TWI706960B - 能夠結合cd19和cd3的雙特異性雙抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
CD19x CD3雙特異性雙抗體,尤其是CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體能夠同時結合CD19和CD3,並且用於治療血液學惡性腫瘤。
Description
本發明涉及雙特異性單價雙抗體,其包括兩條多肽鏈並且其具有對CD19的表位特異的一個結合位點和對CD3的表位特異的一個結合位點(即,“CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。最優選地,這樣的CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體由三條多肽鏈組成,並且具有對CD19的表位特異的一個結合位點和對CD3的表位特異的一個結合位點並且另外包括免疫球蛋白Fc結構域(即,“CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。在一些實施例中,雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合CD19和CD3。本發明更涉及包含這樣的雙特異性單價雙抗體或這樣的雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及這樣的雙抗體在治療疾病,尤其是血液學惡性腫瘤中使用的方法。
A. CD19
CD19(B淋巴細胞表面抗原B4,Genbank登錄號M28170)是免疫球蛋白超家族的95kDa I型跨膜糖蛋白(Stamenkovic,I.等(1988)“CD19,The Earliest Differentiation Antigen Of The B Cell Lineage,Bears Three Extracellular Immunoglobulin-Like Domains And An Epstein-Barr Virus-Related Cytoplasmic Tail,”J.Exper.Med.168(3):1205-1210;Tedder,T.F.等(1989)“Isolation Of cDNAs Encoding The CD19 Antigen Of Human And Mouse B Lymphocytes.A New Member Of The Immunoglobulin Superfamily,”J.Immunol.143(2):712-717;Zhou,L.J.等(1991)“Structure And Domain Organization Of The CD19 Antigen Of Human,Mouse,And Guinea Pig B Lymphocytes.Conservation Of The Extensive Cytoplasmic Domain,”J.Immunol.147(4):1424-1432)。當CD19表達下調時,在重鏈重排至漿細胞階段時,CD19在濾泡樹突細胞上和來自早期前B細胞的所有B細胞上表達。在祖B細胞(pro-B cell)階段之前,CD19不在造血幹細胞或B細胞上表達(Sato等(1995)“CD19 Signal Transduction Molecule Is A Response Regulator Of B-Lymphocyte Differentiation,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92:11558-62;Loken等(1987)“Flow Cytometric Analysis of Human Bone Marrow.II.Normal B Lymphocyte Development,”Blood,70:1316-1324;Wang等(2012)“CD19:A Biomarker For B Cell Development,Lymphoma Diagnosis And Therapy,”Exp.Hematol.and Oncol.1:36)。
CD19是B細胞-受體(BCR)複合物的組分,並且是B細胞信號傳導的正調節物,其調節B細胞啟動和體液免疫的閾值。CD19通過兩個細胞外C2型Ig樣結構域與CD21(CR2、C3d片段受體)和CD81相互作用,與CD225一起形成BCR複合物。CD19的細胞內結構域涉及細胞內信號傳導級聯放大,主要是但不是僅僅調節BCR和CD22下游的信號(Mei等(2012)“Rationale of Anti-CD19 Immunotherapy:An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity,”Arthritis Res and Ther.14(Suppl.5):S1;Wang等(2012)“CD19:A Biomarker For B Cell Development,Lymphoma Diagnosis And Therapy,”Exp.Hematol.and Oncol.1:36);Del Nagro等(2005)“CD19 Function in Central and Peripheral B-Cell Development,”Immunologic Res.31:119-131)。
CD19的若干特性提示其作為免疫療法的靶標的可能的潛力。CD19是B細胞系中最廣泛表達的抗原之一,並且在>95%的B細胞惡性腫瘤,包括急性成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(Wilson,K.等(2010)“Flow Minimal Residual Disease Monitoring Of Candidate Leukemic Stem Cells Defined By The Immunophenotype,CD34+CD38lowCD19+ In B-Lineage Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia,”Haematologica 95(4):679-683;Maloney,D.G.等(1997)“IDEC-C2B8 (Rituximab)Anti-CD20 Monoclonal Antibody Therapy In Patients With Relapsed Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma,”Blood 90(6):2188-2195;Vose,J.M.(1998)“Current Approaches To The Management Of Non-Hodgkin's Lymphoma,”Semin.Oncol.25(4):483-491;Nagorsen,D.等(2012)“Blinatumomab:A Historical Perspective,”Pharmacol.Ther.136(3):334-342;Topp,M.S.等(2011)“Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival,”J.Clin Oncol.2011 Jun 20;29(18):2493-2498;Nadler,等(1983)“B4,A Human B Lymphocyte-Associated Antigen Expressed On Normal,Mitogen-Activated,And Malignant B Lymphocytes.”J.Immunol.;131:244-250;Ginaldi等(1998)“Levels Of Expression Of CD19 And CD20 In Chronic B Cell Leukaemias,”J.Clin.Pathol.51:364-369;Anderson等(1984)“Expression of Human B Cell-Associated Antigens on Leukemias and Lymphomas:A Model of Human B Cell Differentiation,”Blood 63:1424-1433)。CD19在少數其他細胞類型上表達,如果存在的話,並且也不在最終分化的漿細胞上表達,其因此通過CD19導向的治療可以是節省的。CD19不流入迴圈,並且可快速內化(Ma等(2002)“Radioimmunotherapy For Model B Cell Malignancies Using 90Y-Labeled Anti-CD19 And Anti-CD20 Monoclonal Antibodies,”Leukemia 16:60-66;Raufi等(2013)“Targeting CD19 in B-cell lymphoma:emerging role of SAR3419,”Cancer Management Res 3:225-233)。值得注意的是,CD19表達保持在B細胞淋巴瘤上,其對抗-CD20療法變得有抗性(Davis等(1999)“Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.”Clin Cancer Res,5:611-615,1999)。也已經建議CD19作為治療自身免疫疾病的靶標(Tedder(2009)“CD19:A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,”Nat.Rev.Rheumatol.5:572-577)。
B細胞惡性腫瘤代表各種各樣的具有廣泛不同特徵和臨床行為的疾病。歷史上,具有症狀疾病的大部分患者接受非交叉反應的遺傳毒性劑的組合,期望實現持久的緩解和在一些情況下治癒。儘管有效,但是許多傳統的方案也涉及大量的急性和長期毒性(見,例如,Stock,W.等(2013)“Dose Intensification Of Daunorubicin And Cytarabine During Treatment Of Adult Acute Lymphoblastic Leukemia:Results Of Cancer And Leukemia Group B Study 19802,”Cancer.2013 Jan 1;119(1):90-98)。抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗(rituximab)用於治療許多B細胞病症,其中其可與“護理標準(standard of care)”劑組合使用或作為單劑使用(Fowler等(2013)“Developing Novel Strategies to Target B-Cell Malignancies,”Targeted Pathways,B-Cell Lymphoma in ASCO Educational Book,366-372頁;Bargou,R.等(2008)“Tumor Regression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-Engaging Antibody,”Science 321(5891):974-977;Thomas,D.A.等(2010)“Chemoimmunotherapy With A Modified Hyper-CVAD And Rituximab Regimen Improves Outcome In De Novo Philadelphia Chromosome-Negative Precursor B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia,”J.Clin.Oncol.28(24):3880-3889)。儘管令人鼓舞的臨床結果,但是用單劑利妥昔單抗再治療患無痛淋巴瘤的患者與僅僅40%的應答率相關,表明作為對延長暴露於利妥昔單抗的回應,在惡性B細胞中可能出現了抗性(Smith(2003)“Rituximab(Monoclonal Anti-CD20 Antibody):Mechanisms Of Action And Resistance.”Oncogene.22:7359-68;Davis等(1999)“Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression,”Clin Cancer Res,5:611-615,1999;Gabrilovich,D.等(2003)“Tumor Escape From Immune Response:Mechanisms And Targets Of Activity,”Curr.Drug Targets 4(7):525-536)。已經報導了體內產生的利妥昔單抗抗性細胞系展示針對多種化療劑的交叉抗性(Czuczman等(2008)“Acquirement Of Rituximab Resistance In Lymphoma Cell Lines Is Associated With Both Global CD20 Gene And Protein Down-Regulation Regulated At The Pretranscriptional And Post-transcriptional Levels,”Clin Cancer Res.14:1561-1570;Olejniczak等(2008)“Acquired Resistance To Rituximab Is Associated With Chemotherapy Resistance Resulting From Decreased Bax And Bak Expression,”Clin Cancer Res.14:1550-1560)。
由治療性抗體靶向的其他B細胞淋巴瘤表面抗原包括CD19(Hoelzer(2013)“Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblasitic Leukemia,Curr.Opin.Oncol.25:701-706;Hammer(2012)“CD19 As An Attractive Target For Antibody-Based Therapy,”mAbs 4:571-577)。但是,儘管針對各種抗CD19抗體,具有抗CD19結合部分的雙特異性抗體或抗體藥物綴合物(ADCs)報導了與複合物內化和細胞內釋放游離藥物相關的有效的抗淋巴瘤活性,但是這些抗CD19抗體或ADC的抗腫瘤作用是不同的,表明抗體特異性性質,比如表位結合,誘導CD19寡聚的能力或細胞內信號傳導的差異影響它們的效力(Du等(2008)“Differential Cellular Internalization Of Anti-CD19 And -CD22 Immunotoxins Results In Different Cytotoxic Activity,”Cancer Res.68:6300-6305;Press等.(1994)“Retention Of B-Cell-Specific Monoclonal Antibodies By Human Lymphoma Cells.Blood,”83:1390-1397;Szatrowski等(2003)“Lineage Specific Treatment Of Adult Patients With Acute Lymphoblastic Leukemia In First Remission With Anti-B4-Blocked Ricin Or High-Dose Cytarabine:Cancer And Leukemia Group B Study 9311,”Cancer 97:1471-1480;Frankel等(2013)“Targeting T Cells To Tumor Cells Using Bispecific Antibodies,”Curr.Opin.Chem.Biol.17:385-392)。
因此,儘管改善了許多人的生存,但遭受B細胞惡性腫瘤的大部分患者在標準化學免疫療法之後繼續復發並且在美國每年仍超過15,000名患者死于B細胞癌。因此,需要用新的非交叉抗性化合物進行治療,以進一步改善患者生存。
B. CD3
CD3是T細胞共受體,其由四條不同的鏈組成(Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T-Cell Receptor:Insights Into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation Of Signaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(4):a005140;pages 1-14;Chetty,R.等(1994)“CD3:Structure,Function,And Role Of Immunostaining In Clinical Practice,”J.Pathol.173(4):303-307;Guy,C.S.等(2009)“Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,”Immunol.Rev.232(1):7-21)。
在哺乳動物中,複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與稱為T細胞受體(TCR)的分子結合,以在T淋巴細胞中產生啟動信號(Smith-Garvin,J.E.等(2009)“T Cell Activation,”Annu.Rev.Immunol.27:591-619)。在沒有CD3的情況下,TCR不能適當地組裝,因此被降解(Thomas,S.等(2010)“Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,”Immunology 129(2):170-177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜,並
且實際上不結合其他細胞類型的膜(見,Janeway,C.A.等(2005)在以下中:Immunobiology:The Immune System In Health And Disease,”第6版Garland Science Publishing,NY,214-216頁;Sun,Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,”Cell 105(7):913-923;Kuhns,M.S.等(2006)“Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,”Immunity.2006 Feb;24(2):133-139)。
T細胞上T細胞受體(TCR)複合物的不變的CD3ε信號傳導組分已經用作靶標,以促使在T細胞和腫瘤細胞之間形成免疫突觸。CD3和腫瘤抗原的共銜接啟動了T細胞,引發表達腫瘤抗原的腫瘤細胞裂解(Baeuerle等(2011)“Bispecific T Cell Engager For Cancer Therapy,”在以下中:Bispecific Antibodies,Kontermann,R.E.(Ed.)Springer-Verlag;2011:273-287)。此方法允許雙特異性抗體整體上與T細胞室(compartment)以對腫瘤細胞的高特異性相互作用,並且廣泛適用于大量的細胞表面腫瘤抗原。
C.抗體和其他結合分子
抗體是免疫球蛋白分子,其通過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點能夠特異性結合靶標,比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所使用,此術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體,而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括具有具有必要特異性的抗原識別位元點的抗體部分的融合蛋白、人源化的抗體和嵌合抗體以及包括具有必要特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。
完整的、未修飾的抗體(例如,IgG)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上可變結構域(即,分別為VL和VH結構域)的存在。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用,尤其地,其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點之一。相比之下,scFv構建體包括包含在單多肽鏈中的抗體的VL和VH結構域,其中結構域由足夠長的靈活連接體分開,以允許兩個結構域自組裝成功能表位結合位點。在VL和VH結構域的自組裝由於不夠長(小於約12個氨基酸殘基)的連接體而不可能時,兩個scFv構建體彼此相互作用,以形成二價分子,其中一條鏈的VL與另一條鏈的VH結合(在以下文獻中綜述:Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658中)。
除了它們在診斷中的已知作用,已經顯示抗體可用作治療劑。最近幾十年已經看到了在抗體治療潛能中的興趣的復興,並且抗體已經成為一種主要類型的生物技術衍生的藥物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In The Treatment of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。大約200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。
天然抗體能夠結合僅僅一個表位種類(即,單特異性),儘管它們可結合此種類的多個拷貝(即,展示二價或多價)。已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見,例如,PCT公佈號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968),其大部分使用連接體肽,以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至另外的結合蛋白質(例如scFv),或者,融合例如兩個Fab片段或scFv。典型地,這樣的方法涉及折中和權衡。例如,PCT公佈號WO 2013/174873、
WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了連接體的使用可在治療情形中引起問題並教導三特異性抗體,其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被交換並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236;WO 2010/108127),以允許他們結合一個以上抗原。因此,這些文獻中公開的分子權衡了結合特異性與結合另外的抗原種類的能力。PCT公佈號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域以含有融合蛋白加合物,其包括結合結構域。此文獻指出,CH2結構域在介導效應子功能中可能僅發揮最小的作用。PCT公佈號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體,其Fc區已經被取代以另外的VL和VH結構域,以便形成三價結合分子。PCT公佈號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體,其單獨的鏈含有scFv結構域。PCT公佈號WO 2013/006544公開了多價Fab分子,其作為單多肽鏈被合成,然後經歷蛋白酶解,以產生異源二聚結構。因此,這些文獻中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外的抗原種類的能力。PCT公佈號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能集團至抗體或抗體部分(例如,添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。因此,這些文獻中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
