JP2015528003A - 抗ｃｄ３構築物を含む二重特異性の非対称ヘテロ二量体 - Google Patents

抗ｃｄ３構築物を含む二重特異性の非対称ヘテロ二量体 Download PDF

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Abstract

第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物、を含む多重特異性ヘテロ多量体構築物を含む、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物を開示する。少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチド、を含む第二ポリペプチド構築物とを含む、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物もまた提供する。開示した構築物を、癌を処置するために使用する方法もさらに開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願６１／６７１，６４０（２０１２年７月１３日出願）および米国特許出願６１／８４５，９４８（２０１３年７月１３日出願）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本発明の技術分野は、生物学的療法のカスタム開発のためのＣＤ３結合ドメインを含む多重特異性足場の合理的設計である。
治療用タンパク質の領域において、それらの多価標的結合特徴を有する抗体は、薬剤候補の設計のための優れた足場である。これらの特徴をさらに進展させると、設計される二重特異性抗体およびその他の融合多重特異性治療薬は、二重または多重の標的特異性を示し、そして新規作用様式を有する薬剤を創生する格好の機会を示す。好ましい薬物動態および機能的活性を有するこのような多価および多重特異性治療用タンパク質の開発が挑戦されてきた。
ヒトおよび動物の両方の免疫系は、２つの主要なクラスのリンパ球を包含する:すなわち、胸腺由来細胞（Ｔ細胞）と骨髄由来細胞（Ｂ細胞）である。Ｔ細胞は免疫学的特異性を示し、細胞媒介性免疫応答（例えば、移植片拒絶）に直接関与する。Ｔ細胞は、種々の外来性構造（抗原）に対抗して、または応答して作用する。多くの場合、これらの外来抗原は感染の結果として宿主細胞上で発現される。しかしながら、外来抗原は、腫瘍形成または感染により変更されている宿主細胞からも生じ得る。
Ｔ細胞活性化は、応答しているＴ細胞集団上で発現される種々の細胞表面分子の参加に依存する複雑な現象である。例えば、抗原特異性Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）はジスルフィド結合ヘテロ二量体からなり、一般にＣＤ３と呼ばれる低分子量インバリアントタンパク質の複合体と非共有結合する、クローン的に２つに分配された内在性膜糖タンパク質鎖、アルファおよびベータ（αおよびβ）、またはガンマおよびデルタ（γおよびδ）を含有する。
ＣＤ３結合ドメインを含む多重特異性ヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。一実施形態では、抗ＣＤ３構築物を含む二重特異性の非対称ヘテロ二量体が提供される。
以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される：第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物；ここで前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが一本鎖Ｆｖ領域を含み；ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７０％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される。ある実施形態では、前記安定な哺乳動物細胞は、前記第一ポリペプチドをコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列（１:１の予定比率）でトランスフェクトされる。ある実施形態では、第一または第二ポリペプチド構築物は、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン第一定常（ＣＨ１）領域のうちの少なくとも１つを欠いている。
ある実施形態では、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、すべてのＦｃガンマ受容体との機能的に有効な結合を妨げるアミノ酸修飾を含む、変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾を含む前記変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジが、さらにまた、補体タンパク質（Ｃ１ｑ複合体）との機能的に有効な結合を妨げる本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。一実施形態では、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合を増強するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む、単離多重特異性ヘテロ多量体である。
一実施形態では、以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される：第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物；ここで前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが任意で一本鎖Ｆｖ領域を含み；前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し；この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を７０％より多く含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成され；かつＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物は１より大きい結合価で前記少なくとも１つのＢ細胞に結合し、そして前記多重特異性ヘテロ多量体は前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与する。ある実施形態では、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物は、原子価２で前記少なくとも１つのＢ細胞に結合する。
以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される：第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、無視できるほどの受容体結合を示す立体調節因子構築物とを含む第二ポリペプチド構築物；ここでＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し；この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される。
以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される：第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物（ここで、前記第二ポリペプチド構築物は抗原結合ポリペプチド構築物を含まない）；ここでＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し；この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される。
ある実施形態では、本明細書中で記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインよりも多くＦｃガンマＩＩｂ受容体に選択的に結合する。ある実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインよりも多くＦｃガンマＩＩＩａおよびＦｃガンマＩＩａ受容体のうちの少なくとも１つに選択的に結合する。
