CN111971090A - 双特异性egfr/cd16抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了用于使NK细胞与EGFR阳性细胞结合的四价、双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白。描述了具有不同药代动力学(PK)特性的EGFR/CD16A抗原结合蛋白。进一步描述了双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白在治疗EGFR阳性恶性肿瘤例如EGFR阳性肿瘤中的用途。

Description

双特异性EGFR/CD16抗原结合蛋白
技术领域
本发明涉及用于使NK细胞与EGFR阳性细胞结合的四价、双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白，以及它们在治疗EGFR阳性恶性肿瘤例如EGFR阳性肿瘤中的用途。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是经过验证的用于治疗几种实体瘤的靶标。目前的靶向EGFR的单克隆抗体(mAbs)和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)主要通过阻断信号传导来发挥作用。此外，这些药物的治疗效果取决于受体或信号通路的突变状态，例如酪氨酸激酶结构域中的T790M看门(Gatekeeper)突变或信号转导级联(例如RAS或RAF)下游的突变，这可能会在许多患者中导致治疗内在或获得性抗性。另外，靶向EGFR的疗法与被认为影响处方率的副作用相关。
表皮生长因子受体(EGFR)是HER受体酪氨酸激酶家族的成员，由四个成员组成：EGFR(ErbB1/HER1)、HER2/neu(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。通过配体结合(例如EGF、TGFa、HB-EGF、神经调节蛋白、细胞素、双调蛋白)刺激受体可通过酪氨酸磷酸化激活内在受体酪氨酸激酶，并促进与HER家族成员的同型或异型二聚化。这些磷酸化酪氨酸充当各种衔接蛋白或酶(包括MAPK和PI(3)K/Akt)的停靠位，它们同时启动许多信号级联，从而影响细胞增殖、血管生成、凋亡抗性、侵袭和转移。
酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族已被描述为是多种病理生理状态(例如恶性肿瘤)的发展和增长的驱动因素，并且在许多人的上皮癌中发现了EGFR的异常表达或活性。特别地，已经描述了在许多癌症中扩增EGFR基因，并且已经描述并很好地表征了EGFR中的许多激酶激活突变。EGFRvIII是EGFR的胞外结构域突变体，该突变是由于跨越EGFR编码序列的外显子2-7的碱基对的框内缺失而导致的，从而使该突变体无法与配体结合。据报道，在EGFRvIII突变的肿瘤中，EGFR信号具有组成性活性，从而推动了肿瘤的发展。同样，已证明结合并激活包括EGFR的HER家族成员的配体在自分泌刺激循环中过表达或有相关性。此外，已经描述了在许多导致自身磷酸化HER2受体(同二聚化)或组成型激活异二聚体(例如EGFR/HER2)的癌症中基因扩增HER2。
针对EGFR的TKI已经被开发并在多种癌症中推广，但与其他癌症药物相似，其已显示出严重的副作用。这些副作用的原因是在组织中同时抑制EGFR活性和下游分子(如MAPK)，MAPK依赖于EGFR信号传导来实现正常功能。受这些药物影响的最常见组织是皮肤。副作用包括痤疮样皮疹、皮肤干燥、瘙痒、指甲变色和头发变色。由于在皮肤中EGFR信号传导的重要性，因此经常使用TKI来描述皮肤毒性。由此产生的严重的身体和心理社会不适感可能导致抗癌药的中断或剂量改变。
更详细地，在这些位点的EGFR活性的抑制可导致正常EGFR阳性细胞例如角质形成细胞的异常增殖、迁移和/或分化，并伴随炎症细胞的募集而破坏皮肤的完整性。药理学或治疗学介导的EGFR信号传导的阻滞导致依赖于EGFR存活的正常细胞的生长停滞和凋亡。皮肤由三层组成：表皮是最表层，其覆盖在真皮(提供支撑和拉伸强度)和皮下组织(脂肪组织)上。表皮主要由角质形成细胞(约90％的细胞)组成，其在基底层和基底上层中表达最多的EGFR(表皮生长因子受体)。毛囊的基底层和凸起包含增殖的干细胞，这些干细胞会产生最终分化的角质形成细胞，这些角质形成细胞向外迁移并形成角质层，在角质层中无核细胞形成保护性屏障。毛囊的外根鞘与基底层相邻，具有生化特性和高EGFR表达。
TKI影响基底角质形成细胞，导致皮肤副作用的发展，这一观点已被广泛接受。在用靶向EGFR的抑制剂治疗期间，表皮细胞中EGFR的磷酸化水平降低或消失，这种去磷酸化水平与皮肤毒性程度相关。基底角质形成细胞中EGFR的抑制导致生长停滞和过早分化。随后，对EGFR信号转导的抑制会通过以下方式影响表达EGFR的细胞(例如角质形成细胞)：诱导生长停滞和凋亡、减少细胞迁移、增加细胞附着和分化以及刺激炎症作用，所有这些都会导致独特的皮肤表现，例如严重的皮疹。尽管炎症是与皮疹相关的许多体征和症状的原因，但主要作用似乎是药物诱导的、抗体诱导的或TKI诱导的EGFR信号改变。
在临床研究中，功效与皮肤毒性有关，皮肤毒性大多以皮疹的形式出现。这既适用于靶向EGFR的mAb，例如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)，也适用于TKI。总体而言，使用EGFR靶向剂的许多II期和III期临床试验表明皮疹发生率、严重程度和生存率之间存在关联。
最初的高负荷剂量后，西妥昔单抗在关键重复剂量毒性研究中每周以7.5、24和75mg/kg的剂量给药于猴。高剂量、中剂量和低剂量组分别在15、22和64天后观察到西妥昔单抗的皮肤毒性反应。此外，在帕尼单抗给药后7-14天(即两剂或三剂)内观察到皮肤毒性。
单克隆抗体尼莫妥珠单抗的临床经验表明，临床疗效也可能伴随低毒性。关于尼妥珠单抗，尚未观察到与其他靶向EGFR的单克隆抗体相关的典型的严重皮肤毒性，这可能是由于结合仅限于表达中至高水平EGFR的细胞。
消除EGFR+肿瘤细胞的另一种方法是使用双特异性T细胞衔接子，例如BiTE构建体，其描述于Lutterbüse等人(PNAS 2010，107(28)，p12605)中。然而，这种方法表明，通过募集免疫细胞，将作用方式从受体阻滞简单改变到消除靶细胞从而杀死靶细胞，这并未能成功避免严重的副作用，因为在以μg/kg/d范围内相对较低剂量的试验给药食蟹猴(cynomolgus monkey)后，由于观察到严重的肝肾毒性而必须终止给药。
发明内容
因此，本发明的解决的技术问题是提供一种EGFR-靶向治疗剂，其具有肿瘤特异性的杀伤能力，并且对磷酸化具有较低影响或没有影响，从而导致轻微至无皮肤毒性。
该技术问题通过权利要求中限定的内容解决。
提供了EGFR/CD16A抗原结合蛋白，其用于基于天然杀伤(NK)细胞的EGFR靶向方法，该EGFR/CD16A抗原结合蛋白对EGF诱导的EGFR磷酸化没有或仅有很小的抑制作用(实施例6)。这表明，本文提供的EGFR/CD16A抗原结合蛋白在依赖于用于组织稳态的EGFR信号传导的组织例如皮肤中表现出降低的毒性。
对EGF介导的EGFR磷酸化的影响应与抗原结合蛋白的特定3D结构的固有特性相关。
此外，本文所述的EGFR的抗原结合位点也结合EGFRvIII(实施例3)。因此，EGFR/CD16A抗原结合蛋白可用于治疗表达EGFR的和表达EGFRvIII的癌症。与EGFR相反，EGFRvIII仅在癌细胞上表达，而在健康组织上不表达。因此，本文所述的EGFR/CD16A抗原结合蛋白可以靶向更广泛的EGFR和/或EGFRvIII阳性肿瘤，并因此可以靶向更广泛的患者群体。
本发明提供了不同的多特异性，特别是双特异性的具有不同药代动力学(PK)特性的与NK细胞结合的抗原结合蛋白，其被设计用于将NK细胞介导的杀伤重定向至EGFR阳性和/或EGFRvIII阳性肿瘤。使用Fv抗体结合域和各种抗体或抗体片段融合形式设计了针对人和食蟹猴EGFR和CD16A的不同双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白。
延长的血清半衰期有利于体内应用。EGFR/CD16A抗原结合蛋白具有不同的血清半衰期，包括具有药代动力学(PK)谱的抗体，其可与基于IgG的抗体进行剂量匹配。尽管延长了血清半衰期，但与由选定的Bi-scFv-Fc和scFv-IgAb抗原结合蛋白的特定3D构象提供的其他EGFR靶向疗法相比，本文所述的Fc融合抗原结合蛋白还负责改善安全性特征，例如降低皮肤毒性。因此，本发明提供了具有与单克隆抗体相似的药代动力学特征的、但是另外具有改善的安全性特征的抗原结合蛋白。
当NK细胞通过其CD16A受体被多特异性抗原结合蛋白与EGFR阳性肿瘤细胞结合(通过其EGFR抗原)时，它会形成免疫突触，这会产生强烈的激活信号。多特异性抗原结合蛋白通过其CD16A受体与NK细胞结合同时通过EGFR与肿瘤细胞结合，诱导CD16A介导的NK细胞活化和免疫突触的形成，导致包含穿孔素和颗粒酶的溶解性颗粒的极化胞吐作用，以及FasL、TRAIL和TNF-α的细胞表面表达，这会通过引发一系列进一步的酶活性(胱天蛋白酶级联反应)来诱导肿瘤细胞死亡，从而导致肿瘤细胞凋亡(程序性细胞死亡)。
因此，这种多特异性抗原结合蛋白能够选择性地重定向EGFR阳性癌细胞的NK细胞裂解。相反，IgG同种型的全长抗体通过其Fc区激活和抑制性Fcγ受体结合，Fcγ受体包括CD16A、CD16B(FcγRIIIB)、CD32A(FcγRIIA)、CD32B(FcγRIIB)和CD64(FcγRI)。然而，对CD16A具有特异性的抗原结合蛋白选择性地靶向活化亚型CD16A，活化亚型CD16A被发现在NK细胞和巨噬细胞上，而不在嗜中性粒细胞上。此外，与NK细胞结合的抗原结合蛋白与CD16A双价相互作用，导致与常规抗体相比，亲和力提高约1,000倍。
CD16A是一种可触发NK细胞的细胞毒活性的激活受体。抗体对CD16A的亲和力与其触发NK细胞活化的能力直接相关。抗原结合蛋白与CD16A双价结合，即具有两个抗原结合位点，从而由于对CD16A具有更高亲和力而增加了亲和力。根据以下作用方式，施用这些抗原结合蛋白将不会或只会导致轻微(皮肤)毒性：
在一个实施方案中，多特异性抗原结合蛋白是EGFR/CD16A双特异性串联双抗体。串联双抗体在其结构上仅包含EGFR和CD16A抗原结合位点的可变Fv域，不包含Fc段。由于缺少Fc段，它们不会被FcRn从血管间隙转运至正常组织的间质，并且主要停留在血管系统中。在肿瘤中，由于肿瘤血管对诸如串联双抗体的大蛋白的选择性和高渗透性(增强的渗透性和保留效应[EPR])，因此EGFR/CD16A串联双抗体达到适当水平。
在食蟹猴中每隔一天给予EGFR/CD16A串联双抗体不会引起任何皮肤毒性。与IgG或其他含Fc的抗体片段相比，在串联双抗体中不存在Fc段可能导致没有或至少显著减少通过FcRn向正常组织的转移。
在另一个实施方案中，多特异性抗原结合蛋白是包含Fc段的双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白。由于Fc段的存在，它可能被FcRn转运到正常组织。然而，正常组织不会被间质空间内的NK细胞浸润，从而使得NK细胞介导的对正常EGFR阳性细胞的杀伤不太可能发生。在肿瘤中，NK细胞的数量要高得多，并且包含Fc段的抗原结合蛋白将由于上述串联双抗体的EPR效应而达到合适的水平。
此外，如详细描述的，与体外西妥昔单抗相比，包含Fc段的EGFR/CD16A抗原结合蛋白对EGFR信号转导的抑制显著降低。
此外，当在细胞毒性试验中测试时，与先前已知的单克隆抗体(mAb)或其他Fc增强抗体相比，本文所述的EGFR/CD16A抗原结合蛋白显示出优越的效能和功效。在人源化小鼠的A-431肿瘤模型中证明了所选抗体的体内功效。
因此，EGFR/CD16A抗原结合蛋白是适合治疗表达EGFR的癌症的候选药物，并提供改善安全性特征的可能性。
通过引用合并
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指出通过引用并入一样。
附图说明
图1显示了具有人IgG1、CH1、CH2和CH3重链恒定结构域的IgG样抗原结合蛋白。将抗CD16A可变结构域作为抗原结合位点并入IgG的N端Fab段，并将抗EGFR scFvC端融合到CH2-CH3同型二聚体的每个多肽上(H：可变重链结构域；L：可变轻链结构域，C：C端，λ：Cλ轻链恒定结构域，1：CD16A抗原结合位点，2：EGFR抗原结合位点)。
图2显示了具有两个CH2-CH3多肽的同型二聚体的scFv-Fc融合抗原结合蛋白。在每种多肽中，CD16A scFv单元通过铰链区N端与CH2融合，并且抗EGFR scFv与CH2-CH3同二聚体C端融合(H：重链可变结构域；L：轻链可变结构域，C：C端；1：CD16A抗原结合位点；2：EGFR抗原结合位点)。
图3显示了由两条多肽链组成的双特异性EGFR/CD16A串联双抗体，其中在每条多肽链中，轻链(L)和重链(H)可变结构域通过肽接头彼此连接，并且这些多肽中的两个彼此非共价结合，从而形成四价抗原结合蛋白(N：N端；H6：六组氨酸标签，1：CD16A抗原结合位点，2：EGFR抗原结合位点)。
图4显示了三特异性EGFR/CD16A/HSA aTriFlex抗原结合蛋白，其由第一多肽组成，所述第一多肽包含N-端与抗CD16A双抗体单元融合的抗EGFR scFv单元和C-端与CD16A双抗体单元融合的抗HSA scFv-单元(H：重链可变结构域；L：轻链可变结构域；N：N端；H6：六组氨酸标签，1：CD16A抗原结合位点，2：EGFR抗原结合位点，3：HSA抗原结合位点)。
图5显示了scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02纯化后用无污点成像技术(Bio-Rad)可视化的SDS PAGE凝胶图像。
图6显示了EGFR/CD16A串联双抗体与(A)EGFR-抗原或(B)CD16A-抗原的浓度依赖性结合。
图7显示了(A)EGFR/CD16A scFv与单体EGFR-mFc的浓度依赖性结合或(B)CD16A-抗原或CD16B抗原与EGFR/CD16A scFv-IgAb的浓度依赖性结合。
图8显示(A)EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc与单体EGFR-mFc的浓度依赖性结合，或(B)CD16A-抗原或CD16B抗原与EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc的浓度依赖性结合。
图9显示了EGFR/CD16A aTriFlex与(A)EGFR-抗原或(B)CD16A-抗原的浓度依赖性结合。
图10显示了在存在和不存在10mg/mL人多克隆IgG(Gammanorm)的情况下，几种双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对原代人NK细胞的结合亲和力的评价。浓度增加时的平均荧光强度。
图11显示了几种双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对表达EGFR的肿瘤A-431细胞的结合亲和力的评价。
图12显示了在A-431(A)和HCT-116(B)靶细胞上4h钙黄绿素释放试验中双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白的细胞毒活性，其中具有E：T比为5：1的富集人NK细胞作为效应细胞。
图13显示了通过各种抗EGFR抗体构建体和对照抗体对A-431细胞的EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制。在磷酸化ELISA中测量磷酸化的EGFR，并将其绘制为在450nm的吸光度。
图14显示了各种抗EGFR抗体构建体和对照抗体对A-431细胞对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制。在磷酸化ELISA中测量磷酸化的EGFR，并将其绘制为在450nm的吸光度。
图15显示了在A-431细胞(图15a)和A-549细胞(图15b)中EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制。在磷酸化ELISA中测量磷酸化的EGFR，并将其绘制为在450nm的吸光度。
图16显示了用EGF刺激5分钟的样品的蛋白质印迹膜。分别描绘了磷酸蛋白(印迹的左图)和总蛋白(印迹的右图)。
图17显示了用EGF刺激15分钟的样品的蛋白质印迹膜。分别描绘了磷酸蛋白(印迹的左图)和总蛋白(印迹的右图)。
图18显示了pEGFR的条带强度的定量。将各个泳道的GAPDH信号强度标准化为未处理对照的GAPDH信号强度。将pEGFR的强度相对于未处理对照的pEGFR标准化。相对于标准化的GAPDH信号，所描绘的相对条带强度对应于标准化的pEGFR信号。白条：5min刺激，黑条：15min刺激。
图19显示了pAkt的条带强度的定量。将各个泳道的GAPDH信号强度标准化为未处理对照的GAPDH信号强度。将pAkt的强度标准化为未处理对照的pAkt。相对于标准化的GAPDH信号，所描绘的相对条带强度对应于标准化的pAkt信号。白条：5min刺激，黑条：15min刺激。
图20显示了pErk的条带强度的定量。将各个泳道的GAPDH信号强度标准化为未处理对照的GAPDH信号强度。将pErk的强度标准化为未处理对照的pErk。相对于标准化的GAPDH信号，所描绘的相对条带强度对应于标准化的pErk信号。白条：5min刺激，黑条：15min刺激。
图21显示了PBMC与EGFR+A-431细胞共培养后，由scFv-IgAb_02诱导的IL-6释放。显示了在存在或不存在浓度递增的scFv_IgAb_02的情况下共培养物的孵育时间。在图下方显示了在没有A-431靶细胞的情况下IL-6释放的背景值。
图22显示了PBMC与EGFR+A-431细胞共培养后，由scFv-IgAb_02诱导的TNF-α释放。显示了在存在或不存在浓度递增的scFv-IgAb_02的情况下共培养物的孵育时间。曲线下方显示了在没有A-431靶细胞的情况下TNF-α释放的背景值。
图23显示了在PBMC与EGFR+A-431细胞共培养4h后，由scFv-IgAb_02诱导的IFN-γ释放。曲线下方显示了在没有A-431靶细胞的情况下IFN-γ释放的背景值。
图24显示了在存在或不存在EGFR+A-431的情况下，PBMC与scFv-IgAb_02共培养24h后活化的NK细胞。在PBMC(A)和PBMC+A-431细胞(B)的培养物中，ScFv-IgAb_02诱导表达CD69和CD25的活化CD56+NK细胞增加。
图25显示了在存在或不存在EGFR+A-431的情况下，PBMC与scFv-IgAb_02共培养48小时后的活化NK。在PBMC(A)和PBMC+A-431细胞(B)的培养物中，ScFv-IgAb_02诱导表达CD69和CD25的活化CD56+NK细胞增加。
图26显示了在TRANSCURE预防性研究中从第7天到第35天的肿瘤生长。
图27显示了TRANSCURE预防性研究中的肿瘤生长。
图28：在预防性(A)和治疗性条件(B)中，RSV-EGFR和不同scFv-IgAB_02浓度对A431肿瘤生长的影响。
图例：代表每组肿瘤生长的平均值±SD。每个治疗组N＝7-8，每个预防组N＝12。
图29显示了TRANSCURE研究的预防组。在肿瘤生长研究中，如所附实施例11所述施用scFv-IgAb_02和对照抗体构建体RSV/EGFR。
图30显示了TRANSCURE研究的治疗组。观察到用scFv-IgAb_02和对照抗体构建体RSV/EGFR以10mg/kg治疗后肿瘤生长明显降低。
图31显示了如实施例13中所述的scFv-IgAb_02的组织分布的结果。在向A431异种移植小鼠静脉注射125I-scFv-IgAB_02后，在血液和器官/组织中恢复的ID的百分比(％ID/g)。
图32显示了如实施例13中所述向A431异种移植小鼠静脉注射125I-scFv-IgAB_02后的肿瘤/器官比率。
图33显示了如所附实施例13中所述静脉注射125I-scFv-IgAB_02后在336小时(14天)处死的小鼠的全身放射自显影图。
图34显示了在所附实施例14中描述的毒理学研究中观察到的个体动物的血清IL-6水平。
具体实施方式
本发明涉及包含EGFR和CD16A的抗原结合位点的多特异性例如双特异性抗原结合蛋白。