現有技術已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即,除了雙價或多價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不
同于這樣的天然抗體的雙抗體的能力(見,例如,Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448;US 2004/0058400(Hollinger等);US 2004/0220388(Mertens等);Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94;Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672;WO 02/02781(Mertens等);Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Protein Eng Des Sel.17(1):21-27;Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033;Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683,J.Biochem.76(8):992;Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588;Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
雙抗體的設計是基於單鏈可變區片段(scFv)。通過使用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變區製備這樣的分子。Bird等(1988)
(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了連接肽的例子,其在一個可變區的羧基末端和另一可變區的氨基末端之間橋接約3.5nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。連接體可進而針對另外的功能被修飾,比如附接藥物或連接至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。對於合成產生scFv,可使用自動合成儀。對於重組產生scFv,可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適的質粒引入適當的宿主細胞--真核細胞諸如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞或原核細胞諸如大腸埃希氏菌中。編碼感興趣的scFv的多核苷酸可通過常規操作諸如多核苷酸的連接而製備。產生的scFv可利用本領域中已知的標準蛋白純化技術分離。
美國專利號7,585,952和美國專利公開號2010-0173978涉及對ErbB2免疫特異性的scFv分子。已經描述了雙特異性T細胞銜接體(engager)(“BiTEs”),一種類型的scFv分子(WO 05/061547;Baeuerle,P等(2008)“BiTE:A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells,”Drugs of the Future 33:137-147;Bargou,等2008)“Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody,”Science 321:974-977)。這樣的分子由具有兩個抗原結合結構域的單多肽鏈分子組成,其中一個抗原結合結構域免疫特異性結合CD3表位元和其中第二個抗原結合結構域免疫特異性結合靶細胞的表面上存在的抗原。
已經描述了靶向CD19和CD3二者的雙特異性分子。蘭妥莫單抗(Blinatumomab),一種雙特異性scFv-CD19 x CD3 BiTE處在臨床試驗中並且被報導對於CD3具有的親和力為~100nM,和對於CD19
的親和力為~1nM。對於靶細胞體外裂解,蘭妥莫單抗展示的EC50為~10-100pg/ml(Frankel等(2013)“Targeting T Cells To Tumor Cells Using Bispecific Antibodies,”Curr.Opin.Chem.Biol.17:385-392)。也已經開發了雙特異性CD19 x CD3雙親和性重定向(DART)(Moore等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551)。與雙特異性scFv-CD19 x CD3 BiTE比較,此分子展示類似的結合親和力,但是對於靶細胞體外裂解具有更低的EC50,為~0.5至5pg/ml,並且一直顯示更高水準的最大裂解。也已經描述了AFM11,一種CD19 x CD3雙特異性Tandab。AFM11被報導為對於靶細胞體外裂解具有的EC50為~0.5至5pg/ml(Zhukovsky等(2013)“A CD19/CD3 Bispecific Tandab,AFM11,Recruits T Cells To Potently and Safely Kill CD19+Tumor Cells,”J Clin Oncol 31,2013(補充;摘要3068))。所有這些構建體都不包括Fc結構域。
儘管這樣的成功,可通過細心考慮和將半胱氨酸殘基放置在採用的一條或多條多肽鏈中進一步優化穩定的、功能性異源二聚化、非單特異性雙抗體的產生。可以更高的產率並且以比非優化的雙抗體更大的活性產生這樣的優化的雙抗體。因此,本發明涉及提供尤其被設計和優化以形成異源二聚雙抗體的多肽的問題。本發明通過提供示例性、優化的CD19 x CD3雙抗體解決了此問題。
本發明涉及雙特異性單價雙抗體,其包括兩條多肽鏈並且其具有對CD19的表位特異的一個結合位點和對CD3的表位特異的一個
結合位點(即,“CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。在一些實施例中,這樣的CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體由三條多肽鏈組成,且具有對CD19的表位特異的一個結合位點和對CD3的表位特異的一個結合位點,並且另外包括免疫球蛋白Fc結構域(即,“CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。在一些實施例中,這樣的雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合CD19和CD3。本發明更涉及包含這樣的雙特異性單價雙抗體或這樣的雙特異性單價Fc雙抗體的藥學組合物。本發明另外涉及這樣的雙抗體在治療疾病,尤其是血液學惡性腫瘤中使用的方法。
因此,在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體和雙特異性單價Fc雙抗體包括至少兩條不同的多肽鏈。這樣的雙抗體的多肽鏈以異源二聚化方式彼此結合,以形成對CD19的表位有特異性的一個結合位點和對CD3的表位有特異性的一個結合位點。因此,在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Fc雙抗體是單價的,在於其僅僅能夠結合CD19的表位元的一個拷貝並且僅僅結合CD3的表位元的一個拷貝,但是是雙特異性的,在於單一雙抗體能夠同時結合CD19的表位和CD3的表位。雙抗體多肽鏈的每一條共價結合雙抗體的另一多肽鏈,例如通過位於這樣的多肽鏈中的半胱氨酸殘基的二硫鍵合,以便形成共價結合的複合物。在一些實施例中,此雙抗體更具有免疫球蛋白Fc結構域和/或白蛋白結合結構域,以延長體內的半衰期。
在一些實施例中,一種CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,其能夠特異性結合CD19和CD3,其中雙抗體包括第一、第二和第三多肽鏈,其中多肽鏈形成共價結合的複合物,和其中:I.第一多肽鏈
在N-末端至C-末端方向上包括:A.結構域IA、B.結構域IB和C.結構域IC,II.第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括:A.結構域IIA和B.結構域IIB,和III.第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括結構域IIIC。A.結構域IA包括(1)亞結構域(IA1)和(2)亞結構域(IA2),並且亞結構域IA1和IA2通過多肽連接體彼此分開。(1)亞結構域(IA1)包括能夠結合CD19(VLCD19)或CD3(VLCD3)的VL結構域。(2)亞結構域(IA2)包括能夠結合CD19(VHCD19)或CD3(VHCD3)的VH結構域。其中,亞結構域IA1和IA2通過多肽連接體彼此分開,並且是(a)VLCD19和VHCD3或(b)VLCD3和VHCD19。B.結構域IB包括帶電的促進異源二聚體的結構域,並且結構域IB通過多肽連接體與結構域1A分開。C.結構域IC包括抗體的CH2-CH3結構域。A.結構域IIA包括(1)亞結構域(IIA1)和(2)亞結構域(IIA2)。(1)亞結構域(IIA1)包括能夠結合CD19(VLCD19)或CD3(VLCD3)的VL結構域。(2)亞結構域(IIA2)包括能夠結合CD19(VHCD19)或CD3(VHCD3)的VH結構域。其中,亞結構域IIA1和IIA2通過多肽連接體彼此分開。當亞結構域IA1和IA2是VLCD3和VHCD19時,亞結構域IIA1和IIA2是:(a)VLCD19和VHCD3。當亞結構域IA1和IA2是VLCD19和VHCD3時,亞結構域IIA1和IIA2是:(b)VLCD3和VHCD19。B.結構域IIB包括帶電的促進異源二聚體的結構域。其中,結構域IIB通過多肽連接體與結構域IIA分開,並且結構域IB的帶電的促進異源二聚體的結構域和結構域IIB的帶電的促進異源二聚體的結構域具有相反的電荷。結構域IIIC包括抗體的CH2-CH3結構域。其中,VLCD19和VHCD19結構域形成CD19結合結構域,並且VLCD3和VHCD3結構域形成CD3結合結構域。第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域形成能夠結合Fc受體的Fc結構域,從而形成CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體。
在一些實施例中,(A)結構域IB和IIB每個包括半胱氨酸殘基,其經二硫鍵使第一多肽鏈與第二多肽鏈共價結合;並且(B)結構域IC和IIIC每個包括半胱氨酸殘基,其經二硫鍵使第一多肽鏈與第三多肽鏈共價結合。
在一些實施例中,VLCD19具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列和VHCD19具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些實施例中,VLCD3具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列和VHCD3具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些實施例中,結構域IC的CH2-CH3結構域具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列和結構域IIIC的CH2-CH3結構域具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些實施例中,(A)結構域IB的帶電的促進異源二聚體的結構域具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列和結構域IIB的帶電的促進異源二聚體的結構域具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列;或(B)結構域IB的帶電的促進異源二聚體的結構域具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列和結構域IIB的帶電的促進異源二聚體的結構域具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在一些實施例中,(A)第一多肽鏈具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列;(B)第二多肽鏈具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列;和(C)第三多肽鏈具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些實施例中,上述之CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠與人和靈長類CD19和CD3都進行交叉反應。
在一些實施例中,上述之CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能用作藥物。
在一些實施例中,上述之CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,能用於治療與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況,或用於治療特徵在於CD19的表達的疾病或病況的方法中,尤其是其中與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況是癌症的情況,更具體地,其中癌症選自:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML),包括急變期CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL),包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性(blastic)漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在一些實施例中,一種共價結合的多肽複合物,其中多肽複合物包括第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中,(A)第一多肽鏈包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,其連接至具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的促進異源二聚體的結構域;和(B)第二多肽鏈包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,其連接至具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的促進異源二聚體的結構域。其中,第一多肽鏈的促進異源二聚體的結構域和第二多肽鏈的促進異源二聚體的結構域經二硫鍵彼此共價結合。
在一些實施例中,一種包括任何上述CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體的藥學組合物。在一些實施例中,一種藥學組合物在治療與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達
的疾病或病況中的用途,尤其是其中與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況是癌症的情況。在一些實施例中,前述之癌症選自:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML),包括急變期CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL),包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠展示對可溶性人和食蟹猴(cynomolgus monkey)CD3類似的結合親和力和在結合CD19方面的10倍差異,如通過表面等離子共振(SPR)技術(BIAcore)所分析的,或如通過流式細胞術使用CD4+和CD8+設門的T細胞群體和CD20+設門的B細胞群體所分析的。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體使用人T細胞在採用3個靶B淋巴瘤細胞系:Raji/GF(伯基特淋巴瘤),HBL-2(套細胞淋巴瘤),或Jeko-1(套細胞淋巴瘤)中的任何一個的試驗中,並使用純化的人初級T細胞作為效應細胞,優選能夠介導重定向殺傷靶腫瘤細胞。在這樣的試驗中,使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗測量靶腫瘤細胞殺傷,其中定量測量細胞死亡時從細胞釋放的LDH的酶活性,或通過螢光素酶試驗測量靶腫瘤細胞殺傷,其中螢光素酶相對光單位(RLU)是指示Raji/GF靶細胞的相
對生活力的讀數,所述靶細胞已經被工程化以表達綠色螢光蛋白(GFP)和螢光素酶報告基因。觀察到的這樣的重定向殺傷的EC50是約5pM或更少、約3pM或更少、約1pM或更少、約0.5pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或更少、約0.1pM或更少、約0.05pM或更少、約0.04pM或更少、約0.03pM或更少、約0.02pM或更少或約0.01pM或更少。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體優選地能夠介導人和食蟹猴外周血單核細胞(PBMC)中的細胞毒性,以便以下效應細胞與T細胞比例引起兩種這樣的細胞系統中的劑量依賴性CD20+ B細胞消耗:2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。觀察到的人CD20+ B細胞消耗的EC50是約7pM或更少、約5pM或更少、約3pM或更少、約1pM或更少、約0.5pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或更少、約0.1pM或更少、約0.05pM或更少、約0.04pM或更少、約0.03pM或更少、約0.02pM或更少或約0.01pM或更少。觀察到的食蟹猴CD20+ B細胞消耗的EC50是約1000pM或更少、約900pM或更少、約800pM或更少、約500pM或更少、約300pM或更少、約100pM或更少、約50pM或更少、約20pM或更少、約10pM或更少、約5pM或更少、約2pM或更少或約1pM或更少,使得自體人B細胞消耗與食蟹猴B細胞消耗的比例是約500:1或更少、約300:1或更少、約100:1或更少、約50:1或更少、約20:1或更少或約10:1或更少。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠通過人和食蟹猴PBMC介導細胞因數(例如,IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10,尤其是IFN-γ和TNF-α)的釋放。這樣的釋放是約5000pg/mL或更少、約4000pg/mL
或更少、約3000pg/mL或更少、約2000pg/mL或更少、約1000pg/mL或更少、約500pg/mL或更少、約2000pg/mL或更少,或約100pg/mL或更少。從人PBMC的這樣的細胞因數釋放的平均EC50是約100pM或更少、約90pM或更少、約80pM或更少、約50pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少、約10pM或更少,或約5pM或更少。從食蟹猴PBMC的這樣的細胞因數釋放的平均EC50是約3000pM或更少、約2000pM或更少、約1000pM或更少、約500pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少、約100pM或更少,或約50pM或更少。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠介導對共混合(co-mix)異種移植物中人B細胞淋巴瘤腫瘤生長的抑制,在所述共混合異種移植物中,這樣的分子與比例為1:5的HBL-2(人套細胞淋巴瘤)或Raji(伯基特淋巴瘤)腫瘤細胞和啟動的人T細胞一起被引入到NOD/SCID小鼠中。在一些實施例中,當以下述濃度提供時,這樣的雙抗體能夠抑制腫瘤生長:大於100μg/ml的濃度、約100μg/kg的濃度、約80μg/kg的濃度、約50μg/kg的濃度、約20μg/kg的濃度、約10μg/kg的濃度、約5μg/kg的濃度、約2μg/kg的濃度、約1μg/kg的濃度、約0.5μg/kg、約0.2μg/kg的濃度、約0.1μg/kg的濃度、約0.05μg/kg的濃度、約0.02μg/kg的濃度、約0.01μg/kg的濃度或約0.005μg/kg的濃度或小於0.005μg/kg的濃度。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體能夠在雌性NSG B2m-/-小鼠的HBL-2(人套細胞淋巴瘤)異種移植模型中展示抗腫瘤活性,所述異種移植模型在第0天被真皮內(ID)植入HBL-2腫瘤細胞的,然後在第4天被腹
膜內(IP)注射PBMC和在第17天施用雙抗體,以便使腫瘤體積減少約10%、約20%、約40%、約60%、約80%、約90%或大於90%。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體在引入到接受者人或非人動物中時優選地能夠展示延長的半衰期。可通過將雙抗體引入到人FcRn轉基因小鼠中測量這樣的半衰期(美國專利號6,992,234和7,358,416;Haraya,K.(2014)“Application Of Human FcRn Transgenic Mice As A Pharmacokinetic Screening Tool Of Monoclonal Antibody,”Xenobiotica 2014 Jul 17:1-8;Proetzel,G.等(2014)“Humanized FcRn mouse models for evaluating pharmacokinetics of human IgG antibodies,”Methods 65(1):148-153;Stein,C.等(2012)“Clinical Chemistry Of Human FcRn Transgenic Mice,”Mamm.Genome 23(3-4):259-269;Roopenian,D.C.等(2010)“Human FcRn Transgenic Mice For Pharmacokinetic Evaluation Of Therapeutic Antibodies,”Methods Molec.Biol.602:93-104)。使用可獲得自Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,US的B6.Cg-Fcgrttm1Dcr(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ小鼠(庫存號(Stock Number)004919)進行測量。