ある実施形態では、本明細書中で記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、変異体ＣＨ３ドメインが約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、約９０％より高い純度で形成される。ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は約９５％以上の純度で形成され、Ｔｍは少なくとも約７５℃である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は少なくとも約９０％の純度で形成され、Ｔｍは約７５℃である。一実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列は、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二輸送体ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含む。別の実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列は、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。さらなる一実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＭおよびＴ３９４Ｗを含む。いくつかの実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含む。さらに別の実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｒ、およびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。いくつかの実施形態では、第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２ＲおよびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列はアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがグリコシル化されている本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがアフコシル化（afucosylated）される本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがアグリコシル化（aglycosylated）される本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体は、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物が、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つの標的抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体は、前記抗体が軽鎖を欠く重鎖抗体である。さらなる実施形態では、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体は、前記抗原結合ポリペプチド構築物が少なくとも１つのＣＤ１９結合ドメインを含む。ある実施形態では、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体は、前記抗原結合ポリペプチド構築物が少なくとも１つのＣＤ２０結合ドメインを含む。
以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される：少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物；ここで前記第一および第二輸送体ポリペプチドは前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドは前記タンパク質のセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記輸送体ポリペプチドは自己集合して前記単量体タンパク質の擬似ネイティブ構造を形成する。
ある実施形態では、前記輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアルブミン誘導体である。いくつかの実施形態では、前記アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアロアルブミン誘導体である。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドは異なるアロアルブミンに由来する。
以下を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される：少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物；ここで前記第一および第二輸送体ポリペプチドはアルブミンのセグメント化により得られ、かつ各輸送体ポリペプチドはアルブミンのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、これにより前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブアルブミンを形成し、かつ前記第一カーゴポリペプチドは前記第二カーゴポリペプチド中に存在するいかなる結合ドメインも有さない。
ある実施形態では、ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与する本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物は、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つの標的抗原結合ドメインを含む。ある実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は少なくとも１つのＣＤ１９結合ドメインを含む。
ある実施形態では、前記抗原結合ポリペプチド構築物が少なくとも１つのＣＤ２０結合ドメインを含む本明細書中に記載の多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
ある実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３特異的抗体、ナノボディ、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインは、修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合に免疫原性を低減させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体は、前記少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインが、修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合にＴｍにより測定されるその安定性を増大させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、軽鎖を欠く重鎖抗体であるＣＤ３特異的抗体に由来する少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、非抗体タンパク質足場ドメイン由来の少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む。
一実施形態では、前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが一本鎖Ｆｖポリペプチドをさらに含む、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが一本鎖Ｆａｂポリペプチドをさらに含む、本明細書中に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体構築物は、ＣＤ３発現細胞がＴ細胞である。ある実施形態では、本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体は、前記ヘテロ多量体が十分な親和性でＴ細胞と結合し、Ｔ細胞とＢ細胞が架橋される際にＴ細胞がＢ細胞死滅活性を示すよう誘導する十分な能力でＴ細胞を修飾する。
