位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病。即使将抗肿瘤剂(诸如化学疗法)施用于癌症患者，“难治性”癌症仍会进展。难治性癌症的一个实例是铂难治性癌症。“复发性”癌症是对初始疗法(诸如手术)产生应答后，在初始部位或远处部位复发的癌症。“局部复发”癌症是在治疗后与先前治疗过的癌症在同一位置复发的癌症。“可手术的”或“可切除的”癌症是局限于主要器官且适合手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。
优选地，“患者”或“受试者”是人类患者。患者可以是“癌症患者”，即罹患或有风险罹患一个或多个癌症症状、特别是头颈部癌症状的患者。
“患者群体”是指一组癌症患者。此类群体可以用于证明药物，诸如帕妥珠单抗在统计学上显著的功效及/或安全性。“复发”的患者是缓解后有癌症体征或症状的患者。任选地，患者在辅助或新辅助疗法后已经复发。
如本文所用，术语“组合疗法”或“组合的治疗”或“组合”表示使用至少两种不同治疗剂的任何形式的并行或平行治疗。
本文中的“新辅助疗法”或“术前疗法”是指在手术之前给予的疗法。新辅助疗法的目标是提供立即的全身治疗，潜在地消除微转移，如果遵循标准的外科手术程序随后进行全身疗法，这种微小转移可能会扩散。新辅助疗法也可能有助于减小肿瘤的大小，从而允许完全切除最初不可切除的肿瘤或保留器官及其功能的部分。此外，新辅助疗法允许对药物功效进行体内评估，这可以指导后续治疗的选择。
本文中的“辅助疗法”是指在确定性手术之后给予的疗法，其中无法检测到残留病的证据，从而降低了疾病复发的风险。辅助疗法的目的是防止癌症复发，从而减少癌症相关死亡的机会。本文中的辅助疗法特别排除了新辅助疗法。
“化疗”是指使用可用于治疗癌症的化疗剂。
“化疗剂”是可用于治疗癌症的化合物，而不管作用机制如何。化疗剂的种类包括但不限于：烷化剂、抗代谢物、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。
用于本发明中的示例性靶向FAP的CD40激动剂
提供了包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD40抗原结合分子，以及其与放射疗法组合的使用，特别是它们在用于治疗个体的实体瘤的方法中的使用。
在一些方面，用于治疗个体的实体瘤的双特异性激动性CD40抗原结合分子是包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中该至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。特别地，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在进一步的方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在另外其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一个方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
因此，在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列。
在又一方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40)和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)；以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。在又一方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链可变区(VHCD40)和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD40)；以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含含有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在另一方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在其他方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，以及(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列。
在一些方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，其在N末端处与所述Fc区的C末端融合。
在一些方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其与所述Fc区的C末端融合。
在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其中该交叉fab片段的VH-Cκ链与Fc区的C末端融合。在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合。在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40二价结合和与FAP单价结合。
在一个方面，该双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
(a)含有两个Fab片段的抗体的两条轻链和两条重链，该两个Fab片段能够与CD40和Fc结构域特异性结合，以及
(b)能够与靶细胞抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域，其中该VH结构域和该VL结构域各自经由肽接头连接至两条重链的C末端中的一者。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性CD40抗原结合分子，其包含：
(a)两条重链，每条重链包含能够与CD40特异性结合的Fab片段的VH和CH1结构域以及Fc区亚基，
(b)两条轻链，每条轻链都包含能够与CD40特异性结合的Fab片段的VL和CL结构域，以及
(c)能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其包含VL-CH1链和VH-CL链，其中所述VH-CL链连接至(a)中的所述两条重链中的一者的C末端。
在一个方面，VH-CL(VH-Cκ)链连接至Fc杵重链的C末端。
在一个特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)各自含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的两条轻链、含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的一条轻链、含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的第二重链。
在另一方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40四价或三价结合和与FAP单价结合。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的特征在于与CD40四价结合和与FAP单价结合。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子包含四个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其中每两个Fab片段彼此融合并且在其C末端处与Fc区的N末端融合。
放射疗法
在本发明的方面，本文所述的靶向FAP的CD40激动剂与放射疗法组合使用。
放射疗法(radiotherapy或radiation therapy)通常缩写为RT，是一种使用电离辐射的疗法，通常作为癌症治疗的一部分来控制或杀死恶性细胞并通常由直线加速器提供。如果将放射疗法局限于身体的一个区域，则其可以治愈多种类型的癌症。其也可以用作辅助疗法的一部分，以防止在手术切除原发性恶性肿瘤(例如，早期乳腺癌)后肿瘤复发。放射疗法与化学疗法具有协同作用，并且已经用于在化学疗法之前、期间和之后在易感癌症中使用。
放射疗法由于其控制细胞生长的能力，通常应用于癌性肿瘤。电离辐射的作用是破坏癌组织的DNA，引起细胞死亡。为了保护正常组织(诸如治疗肿瘤时放射物必须穿过的皮肤或器官)，成形放射束从若干个暴露角度瞄准以在肿瘤处相交，从而在该处提供比在周围健康组织大得多的吸收剂量。除了肿瘤本身，如果引流淋巴结在临床或放射学上与肿瘤有关，或者被认为存在亚临床恶性扩散的风险，则照射野还可包括引流淋巴结。有必要包括肿瘤周围的正常组织的边缘，以考虑到日常摆位和内部肿瘤运动的不确定性。这些不确定性可能是由内部运动和外部皮肤标记相对于肿瘤位置的运动引起的。癌症对放射的应答由其辐射敏感度来描述。中等剂量的放射可迅速杀死具有高辐射敏感度的癌细胞。这些包括白血病、大多数淋巴瘤和生殖细胞肿瘤。大多数上皮癌仅具有中等放射敏感度，并且需要显著较高剂量的放射(60-70Gy)才能实现根治。某些类型的癌症具有明显的抗放射性，也就是说，产生根治所需的剂量远高于临床实践中可能安全的剂量。重要的是区分特定肿瘤的放射敏感度(这在某种程度上是一种实验室量度)与癌症在实际临床实践中的放射“治愈可能性”。例如，白血病通常不能通过放射疗法治愈，因为白血病是遍布全身的。如果淋巴瘤局限于身体的一个区域，则可以根治它。同样，许多常见的、对放射有中等应答的肿瘤如果处于早期阶段，则通常会用治愈剂量的放射疗法来治疗它们。诸如皮肤癌、头颈部癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌和前列腺癌等癌症通常不能通过放射疗法来治愈，因为放射疗法无法治疗全身。
肿瘤对放射疗法的应答取决于肿瘤的大小。与较小的肿瘤或显微镜下的疾病相比，非常大的肿瘤对放射的应答较差。各种策略被用来克服这种作用。最常见的技术是在放射疗法之前进行手术切除。这在利用乳房切除术随后进行辅助放射疗法的乳腺癌治疗中最为常见。另一种方法是在根治性放射疗法之前通过新辅助化学疗法缩小肿瘤。第三种技术是通过在放射疗法的过程中给予某些药物来增强癌症的放射敏感度。放射增敏药物的示例包括顺铂、尼莫拉唑和西妥昔单抗。
放射疗法通常会引起很小的副作用或没有副作用，但由于水肿压迫所治疗区域的神经，在治疗后的几天内可能会出现短期疼痛发作。较高剂量会在治疗期间(急性副作用)、治疗后数月或数年(长期副作用)或再次治疗后(累积副作用)引起不同的副作用。副作用的性质、严重程度和持续时间取决于接受放射的器官、治疗本身(放射类型、剂量、分割(fractionation))和患者。所报告的主要副作用是疲乏和皮肤刺激，如轻度至中度灼伤。疲乏通常发生在治疗过程中间，并可能在治疗结束后持续数周。受刺激的皮肤会愈合，但可能不像以前那样有弹性。放射的副作用通常限于患者身体的接受治疗的区域并且具有剂量依赖性。例如，较高剂量的头颈部放射可能与心血管并发症、甲状腺功能不全和垂体轴功能障碍有关。因此，可能优选较低剂量的放射疗法。
光子放射疗法中使用的放射量以戈瑞(Gy)为单位测量，并根据所治疗的癌症的类型和阶段而有所不同。对于可治愈病例，实体上皮肿瘤的典型剂量范围为60至80Gy，而淋巴瘤的治疗范围为20至40Gy。预防剂量通常在45至60Gy的范围内，以1.8至2Gy(对于乳腺癌、头癌和颈癌)分次(fraction)。放射肿瘤学家在选择剂量时会考虑许多其他因素，包括患者是否正在接受化学疗法、患者合并症、放射疗法是在手术前还是手术后施用。在治疗计划期间确定处方规定剂量的递送参数(放射量测定的一部分)。治疗计划通常使用专门的治疗计划软件在专用计算机上执行。根据放射递送方法，若干角度或来源可用于求和总的必要剂量。计划者将尝试设计这样的计划，该计划为肿瘤递送统一的处方剂量，并最大限度地减少给予周围健康组织的剂量。
出于几个重要原因，总剂量被分割(随时间分散开)。分割使正常细胞有时间恢复，而肿瘤细胞在分次之间的修复效率通常较低。分割还允许在一次治疗中处于细胞周期中相对抗放射阶段的肿瘤细胞在给予下一个分次之前循环到周期的敏感阶段。类似地，慢性或急性缺氧(并且因此更具抗放射性)的肿瘤细胞可能会在分割之间再次充氧，从而提高对肿瘤细胞的杀伤力。对于成人的典型分割计划是每天1.8至2Gy，每周五天。在某些癌症类型中，分次计划时间跨度过长可能导致肿瘤开始重新生长，并且对于这些肿瘤类型(包括头颈部癌和宫颈鳞状细胞癌)，放射治疗优选在一定时间内完成。对于儿童，典型的分次剂量大小(fraction size)可以是每天1.5至1.8Gy，因为较小的分次剂量大小与正常组织中迟发性副作用的发生率和严重程度的降低有关。在某些情况下，在接近治疗过程结束时每天使用两个分次。这种被称为同期加量调强方案(concomitant boost regimen)或超分割(hyperfractionation)的计划用于肿瘤较小时再生速度更快的肿瘤。特别是，头颈部中的肿瘤表现出这种行为。
一种正在被越来越多地使用并继续研究的分割计划是大分割(hypofractionation)。这是一种将放射的总剂量分成大剂量的放射治疗。典型剂量因癌症类型而有显著差异，从1.8Gy/分次到20Gy/分次，后者是用于治疗颅下病变的典型立体定向治疗(立体定向消融体部放疗或SABR，也称为SBRT或立体定向体部放疗)，或用于颅内病变的典型SRS(立体定向放射手术)。可能优选的是剂量在5至20Gy范围内的大分割放射。根据要治疗的癌症，剂量在1.8至2.2Gy范围内的大分割放射可能特别令人感兴趣。大分割的基本原理是通过剥夺促克隆细胞繁殖所需的时间来降低局部复发的概率，并且同时利用某些肿瘤的放射敏感度。特别是，立体定向治疗旨在通过消融过程破坏促克隆细胞，即递送旨在直接破坏促克隆细胞的剂量，而不是像常规放射疗法那样重复中断促克隆细胞分裂(细胞凋亡)的过程。
存在两种形式的局部放射疗法，外照射放射疗法(external beam radiotherapy)和内放射疗法(internal radiotherapy)。外照射放射疗法(EBRT)是最常见的放射疗法的形式。外部电离辐射源指向患者身体的特定部位。与辐射源在体内的近距离放射疗法(密封源放射疗法)和非密封源放射疗法不同，外照射放射疗法将放射从体外引导到肿瘤。正电压(“浅表”)X射线用于治疗皮肤癌和浅表结构。X射线和电子束是迄今为止使用最广泛的外照射放射疗法的来源。
内放射疗法(近距离放射疗法)是将密封的辐射源放置在需要治疗的区域内部或附近的放射疗法的形式。近距离放射疗法的优点是照射仅影响辐射源周围非常局部的区域。因此，远离辐射源的健康组织的放射暴露量减少了，并且可以用非常高剂量的局部放射来治疗肿瘤，同时降低对周围健康组织造成不必要损害的可能性。此外，如果在治疗期间患者移动或者如果肿瘤在体内有任何移动，则辐射源保持其相对于肿瘤的正确位置。