术语“多特异性”是指抗原结合蛋白，其包含与至少两个不同的靶即不同的抗原结合的抗原结合位点。“多特异性”包括但不限于双特异性、三特异性和四特异性。抗原结合蛋白至少特异性结合抗原EGFR和CD16A，因此至少是双特异性的。在某些实施方案中，抗原结合分子可以对第三抗原具有第三特异性。例如，第三特异性可以是特异性针对血清白蛋白，特别是人血清白蛋白(HSA)的抗原结合侧。三特异性抗原结合蛋白的实例是下面描述的四价aTriFlex，其包含对EGFR具有特异性的抗原结合位点、对CD16A具有特异性的两个抗原结合位点和对HSA具有特异性的一个抗原结合位点。在其他实施方案中，第三特异性可以是用于制造双重肿瘤靶向的抗原结合蛋白的第二肿瘤抗原，例如，抗原结合蛋白可包含第二肿瘤抗原例如HER2、HER3、HER4、c-MET、AXL、FGFR4、VEGF-A、HGF的至少一个其他抗原结合位点。
术语“抗原结合蛋白”是指具有抗原结合特性的免疫球蛋白(Ig)衍生物。优选地，抗原结合蛋白是人或人源化蛋白。即，抗原结合蛋白主要由来自种系Ig的人序列组成。如果抗原结合蛋白是人的或人源化的，则它可以包含例如在CDR、接头中或通过突变掺入的单个非人残基或非人片段。Ig是由两个相同的轻链(L)多肽和两个相同的重链(H)多肽组成通过共价链间二硫键结合成复合物的多聚体蛋白。在N-端部分，轻链可变结构域(VL)与重链(H)的可变结构域(VH)结合，形成Ig Fv的抗原结合位点。另外，轻链(L)和重链(H)均具有恒定区。因此，轻链(L)具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)例如λ或κ，重链(H)具有三个恒定结构域，分别称为CH1、CH2和CH3。因此，重链(H)具有一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2、CH3)。重链(H)也可分为三个功能单元：包含VH和CH1的Fd区、包含CH2-CH3多肽链的铰链区和Fc段。Fc段负责效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和与Fc受体的结合，并相对于缺少Fc段的多肽延长体内半衰期(通过结合新生Fc(FcRn)受体)。此外，在IgG中，彼此结合的两条CH2-CH3多肽链的同源二聚体形成抗体的Fc区。抗原结合蛋白包含能够结合靶抗原的免疫功能性免疫球蛋白部分。免疫功能性免疫球蛋白部分可包含免疫球蛋白部分(例如Fv、Fab)、衍生自免疫球蛋白部分的融合肽或结合形成抗原结合位点的免疫球蛋白部分的缀合物。在某些实施方案中，抗原结合位点部分或全部是人的或人源化的。结合蛋白包含抗原结合位点，抗原结合位点是结合蛋白与靶抗原结合的区域、部分或结构域。每个抗原结合位点至少包含产生抗原结合位点的免疫球蛋白重链或轻链的CDR。在一些实施方案中，术语“抗原结合蛋白”指保留对其抗原的特异性和亲和力的抗体衍生物或抗体样结合蛋白，包括例如基于与Fc段融合的抗原结合位点的IgG样或非IgG样融合肽，所述Fc段来自任何Ig类尤其是来自IgG亚类，例如IgG1，其至少包含CH2，在一些实施方案中至少包含CH2-CH3多肽链，特别是两条CH2-CH3多肽链的同二聚体。恒定区可包含完整的Ig恒定区，即CH1-铰链-CH2-CH3，或仅包含Fc段，即CH2-CH3结构域，例如如本文所述的scFv-IgAb、Bi-scFv-Fc或Fc-scFv。在其他实施方案中，抗原结合蛋白是指基于Fv结构域的抗体衍生物，所述Fv结构域不具有或具有另外的恒定结构域，例如Fv片段、单链Fv、串联单链Fv((scFv)2)、双特异性NK细胞衔接子(BiKE)、双亲和力重定位抗体(DARTTM)、双抗体、单链双抗体和串联双抗体
Figure BDA0002675941450000061
aTriFlex、三抗体、三抗体或三特异性NK细胞衔接子(TriKE)。多种抗原结合蛋白支架综述于Brinkmann和Kontermann，mAbs，2017，9(2)：182-192或Spiess等人，2015，分子免疫学，67：95-106中。
术语“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白的抗体-抗原结合位点或互补位，尤其特别地与抗原的抗原决定簇(表位)结合。抗原结合位点可以是人的或人源化的。抗原结合位点是抗原结合蛋白的结合部分，其能够识别抗原并与抗原特异性结合。抗原结合位点包含与抗原结合的轻链(VL)和重链(VH)的可变结构域，即与抗原表位结合。在某些实施方案中，抗原结合位点可以是单个结构域(sdAb)，例如骆驼科动物的VHH片段或软骨鱼类的VNAR片段。
每个抗原结合位点由抗体即免疫球蛋白与相同表位结合的可变重链结构域(VH)和抗体可变轻链结构域(VL)形成，而可变重链结构域(VH)包含三个重链互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3；可变轻链结构域(VL)包括三个轻链互补决定区(CDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3。抗原结合位点的可变重链结构域和可变轻链结构域可以例如通过肽接头彼此共价连接，或彼此非共价结合形成Fv抗原结合位点。
“单链可变抗体片段”或“scFv”包含抗原结合位点，该抗原结合位点由经由肽接头连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)组成。scFv可以是多肽链：从多肽链的N端到C端的VL-接头-VH或VH-接头-VL(Huston等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1988，85：5879-83)。
“抗原结合(Fab)片段”或“Fab”包含重链(H)和轻链(L)中的每一个的一个恒定结构域(CH1、CL)和一个可变结构域(VH、VL)，其中可变结构域VH和VL与抗原结合位点相关。两个Fab′片段以F(ab′)2片段的形式通过铰链区N-端连接到Fc段。
“接头”是连接其他肽的肽。通常，肽接头为1至约50个氨基酸，优选1至约30个氨基酸，最优选1至约20个氨基酸。接头的长度影响多肽链的柔性。期望的柔性取决于靶抗原密度和靶抗原的可及性。更长的接头提供了更多的活泼抗原结合位点。如果连接VH和VL结构域的接头由约12个或更多个氨基酸残基组成，则多肽可从头到尾折叠并形成scFv。在某些实施方案中，scFv中VH和VL的接头由约15至约25，优选约15至约20，例如18个氨基酸组成。将接头缩短至约12个或更少的氨基酸残基通常防止相同多肽链的相邻结构域彼此相互作用。然而，可以使用这样的接头将scFv融合到Fc段。在一个具体的实施方案中，scFv通过肽结合的方式直接融合至Fc段。关于接头的氨基酸组成，在一些实施方案中，选择不干扰抗原结合位点组装的肽。例如，包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头通常提供柔性和蛋白酶抗性。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(GaSb)c，其中a＝1-5，b＝1-3和c＝1-8。在特定的实施方案中，接头可以包含氨基酸序列(GGS)x，其中x＝1-8或(GGGGS)y，其中y＝1-5。
术语“多肽”或“多肽链”是指通过酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物。多肽链优选是不分支的单链融合蛋白。抗原结合蛋白包含至少两条多肽链。这样的抗原结合蛋白是多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体。在某些实施方案中，例如串联双抗体或Bi-scFv-Fc抗原结合蛋白是同型二聚体，并且由两条相同的多肽链组成。在其他实施方案中，抗原结合蛋白是异二聚体例如aTriFlex或异四聚体例如scFv-IgAb。
抗原结合位点特异性结合EGFR或CD16A。
“EGFR”是指表皮生长因子受体(人类中的EGFR；ErbB-1；HER1，包括描述具有激活突变并与病理生理过程有关的所有同种型或变体)。EGFR抗原结合位点识别EGFR细胞外结构域中的表位。在某些实施方案中，抗原结合位点特异性结合人和食蟹猴EGFR。
“EGFRvIII”是指由于跨越EGFR编码序列的外显子2-7的碱基对的框内缺失而导致的EGFR的胞外域突变体(Gan HK等人，FEBS 2013，280：5350-5370)。
在一个特定的实施方案中，EGFR的抗原结合位点包含对EGFR具有特异性的重链和轻链可变结构域，其中(i)对EGFR具有特异性的重链可变结构域(VH)包含具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的重链CDR3；对EGFR具有特异性的轻链可变结构域(VL)包含具有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(ii)对EGFR具有特异性的重链可变结构域(VH)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；和/或
(iii)对EGFR具有特异性的轻链可变结构域(VL)具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
EGFR的该抗原结合位点也结合EGFRvIII(实施例3)。因此，在治疗中使用这种抗原结合位点允许同时治疗表达EGFR和EGFRvIII的癌症。与EGFR相反，EGFRvIII仅在癌细胞上表达，而在健康组织上不表达。由于EGFRvIII增强了致癌性和EGFR信号通路的组成性激活作用，因此其他靶向EGFR的疗法在EGFRvIII阳性癌症中可能无效。
“CD16A”是指在NK细胞的细胞表面表达的活化受体CD16A，也称为FcγRIIIA。CD16A是一种激活受体，可触发NK细胞的细胞毒活性。抗体对CD16A的亲和力与它们触发NK细胞激活的能力直接相关，因此对CD16A的更高亲和力降低了激活所需的抗体剂量。抗原结合蛋白的抗原结合位点结合CD16A，但不结合CD16B。例如，包含与CD16A结合但不与CD16B结合的重链(VH)和轻链(VL)可变结构域的抗原结合位点可以由与CD16A的表位特异性结合的抗原结合位点提供，所述CD16A的表位包括：CD16B中不存在的C端序列SFFPPGYQ的氨基酸残基(SEQ ID NO：3)和/或CD16A的残基G130和/或Y141(SEQ ID NO：4)。
在一些实施方案中，CD16A抗原结合位点包含对CD16A具有特异性的重链和轻链可变结构域，其中(i)对CD16A具有特异性的重链可变结构域(VH)包含具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：6或11所示氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ IDNO：7所示氨基酸序列的重链CDR3；对CD16A具有特异性的轻链可变结构域(VL)包含具有SEQID NO：8所示氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(ii)对CD16A具有特异性的重链可变结构域(VH)具有SEQ ID NO：12或14所示的氨基酸序列；和/或者
(iii)对CD16A具有特异性的轻链可变结构域(VL)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
CD16A的此抗原结合位点不与CD16B结合，而是以相似的亲和力与已知的CD16A同种异型F158和V158结合。已在改变158位氨基酸的人CD16A中鉴定出两个等位基因单核苷酸多态性，这对于与IgG铰链区的相互作用非常重要。在白种人人群中，纯合158F/F和杂合158V/F等位基因的等位基因频率相似，分别在35％至52％或38％至50％，而纯合158V/V等位基因仅发现为10-15％(Lopez-Escamez JA等人；BMC Med Genet 2011；12：2)。因此，由于相似的亲和力，通过该抗CD16A结构域激活NK细胞在所有患者中都是有利的。WO 2006/125668中描述了包含与CD16A结合但不与CD16B结合的重链和轻链可变结构域的其他CD16A抗原结合位点。
在替代实施方案中，重链和轻链结构域掺入了本文描述的CDR或框架序列的免疫活性同系物或变体。因此，在一些实施方案中，与CD16A或EGFR结合的重链或轻链结构域中的CDR序列与SEQ ID NO：5-11或21-26所示的氨基酸序列相似但不相同。在某些情况下，与具有免疫活性的5-11或21-26的序列相比，CDR变体序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的序列同一性。
在其他情况下，修饰CDR变体序列以改变非关键残基或非关键区域中的残基。可以通过已知方法鉴定非关键氨基酸，已知方法例如亲和力成熟、CDR步进诱变、定点诱变、结晶、核磁共振、光亲和标记或丙氨酸扫描诱变。
抗原结合蛋白是多价的。“多价”是指存在两个或更多个抗原结合位点，例如2、3、4、5、6或更多。天然IgG抗体具有两个结合位点，因此是二价的。多特异性抗原结合蛋白具有至少四个抗原结合位点，因此至少是四价的。在某些实施方案中，抗原结合蛋白具有对于EGFR的两个抗原结合位点和对于CD16A的两个抗原结合位点，即，抗原结合蛋白与EGFR双价结合且与CD16A双价结合。
在一个实施方案中，EGFR/CD16A抗原结合蛋白的支架由串联双抗体提供(图3)。术语“串联双抗体”是指通过将与另一个相同多肽结合的单个多肽中的至少四个可变结构域(两个重链可变结构域(VH)和两个轻链可变结构域(VL))连接至抗原结合同型二聚体而构建的抗原结合蛋白。在这样的串联双抗体中，接头长度使得它防止可变结构域的分子内配对，使得多肽链不能自身折叠以形成单体单链蛋白，而是被迫与另一条链的互补域配对。可变结构域还被设置为使得在该二聚化过程中相应的可变结构域配对(Weichel等人，2015，欧洲药物评论(European Pharmaceutical Review)，20(1)：27-32)。因此，串联双抗体是一种抗原结合蛋白，其中在每个多肽链中，可变结构域通过肽接头L1、L2和L3逐一连接，并按以下顺序位于从N端到C端的两个多肽链的每一个内：
(i)VH-L1-VL-L2-VH-L3-VL，或者
(ii)VL v1-L1-VH-L2-VL-L3-VH，
在一个特定的实施方案中，由接头L2连接的多肽链中心的可变结构域对CD16A是特异性的，而在N-端和C-端的外围结构域分别对EGFR是特异性的。在这样的实施方案中，可变结构域按以下顺序位于从N端到C端的每个多肽链内：
(i)VH(EGFR)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L3-VL(EGFR)，或
(ii)VL(EGFR)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L3-VH(EGFR)，
在一个优选的实施方案中，可变结构域定位的顺序为：(i)VH(EGFR)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L3-VL(EGFR)。
根据报道的研究，接头的长度影响这种多特异性抗原结合蛋白的柔性。串联双抗体中肽接头L1、L2和L3的长度较“短”，即由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸组成残基，多肽链的可变结构域与另一个多肽的结构域分子间结合以形成串联双抗体。因此，在某些情况下，接头由约12个或更少的氨基酸残基组成，例如3-12、3-10或3-9个氨基酸残基。
从单个基因构建体表达后，两条相同的多肽链从头到尾折叠，形成约105kDa的功能性非共价同源二聚体。尽管不存在分子间共价键，但是同二聚体一旦形成就高度稳定，保持完整并且不会回复为单体形式。串联双抗体仅包含抗体可变结构域而缺乏恒定结构域。串联双抗体允许与CD16A的二价结合和与EGFR的二价结合。串联双抗体的大小约为105kDa，比IgG小，但远高于首次通过肾脏清除的阈值，与基于抗体结合域或非抗体支架的较小双特异性形式相比，其具有药代动力学优势。此外，基于这些药代动力学和亲和力特性，串联双抗体比其他双特异性结合蛋白例如
Figure BDA0002675941450000091
或DARTTM分子更具优势，从而导致更长的固有半衰期和增强的细胞毒性。串联双抗体在宿主细胞例如哺乳动物CHO细胞中良好表达。可以预期，稳健的上游和下游制造工艺可用于串联双抗体。
在另一个实施方案中，抗原结合蛋白是不对称的三特异性弹性体(aTriFlex)，如WO 2017/064221中所公开。此类aTriFlex是包含至少六个可变结构域的第一多肽和包含至少两个可变结构域的第二多肽的二聚体(图4)。在这样的实施方案中，第二多肽是双抗体单元的一部分，并且优选非共价地与整合到第一多肽中的两个并列可变结构域中的另一对结合。在第一多肽链由六个可变结构域组成且第二多肽由两个可变结构域组成的实施方案中，可变结构域可以以下方向从多肽的N-端至C-端排列：例如VH-VL-VH-VH-VL-VH(第一多肽)和VL-VL(第二多肽)、VL-VH-VH-VH-VH-VL(第一多肽)和VL-VL(第二多肽)、VH-VL-VL-VL-VH-VL(第一多肽)和VH-VH(第二多肽)、VL-VH-VL-VL-VH-VL(第一多肽)和VH-VH(第二多肽)或VH-VL-VL-VL-VL-VH(第一多肽)和VH-VH(第二多肽)。在方向VH-VH中具有一对两个可变结构域和在方向VL-VL中具有另一对两个可变结构域的双抗体单元有利于正确折叠，特别是多特异性例如三特异性抗体分子的正确折叠。在优选的实施方案中，对CD16A具有特异性的可变结构域位于第一多肽链和第二多肽的中心，所述第一多肽链由六个可变结构域组成，所述第二多肽由对CD16A具有特异性的互补可变结构域组成。此类aTriFlex是四价和双特异性或三特异性的。在一个实施方案中，aTriFlex是三特异性的，并且包含一个EGFR的抗原结合位点、两个CD16A的抗原结合位点和一个HSA(人血清白蛋白)的抗原结合位点。在一个特定的实施方案中，aTriFlex由第一条多肽链和第二条多肽链组成，所述第一条多肽链具有(i)VH(EGFR)-VL(EGFR)-VL(CD16A)-VL(CD16A)-VH(HSA)-VL(HSA)顺序排列的可变结构域，且所述第二条多肽链具有VH(CD16A)-VH(CD16A)顺序排列的可变结构域；或所述第一条多肽链具有(ii)VH(EGFR)-VL(EGFR)-VH(CD16A)-VH(CD16A)-VH(HSA)-VL(HSA)顺序排列的可变结构，且第二条多肽链具有VL(CD16A)-VL(CD16A)顺序排列的可变结构域。在WO 2017/064221中描述了此类aTriFlex抗原结合蛋白的产生和生产。
在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白是Fc融合蛋白，其包含选自IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类别的免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定结构域和包含与其连接的抗原结合位点的scFv。优选的是IgG，特别是IgG1的恒定结构域。因此，在一些实施方案中，Fc融合抗原结合蛋白包含Fc段。由于Fc段与FcRn的结合，相对于基于Fv结构域的抗原结合蛋白，例如串联双抗体或aTriFlex，Fc融合抗原结合蛋白的血清半衰期显著增加。
“Fc融合抗原结合蛋白”是指包含免疫球蛋白的Fc段和在该Fc段的N端和/或C端融合的至少一个抗原结合位点的组合的抗原结合蛋白。本发明提供了多特异性且至少四价的Fc融合抗原结合蛋白，其具有两个与N-端连接的抗原结合位点和两个与Fc-段C末连接的抗原结合位点。连接到N端的两个抗原结合位点可以是抗原结合的Fab's或scFv's，它们通过铰链结构域与Fc段的CH2的N端相连。置于C端的两个抗原结合位点中的每一个是通过肽接头与Fc段的CH3的C端融合的scFv。在一些实施方案中，位于Fc段的N端上的两个抗原结合位点对第一抗原是特异性的，位于C端上的两个抗原结合位点对第二抗原是特异性的。因此，四价抗原结合分子与第一抗原二价结合并且与第二抗原二价结合，而这种二价结合增加了亲合力，从而提高了对两种抗原中每一种的结合亲和力。在一个特定的实施方案中，位于Fc段的N端上的抗原结合位点对于CD16A是特异性的，位于Fc段的C端上的抗原结合位点对于EGFR是特异性的。