為了避免任何懷疑,本發明任一實施例的雙抗體可展示本文所述的功能特性中的一種、兩種、三種、大於三種或所有功能特性。因此,本發明任一實施例的雙抗體可展示本文所述的功能特性的任何組合。
在一些實施例中,前述之雙抗體可用作藥物。在一些實施例中,前述之雙抗體能用於治療與CD19的表達相關或特徵在於CD19的
表達的疾病或病況。本發明更涉及前述之雙抗體在製造用於治療與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況的藥學組合物中的用途,如本文進一步限定的。
其中,與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況可以是B細胞惡性腫瘤(Campo,E.等(2011)“The 2008 WHO Classification Of Lymphoid Neoplasms And Beyond:Evolving Concepts And Practical Applications,”Blood 117(19):5019-5032)。例如,癌症可選自:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML),包括急變期CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL),包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL),和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
在一些實施例中,一種包括任何上述雙抗體和生理學上可接受的載體的藥學組合物。本發明尤其涉及這樣的藥學組合物,其中被治療的疾病或病況是用利妥昔單抗難以治療的。
在一些實施例中,一種前述之藥學組合物在治療與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況中的用途。
其中,與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況是B細胞惡性腫瘤(尤其選自下述的癌症:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML),包括急變期CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B
成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL),包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤)。
在本文中,術語比如“約”應解釋為指定值的10%,更優選地5%以內,除非上下文另外指出。
VL:結構域
VH:結構域
CH2:結構域
CH3:結構域
ELISA:酵素連結免疫吸附分析
OD:吸光值
DART:雙親和力重定向試劑
DART-A:CD19 x CD3雙特異性分子
對照DART 1:螢光素x CD3
對照DART 2:螢光素x CD19
PBMC:外周血液單核細胞
MFI:平均螢光強度
mAb:IgG1抗體
圖1圖解了由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙特異性單價雙抗體的結構。
圖2A和2B闡釋了本發明的三鏈CD19x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的兩種形式的第一、第二和第三多肽鏈的結構(形式1,圖2A;形式2,圖2B)。
圖3顯示了CD19和CD3二者通過DART-A(●)的同時銜接。對照DART 1(■)或對照DART 2(▲)都不能同時結合兩個靶。
圖4A-4B顯示了CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)與人(圖4A)和食蟹猴(圖4B)CD20+ B細胞的結合。
圖5A-5B顯示CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)與人(圖5A)和食蟹猴(圖5B)CD4+和CD8+ T細胞的結合。
圖6A-6F顯示了CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)相對於對照DART 1介導的對靶細胞的重定向殺傷。DART-A-介導的細胞毒性的劑量回應曲線使用初級人T細胞作為針對下述靶細胞系的效應細胞:
HBL-2(圖6A)、Raji/GF(綠色螢光的)(圖6B)、Jeko-1(圖6C)、Molm-13(圖6D)和Colo205/Luc(圖6F),其中使用LDH試驗測量靶細胞殺傷。圖6E顯示了Raji/GF細胞的殺傷,如使用螢光素酶試驗(RLU)測定的,以測量相對存活的細胞。對於1個代表性實驗,DART-A的EC50值顯示在每張圖上。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖7A-7D顯示了以不同的E:T細胞比例CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)-介導的對靶Raji/GF細胞的重定向殺傷(10:1(●)、5:1(■)和2.5:1(▲))。在24小時孵育(圖7A)和48小時孵育(圖7B)之後測定DART-A-介導細胞毒性的劑量回應曲線(細胞毒性百分數),其中初級人T細胞作為針對CD19+靶Raji/GF細胞的效應細胞。在24小時孵育(圖7C)之後和48小時孵育(圖7D)之後測定的DART-A-介導細胞毒性的劑量回應曲線(細胞毒性百分數)被包括,作為對照,其中初級人T細胞作為針對CD19-陰性JIMT-1細胞的效應細胞。顯示的是每個均使用來自獨立供體的T細胞的3個代表性實驗的1個。
圖8A-8D顯示了以2.5:1(●)或1:1(■)的更低的E:T細胞比例,CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)-介導的對靶Raji/GF細胞的重定向殺傷。在72小時孵育(圖8A)之後和96小時孵育(圖8B)之後測定DART-A-介導細胞毒性的劑量回應曲線(細胞毒性百分數),其中初級人T細胞作為針對CD19+靶Raji/GF細胞的效應細胞。在72小時孵育(圖8C)之後和96小時孵育(圖8D)之後測定的CD19 x CD3雙特異性DART-A-介導細胞毒的劑量回應曲線性(細胞毒性百分數)作為對照被包括,作為對照,其中初級人T細胞作為針對CD19-陰性JIMT-1細胞的效應細胞。顯示的是每個均使用來自獨立供體的T細胞的3個代表性實驗的1個。
圖9A-9B顯示了CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)-介導的在人或食蟹猴PBMC中的自體B細胞消耗。呈現了DART(DART-A或對照DART 1)-介導的自體B細胞消耗的劑量回應曲線。圖9A:用各種劑量的DART-A或對照DART 1進行PBMC處理之後的人CD20+細胞的百分數。圖9B:用各種劑量的DART-A或對照DART 1進行PBMC處理之後的食蟹猴CD20+細胞的百分數。DART-A的EC50值顯示顯示在每張圖上。平行分析CD3+細胞的百分數並且用作內參考對照--在任何測試的濃度沒有觀察到改變。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖10顯示了以E:T=30:1,通過食蟹猴PBMC,CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)-介導的對靶細胞的重定向殺傷。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖11A-11C顯示了在存在靶細胞的情況下CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)-介導的從人T細胞的細胞因數釋放。用DART-A或對照DART 1在存在Raji/GF靶細胞的情況下處理人T細胞約24小時。收集培養物上清液並且進行基於ELISA的細胞因數測量。顯示的是使用不同供體的2個中的一個代表性實驗。圖11A:γ-干擾素(IFNγ)釋放;圖11B:腫瘤壞死因數-α(TNF-α)釋放;圖11C:白介素2(IL-2)釋放。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖12A-12D顯示了在重定向細胞殺傷期間通過CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)相對於對照DART 1的人T細胞啟動。使用Raji/GF靶細胞,DART-A-介導的T細胞啟動標記物CD25(圖12A-12B)和CD69(圖12C-12D)對CD8+(圖12A和12C)和CD4+(圖12B和12D)
人T細胞的誘導的的劑量回應。顯示的是每個均使用來自不同供體的T細胞的2個中的一個代表性實驗。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖13A-13D顯示了在重定向細胞殺傷期間通過CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)相對於對照DART 1的食蟹猴T細胞啟動。使用Raji/GF靶細胞,DART-A-介導T細胞啟動標記物CD25(圖13A和13B)和CD69(圖13C和13D)對CD8+(圖13A和13C)和CD4+(圖13B和13D)食蟹猴T細胞或PBMC的誘導的量回應。顯示的是使用T細胞的一個代表性實驗。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖14A-14D顯示了CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)和對照DART 1不能在存在CD19-陰性JIMT1細胞的情況下介導人T細胞啟動。呈現了DART-A-介導的T細胞啟動標記物CD25(圖14A和14B)和CD69(圖14C和14D)對來自如圖12A-12D的相同供體的CD8+(圖14A和14C)和CD4+(圖14B和14D)的誘導的劑量回應。DART-A:▲;對照DART 1:▼。
圖15A-15B顯示了在用不同濃度的Raji/GF靶細胞和DART-A或對照DART 1以10:1的E:T比例孵育24小時之後,在CD4+和CD8+人T細胞中染色的粒酶B(圖15A)和穿孔蛋白(圖15B)的細胞內水準。
圖16A和16B顯示了在以10:1的E:T比例在存在200ng/mL的DART-A或對照DART 1的情況下與HBL-2靶細胞共培養24小時(圖16A)或72小時(圖16B)之後,通過FACS分析的CFSE標記的人T細胞的增殖。顯示了在在存在DART-A的情況(黑線)或在存在下對照DART 1的情況下(灰色填充)與HBL-2細胞共培養之後的染色曲線(profile)。
圖17顯示了在移植以HBL-2腫瘤細胞的小鼠中在存在啟動的人T細胞的情況下通過CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)對腫瘤生長的抑制。在第0天,雌性非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(n=8/組)被皮下移植(SC)以HBL-2腫瘤細胞+啟動的人T細胞,隨後在第0-3天用媒介對照、對照DART 1或DART-A處理總共4個劑量,IV施用。以1:5的比例(分別1 x 106和5 x 106個細胞)孵育人T細胞和HBL-2細胞。腫瘤體積顯示顯示為組平均數±SEM。
圖18顯示了在存在啟動的人T細胞的情況下,CD19 x CD3雙特異性分子(DART-A)在移植Raji腫瘤細胞的小鼠中對腫瘤生長的抑制。在第0天,雌性NOD/SCID小鼠(n=8/組)被SC植入Raji腫瘤細胞+啟動的人T細胞,隨後在第0-3天用媒介對照、對照DART 1或DART-A處理總共4個劑量,IV施用。以1:5的比例(分別1 x 106和5 x 106個細胞)孵育人T細胞和Raji細胞。腫瘤體積顯示為組平均數±SEM。
圖19A-19B顯示在移植以HBL-2腫瘤細胞的小鼠中腫瘤體積隨著時間的變化。圖19A:在第0天,雌性NSG B2m-/-小鼠(n=8/組)被真皮內(ID)移植以HBL-2腫瘤細胞(5 x 106)。在第4天,小鼠被腹膜內(IP)移植以PBMC(5 x 107)。然後,用媒介、對照DART 1或CD19 x CD3雙特異性DART-A如指示地(見Rx箭頭)經靜脈內(IV)處理小鼠。腫瘤體積顯示為組平均數±SEM。圖19B:在第0天,雌性NSG B2m-/-小鼠(n=8/組)被真皮內(ID)移植以HBL-2腫瘤細胞(5 x 106)。在第4天,小鼠被腹膜內(IP)移植以PBMC(5 x 107)。然後,用媒介、對照DART 1或CD19 x CD3雙特異性DART-A如指示地(見Rx箭頭)經靜脈內(IV)處理小鼠。腫瘤體積顯示為組平均數±SEM。
圖20A-20B顯示在IV施用多達4個迴圈的每週一次的遞增劑量的CD19 x CD3雙特異性DART-A之後,食蟹猴中隨著時間推移的迴圈B細胞水準。組1中的食蟹猴(n=4)在第1、8、15、22和29天(由垂直虛線指示)用IV施用的媒介→0.5→5→50→50μg/kg DART-A處理(圖20A)。在第1、8、15、22和29天(由垂直虛線指示)用IV施用的媒介→2→10→100→100μg/kg DART-A處理組2中的食蟹猴(n=4)(圖20B)。顯示了每個食蟹猴的資料。
圖21A-21D顯示了在IV施用多達3個迴圈的每週一次的固定劑量或多達5個迴圈每3天一次的固定劑量的DART-A之後,食蟹猴中隨著時間推移的迴圈B細胞水準。用CD19 x CD3雙特異性DART-A處理組3-5中的食蟹猴(n=2/組)。組3(圖21A)接受5ng/kg DART-A;組4(圖21B)接受50ng/kg DART-A;和組5(圖21C)接受500ng/kg DART-A。在第1、8和15天(由垂直虛線指示)IV施用DART-A。在第1、4、8、11和15天(由垂直虛線指示)用IV施用的500ng/kg DART-A處理組6中的食蟹猴(n=2)(圖21D)。顯示了每個食蟹猴的資料。
圖22顯示了DART-A人FcRn轉基因小鼠藥物代謝動力學(PK)分析。mAb 1、mAb 2和mAb 3是不相關的人源化的IgG1抗體,其用作對照,以允許測定轉基因動物中典型的抗體半衰期。
圖23顯示了用500μg/kg DART-A(■)、500μg/kg對照DART 1(▲)或媒介對照(●)處理之後,在人PBMC-重構的小鼠中散佈(disseminated)的Raji-luc細胞白血病模型中的生存曲線。
圖24顯示了用500μg/kg(●)、100μg/kg(■)、20μg/kg(○)、4μg/kg(▲)、0.8μg/kg(▼)或0.16μg/kg(□)的DART-A、500mg/kg
(△)對照DART 1或媒介對照(◆)處理之後,在人PBMC-重構的小鼠中散佈的Raji-luc細胞白血病模型中的生存曲線。
圖25顯示了用0.5mg/kg的DART-A(▲)、0.1mg/kg DART-A(■)或媒介對照(●)處理之後,人PBMC-重構的小鼠中Raji.luc細胞淋巴瘤模型中的生存曲線。
圖26顯示了在用500μg/kg(■)、100μg/kg(▲)、20μg/kg(▼)、4μg/kg(◆)、0.8μg/kg(□)或0.16μg/kg(△)的DART-A、0.1mg/kg的對照DART 1(○)或媒介對照(●)處理之後,人PBMC-重構的小鼠中Raji.luc細胞淋巴瘤模型中的生存曲線。
圖27顯示了被投以10μg/kg DART-A的食蟹猴中DART-A的血清濃度-時間曲線。
圖28顯示了對於研究天數和組,通過流式細胞術測定的CD45+/CD20+細胞/μL的平均±SEM數量。在第8、15、22和29天的垂直虛線指示組2-5的動物通過2-小時IV輸注的每個劑量(D)的DART-A;而組1的動物繼續接受媒介對照。x軸指示研究天數,其分成3段,覆蓋第-7天至-1天、第0天至第63天和第64-121天。
圖29A-29I顯示了CLL PBMC(E:T=1:23)中惡性B細胞(CD20+/CD5+)(圖29A-29C)、T細胞(CD4+或CD8+)(圖29D-29E)和T細胞啟動(CD4+(圖29F-29G)或CD8+(圖29H-29I)T細胞中的CD25)在沒有處理(圖29A)、DART-A(圖29C、29E、29G和29I)或對照DART 1(圖29B、29D、29F和29H)處理6天后的代表性FACS分析。
本申請要求美國臨時專利申請號62/055,695(2014年9月
26日提交的)的優先權,並且通過引用以其整體併入本文。
A.抗體和其他結合分子
1.抗體
如本文所使用,術語“抗體”不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體,而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括具有必要的特異性的抗原識別位元點的抗體部分的融合蛋白、人源化的抗體和嵌合抗體以及包括具有必要的特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的結構。遍及本申請,抗體輕鏈和重鏈的氨基酸殘基的編號是根據如在以下文獻中的EU索引:Kabat等(1992)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health Publication No.91-3242中。如本文所使用,“抗體的抗原結合片段”是抗體具有至少一個抗原識別位點的一部分。如本文所使用,此術語包括片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 Fv)和單鏈(scFv)。
術語“單克隆抗體”指同質性(homogenous)抗體群體,其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異性的,針對單抗原位點。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體,而且也包括其片段(比如Fab、Fab’、F(ab’)2 Fv)、單鏈(scFv),其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有必要特異性和結合抗原能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。就抗體來源或製備其的方式(例如,通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言不期望受到限制。此術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據定義“抗體”描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler,G.等的方
法(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256:495-497或其改良方法。典型地,單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用包含期望的表位的免疫原量的細胞、細胞提取物或蛋白製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是,但不限於初始細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可培養一段時間(例如,至少24小時),然後它們用作免疫原。細胞可通過它們本身或組合非變性佐劑比如Ribi用作免疫原。一般而言,當用作免疫原時,細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞,完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑,例如,弗氏佐劑的使用,可使細胞破裂,因此,其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用,諸如兩週一次或一週一次,或者可以維持在動物(例如,在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地,對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施例中,對這樣的抗體測序,然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中,並且,可然後擴展和冷凍宿主細胞用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用于基因操作,以產生本發明的雙特異性分子以及嵌合抗體、人源化的抗體或犬源化(caninized)的抗體,改善抗體的親和性,或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合部分的基本序列,同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化大體上有四個步驟。這些是:(1)測定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列(2)設計人源化的抗體或犬源化的抗體,即,確定在人源化或犬源化過程期間使用哪個抗體框架區(3)
實際人源化或犬源化方法/技術和(4)轉染和表達人源化的抗體。見,例如,美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
2.雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART
TM
雙抗體
非單特異性“雙抗體”的供應提供了相對於抗體的明顯優勢:共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此,二價雙抗體具有寬範圍的應用,包括治療和免疫診斷。二價允許在各個應用中在設計和工程化雙抗體時更大的靈活性,提供對多聚抗原的增強的抗體親抗原性、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的直接靶向,這取決於兩個靶標抗原的存在。由於其增加的價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體,為~50kDa或以下),本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。尤其重要的是共連接不同的細胞,例如,交聯細胞毒性T細胞與腫瘤細胞(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,”Nature 314:628-631和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305)。
雙抗體表位元結合結構域也可針對B細胞,比如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74的表面決定子(Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551;Cheson,B.D.等(2008)“Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,”N.Engl.