全身放射疗法或放射性同位素疗法(RIT)是另一种形式的放射疗法。靶向作用可以通过同位素诸如放射性碘(甲状腺特异性吸收放射性碘的能力是体内其他器官的千倍)的化学性质来实现，或者通过将放射性同位素附着到另一种分子或抗体以将其引导至靶标组织来实现。放射性同位素通过输注(进入血流)或摄入来递送。示例为输注间碘苯甲胍(MIBG)来治疗神经母细胞瘤，输注口服碘-131来治疗甲状腺癌或甲状腺毒症，以及输注激素结合的镥-177和钇-90来治疗神经内分泌肿瘤(肽受体放射性核素疗法)。另一个示例是将放射性钇-90或钬-166微球注射到肝动脉中，以放射性栓塞肝肿瘤或肝转移瘤。这些微球用于称为选择性内放射疗法的治疗方法。微球的直径为约30μm(为人类头发的约三分之一)，并且可被直接递送到为肿瘤供血的动脉中。这些治疗以引导导管向上穿过腿部的股动脉，导航到所需的靶标部位并施用治疗开始。供给肿瘤的血液将把微球直接带到肿瘤，这实现了比传统的全身化学疗法更具选择性的方法。目前存在三种不同类型的微球：SIR-Spheres、TheraSphere和QuiremSpheres。全身放射性同位素疗法的主要用途是治疗癌症骨转移。放射性同位素选择性地行进到受损骨骼区域，并保护正常未受损的骨骼。常用于治疗骨转移的同位素是镭-223、锶-89和钐(153Sm)来昔决南钐。
用于本发明的双特异性抗原结合分子的制备
组合中使用的治疗剂包含多特异性抗原结合分子，例如双特异性抗原结合分子。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，结合特异性针对不同的抗原。在某些方面，结合特异性针对同一抗原上的不同表位。可以将双特异性抗原结合分子制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829以及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼”工程改造(参见例如，美国专利号5,731,168)。对于重组生产，提供一种或多种编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸。将一种或多种编码双特异性抗原结合分子的多核苷酸分离并插入至一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献该的技术：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌性信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调节序列缔合，以使基因产物的表达处于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔α珠蛋白基因的5'-侧翼区和内部区)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区缔合，这些额外编码区指导由多核苷酸编码的多肽的分泌。举例而言，如果需要分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N末端融合的信号肽，该信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产该多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。DNA编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白的DNA可包含在编码本发明中使用的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明中使用的双特异性抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程改造以产生双特异性抗原结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中该)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中该)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中该)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，HumanaPress,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。产生本发明中使用的双特异性抗原结合分子的方法包括：在适于表达双特异性抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收双特异性抗原结合分子或其多肽片段。
如本文所述制备的本发明中使用的双特异性抗原结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。举例而言，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。举例而言，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本发明中使用的抗原结合分子的Fc结构域由一对包含免疫球蛋白分子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。
Fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时它可能导致将双特异性抗原结合分子不希望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。因此，在特定方面，如与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，Fc基本上不结合到Fc受体和/或不诱导效应子功能。在特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在具体方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突状细胞成熟或减少的T细胞引发。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的双特异性抗原结合分子的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。在特定方面，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，特别是对于Fcγ受体的结合。
在一个方面，双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位(EU编号)处包含氨基酸取代。特别地，Fc结构域包含IgG重链234和235位(EU编号)和/或329位(EU编号)的氨基酸取代。更具体地，提供根据本发明的抗体，其包含在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸取代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如国际专利申请公开号WO2012/130831 A1该，该专利申请公开还描述制备这种突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸位置处的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
在另一方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。WO 2012/130831中也描述了此类IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl AcadSci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(威斯康星州，麦迪逊市，普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目标分子的ADCC活性。
在一些方面，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明中使用的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗体的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。因此，双特异性抗原结合分子包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，该修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在具体方面，该修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，该修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，双特异性抗原结合分子包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中根据杵臼结构方法，Fc结构域的第一亚基包含杵并且Fc结构域的第二亚基包含臼。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代。在一个方面，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代。
在又进一步的方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中该。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
如本文报道的双特异性抗原结合分子的重链的C-末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C-末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施例中，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其包含(a)能够与CD40特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与FAP特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中在Fab片段之一中，可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL被交换。根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
在WO2009/080252和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其包含(a)能够与CD40特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与FAP特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中在Fab片段之一中，恒定结构域CL和CH1被彼此替换，使得CH1结构域是轻链的一部分，并且CL结构域是重链的一部分。更特别地，在能够与靶细胞抗原特异性结合的第二Fab片段中，恒定结构域CL和CH1被彼此替代，使得CH1结构域是轻链的一部分，并且CL结构域是重链的一部分。
在特定方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含(a)能够与CD40特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与FAP特异性结合的第二Fab片段，其中恒定结构域CL和CH1被彼此替换，使得CH1结构域是轻链的一部分，并且CL结构域是重链的一部分。此类分子与CD40和FAP二者单价结合。
在另一方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含(a)包含两个能够与CD40特异性结合的Fab片段和Fc结构域的抗体的两个轻链和两个重链，以及(b)两个能够与FAP特异性结合的额外Fab片段，其中所述额外Fab片段各自经由肽接头连接至(a)的重链的C末端。在某一特定方面，另外的Fab片段是Fab片段，其中可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分。
因此，在特定方面，本发明包含一种双特异性抗原结合分子，其包含(a)包含两个能够与CD40特异性结合的Fab片段和Fc结构域的抗体的两个轻链和两个重链，以及(b)两个能够与FAP特异性结合的额外Fab片段，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的所述两个额外Fab片段是交换型Fab片段，其中可变结构域VL和VH被彼此替换，并且VL-CH链各自经由肽接头连接至(a)的重链的C末端。
在另一方面，并为了进一步改善正确的配对，双特异性抗原结合分子可能含有不同的带电荷的氨基酸取代(所谓的“带电荷的残基”)，该双特异性抗原结合分子包含(a)第一Fab片段，其能够与CD40特异性结合，(b)第二Fab片段，其能够与FAP特异性结合，以及(c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在特定方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其中在CL结构域之一中，123位(EU编号)的氨基酸已被精氨酸(R)取代和/或其中124位(EU编号)的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在CH1结构域之一中，147位(EU编号)和/或213位(EU编号)的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
测定
本文所提供的抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。
1.结合测定
可以例如通过使用表达人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的鼠成纤维细胞系和流式细胞术(FACS)分析来评价本文提供的双特异性抗原结合分子与相应靶标表达细胞的结合。可以通过使用原代B细胞来确定本文提供的双特异性抗原结合分子与CD40的结合。
2.活性测定
测试本发明的双特异性抗原结合分子的生物学活性。生物学活性可包括双特异性抗原结合分子的功效和特异性。通过与靶抗原结合后CD40受体的激动性信号传导的测定证明了其功效和特异性。此外，使用已经与双特异性抗原结合分子一起孵育的树突状细胞(DC)进行体外T细胞引发测定。
药物组合物、制剂和施用途径