“Fc段”是指保留恒定Ig区域的Fc区域的至少一种功能，特别是与FcRn结合的功能的多肽，并且至少包含CH2结构域，优选CH2-CH3多肽链。CH2-CH3多肽链与另一条CH2-CH3多肽链组装成彼此结合的两个CH2-CH3多肽的同型二聚体，其中二聚作用通过CH2结构域的C端的铰链区促进。因此，在一些实施方案中，Fc段包含两条CH2-CH3多肽链的同型二聚体和一个铰链区。优选地，Fc段包含IgG类别的恒定结构域，特别是IgG1恒定结构域。
此外，“铰链结构域”可以在N端与Fc段连接。铰链结构域可以与Fc段具有相同或不同的IgG类别，或者是工程改造的、非天然存在的铰链结构域。
这种Fc融合抗原结合蛋白可以通过CD16A和EGFR的抗原结合位点与优选的IgG1Fc段的模块化结合而产生，使得两个抗原结合位点以Fab片段或scFv的方式通过铰链结构域N端融合到Fc段，两个scFv抗原结合位点C端与Fc段融合，从而提供双特异性和四价抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，Fc融合抗原结合蛋白是scFv-IgAb(图1)或Bi-scFv-Fc(图2)。
因此，在另一个实施方案中，多特异性抗原结合蛋白是四价和双特异性Fc融合蛋白(Bi-scFv-Fc)(图2)，其包含两个CH2-CH3多肽的同二聚体，两个CH2-CH3中的每个多肽在N端和C端与scFv融合，该scFv包含通过柔性接头共价连接以形成scFv的抗原结合位点的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。因此，此类Bi-scFv-Fc抗原结合蛋白由两条多肽链组成，每条多肽均包含第一条单链Fv(scFv(1))和第二个单链Fv(scFv(2))，所述第一条单链Fv由通过肽接头连接至第一抗原结合位点的VH的VL组成，即scFv(1)通过铰链区N端与CH2-CH3多肽链的CH2结构域融合，所述第二个单链Fv(scFv(2))由通过肽接头连接至第二个抗原结合位点的VH的VL组成，该第二抗原结合位点通过肽接头C端与CH2-CH3多肽链的CH3结构域融合。因此，这种Bi-scFv-Fc抗原结合蛋白由具有以下从N端到C端的结构的两条多肽链组成：scFv(1)-铰链-CH2-CH3-scFv(2)。特别地，(i)scFv(1)是CD16A的抗原结合位点，而scFv(2)是EGFR的抗原结合位点，或者(ii)scFv(1)是EGFR的抗原结合位点，而scFv(2)是CD16A的抗原结合位点。优选地，由CH2-CH3同型二聚体组成的Fc段沉默，即，其基本上不结合Fc-γ受体，但保持结合FcRn。在一个具体的实施方案中，抗原结合蛋白包含具有SEQID NO：20所示的氨基酸序列的CH 2-CH 3重链恒定结构域。
在另一个实施方案中，多特异性Fc融合抗原结合分子是四价和双特异性scFv-Ig抗原结合蛋白(scFv-IgAb；图1)。这种scFv-IgAb由IgG优选IgG1、支架和两个在C端融合到其上的scFv组成。因此，这种scFv-IgAb由两条重链(H)和两条轻链(L)组装而成。重链(H)由可变重链结构域(VH)组成，该可变重链结构域(VH)在C端连接至CH1结构域，所述CH1结构域通过铰链区在C端连接至CH2-CH3多肽链，并且所述CH3结构域与scFv融合，所述scFv包含具有通过柔性接头连接至可变重链结构域(VH)的可变轻链结构域(VL)的抗原结合位点。轻链(L)由连接至轻链恒定结构域(CL)的可变轻链结构域(VL)例如λ或κ轻链恒定结构域组成。scFv-IgAb抗原结合蛋白由两条重链(H)和两条轻链(L)组装而成，其中重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域结合在N端形成Fab’s的两个Fv抗原结合位点。在一个实施方案中，Fab’s的N端Fv抗原结合位点对CD16A具有特异性，而C端scFv抗原结合位点对EGFR具有特异性。在另一个实施方案中，Fab’s的N端Fv抗原结合位点对EGFR是特异性的，而C末端scFv抗原结合位点对CD16A具有特异性。
特别地，多特异性抗原结合蛋白包含重链(H)和轻链(L)，其中(i)重链(H)具有结构VH(CD16A)-CH1-铰链-CH2-CH3-VH(EGFR)-VL(EGFR)，轻链具有结构VL(CD16A)-CL，或(ii)重链具有结构VH(EGFR)-CH1-铰链-CH2-CH3-VH(CD16A)-VL(CD16A)，轻链具有结构VL(EGFR)-CL，或(iii)VH(EGFR)-CH1-CH2-CH3-VL(CD16A)-VH(CD16A)，轻链具有结构VL(EGFR))-CL。在一些实施方案中，由CH2-CH3同型二聚体组成的Fc段沉默，即，基本上不结合FcγR，但保留结合FcRn。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含沉默的Fc段。与IgG相比，这种Fc段在与FcγR的结合中被沉默。在一个具体的实施方案中，抗原结合蛋白包含具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的重链恒定结构域和/或具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的λ轻链结构域。
“沉默的Fc段”是指修饰的Fc段，其不结合Fc-γ受体(FcγR)，但保留与新生Fc受体(FcRn)的结合，以延长半衰期和较长的血清持久性。抗原结合蛋白被设计成通过CD16A抗原特异性地与NK细胞结合，因此，在优选的实施方案中，应防止Fc与Fc-γ受体的结合。此外，据报道，FcRn保护IgG免受降解，并负责IgG穿过上皮屏障的转运。因此，优选保留或增强FcRn结合的Fc融合抗原结合蛋白的Fc段的修饰。
已经描述了用于产生具有减少的Fc-γ受体结合或不结合Fc-γ受体的IgG1的几组突变或变化，所述几组突变或变化选自：C220S、C229S、E233P、L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S、D265A、N297A、N297Q、P331S；或用于产生具有F减少的c-γ受体结合的IgG2的突变，所述突变可选自：H268Q、V309L、A330S、A331S，或用于产生具有减少的Fc-γ受体结合的IgG4的突变，所述突变可选自L235A、G237A、E318A(Strohl W.，生物技术现状(Current Opinion in Biotechnology)2009，20：1-7；Kaneko E和Niwa R，生物制药(Biodrugs)2011，25(1)：1-11；Baudino L.，疫学杂志(J.Immunology)2008，181：6664-6669)。
此外，可以对Fc段进行工程改造以延长血清半衰期。已描述了IgG1 Fc段中延长以下抗原结合蛋白血清半衰期的突变：T250Q、M252Y、S254T、T256E、T307A、E380A、M428L、H433K、N434A、N434Y(Srohl W.生物技术当前述评(Opinion in Biotechnology)2009，20：1-7；Borrok MJ等人，药物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)2017，106(4)：1008-1017)。
在一些实施方案中，IgG1 Fc段包含根据Kabat编号在位置234、235和265处的一组突变，特别是该组突变选自L234F/V/A、L235A/E和D265A。特别优选的是包含一组突变L234F、L235E和D265A(SEQ ID NO：20)的IgG1 Fc段。因此，在一些实施方案中，Fc融合抗原结合分子，例如Bi-scFv-Fc或scFv-IgAb，包括具有突变L234F、L235E和D265A的沉默的IgG1Fc段。所有列举的突变对应于Kabat编号系统(Kabat，E.A.等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版-美国卫生与人类服务部，NIH出版号91-3242，第662、680、689页(1991))。
在替代实施方案中，可以通过以下方式来延长EGFR/CD16A抗原结合蛋白的血清半衰期：(i)将人血清白蛋白(HSA)的至少一个抗原结合位点融合至抗原结合蛋白，或者(ii)将人血清白蛋白(HSA)与抗原结合蛋白融合或结合。
可以通过表达编码形成抗原结合蛋白的单个多肽链的多核苷酸来产生根据本文所述的实施方案中任一的抗原结合蛋白。因此，本发明的另外的实施方案是编码上述抗原结合蛋白多肽的多核苷酸，例如DNA或RNA。可以通过本领域技术人员已知的方法构建多核苷酸，例如通过将编码可变结构域和恒定结构域的基因组合到一个基因构建体中，所述可变结构域和恒定结构域由肽接头分隔开或通过多肽链的肽键直接连接，所述基因构建体可操作地连接至合适的启动子、可选的合适的转录终止子，并在细菌或其他合适的表达系统例如CHO细胞(实施例1)中表达。
本发明进一步提供了多特异性抗原结合蛋白，特别是包含如上所述的多特异性抗原结合分子和至少一种其他成分的组合物。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性抗原结合蛋白用作治疗化合物。优选地，根据本发明的多特异性抗原结合蛋白用于治疗以EGFR阳性或EGFRvIII阳性细胞为特征的癌症。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用根据本发明的多特异性抗原结合蛋白的步骤。待治疗的受试者可以是人类。在本发明的一个特定实施方案中，增殖性疾病或肿瘤性疾病的特征在于EGFR阳性或EGFRvIII阳性细胞。
为了用作治疗化合物或用于治疗EGFR阳性疾病或EGFR阳性和/或EGFRvIII阳性癌症，优选将包含多特异性抗原结合蛋白的组合物与合适的药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的载体”是指包括任何载体，其不干扰成分的生物活性的有效性并且对所施用的患者无毒。合适的药物载体的实例是本领域众所周知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。此类载体可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量给予受试者。优选地，所述组合物是无菌的。这些组合物还可包含佐剂例如防腐剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的作用。合适的组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、外用或皮内给药。当然，给药途径取决于治疗方法和药物组合物中所含化合物的类型。剂量方案将由主治医师和其他临床因素决定。
可以使用本发明的抗原结合蛋白治疗的EGFR阳性和/或EGFRvIII阳性癌症包括但不限于例如结肠直肠癌、头颈癌、肺癌和成胶质细胞瘤。
以下实施例应进一步说明所描述的实施方案，而不限制本发明的范围。证明了根据本发明的抗原结合蛋白能够诱导NK细胞介导的细胞毒性，同时对EGF诱导的EGFR磷酸化没有抑制作用或几乎没有抑制作用：
实施例1：EGFR/CD16A抗原结合蛋白的产生和生产
材料
Figure BDA0002675941450000131
GFR/CD16A抗原结合蛋白的产生
串联双抗体
如Reusch等人，2014，mAbs 6：3，728-739中所述构建串联双抗体(图3)。为了构建串联双抗体，将抗EGFR Fv结构域(SEQ ID NO：1,2)与抗CD16A Fv结构域(SEQ ID NO：12,13)组合。克隆串联双抗体的表达组件，使得抗EGFR结构域和抗CD16A结构域以VH_EGFR-L1-VL_CD16A-L2-VH_CD16A-L3-VL_EGFR的顺序排列。9个氨基酸的接头(G2S)3(SEQ ID NO：36)用于接头L1和L3，6个氨基酸的接头(G2S)2(SEQ ID NO：35)用于接头L2，获得EGFR/CD16A串联双抗体由两个具有SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的多肽组成。
aTriFlex
如WO 2017/064221中所述构造aTriFlex(图4)。为了构建aTriFlex，将抗EGFR Fv结构域(SEQ ID NO：1,2)与抗CD16A Fv结构域(SEQ ID NO：12,13)和抗HSA Fv结构域(SEQID NO：31,32)结合。克隆aTriFlex的表达组件，使抗EGFR结构域和抗CD16A结构域位于第一个多肽中：VH_EGFR-L1-VL_EGFR-L2-VL_CD16A-L2-VL_CD16A-L2-VH_HSA-L1-VL_HAS，在第二个多肽中以VH(CD16A)-L2-VH(CD16A)顺序排列，并且18个氨基酸的接头(G2S)6(SEQ IDNO：18)用于接头L1，9个氨基酸的接头(G2S)3(SEQ ID NO：36)用于接头L2。
Bi-scFv-Fc
为了在CHO细胞中表达Bi-scFv-Fc抗原结合蛋白(图2)，将该分子的编码序列克隆到哺乳动物表达载体系统中。简而言之，编码通过肽接头连接的抗EGFR Fv结构域(SEQ IDNOs：1,2)和抗CD16A Fv结构域(SEQ ID NOs：12,13)的基因序列由赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)(德国雷根斯堡)GeneArt合成。用相应的引物产生不同可变结构域和含有沉默点突变的Fc段的PCR-扩增子(SEQ ID NO：20)。之后，在一个等温反应中将不同的重叠DNA片段和线性化的骨架载体结合在一起。Bi-scFv-Fc表达构建体被设计为包含分别促进抗体分泌和纯化的N端信号肽和Fc段的编码序列。通过使用引物对5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：33)和5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’(SEQ ID NO：34)在GATC(德国科隆
Figure BDA0002675941450000141
)进行DNA测序确认了构建体的序列。克隆Bi-scFv-Fc的表达组件，使抗EGFR结构域和抗CD16A结构域按VL_CD16A-L1-VH_CD16A-铰链-CH2-CH3-L2-VH_EGFR-L3-VL_EGFR的顺序定位，(G2S)7用于接头L1，(G4S)2用于接头L2，(G2S)6用于接头L3。所获得的Bi-scFv-Fc-02由两个具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的多肽组成。
scFv-IgAb(图1)：
编码scFv-IgAb的DNA表达构建体是通过将抗CD16A Fv结构域的编码序列(SEQ IDNOs：12,13)克隆到含有CMV受控表达组件的哺乳动物表达载体中而得到的，该表达组件包括可从同一载体共表达的具有Fc沉默点突变的重链和轻链恒定结构域(SEQ ID NO：15,16)。然后，由编码抗EGFR Fv结构域的基因序列(SEQ ID NO：1,2)产生PCR扩增子，所述基因序列被具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列(VH-(G2S)6-VL)的钛接头用相应的引物分隔开。将所得的重叠DNA片段在相关位置插入共表达载体。通过赛默飞世尔科技GeneArt(德国雷根斯堡)合成了所有需要的编码可变域和恒定结构域的基因序列，这些可变域和恒定结构域包含Fc沉默的点突变。将scFv-IgAb表达构建体设计为包含分别促进抗体分泌和纯化的N端信号肽和Fc段的编码序列。通过使用定制引物在GATC(德国科隆)进行DNA测序，确认了所有构建体的序列。克隆了scFv-IgAb的表达组件，使抗EGFR结构域、抗CD16A结构域和恒定结构域位于第一个多肽中：VH_CD16A-CH1-铰链-CH2-CH3-L1-VH_EGFR-L2-VL_EGFR和以VL_CD16A-Cλ顺序位于第二个多肽中。(G4S)2(SEQ ID NO：35)用于接头L1，(G2S)6(SEQ ID NO：18)用于接头L2。获得的scFv-IgAb_02由具有SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的重链与具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的轻链组成。
宿主细胞培养
在补充了左旋谷酰胺10％FCS和100μg/ml博莱霉素的Ham's F-12营养混合物中培养了Flp-In CHO细胞(生命科技公司)，其为CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞的衍生物(ATCC，CCL-61)(Kao和Puck，1968年)。用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离贴壁细胞，并根据生命科技公司提供的标准细胞培养方案进行继代培养。
为了适应悬浮液中的生长，将细胞从组织培养瓶中取出，置于无血清HyCloneCDM4 CHO培养基中，随后在摇瓶中于37℃、5％CO2和120rpm孵育。用于培养悬浮液适应性Flp-In CHO宿主细胞的标准培养基是添加L-谷氨酰胺、HT混合盐、青霉素/链霉素和100μg/mL博莱霉素的HyClone CDM4 CHO。将悬浮液适应的细胞冷冻保存在含10％DMSO的培养基中，并使用MycoAlert支原体检测试剂盒(龙沙)测试支原体阴性。
稳定转染的细胞池的产生
通过转染适应悬浮液的宿主细胞，可产生稳定表达分泌的重组抗体、Fc融合构建体或比较抗体以及膜锚定抗原的重组Flp-In CHO细胞系。为此，将细胞与编码目的蛋白的表达质粒(pcDNA5-FRT)(2.5μg)和Flp重组酶(pOG44，生命科技公司)使用聚乙烯亚胺(PEI)共转染前一天，将细胞置于不含博莱霉素的标准培养基中。简而言之，将载体DNA和转染试剂以DNA：PEI比为1：3(μg/μg)在共100μL OptiMEM I培养基中混合并孵育10分钟，然后添加到悬浮在1ml CHO-S-SFMII培养基(生命科技公司)中的2E+6Flp-In CHO细胞中。孵育24-48小时后，通过在CHO-S-SFMII培养基中将培养液稀释至0.1E+6个活细胞/mL的密度后，添加6-7μg/mL嘌呤霉素二盐酸盐开始选择稳定转染的细胞。Flp重组酶通过位点特异性DNA重组介导Flp-In表达构建体在整合的FRT位点插入基因组中(O’Gorman等人，1991)。在选择过程中，每周两次测量活细胞密度，将细胞离心并以最大密度0.1E+6个活细胞/mL悬浮在新鲜的选择培养基中。选择2至3周后，回收稳定表达重组蛋白产品的细胞池，此时将细胞转移至摇瓶中的标准培养基中。重组分泌蛋白或膜锚定蛋白的表达分别通过使用标准无污染(Bio-Rad)技术(见下文)或流式细胞术通过细胞培养上清液的蛋白凝胶电泳进行确认。将稳定的细胞池冷冻保存在含有7.5％DMSO的培养基中。
补料分批(Fed-batch)CHO细胞悬浮培养中重组蛋白的制备
通过分泌到细胞培养上清液中，重组蛋白在稳定转染的CHO细胞的第10天或11天补料分批培养中产生。为此，将稳定表达重组抗体、Fc融合抗原或比较抗体的细胞以6E+5细胞/mL的起始密度接种在带有透气帽(Corning)的聚碳酸酯锥形瓶中的标准培养基中，并在37℃和5％CO2在140rpm搅拌下孵育。在分批补料培养过程中，在第0天(起始日)向培养基补充40mL/L ActiCHO Feed A(通用医疗)和4mL/L ActiCHO Feed B(通用医疗)，并在第3、5和7天加倍。在10或11天后，通常以>75％的培养力收获细胞培养上清液。在进食前每隔一天从生产培养物中收集样品，并评估细胞密度和生存力。收获当天，在进一步使用前，使用Millipore Express PLUS膜过滤器(Millipore)通过离心和真空过滤(0.22μm)清除细胞培养上清液。
表达滴度定量：
在生产培养的第5、7和10或11天，通过SDS-PAGE分析细胞培养上清液(CSS)中的蛋白表达滴度和产物完整性。将样品与SDS PAGE样品缓冲液混合，然后加载到4-20％Criterion TGX预制SDS PAGE凝胶(Biorad)上。使用标准无污染分子成像系统(Biorad)在凝胶中可视化总蛋白。通过与已知浓度的参考抗体比较，半定量确定产品滴度。