ＣＤ３発現細胞がヒト細胞である本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、ＣＤ３発現細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は霊長類細胞である。ある実施形態では、霊長類はサルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、多数の種にまたがるＣＤ３構築物と結合する。ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドは、ヒト、ラット、マウスおよびサルのうちの少なくとも１つ以上を含む多数の種にまたがるＣＤ３構築物と結合する。
少なくとも１つのＢ細胞が疾患と関連する本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体構築物が提供される。ある実施形態では、疾患は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である。いくつかの実施形態では、癌は、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、少なくとも１つのＢ細胞は、リンパ球系または骨髄系の細胞である自己免疫反応性細胞である。
前記ヘテロ多量体が、以下の：ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管退縮因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（繊維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＥＰＨＡ４ ＣＤ６３、ＣＤ３ ＢｓＡｂイムノサイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＲＡＩＬ、のうちの少なくとも１つに結合する少なくとも１つの結合ドメインをさらに含む本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体構築物が提供される。
前記ヘテロ多量体が任意で少なくとも１つのリンカーを含む本明細書中に記載の単離ヘテロ多量体構築物が提供される。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのリンカーは、約１〜約１００個のアミノ酸を含むポリペプチドである。
本明細書中に記載の多重特異性ヘテロ多量体のための一式の発現ベクターであって、前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列を含む発現ベクターが提供される。
本明細書中に記載の多重特異性ヘテロ多量体を含有する発現生成物を安定な哺乳動物細胞で産生する方法であって、以下を含む方法が提供される:前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列で少なくとも１つの哺乳動物細胞をトランスフェクトし、これにより、前記少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、前記少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列が、予定比率で前記少なくとも１つの哺乳動物細胞にトランスフェクトされて安定な哺乳動物細胞を生成する段階；前記安定な哺乳動物細胞を培養して、前記多重特異性ヘテロ多量体を含む前記発現生成物を産生する段階。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の多重特異性ヘテロ多量体構築物を含有する発現生成物の産生方法であって、少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列：少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率が約１:１である方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される。
本明細書中に記載の多重特異性ヘテロ多量体、ならびに適切な賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。さらにまた、前記薬学的組成物の産生方法であって、以下を含む方法が提供される：本明細書中で定義されるようなヘテロ多量体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階；培養物から産生ヘテロ多量体を回収する段階;および薬学的組成物を生成する段階。
増殖性疾患、微小残存癌、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウィルス性疾患、アレルギー反応、寄生生物性反応、移植片対宿主疾患または宿主対移植片疾患、あるいは細胞悪性腫瘍のうちの少なくとも１つの防止、処置または改善のための方法が提供され、前記方法はこのような防止、処置または改善を必要とする対象に本明細書中に記載の薬学的組成物を投与する段階を包含する。それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の薬学的組成物を含む組成物を、任意で他の薬学的に活性な分子と組み合わせて、哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、前記癌は固形腫瘍である。いくつかの他の実施形態では、前記固形腫瘍は肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である。ある種の他の実施形態では、癌は血液学的癌である。さらなる一実施形態では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および白血病のうちの１つ以上である。
癌細胞の処置方法であって、本明細書中に記載のヘテロ多量体を含む組成物を前記細胞に提供する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、前記ヘテロ多量体は別の治療薬と一緒に提供される。
それを必要とする哺乳動物におけるＣＤ１９溶解性抗体、ＣＤ２０溶解性抗体およびブリナツモマブのうちの少なくとも１つに非応答性である癌の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の薬学的組成物を含む組成物を哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。
ブリナツモマブによる処置後に退縮する癌細胞の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の薬学的組成物を含む組成物を前記癌細胞に提供する段階を包含する方法が提供される。
Ｂ細胞の発現により特徴付けられる疾患に罹患している個体の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の薬学的組成物を含む有効量の組成物を前記個体に提供する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、前記疾患は、抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ２０抗体の少なくとも１つによる処置に応答性でない。
それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、有効量の本明細書中で提供される有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、前記自己免疫症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である。
それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、本明細書中で提供されるヘテロ多量体を含む有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。