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文所提供的双特异性抗原结合分子中的任何一者以及至少一种药用赋形剂。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用载体中的一种或多种双特异性抗原结合分子治疗有效量。短语“药物或药理学上可接受”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有根据本发明所述的至少一种双特异性抗原结合分子和任选地附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)所例示，所述文献以引用方式并入本文。特别地，这些组合物是冻干调配物或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的双特异性抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，双特异性抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的抗原结合分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，该真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
本文的示例性药用赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
除了先前描述的组合物的外，抗原结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，举例而言，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式调配，该载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
双特异性抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基基团形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
靶向FAP的CD40激动剂与放射疗法的组合的施用
包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD40抗原结合分子可以通过任何合适的方式施用，这些合适的方式包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果局部治疗需要，则包括病灶内施用。特别地，双特异性激动性CD40抗原结合分子可以通过肠胃外，特别是静脉内输注来施用。
肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。在一个方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子经肠胃外，特别是经静脉内施用。在特定方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子通过静脉内输注来施用。
双特异性激动性CD40抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式调配、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。双特异性激动性CD40抗原结合分子不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量取决于调配物中存在的治疗剂的量、病症或治疗的类型、以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文该相同的剂量和施用途径使用，或以本文该剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，双特异性激动性CD40抗原结合分子的适当剂量(当以组合使用或与一种或多种其他额外治疗剂一起使用时)将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、施用该分子用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的病史和对治疗剂的应答以及主治医师的酌情决定权。双特异性激动性CD40抗原结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg–10mg/kg)的物质可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于受试者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。双特异性激动性CD40抗原结合分子的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向受试者施用约0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)中的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周、每两周或每三周施用(例如，使得受试者接受约两个至约二十个、或例如约六个剂量的治疗剂)。可以施用初始较高负载剂量，随后是一个或多个较低剂量，或者初始较低剂量，随后是一个或多个较高剂量。示例性给药方案包括施用约10mg初始剂量，随后是每两周施用约20mg剂量的治疗剂。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
在一个方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的施用是单次施用。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法同时施用。术语“同时(simultaneously)”意指在同一时间或在短时间段内，通常少于1小时。在一些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子在放射疗法后同时施用。“在放射疗法后”意指在放射结束后超过3小时，优选数天，优选放射结束后一天，但不超过1至2周的时间段内。在某些方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的施用是两次或更多次施用。与一种或多种其他药物“并行(concurrently)”施用的药物是在同一治疗周期内，在与一种或多种其他药物的治疗的同一天，以及任选地与一种或多种其他药物同时施用。例如，对于每3周给予的疗法，并行施用的药物各自在3周周期的第-1天施用。在一个方面，双特异性激动性CD40抗原结合分子的施用包括初始施用第一剂量的双特异性激动性CD40抗原结合分子和一次或多次后续施用第二剂量的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中第一剂量不低于第二剂量。
当放射疗法和双特异性激动性CD40抗原结合分子二者依次共同施用时，它们以间隔“特定时间段”的两次单独施用来施用。术语特定时间段意指1小时至15天的任何时间。例如，双特异性激动性CD40抗原结合分子可在施用放射疗法后约1、2、3、4、5、6或7天或1至24小时内施用，并且在一个方面，特定时间段为1至3天或2至8小时。
在特定方面，放射疗法在施用双特异性激动性CD40抗原结合分子之前施用。在一个方面，放射疗法与双特异性激动性CD40抗原结合分子的施用同时施用。
治疗方法和组合物
在一个方面，提供一种用于治疗个体的实体瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子和有效量的本文所述的放射疗法。
在一个此类方面，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外治疗剂。合适的额外药剂包括以下一者或多者：蒽环类药物，诸如多柔比星和表柔比星紫杉烷类药物，诸如紫杉醇/>和多西他赛/>氟尿嘧啶(5FU)；环磷酰胺；甲氨蝶呤；顺铂；和卡培他滨。其他合适的额外治疗剂包括激酶抑制剂拉帕替尼(Tykerb)和来那替尼(Nerlynx)。在进一步的实施例中，本文提供一种用于肿瘤缩小的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子和如本文所述的放射疗法。根据上述方面中的任一者的“个体”或“受试者”优选地是人。
在一个方面，本发明提供一种本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其用于治疗或延缓癌症进展的方法中，其中本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法组合使用。在一些方面，本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子和放射疗法与额外治疗剂组合。
在进一步的方面，提供一种用于癌症免疫疗法的组合疗法，其包括本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子和如本文所述的放射疗法。
在进一步的方面，本文提供本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子在制造或制备用于与放射疗法组合的药物中的用途。在一些方面，该药物用于治疗癌症。在一些实施例中，该药物用于治疗实体瘤。在一些实施例中，该药物用于肿瘤缩小的方法中，该方法包括向患有实体瘤的个体施用有效量的药物。在一个这样的方面，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一些方面，该药物用于治疗实体瘤。
在特定方面，个体患有以肿瘤基质中有FAP表达为特征的癌症。在一些方面，该肿瘤可包含过表达FAP的基质。在一些方面，该癌症包含实体瘤。在一些方面，该实体瘤为晚期和/或转移性实体瘤。在一些方面，表达FAP的癌症选自由以下项组成的组：头颈部癌、黑素瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌和胃癌。在一些方面，癌症为头颈部癌。在一些方面，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些方面，实体瘤为来自在早期治疗后复发的癌症的肿瘤。在一些方面，肿瘤来自在早期治疗后复发的头颈部癌。
该治疗可旨在预防实体瘤的发展或生长。因此，可以使用本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法的组合对个体进行预防性治疗以防止出现实体瘤的复发。在一些方面，本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法协同作用。
本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式调配、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文该相同的剂量和施用途径使用，或以本文该剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
制品(试剂盒)
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该试剂盒包括至少一个容器和在该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。这些容器可以由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断该病症的组合物组合，并且该容器可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒中的活性剂为本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子。此外，该试剂盒包括在组合放射疗法中使用本文所述的双特异性激动性CD40抗原结合分子的说明。标签或包装插页指示组合物如何用于治疗所选病症并提供在组合疗法中使用组合物的说明。
替代地或另外地，试剂盒可进一步包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
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关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:Alaboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
细胞培养技术
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中该的标准细胞培养技术。
所有基因均在由MPSV核心启动子与CMV启动子增强子片段组合组成的嵌合MPSV启动子的控制下瞬时表达。表达盒在cDNA的3'末端还含有合成的polyA信号。表达载体也含有用于在含有EBNA(埃-巴二氏病毒核抗原)的宿主细胞中游离型复制的oriP区。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0中将聚集的蛋白与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen)。特别地，使用10％或4-12％/>Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和/>MES(还原凝胶，具有/>抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(SEC)。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC系统上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
质谱法
本节描述了对具有VH/VL交换(VH/VL CrossMab)的多特异性抗体的表征，重点在于该多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性LysC消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMab用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的LysC(罗氏)消化用pH 8的Tris缓冲液中的100μg去糖基化的VH/VL CrossMab分别在室温执行120小时和在37℃执行40min。在质谱法之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来确定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)测定多特异性抗体对相应抗原的结合亲和力(BIACORE)