抗EGFR抗体的纯化
在包括蛋白A和制备型SEC的两步过程中，从澄清的CHO细胞培养上清液中纯化抗EGFR抗原结合蛋白。对于蛋白A，将澄清的上清液加载到HiTrap MabSelectSuRe柱上。用磷酸盐缓冲盐水pH 7.4和10mM磷酸钠pH 7.0洗涤后，用50mM乙酸钠pH 3.5和10mM甘氨酸/HClpH 2.0分两步洗脱。使用SE-HPLC和SDS-PAGE分析级分的纯度。合并具有可接受纯度的级分，并使用Superdex 200制备级色谱柱进行制备性凝胶过滤。合并含有纯化的抗EGFR抗原结合蛋白的洗脱液级分，并使用Sephadex G-25柱针用10mM乙酸钠、4.5％山梨糖醇pH 5.0进行缓冲液交换，并通过超滤浓缩至约1mg/ml的标准浓度。在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE评估了最终样品的均质性(scFv-IgAb_2约为79％，Bi-scFv-Fc_2约为85％)(参见图5)。将样品与非还原2×SDS-PAGE样品缓冲液或含二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂的还原2xSDS-PAGE样品缓冲液混合。将所有样品在95℃下加热5分钟，然后加载到4-20％的Criterion TGX预制SDS Page Gel中。每个泳道使用2μg纯化蛋白样品。为了分离凝胶中的蛋白质，将SDS-PAGE在1x Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中于300V下运行约22分钟。使用标准无污染分子成像系统(BioradBio-Rad)在凝胶中可视化总蛋白。Page Ruler未染色蛋白阶梯用作分子量标记。使用Superdex 200 Increase 10/300GL色谱柱通过分析性SE-HPLC评估纯度(scFv-IgAb_2约为99％，Bi-scFv-Fc_2约为97％)。纯化的蛋白质以等分试样的形式保存在-80℃下，直至进一步使用。
ELISA中EGFR/CD16A抗原结合蛋白的结合分析
ELISA中的结合分析
将96孔ELISA板(Immuno MaxiSorp；Nunc)在4℃下用重组抗原或抗体在100mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中包被过夜。EGFR-mFc抗原的包被浓度为2.5μg/mL，EGFR-Fc的浓度为3μg/mL，CD16A-Fc的浓度为1.5μg/ml，EGFR/CD16A scFv-IgAb的浓度为3.8μg/ml或EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc浓度为3μg/mL。用溶于PBS的3％(w/v)脱脂奶粉(Merck)封闭后，将含有0.3％(w/v)脱脂奶粉的PBS中不同抗体或可溶性抗原的系列稀释液在平板上在室温下孵育1.5小时。用每孔300μL含0.1％(v/v)吐温20的PBS洗涤3次后，将板与检测抗体在室温下孵育1小时。为了检测带有His标签的分析物，使用Penta-HIS-HRP(Qiagen)以1：3000稀释。为了检测结合在EGFR-mFc抗原上的EGFR/CD16A scFv-IgAb或EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc，将生物素化的CD16-Fc在板上以1μg/mL在室温下孵育1小时，然后清洗并在室温下与链霉亲和素-HRP偶联物(Roche)以1：10000稀释孵育1小时。用每孔300μL含0.1％(v/v)吐温20的PBS洗涤3次后，将板与四甲基联苯胺(TMB)底物(Seramun)孵育，直到显色为止。通过每孔添加100μL 0.5M H2SO4终止反应。使用多标记酶标仪(Victor，Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。使用与GraphPad Prism 6.07版(GraphPad软件，美国拉荷亚加利福尼亚)拟合的非线性回归、S形剂量响应(可变斜率)、最小二乘(常规)绘制并分析吸光度值。
与FcRn和各种Fcγ受体的结合
为了表征EGFR/CD16A抗原结合蛋白中沉默的Fc，使用表面等离子体共振光谱(SPR)测量与各种Fcγ受体和FcRn(pH 6.0)的结合。
材料与方法：
配体分子
融合到单Fc(mFc)和Avi-标签的各种Fcγ受体(人、犬、食蟹猴、鼠)在CHO中表达，并通过蛋白A和大小排阻色谱法(SEC)纯化。使用生物素蛋白连接酶/BirA试剂盒(GeneCopoeia)在Avi标签处对分子进行生物素化。
Figure BDA0002675941450000161
市购生物素化的FcRn分子(人、小鼠、食蟹猴)：
FcRn(FCGRT/B2M)，His标签，生物素标记，(人)HiPTM产品编号71283
FcRn(FCGRT/B2M)，His-Avi标签，生物素标记的(小鼠)HiPTM产品编号71286
FcRn(FCGRT/B2M)，Avi标签，生物素标签，(食蟹猴)AcroTM产品编号FCM-C82W5
SPR方法
A)与各种Fcγ受体结合
在Biacore T200仪器上使用HBS-P+在25℃下测量EGFR/CD16A抗原结合蛋白与各种Fcγ受体的结合。
b)与FcRn结合
EGFR/CD16A抗原结合蛋白与FcRn(人、食蟹猴、鼠)的结合在Biacore T200仪器上在25℃下使用pH-6.0PBS-T缓冲液作为运行缓冲液并进行稀释(1x Gibco PBS，0.005％Tween20，用4M HCl滴定至pH 6.0)进行测量。为此，使用Biotin CAPture Kit(通用医疗)进行了多周期动力学实验。为了激活传感器表面，将Biotin CAPture试剂(通用医疗)注射到流通池Fc 1-4(100秒，5μL/min)中，产生2100RU–2800RU的响应。将不同物种的生物素化FcRn注射到流通池Fc2(5μL/min)中，产生约8–15RU的响应。在(pH 7.4)运行缓冲液中进行EGFR/CD16A抗原结合蛋白的一系列稀释。为此，使用Biotin CAPture试剂盒(通用医疗)进行了单周期动力学实验。为了激活传感器表面，将Biotin CAPture试剂(通用医疗)注射到流通池Fc 1-4(100秒，5μL/min)中，产生2100RU–2800RU的响应。在流通池Fc2、Fc3、Fc4中捕获(35RU-55RU)生物素化的Fcγ受体。将一系列抗EGFR抗体构建体的稀释液以单周期动力学模式(30μL/min，结合180秒，解离240秒，6000nM–1.47nM稀释度1：4)注射到流通池Fc 1-4中。使用再生溶液(通用医疗)(10μL/min，流通池1-4，120秒)再生芯片。通过减去零浓度周期和减去参考通道Fc1(Fc 2-1、Fc 3-1、Fc 4-1)中的信号来引用传感图。使用注入流动池Fc 1，2(30μL/min，结合240秒，解离100秒，解离100秒，3000nM–12.5nM稀释度1：3)的Biacore T200评估软件，通过将数据拟合至1：1绑定模型(RI常数为零)来评估结合动力学。使用再生溶液(通用医疗)(10μL/min，流通池1-4，120秒)再生芯片。通过减去零浓度周期和减去参考通道Fc 1(Fc 2-1)中的信号来引用传感图。使用Biacore T200评估软件通过将数据拟合为1：1绑定模型(局部拟合的Rmax和RI)来评估结合动力学。
结果：
在Fcγ-受体结合测定中，scFv-IgAb_02显示与人CD16AFcγRIIIa(48R-158V)-mFc-Avi(KD 12.5nM)和食蟹猴CD16FcγRIII-mFc-Avi(KD 19.9nM)结合，而对于所有其他测试的Fcγ受体均未检测到结合相互作用(表1)。Bi-scFv-Fc_02显示仅与CD16AFcγRIIIa(48R-158V)-mFc-Avi(KD 12.2nM)和猕猴CD16FcγRIII-mFc-Avi(KD 25.2nM)结合。对照分子EGFR/CD16A串联双抗体显示与人CD16AFcγRIIIa(48R-158V)-mFc-Avi(KD 4.4nM)和食蟹猴CD16FcγRIII-mFc-Avi(KD 8.9nM)结合。所有测试的Fcγ受体的功能由不同的IgG1对照分子显示(数据未显示)。
scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02中Fc的沉默可通过不存在与测试Fcγ受体的结合相互作用(除了通过抗CD16A结构域与人CD16A和食蟹猴CD16的特异性结合)来验证。
对于人FcRn(scFv-IgAb_2KD 430nM，Bi-scFv-Fc_02KD 410nM)、鼠FcRn(scFv-IgAb_02KD 180nM、Bi-scFv-Fc_02KD 121nM)和猕猕猴FcRn(scFv-IgAb_02KD 842nM、Bi-scFv-Fc_02KD 268nM)，显示了pH 6.0下scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc-02的FcRn结合。对于对照分子EGFR/CD16A串联双抗体，没有测量到结合相互作用。可以验证在scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02的沉默Fc中FcRn结合能力的保存。
表1用EGFR/CD16A抗原结合蛋白进行的Fcγ-受体结合测定的汇总表。
Figure BDA0002675941450000181
表2：在pH 6.0下与EGFR/CD16A抗原结合蛋白结合的FcRn的汇总表。
Figure BDA0002675941450000182
实施例2：
在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋 白与原代人NK细胞的结合
方法：
从血沉棕黄层中分离PBMC和人NK细胞的富集
通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆，德国)中分离PBMC。血沉棕黄层样品用2-3倍体积的PBS(英杰公司(Invitrogen)，产品编号:14190-169)稀释，铺在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies)，产品编号:07861)的垫层上，并以800×g室温下离心25分钟(不加制动)。收集位于界面中的PBMC，并用PBS洗涤3次，然后无刺激下将其在添加有10％FCS的完全RPMI 1640培养基中培养过夜。为了富集NK细胞，从过夜培养物中收获PBMC，并根据制造商的说明使用对未接触的人NK细胞进行免疫磁分离的EasySepTM人NK细胞富集试剂盒(干细胞技术公司，产品编号：19955)和Big Easy EasySepTM磁铁(干细胞技术公司，产品编号:18001)进行一轮阴性选择。
细胞结合测定和流式细胞仪分析
将所示细胞类型的等分试样与100μL各种双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白在FACS缓冲液(PBS，英杰公司，产品编号：14190-169)中添加或不添加10mg/mL多克隆人IgG(GAMMANORM，瑞士)的系列稀释液在37℃下一起孵育45分钟，所述FACS缓冲液含2％热灭活的FCS(英杰公司，产品编号：10270-106)、0.1％叠氮化钠(Roth，卡尔斯鲁厄，德国，产品编号：A1430.0100)。用FACS缓冲液反复洗涤后，先用10mg/mL抗EGFR mAb(克隆62-1-1(生化基因公司(Biogenes))检测细胞结合的抗体，然后用15μg/mL FITC偶联的山羊抗小鼠IgG(DIANOVA，产品编号：115-095-062)检测细胞结合的抗体。通过AlexaFluor 488偶联的链霉亲和素(DIANOVA 016-540-084)检测到生物素化西妥昔单抗以及生物素化抗EGFR IgG抗体(IgAb_wtFc，IgAb_enhFc)。在最后的染色步骤之后，再次洗涤细胞，并将其重悬于含有2μg/mL碘化丙锭(PI)(Sigma，产品编号：P4170)的0.2mL FACS缓冲液中，以排除死细胞。使用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(默克密理博公司(Merck Millipore)，施瓦尔巴赫，德国)测量2-5×103个活细胞的荧光。使用Incyte软件(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)计算细胞样品的平均荧光强度。减去仅用第二试剂和第三试剂染色的细胞的荧光强度值后，使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚洲拉荷亚)将这些值进行非线性回归分析。对于KD的计算，使用了单点结合方程(双曲线)。
结果
为了评估人IgG的生理浓度对双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白结合能力的影响，在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，用几种双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对原代人NK细胞进行结合试验，如图10所示。表3总结了两种条件下所示双特异性抗原结合蛋白的结合亲和力。在存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，EGFR/CD16A串联双抗体对原代人NK细胞的表观亲和力基本不变。但是，IgG的添加将Bi-scFv-Fc_02的亲和力降低了约4倍，从5nM降至20nM。
Figure BDA0002675941450000191
Figure BDA0002675941450000201
表3：在两个独立的结合测定中，在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白在原代人NK细胞上的表观亲和力。给出了独立实验的平均KD和SD值。SD，标准偏差；n，独立实验的次数；不，代表不结合；n.a.不适用。
实施例3：
EGFR/CD16A串联双抗体对表达重组人EGFR或EGFRvIII的CHO细胞的结合
细胞结合测定和流式细胞仪分析
将指示细胞的等分试样与100μL在FACS缓冲液(英杰公司，产品编号：14190-169)中连续稀释的His标签的串联双抗体的系列稀释液在37℃下一起孵育45分钟，所述FACS缓冲液含有2％热灭活的FCS(英杰公司，产品编号：10270-106)、0.1％叠氮化钠(Roth，卡尔斯鲁厄，德国，产品编号：A1430.0100)。用FACS缓冲液反复洗涤后，先用10μg/mL抗His mAb13/45/31-2(DIANOVA，汉堡，德国，产品编号：DIA910-1MG)检测细胞结合的抗体，然后用15μg/mL FITC偶联的山羊抗小鼠IgG(DIANOVA，产品编号：115-095-062)检测细胞结合的抗体。在最后的染色步骤之后，再次洗涤细胞，并将其重悬于含有2μg/mL碘化丙啶(PI)(Sigma，产品编号：P4170)的0.2mL FACS缓冲液中，以排除死细胞。使用贝克曼库尔FC500 MPL流式细胞仪和MXP软件(贝克曼库尔特，克雷菲尔德，德国)或Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)测量2-5×103个活细胞的荧光。使用CXP软件(贝克曼库尔特)或Incyte软件(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)计算细胞样品的平均荧光强度。减去仅用第二试剂和第三试剂染色的细胞的荧光强度值后，使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚洲拉荷亚)将这些值进行非线性回归分析。对于KD的计算，使用了单点结合方程(双曲线)。
结果
在37℃下EGFR/CD16A串联双抗体与表达人EGFR或EGFRvIII的细胞具有相似的表观亲和力(表4)。
因此，EGFR/CD16A抗原结合蛋白可用于治疗表达EGFR的和表达EGFRvIII的癌症。与EGFR相反，EGFRvIII仅在癌细胞上表达，而在健康组织上不表达。
表4：在37℃下，EGFR/CD16A串联双抗体对表达重组人EGFR或EGFRvIII的CHO细胞的表观亲和力。
Figure BDA0002675941450000202
实施例4：
EGFR/CD16A构建体与EGFR+A-431和HCT-116细胞的结合
方法：
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有组分来自英杰公司)中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555，RAS wt)。
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的RPMI 1640培养基(所有组分来自英杰公司，在本文中称为完全RPMI 1640培养基)中培养HCT-116(ATCC，产品编号：CCL-247，RAS mut)。将所有细胞系在37℃、5％CO2的潮湿气氛中培养。
细胞结合测定和流式细胞仪分析
将所示细胞类型的等分试样与100μL所示双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白的系列稀释液在FACS缓冲液(PBS，英杰公司，产品编号：14190-169)中在37℃下一起孵育45分钟，所述FACS缓冲液含有2％热灭活的FCS(英杰公司，产品编号：10270-106)、0.1％叠氮化钠(Roth，卡尔斯鲁厄，德国，产品编号：A1430.0100)。用FACS缓冲液反复洗涤后，先用10μg/mL的抗EGFR mAb(克隆4-1-1(生化基因公司))检测细胞结合的抗体，然后用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG min X(Dianova；产品编号：115-095-062)检测细胞结合的抗体。通过FITC偶联的山羊抗人IgG(DIANOVA；产品编号：109-095-08)检测到细胞表面结合的西妥昔单抗、具有wtFc的抗EGFR(IgAb_wtFc；IgAb_49)、具有增强的Fc的抗EGFR(IgAb_enhFc，IgAb_53)。在最后一个染色步骤之后，再次洗涤细胞，并将其重悬于含2μg/mL碘化丙锭(PI)(Sigma，产品编号：P4170)的0.2mL FACS缓冲液中，以排除死细胞。使用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)测量2-5×103个活细胞的荧光。使用Incyte软件(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)计算细胞样品的平均荧光强度。减去仅用第二试剂和第三试剂染色的细胞的荧光强度值后，使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚洲拉荷亚)将这些值用于非线性回归分析。对于KD的计算，使用了单点结合方程(双曲线)。
结果
在独立的结合实验中确定了双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白在EGFR+肿瘤细胞系上的表观亲和力，并总结在表5中。
Figure BDA0002675941450000211
表5：在EGFR+肿瘤细胞系的独立结合测定中确定的EGFR/CD16A抗原结合蛋白的表观亲和力。给出了独立实验的平均KD和SD值。SD，标准偏差；n，独立实验的次数；n.a.不适用。
实施例5：
双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对EGFR+肿瘤细胞系的细胞毒活性
方法：