J.Med.359(6):613-626;Castillo,J.等(2008)“Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies,”Exp.Hematol.36(7):755-768。在許多研究中,也發現結合效應細胞決定子,例如Fcγ受體(FcγR),的雙抗體啟動效應細胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305;Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916、WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068)。通常,效應細胞啟動由結合抗原的抗體經Fc-FcγR相互作用與效應細胞的結合而觸發;因此,就此而言,雙抗體分子可展示Ig樣功能,不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如,如在本領域中已知的任何效應功能測定中所分析的或在本文示例的效應功能測定(例如,ADCC測定)中所分析的)。通過交聯腫瘤和效應細胞,雙抗體不僅能使效應細胞在腫瘤細胞附近,而且導致有效腫瘤殺傷(見例如Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。
然而,上述優勢是以顯著的成本獲得的。這樣的非單特異性雙抗體的形成要求成功組裝兩個或多個有區別而不同的多肽(即,這樣的形成要求雙抗體通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成)。此事實與單特異性雙抗體不同,其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即,兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致失活分子
(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588),這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即,以便防止同源二聚化)(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。因此,本領域已經教導了這樣的多肽的非共價結合(見,例如Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27;Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683,J.Biochem.76(8):992;Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588;Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
但是,現有技術已經認識到由非共價結合的多肽組成的雙特異性雙抗體是不穩定的並且容易解離成無功能的單體(見,例如,Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The
Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
面對此挑戰時,現有技術已經成功開發了穩定的、共價結合的異源二聚化非單特異性雙抗體,稱為DARTsTM(見,例如,美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910;歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538;和Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551;Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943;Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449)。這樣的雙抗體包括兩個或多個共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中。例如,將半胱氨酸殘基添加至這樣的構建體的c-末端已經被證明允許多肽鏈之間的二硫鍵合,穩定了產生的異源二聚體,而不干擾二價分子的結合特性。
最簡單DARTTM的兩個多肽中的每一個包括三個結構域(圖1)。第一多肽包括:(i)結構域,其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區域(VL1),(ii)第二結構域,其包括第二免疫球蛋白的
重鏈可變結構域的結合區域(VH2),和(iii)第三結構域,其用於促進與第二多肽的異源二聚化並且使第一多肽共價結合雙抗體的第二多肽。第二多肽包含互補的第一結構域(VL2結構域),互補的第二結構域(VH1結構域)和與第一多肽鏈的第三結構域複合的第三結構域,以便促進與第一多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合。這樣的分子是穩定的、有效的並且能夠同時結合兩個或更多個抗原。它們能夠促進重定向的T細胞介導對表達靶抗原的細胞的殺傷。
在一種實施例中,第一和第二多肽的第三結構域每個包含半胱氨酸殘基,其用於經二硫鍵將多肽結合在一起。多肽中的一個或兩個的第三結構域可另外具有CH2-CH3結構域的序列,以便雙抗體多肽的複合形成能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc結構域(圖2A-2B)。已經描述了這樣的分子的許多變型(見,例如,美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910;歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221;和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。這些包含Fc的DART可包括三條多肽鏈。這樣的雙抗體的第一多肽包含三個結構域:(i)包含VL1的結構域,(ii)包含VH2的結構域,(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合的結構域和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。這樣的DARTTM的第二多肽包含:(i)包含VL2的結構域,(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合的結構域。這樣的DARTTM的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此,這樣的DARTTM的第一和第二多肽鏈結合在一起,以形成能夠結合表位的
VL1/VH1結合位點,以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽經其各自的第三結構域中包括半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是,第一和第三多肽鏈彼此複合以形成Fc區,其經二硫鍵被穩定。這樣的雙抗體具有增強的效力。這樣的包含Fc的DARTsTM可具有兩個定向(表1)中的任意之一:
B. CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體
本發明尤其涉及能夠同時結合CD19和CD3的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體,並且涉及這樣的分子在治療血液學惡性腫瘤中的用途。儘管非優化的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體是充分起作用的,與通過密碼子優化在基因表達中獲得的改善類似(見,例如,Grosjean,H.等(1982)“Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes:The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes”Gene 18(3):199-209),還可能通過修飾或改進它們的序列而進一步提高
CD19x CD3雙特異性單價雙抗體的穩定性和/或功能。
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體是由三條多肽鏈組成的CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,所述三條多肽鏈彼此結合以形成對CD19的表位具有特異性的一個結合位點和對CD3的表位具有特異性的一個結合位點(見,圖2A-2B),以便能夠同時結合CD19和CD3的。因此,這樣的雙抗體結合“第一抗原”,其可以是CD3或CD19,和結合“第二抗原”,其在第一表位是CD3時是CD19並且在第一表位是CD19時是CD3。
在一些實施例中,如在圖2A中所顯示,這樣的三條多肽鏈的第一條在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、“第一”抗原(CD3或CD19)的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域(VL)、第二抗原(CD19,如果第一抗原是CD3;CD3,如果第一抗原是CD19)的重鏈可變結構域的抗原結合結構域(VH)、促進異源二聚體的結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。優選地,重鏈可變結構域的抗原結合結構域通過間插連接體肽(連接體2)連接至促進異源二聚體的結構域。在CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的情況下,促進異源二聚體的結構域的C-末端通過間插連接體肽(連接體3)或通過間插間隔連接體肽(間隔連接體3)連接至Fc區域的CH2-CH3結構域(“Fc結構域”)。最優選地,三條多肽鏈的第一條在N-末端至C-末端方向上因此包含:VL第一抗原-連接體1-VH第二抗原-連接體2-促進異源二聚體的結構域-間隔連接體3-Fc結構域。
在一些實施例中,如在圖2B中所顯示,這樣的三條多肽鏈的第一條在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、連接體3、Fc區域的
CH2-CH3結構域(“Fc結構域”)、間插間隔肽(連接體4),其具有例如氨基酸序列:APSSS(SEQ ID NO:47)或氨基酸序列APSSSPME(SEQ ID NO:48)、第一抗原(CD3或CD19)的輕鏈可變結構域(VL)的抗原結合結構域、第二抗原(CD19,如果第一抗原是CD3;CD3,如果第一抗原是CD19)的重鏈可變結構域(VH)的抗原結合結構域、促進異源二聚體的結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體1)使輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。優選地,重鏈可變結構域的抗原結合結構域通過間插連接體肽(連接體2)連接至促進異源二聚體的結構域。最優選地,三條多肽鏈的第一條因此在N-末端至C-末端方向上包含:連接體3-Fc結構域-連接體4-VL第一抗原-連接體1-VH第二抗原-連接體2-促進異源二聚體的結構域。
在一些實施例中,這樣的三條多肽鏈的第二條在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、第二抗原的輕鏈可變結構域(VL)的抗原結合結構域、第一抗原的重鏈可變結構域(VH)的抗原結合結構域、促進異源二聚體的結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。優選地,重鏈可變結構域的抗原結合結構域通過間插連接體肽(連接體2)連接至促進異源二聚體的結構域。在一些實施例中,三條多肽鏈的第二條因此在N-末端至C-末端方向上包含:VL第二抗原-連接體1-VH第一抗原-連接體2-促進異源二聚體的結構域。
在一些實施例中,這樣的三條多肽鏈的第三條包含連接體肽(連接體3)和Fc區域的CH2-CH3結構域(“Fc結構域”)。
第一多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第二多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用,以便形成對第一
抗原(即,CD19或CD3)具有特異性的功能性抗原結合位點。同樣地,第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第一多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用,以便形成對第二抗原(即,CD3或CD19,這取決於第一抗原的身份)具有特異性的第二功能性抗原結合位點。因此,第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域和重鏈可變結構域的抗原結合結構域的選擇是協調的,以便兩條多肽鏈總共包括能夠結合CD19和CD3的輕鏈和重鏈可變結構域的抗原結合結構域。
I.優選的連接體
在一些實施例中,選擇將多肽鏈這樣的VL和VH結構域分開的連接體1的長度,以基本上或完全防止這樣的VL和VH結構域彼此結合。因此第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣地,第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:1):GGGSGGGG。
連接體2的目的是將多肽鏈的VH結構域與此多肽鏈的促進異源二聚體的結構域分開。各種連接體中的任意一種均可用於連接體2的目的。用於這樣的連接體2的優選的序列具有氨基酸序列:ASTKG(SEQ ID NO:2),其源自IgG CH1結構域,或GGCGGG(SEQ ID NO:3),其具有可用於使第一和第二多肽鏈經二硫鍵彼此共價結合的半胱氨酸殘基。因為連接體2,ASTKG(SEQ ID NO:2),不具有這樣的半胱氨酸,這樣的連接體2的使用優選地與包含半胱氨酸的促進異源二聚體的結構域的使用相結合,比如SEQ ID NO:12的E-螺旋或SEQ ID NO:13的K-螺旋(見下文)。
連接體3的目的是將多肽鏈的促進異源二聚體的結構域與
此多肽鏈的Fc結構域分開。各種連接體中的任意一種均可用於連接體3的目的。這樣的連接體3的優選的序列具有氨基酸序列:DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)。間隔連接體3的優選的序列具有氨基酸序列:GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)。
2.優選的促進異源二聚體的結構域
第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可通過包括促進異源二聚體的結構域而被驅動。這樣的結構域在一條多肽鏈上包括GVEPKSC(SEQ ID NO:6)或VEPKSC(SEQ ID NO:7)和在另一條多肽鏈上包括GFNRGEC(SEQ ID NO:8)或FNRGEC(SEQ ID NO:9)(US2007/0004909)。
但是,在一些實施例中,促進異源二聚體的結構域由具有相反電荷的一個、兩個、三個或四個串聯重複的螺旋結構域形成,所述螺旋結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶電氨基酸殘基的序列(Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9:3173-3180;Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments:Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312:221-228;Arndt,K.M.等(2002)“Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,”Structure 10:1235-1248;Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,”Analytical Biochemistry 399:138-140;Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development:Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity
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這樣的重複螺旋結構域可以是精確的重複序列(repeat)或可具有取代。例如,第一多肽鏈的促進異源二聚體的結構域可包括具有八個帶負電的氨基酸殘基的序列和第二多肽鏈的促進異源二聚體的結構域可包括具有八個帶正電的氨基酸殘基的序列(或反之亦然)。哪個螺旋提供給第一或第二多肽鏈不重要,只要具有相反電荷的螺旋用於另一多肽鏈。但是,在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體具有的第一多肽鏈具有帶負電的螺旋。帶正電的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電的氨基酸優選地是谷氨酸。採用僅僅單個促進異源二聚體的結構域是可能的(因為這樣的結構域抑制同源二聚化,從而促進異源二聚化),但是,在一些實施例中,雙抗體的第一和第二多肽鏈二者均包含促進異源二聚體的結構域。
在一些實施例中,促進異源二聚體的結構域之一包括四個串聯的“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:10: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K),其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷,而另一促進異源二聚體的結構域包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:11: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E),
其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這樣的帶電結構域的存在促進了第一和第二多肽之間的結合,因此促進異源二聚化。尤其是,這樣的促進異源二聚體的結構域:其中SEQ ID NO:10的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾成包含半胱氨酸殘基: E VAA E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:12)。同樣地,尤其是,這樣的促進異源二聚體的結構域,其中SEQ ID NO:11的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾成包含半胱氨酸殘基: K VAA K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:13)。
3.多肽鏈的共價鍵合
在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體被工程化,以便它們的第一和第二多肽鏈經沿著它們的長度佈置的一個或多個半胱氨酸殘基彼此共價鍵合。這樣的半胱氨酸殘基可被引入到將多肽的VL和VH結構域分開的間插連接體中。可選地,連接體2可包含半胱氨酸殘基。另外或可選地,連接體3可包含半胱氨酸殘基,如在SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中。最優選地,促進異源二聚體的結構域的一個或多個螺旋結構域被取代,以包含半胱氨酸殘基,如在SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中。
在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體可進一步具有白蛋白結合結構域,以延長體內的半衰期。
4. Fc結構域
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可是完整的Fc區域(例如,完整的IgG Fc區域)或僅僅是完整Fc區域的片段。儘管本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可具有結
合一個或多個Fc受體(例如,FcγR(一種或多種))的能力,但是更優選地這樣的Fc結構域將造成與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)減少的結合(相對於野生型Fc區域展示的結合)或基本上消除這樣的Fc結構域結合這樣的受體(一種或多種)的能力。在一些實施例中,雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括完整Fc區域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域,或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其相對於完整Fc區域的CH2或CH3結構域可包括,例如,一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。在一些實施例中,雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括非Fc多肽部分,或可包括非天然的完整Fc區域的部分,或可包括非天然取向的CH2和/或CH3結構域(比如,例如,兩個CH2結構域或兩個CH3結構域,或在N-末端至C-末端方向上,連接至CH2結構域的CH3結構域等)。
在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈每個包括複合在一起的CH2-CH3結構域,以形成免疫球蛋白(IgG)Fc結構域。人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14):
因此,第一和第三多肽鏈的CH2和/或CH3結構域二者可都由SEQ ID NO:14或其變體組成。
尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域展示與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於野生型Fc區域(SEQ ID NO:14)展示的結合。能夠介導這樣的改變的結合的Fc變體和突變體形式是本領域熟知的,其包括在234和235位的氨基酸取代、在265位的取代或在297位的取代(見,例如,US專利號5,624,821,其通過引用併入本文)。在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括在234位用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代。
第一和第三多肽鏈的CH2和/或CH3結構域的序列不需要一致,並且,其有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如,氨基酸取代(優選以包括形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域,以便空間干擾將防止與類似突變的結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與這樣的結構域配對:已經向所述結構域中工程化了互補或適應性突變“臼(hole)”(例如,用甘氨酸取代)。這樣的突變組可被工程化到包含雙特異性單價Fc雙抗體分子的任意多肽對中,並且進一步被工程化到所述多肽對的多肽鏈的任何部分中。相對于同源二聚化利於異源二聚化的蛋白質工程的方法在本領域中是悉知的,尤其是關於工程化免疫球蛋白樣分子,這些都包括在本文中(見例如,Ridgway等(1996)‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization”Proteins Engr.9:617-621,Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A