通过使用BIACORE仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala,Sweden)进行表面等离子体共振来研究产生的抗体与相应抗原的结合。简言之，对于亲和力测量，山羊抗人IgG、JIR 109-005-098抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上，用于针对相应抗原呈递抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％ Tween 20，ph 7.4)中、在25℃(或替代性地在37℃)测量结合。在溶液中加入不同浓度的抗原(R&D系统或内部纯化)。通过注射抗原80秒至3分钟来测量关联性；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1的朗缪尔结合模型来估计KD值。从样品曲线中减去负控制数据(如缓冲曲线)，用于校正系统固有基线漂移和降低噪声信号。使用相应的Biacore评估软件来分析传感图和计算亲和力数据。
实例1
靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD40的双特异性抗原结合分子的制备、纯化和表征
如国际专利申请公开号WO 2018/185045 A1、WO 2020/070041 A1或WO 2020/070035A1中所述，制备靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD40的双特异性抗原结合分子。
特别地，制备以下分子：
a)靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD40的双特异性抗原结合分子
以如下形式制备双特异性FAP-CD40抗体：2+1形式，其由与在Fc的C末端处与一个FAP结合部分组合的两个CD40结合部分组成(图1D)；或4+1形式，其由与在Fc的C末端与一个FAP结合部分组合的四个CD40结合部分组成(图1A或图1B)。双特异性CD40-FAP抗体包括如WO2020/070041A1中所公开的抗FAP克隆212或已在WO 2012/020006 A2中描述的FAP克隆4B9和28H1。为了产生4+1和2+1分子，使用杵臼结构技术以实现异源二聚化。将S354C/T366W突变引入第一重链HC1(Fc杵重链)中，并且将Y349C/T366S/L368A/Y407V突变引入第二重链HC2(Fc臼重链)中。独立于双特异性形式，对于hu IgG1，根据WO 2012/130831 A1中所描述的方法使用效应子沉默Fc(P329G；L234，234A)消除与Fcγ受体的结合。双特异性分子的序列示出于表1。作为对照分子，通过用种系DP47替换FAP克隆相应地制备非靶向版本。
表1：FAP-CD40双特异性抗体
b)鼠替代物和对照分子
以类似的方式，制备包含FAP克隆28H1和与鼠CD40(FGK4.5)结合的CD40克隆的双特异性FAP-CD40抗体以用于利用小鼠的研究。以如下形式制备分子：2+1形式，其由与在Fc的C末端处与一个FAP结合部分组合的两个CD40结合部分组成(图1D)，或4+1形式，其由与一个FAP结合部分(在Fc的C末端处连接的VH和VL，图1B)组合的四个CD40结合部分组成。这些双特异性分子的序列示于表2。作为对照分子，通过用种系DP47替换FAP克隆相应地制备非靶向版本。
表2：鼠替代物和对照分子
实例2
如mEERL95肿瘤模型中所示的靶向FAP的抗CD40抗原结合分子与放射疗法组合的体内抗肿瘤功效
2.1材料和方法
在携带mEERL95肿瘤细胞系的小鼠(一种临床相关的HPV相关头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)小鼠模型)中测试了单独或与大分割放射疗法方案组合的双特异性靶向FAP的抗CD40抗原结合分子实现治疗功效的能力。
自Janvier Labs购得七周龄至八周龄的雌性C57BL/6J小鼠。人源化hCD40Tg小鼠由Roche Glycart AG(Zurich)提供。Batf3-/-小鼠由Hans Acha Orbea博士(洛桑大学(University of Lausanne))友情赠送，并在洛桑大学的设施中饲养。所有动物程序均根据瑞士沃州兽医局(Veterinary Authority of the Swiss Canton of Vaud)批准的许可VD3173j进行。
mEERL95细胞系来源于携带mEERL的C57BL/6J雌性的肿瘤外植体(Mermod等人,Int.J.Cancer 2018,142,2518-2528),并在补充有5％胎牛血清(FBS,Life Technologies)和1x人角质形成细胞生长补充剂(HKGS,Thermo Fisher Scientific)的DMEM/营养混合物F-12(Thermo Fisher Scientific)培养基中培养。TC-1细胞(Lin等人,Cancer Research1996,56,21-26)由T.C.Wu(Johns Hopkins)于2009年友情提供，并在补充有10％FBS(LifeTechnologies)、青霉素/链霉素(Life Technologies)和5x 10-5M 2-巯基乙醇(LifeTechnologies)的RPMI 1640培养基(Life Technologies)中生长。两种细胞系均在37℃和5％ CO2的孵育箱中培养，并进行常规检测以弃置支原体。当达到90％汇合时，收获细胞以用于接种到小鼠中。
肿瘤模型和体内治疗
向小鼠的颏下区域皮下注射重悬于30L HBSS(Hank's平衡盐溶液，Thermo FisherScientific)和20L Matrigel(Corning)中的1x105 mEERL95或TC1细胞。在肿瘤移植后第10天和第11天，使用由两个连续6Gy剂量(2x 6Gy)组成的大分割方案照射肿瘤。使用允许局部照射肿瘤的15-mm准直器，用Xrad-225CX-PXi仪器递送剂量。
在第11天，将小鼠单次i.p注射分别于PBS中的18.3mg/kg和10mg/kg的靶向FAP的双特异性抗muCD40抗体(FAP-CD40)或相应的非靶向抗CD40对照抗体(DP47-CD40)进行治疗。用2x 6Gy方案照射携带mEERL95的huCD40Tg小鼠，并用于PBS中的13mg/kg的单次i.p剂量的FAP-huCD40进行治疗。每周两次使用卡尺跟踪肿瘤大小，并用下式计算体积：
V＝(长x宽2)/2(V＝肿瘤体积)
对于耗尽研究，使用200μg/剂量的抗CD8βmAb(克隆H35-17-2)、抗CD4(克隆GK1.5)或大鼠IgG2a(克隆2A3，BioXCell)作为免疫球蛋白同种型对照，在相对于治疗开始日的第-2天和第0天给予至携带mEERL95的小鼠。抗体的施用每三天进行一次，持续两周。在第18天通过流式细胞术检查外周血淋巴细胞的耗尽效率。对于阻断IL-12的体内实验，从治疗抗体施用的同一天开始，每天用在PBS中稀释的500μg抗IL-12(克隆C17.8，BioXCell)治疗小鼠一周。相同剂量的大鼠IgG2a(克隆2A3，BioXCell)用作免疫球蛋白同种型对照。
肿瘤再攻击
为了表征免疫记忆的发展，将重悬于PBS中的106个mEERL95或105个TC-1肿瘤细胞皮下移植到已在疗法后排斥原发性肿瘤的小鼠的侧腹。在出现完全缓解后约40天进行肿瘤接种。通过每2-3天用卡尺测量一次来跟踪肿瘤生长。
细胞分离
在肿瘤移植后10、16或18天收获肿瘤和区域淋巴结。将收集的肿瘤和淋巴结在37℃下分别与1mg/ml胶原酶-D和40μg/ml DNase-I(Sigma-Aldrich)一起孵育45min和20min。之后，将它们机械分解并使用70-μm细胞滤器(Falcon,BD Bioscience)进行过滤以获得单细胞悬浮液。此外，以35％ Percoll梯度从基质细胞中分离肿瘤浸润性淋巴细胞。需要时，在流式细胞术染色前，用RBC缓冲液(Qiagen)在室温下裂解红血球3min。
流式细胞术
将单细胞悬浮液首先与FcR-Block(抗CD16/32克隆2.4G2，自制)一起在FACS缓冲液(PBS中的2％ FCS和2mM EDTA)中在冰上孵育15min。为了表征免疫群体，将样品在暗处用以下抗体组在冰上表面染色20min：CD11c-BV421(克隆N418)、CD8-BV510(克隆53-6.7)、F4/80-BV605(克隆BM8)、NK1.1-BV650(克隆PK136)、CD11b-BV711(克隆M1/70)、CD4-BV785(克隆RM4-5)、CD19-BV785(克隆6D5)、Ly6G-FITC(克隆1A8)、CD45-PerCP(克隆30-F11)、Ly6C-AF700(克隆HK1.4)、IA/IE-APC-Cy7(克隆M5/114.15.2)和B220-APC(克隆RA3-B2)，来自Biolegend；CD80-Pe-Vio770(克隆16-10A)，来自Miltenyi Biotec；CD103-PE(克隆2E7)、CD3-PE-Cy5.5(克隆145-2C11)和Foxp3-PeFluor-610(克隆FJK-165)，来自eBioscience。根据制造商的说明，用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience)对Foxp3进行细胞内染色。LIVE/DEADTMFixable Blue Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific)用作活力标志物。
对于离体刺激测定，将来自肿瘤和淋巴结的淋巴细胞与mEERL95细胞一起以10:1比率共培养。将mEERL95细胞预先与IFN-γ(200ng/ml；ImmunoTools)一起孵育24h。共培养在存在1μg/ml抗CD28(克隆37.51)和10μg/ml抗PD1(克隆RMP1-14，BioXCell)的情况下进行，并在37℃下在完全培养基中保持16h。未刺激的细胞用作阴性对照。在开始染色前4h，将GolgiPlug和GolgiStop(均为1:1000；BD Biosciences)添加到细胞中。在用CD45-BV650(克隆104，BioLegend)、CD3-(克隆17A2，eBioscience)、CD8-(克隆53-6.7，eBioscience)、CD4-(克隆GK1.5，BioLegend)进行表面染色后，将细胞用固定缓冲液(BioLegend)在冰上固定和透化20min。之后，将细胞悬浮液用以下在Perm/洗涤缓冲液1x(BioLegend)中稀释的细胞内抗体在冰上染色30min：IFNγ-PerCp-Cy5.5(克隆XMG1.2，eBioscience)、TNFα-PB(克隆MP6-XT22，BioLegend)和颗粒酶B-PerCp-Cy5.5(克隆QA16A02，BioLegend)。用LSRII-SORP和Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)获取样品。使用FlowJo v10(FlowJo LLC)进行数据分析。
免疫荧光和成像
将肿瘤块包埋在CellpathTM OCT低温切片包埋基质(Cell Path Ltd.Newton,Powys UK)中并在干冰上冷冻。将十微米冰冻切片在2％多聚甲醛(PFA，Sigma)中固定10min，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。将一抗在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)、0.3％ Triton X-100(AppliChem GmbH Germany)和1％来自二抗的相同宿主物种的血清的PBS中孵育。将载玻片在4℃的潮湿室中保存过夜。在用PBS洗涤三次后，将样品在室温下用二抗染色一小时。将组织切片再用PBS洗涤三次，并用含有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的ProlongTM Gold抗褪色试剂封片。在进行免疫荧光法后，将载玻片在ZEISS AxioScan Z1上数字化。用FIJI(一个用于生物图像分析的开源平台)(Schindelin等人,NatureMethods 2012,9,676-682)使用定制脚本进行下游分析。简而言之，使用DAPI染色估计切片的总面积，同时使用E-钙粘蛋白染色测量肿瘤面积。对于诸如免疫细胞的界限分明的细胞的定量，基于每个分析区域检测到的阳性细胞计数来计算浸润指数。对于不可辨别的细胞(诸如间充质细胞)群，通过计算免疫染色呈阳性的区域的大小除以所分析区域的总大小之间的比率来进行定量。
免疫组织化学
收集淋巴结并在4℃下固定在1％ PFA中过夜，用PBS洗涤两次并在30％蔗糖溶液中在4℃下孵育3-6h。之后，将淋巴结包埋在OCT包埋基质(Cell Path Ltd.Newton,PowysUK)中并在干冰上冷冻。将八微米冰冻切片直接与针对小鼠FAP的一抗(克隆4B9，RocheGlycart AG)一起在4℃下孵育16h。在洗涤后，将样品与作为二抗的生物素缀合的山羊抗兔一起孵育，并用Vectastin ABS试剂盒(Vector labs)显示。
多重测定
根据制造商的说明，用LegendPlexTM小鼠促炎性趋化因子组和LegendPlexTM小鼠炎症组(均来自Biolegend)测量血清和肿瘤中的细胞因子和趋化因子浓度。使用LegendPlexTM数据分析软件(Biolegend，San Diego CA)进行分析。
RNA提取、实时和基因表达分析
使用DirectZolTMRNA MiniPrep Kit(ZymoResearch)从肿瘤块中提取总RNA。用M-MLV逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录，并在ABI Prism 7500快速装置(Thermo FisherScientific)上用Fast SyberGreen PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)进行定量实时PCR(q-PCR)。使用小鼠Fap cDNA的引物进行qPCR(fw：5’-GTCACCTGATCGGCAATTTGT-3’，rev：5’-CCCCATTCTGAAGGTCGTAGAT-3’)，引物的表达经小鼠Tbp水平(fw:5’-CCTTGTACCCTTCACCAATGAC-3’，rev：5’-ACAGCCAAGATTCAC GGTAGA-3’)归一化。表达根据此式表示：
2ΔCt(Ct tbp-Ct fap)，其中Ct对应于循环数。
为了研究肿瘤微环境中免疫相关基因的表达，将在第14天从肿瘤中提取的100ng总RNA与PanCancer免疫分析面板(NanoString Technologies)杂交。使用nSolverTM 2.6软件(NanoString Technologies，Seattle)用来自面板的选定管家基因对基因计数进行归一化。