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有组分来自英杰公司)中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555)。在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的RPMI 1640培养基(所有组分来自英杰公司，本文中称为完全RPMI 1640培养基)中培养HCT-116(ATCC，产品编号：CCL-247)。将所有细胞系在37℃、5％CO2的潮湿气氛中培养。
从血沉棕黄层中分离PBMC和人类NK细胞的富集
通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆，德国)中分离PBMC。血沉棕黄层样品用2-3倍体积的PBS(英杰公司(Invitrogen)，产品编号:14190-169)稀释，铺在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies)，产品编号:07861)的垫层上，并以800×g室温下离心25分钟(不加制动)。收集位于界面中的PBMC，并用PBS洗涤3次，然后无刺激下将其在添加有10％人源血清(Sigma，产品编号：H4522)的完全RPMI 1640培养基中培养过夜。为了富集NK细胞，从过夜培养物中收获PBMC，并根据制造商的说明使用对未接触的人NK细胞进行免疫磁分离的EasySepTM人NK细胞富集试剂盒(干细胞技术公司，产品编号：19055)和Big Easy EasySepTM磁铁(干细胞技术公司，产品编号:18001)进行一轮阴性选择。
4小时钙黄绿素释放细胞毒性测定
对于钙黄绿素释放细胞毒性测定，从培养物中收获指定的靶细胞，用不含FCS的RPMI 1640培养基洗涤，并在不含FCS的RPMI培养基中于37℃下用10μM钙黄绿素AM(英杰公司/分子探针，产品编号：C3100MP)标记30分钟。轻轻洗涤后，将标记的细胞重悬于完全RPMI培养基(补充有10％热灭活的FCS、4mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素的RPMI培养基)中至密度为1×105/mL。然后将1×104靶细胞与富集的原代人NK细胞以5：1的E：T比一起和以12系列稀释的指定的抗体接种到圆底96孔微孔板的单个孔中，总体积为200μL/孔，一式两份。在每块板上一式四份测定在没有抗体的情况下靶通过效应子的自发释放、最大释放和杀死。
在200g离心2分钟后，将测定液在37℃、5％CO2的潮湿气氛中孵育4小时。孵育结束前15分钟，将20μL的RPMI培养基中的10％Triton X-100添加到含有靶细胞的孔中。将20μLRPMI培养基添加到所有其他孔中。在500g再次离心5分钟后，从每个孔中收集100μL细胞培养上清液，并使用荧光酶标仪(EnSight多功能酶标仪，Perkin Elmer)在520nm下测量释放的钙黄绿素的荧光。根据测量的计数，根据下式计算特定的细胞裂解：[荧光(样品)-荧光(自发)]/[荧光(最大)-荧光(自发)]×100％。荧光(自发)表示在没有效应细胞和抗体的情况下来自靶细胞的荧光计数，荧光(最大)表示通过添加Triton X-100诱导的总细胞裂解。S型剂量响应曲线和EC50值通过非线性回归/4参数逻辑拟合使用GraphPad Prism软件(Windows，GraphPad软件，美国加利福尼亚拉荷亚的GraphPad Prism版本6.00)计算。
结果：
在4小时钙黄绿素释放细胞毒性试验中，在EGFR+A-431和HCT-116靶细胞上将多种双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白和对照构建物一起检测。抗原结合蛋白未显示脱靶细胞毒性。图12显示了一个示例性实验的结果。3个独立实验的结果汇总在表6(A-431靶细胞)和表7(HCT-116靶细胞)中。
Figure BDA0002675941450000231
表6：双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对A-431靶细胞的细胞毒性
在针对以具有E：T比为5：1的富集的人NK细胞为效应细胞的EGFR+A-431肿瘤靶细胞的三个独立的4h钙黄绿素释放细胞毒性试验中，确定了EGFR/CD16A抗原结合蛋白的EC50值的平均值和SD[pM]。SD，标准偏差；不，代表不裂解；n.a.，不适用。
Figure BDA0002675941450000232
表7：双特异性EGFR/CD16A抗原结合蛋白对HCT-116靶细胞的细胞毒性
在针对以具有E：T比为5：1的富集的人NK细胞为效应细胞的EGFR+HCT-116肿瘤靶细胞的三个独立的4h钙黄绿素释放细胞毒性试验中，确定了EGFR/CD16A抗原结合蛋白的EC50值的平均值和SD[pM]。SD，标准偏差；不，代表不裂解；n.a.，不适用。
实施例6：
EGFR磷酸化的抑制
为了比较不同的EGFR/CD16A抗原结合蛋白对EGF诱导的EGFR信号转导的抑制作用，使用A-431细胞进行了磷酸化分析。
材料与方法：
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有成分均来自英杰公司)中在37℃、5％CO2的潮湿气氛中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555)。
磷酸化测定
简而言之，将5×104A-431细胞的等分试样(ATCC，产品编号：CRL-1555)在37℃和5％CO2的湿润气氛中接种到在DMEM培养基中的96孔板的各个孔中20小时，所述DMEM培养基补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素(所有成分均来自英杰公司)。然后将细胞在无血清的培养基中饥饿4小时，然后加入指定抗体构建体的连续稀释液。在37℃孵育30分钟后，加入EGF(Sigma，产品编号：10605-HNAE-250)至终浓度为100ng/mL，将培养物在37℃进一步孵育10分钟，然后用冰冷的PBS(英杰公司，产品编号：14190-169)洗涤，裂解，然后根据制造商的说明使用Phospho-EGFR ELISA试剂盒(RayBiotech，产品编号：PEL-EGFR-Y)用于磷酸化EGFR的相对定量。用多板读数器(Victor 3，Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚拉荷亚)分析吸光度值并作图。
细胞结合测定和流式细胞仪分析
将标样细胞的等分试样与100μL在FACS缓冲液(PBS，英杰公司，产品编号：14190-169)中指定抗体的系列稀释液在37℃下一起孵育45分钟，所述FACS缓冲液含有2％热灭活的FCS(英杰公司，产品编号：10270-106)、0.1％叠氮化钠(Roth，卡尔斯鲁厄，德国，产品编号：A1430.0100)。用FACS缓冲液反复洗涤后，先用10μg/mL抗His mAb 13/45/31-2(Dianova，汉堡，德国，产品编号：DIA910-1MG)检测细胞结合的双抗体，然后再用15μg/mLFITC偶联的山羊抗小鼠IgG(DIANOVA，产品编号：115-095-062)、或针对抗CD16A Fv结构域(SEQ ID NO：12,13)生成的单克隆抗体4-1-1、然后用15μg/mL FITC偶联的山羊抗小鼠IgG来检测细胞结合的串联双抗体。细胞表面结合的Bi-scFv-Fc_02(SEQ ID NO：30)、scFv-IgAb_01和scFv-IgAb_02(SEQ ID NO：28,29)通过FITC偶联的山羊抗人IgG(英杰公司，产品编号：109-095-088)或mAb 4-1-1检测，然后用15μg/mL FITC偶联的山羊抗小鼠IgG检测。细胞表面结合西妥昔单抗和IgAb_wtFc(IgAb_049)通过FITC偶联的山羊抗人IgG(Dianova，产品编号:109-095-088)检测。在最后染色步骤之后，再次洗涤细胞，并将其重悬于含有2μg/mL碘化丙啶(PI)(Sigma，产品编号：P4170)的0.2mL FACS缓冲液中，以排除死细胞。使用贝克曼库尔FC500 MPL流式细胞仪和MXP软件(贝克曼库尔特，克雷菲尔德，德国)或MilliporeGuava EasyCyte流式细胞仪(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)测量2-5×103个活细胞的荧光。使用CXP软件(贝克曼库尔特)或Incyte软件(默克密理博公司，施瓦尔巴赫，德国)计算细胞样品的平均荧光强度。减去仅用第二试剂和第三试剂染色的细胞的荧光强度值后，使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚洲拉荷亚)将这些值进行非线性回归分析。对于KD的计算，使用了单点结合方程(双曲线)。
结果：
用作阳性对照的抗EGFR IgG西妥昔单抗，以及来自伊加妥珠单抗(imgatuzumab)的具有抗EGFR Fab结构域的人IgG1(IgAb_065)以EC50值为7μg/mL-9μg/mL呈剂量依赖性抑制EGF诱导的EGFR磷酸化。
EGFR/CD16A串联双抗体、EGFR/CD16A scFv-IgAb_01、Fc沉默的IgG1(IgAb_047)和wt IgG1(IgAb_049)抑制EGFR磷酸化的效能大大降低，EC50值高于100μg/mL，上述抗体均包含抗EGFR Fab结构域，该结构域包含SEQ ID NO：1和2所示的可变结构域。
值得注意的是，包含如SEQ ID NO：1和2所示的抗EGFR结构域作为与Fc的C端融合的scFv的scFv-IgAb_02，对EGF诱导的EGFR磷酸化没有抑制作用或只有很小的抑制作用。
这些数据表明，与西妥昔单抗和伊加妥珠单抗相比，scFv-IgAb_02表现出降低的受体拮抗作用，因此在依赖于用于组织稳态的EGFR信号传导的组织例如皮肤中表现出降低的毒性。
用作阴性对照的CD19/CD16A串联双抗体显示未抑制EGFR磷酸化。图13和图14中描绘的实验结果汇总在表8中。
表8：使用A-431细胞的EGFR磷酸化测定的列表汇总
Figure BDA0002675941450000251
n.t.，未检测
测试的抗体构建体和形式对EGF诱导的EGFR磷酸化抑制作用的差异不能归因于其对EGFR亲和力的差异，因为对A-431细胞的表观结合亲和力(KD值)与抑制EGF诱导的EGFR磷酸化的能力不相关(表9；图14)。
例如：与scFv-IgAb_02或Bi-scFv-Fc_02相比，EGFR/CD16A串联双抗体对A-431细胞的结合亲和力稍低/或相似，但与scFv-IgAb_02或Bi-scFv-Fc_02相比，磷酸化抑制作用强得多。或：EGFR对scFv-IgAb_01或Bi-scFv-Fc_02的A-431的的表观亲和力与西妥昔单抗相同，但对scFv-IgAb_01或Bi-scFv-Fc_02的EGFR磷酸化的抑制作用相对于西妥昔单抗低得多。
由于所有测试的EGFR/CD16A抗原结合蛋白都包含与EGFR和CD16A相同的结合域，因此对EGF介导的EGFR磷酸化的影响应与抗原结合蛋白的3D结构的固有特性相关。仅在C端位置包含EGFR结合域的scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02显示了这种特异性(对磷酸化没有或只有很小的抑制作用)。
因此，期望该独特性质转化为与相比于例如西妥昔单抗改善的副作用。该假设背后的原因是，如前所述，EGFR抑制剂所见的皮肤毒性是由于对皮肤角质形成细胞的EGFR信号传导产生了有害的抑制作用。
表9：在37℃下对A-431细胞的细胞结合实验中确定的各种抗EGFR抗原结合蛋白的表观亲和力
Figure BDA0002675941450000261
n，独立实验的次数；n次实验的平均KD值；SD，标准偏差，n.t.，未测试，n.a.，不适用
实施例7：
药代动力学(PK)特性的评价：
单次静脉注射相应抗体后，测定CD1小鼠中scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02的血清浓度：
在CD1小鼠的单剂量PK研究中，对EGFR/CD16A抗原结合蛋白进行PK评价。必须指出的是，在CD1小鼠中不与标称靶标结合，并且在该模型中无法研究靶标介导的作用。但是，这些测试项目对鼠FcRn受体具有完全交叉反应性，应充分体现FcRn对半衰期的影响。实施了两个测试系统，以在小鼠血清中的PK分析中评价了EGFR/CD16A抗原结合蛋白。已经以ELISA形式设置了第一测试系统，随后将该平台转移到了MSD阅读器平台上。两种测定显示出一致的血清浓度和PK数据。
制备用于静脉缓慢推注的300μg/小鼠剂量的scFv-IgAb_02和Bi-scFv-Fc_02应用溶液，以获得300μg/250μL的终浓度。
进行了两项PK研究：
抽血(在治疗前(给药前)、治疗后168小时(研究1)和治疗后504小时(研究2)进行样品采集)。
采血/动物的数量：3
每个时间点的动物数：4
在异氟烷麻醉下通过眼球后静脉丛的点刺进行采血。血容量为100-150μL(约30μL血清)。
第三次末次采血后立即处死动物。
全血处理为血清，所有样品立即冷冻并保存在-65℃以下。
在第一项研究中，通过MSD和ELISA评估了168小时(7天)内的血清药代动力学。半衰期为：
scFv-IgAb_02：79小时
Bi-scFv-Fc_02：96小时
由于采血时间太短并且无法适当计算末端消除时间，因此进行了后续研究。因此，在第二项研究中，仅在scFv-IgAb_02的504小时(21天)时间内进行了血清药代动力学评价(ELISA测定血清浓度)。观察时间足够，并且可以在消除阶段进行明显可靠的半衰期计算。scFv-IgAb_02的半衰期为：
·329.2小时
测定小鼠的半衰期：
使用峰会研究服务(Summit Research Services)的PK Solutions(2.0版)程序通过非隔室确定药代动力学参数(68911旷场实验(Open Field Dr.)，蒙特罗斯，科罗拉多州81401美国)。
实施例8：
在A-431和A-549细胞中EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制
为了比较不同的EGFR/CD16A抗原结合蛋白对EGF诱导的EGFR信号转导的抑制作用，对A-431和A-549细胞进行了磷酸化分析。
材料与方法：
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠盐和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有组分来自英杰公司)中在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555)和A-549(DSMZ，产品编号：ACC 107)。
磷酸化测定
简而言之，将5×104A-431或A-549细胞的等分试样在37℃和5％CO2的湿润气氛中接种到在DMEM培养基中的96孔板的各个孔中20-22小时，所述DMEM培养基补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素(所有成分均来自英杰公司)。然后将细胞在无血清的培养基中饥饿4小时，然后加入指定抗体构建体的连续稀释液。在37℃孵育30分钟后，加入EGF(Sigma，产品编号：10605-HNAE-250)至终浓度为100ng/mL，将培养物在37℃进一步孵育10分钟，然后用冰冷的PBS(英杰公司，产品编号：14190-169)洗涤，裂解，然后根据制造商的说明使用Phospho-EGFR ELISA试剂盒(RayBiotech，产品编号：PEL-EGFR-Y)用于磷酸化EGFR的相对定量。用多板读数器(Victor3，Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism软件(适用于Windows的GraphPad Prism版本6.00，GraphPad软件，美国加利福尼亚拉荷亚)分析吸光度值并作图。
结果：
使用A-431细胞(图15a)和A-549细胞(图15b)评估了EGF刺激后EGFR/CD16A scFv-IgAb(scFv-IgAb_02)、参考抗EGFR IgG西妥昔单抗和帕尼单抗以及各种对照抗体对EGFR磷酸化的抑制作用。表10显示了针对EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制而确定的抗体描述和EC50值汇总。
抗EGFR IgG西妥昔单抗和帕尼单抗用作参考抗体，以剂量依赖的方式抑制EGF诱导的EGFR磷酸化，对A-431细胞的EC50值分别为7.7μg/mL和8.2μg/mL，对A-549细胞的EC50值分别为0.1μg/mL和0.3μg/mL。RSV/CD16A scFv-IgAb(scFv-IgAb_44)用作阴性对照，显示出对EGF刺激的EGFR磷酸化无抑制作用。
均包含SEQ ID NO：1和2所示的可变结构域的抗EGFR Fab结构域的Wt IgG1(IgAb_49)和Fc增强的IgG1(IgAb_53)，其抑制EGFR磷酸化的效力大大低于西妥昔单抗或帕尼单抗，西妥昔单抗或帕尼单抗对A-431细胞的EC50值高5-6倍，对A-549细胞的EC50值高75-300倍。
值得注意的是，包含如SEQ ID NO：1和2所示的抗EGFR结构域作为与Fc的C端融合的scFv并且仅在Fab结构域上不同的scFv-IgAb_02和scFv-IgAb_45，显示了仅在高浓度下，对EGF诱导的EGFR磷酸化具有抑制作用，对A-431细胞的EC50值为1.1mg/mL至1.5mg/mL，对A-549细胞的EC50值为478μg/mL至643μg/mL。
这些数据表明，与包含相同抗EGFR Fv域的IgG1抗体(IgAb_49和IgAb_53)相比，scFv-IgAb_02表现出降低的受体拮抗作用。对于EGFR/CD16A scFv-IgAb_02，可观察到与西妥昔单抗介导的抑制作用相比，差异甚至更大，对A-431细胞效力降低约200倍，对A-549细胞效力降低约5000倍。从这些数据可以得出结论，减少对scFv-IgAb_02的EGFR信号的抑制作用与改善的副作用有关，并转化为较少的皮肤毒性，这在具有强受体拮抗特性的抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗和帕尼单抗)中通常可见。
表10：使用A-431和A-549细胞进行的EGFR磷酸化测定的列表汇总
Figure BDA0002675941450000281
§，将底部约束为0.25以进行非线性回归分析和EC50值的计算。$，将底部限制为0.1以进行非线性回归分析和EC50值的计算。
实施例9：
在scFv-IgAb_02对EGF处理后对EGFR信号蛋白磷酸化的抑制作用评价
方法：
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有成分均来自英杰公司)中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555)。在用于实验之前，将细胞在饥饿培养基(具有1％FCS的RPMI 1640培养基(英杰公司))中培养1小时。
用抗体抑制EGFR信号转导
如果需要，将3×106个细胞与20μg/mL的相应抗体在37℃的潮湿环境中孵育1小时。随后，通过在37℃在潮湿的气氛中加入浓度为100ng/mL的重组人EGF(ThermoFisher，#10605HNAE250)刺激细胞5或15分钟。然后洗涤细胞，并用放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA)在冰上使细胞溶解45分钟，所述放射免疫沉淀测定缓冲液含有150mM NaCl(AppliChem，#131659.1211)、1％Triton X-100(Roth，#30512)、0.05％脱氧胆酸钠(Sigma，#D6750)、0.1％SDS(Roth，#CN30.1)、50mM Tris(Biomol，#08003.1)、蛋白酶抑制剂(Roche，#11697498001)和磷酸酶抑制剂(Roche，#4906845001)。在300×g和4℃下离心15分钟后，将上清液与含有62.5mM Tris-HCl pH 6.8、2％SDS、5％甘油(Applichem，#A2926,055)、200mM溴酚蓝(Roth，#A512.1)、0.1M DTT(Roth，#6908.2)的还原样品缓冲液以1：1混合，并加热至95℃10分钟，然后在4-20％Criterion TGX预制SDS-PAGE凝胶上在1×Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Bio-Rad，#1610732)中于300V下进行SDS-PAGE(Bio-Rad，#5678095)22分钟。为了进行免疫印迹，根据制造商的说明，使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-Rad)将蛋白质转移到PVDF膜(BioRad，#1704157)上。然后将膜在室温下在5％脱脂牛奶(Sigma，#70166)的TBS中封闭1h，用TBS洗涤3次，并按照制造商推荐在5％BSA(Sigma，#A3059)、0.05％NaN3(Roth，#K305.1)中稀释的一抗在室温下孵育于TBS中1h，或在4℃孵育过夜。随后将膜用TBS洗涤3次，并在室温下与在TBS中的HRP缀合的二抗和5％脱脂乳一起孵育1小时。用TBS洗涤后，使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)测量添加ECL溶液(ThermoFisher，#32209)后的化学发光，并使用图像实验室软件(Image Lab Software)(BioRad)进行分析。表11列出了测试的抗体清单，表12列出了用于检测蛋白质的抗体清单。