Phage Display Library”J.Mol.Biol.270:26-35和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor Cell Lysis”J.Immunol.Methods 296:95-101;其每一篇通過參考以其整體併入本文)。在一些實施例中,“杵”被工程化到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化到第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此,“杵”將有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。由於第三多肽鏈優選包含“臼”取代,其將與第一多肽鏈異源二聚化以及自身同源二聚化。通過將天然IgG Fc結構域修飾為含有修飾T366W,產生優選的杵。通過將天然IgG Fc結構域修飾為含有修飾T366S、L368A以及Y407V,產生優選的臼。為了幫助從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同二聚物,第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地經在435位的氨基酸取代(H435R)被突變。因此,第三多肽鏈同二聚物不會結合蛋白A,而雙特異性單價Fc雙抗體會保留其通過第一多肽鏈上的蛋白A結合位點結合蛋白A的能力。
如將敘述的,SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的CH2-CH3結構域包括在234位用丙氨酸進行的取代和235位用丙氨酸進行的取代,並且因此形成的Fc結構域展示與FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)下降的(或基本上不)結合(相對於野生型Fc區域(SEQ ID NO:14)展示的結合)。
在一些實施例中,第一多肽鏈具有“包含杵的”CH2-CH3序列,比如SEQ ID NO:15的CH2-CH3序列。但是,如將認識到,“包含臼的”CH2-CH3結構域(例如,SEQ ID NO:16)可在第一多肽鏈中採用,在此情況下,“包含杵的”CH2-CH3結構域(例如,SEQ ID NO:15)將用於第三多肽鏈。
5. CD19可變區
其中,加底線的序列分別是其CDR1、CDR2和CDR3:VLCD19 CDR1:RASQSVSYMH (SEQ ID NO:18)
VLCD19 CDR2:DASNRAS (SEQ ID NO:19)
VLCD19 CDR3:FQGSVYPFT (SEQ ID NO:20)
其中,加底線的序列分別是其CDR1、CDR2和CDR3:VHCD19 CDR1:TSGMGVG (SEQ ID NO:22)
VHCD19 CDR2:HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO:23)
VHCD19 CDR3:MELWSYYFDY (SEQ ID NO:24)
6. CD3可變結構域
其中,加底線的序列分別是其CDR1、CDR2和CDR3:
VLCD3 CDR1:RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:26)
VLCD3 CDR2:GTNKRAP (SEQ ID NO:27)
VLCD3 CDR3:ALWYSNLWV (SEQ ID NO:28)
其中,加底線的序列分別是其CDR1、CDR2和CDR3:VHCD3 CDR1:TYAMN (SEQ ID NO:30)
VHCD3 CDR2:RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO:31)
VHCD3 CDR3:HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:32)
7.白蛋白結合結構域
如在WO 2012/018687中公開的,為了進一步改善本發明任一實施例的CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體Fc雙抗體的體內藥物代謝動力學特性,可修飾這樣的雙抗體,以在雙抗體的一個或多個末端包含血清結合蛋白的多肽部分。在一些實施例中,血清結合蛋白的這樣的多肽部分安置在雙抗體的C-末端。此血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)。鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)是尤其優選的。
鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)由形成穩定的三-螺旋束的46個氨基酸殘基組成,並且具有廣泛
的白蛋白結合特異性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120)。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中的半衰期為19天。白蛋白具有若干小分子結合位點,其允許它非共價結合其他蛋白質,從而延長它們的血清半衰期。
因此,具有白蛋白結合結構域的這樣的CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體或雙特異性單價Ec雙抗體的第二多肽鏈包含連接體(連接體4),其將這樣的多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)與白蛋白結合結構域分開。這樣的連接體4的優選的序列是SEQ ID NO:33:GGGS。優選的白蛋白結合結構域(ABD)具有序列(SEQ ID NO:34):LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
C. CD19x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,“DART-A”
在一些實施例中,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,其能夠同時並特異性結合CD19和CD3。此雙抗體表示為“DART-A”。發現此雙抗體相對於其他CD19x CD3雙抗體展示增強的功能活性。
如上面所示,在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包括三條多肽鏈。DART-A的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD19的單克隆抗體的VL結構域(VLCD19)(SEQ ID NO:17)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO:29)、間插連接體肽(連接體2;ASTKG(SEQ ID NO:2))、促進異源二聚體的(E-螺旋)結構域( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:12))、
間插連接體肽(間隔連接體3;GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5))、包含“包含杵的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:15)和C-末端。
因此,DART-A的第一多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15。
DART-A的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO:25)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合CD19的單克隆抗體的VH結構域(VHCD19)(SEQ ID NO:21)、間
插連接體肽(連接體2;ASTKG(SEQ ID NO:2))、促進異源二聚體的(K-螺旋)結構域( K VAA K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:13)和C-末端。
因此,DART-A的第二多肽由以下組成:SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:13。
DART-A的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體3;DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4))、包含“包含臼的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:16)和C-末端。
因此,DART-A的第三多肽由以下組成:SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:16。
D.對照DARTS
為了更有意義地表明CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體的特性,構建了兩個對照DARTS。第一對照DART(“對照DART 1”)能夠結合螢光素和CD3。第二對照DART(“對照DART 2”)能夠結合螢光素和CD19。
用於形成對照DART 1和2的抗螢光素抗體是抗體4-4-20(Gruber,M.等(1994)“Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,”J.Immunol.152(11):5368-5374;Bedzyk,W.D.等(1989)“Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family,”J.Biol.Chem.264(3):1565-1569),用於對照雙抗體中。抗螢光素抗體4-4-20的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的氨基酸序列如下:抗螢光素抗體4-4-20的輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:41):
1.對照DART 1(螢光素x CD3)
對照DART 1的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VL結構域(VL4-4-20)(SEQ ID NO:41)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO:29)、間插連接體肽(連接體2;GGCGGG(SEQ ID NO:3))、促進異源二聚體的(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10))、間插連接體肽(間隔連接體3;GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5))、包含“包含杵的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:15)和C-末端。
因此,對照DART 1的第一多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15。
對照DART 1的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3)(SEQ ID NO:25)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VH結構域(VHFluor)(SEQ ID NO:42)、間插連接體肽(連接體2;GGCGGG(SEQ ID NO:3))、促進異源二聚體的(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11)和C-末端。
因此,對照DART 1的第二多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:42-SEQ ID NO3-SEQ ID NO:11。
對照DART 1的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體3;DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4))、包含“包含臼的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:16)和C-末端。
因此,對照DART 1的第三多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:16。
2.對照DART 2(螢光素x CD19)
對照DART 2的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD19的單克隆抗體的VL結構域(VLCD19)(SEQ ID NO:17)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VH結構域(VHFluor)(SEQ ID NO:42)、間插連接體肽(連接體2;GGCGGG(SEQ ID NO:3))、促進異源二聚體的(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10))、間插連接體肽(間隔連接體3;GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5))、包含“包含杵的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:15)和C-末端。
因此,對照DART 2的第一多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15。
對照DART 2的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VL結構域(VLFluor)(SEQ ID NO:41)、間插連接體肽(連接體1;GGGSGGGG(SEQ ID NO:1))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3)(SEQ ID NO:29)、間插連接體肽(連接體2;GGCGGG(SEQ ID NO:3))、促進異源二聚體的(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11)和C-末端。
因此,對照DART 2的第二多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:11。
對照DART 2的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體3;DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4))、包含“包含臼的”CH2和CH3結構域的多肽(Fc結構域序列,SEQ ID NO:16)和C-末端。
因此,對照DART 2的第三多肽鏈由以下組成:SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:16。
E.藥學組合物
在一些實施例中,組合物包括原料藥(bulk drug)組合物,其可用於製備藥學組合物(例如,不純或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即,適於施用給受試者或患者的組合物)。這樣的組合物包括預防有效量的或治療有效量的本發明的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或這樣的藥劑和藥學上可接受的載體的組合。在一些實施例中,此組合物包括預防有效量的或治療有效量的本發明的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體和藥學上可接受的載體。
在一些實施例中,這樣的藥學組合物,其包括任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體),和對特定的癌症抗原有特異性的第二治療抗體(例如,腫
瘤特異性單克隆抗體),以及藥學上可接受的載體。
在具體實施例中,術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他供用於動物,特別是用於人類的通常獲得認可的藥典中。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體,如水和油,包括石油、動物油、植物油或合成來源的油,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時,水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液體載體,特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要,組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。
通常,根據本發明實施例之組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起,例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物,所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時,其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物,則可以提供一安剖注射用無菌水或鹽水,以便可以在施用前混合所述成分。
可以將根據本發明實施例之的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽,所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子,並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫
氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
在一些實施例中,藥學包裝或試劑盒,其包括一個或多個容器,所述容器填充任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體),單獨地或組合這樣的藥學上可接受的載體。另外,用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可以包括於所述藥學包裝或試劑盒中。在一些實施例中,藥學包裝或試劑盒,其包含一個或多個容器,所述容器填充以任一實施例的藥學組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice),所述佈告反映了管理機構對用於人類施用的製造、使用或銷售的批准。
在一些實施例中,試劑盒可包括任一實施例的的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體,優選地,包括CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑;和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一個或多個癌抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施例中,其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施例中,預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。
F.施用方法
通過向受試者施用有效量的任一實施例的融合蛋白或綴合分子或包括任一實施例的融合蛋白或綴合分子的藥學組合物,可以提供任一實施例的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面,這類組合物基本上是純的(即,基
本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施例中,受試者是動物,優選哺乳動物,如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如,猴子,如食蟹猴、人等)。在一些實施例中,受試者是人。
各種遞送系統是已知的,並且可以用於施用任一實施例的組合物,例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊、重組細胞中,能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見,例如,Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System”J.Biol.Chem.262:4429-4432),構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用任一實施例的分子的方法包括、但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用,例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining)(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收,並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外,也可以應用肺部給藥,例如通過使用吸入器或噴霧器,並且與霧化劑一起配製。見例如美國專利號6,019,968;5,985,320;5,985,309;5,934,272;5,874,064;5,855,913;5,290,540;和4,880,078;和PCT公佈號WO 92/19244;WO 97/32572;WO 97/44013;WO 98/31346;和WO 99/66903,其各自通過引用以其整體併入本文。
根據本發明實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)可包裝在密封容器中,比如
指示分子的量的安瓿或小袋中。在一個實施例中,任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中,並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度用於施用於受試者。在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體作為凍幹無菌粉提供於密封容器中,其單位劑量為至少5μg、更優選地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg、或至少200μg。
在一些實施例中,凍幹的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體應在它們的原容器中在2和8℃之間儲存,並且分子應在重構之後的12小時內,優選地6小時內,5小時內,3小時內,或1小時內施用。在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體可以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。在一些實施例中,液體形式的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體可提供在密封容器中,其中分子存在的濃度為至少1μg/ml,更優選地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。