统计分析
用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla,CA)分析免疫细胞频率和肿瘤生长以及小鼠存活的差异。使用用于多重比较的T检验、ANOVA或相应的非参数检验(Mann-Whitney或Kruskal-Wallis)。对数秩检验用于存活分析。<0.05的P值被认为是显著的。
2.2结果
FAP-CD40与RT组合疗法的组合是安全、高效的，并且需要经由FAP进行交联来介导对肿瘤生长的控制
为了测试靶向FAP的CD40双特异性抗体(FAP-CD40)的治疗潜力，使用原位头颈部肿瘤模型(mEERL95)，该模型先前已生成(Mermod等人,Int.J.Cancer 2018,142,2518-2528)并且重现了该疾病的关键临床方面，包括FAP阳性基质。在第一个实验中，根据图2A中所示的方案，研究了单独或与大分割放射疗法(由两个连续6Gy剂量组成)组合或不组合的FAP-CD40的抗肿瘤功效和安全性。非靶向DP47-CD40对照双特异性抗体(DP47为种系对照)与仅PBS治疗一样，在荷瘤小鼠中没有显示出抗肿瘤作用(图2C和图2D)。相反，FAP-CD40导致40％的经治疗小鼠肿瘤完全消退，随后一只小鼠肿瘤复发(图2E)。这些结果表明FAP-CD40需要经由FAP进行交联才能在治疗上有效。
单独(图2F)或与对照DP47-CD40抗体(图2G)一起给予的局部放射疗法，与对照组(即未经PBS治疗和经DP47-CD40治疗的小鼠(图2C和图2D))相比，导致肿瘤生长延迟和存活增加。然而，从mEERL95肿瘤植入后第20天起，经2x 6Gy和2x 6Gy+DP47-CD40治疗的肿瘤开始复发，因此没有产生客观完全缓解(CR)。有趣的是，所有荷瘤小鼠都对放射疗法(2x 6Gy)与FAP-CD40抗体的组合有应答，这在83％(5/6)的动物中诱发完全肿瘤消退和持久控制(图2H)。在第13天额外剂量的抗FAP-CD40没有改善组合的结果(图2K和图2L)。总体而言，在5个CR中的2个，与PBS和DP47-CD40对照组相比，用FAP-CD40作为单一药剂治疗的小鼠显著增加了总存活(图2B)。值得注意的是，在长时间段观察(超过90天)后，组合治疗的所有应答小鼠保持未复发，表明这种FAP-CD40放射免疫疗法组合不仅诱导了高肿瘤消退率，而且还延长了动物存活期(图2B)。
FAP-CD40抗体作为单一药剂或与大分割放射疗法组合的功效不伴随全身毒性，这是在用CD40激动性单克隆抗体的疗法中观察到的共同特征(Vonderheide等人,J.Clin.Oncol.2007,25(7),876-883；Medina-Echeverz等人,Cancer Immunol.Res.2015,3(5),557-566或Vonderheide等人,Oncoimmunology 2013,2(1):e23033)。在第二个比较实验中，用FAP-CD40抗体治疗的荷瘤小鼠没有出现体重减轻，而单次注射与RT组合或不组合的(相同摩尔浓度的)CD40 mAb诱导显著的体重减轻以及与双特异性FAP-CD40抗体疗法介导的相当的肿瘤生长控制。第二个实验的结果示于图3A至图3F中，图3G中显示了相应的体重变化。
在肿瘤基质中存在表达FAP的成纤维细胞为有效的FAP-CD40活性所需
FAP，一种脯氨酰内肽酶，在来自人HNSCC的癌症相关成纤维细胞(CAF)中高度表达，并在mEERL95模型中重现，如图4A中所示。为了进一步研究FAP-CD40介导的抗肿瘤活性是否需要表达FAP的基质成纤维细胞，使用表达突变型H-ras、HPV16 E6和E7蛋白(Lin等人,Cancer Research 1996,56,21-26)但没有FAP表达(Dupperet等人,Clin.CancerRes.2018,24(5),1190-1201)的小鼠TC-1肺癌细胞。植入颏下区域的TC-1肿瘤细胞导致肿瘤具有瘤周表达αSMA的CAF和一些αSMA阳性、FAP阴性细胞的瘤内区域(图4A和图4B)。与免疫染色结果一致，Fap基因的mRNA表达水平在TC-1肿瘤中显著降低(图4B)。
一致地，并且不同于mEERL95模型中观察到的结果，TC-1肿瘤对单独的FAP-CD40没有应答并且在用单独的RT或2x 6Gy和FAP-CD40的组合治疗后仅显示9％(1/11)的完全缓解(CR)(图4D至图4G)。为了评定FAP-CD40抗体进入TC-1肿瘤的情况，我们将用Alexa647标记的抗FAP-CD40抗体腹膜内注射到接受局部照射的携带TC-1和mEERL95肿瘤的小鼠中。在施用后四天，在两个肿瘤中都可检测到抗体。在呈现相似CD40mRNA表达水平(图4C)的TC-1和mEERL95肿瘤二者(图4H)中未检测到荧光强度的显著差异。这些结果表明FAP-CD40确实能够靶向存在于TC-1肿瘤微环境中的表达CD40的细胞，但无法促进保护性免疫，这是因为在没有FAP介导的交联的情况下不会发生CD40信号传导的活化。
由于FAP也存在于淋巴结基质隔室中，尤其是存在于成纤维细胞网状细胞(FRC)中(Denton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014,111(33),12139-12144)，检查了来自两种肿瘤模型的区域淋巴结中的FAP水平。在接种后10天，通过IHC在来自mEERL95和TC-1颏下肿瘤二者的颈部淋巴结中检测到FAP表达(图4I)。通过流式细胞术测量的在FRC(gp38+CD31-)上FAP的频率和表达在携带TC-1和mEERL95的小鼠中也相似(图4J和图4K)。这些结果强调了肿瘤基质中FAP表达的需求。
FAP-CD40与放射疗法的组合促进长期抗肿瘤保护性免疫
为了确定放射疗法(2x 6Gy)与抗FAP-CD40治疗的组合是否能够在携带mEERL95肿瘤的小鼠中诱导肿瘤特异性长期保护性免疫记忆，将那些在使用组合后排斥mEERL95原发性肿瘤的小鼠(长期应答者)在右侧用同源肿瘤再攻击(图5A)。所有小鼠都控制了肿瘤生长并最终排斥它们，表明存在特异性免疫记忆(图5B)。由于mEERL95细胞表达HPV16 E7蛋白，我们假设此类蛋白可能是观察到的免疫记忆的免疫显性靶抗原。为了检验这一假设，使治愈的小鼠在左侧暴露于TC-1细胞系的第二次再攻击，该细胞系也表达E7蛋白(图5A)。8只小鼠中仅有3只能够排斥TC1细胞，表明E7在这种情况下可能不是免疫显性抗原(图5C)。此外，大约40％-60％的长期应答小鼠(在使用FAP-CD40作为单一药剂或与RT组合治疗后排斥mEERL95原发性肿瘤)在PBMC的体外扩增后呈现E7特异性T淋巴细胞(图5D)。事实上，与未经治疗的肿瘤相比，在使用组合后mEERL95肿瘤微环境中E7特异性CD8 T细胞的频率(通过特异性四聚体染色检测)降低(图5E)。
在令人鼓舞的结果的推动下并且为了促进这种组合疗法向临床的转化，由抗小鼠FAP部分构成但靶向人CD40受体(FAP-huCD40)的替代双特异性抗体的抗肿瘤特性在进一步的实验中进行了测试。因此，将mEERL95肿瘤细胞接种到表达人CD40受体的转基因小鼠(huCD40 Tg小鼠)的颏下区域。按照与携带野生型肿瘤的小鼠相同的治疗计划，用两个连续6Gy剂量对肿瘤进行局部照射。之后，恰在第二次放射疗法期间以i.p.注射FAP-huCD40抗体对小鼠进行施用(图6A)。在没有观察到完全缓解的情况下，作为单一药剂的FAP-huCD40在肿瘤生长或存活方面相对于未经治疗的小鼠没有差异(图6B和图6D)。与FAP-CD40和对照小鼠相比，接受2x6Gy的小鼠减缓肿瘤生长，诱导肿瘤消退并增加存活；然而，它们中无一者完全排斥肿瘤(图6B和图6E)。2x6Gy和FAP-huCD40的组合产生40％的完全缓解(4/10)，并且与其余组相比显著延长了长期存活期(图6F和图6B)。
FAP-CD40与放射疗法的组合将肿瘤免疫微环境重塑为免疫抑制程度较低的景观
基于第一个实验(图2A)，探索了与该组合的抗肿瘤作用相关联的细胞和分子免疫组分。在第一次放射疗法剂量后八天分析肿瘤内免疫浸润。使用基于流式细胞术的16色抗体组，与PBS和DP47-CD40相比，在所有治疗组中观察到每毫克肿瘤的免疫细胞(CD45+细胞)的数量总体增加(图7A)。与PBS和DP47-CD40对照相比，CD8 T细胞的数量在照射后显著增加。这种增加在FAP-CD40单一疗法和组合治疗后不太明显(图7B)。与对照小鼠相比，肿瘤中存在的调节性T细胞(Treg)的数量仅在放射疗法后增加(图7C)，导致FAP-CD40、RT和组合治疗组中CD8/Treg比率增加(图7D)。有趣的是，CD8细胞/巨噬细胞比率仅在FAP-CD40+2x6Gy组中增加，支持了一观点，即该组合可能改变有利于肿瘤中CD8 T细胞浸润的平衡的(图7E)。在这种情况下，尽管与未经治疗的小鼠相比，CD4 T细胞(图7F)、树突状细胞(DC，图7G)和NK(图7H)的频率随着不同的治疗而降低，但每毫克肿瘤的数量在所有组中相当。
此外，在针对mEERL95细胞的离体再刺激测定中，观察到来自用FAP-CD40和RT治疗的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的CD8和CD4 T细胞产生的IFNγ有所增加(图8A和图8D)。TNFα和颗粒酶B在两个T细胞亚群中也得到增强(图8B、图8C、图8E和图8F)，表明效应和细胞毒性表型。CD8 TIL的增殖(以Ki67阳性细胞测量)(图8G)在所有治疗组中与对照组相比均有所增加，而PD-1的表达以FAP-CD40依赖性方式保持较低水平，表明耗尽较少的表型(图8H)。组合疗法促进了来自区域淋巴结的CD8 T细胞上的记忆表型(CD62L+CD44+)(图8I)。
与未经治疗的肿瘤相比，组合疗法通过上调399个免疫相关基因和下调39个免疫相关基因，显著增强了肿瘤微环境的分子重塑。这种由组合疗法触发的分子印记包括诱导不同途径的表达，这些途径涉及适应性免疫应答、抗原加工、干扰素信号传导、炎症、趋化因子和细胞因子或DC功能。在接受2x 6Gy和FAP-CD40治疗的组合疗法的肿瘤中发现了树突状细胞特异性炎症基因特征的显著富集，包括Cd40、Ccl22、Il12b、Irf8和Ccr7上调。通过多重细胞因子/趋化因子测定，γ证实IFN水平和某些趋化因子(诸如CXCL9和CXCL10)的肿瘤内水平的上调是由组合疗法触发的(图9A、图9B和图9C)。我们还发现在使用2x6Gy+FAP-CD40后对于来自mEERL95浸润物的DC的表面上的成熟标志物(诸如CD80和CD86)的诱导(图9E和图9F)。
总而言之，这些数据表明，FAP-CD40疗法与使用2x 6Gy的RT的组合的显著功效与肿瘤免疫景观的重大重塑相关联，包括免疫抑制减少、CD8 T细胞浸润和增殖增加、细胞因子产生和DC成熟。
该组合的治疗功效依赖于CD8 T细胞和交叉引发DC，并依靠于CD4T细胞以预防复发
通过体内选择性耗尽，检查T淋巴细胞对组合疗法的抗肿瘤作用的贡献。在开始疗法前四十八小时，从治疗性处理前48h开始每三天一次使携带mEERL95肿瘤的小鼠接受i.p.注射抗CD8β、抗CD4或相应的IgG对照抗体。用靶向CD8 T淋巴细胞的抗体对小鼠进行耗尽治疗导致在组合疗法后观察到的疗效消除(图10C)。耗尽CD4 T细胞的小鼠截至治疗后第30天显示出完全缓解(图10D)。然而，来自该组的7只小鼠中的2只(28％)经历了肿瘤复发，相比于来自IgG对照组的7只小鼠中的5只(71％)经历了肿瘤复发(图10B)，导致存活减少(图10E)。这些结果突出了CD4T细胞在形成持久抗肿瘤应答中的重要作用。
组合疗法后肿瘤中DC成熟转录特征的富集表明活化的Batf3依赖性DC的作用以及CD8 T细胞-cDC1串扰在CD8 T细胞介导的应答中的必要性。因此，我们试图在没有此类免疫群体的情况下测试组合疗法。如图10F至图10I所示，RT(2x6Gy)和FAP-CD40治疗的组合的疗效在Batf3-/-小鼠(缺乏cDC1)中被消除。尽管与未经治疗的荷瘤Batf3-/-小鼠相比，一些经治疗的Batf3-/-小鼠的肿瘤生长动力学有所降低，但与经治疗的荷瘤野生型小鼠相比，组合疗法的抗肿瘤作用被消除，表明FAP-CD40介导的稳健保护性应答需要交叉引发DC。
在T细胞效应期期间阻断IL-12会消除组合疗法的功效
鉴于IL12b是组合疗法后肿瘤差异表达最高的基因之一，并且已知IL-12的细胞溶解活性，研究了其在对RT(2x 6Gy)和FAP-CD40的组合的治疗应答中的功能相关性。因此，从放射疗法前一天开始，施用阻断IL-12的抗体七天。如图11C所示，在所有小鼠中，肿瘤在组合疗法和IL-12中和后消退，但肿瘤在85％的小鼠(7只中有6只)中恢复了生长，从而强烈支持IL-12在实现由组合疗法介导的抗肿瘤作用的全部强度中的关键作用。有趣的是，当抗肿瘤活性可能主要归因于放射疗法时，IL-12的阻断不会影响早期阶段的应答。IL-12中和后治疗功效的丧失伴随着树突状细胞产生的某些趋化因子(诸如CXCL9、CXCL10、CCL4和CCL22)的血清水平的降低(图11D至图11G)，此与T细胞招募、迁移和引发相关联。
2.3结果讨论
已经表明，双特异性FAP-CD40抗体与RT的组合是一种安全且有效的新型策略，以在HPV+HNSCC中增强放射疗法并实现持久的保护性免疫记忆。这种组合的关键组成部分是基于经由靶向表达FAP的基质细胞来限制针对肿瘤微环境的CD40激动剂的活性。我们能够确定相关的治疗方案，并表明CD8 T细胞-DC1轴驱动了在肿瘤处进行IL12诱导后的主要细胞作用机制。总之，这些结果为将这种治疗方法转化为临床提供了强有力的生物学依据。此外，在使用放射疗法与双特异性替代FAP-huCD40抗体的组合后，通过人类CD40信号传导介导的显著效果支持了这种方法的临床适用性，该方法不仅可以治疗头颈部癌患者，还可以治疗其他以表达FAP的成纤维细胞的基质积聚为特征的癌症类型。
此外，还探索了该疗法对肿瘤免疫细胞景观的影响和作用机制。出于以下几个原因选择头颈部癌(mEERL95)的原位模型：第一，该模型模拟在原发性肿瘤复发患病率较高情况下的人类疾病；以及其次，在mEERL95基质中发现高水平的FAP。最后一个特征是验证FAP-CD40抗体的治疗效率的关键。
FAP-CD40仅在与FAP+细胞交联时诱导CD40共刺激。这种双特异性抗体的此类内在特征，即将CD40治疗抗体靶向至其中表达FAP的细胞和表达CD40的细胞共定位的肿瘤区域，是避免在使用CD40激动剂的情况下所描述的经典全身毒性模式的关键。FAP(成纤维细胞活化蛋白)是主要由来自肿瘤基质的促肿瘤活化成纤维细胞表达的内肽酶，但它也可以存在于其他基质隔室中，诸如来自淋巴结的FRC。通过处理TC-1肿瘤模型，其中组合疗法的最小功效与低瘤内FAP表达一致，发现肿瘤基质处FAP介导的交联对于FAP-CD40抗体的抗肿瘤作用至关重要。尽管通过体内荧光成像在肿瘤区域中检测到FAP-CD40抗体，但我们不能正式排除该抗体在邻近淋巴结中的存在。然而，在TC-1和mEERL95肿瘤的区域淋巴结中同样存在FAP阳性细胞以及它们对疗法的相反反应提供了间接证据，表明在这些所研究的肿瘤模型中，FAP-CD40+RT介导的抗肿瘤免疫活化发生在肿瘤床中。了解FAP-CD40在免疫‘冷’肿瘤中如何表现将会很有趣。