本明細書中で定義されるようなヘテロ多量体を含むキット、ならびにその使用説明書が提供される。
少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメインを含む第一カーゴポリペプチドと融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一単量体;少なくとも１つのＨＥＲ３結合ドメインを含む第二カーゴポリペプチドと融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二単量体を含むヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供され、ここで前記第一カーゴポリペプチドは前記第二カーゴポリペプチド中に存在するいかなる結合ドメインも有さず;前記第一および第二輸送体ポリペプチドは、ネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴う前記ヘテロ二量体の形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメインを含む第一カーゴポリペプチドと融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一単量体;少なくとも１つのＨＥＲ３結合ドメインを含む第二カーゴポリペプチドと融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二単量体を含むヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供され、ここで前記第一および第二輸送体ポリペプチドはアルブミンのセグメント化により得られ、したがって前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブアルブミンを形成する。
本明細書中で定義されるような単離多重特異性ヘテロ多量体ならびに適切な賦形剤を含む薬学的組成物が、本明細書中で提供される。さらにまた、このような薬学的組成物の産生方法が提供され、前記方法は、本明細書中で定義されるようなヘテロ多量体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;培養物から産生ヘテロ多量体を回収する段階;および薬学的組成物を産生する段階を包含する。
本明細書中で記載される異種多量体をコードする核酸を含む宿主細胞が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、第一単量体タンパク質をコードする核酸および第二単量体タンパク質をコードする核酸が、単一ベクター中に存在する。ある実施形態では、第一単量体タンパク質をコードする核酸および第二単量体タンパク質をコードする核酸は、別個のベクター中に存在する。
本明細書中で定義されるようなヘテロ多量体を含むキット、ならびにその使用説明書も提供される。
本明細書中で提供されるヘテロ多量体構築物の例示的模式図を示す。例えば、免疫グロブリンベースの抗ＣＤ３×ＣＤ１９構築物はヘテロ多量体の異なる態様を示し、例えば、漫画風の図は、第一および第二ポリペプチド構築物を示し、ここで第一ポリペプチド構築物はＣＨ３結合構築物（黒色）を含み、第二ポリペプチド構築物は抗原結合構築物（青色）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、存在しないか、あるいは立体調節構築物に取って代わられる。第一および第二ポリペプチド構築物の変異体ＣＨ３領域により形成されるＦｃヘテロ多量体も示されている。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物（ｖ８７３）ならびにヘテロ多量体Ｆｃを含まない構築物（ブリナツモマブＣＤ１９−ＣＤ３ ＢｉＴＥ（ｖ８９１、ＭＴ−１０３））の、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ３ Ｔ細胞（上左象限）をＲａｊｉ ＣＤ１９Ｂ細胞（下右象限）と架橋させる能力をＦＡＣＳにより示す。 本明細書中に記載されるヘテロ多量体（ｖ８７３）が、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（下右パネル）ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞（上右パネル）と選択的に結合し架橋し得ることを実証する。図２はまた、単腕抗ＣＤ３抗体がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と特異的に結合し（下中パネル）ＣＤ１９発現Ｂ細胞とは交差反応しない（上中パネル）ことを実証し、かつ単腕抗ＣＤ１９抗体がＲａｊｉ Ｂ細胞と特異的に結合し（上左パネル）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは交差反応しない（下左パネル）ことを実証する。 図３Ａは、３つのドナーからの標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞を死滅させるようＩＬ−２活性化ＰＢＭＣを再指向させる、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３）の能力を示す。図３Ｂは、ドナーの１つにおいて本明細書中に記載のヘテロ多量体が、ヘテロ二量体Ｆｃを欠く構築物よりも高い再指向性Ｔ細胞性細胞傷害性を媒介できることを実証する。 本明細書中に記載のヘテロ多量体が、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と結合しかつＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞と結合し得ることを示す。 試験した濃度において、ｖ１０９３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が総細胞の３１％を架橋でき、またｖ８７３（本明細書中に記載の別のヘテロ多量体）が総細胞の２５％を架橋できたことを示す。 ｖ１０９３がｖ２２１より大きい程度に、そしてｖ８９１およびｖ８７３と同程度に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋し得たことを実証する。 ある種の適応症の処置のために本明細書中に記載のヘテロ多量体とともに提供され得る抗体治療薬を示す。 本明細書中に記載の例示的ヘテロ多量体構築物が、＞８０％の細胞生存度で、ＣＨＯ３Ｅ７細胞中で一時的に発現されることを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 個々のドナーにわたって比較する場合、陰性対照ヒトＩｇＧ１（Ｇ１）と比較して、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３）が標的Ｂ細胞に対してより高い細胞傷害性(%)を誘導することを示す。 図９Ａは、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは結合せず、Ｒａｊｉ Ｂ細胞との低レベル結合を有することを示す。図９Ａはまた、抗ＣＤ１９単腕構築物がＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは交差反応しないことを示す。図９Ｂは、ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞ならびにＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合することを示すＦＡＣＳアッセイを示す。 ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しないＫ５６２細胞株と結合しないことを示す。 ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しないマウスリンパ様細胞と結合しないことを示す。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３、ｖ８７５）ならびにヘテロ二量体Ｆｃを欠く構築物（ｖ８９１）の、ＣＤ３発現ＨＰＢ−ＡＬＬおよびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞とのＦＡＣＳ結合曲線を示す。 