可通過標準臨床技術測定根據本發明實施例的組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的途徑和病況的嚴重性,並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線來推斷。
對於根據本發明實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,可基於接受受試者的體重(kg)確定施用至患者的劑量。施用的劑量通常是至少約0.3ng/kg/天至約0.9ng/kg/天、至少約1ng/kg/天至約3ng/kg/天、至少約3ng/kg/天
至約9ng/kg/天、至少約10ng/kg/天至約30ng/kg/天、至少約30ng/kg/天至約90ng/kg/天、至少約100ng/kg/天至約300ng/kg/天、至少約200ng/kg/天至約600ng/kg/天、至少約300ng/kg/天至約900ng/kg/天、至少約400ng/kg/天至約800ng/kg/天、至少約500ng/kg/天至約1000ng/kg/天、至少約600ng/kg/天至約1000ng/kg/天、至少約700ng/kg/天至約1000ng/kg/天、至少約800ng/kg/天至約1000ng/kg/天、至少約900ng/kg/天至約1000ng/kg/天或至少約1,000ng/kg/天。
在另一實施例中,患者被施用這樣的治療方案:其包括一個或多個劑量的這類預防有效量或治療有效量的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體),其中治療方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施例中,治療方案包括間歇地施用預防有效量或治療有效量的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體的劑量(例如,在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量,並且在此周的第5天、第6天和第7天不施用預防有效量或治療有效量的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)的劑量)。典型地,有1、2、3、4、5或更多個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。
在另一個實施例中,施用的劑量在方案(一個或多個)的前四分之一、前一半、或前三分之二或四分之三內上升(例如,在四療程的第一、第二或協力廠商案內),直到達到日預防有效量或治療有效量的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)。
表2提供針對典型治療療程的上述不同給藥方案的5個實例。
可通過修飾比如,例如,脂質化來增強CD19x CD3雙特異性單價雙抗體的吸收和組織滲透而降低或改變本發明任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的施用劑量和頻率。
可計算施用至患者的本發明任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的劑量,以用作單劑療法。在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體結合其他治療性組合物使用,並且施用至患者的劑量小於當所述分子用作單劑療法時施用的劑量。
本發明任一實施例的藥學組合物可局部施用至需要治療的區域;這可通過例如,但不限於下述方式實現:局部輸注、通過注射、或通過植入物的手段,所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料,包括膜,比如矽橡膠膜或纖維。優選地,當施用本發明的分子時,必須注意使用不吸收此分子的材料。
本發明任一實施例的組合物可在泡狀體(vesicle),尤其是脂質體中遞送(見Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533);Treat等,在以下中:Liposomes in the
Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,New York,353-365頁(1989);Lopez-Berestein,同上,317-327頁)。
可以在控釋或緩釋系統中遞送本發明任一實施例的組合物。可以使用本領域技術人員已知的任何技術產生包括一個或多個本發明任一實施例的一個或多個CD19x CD3雙特異性單價雙抗體的緩釋製劑。見例如美國專利號4,526,938;PCT公開物WO 91/05548;PCT公開物WO 96/20698;Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179-189,Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854;和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其各通過引用以其整體併入本文。在一個實施例中,泵可用於控釋系統(見Langer,上文;Sefton,(1987)“Implantable Pumps,”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240;Buchwald等(1980)“Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88:507-516;和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The
Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一個實施例中,聚合材料可用于實現分子的控釋(見例如Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,”Science 228:190-192;During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In Vivo Characterization,”Ann.Neurol.25:351-356;Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112);美國專利號5,679,377;美國專利號5,916,597;美國專利號5,912,015;美國專利號5,989,463;美國專利號5,128,326;PCT公佈號WO 99/15154;和PCT公佈號WO 99/20253)。緩釋製劑所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控釋系統可接近治療靶標(例如,肺)佈置,因此僅僅需要全身劑量的一部分(見例如Goodson,在Medical Applications of Controlled Release中,上文,卷2,115-138頁(1984))。根據Dunn等(見U.S.5,945,155),使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。此特定方法基於聚合物系統中生物活性
材料原位控釋的治療效果。移植可通常發生于患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統,由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中,移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織液中,並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱,形成固體微孔基質(見U.S.5,888,533)。
控釋系統在Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)的綜述中有論述。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含根據本發明任一實施例的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見例如美國專利號4,526,938;國際公佈號WO 91/05548和WO 96/20698;Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179-189,Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854;和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其各通過引用以其整體併入本文。
在一些實施例中,根據本發明的組合物是編碼本發明任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體的核酸的情況下,核酸可體內施用,以通過如下方式促進其編碼的CD19x CD3雙特異性單價雙抗
體或CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的表達:通過將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用它從而其成為細胞內的,例如,通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286),或通過直接注射,或通過使用微粒轟擊(例如,基因槍;生物彈道技術(Biolistic),Dupont),或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑塗覆,或通過與已知進入核的同源框樣肽一起施用(見例如Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等。可選地,可以將核酸經細胞內引入並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中,以進行表達
用治療或預防有效量的本發明任一實施例的CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)治療受試者可包括單一治療或,優選地,可包括一系列治療。在醫些實施例中,用這樣的雙抗體每週治療受試者一次持續約1至10周,優選地2至8周,更優選地約3至7周,和甚至更優選地約4、5或6周。本發明的藥學組合物可一天施用一次、一天兩次或一天三次。可選地,藥學組合物可一周施用一次、一周兩次、每兩週一次、一個月一次、每六週一次、每兩個月一次、一年兩次或每年一次。應當認識到,用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體療程增加或降低
G.組合物的用途
在一些實施例中,CD19x CD3雙特異性單價雙抗體(尤其地,本發明任一實施例的CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)具有治療任何與CD19的表達相關或特徵在於CD19的表達的疾病或病況的能力。因此,這樣的分子可用于診斷或治療(但不限於)下述疾病或病況:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML),包括急變期
CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL),包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤;自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症、哮喘和類風濕性關節炎。本發明的雙特異性單價雙抗體可另外用於製造治療上述病況的藥物。
範例1
CD19細胞表面表達的定量
為了鑒定用於評估CD19 x CD3雙特異性雙抗體的生物學活性的合適的靶細胞系,首先使用定量FACS(QFACS)在一系列人B-細胞淋巴瘤/白血病細胞系上確定CD19細胞表面表達水準,所述細胞系包括Nalm-6(急性成淋巴細胞白血病)、Raji(伯基特淋巴瘤)、Daudi(伯基特淋巴瘤)、HBL-2(套細胞淋巴瘤)、MEC-1(慢性淋巴細胞白血病)和Jeko-1(套細胞淋巴瘤)、MOLM-13(急性髓細胞樣白血病細胞系)、JIMT1(乳腺癌)和Colo205(結腸癌)。使用QFACS試劑盒計算表面上CD19抗體結合位點的絕對數。如表3中顯示,細胞系上CD19結合位元點的絕對數順序如下:Raji(高)>Nalm-6(中)>Daudi(中)>HBL2(中)>MEC-1(低)>Jeko-1(低)。如預期的,MOLM-3、JIMT-1和Colo205沒有CD19表達,這與CD19是B-細胞特異性抗原一致。
範例2
結合親和力
為了量化CD19 x CD3雙特異性單價雙抗體和人或食蟹猴CD3之間的結合程度,使用示例性CD19 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體,DART-A進行BIACORETM分析。BIACORETM分析測量解離速率(dissociation off-rate),kd。根據公式:KD=[kd]/[ka],抗體和其靶標之間的結合親和力(KD)是結合(結合速率(on reate),ka)和解離(速率(off-rate),kd)的動力學常數的函數。BIACORETM分析使用表面等離子共振,以直接測量這些動力學參數。
通過表面等離子共振(SPR)技術(BIAcore)分析的DART-A(0-100nM)與可溶性人和食蟹猴CD3和CD19的結合的結果顯示在表4中。
DART-A對人和食蟹猴CD3的結合親和力類似(KD分別=21.2nM和21.9nM)。但是,DART-A對食蟹猴CD19是對人CD19的親和力低約1/10(KD分別=20.3nM和2.0),原因是食蟹猴CD19增加的解離速率常數(kd)。食蟹猴仍是用於毒理學評估的相關物種,儘管應考慮CD19結合親和力方面的差異。
範例3
細胞結合特徵
通過流式細胞術體外評估DART-A與小鼠、大鼠、兔子、食蟹猴和人血液白細胞(由全血純化)的結合。用濃度為25或100nM的DART-A以及對照DART 1和對照DART 2將白細胞染色約1小時。對照DART 2包含與DART-A相同的CD19結合組分,而對照DART 1包含與DART-A相同的CD3結合組分。孵育之後,用識別DART蛋白質的EK螺旋異源二聚化區域的抗E-螺旋/K-螺旋(EK)mAb檢測結合白細胞的DART蛋白質。在小鼠、大鼠或兔子血液白細胞上沒有觀察到DART-A結合。同樣地,對照DART雙抗體也不顯示與小鼠、大鼠或兔子白細胞的任何結合。如預期地,測試的兩種濃度的DART-A都顯示與人和食蟹猴血液白細胞的特異性結合。
雙功能ELISA試驗用於顯示由DART-A同時銜接兩個靶抗原。ELISA板被包被以可溶性人CD3ε/δ異源二聚體,並且在4C孵育過夜,然後用BSA封閉。添加各種濃度的DART-A,隨後添加可溶性人CD19-生物素。沖洗平板,並且用綴合鏈黴抗生物素的化學發光底物檢測免疫複合物。如圖3中顯示,DART-A能夠同時結合CD19和CD3二者。
通過流式細胞術在食蟹猴和人血液白細胞(從全血純化)中進一步評估DART-A的雙特異性結合。用濃度範圍是0.005至80nM的DART-A、對照DART 1或對照DART 2將白細胞染色約1小時。孵育之後,使用識別DART蛋白質的EK螺旋異源二聚化區域和鏈黴抗生物素
-PE的生物素化的抗E-螺旋/K-螺旋(EK)mAb檢測與白細胞的結合。因為DART-A結合CD3,CD4和CD8的組合用於明確T細胞群體。類似地,CD20而不是CD19用作B細胞標記物。所以,在此研究中,CD4+和CD8+設門事件表示T細胞群體和CD20+設門事件表示B細胞群體。DART-A顯示與人和食蟹猴B細胞和T細胞的雙特異性結合。相反,對照DART雙抗體僅僅顯示與B細胞(對照DART 2)或T細胞(對照DART 1)的單特異性結合,這與它們相應的結合特異性一致。人和食蟹猴B和T細胞的DART-A和對照DART雙抗體結合滴定曲線提供在圖4A-4B和圖5A-5B中。
範例4
使用人T細胞,DART-A-介導的對靶腫瘤細胞的重定向殺傷
使用純化的人初級T細胞作為效應細胞,在展示一定範圍CD19表達的3個靶B淋巴瘤細胞系:Raji/GF(伯基特淋巴瘤)、HBL-2(套細胞淋巴瘤)和Jeko-1(套細胞淋巴瘤)上評估DART-A介導重定向靶細胞殺傷的能力。Raji/GF細胞顯示最高水準的CD19表達,隨後是HBL-2細胞中中等水準的CD19表達和Jeko-1細胞中更低的CD19表達水準。使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗測量靶腫瘤細胞殺傷,在所述試驗中,定量測量細胞死亡時從細胞釋放的LDH的酶活性,或通過螢光素酶試驗測量靶腫瘤細胞殺傷,其中螢光素酶相對光單位(RLU)是指示Raji/GF靶細胞相對活力的讀數,所述靶細胞已經被工程化以表達綠色螢光蛋白(GFP)和螢光素酶報告基因二者。
當來自多個獨立人供體的純化的T細胞以10:1的效應子與靶(E:T)細胞比例使用時,DART-A在所有3個細胞系中展示有效的重定
向細胞殺傷(圖6A-6C)。在50%最大活性(EC50)值的平均有效濃度是:對於HBL-2細胞,1.05 x 10-1pM;對於Raji/GF細胞,3.07 x 10-1pM;和對於Jeko-1細胞,1.46 x 10-1pM(表5)。對照DART 1不介導T細胞重定向殺傷靶細胞。最重要地,在不表達CD19的細胞系(Molm-13和Colo205)中沒有觀察到細胞殺傷活性(圖6D-6F)。
為了評估DART-A在存在較少數量效應細胞的情況下的活性,在用DART-A孵育24至96小時之後,在Raji/GF細胞中以5:1、2.5:1和1:1的較低的E:T細胞比例測試重定向細胞殺傷。在5:1比例下觀察到的細胞毒素活性是在10:1比例下觀察到的最大活性的約一半;以2.5:1的E:T細胞比例在24和48小時兩個時間點都也觀察到更低的比活性(圖7A-7D和表5)。在孵育72或96小時之後,在2.5:1和1:1的比例下Raji/GF細胞的細胞毒性明顯增加(見圖8A-8D和表6)。值得注意的是,在更低的E:T細胞比例下,有效的細胞裂解在Raji/GF細胞中隨著時間的推移而增加,表明通過DART-A-啟動的T細胞的連續靶細胞殺傷。動力學表明時間是有效消除較大量靶細胞的低T細胞數量的限制因素。總之,來自使用來自不同供體的人T細胞的多個實驗的資料指示DART-A重定向細胞殺傷活性取決於E:T細胞比例和時間,尤其在較低的E:T細胞比例下。
範例5
人和食蟹猴PBMC中DART-A-介導的自體B細胞消耗
因為正常的B細胞表達CD19並且因為DART-A顯示與食蟹猴CD19和CD3交叉反應(實施例2,圖4A-4B和圖5A-5B),所以在人和食蟹猴外周血液單核細胞(PBMC)中都觀察到DART-A-介導的細胞毒性。在用DART-A處理之後,在人和食蟹猴PBMC二者中都觀察到劑量依賴性CD20+ B細胞消耗(圖9A-9B)。如預期地,在用對照DART 1處理之後,沒有觀察到B細胞消耗。
為了進一步確認PBMC中的DART-A活性,具有不同的T細胞(效應子)與B細胞(靶)E:T細胞比例的多個獨立的人或食蟹猴PBMC供體被用於評估效力。在總結中(表7),人B細胞消耗的EC50值的範圍是1.84至6.27pM;而食蟹猴B細胞消耗的EC50值在106.8至859.1pM之間。自體人B細胞消耗的DART-A的效力好像大於食蟹猴B細胞消耗的(平均為約100倍;範圍:19至312倍)。但是,值得注意的是,食蟹猴PBMC中的E:T細胞比例(平均約4:1)小於人PBMC中的E:T細胞比例(平均約8:1),考慮到DART-A重定向殺傷活性取決於E:T細胞比
例,這可能歸因於EC50值的較大差異。人和食蟹猴B細胞之間CD19表達水準的潛在差異可能是造成效力的明顯差異的另一可變因素。
重要地是,應注意當食蟹猴PBMC用作效應細胞時DART-A介導的針對Raji/GF靶細胞的有效的細胞毒性,其中EC50為1.30 x 10-2pM(圖10),類似於當人T細胞用作效應細胞時觀察到的(平均EC50=3.07 x 10-1pM),表明人和食蟹猴T細胞針對相同靶細胞系具有相當的活性。這些資料進一步支援食蟹猴在非臨床毒理學研究中作為評估DART-A的相關物種的用途。
範例6
使用人或食蟹猴效應細胞評估DART-A-介導的細胞因數釋放
人和食蟹猴PBMC中DART-A-介導的B細胞群體的消耗與人和食蟹猴PBMC中的細胞因數釋放相關。如在下麵表8中總結,細胞因數釋放的EC50值等於或大於人或食蟹猴自體B細胞消耗,表明DART-A在介導B細胞消耗方面比體外誘導細胞因數釋放更有效。體外人和食蟹猴之間的細胞因數釋放曲線具有一些相似性和差異。IFN-γ和TNF-α是在用DART-A處理之後在兩種物種中釋放的主要的細胞因數。但是,基於Emax值,IL-6是人中產生的第三種最主要的細胞因數,而IL-2僅僅在食蟹猴PBMC中大量產生。比較用DART-A孵育之後PBMC中產生的最靈敏細胞因數(人中IFN-γ、TNF-α和IL-6)的平均EC50值與自體B細胞消耗的平均EC50值,揭示了存在至少6倍表觀安全邊際(apparent safety margin),如在人中B細胞消耗和細胞因數產生之間的差異所反映的(表9)。
也研究了在存在靶細胞的情況下通過T細胞的DART-A-介導的細胞因數釋放。在與Raji/GF靶細胞共孵育之後,觀察到來自人T細胞的TNF-α、IFN-γ和IL-2的DART-A劑量依賴性細胞因數產生,其中針對IL-2(>7000pg/mL)觀察到最高水準(Emax)(圖11A-11C;表10)。也產生大量水準的TNF-α和IFN-γ(~2000-4000pg/mL)。如預期地,用對照DART雙抗體孵育不導致任何可檢測的細胞因數產生(圖11A-11C)。相比在靈敏度最小的靶細胞系(Raji/GF)中的靶細胞細胞毒性的平均EC50值,考慮到在用DART-A在存在表達CD19的靶細胞
(Raji/GF)的情況下孵育之後通過純化的人T細胞產生的最靈敏細胞因數(TNF-α)的平均EC50值,在靶細胞殺傷和細胞因數產生之間存在至少12倍表觀安全邊際(見上面表9)。
範例7
DART-A-介導的人和食蟹猴T細胞啟動的評估
通過評估T細胞啟動標記物CD69和CD25的表達表徵DART-A-介導的重定向靶細胞(Raji/GF細胞)裂解期間對T細胞的作用。在人和食蟹猴CD4+和CD8+ T細胞中CD25和CD69都以劑量依賴性方式被上調(圖12A-12D和圖13A-13D),指示DART-A-介導的重定向細胞殺傷與T細胞伴隨的啟動相關。在存在CD19-陰性JIMT-1細胞的情況下沒有觀察到T細胞啟動(圖14A-14D)。這些資料表明T細胞啟動依賴於靶細胞共銜接。進一步支持此結論,對照DART 1不介導T細胞啟動標記物的誘導(圖12A-12D和圖13A-13D)。
範例8
CD19 x CD3作用機制的評估
為了確認通過T細胞的CD19 x CD3-介導的重定向細胞殺傷的預期的機制是由粒酶B和穿孔蛋白介導,在CTL試驗中測量暴露於DART-A或對照DART 1之後T細胞中的細胞內粒酶B和穿孔蛋白的水
準。在用DART-A在存在Raji/GF靶細胞的情況下以10:1的E:T細胞比例孵育人T細胞24小時之後,觀察到CD8+和CD4+ T細胞中的粒酶B和穿孔蛋白水準的劑量依賴性上調(圖15A-15B)。相比之下,當人T細胞用Raji/GF靶細胞和對照DART 1孵育時,沒有觀察到粒酶B或穿孔蛋白的上調。這些資料支援了DART-A-介導的靶細胞殺傷可由粒酶B和穿孔蛋白途徑介導。重要地,粒酶B(圖15A)和穿孔蛋白(圖15B)的上調在CD8+ T細胞中比CD4+ T細胞中更高,這與預期的CD8+ T細胞更高的CTL效力一致。