在mEERL95肿瘤中报告的功效大小和应答小鼠中没有复发使得值得在生物学水平上进行进一步研究。用FAP-CD40和RT的组合治疗的动物的长期存活以及在经再攻击的治愈小鼠中对同源肿瘤的排斥支持该组合对长期免疫记忆具有作用，这与在局部淋巴结中发现的对于T细胞记忆表型的诱导一致。虽然对特定抗原的鉴别超出了研究范围，但我们排除了E7(一种明显的抗原，因mEERL95呈HPV+)的影响。这些数据与其他报告一致，在这些其他报告中，接种单独或与其他免疫疗法组合的该肽可增强肿瘤临床前模型中的E7特异性应答。
该组合在T细胞耗尽的小鼠中的作用的消除证实了此类群体对治疗结果极其重要。虽然该组合的抗肿瘤作用需要CD8 T细胞，但CD4 T淋巴细胞对于产生持久应答和预防复发以及强大的免疫CD8-T记忆至关重要，这已在疫苗和病毒感染背景中得到证实(Ahrends等人,Nat.Commun.2019,10(1),5531)。此类发现也得到了先前临床前研究的支持，在这些临床前研究中，CD4 T细胞介导的免疫应答在抗CD40疗法中极其重要。
放射疗法和抗FAP-CD40组合疗法的治疗效果伴随着肿瘤免疫景观的深刻重塑。调节性T细胞和巨噬细胞的减少表明该组合促使免疫抑制背景减弱，从而有利于效应T淋巴细胞的功能。在这方面，我们发现肿瘤内IFNγ水平增加，这与诸如细胞因子的产量提高，以及在来自用FAP-CD40和放射疗法的组合治疗的肿瘤的经再刺激TIL上的低PD-1表达水平一致。事实上，IFNγ，被假定为与IL-12组合之在CD40介导的抗肿瘤应答中的关键因素(Garris,Immunity 2018,49(6),1149-1161)，在组合后以FAP-CD40特异性方式被诱导。有趣的是，在应答的效应期期间的IL-12中和消除了组合治疗的治疗效果，表明FAP-CD40依赖于诸如细胞因子来发挥功效。已知活化的交叉引发树突状细胞为人类和小鼠中IL-12的主要生产细胞(Maier等人Nature 2020,580,257-262)。从这个意义上来说，以下两个值得注意的发现表明这些细胞在组合的作用机制中极其重要。第一，在肿瘤微环境中在用FAP-CD40和放射疗法的组合治疗后，活化的交叉引发树突状细胞特异性基因特征富集，第二，缺乏cDC1细胞的Batf3ko小鼠丧失抗肿瘤应答。这些观察结果与先前的研究一致，这些研究报告了抗CD40疗法对交叉引发树突状细胞的依赖性(Garris,Immunity 2018,49(6),1149-1161)。尽管巨噬细胞已被描述为在CD40介导的应答中发挥作用(Beatty等人,Science2011,331,1612-1616)，但它们数量的减少和IL-12的关键作用表明，在本文背景中的放射免疫治疗效果主要由树突状细胞介导。
组合治疗在安全性和抗肿瘤应答方面获得的结果支持将这种新颖治疗方法转化为临床，该治疗方法结合了黄金标准护理、放射疗法与新颖且安全的分子工程化CD40靶向免疫疗法。
实例3
如SV2肺肿瘤模型中所示的靶向FAP的抗CD40抗原结合分子与放射疗法组合的体内抗肿瘤功效
3.1材料和方法
在携带SV2肿瘤细胞系的小鼠(一种非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型)中测试了与大分割放射疗法方案组合的双特异性靶向FAP的抗CD40抗原结合分子实现治疗功效的能力。
自Charles River Labs购得十周龄的雄性C57BL/6J小鼠。所有动物程序均根据瑞士沃州兽医局(Veterinary Authority of the Swiss Canton of Vaud)批准的许可VD3173.1进行。SV2细胞系来源于KP肿瘤(KrasLSL.G12D/wt；p53frt/frt)并且获自Meylan Lab。如先前所述用OVA转导SV2细胞系(Martinez-Usatorre A,Romero P,Generation ofaffinity ranged antigen-expressing tumor cell lines,Methods Enzymol.2020,632,503-519,doi:10.1016/bs.mie.2019.12.001.Epub 2019年12月18日。PMID:32000912)并在含有GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)并补充有10％ FBS(Life Technologies)的DMEM培养基中培养。将细胞在37℃和5％ CO2的孵育箱中培养。
肿瘤模型和体内治疗
向小鼠尾静脉处静脉内注射重悬于PBS(Thermo Fisher Scientific)中的1x106个SV2-OVA细胞。在第12天，向小鼠静脉内注射从未处理的脾脏中分离的1x105个OT1细胞。在肿瘤细胞移植后第13天和第14天，使用由两个连续6Gy剂量组成的大分割方案照射肺。使用允许局部照射肺的20-mm准直器，用Xrad-225CX-PXi仪器递送剂量。在第14天和第18天，腹膜内注射于PBS中的18.3mg/kg的抗FAP-CD40(P1AD9139)治疗小鼠。每周两次使用U-CT系统(MILabs)跟踪肿瘤大小，并使用Imalytics Preclinical进行图像分析。
3.2结果
FAP-CD40与RT之组合显著延迟SV2肺肿瘤模型中的肿瘤生长
为了测试靶向FAP的CD40双特异性抗体(FAP-CD40)的治疗潜力，向小鼠移植150万个SV2-OVA，并使其接受2次6Gy次优剂量和2次FAP-CD40剂量。治疗前，使小鼠i.v.接受100000个OT1。治疗计划表示于图3A中。据观察，与使用单独RT的治疗相比，RT和抗FAP-CD40的组合延迟了肿瘤生长(图3B)。与未经治疗的小鼠相比，该组合还可以将存活期再延长20天(图3C)。
***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 与靶向 FAP 的 CD40 激动剂的组合疗法
<130> P36518-WO
<140> PCT/EP2021/081610
<141> 2021-11-15
<150> EP20207768.1
<151> 2020-11-16
<160> 81
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-H1
<400> 1
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Gly
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<220>
<223> hu CD40 CDR-H3
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu CD40 CDR-L1
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<212> PRT
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<220>
<223> hu CD40 CDR-L3
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<220>
<223> hu CD40 VL
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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Gly
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<220>
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<400> 12
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Leu Ser Phe Ile Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-L2
<400> 13
Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Ser Asn Glu Val Pro Tyr Thr
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化 FAP (212) VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化 FAP (212) VL
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 5
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<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 18
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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<213> 人工序列
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Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
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<213> 人工序列
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<223> FAP(28H1) CDR-L1
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<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
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Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 22
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Tyr Ala Met Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 26
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 29
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 30
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 34
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 35
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 35
Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 36
<211> 761
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 36
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
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690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile
725 730 735
Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe
740 745 750
Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 37
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠 FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 37
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1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp
35 40 45
Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile
225 230 235 240
Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp
290 295 300
Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Ile Leu Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr
705 710 715 720
Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 38
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴 FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 38
Arg Pro Pro Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Phe Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 39
<211> 289
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 39
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Leu Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
His Asp Gly Gln Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr
35 40 45
Ser His Cys Thr Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Phe Ser Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Arg His Cys Glu Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr
85 90 95