表11：测试的抗体
构建体 描述
scFv-IgAb_02 双特异性EGFR/CD16A抗体
西妥昔单抗 嵌合IgG1抗EGFR；爱必妥；PZN 11191428
scFv-IgAb_45 双特异性EGFR/RSV抗体
表12：用于检测信号蛋白的抗体
Figure BDA0002675941450000291
结果
为了评价EGFR/CD16A scFv_IgAb_02对EGF诱导的EGFR信号转导的抑制作用，将A-431细胞与作为对照的scFv IgAb_02以及EGFR/RSV scFv-IgAb_45或抗EGFR IgG1西妥昔单抗一起孵育。分别刺激5分钟和15分钟，并通过免疫印迹评估磷酸化的诱导。
印迹图像如图16和17所示。各个磷蛋白的相对条带强度的定量如图18、19和20所示。
在该实施例中给出的结果显示了用EGF刺激A-431细胞后EGFR、Akt和Erk的磷酸化。用EGF刺激5分钟和15分钟后，可测量EGFR的磷酸化及其抑制作用(图18)，而分别在5分钟(图19)或15分钟(图20)后，pAkt和pErk的差异最为明显。
用西妥昔单抗对细胞进行预培养可阻止对EGFR、Akt和Erk的EGF刺激，而与EGFR/CD16A scFv-IgAb_02或EGFR/RSV scFv-IgAb_45的预培养则没有或仅有很小的抑制作用EGF刺激的EGFR、Akt和Erk磷酸化。EGF刺激和抗体治疗对EGFR、Akt和Erk的总蛋白水平没有影响。
实施例10：
scFv-IgAb_02诱导的PBMC细胞因子释放
从血沉棕黄层中分离PBMC
通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆，德国)中分离PBMC。血沉棕黄层样品用2-3倍体积的PBS(英杰公司，产品编号:14190-169)稀释，铺在淋巴细胞分离剂(干细胞技术公司，产品编号:07861)的垫层上，并以800×g室温下离心25分钟(不加制动)。收集位于界面中的PBMC，并用PBS洗涤3次，然后无刺激下将其在添加有10％FCS的完全RPMI 1640培养基中培养过夜。
细胞系培养
在标准条件下，在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基(所有组分来自英杰公司)中在37℃、5％的潮湿环境中培养A-431(ATCC，产品编号：CRL-1555)。
在存在或不存在EGFR+靶细胞的情况下，对由scFv-IgAb_02刺激的PBMC释放的细胞因子进行定量。
将5×105原代人PBMC与EGFR+A-431靶细胞以效应子与靶标比率为50：1共培养。在存在或不存在浓度递增的scFv-IgAb_02的情况下，将共培养物在添加有10％FCS的完全RPMI 1640培养基中孵育，总体积为200μL。通过仅在存在或不存在scFv-IgAb_02的情况下包括PBMC或A-431细胞的培养物来评价培养物中的背景细胞因子水平。作为阳性对照，将共培养物与DynaBeads人T激活剂CD3/CD28(Gibco，产品编号11132D)一起孵育，刺激PBMC群体中T细胞释放所有测试的细胞因子。将所有培养物在加湿培养箱中于37℃和5％CO2下孵育4h、24h或48h，然后在室温下以70×g离心2min。从每个孔中收集细胞培养物上清液(70μL)，并转移至圆底96孔微孔板中，于-80℃下储存，直至使用BDTM流式微珠阵列(CytometricBead Array)(CBA)人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD生物科技)在生物测定有限公司(德国海德堡)通过基于微珠的多重方法对细胞因子进行定量。使用适用于Windows的GraphPadPrism(V6.00/7.03，GraphPad软件，美国加利福尼亚州拉荷亚)分析和绘制结果。
在存在或不存在靶细胞和scFv-IgAb_02的情况下，通过PBMC共培养确定NK活化状态。
收集上清液进行细胞因子定量后，通过流式细胞仪评价细胞的NK细胞活化。为此，将细胞洗涤并重悬于CD56-PC7(5μL/测试；贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，A21692)、CD25-PE(10μL/测试；贝克曼库尔特公司，A07774)和CD69-PC5(5μL/测试；贝克曼库尔特公司，IM2656)中，总染色体积为100μL FACS缓冲液(含有2％热灭活的FCS和0.1％叠氮化钠的PBS)。在黑暗中于冰上孵育15分钟后，将细胞洗涤，重悬于FACS缓冲液中，并通过流式细胞仪进行分析。
结果
释放的六种细胞因子，即白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素
在存在或不存在浓度递增的scFv-IgAb_02的情况下，在PBMC和A-431共培养4h、24h和48h后，在细胞培养上清液中评价干扰素-γ(IFN-γ)。
在用CD3/CD28激活珠刺激时，单独和在A-431存在下孵育PBMC不会导致IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α或IFN-γ的可检测到的增加导致所有测试的细胞因子明显释放(数据未显示)。PBMC暴露于浓度递增的scFv-IgAb_02中会导致所有细胞因子的微小释放。仅由scFv-IgAb_02诱导的PBMC的最大细胞因子释放被认为是各个细胞因子的背景水平(表13)。
PBMC和A-431靶标的细胞培养上清液中的细胞因子水平增加到背景水平的5倍以上被认为是阳性信号，并汇总在表13中。这些分析揭示了在PBMC和EGFR+靶细胞共培养至指定时间点的scFv-IgAb_02诱导的剂量依赖性IL-6、TNF-α和IFN-γ释放。没有检测到scFv-IgAb_02诱导的所有其他测试细胞因子超过背景水平的释放。
表13.在原代人PBMC和EGFR+A-431靶细胞和增加浓度的scFv-IgAb_02共培养的情况下，释放的细胞因子汇总。显示了scFv-IgAb_02诱导的细胞因子释放的效力(EC50)和最大应答(Emax)。
Figure BDA0002675941450000311
在PBMC和A-431共培养24h和48h后，效力(EC50)分别为3.7pM和7.1pM(表13；图21)，检测到ScFv-IgAb_02诱导的剂量依赖性IL-6释放。
ScFv-IgAb_02诱导的TNF-α分泌可分别在4h和24h后评价(表13；图22)，而IFN-γ的升高水平仅在4h后可测量(表13；图23)。
在PBMC和A-431细胞共培养24h和48h后，可以检测到CD69+NK细胞的抗体剂量依赖性增加，在所应用的检测设置中，最多可支持44％的NK细胞活化(图24B，图25B)。在没有A-431细胞的情况下，仅在高浓度scFv-IgAb_02培养24小时后，也可以检测到CD69+NK细胞水平升高。在存在A-431细胞的PBMC分别共培养24h和48h中，未检测到scFv-IgAb_02诱导的晚期NK细胞激活标记CD25的明显增加。
实施例11：
体内药效学研究(POC)
在具有异种移植人EGFR+肿瘤的人源化小鼠模型中，采用预防性和治疗性给药方案进行了几项对scFv-IgAb_02的体内POC研究。该模型由水动力性IL-15增强的NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull小鼠(NOG)组成，该小鼠先植入有脐血来源的人CD34+造血干细胞。在第0天(D0)，通过皮下接种1×106A-431细胞植入肿瘤。该模型由法国TransCure BioServicesSAS提供。在前期研究中证明了用人免疫效应细胞(包括人NK细胞)和稳定的A-431肿瘤摄取和生长可实现可靠的重构。就人类NK细胞重构(每mL外周血产生1-2×104个人NK细胞)而言，该模型目前看来是最好的人源化小鼠模型。
下面在上述鼠模型中使用scFv-IgAB_02进行了四项研究。
在预防性治疗设置中(即在肿瘤接种时开始的治疗)，在5mg/kg处观察到scFv-IgAB_02治疗降低了肿瘤生长的趋势，从10mg/kg开始显著抑制了肿瘤生长。在治疗环境中(即，当肿瘤达到50-100mm3的体积时开始治疗)，从10mg/kg的剂量水平开始，观察到通过scFv-IgAB_02治疗显著抑制了肿瘤生长，证明了鼠模型中scFv-IgAB_02的的抗肿瘤功效。
根据上述显示体外研究的实施例，可以得出结论，scFv-IgAB_02具有双重抗肿瘤作用方式，包括
A)通过强迫与CD16A+NK细胞和/或巨噬细胞的相互作用来诱导针对EGFR+肿瘤细胞的ADCC和/或ADCP
B)通过阻断EGFR受体对EGFR+肿瘤细胞的直接生长抑制作用，
诱导ADCC(和/或ADCP)是scFv-IgAB_02发挥的主要抗肿瘤作用(与西妥昔单抗相反，后者主要是通过阻断EGFR磷酸化来直接抑制生长)。
进行了两项鼠POC研究，旨在通过将RSV/EGFR作为参考项目来描述ADCC与直接生长抑制作用。在这种情况下，RSV/EGFR是一种分子，其包含相同的EGFR结合区和scFv-IgAB_02的Fc部分，但不含被不相关的RSV结合域(呼吸道合胞病毒)取代的CD16A结合部分–因此无法诱导ADCC。
两项RSV/EGFR研究中的第一项显示，scFv-IgAB_02的抗肿瘤作用比RSV/EGFR略好(因此指出在鼠A-431肿瘤模型中ADCC对总体抗肿瘤功效的贡献)。然而，第二项研究比较了预防和治疗组中scFv-IgAB_02和RSV/EGFR的几种不同剂量水平，结果表明鼠鼠A-431肿瘤模型中两种变体的效价相同。因此，假定在重组鼠模型中，scFv-IgAB_02的重叠药效学作用似乎主要受磷酸化抑制(EGFR信号转导)的影响，这可能是由于与人类情况相比，该模型中存在的NK细胞数量较少。
因此，尽管为scFv-IgAB_02的体内抗肿瘤功效提供了一般的POC，但人源化的鼠模型并不适合于描述针对EGFR+肿瘤的ADCC诱导作为scFv-IgAB_02的主要效应子机制。
在最初的研究中，在带有A431肿瘤的eHIS-IL15-huNOG小鼠的预防环境中比较了不同的双特异性EGFR/CD16抗原结合蛋白(scFv-IgAB_02和结构变体/对照)。在第0天(D0)，皮下接种移入有脐血来源的CD34+造血干细胞(HuNOG)的IL-15增强型NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull小鼠(NOG)。从第1天开始，动物每周静脉注射scFv-IgAB_02和Bi-scFv_Fc_02，剂量分别为5mg/kg和10mg/kg，持续四周(q7d×4)。使用相同的给药间隔，以5和0.5mg/kg浓度的西妥昔单抗作为阳性对照。
肿瘤细胞移植后12天，在所有治疗动物中，西妥昔单抗(5mg/kg)、scFv-IgAB_02(15mg/kg)和Bi-scFv_Fc_02(15mg/kg)与载体相比诱导显著延缓肿瘤生长(图26)。低剂量(5mg/kg)scFv-IgAB_02和Bi-scFv_Fc_02趋于减慢肿瘤生长(不明显)，而西妥昔单抗(0.5mg/kg)则无作用。
在随后的功效研究中，在预防性环境中以不同的剂量水平对scFv-IgAB_02进行了测试。在第0天(D0)，皮下接种移入有脐血来源的CD34+造血干细胞(HuNOG)的IL-15增强型NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull小鼠(NOG)。根据人源化率和人类白细胞中NK细胞的百分比，将HuNOG小鼠随机分为治疗组(n＝7)。从D1开始，动物每周静脉注射剂量为5、15和45mg/kg的scFv-IgAB_02(q7d×4)。
肿瘤细胞移植后第11天，在载体组和用scFv-IgAB_02(15mg/kg)和scFv-IgAB_02(45mg/kg)治疗的组之间观察到明显的肿瘤体积减小。植入肿瘤细胞(处死)后第41天，与载体相比，每周注射scFv-IgAB_02(5mg/kg)可使肿瘤体积减少70％。与载体相比，scFv-IgAB_02(15和45mg/kg)可使肿瘤体积减少95％(图27)。
总之，在5mg/kg下观察到通过scFv-IgAB_02治疗减少肿瘤生长的趋势。观察到在15mg/kg和45mg/kg时有明显的抑制作用，表明存在剂量依赖性。
在另一个TRANSCURE研究中，疗效评价是在治疗环境中进行的。
在平行的同一研究中，在预防性环境中，将scFv-IgAB_02与对照构建体RSV-EGFR进行了比较。RSV-EGFR是一种分子，包含scFv-IgAB_02的EGFR结合区和相同的Fc部分，但不含被不相关的RSV结合域取代的CD16A结合部分。
在第0天(D0)，皮下接种移入有脐血来源的CD34+造血干细胞(HuNOG)的IL-15增强型NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull小鼠(NOG)。根据人源化率和人类白细胞中NK细胞的百分比，将HuNOG小鼠随机分为治疗组(n＝7)。
治疗性治疗：
当D17上A-431肿瘤的大小达到50-100mm3时，动物每周以5、15和45mg/kg的剂量静脉注射scFv-IgAB_02(q7d×4)。
两种最高剂量的scFv-IgAB_02(15mg/kg和45mg/kg)分别使A431肿瘤的生长分别降低70％和90％。5mg/kg的scFv-IgAB_02对肿瘤生长没有显著影响(图28A)。
预防性治疗：
从D1(q7d x 4)开始，动物每周以45mg/kg的剂量静脉注射scFv-IgAB_02或RSV-EGFR。
在肿瘤细胞植入后的最初24天内，用scFv-IgAB_02(45mg/kg)和RSV-EGFR(45mg/kg)的治疗完全阻止了肿瘤的生长。从D24开始，RSV-EGFR组的肿瘤生长快于scFv-IgAB_02组。处死时，RSV-EGFR组的平均肿瘤体积达到837mm3，而scFv-IgAB_02组的平均肿瘤体积仅为449mm3(图28B)。这种差异具有统计学意义，表明scFv-IgAB_02的ADCC的额外药效作用是通过阻断两个构建体的EGFR磷酸化来抑制EGFR+肿瘤细胞的直接生长。
为了研究存在ADCC对小鼠A431肿瘤模型中的作用方式的影响/证据，在低剂量scFv-IgAB_02和RSV-EGFR中测试了预防性治疗。此外，比较了单剂量水平下用scFv-IgAB_02和RSV-EGFR进行的治疗。
90只IL15增强的人源化小鼠根据其人源化率和NK细胞(CD56+细胞)的数量随机分为两组。
预防组：预防组(每组6只小鼠)在其右侧植入1×106A431细胞。接种肿瘤细胞后一天，小鼠接受了治疗(静脉注射，每周一次，共四周，最后一次注射是在处死前三天)。第0天被定义为肿瘤细胞接种的日期。进行了以下处理：
·第1组：IL15-huNOG+A431+载体(每周一次，静脉注射)
·第2组：IL15-huNOG+A431+scFv-IgAB_02(1.25mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第3组：IL15-huNOG+A431+scFv-IgAB_02(2.5mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第4组：IL15-huNOG+A431+scFv-IgAB_02(5mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第5组：IL15-huNOG+A431+scFv-IgAB_02(10毫克/千克，每周一次，静脉注射)
·第6组：IL15-huNOG+A431+RSV/EGFR(1.25mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第7组：IL15-huNOG+A431+RSV/EGFR(2.5mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第8组：IL15-huNOG+A431+RSV/EGFR(5mg/kg，每周一次，静脉注射)
·第9组：IL15-huNOG+A431+RSV/EGFR(10mg/kg，每周一次，静脉注射)
肿瘤细胞植入后35天处死所有小鼠。对外周血和肿瘤浸润细胞进行流式细胞术分析。
治疗组：治疗组在其右侧植入1×106A431细胞。当肿瘤的体积达到50-100mm3时，根据小鼠的肿瘤体积、人源化率和NK细胞数量将其随机分组，并开始治疗。第0天被定义为第一次治疗的日期。第10组的动物以及第11和12组的另外的6只动物用作卫星动物用于流式细胞术分析。
进行以下治疗(静脉注射，每周一次，持续四周，死前三天最后一次注射)：
·第10组：IL15-huNOG+A431+载体(每周一次，静脉注射)n＝6
·第11组：IL15-huNOG+A431+scFv-IgAB_02(10mg/kg，每周一次，静脉注射)n＝15
·第12组：IL15-huNOG+A431+RSV/EGFR(10mg/kg，每周一次，静脉注射)n＝15
在治疗开始后3天和10天处死卫星小鼠。在每个时间点处死来自第11组的三只小鼠和来自第12组的三只小鼠。治疗开始后二十四天，每组处死三只肿瘤体积最大的小鼠。在治疗开始后30天处死来自治疗组的所有其余小鼠。对卫星小鼠的外周血和肿瘤浸润细胞进行流式细胞仪分析。在治疗开始后30天，通过流式细胞术对淋巴细胞进行表型分析。
预防性治疗：用scFv-IgAB_02和RSV/EGFR对人表皮样癌A431人源化小鼠肿瘤模型进行的预防性治疗以10mg/kg的剂量可显著减少肿瘤体积。与载体相比，较低的剂量(1.25、2.5和5mg/kg)没有显著抑制肿瘤的生长。在每个测试剂量下，用RSV/EGFR治疗和用scFv-IgAB_02治疗对肿瘤生长具有相似的效果(图29)。对于完全启动针对肿瘤细胞的有效ADCC，此人源化小鼠模型中的NK细胞计数可能太低。
对卫星动物外周血的流式细胞仪分析表明，随着时间的推移，血细胞计数仍保持恒定，但肿瘤细胞植入后，NK细胞(CD69和NKp44)上的激活标记显著增加。
还研究了肿瘤浸润免疫细胞的表型。在细胞数量上，CD45、T和NK细胞组之间没有观察到显著差异。值得注意的是，与载体组相比，scFv-IgAB_02和RSV/EGFR的最高剂量显著增加了NK细胞表面CD69和NKp44的表达。
治疗性处理，与载体相比，以10mg/kg的剂量用scFv-IgAB_02和RSV/EGFR进行的治疗性处理显著降低了肿瘤体积(图30)。RSV/EGFR和scFv-IgAB_02治疗之间未观察到显著差异。
对外周血的流式细胞术分析表明，CD45、NK、T细胞和CD14阳性细胞的数量随时间保持恒定。各组之间未观察到显著差异。
在肿瘤中，用scFv-IgAB_02开始治疗后30天，观察到CD45、NK和T细胞以及CD14阳性细胞的总体增加。与载体和RSV/EGFR治疗组相比，在用scFv-IgAB_02治疗的小鼠中，激活标记的表达趋于更高。在脾脏中，各组之间未观察到显著差异。
实施例12：
药代动力学
涵盖了scFv-IgAB_02的药代动力学程序
·开发猕猴血清基质中的灵敏分析方法
·在食蟹猴中进行静脉单剂量PK研究(三种剂量水平)
·在食蟹猴中剂量范围发现研究中的PK/TK评价(数据尚在等待中)
·在食蟹猴中关键的28天毒理研究中的PK/TK评价(数据仍在等待中)
食蟹猴体内药代动力学样品的生物分析