考慮到先前已經報導了伴隨T細胞啟動的增殖,也評估了在由CD9 x CD3共銜接效應子:靶細胞期間T細胞的擴展。將CFSE標記的人T細胞與HBL-2靶細胞以10:1的E:T細胞比例在存在濃度為200ng/mL的DART-A或對照DART 1的情況下共培養。通過FACS分析經由CFSE稀釋的水準監測CFSE標記的T細胞隨著時間的推移的增殖(圖16A-16B)。圖16A顯示在存在DART-A或對照DART1和靶細胞的情況下CFSE-染色曲線。DART-A的添加導致增殖(CFSE稀釋),其中在72小時孵育之後約75%的細胞增殖(圖16B)。相反,在存在對照DART 1的情況下沒有觀察到CFSE標記的T細胞的增殖。
範例9
共混合(Co-Mix)異種移植物的功效
評估被注射與啟動的人T細胞共混的HBL-2(人套細胞淋巴瘤)或Raji(伯基特淋巴瘤)腫瘤細胞的雌性NOD/SCID小鼠(n=8/組)中DART-A對人B細胞淋巴瘤腫瘤生長的抑制。在兩個研究中,人T細胞和腫瘤細胞(HBL-2或Raji)以1:5的比例(分別為1 x 106和5 x 106個細胞)組合,並且在第0天SC注射至小鼠。隨後在第0、1、2和3天IV施用
媒介對照(僅腫瘤細胞)、DART-A或對照DART 1。
如在圖17中顯示,在用劑量水準0.2μg/kg的DART-A進行IV處理之後HBL-2腫瘤細胞的生長被完全抑制。儘管用0.02μg/kg DART-A處理好像延遲了HBL-2腫瘤的生長,但是應答不是統計上顯著的。到第13天,媒介和對照DART組中的HBL-2腫瘤達到的平均腫瘤體積是約1000mm3。
如圖18中,直到研究結束(第28天),在所有評估的劑量(0.8至100μg/kg)下,在用DART-A處理的小鼠中沒有觀察到明顯Raji腫瘤細胞的生長。用0.8μg/kg DART-A處理導致8只小鼠的7只小鼠中的完全應答。媒介和對照DART 1組中的Raji腫瘤表現體內腫瘤生長,其中到研究結束時(第28天)平均腫瘤體積分別達到2449.4±421.1mm3和2968.2±200.0mm3。
範例10
建立的腫瘤模型中的功效
在雌性NSG B2m-/-小鼠(n=8/組)中,評估DART-A在HBL-2(人套細胞淋巴瘤)異種移植模型中的抗腫瘤活性。小鼠在第0天被真皮內(ID)移植以HBL-2腫瘤細胞(5 x 106個細胞),隨後在第4天被腹膜內(IP)注射PBMCs(5 x 107個細胞)。在第17天開始用IV施用的媒介、對照DART 1或DART-A進行處理,此時接收媒介、對照DART 1或DART-A的組的平均腫瘤體積分別是438.4±80.2、433.7±63.8和531.7±122.5mm3。在第21天(第二劑量施用),用媒介、對照DART 1和DART-A處理的組中,平均腫瘤體積已經分別增加至1306.1±240.4、1185.6±138.7和958.5±216.1mm3。在第24天(第三劑量施用),媒介和對照DART 1組中的平均腫瘤體積已經分別增加至2401.3±
397.4和2623.7±351.5mm3。相反,接受DART-A的組中的體積已經減小45%,達到527.3±148.3mm3。在DART-A處理的組中,腫瘤的尺寸繼續減小,最終在第42天達到終體積111.4±38.9mm3,從記錄的最大腫瘤體積減小了88.3%(圖19A)。總之,用0.5mg/kg的DART-A處理導致建立的大的HBL-2套細胞淋巴瘤腫瘤縮小。在研究結束時的第42天沒有復發被記錄。
在研究的第14天,平均腫瘤尺寸為541mm3的另一組荷瘤小鼠(n=4小鼠)按計劃用500μg/kg DART-A處理。在第一劑量(研究的第17天)時,腫瘤已經達到的平均體積是2279±61mm3(圖19B)。但是,在第三(研究的第24天)和第四(研究的第28天)劑量時,腫瘤體積分別達到1469±162和848±74mm3,代表腫瘤體積相對於在研究的第21天記錄的峰體積分別減小36%和63%(圖19B)。腫瘤的尺寸繼續減小至在第42天達到的程度,平均腫瘤體積是248±52mm3,腫瘤體積減小89%(圖19B)。
範例11
食蟹猴中DART-A的毒代動力學研究
在食蟹猴中進行非GLP(良好實驗室規範(Good Laboratory Practice))毒理學研究,以評估DART-A的不同劑量和方案(regime)。首先進行A階段,以評估每個連續周,達4周,的動物內遞增劑量的DART-A的2-小時IV輸注,如在表11中總結(A階段)的。在第36天或第64天處死每組中一半的A階段食蟹猴(1M/1F)。隨後進行B階段的研究,以評估每個組中作為固定劑量施用的DART-A的2-小時IV輸注(表11,B階段)。對於第3、4和5組,每個連續周施用相同劑量(分別為5、50或500ng/kg),每個動物總共3個劑量。對於組6,在研究的第1、4、
8、11和15天施用500ng/kg,作為2-小時IV輸注,每個動物總共5個劑量。在第18天處死所有B階段動物。
1.食蟹猴中DART-A的毒代動力學研究(A階段)
在食蟹猴中進行非GLP、實驗性、探索性劑量遞增的DART-A研究。在研究的A階段,第1、8、15、22和29天,向兩組食蟹猴(n=4/組;2M/2F)施用內部遞增劑量的媒介(第1天)或DART-A,作為2-小時IV輸注。組1中的食蟹猴接受媒介對照→500→5000→50,000→50,000ng/kg DART-A。組2中的食蟹猴接受媒介對照→2000→10,000→100,000→100,000ng/kg DART-A。在第36天或第64天處死每組中A階段中一半的食蟹猴(1M/1F)。
在研究的A階段沒有DART-A相關的死亡率,並且沒有DART-A相關的肉眼可見的改變或器官重量改變。但是,在500ng/kg的劑量水準存在DART-A相關的作用,如下面詳述。這些作用與測試物品的藥理學一致,並且不認為是細胞毒性顯著的。
在A階段的第36天,對於所有組1和2動物,DART-A相關的顯微鏡發現限於淋巴結(腹股溝、下頜和腸系膜)、脾和腸相關的淋巴組織(GALT),其中到第64天沒有恢復顯微鏡發現。在第36天,淋巴結和脾中的顯微鏡發現是類似的,其包括鑒定的淋巴樣濾泡生髮中心數量和尺寸的中等(moderate)至顯著(marked)的減少;在GALT中,淋巴樣濾泡生髮中心的數量和尺寸減小最少。到第64天,測試物品相關的發現仍存在於淋巴結、脾和GALT中;在淋巴結和脾中,顯微鏡發現包括淋巴樣濾泡生髮中心輕微(mild)至顯著的數量和尺寸的減小,並且在GALT中,淋巴樣濾泡生髮中心的數量和尺寸減小最少。
通過免疫組織化學(IHC)評估骨髓(胸骨)、淋巴結(腹股
溝、下頜和腸系膜)和脾,揭示在第36天在A階段動物中CD20陽性細胞數目的大大減少,到第64天僅僅部分恢復CD20染色。在第36天,在A階段動物的骨髓或淋巴結中大體上沒有注意到CD20陽性染色,除了來自組1的一個動物,其中僅僅分別在腹股溝淋巴結的生髮中心和淋巴細胞冠(corona)存在非常稀少(very rare)的、輕微至中等的CD20陽性染色。在脾中,僅僅在3個動物的紅髓中鑒定了CD20陽性細胞(1個動物來自組1;2個動物來自組2),CD20陽性細胞的頻率是非常稀少至稀少(rare)和最低(minimal)或輕微至中等強度。
在恢復的動物中(第64天),僅僅在組1動物的骨髓中注意到非常稀少至偶爾、中等染色的CD20陽性細胞。在淋巴結(腹股溝、下頜和腸系膜)中,僅僅在來自組1的一個動物中鑒定了CD20陽性染色;CD20陽性細胞的頻率通常在所有淋巴結中大大降低,而陽性細胞的染色強度是中等至顯著。在所有組1和2動物的脾中鑒定了CD20陽性細胞。在組1動物中,在一個動物的淋巴樣濾泡、微動脈周圍淋巴鞘(PALS)和紅髓中和另一動物的PALS和紅髓中鑒定了CD20陽性細胞。在組2動物中,僅僅在紅髓中鑒定了非常稀少至稀少的CD20陽性細胞,其具有輕微染色強度。
下面總結了在此研究的A階段部分中對基於FACS的B細胞消耗、細胞因數和ADA的評估。
a.對於B、T、NK細胞以及單核細胞的FACS評估
為了各種淋巴細胞亞組和單核細胞細胞群的流式細胞術評估,收集全血樣品。在-1周;在第1、8、15、22和29天給藥之前;在第2、9、16、23和30天開始輸注(SOI)後24小時;在第4、11、18、25和32天SOI後72小時;在第35天;和在43、50、57和63天,評估A階段
動物(僅僅應用於來自每組的一半A階段食蟹猴,在第64天執行恢復處死(recovery sacrifice))。
對於兩個組(組1和2),在第9天(SOI後24小時)開始出現B淋巴細胞(CD20+)的絕對計數的劑量依賴性減少。在第11和15天,對於500ng/kg/劑量動物(組1),B淋巴細胞群趨向于研究前水準,而對於2000ng/kg/劑量動物,此值(組2)保持減少。對於兩個劑量組,在第二DART-A劑量施用之後的第16天(SOI後24小時)B淋巴細胞實質上被消耗,並且對於所有隨後的時間點仍被消耗(圖20A-20B)。B淋巴細胞消耗是DART-A預期的藥理學作用。
通過流式細胞術也評估了其他免疫細胞群,包括單核細胞、天然殺傷細胞(NK)和T細胞。
對於以2000ng/kg被投藥的大部分動物(組2),在SOI後24小時的第9天開始出現CD14+單核細胞數量的暫態、劑量依賴性減少。對於分別以5000ng/kg和50,000ng/kg被投藥的大部分動物(組1)和對於分別以10,000ng/kg和100,000ng/kg被投藥的所有動物(組2),在第16天和第23天,SOI後24小時,也出現CD14+單核細胞數量的減少。CD14+單核細胞群在每次輸注結束時快速恢復,並且在隨後劑量之後24小時再次減少之前到下一給藥時間點前,一般達到或超過研究前基線值。在給藥階段結束時,CD14+單核細胞值波動,其趨於朝著研究前水準並且保持處於或高於研究前基線水準的值。
也觀察到了總T淋巴細胞、CD4+ T淋巴細胞、CD8+ T淋巴細胞、T調節性淋巴細胞(CD4+/CD25+/FoxP3+)、CD159a+ NK細胞、CD16+ NK細胞和CD16+/CD159a+ NK細胞的暫態、劑量依賴性減少,其中在第9天(SOI後24小時)對2000ng/kg/劑量動物(組2)觀察到
最大減少,隨後在第16天(SOI後24小時)在組1動物中5000ng/kg/劑量觀察到最大減少。T淋巴細胞和NK細胞亞組在每次輸注結束時快速恢復,並且,在每次給藥後24小時再次減少之前,在第15和22天下一次給藥之前,通常達到或超過研究前基線水準,然後。對於組1或2,在第29天施用劑量後的第30天(SOI後24小時),沒有出現進一步減少。
針對啟動標記物PD-1、TIM-3、CD25和CD69的上調,評估CD4+和CD8+ T淋巴細胞群,以確定DART-A劑量施用之後的細胞的啟動狀態。在給藥之後,在CD4+ T淋巴細胞中PD-1+、CD69+和CD25+存在不同的增加頻率和在CD8+T淋巴細胞中PD-1+和CD69+存在不同的增加頻率,表明給藥之後在全血中啟動的CD4+和CD8+T淋巴細胞的頻率的增加。在第9天(SOI後24小時)開始,CD4+ T淋巴細胞中的CD69+、PD-1+和CD25+的頻率(在較小程度上,在一些但不是所有的動物中發生)和CD8+ T淋巴細胞中的PD-1+和CD69+的頻率在500ng/kg(組1)和2000ng/kg(組2)劑量之後增加。這些值一般保持高於基線水準並且對於所有的隨後時間點高度可變。CD25+/CD69+、TIM-3+和PD-1+/TIM3+淋巴細胞群的相對百分數一般<1%的總CD4+和CD8+ T淋巴細胞群,使得難以評估任何DART-A相關的改變。總體上,這些資料表明DART-A施用導致在CD4+和CD8+ T淋巴細胞上PD-1和CD69表達的向上趨勢以及在一些但不是所有動物中的CD4+ T淋巴細胞中的CD25+的更適度的增加。
b.細胞因數評估
在給藥前和在每次輸注開始後4和24小時,測定血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水準(EMD Millipore試驗)。當食蟹猴在2-小時時間內通過IV輸注被施用遞增劑量範圍是中
500至50,000ng/kg(組1)和2000至100,000ng/kg(組2)的前3個劑量時,在輸注開始之後4小時觀察到IL-10水準的暫態DART-A劑量相關的增加(多達1918pg/mL);在輸注開始之後24小時之內水準通常返回到基線。在任一組中,在最後DART-A輸注(組1中50,000ng/kg或組2中100,000ng/kg)開始之後4小時通常沒有檢測到IL-10,有一個例外(動物2502)。動物2502在最後一次給藥(在第29天,100,000ng/kg)之後經歷了暫態IL-10增加至332pg/mL,但是此增加的量級低於在第22天第一次100μg/kg劑量(570pg/mL)之後的IL-10增加。經歷最高IL 10水準(在第22天,1918pg/mL)的一隻食蟹猴(動物1001)以50,000ng/kg劑量水準也經歷了IL-2(32pg/mL)、IL 5(45pg/mL)和IL-6(357pg/mL)的同時暫態增加。在輸注DART-A之後的4小時,在大部分食蟹猴中觀察到了IL-6水準的暫態增加;但是,與在沒有明顯劑量回應的第1天輸注媒介對照(多達190pg/mL)之後觀察的水準比較,此增加一般是類似的,或量級更低(上述動物1001例外)。沒有明顯的與增加的細胞因數水準相關的臨床觀察。
在輸注DART-A之後,IL-5、IL-4、IL-2、IFN-γ或TNF-α的水準沒有一致的變化。在第15天或22天DART-A輸注之後,在經歷小的暫態增加(~10-20pg/mL;上面討論的動物1001除外)的各組約一半的動物的IL-5水準是變化的。IFN-γ的水準在整個研究中也是變化的,在一些動物中在輸注之後有小的(<~10pg/mL)暫態增加。
2.食蟹猴中DART-A的毒代動力學研究(B階段)
在研究的B階段,4組食蟹猴(n=2/組;1M/1F)被施用固定劑量的DART-A,作為2-小時IV輸注,其中在第1、8和15天為組3(5ng/kg)、組4(50ng/kg)和組5(500ng/kg)施用3個劑量;和在第1、4、
8、11和15天為組6(500ng/kg)施用5個劑量。所有B階段動物在第18天被實施安樂死。
在研究的B階段期間沒有DART-A相關的死亡率,並且沒有DART-A相關的肉眼可見的或器官重量改變。
在第18天,DART-A相關的顯微鏡發現限於組4、5和6動物的淋巴結(腹股溝、下頜和腸系膜),其包括由包括脾中PALS的淋巴樣組織的尺寸和/或細胞密度沒有明顯改變而鑒定的淋巴樣濾泡生髮中心的數量和尺寸的最小至輕微減少。沒有報導在組3(5ng/kg)中注意到了顯微鏡發現。
通過IHC,針對表達CD20的細胞群評估骨髓(胸骨)、淋巴結(腹股溝、下頜和腸系膜)和脾的另外的福馬林固定的石蠟包埋的切片(Mordenti,J.等(1991)“Interspecies Scaling Of Clearance And Volume Of Distribution Data For Five Therapeutic Proteins,”Pharm.Res.8(11):1351-1359)。組3、4、5或6的骨髓(胸骨)、淋巴結(腹股溝、下頜和腸系膜)或脾中的CD20陽性細胞的分佈和/或染色強度沒有可感知的(appreciable)差異。在所有組織中,陽性染色與細胞膜相關。一般而言,在骨髓中,偶爾的CD20陽性細胞遍佈骨髓基質分佈,並且陽性細胞的染色強度是中等至顯著。在淋巴結中,CD20陽性細胞主要與生髮中心和濾泡的淋巴細胞冠相關,其中較少數的CD20陽性細胞位於副皮質、髓索和髓竇和被膜下竇中。生髮中心、淋巴細胞冠、髓索和髓竇以及被膜下竇的染色強度是中等至顯著。副皮質中的染色強度是輕微至顯著。在脾中,CD20陽性細胞主要與生髮中心、濾泡套(follicular mantle)和淋巴樣濾泡的邊緣區相關,其中較少的CD20陽性細胞在PALS和紅髓內並且染色是中等至顯著強度。
下面總結了此研究B階段部分的基於FACS的B細胞消耗、細胞因數和ADA的評估。
a.對B細胞、T細胞、NK細胞和單核細胞的FACS評估
收集全血樣品用於對各種淋巴細胞亞組和單核細胞細胞群進行流式細胞術評估。在-1周;在第1、4(僅僅組6)、8、11(僅僅組6),和15天投藥之前;在第2、9和16天SOI後24小時;和在第4天和第11天SOI後72小時(僅僅組3-5),評估B階段動物。
在第1、8和15天在開始輸注施用的劑量之後的24小時,B淋巴細胞(CD20+)的總數存在明顯的劑量依賴性減少。對於5ng/kg(組3)、50ng/kg(組4)和500ng/kg(組5和6)處理組的最大減少出現在第2天(SOI後24小時)。在組3和4中B淋巴細胞群在每次輸注後快速恢復,並且在所有其他時間點呈現研究前基線水準附近的波動值。組5和6在給藥之間呈現最小的恢復並且通常在第2天之後的所有時間點保持減小的值(圖21A-21D)。持續的B淋巴細胞消耗是預期的較高劑量的DART-A的藥學作用。
也通過流式細胞術評估了其他免疫細胞群,包括單核細胞、NK細胞和T細胞。
對於所有劑量組(組3-6)中的大部分動物,總的CD14+單核細胞在第2天(SOI後24小時)開始出現暫態劑量依賴性減少。在第9和16天,所有劑量組中的大部分動物也出現CD14+單核細胞的另外的改變,並且值是高度可變的。
總T淋巴細胞、T調節性淋巴細胞(CD4+/CD25+/FoxP3+)、CD4+ T淋巴細胞、CD8+ T淋巴細胞和NK細胞亞組的數目存在暫態劑量依賴性減少,其中所有組(組3-6)最大的減
少一般出現在第2天(SOI後24小時)。T淋巴細胞亞組在每次輸注之後快速恢復,並且在所有組中在下一次輸注之前,所有的劑量通常達到或超過研究前水準。對於50ng/kg(組4)、500ng/kg(組5)和多劑量的500ng/kg(組6)給藥的動物,CD4+、CD8+和T調節性淋巴細胞的另外的減少也出現在第9和16天(SOI後24小時);但是,相比在第一次DART-A給藥後第2天出現的那些減少,在這些時間點出現的減少具有較低的量級。NK細胞亞組通常在輸注的第一天后趨於恢復,並且在所有剩餘的時間點呈現可變的值。
評估CD4+和CD8+ T淋巴細胞群的啟動標記物PD-1、TIM-3、CD25和CD69的上調,以確定在DART-A劑量施用之後的細胞的啟動狀態。CD4+和CD8+ T淋巴細胞群中CD25+/CD69+(僅僅對於CD4+ T淋巴細胞)、TIM-3+和PD-1+/TIM3+的相對百分數通常<總CD4+和CD8+ T淋巴細胞群的1%,使得難以評估任何DART-A相關的改變。在組5和6中,對於500ng/kg/劑量動物,在第2天(SOI後24小時)開始,在多個時間點存在CD4+和CD8+ T淋巴細胞中PD-1+和CD69+頻率的增加。另外,對於500ng/kg/劑量動物(組5和6),在第2天(SOI後24小時)開始,出現CD4+和CD8+ T淋巴細胞中CD25+的頻率更適度的增加,以及對於多劑量500ng/kg/劑量動物(組6),CD8+ T淋巴細胞中CD25+/CD69+相對百分數的增加。與在第2天出現的那些增加的量級相當的增加通常也在隨後劑量後出現第9和16天(SOI後24小時)。共同地,這些資料指示DART-A施用導致CD4+和CD8+ T淋巴細胞上PD-1、CD69和CD25表達的上升趨勢。
b.細胞因數評估
在第-7、8和15天給藥之前;和在第1、8和15天開始輸注
後4和24小時,測定血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水準(EMD Millipore試驗)。當食蟹猴被施用5、50或500ng/kg的DART-A劑量時(組3-6),在第一次DART-A輸注開始後4小時後觀察到IL-10水準的暫態和劑量相關的增加(多達173pg/mL);此水準通常在輸注開始的24小時內返回到基線。相比第二和第三劑量之後的IL-10增加(所有動物中<22pg/mL,下述動物5001除外),在第一劑量的DART-A之後,在所有組中IL-10的增加好像更明顯,表明在第一次給藥之後,細胞因數釋放的“脫敏”和/或負責T細胞啟動的靶細胞群體的快速減少/消除。在所有劑量組的一些動物中,每次DART-A輸注開始後4小時不定地觀察到IL-6水準的暫態增加(多達162pg/mL),其中此水準通常在24小時內返回到基線水準或其附近。但是,基於從A階段中媒介施用產生的資料,其中觀察到IL-6水準增加多達190pg/mL,B階段中IL-6波動的水準(162pg/mL)可能未必反映藥物相關的回應。貫穿此研究,沒有觀察到IL 5、IL-4、IL-2、IFN γ或TNF-α水準的一致的改變。
一隻食蟹猴(動物5001)在第二次DART-A輸注之前的第8天經歷升高水準的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL5和IL-10。在第8天第二次輸注後4小時,細胞因數(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α)水準進一步增加或保持穩定(IL-2)。到第二次給藥第24小時,細胞因數水準開始下降,其中在第15天第三次DART-A輸注之後一些細胞因數的增加不同。儘管所有的細胞因數水準從它們的峰值下降,但是在此食蟹猴中細胞因數水準在評估的最後時間點(第16天)仍高於基線水準。沒有與增加的細胞因數水準相關的明顯的臨床觀察。
範例12
人FcRn轉基因小鼠中的Ig樣半衰期
使用可獲得自Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,US的人FcRn轉基因小鼠株B6.Cg-Fcgrttm1Dcr(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ小鼠(庫存號(Stock Number)004919)進行人FcRn轉基因小鼠藥物代謝動力學(PK)研究,以評估DART-A和對照DART 1(圖22)。終期半衰期分別是85.6和92.1小時。在相同的測試系統中,也評估了三個人mAb用於比較,其終期半衰期範圍是58.7至102.7小時。
範例13
人PBMC-重構的小鼠中散佈的Raji細胞白血病/淋巴瘤模型中的功效
使用螢光素酶-轉導的Raji淋巴瘤細胞(Raji.luc)在用人PBMC重構的雌性NSG B2m-/-小鼠中建立散佈的腫瘤模型,其中小鼠在腫瘤細胞注射後一天(“早期處理”或白血病範例)或在體內生長至少兩周後(“建立的腫瘤”或淋巴瘤模型)用媒介、對照DART 1或DART-A處理。
早期處理模型
在第-14研究天人PBMC重構之後,在第0研究天注射Raji.luc淋巴瘤細胞並且在第二天(第1研究天)開始處理。每3-4天IV注射媒介對照、0.5mg/kg對照DART 1或0.5mg/kg DART-A一次,總共12個劑量(即,第1、4、6、8、11、13、15、18、20、22、25和27研究天)。從第54研究天或第56研究天跟蹤小鼠的生存。
在接收媒介或對照DART 1的組中,彌漫性散佈的腫瘤細胞剖面(profile)快速聯合,並且到第2和3周在大部分小鼠中擴張。最早在腫瘤細胞移植後兩周注意到在這兩個對照組中的動物死亡。媒介或對
照DART 1組中的所有的小鼠到第40或53研究天分別死亡或人道地處死(即,如果動物垂死或失去大於它們15%的體重)。圖23描繪了生存曲線。相反,用DART-A處理的組在任何時間點都顯示沒有腫瘤細胞生長並且到研究結束時沒有觀察到動物死亡。圖23描繪了生存曲線。
在隨後實驗中在上述相同實驗條件下進行劑量範圍發現研究,除了每3-4天IV注射0.16μg/kg、0.8μg/kg、4μg/kg、20μg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg DART-A一次,共12個劑量(即,第1、4、6、8、11、13、15、18、20、22、25和27研究天)。在相同研究天如上述施用媒介和對照DART 1。在用媒介或對照DART 1處理的小鼠中觀察到Raji.luc腫瘤生長的快速進展。在所有測試劑量下DART-A均顯示功效,其中在低至20μg/kg的劑量下,大部分小鼠是活的(>8%)並且在研究結束時(第56天)無腫瘤(圖24)。
建立的腫瘤模型
在不同的實驗組中測試了當延遲處理時CD19 x CD3控制Raji.luc細胞腫瘤負荷的能力。在建立的腫瘤模型中,以第0研究天(約PBMC注射後一周)的Raji.luc細胞IV接種人-PBMC-重構的小鼠並且允許生長14天,然後開始處理。
在第12研究天基於腫瘤負荷將小鼠隨機分成3組,並且隨後在第14研究天(Raji.luc細胞接種後2周)開始用媒介、0.1mg/kg DART-A或0.5mg/kg DART-A處理,共10個劑量(即,第14、15、16、19、21、23、30、33、35和37研究天)。在媒介對照組中,到處理的第一周結束時,初始病灶的尺寸明顯增加,並且在處理開始的2周內5/7小鼠死亡(圖25)。相反,在處理的第一周期間,在兩個DART-A處理組中大部分動物的腫瘤負荷顯著減小或清除。每個DART-A處理組中的僅僅