Ala Glu Ser Asp Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr
100 105 110
Ser Lys Asp Cys Glu Ala Cys Ala Gln His Thr Pro Cys Ile Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Met Glu Met Ala Thr Glu Thr Thr Asp Thr Val Cys His
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Gln Ser Ser Leu Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Tyr Pro Trp Thr Ser Cys Glu Asp Lys Asn Leu Glu Val Leu Gln
165 170 175
Lys Gly Thr Ser Gln Thr Asn Val Ile Cys Gly Leu Lys Ser Arg Met
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 G4S
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)2
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (SG4)2
<400> 42
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 G4(SG4)2
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 44
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)3
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)4
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 47
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 48
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 49
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 50
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 51
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 52
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 53
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 54
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H1
<400> 55
Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H2
<400> 56
Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-H3
<400> 57
His Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L1
<400> 58
Arg Ala Ser Asp Ser Val Ser Thr Leu Met His
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L2
<400> 59
Leu Ala Ser His Leu Glu Ser
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 CDR-L3
<400> 60
Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 61
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (P1AE1689) 轻链交叉 VH-Cκ
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys
225
<210> 62
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD40) 轻链（带电荷的）
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 63
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷的）Fc 杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1)
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
465 470 475 480
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly
485 490 495
Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
500 505 510
Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala Arg
515 520 525
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
530 535 540
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Glu
545 550 555 560
Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
565 570 575
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
580 585 590
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
595 600 605
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
610 615 620
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
625 630 635 640
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
645 650 655
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
660 665 670
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
675
<210> 64
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷的）Fc 臼_PGLALA
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 65
<211> 907
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷的_VH1a (CD40)（VHCH1 带电荷的）-Fc
杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1)
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
225 230 235 240
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
245 250 255
Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser
260 265 270
Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr
275 280 285
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile
290 295 300
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
660 665 670
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
675 680 685
Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
705 710 715 720
Asp Asn Tyr Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
725 730 735
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly
740 745 750
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
755 760 765
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
770 775 780
Gln Ser Asn Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
785 790 795 800
Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
805 810 815
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
820 825 830
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
835 840 845
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
850 855 860
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
865 870 875 880
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
885 890 895
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
900 905
<210> 66
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷的）_VH (CD40)（VHCH1 带电荷的）-Fc
臼_PGLALA
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
225 230 235 240
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
245 250 255
Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser
260 265 270
Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr
275 280 285
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile
290 295 300
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
580 585 590
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
660 665 670
<210> 67
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 轻链交叉 VH-Cκ
<400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
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195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 68
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷的）Fc 杵_PGLALA_28H1 (VL-CH1)
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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770 775 780
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
785 790 795 800
Glu Ile Lys
<210> 74
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) 轻链交叉 VH-CL
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
145 150 155 160
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
180 185 190
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
195 200 205
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215 220
<210> 75
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD40) 轻链（带电荷）
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Arg
115 120 125
Lys Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 76
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40) （VHCH1 带电荷的）Fc 杵_PGLALA FAP(28H1) (VL-CH1)