図１３Ａは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験した、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞と結合するヘテロ多量体構築物ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ１３８１および対照ｖ８９１に関するＦＡＣＳ結合曲線を示す。図１３Ｂは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験したＨＢＰ−ＡＬＬ Ｔ細胞と結合するヘテロ多量体構築物ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０に関するＦＡＣＳ結合曲線を示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物（ｖ８７５およびｖ８９１）が、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間の同等な架橋を促進することを示す。対照ヒトＩｇＧの使用はＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞間の２．５％架橋を生じたが、一方ｖ８７５は総細胞の２２．９％の架橋を促進し、そしてｖ８９１は総細胞の１４．５％の架橋を促進した。 ０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度で、１：１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。 ０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度で、１５:１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。ｖ８７５で試験した両Ｅ:Ｔ比率（１：１および１５：１）は、バックグラウンドに対する倍率として表した場合、同様の総Ｔ細胞−Ｂ細胞架橋を生じた。 ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＲａｊｉ Ｂ細胞への再指向による抗体依存性Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を示す。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５（図１６Ｂ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５（図１６Ｃ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５ｖ１３７９（図１６Ｄ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ１３８０（図１６Ｅ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１７Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％がわずかに低減（ｖ８７５）するか、または全く低減しない（ｖ８７３）ことを示す。図１７Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関する標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。 図１８Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全ての抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。図１８Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全ての抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。 図１９Ａは、ｖ８７５およびｖ８７３がエフェクターとしてＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する＞３０％細胞傷害性を引き起こし、かつ最大標的細胞死滅が３ｎＭ濃度で観察されることを示す図１９Ｂは、ｖ８７５およびｖ８７３がエフェクターとして静止ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する用量依存性（＞２０％）細胞傷害性を引き起こすことを示す。 図２０Ａは、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたｖ８７５の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。図２０Ｂは、静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたｖ８７５の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。 非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に関して、ｖ８７５およびｖ８７３（３００ｎＭ）が、総静止ＰＢＭＣおよび総ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣにおける自家Ｂ細胞死滅を媒介することを示す。 非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に対して、ｖ８７５はより多くの自家Ｔ細胞を残しておくことにより、ｖ８７３およびｖ８９１と比べより選択的なＢ細胞死滅を有することを示す。 ＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ８７５の作用を示す。 静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ８７５の作用を示す。 ＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ１３７９およびｖ１３８０の作用を示す。 静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ１３７９およびｖ１３８０の作用を示す。 図２４Ａは、静止エフェクターおよびＲａｊｉ Ｂ細胞における抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を示す。図２４Ｂは、活性化エフェクターにおける抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を示す。 リツキシマブによる、ならびにＷＴ Ｆｃを用いた本明細書中に記載のヘテロ多量体による（ｖ８７５）ＡＤＣＣの媒介を示す（約４０％の最大細胞溶解）。 ＷＴ Ｆｃをもつｖ１３７９（本明細書中に記載のヘテロ多量体）はＡＤＣＣを媒介し得るが、一方、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５ＡノックＦｃ突然変異をもつｖ１３８０は、標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞へのＡＤＣＣが低下することを示す。 陽性対照リツキシマブと比較した、ｖ１３８０およびｖ１３７９（図２５Ｃ）を用いた標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す。 陽性対照リツキシマブと比較した、ｖ８７５（図２５Ｄ）を用いた標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す。 ０．３ｎＭで、ｖ８７５およびｖ１３８０は、ヒトＩｇＧと比較して、ＰＢＭＣ増殖を誘導しないことを示す。図２６の下パネルは、１００ｎＭ抗体濃度の結果を示しており、ｖ８７５、ｖ１３８０およびｖ８９１が、ヒトＩｇＧと比較して、より高い細胞増殖を誘導することを示す。図２６（下パネル）はまた、１００ｎＭで、ｖ８７５は、４つのＰＢＭＣ集団すべてにおいて抗ＣＤ３ ＯＫＴ３と比較して同様の増殖指数を有することを示す。