为了对食蟹猴的药代动力学样品进行生物分析，进行了基于
Figure BDA0002675941450000342
平台的电化学发光免疫分析。
Figure BDA0002675941450000343
平台采用了类似于ELISA的设置，主要区别在于所读取的不是基于如经典ELISA的酶促底物转化，而是基于电化学发光反应。因此，将特殊的微孔板与吸附捕获抗体的电极表面一起使用。此外，还需要一种标记有被称为SULFO-TAGTM的电化学发光标记物(共轭为NHS酯的钌(II)三联吡啶)的检测器。在MSD读取缓冲液(包含三丙胺，TPA)存在下，提供了用于化学发光的合适化学环境。
Figure BDA0002675941450000344
成像器向板电极施加电压，使SULFO标签紧靠板底部，从而通过一系列还原和氧化反应发光。发射光的强度将被检测。可以通过每个标记的多个激发循环来放大信号，以增强光水平并提高灵敏度。因为刺激机制(电)与信号(光)解耦，所以最小的背景信号和高信号的信噪比是可能的。该测定法的LLOQ为5ng/ml，在LLOQ处具有出色的选择性。14/14个体显示RE％<20。
该方法将在GLP下得到充分验证，以支持关键毒性研究中的传统知识评价。
食蟹猴中的单剂量PK
在Citoxlab研究中，总共招募了九只雄性食蟹猴。根据下表将动物分为三组，分别为接受剂量水平为8mg/kg(三只雄性)、25mg/kg(三只雄性)和75mg/kg(三只雄性)的scFv-IgAB_02。通过2小时以5mL/kg/h的输注速率进行给药。
Figure BDA0002675941450000341
在研究期间，每天两次检查每只动物的死亡率和发病率。每天至少观察两次，以记录临床体征。特别注意在给药部位的任何局部反应。
在治疗前两次记录体重，然后在第-1天记录体重，并且每周至少记录一次，直到研究结束。
在给药当天(第1天)、给药前、注射结束后立即、停止注射后5分钟、0.5小时、1小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、第5天(96h)、第8天(168h)、第11天(240h)、第15天(336h)和第22天(504h)采集血。每只动物在处理前和与PK样本一致的第8、15、22天进行免疫原性取样。
生物分析和免疫原性分析在Chimera Biotec进行。撰写本文时，免疫原性结果仍未定。药代动力学分析是在法国Citoxlab使用
Figure BDA0002675941450000351
软件v6.4上的非分区分析进行的。根据分析样品中的测量浓度确定以下参数：Cmax、Tmax、AUC0-最后和AUC0-inf、t1/2、VZ、CL、MRT和AUMC。
在观察期结束时，在第27天通过肌内注射盐酸氯胺酮使所有动物镇静，通过静脉注射戊巴比妥钠麻醉并通过放血安乐死。
关于PK结果，在给药前样品中未发现可定量的scFv-IgAB_02。
根据获得的数据，可以得出以下结论(请参见表14)：
·所有动物都达到了对测试项目的全身暴露，
·如预期，在scFv-IgAB_02注射结束时达到了Tmax，
·最终的半衰期为33.4到154小时，
·根据剂量归一化的AUC0-t值，给药剂量水平范围内注意到血清试验项目暴露的超过剂量比例的增加，而考虑剂量归一化的Cmax时，观察到大约剂量比例的增加。
·随着剂量水平的增加，最终半衰期值略有增加，从而证实了观察到在scFv-IgAB_02的全身性CL中的剂量相关变化。
·分布的最终体积VZ近似于猴的总血浆体积，表明scFv-IgAB_02主要位于血浆体积中，
·随着剂量的增加，观察到最终分布值的减少，表明组织分布的可能饱和机制/测试物的内在化。
表14：Citoxlab研究中个体动物的药代动力学参数
Figure BDA0002675941450000352
实施例13：
scFv-IgAB_02在EGFR+荷瘤小鼠中的组织分布
scFv-IgAB_02的组织分布评价是通过将125I-scFv-IgAB_02静脉内施用到具有A431细胞的小鼠异种移植模型中进行的。
使用碘原作为氧化剂通过放射性碘化对scFv-IgAB_02进行了放射性标记，最终比活为2mCi/mg。通过大小排阻色谱法和SDS-PAGE证实了标记分子的完整性。
通过对huCD16A进行RIA分析并对A-431细胞进行饱和结合分析来确定各自的KD值(KD分别为：0.729nM和6.982；数据未在此处显示)，确认了生物活性。在7天的时间内确认了小鼠血浆中的稳定性。
将38只小鼠在其右侧皮下植入5×106A431细胞。在注射125I-scFv-IgAB_02时，平均肿瘤体积约为289±83mm3；并且对应于接种后2周的生长期。
在8个终端时间点(30分钟、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时和336小时)评价组织分布(包括靶向肿瘤)。此外，将三只动物饲养在代谢笼中长达168小时，以收集尿液和粪便，从而确定排泄途径和质量平衡。同时，在给药后48小时和336小时进行了定量全身放射自显影研究。
在8至48小时之间观察到肿瘤中最高的放射性浓度，并且在给药后24小时发生最大的125I-scFv-IgAB_02肿瘤吸收，达到8.56％ID/g。在随后的时间点，肿瘤中的放射性逐渐降低，在96小时时仍占5.62％ID/g。在336小时(1.21％ID/g)时未从肿瘤中完全清除放射性，表明scFv-IgAB_02保留在肿瘤组织中(图31)。
对于大多数器官(胃和子宫颈除外)，在30分钟至24-48小时内肿瘤与器官的比率增加，这表明在肿瘤中积累的放射性比在器官中检测到的放射性被清除地更慢，这再次表明scFv-IgAB_02的保留在肿瘤组织中(图32)。
对于几乎所有正常组织(皮肤、子宫颈、肌肉和消化道除外，在8小时和24小时观察到最大浓度)，注射125I-scFv-IgAB_02后的最初30分钟内都观察到最大放射性吸收。然后，这些组织中的放射性水平随时间下降，但是没有明显的滞留，这与池中血液活性的降低相一致。
在整个观察期内，在参与蛋白质代谢和清除系统循环的器官例如肝脏、脾脏和肾脏的％ID/g分别为7.25、8.37和14.75)和参与选择性摄取游离碘的器官(例如胃)(8小时处为4.14％ID/g)中，发现正常器官的最高放射性浓度。此外，在30分钟时发现肺中的放射性水平较高，为10.02％ID/g；可能是由于给药溶液中存在聚集体(根据SE-HPLC分析约为3％)，在卵巢和子宫颈中在30分钟和24小时时分别为11.22％ID/g和6.54％ID/g。
静脉内施用125I-scFv-IgAB_02后，在168小时排泄物中恢复了大约一半的注射活性，尿和粪便的累积排泄分别为43.27％和7.40％。通过肾脏清除的放射性不可能与scFv-IgAB_02相关，但应对应于脱卤过程中释放的游离碘125。
为了放射自显影，在给药后48和336小时处死小鼠。与根据组织解剖技术获得的结果相比，全身放射自显影的结果显示出预期的生物分布模式。确实，放射性主要在给药后48小时发现于参与代谢和排泄机制的肿瘤、肺和器官中，例如肝脏、肾脏和脾脏。在336小时的照片显示，所有器官/组织中的放射性几乎完全降低，而大多数剩余活性都在肿瘤中发现(图33)。
实施例14：
毒理学
支持在晚期肿瘤患者中进行FIM研究的双特异性EGFR/CD16抗原结合蛋白的毒理学研究是在食蟹猴中作为相关物种进行的。没有进行其他物种的毒理学研究。
迄今为止，已进行了scFv-IgAB_02的毒理学方案
·在食蟹猴中进行为期28天的静脉内重复剂量范围发现研究(非GLP)
·对食蟹猴进行为期28天的关键性静脉内重复剂量毒性研究(GLP)
由于结构相似和部分相似的作用机理，可以预期scFv-IgAB_02与西妥昔单抗具有相似的毒性。然而，重要的是要提到，由于scFv-IgAB_02抑制EGFR磷酸化的潜力降低，因此可以期待改善的副作用(无皮肤毒性或降低的皮肤毒性)。然而，剂量水平是根据一项为期39周的研究调整的，该研究是通过在食蟹猴中静脉注射西妥昔单抗进行的(研究070-087，EMEA2004；关于批准爱必妥的科学讨论)。
在静脉内重复剂量范围发现研究中，scFv-IgAB_02没有引起全身或局部毒性。scFv-IgAB_02在75mg/kg(q7d×5)的最大试验剂量水平下，对临床观察、体重、体温、临床或解剖病理没有影响。唯一的影响是在所有剂量水平的首次给药后(6小时内)循环IL-6水平的短暂升高。首次给药后24小时内IL-6水平恢复正常。在首次给药后，scFv-IgAB_02对IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平无影响。此外，在以≥24mg/kg剂量首次给药后7天时，scFv-IgAB_02可引起外周血绝对NK细胞计数(CD3-CD20-CD159+阳性)和CD69+活化NK细胞的短暂减少。
在对scFv-IgAB_02进行的为期28天的关键静脉毒性研究中，测试项目耐受性最高达到75mg/kg的最大剂量水平(q7d×5)。到目前为止，唯一证实的试验项目相关发现是在剂量为75mg/kg时第1天两只动物出现呕吐，以及在第1天给药后4小时白细胞特别是中性粒细胞的增加。中性粒细胞数量的短暂增加可能是由血清IL-6水平的短暂升高引起的(这至少由文献数据表明)。在撰写本文时，一些关键研究的终点仍在等待中。
食蟹猴的重复剂量静脉内剂量范围发现研究
该研究的目的是确定在每周一次向食蟹猴猴反复静脉注射(2h椅输注)4周(共5次输液)和5周恢复阶段后，确定测试项目的最大耐受剂量。将10只毛里求斯食蟹猴(5只雄性和5只雌性)分配到如下剂量组。
Figure BDA0002675941450000371
F＝雄性；M＝雄性
由于结构和功能的相似性，因此强烈根据西妥昔单抗毒性评价(EMA 2004科学讨论：WC5000291131)选择剂量水平和给药方案。
毒性评价基于临床观察、体重、体温以及临床和解剖病理学。
通过Multiplex技术确定IL-2、IL-6、IL-8，TNF-α和INF-γ的细胞因子水平，并采用流式细胞术评价每个剂量水平的淋巴细胞亚群(CD45、CD3、CD4、CD8、CD20、CD16、CD159a)。
对所有动物进行完整的尸体解剖，并记录所有组织的肉眼可见的异常。进行器官重量测量和显微镜检查。
收集血液用于scFv-IgAB_02和抗药物抗体的毒代动力学评价。毒代动力学样品的生物分析和抗药物抗体分析仍在进行中。
scFv-IgAB_02对临床观察结果、体重、体温或临床或解剖病理无影响。
scFv-IgAB_02的药理作用是通过在首次给药后2-4小时内所有剂量水平下的循环IL-6水平瞬时升高来指示的，IL-6水平在4小时后迅速下降，在24小时后恢复到基线(参见图34)。
鉴于NK细胞动态平衡的特点和本研究群体规模较小，尚不能明确评价ScFv-IgAB_02对NK细胞计数和活化状态的相关影响。几乎所有数据都在用药前数据集的可变性范围内。在≥24mg/kg剂量下，绝对NK细胞数(CD3-CD20-CD159+)和CD69+活化的NK细胞数在第8天出现短暂降低的趋势，这被认为与scFv-IgAB_02有关，因为对照组没有受到影响。
总之，scFv-IgAB_02不会引起全身或局部毒性。当在输液椅中经每周一次2小时静脉输液食蟹猴28天时，scFv-IgAB_02在最高剂量(75mg/kg)耐受性良好。
对食蟹猴关键的28天静脉毒性研究
在食蟹猴中进行了为期4周的关键性GLP兼容重复剂量毒性研究(CRO：科文斯(Covance))。在撰写本文时，研究的生命阶段已经完成，可获得初步或部分结果。但是，这项研究的某些最终分析(例如组织病理学、毒物动力学)仍在进行中。
该研究的目的是确定在对食蟹猴猴反复静脉输液(每周2次，每次2小时)共28天(共5次输液)后，scFv-IgAB_02的毒性，并评价观察到的作用的可逆性(如果有)在28天的恢复阶段。选择静脉内给药途径是因为它是预期的人类治疗途径。
scFv-IgAB_02的给药剂量水平为0、8、24和75mg/kg。根据下表，该研究包括四个最终杀灭组，包括载体、中剂量和高剂量恢复动物。
组号/性别 1/M 2/M 3/M 4/M 1/F 2/F 3/F 4/F
剂量水平(mg/kg/每周) 0 8 24 75 0 8 24 75
组数目 5 5 5 5 5 5 5 5
恢复 2 - 2 2 2 - 2 2
在给药期间，观察猴的临床体征、体温、体重、血液学和血液化学、尿液分析以及ECG、血压和检眼镜检查。此外，通过Multiplex技术确定IL-2、IL-6、IL-8，TNF-α和INF-γ的细胞因子水平，并采用流式细胞术评价每个剂量水平的淋巴细胞亚群(CD45、CD3、CD4、CD8、CD20、CD16、CD159a)。
由于皮肤是西妥昔单抗的主要目标，因此特别关注皮肤毒性(尤其是延迟毒性)。西妥昔单抗最显著的皮肤发现是浅表化脓性皮肤病变。
研究终止后，收集了整个EMA组织列表，并进行了组织病理学检查，并特别关注了由糜烂性和溃疡性皮炎引起的继发性合并感染，并累及内脏。
该研究包括综合的传统知识评价和ADA评价。
没有发生临终前的死亡，也没有必要进行与该测试项目相关的兽医治疗。
在研究过程中，第1至第4组中的单只动物发生了一些皮肤改变，没有明显的剂量依赖性。这些发现被认为是偶然的，与测试项目的剂量无关。
关于临床观察，在第一次给药期间，有两只高剂量雄性动物(动物P0301和P0305)呕吐(呕吐液体和/或粘液)。由于仅在高剂量时才能看到，因此该发现被认为与测试项目有关。
进一步的临床观察结果如肿胀和软粪便被认为是偶然的，因为它们不常见，缺乏剂量反应或与该实验室动物物种中通常观察到的观察结果相当。
用scFv-IgAB_02高达75mg/kg的治疗对体重发育没有影响。在给药和恢复阶段，体重发展与对照组相当。
用scFv-IgAB_02高达75mg/kg的治疗对体温没有影响。实验组与对照组之间的平均体温存在显著差异，但被认为是偶然的，因为它们缺乏剂量反应。
未见与测试项目有关的眼科检查结果。在治疗和对照动物中偶发地发现诸如出血、亮区、致密、玻璃疣、上乳头膜、皮损、混浊、色素沉着或瘢痕等表现，和/或也出现在给药前阶段，并且与食蟹猴猴通常观察到的观察结果相当。
用scFv-IgAB_02高达75mg/kg的治疗对血压和呼吸频率无影响。
关于血液学
·从给药阶段的第8天开始，所有组的网织红细胞计数均增加。这被认为是频繁采血的生理补偿作用。
·在给药期第1天，给药后4小时，第2-4组动物的WBC计数和中性粒细胞计数明显增加。这种差异并不依赖于剂量。
在中等剂量组(24mg/kg)的两只动物中，给药后24小时完全可逆。对于其他动物和组，在24小时内未收集任何样品。在第8天，所有其他组均显示出恢复。但是，预计所有组都将在24小时内完全恢复。
用scFv-IgAB_02高达75mg/kg的治疗对临床化学、凝血和尿液参数没有影响。
目前，组织病理学、TK和ADA评价以及ECG分析、免疫表型分析、细胞因子分析等其他一些指标仍在研究中。所有初步的肉眼可见的观察都与该物种中常见的自然背景变化一致。但是，尚待研究病理学家最终评估。器官重量也是如此。
综上所述，到目前为止确认的与测试项目相关的发现如下：
·以75mg/kg的剂量第1天使两只动物呕吐
·第1天给药后4小时，白细胞增加，尤其是ANEU
序列表
Figure BDA0002675941450000391
Figure BDA0002675941450000401
Figure BDA0002675941450000411
Figure BDA0002675941450000421
Figure BDA0002675941450000431
SEQUENCE LISTING
<110> 阿菲姆德股份有限公司(Affimed GmbH)
<120> 双特异性EGFR/CD16抗原结合蛋白
<130> GP202000194CN
<150> EP18161871.1
<151> 2018-03-14
<160> 45
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vh结构域
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vl结构域
<400> 2
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 3
Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
1 5
<210> 4
<211> 192
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 4
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 6
Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 7
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 8
Asn Ile Gly Ser Lys Asn
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 9
Gln Asp Asn Lys Arg
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 10
Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 11
Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr
1 5
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vh
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vl
<400> 13
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vh
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 沉默的Fc
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 16
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 18
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 沉默的Fc
<400> 20
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 21
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 22
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 23
Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 24
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 25
Tyr Asp Ser Asp
1
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cdr
<400> 26
Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His Val Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 串联双抗体
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn
145 150 155 160
Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile
165 170 175
Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala
195 200 205
Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val
210 215 220
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
245 250 255
Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
260 265 270
Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
275 280 285
Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys
290 295 300
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
305 310 315 320
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
325 330 335
Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
370 375 380
Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys
385 390 395 400
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
405 410 415
Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
420 425 430
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
435 440 445
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser
450 455 460
Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala
465 470 475 480
Ala Gly Ser His His His His His His
485
<210> 28
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
450 455 460
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr
465 470 475 480
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
485 490 495
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
500 505 510
Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
515 520 525
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
530 535 540
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro
545 550 555 560
Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Ser Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
595 600 605
Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile
610 615 620
Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
625 630 635 640
Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
645 650 655
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
660 665 670
Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp
675 680 685
Thr Ser Ser Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
690 695 700
Leu
705
<210> 29
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 29
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser
210
<210> 30
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bi-scFv-Fc
<400> 30
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
130 135 140
Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
180 185 190
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
485 490 495
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
500 505 510
Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
515 520 525
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser
530 535 540
Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
545 550 555 560
Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
565 570 575
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile
580 585 590
Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
595 600 605
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
610 615 620
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
625 630 635 640
Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys
645 650 655
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
660 665 670
Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
675 680 685
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
690 695 700
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser
705 710 715 720
Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
725 730
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vh
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> vl
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
taatacgact cactataggg 20
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 35
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 37
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1
<400> 38
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3
<400> 39
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1
<400> 40
Asn Ile Gly Ser Lys Asn
1 5
<210> 41
<400> 41
000
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 42
Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
1 5
<210> 43
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
450 455 460
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr
465 470 475 480
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
485 490 495
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
500 505 510
Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
515 520 525
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
530 535 540
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro
545 550 555 560
Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Ser Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
595 600 605
Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile
610 615 620
Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
625 630 635 640
Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
645 650 655
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
660 665 670
Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp
675 680 685
Thr Ser Ser Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
690 695 700
Leu
705
<210> 44
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 44
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser
210
<210> 45
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 45
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
130 135 140
Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
180 185 190
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
485 490 495
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
500 505 510
Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
515 520 525
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser
530 535 540
Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
545 550 555 560
Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
565 570 575
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile
580 585 590
Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
595 600 605
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
610 615 620
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
625 630 635 640
Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys
645 650 655
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
660 665 670
Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
675 680 685
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
690 695 700
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser
705 710 715 720
Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
725 730

Claims (16)

1.一种多特异性抗原结合蛋白，包含EGFR和CD16A的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点与包含重链恒定结构域CH2和CH3的多肽融合，并且其中所述EGFR的抗原结合位点包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中：
(i)VH包含具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的重链CDR3；VL包含具有SEQ IDNO：24所示氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(ii)VH具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且VL具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD16A的抗原结合位点包含
(i)可变重链结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：6或11所示氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链CDR3；和可变轻链结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链CDR3；或者
(ii)包含SEQ ID NO：12或14所示氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的VL。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含至少两个EGFR的抗原结合位点和至少两个CD16A的抗原结合位点。
4.根据权利要求3所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白由两条多肽链组成，每条多肽链包含第一单链Fv单元(scFv1)和第二单链Fv单元(scFv2)，所述第一单链Fv单元包含通过肽接头连接至第一抗原结合位点的VH的VL，所述第一单链Fv单元(scFv1)通过铰链区N端融合至CH2-CH3多肽的CH2结构域；所述第二单链Fv单元(scFv2)包含通过肽接头连接至第二抗原结合位点的VH的VL，所述第二单链Fv单元(scFv2)通过肽接头C端融合至CH2-CH3多肽的CH3结构域。
5.根据权利要求4所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述scFv1是CD16A的抗原结合位点，所述scFv2是EGFR的抗原结合位点。
6.根据权利要求3所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗体包含F(ab′)2段和Fc段，其中：
(i)F(ab′)2段包含两个CD16A的Fv抗原结合位点，两个包含EGFR的抗原结合位点的单链Fv(scFv)与Fc段融合，其中每个scFv的C端融合至Fc段的CH3结构域；或者
(ii)F(ab′)2段包含两个EGFR的Fv抗原结合位点，两个包含CD16A的抗原结合位点的单链Fv(scFv)与Fc段融合，其中每个scFv的C端融合至Fc段的CH3结构域。
7.根据权利要求6所述的多特异性抗原结合蛋白，所述多特异性抗原结合蛋白包含重链和轻链，其中
(i)所述重链的结构为VH(CD16A)-CH1-CH2-CH3-VH(EGFR)-VL(EGFR)，所述轻链的结构为VL(CD16A)-CL；或者
(ii)所述重链的结构为VH(EGFR)-CH1-CH2-CH3-VL(CD16A)-VH(CD16A)，所述轻链的结构为VL(EGFR)-CL。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白不结合Fc-γ受体，但是结合新生的Fc-受体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述蛋白包含具有SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的轻链；具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的轻链；或具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的轻链。
10.根据权利要求1或9中任一项的多特异性抗原结合蛋白，所述多特异性抗原结合蛋白还包含
(i)血清白蛋白的抗原结合位点，或者
(ii)与抗原结合蛋白融合的血清白蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白用作治疗化合物。
12.如权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白用于治疗以EGFR阳性或EGFRvIII阳性细胞为特征的癌症。
13.根据权利要求12所述用于治疗以EGFR阳性或EGFRvIII阳性细胞为特征的癌症的多特异性抗原结合蛋白，其中所述癌症选自结直肠癌、头颈癌、肺癌和成胶质细胞瘤。
14.一种用于治疗或改善增生性疾病或肿瘤性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求1至10中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述增生性疾病或肿瘤性疾病以EGFR阳性或EGFRvIII阳性细胞为特征。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述增生性疾病或肿瘤性疾病选自结直肠癌、头颈癌、肺癌和胶质母细胞瘤。
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