一隻動物,每個在隨機化時具有相對高的腫瘤負荷,在處理的第一周死亡(圖25)。到第50研究天,0.1mg/kg DART-A處理組中的僅僅2只小鼠仍有外周腫瘤。
在上述一般的實驗條件下在延遲處理模型中進行劑量範圍發現研究。在此實驗中,在第0研究天(PBMC注射後5天),給人PBMC-重構的小鼠IV接種Raji.luc細胞,並且允許生長至第14研究天,然後隨機化。在第15研究天,用媒介、0.1mg/kg對照DART 1或0.16μg/kg、0.8μg/kg、4μg/kg、20μg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg DART-A開始處理,共9個劑量(即,第15、17、21、23、25、28、30、32和35研究天)。
在媒介對照組中,腫瘤負荷逐漸增加並且在處理的第二周結束時所有的小鼠死亡或被處死(圖26)。用0.1mg/kg對照DART 1處理的小鼠與媒介處理的小鼠相比顯示腫瘤進展的稍微延遲(圖26)。相反,用DART-A處理的動物中的腫瘤負荷顯示隨著時間的推移大體上劑量依賴性減小(圖26)。
範例14
食蟹猴中DART-A的藥代動力學
基於與基於用前體mAbs進行的免疫組織化學的人相比在此物種兩個靶抗原的同樣分佈,將食蟹猴選擇為用於DART-A分析的適當的藥理學模型。
根據本發明進行的研究包括5個處理組,由10只食蟹猴/組(5只雄性、5只雌性)組成。對於在第1天第一次輸注,在2小時內用媒介對照通過IV輸注處理組,隨後用媒介對照(組1)或DART-A(組2-5)處理,每週一次,持續四周。當組1動物對於所有的4次隨後輸注繼續接收
媒介對照時,組2-5的動物對於所有隨後輸注在第8、15、22和29天接受0.2μg/kg、2μg/kg、5μg/kg或10μg/kg的DART-A(表12)。三隻雄性和3只雌性在第37天被實施安樂死並且進行屍體剖檢,而剩餘的恢復組猴子(2只雄性和2只雌性)在12-周恢復時間後的第121天被實施安樂死並且進行屍體剖檢。
用ELISA進行在各個時間點收集的血清中的DART-A的濃度分析。來自組5的代表性動物的DART-A血清濃度-時間曲線顯示在圖27中。在0.2、2、5和10μg/kg劑量之後評估PK參數(二室模型(two-compartment model))(表13)。一般而言,在評估的劑量範圍中,觀察到了最大血清濃度(Cmax)和AUCinf的劑量比例增加。儘管主要PK參數的若干成對劑量比較存在差異,但是總體上,在表明線性PK的可評估的劑量中,DART-A的清除(CL)、室間清除(CLD2)和分佈的體積(V1和V2)的變化沒有一致的趨勢。組2-5的動物中的CL值小於食蟹猴的腎小球濾過率(GFR)(~125mL/h/kg),這表明實際上沒有通過腎過濾發生消除,如對於此分子量的蛋白質(109.3kDa)所預期的。組2、3、4和5動物的平均初始分佈體積(V1)與食蟹猴中的血漿體積(~45mL/kg)類似或比其稍大,表明通過結合於靶細胞DART-A在中心室中的少許消耗。平均β-階段半衰期和MRT顯示隨著增加劑量而增加的趨勢,其中平均β
半衰期(t1/2,β)是161小時(6.7天)和平均滯留時間(MRT)是191小時(8天)。值得注意的是,僅來自GLP研究的三隻動物(2μg/kg劑量組中,n=1;5μg/kg劑量組中,n=2)在第二次和隨後的DART-A輸注(n=2)之後或在第四次DART-A輸注(n=1)之後具有異常的PK曲線,並且隨後被確認對於ADA是積極的。因此,對於這3只動物,從PK建模中排除了在受影響的輸注迴圈之後的血清濃度資料。
DART-A處理的食蟹猴中的細胞因數釋放
在第1、8、15、22和29天,在輸注之前和在輸注結束後2和22小時收集血清樣品,以評估細胞因數水準。評估的細胞因數是TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。
相對於在輸注結束後2小時發生的細胞因數水準的最大增
加,在第一次DART-A輸注(第8天)之後觀察到IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水準的增加,。在>2μg/kg的劑量水準觀察到IL-10和IFN-γ的DART-A劑量依賴性增加,而在5μg/kg的劑量水準觀察到IL-6的增加。TNF-α水準的改變小並且僅僅在最高劑量水準(10μg/kg)被觀察到。細胞因數水準的改變是暫態的,並且在輸注開始的24小時內返回到基線或其附近,並且沒有與這些增加的細胞因數水準相關的臨床觀察。在第15、22和29天的DART-A的隨後輸注導致較小的細胞因數水準增加,通常與對照製品輸注之後觀察到的那些水準增加相當。在個體動物中IL-2、IL-4和IL-5的平均水準顯示不同的和孤立的改變,但是在整個研究期間在所有組中保持<20pg/mL,並且不被認為是毒理學上顯著的。
接收0.2μg/kg DART-A的動物中的細胞因數水準與在對照製品輸注之後的觀察的變化相當(組1)。
食蟹猴中DART-A-介導的迴圈B細胞的消耗
在整個研究期間測量B細胞、T細胞,包括T細胞亞組(CD4 vs CD8)和啟動標記物(CD25、CD69、PD-1和TIM-3)、和NK細胞的迴圈絕對水準,作為藥效終點(pharmacodynamic endpoint)。在輸注之前和在第1、8、22和29天輸注結束後2、22和70小時,收集樣品,然後在第37天進行末期屍體剖檢,然後在第36、43、50、57、64、78、92、106和119天的恢復期間的每週一次或每兩一次周收集樣品。
圖28顯示DART-A處理導致期望的靶群體CD20+ B細胞的劑量依賴性消耗。到以劑量水準2μg/kg第一次輸注DART-A開始之後的24小時,觀察到CD20+細胞的完全或幾乎完全消耗。在整個處理期間CD20+ B細胞的消耗是持久的,並且在最後劑量之後持續3-5周。在12周恢復期間的最後數周,存在CD20+ B細胞劑量依賴性返回到劑量
前水準。
範例15
CLL原發性患者樣品中惡性B細胞的自體消耗
為了評估CLL原發性患者樣品中DART-A-介導的溶細胞活性,用DART-A或對照DART 1孵育患者PBMC。由於受限的患者樣品可用性,僅僅測試了2個濃度(50ng/mL和200ng/mL)。在處理之前和處理3天和6天之後,通過流式細胞術測量CLL惡性B細胞(CD19+/CD5+或CD20+/CD5+)和T細胞(CD19-/CD5+或CD4+和CD8+)的百分數。在測試濃度下的DART-A部分阻礙了抗CD19抗體的染色,所以,在用DART-A處理之後不適合使用CD19+/CD5+對惡性B細胞設門。因此,通過在DART-A處理之後對CD20+/CD5+細胞設門測定惡性B細胞消耗。
從CLL惡性B細胞和T細胞頻率測定的E:T比例一般1:10。在顯示的代表性CLL供體實驗中,基於僅僅占總PBMC的4%的CD19-/CD5+ T細胞和約90%的PBMC被鑒定為CD19+/CD5+惡性B細胞,在處理之前E:T細胞比例是約1:23。圖29A-29I和表14顯示與CLL患者樣品相比DART-A處理的效果。用CLL PBMC孵育DART-A導致在兩個評估的DART-A濃度下惡性B細胞的時間依賴性消耗,伴隨著在第6天觀察的T細胞(CD4和CD8)的同時增加。另外,在DART-A處理6天后,T細胞啟動標記物CD25被上調,表明在重定向殺傷惡性B細胞期間,DART-A誘導T細胞啟動。相反,到第6天,用對照DART 1沒有觀察到CD25的B細胞殺傷或上調。
值得注意的是,在兩個評估的濃度下,DART-A介導相同水準的殺傷,但是殺傷的水準隨著時間的推移增加,其中在第3天和第6
天分別約40%和85%的惡性B細胞被殺傷,表明當存在足夠的DART-A時,此時間在低T細胞與靶比例下是有效消耗靶細胞的關鍵因素。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文,如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明,但是應當理
解,其能夠被進一步更改並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變,並且包括與本公開的偏離,只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
<110> 美商宏觀基因股份有限公司(MacroGenics,Inc.)
<120> 能夠結合CD19和CD3的雙特異性雙抗體及其用途
<130> PCT/US2015/051314
<150> US 62/055,695
<151> 2014-09-26
<160> 48
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間插間隔肽(連接體1)
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體2
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的連接體
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> IgG1鉸鏈結構域
<210> 5
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促進異源二聚體的結構域
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促進異源二聚體的結構域
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促進異源二聚體的結構域
<210> 10
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> K-螺旋促進異源二聚體的結構域
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
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<223> 〞包含臼的〞CH2-CH3結構域
<210> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變輕鏈
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變輕鏈的CDR1
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變輕鏈的CDR2
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變輕鏈的CDR3
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變重鏈
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變重鏈的CDR1
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變重鏈的CDR2
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19抗體的可變重鏈的CDR3
<210> 25
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變輕鏈
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變輕鏈的CDR1
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變輕鏈的CDR2
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變輕鏈的CDR3
<210> 29
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變重鏈
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變重鏈的CDR1
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變重鏈的CDR2
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD3抗體的可變重鏈的CDR3
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體4
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合結構域(ABD)
<210> 35
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-A的第一多肽鏈
<210> 36
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-A的多核苷酸(SEQ ID NO:35)
<210> 37
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-A的第二多肽鏈
<210> 38
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-A的第二多肽鏈的多核苷酸(SEQ ID NO:37)
<210> 39
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART-A的第三多肽鏈
<210> 40
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼DART-A的第三多肽鏈的多核苷酸
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗螢光素抗體4-4-20的可變重鏈結構域
<210> 43
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 對照DART 1的第一多肽鏈
<210> 44
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 對照DART 1的第二多肽鏈
<210> 45
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 對照DART 2的第一多肽鏈
<210> 46
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 對照DART 2的第二多肽鏈
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間插間隔肽(連接體4)
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間插間隔肽(連接體4)
VL:結構域
VH:結構域
Claims (18)
- 一種能夠特異性結合CD19和CD3的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中該雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈,其中該些多肽鏈形成共價結合的複合物,和其中:I.該第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括:A.結構域IA,其包括(1)亞結構域(IA1),其包括能夠結合CD19(VLCD19)或CD3(VLCD3)的VL結構域;和(2)亞結構域(IA2),其包括能夠結合CD19(VHCD19)或CD3(VHCD3)的VH結構域;其中該亞結構域IA1和IA2通過多肽連接體彼此分開,並且是(a)VLCD19和VHCD3;或(b)VLCD3和VHCD19;B.結構域IB,其包括帶正電或帶負電的螺旋結構域,其中該結構域IB通過多肽連接體與該結構域IA分開;C.結構域IC,其包括抗體的CH2-CH3結構域;和II.該第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括:A.結構域IIA,其包括(1)亞結構域(IIA1),其包括能夠結合CD19(VLCD19)或CD3(VLCD3)的VL結構域;和(2)亞結構域(IIA2),其包括能夠結合CD19(VHCD19)或CD3(VHCD3)的VH結構域; 其中該亞結構域IIA1和IIA2通過多肽連接體彼此分開,並且是:(a)VLCD19和VHCD3,前提是該亞結構域IA1和IA2是VLCD3和VHCD19;或(b)VLCD3和VHCD19,前提是該亞結構域IA1和IA2是VLCD19和VHCD3;B.結構域IIB,其包括帶正電或帶負電的螺旋結構域,其中該結構域IIB通過多肽連接體與該結構域IIA分開,和其中該結構域IB的該帶電的螺旋結構域和該結構域IIB的該帶電的螺旋結構域具有相反的電荷,其中該結構域IB和該結構域IIB的該帶電的螺旋結構域中的一者包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列,且該結構域IB和該結構域IIB的該帶電的螺旋結構域中的另一者包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列;和III.該第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括結構域IIIC,其包括抗體的CH2-CH3結構域;其中:(1)該VLCD19包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列和該VHCD19包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列;和(2)該VLCD3包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列和該VHCD3包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列;和(3)該VLCD19和該VHCD19結構域形成單價CD19結合結構域;和(4)該VLCD3和該VHCD3結構域形成單價CD3結合結構域;和(5)該第一多肽鏈和該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域形成能夠結合Fc受體的Fc結構域,從而形成該CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中:(A)該結構域IB和該結構域IIB各自包括半胱氨酸殘基,其經二硫鍵將該第一多肽鏈共價結合至該第二多肽鏈;和(B)該結構域IC和該結構域IIIC各自包括半胱氨酸殘基,其經二硫鍵將該第一多肽鏈共價結合至該第三多肽鏈。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中該結構域IC的該CH2-CH3結構域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列和該結構域IIIC的該CH2-CH3結構域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中:該結構域IB的該帶電的螺旋結構域包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列和該結構域IIB的該帶電的螺旋結構域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中使該結構域IB與該結構域IA分開的該多肽連接體包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列,和使該結構域IIB與該結構域IIA分開的多肽連接體包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中使該結構域IB與該結構域IA分開的該多肽連接體包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列,和使該結構域IIB與該結構域IIA分開的多肽連接體包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其中:(A)該第一多肽鏈包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列;(B)該第二多肽鏈包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列;和(C)該第三多肽鏈包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
- 如請求項1至7任一項所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體,其能夠與人和靈長類動物CD19和人和靈長類動物CD3兩者都交叉反應。
- 一種藥學組合物,其包括如請求項1至7任一項所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
- 一種如請求項1至7任一項所述的CD19 x CD3雙特異性Fc雙抗體在製備用於治療與該CD19的表達相關或特徵在於該CD19的表達的疾病或病況的藥物中的用途。
- 如請求項10所述的用途,其中與該CD19的表達相關或特徵在於該CD19的表達的該疾病或該病況是癌症。
- 如請求項11所述的用途,其中該癌症選自:急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急變期CML、與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、Richter綜合症、CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套細胞白血病(MCL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生症和伯基特淋巴瘤。
- 一種共價結合的多肽複合物,包括第一多肽鏈和第二多肽鏈,其中:(A)該第一多肽鏈包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,其連接至包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的帶負電的螺旋結構域;和 (B)該第二多肽鏈包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,其連接至包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的帶正電的螺旋結構域;其中該第一多肽鏈的該帶負電的螺旋結構域和該第二多肽鏈的該帶正電的螺旋結構域經二硫鍵彼此共價結合。
- 一種共價結合的多肽複合物,其中該多肽複合物包括第一多肽鏈和第二多肽鏈,其中:(A)該第一多肽鏈包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽,其連接至包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的帶負電的螺旋結構域;和(B)該第二多肽鏈包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽,其連接至包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的帶正電的螺旋結構域;其中該第一多肽鏈的該帶負電的螺旋結構域和該第二多肽鏈的該帶正電的螺旋結構域經二硫鍵彼此共價結合。
- 一種藥學組合物,包括如請求項13至14任一項所述的共價結合的多肽複合物和生理學上可接受的載體。
- 一種編碼多肽的多核苷酸,該多肽包括SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
- 如請求項16所述的多核苷酸,其包括SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的序列。
- 一種表達載體,包括如請求項16所述的多核苷酸。
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