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＴＮＦα（図２７Ａ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＮＦγ（図２７Ｂ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−２（図２７Ｃ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−４（図２７Ｄ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−１０（図２７Ｅ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ４日インキュベーション時点における精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２８Ａ）および１００ｎＭ（図２８Ｂ）濃度のｖ８７５により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。 ４日インキュベーション時点における精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２９Ａ）および１００ｎＭ（図２９Ｂ）濃度のｖ１３８０により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。 倍率２００倍および４００倍でｖ８７５およびヒトＩｇＧ（３ｎＭ）を比較するＴ：Ｂ細胞の架橋について顕微鏡からの結果を示す。図３０Ａは、倍率２００倍でのヒトＩｇＧおよびｖ８７５の直接比較を示し、ヒトＩｇＧと比較して、ＲａｊｉＢ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間にみられるより多量の架橋を示す。 倍率４００倍でのｖ８７５（図３０Ｂ）に関する２つの実視野を示す。 倍率４００倍でのヒトＩｇＧ（図３０Ｃ）に関する２つの実視野を示す。 プロテインＡおよびＳＥＣ精製後の、そして４℃で４７日貯蔵後の、ｖ８７５、ｖ１３８０、ｖ１３７９およびｖ８９１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。 プロテインＡおよびＳＥＣ精製後のｖ８７５、ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、ｖ１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００およびｖ１８０２を含む追加の例示的ヘテロ多量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。 ｖ８７５に関するＭａｘＥｎｔ．分子量プロフィールのＬＣ−ＭＳ結果を示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ８７５が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞７６℃を有することを示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ１３８０が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．３℃を有することを示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ１３７９が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．５℃を有することを示す。 ＦＡＣＳにより評価した、本明細書中に記載のヘテロ多量体の、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｂ:Ｔ）の架橋能力、ならびにＲａｊｉ:Ｒａｊｉ Ｂ細胞架橋（Ｂ:Ｂ）の能力、およびＪｕｒｋａｔ:Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞架橋（Ｔ:Ｔ）の能力を示す。図３４Ａは、３回の反復実験に亘るｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ８９１、ｖ１３８１、市販のＯＫＴ３およびヒトＩｇＧの、Ｔ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示す。 安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有する変異体（ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００、ｖ１８０２）およびｖ８７５、ならびにヒトＩｇＧのＴ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示す。 安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有する（ｖ１６６６）か、またはヒト／カニクイザル交差反応性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓを有する（ｖ４５４１、ｖ４５４３、ｖ４５４５、ｖ４５４８）Ｆｃノックアウト変異体、市販のＯＫＴ３抗ＣＤ３対照、ｖ２１７６抗ＣＤ１９対照およびヒトＩｇＧ陰性対照の、Ｔ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示しており、すべての変異体が低Ｔ:Ｔ架橋を媒介する。 ＥＬＩＳＡにより測定した、本明細書中に記載のヘテロ多量体のヒトＣＤ３への結合（上パネル）、およびカニクイザルＣＤ３受容体への結合（下パネル）を示す。 ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｈｅｔ−Ｆｃ構築物のそれぞれ線形および対数スケールでの親和性を示し、二重特異性および抗体結合力の両方を実証している。 ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞における、対照１０８７と比較した変異体１０９０の結合を図示し、ｖ１０９０が標的ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対してｖ１０８７と同様の結合を有することを示している。
本発明の詳細な説明
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、特許請求対象物が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、本節における定義が優勢である。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子またはアドレスを参照する場合、このような識別子は変化し得るし、インターネット上の特定情報は移り変わるが、しかしインターネット検索により等価の情報が見出され得る、と理解される。それを参照すると、このような情報の利用可能性および公的普及が立証される。
前記の一般的記述および以下の詳細な記述は、単に例示的および解説的なものであって、特許請求されるいかなる対象物をも限定するものではない、と理解されるべきである。この出願において、単数形の使用は、別記しない限り、複数形を包含する。
抗体技術の技術分野の当業者により理解される用語は、各々、本明細書中で別様に定義されない限り、当該技術分野において得られる意味を与えられる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域および定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造および機能は、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｈａｐｔｅｒ １４ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８）に概説されている。