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln
180 185 190
Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp
195 200 205
Glu Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
210 215 220
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Ala
245 250 255
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
260 265 270
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn
275 280 285
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp
340 345 350
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile
355 360 365
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Asp Asn
370 375 380
Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Asp
385 390 395 400
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
405 410 415
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
420 425 430
Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
450 455 460
Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
465 470 475 480
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
485 490 495
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg
500 505 510
Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
515 520 525
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
530 535 540
Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
545 550 555 560
Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
565 570 575
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
580 585 590
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
595 600 605
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
610 615 620
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
625 630 635 640
Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
645 650 655
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
660 665
<210> 77
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (CD40)（VHCH1 带电荷）Fc 臼_PGLALA
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln
180 185 190
Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp
195 200 205
Glu Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
210 215 220
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Ala
245 250 255
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
260 265 270
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn
275 280 285
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met Ala Lys Asp
340 345 350
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile
355 360 365
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn
370 375 380
Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
405 410 415
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
420 425 430
Ser His Ser Pro Gly
435
<210> 78
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VH
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Asp Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg His Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mu CD40 VL
<400> 79
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Asp Ser Val Ser Thr Leu Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) VH
<400> 80
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Arg Gly Ile His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP (212) VL
<400> 81
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (27)

1.一种用于在治疗个体的实体瘤中使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法组合使用，并且其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域。
3.根据权利要求1或2所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子用于与所述放射疗法同时或依次施用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子用于在所述放射疗法后施用。
5.根据权利要求1至4中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述放射疗法包括选自外照射放射疗法或近距离放射疗法的局部放射疗法。
6.根据权利要求1至5中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述放射疗法包括局部大分割放射。
7.根据权利要求1至6中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述放射疗法包括剂量在1.8至20Gy范围内的局部大分割放射。
8.根据权利要求1至6中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述放射疗法包括剂量在2x6Gy范围内的局部大分割放射。
9.根据权利要求1至8中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述实体瘤选自由以下项组成的组：头颈部癌、黑素瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、胶质母细胞瘤和肉瘤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述实体瘤为头颈部癌。
11.根据权利要求1至9中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述实体瘤为肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
12.根据权利要求1至10中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子为包含IgG Fc结构域、具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域的抗原结合分子，并且其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗体与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
13.根据权利要求12所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含人IgG1亚类的Fc结构域，所述Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD40)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD40)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
(i)至少一个能够与CD40特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD40)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCD40)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(ii)至少一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQID NO:16的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)一个能够与FAP特异性结合的抗原结合结构域，其在N末端处与所述Fc区的C末端融合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含：
a)至少两个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其在C末端处与Fc区的N末端融合，以及
(b)能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其与所述Fc区的C末端融合。
22.根据权利要求21所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含能够与FAP特异性结合的交叉fab片段，其中所述交叉fab片段的VH-Cκ链与所述Fc区的C末端融合。
23.根据权利要求1至22中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含四个能够与CD40特异性结合的Fab片段，其中每两个Fab片段彼此融合并且在其C末端处与Fc区的N末端融合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述使用的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中
(i)所述个体当用治疗有效量的所述双特异性激动性CD40抗原结合分子与放射疗法组合治疗时，与接受所述双特异性激动性CD40抗原结合分子作为单一疗法或接受放射疗法作为单一疗法的个体相比，存活增加，或者
(ii)其中所述个体中的所述实体瘤的尺寸的减小量大于通过使用用作单一疗法的所述双特异性激动性CD40抗原结合分子和用作单一疗法的所述放射疗法治疗来减小所述尺寸的加和量。
25.一种药物组合物，其包含用于在实体瘤的治疗中使用的药物有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子，其中所述治疗包括与放射疗法的组合并且所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
26.双特异性激动性CD40抗原结合分子在制备用于治疗个体的实体瘤的药物中的用途，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子用于与放射疗法组合并且包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
27.一种用于治疗个体的实体瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的双特异性激动性CD40抗原结合分子和有效量的放射疗法，其中所述双特异性激动性CD40抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。
***
CN202180076560.3A 2020-11-16 2021-11-15 与靶向fap的cd40激动剂的组合疗法 Pending CN117916261A (zh)

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PCT/EP2021/081610 WO2022101458A1 (en) 2020-11-16 2021-11-15 Combination therapy with fap-targeted cd40 agonists

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