本発明の記述において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を、そして適切な場合には、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を包含する、と理解されるべきである。本明細書中で用いる場合、「約」は、別記しない限り、指示される範囲、値、配列または構造の±１０％を意味する。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、またはその状況により指図されない限り、列挙された構成成分のうちの「１つ以上」を指す、と理解されるべきである。代替物（例えば「または」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそのいずれかの組合せを意味する、と理解されるべきである。本明細書中で用いる場合、「包含する」および「含む」という用語は、同義的に用いられる。さらに、本明細書中に記載される構造および置換基の種々の組合せから得られる個々の一本鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、各一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記述されるのと同程度に、本出願により開示される、と理解されるべきである。したがって、個々の一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するための特定の構成成分の選択は、本発明の開示の範囲内である。
本明細書中で用いられる節の見出しは、系統化の目的に過ぎず、記載される対象物を限定するよう意図されるべきでない。当該出願中で引用される文書または文書の部分、例えば特許、特許出願、記事、書物、マニュアルおよび学術論文（これらに限定されない）は、任意の目的のためにそれらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
本明細書中に記載される方法および組成物は、本明細書中に記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、構築物および試薬に限定されず、このようなものとして変化し得る、と理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するために過ぎず、本明細書中に記載される方法および組成物の範囲を限定するよう意図されず、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、ということも理解されるべきである。
本明細書中で記述される出版物および特許はすべて、例えば、本明細書中に記載される方法、組成物および化合物とともに用いられ得る出版物中に記載される構築物および方法を記載し、開示する目的のために、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。本明細書中で考察される出版物は、本出願の出願日前に、それらの開示のために提供されるだけである。本明細書中に記載される本発明人等は、以前の発明に基づいて、または任意の他の理由のためにこのような開示に先行するよう授与されない、ということの承認として意図されるべきことは、本明細書中にはない。
本発明の出願において、アミノ酸名および原子名（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｃ等）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ （ＰＤＢ） （ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）により定義されるように用いられるが、これは、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （ｒｅｓｉｄｕｅ ｎａｍｅｓ， ａｔｏｍ ｎａｍｅｓ ｅｔｃ．）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８， ９−３７ （１９８４）ならびにＥｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５２， １ （１９８５）におけるそれらの修正に基づいている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに向けられる記述は、ペプチドの記述およびタンパク質の記述に等しく当てはまり、その逆も言える。当該用語は、天然アミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が天然にコードされないアミノ酸である、アミノ酸ポリマーに適用する。本明細書中で用いる場合、当該用語は、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結される。
「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続ストレッチを示すよう意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源のもの、あるいはその任意の組合せであり得る。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、一般的に、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための方法を指す。概して、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長合成の反復周期を包含する。
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、本明細書中で互換的に用いられ、このような用語はすべて、細胞の増殖または培養に起因する子孫を含む、と理解されるべきである。「形質転換」および「トランスフェクション」は、細胞中にＤＮＡを導入する過程を指すために互換的に用いられる。
「アミノ酸」という用語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を有する化合物を指し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合される炭素を有し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどである。このような類似体は、修飾化Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾化ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸への言及は、例えば、天然タンパク質原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾化アミノ酸、例えばアミノ酸変異体および誘導体；天然非タンパク質原性アミノ酸、例えばβ−アラニン、オルニチン等；ならびにアミノ酸に特徴的であることが当該技術分野で既知の特性を有する化学合成化合物、を包含する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖中に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、ならびに側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基に置換されるアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成非ネイティブアミノ酸、置換アミノ酸、または１つ以上のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸を本発明のタンパク質中に組み入れることは、多数の異なる意味で有益であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有同等物と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性増大を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み入れるペプチドなどの構築は、より大きな細胞内安定性が所望されるかまたは必要とされる場合、特に有用であり得る。さらに具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、それにより、分子の生物学的利用能改善、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの寿命延長が望ましい場合そのような特性を提供する。さらに、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞に対する主要組織適合複合体クラスＩＩ制限提示のために効率的にプロセシングされ得ず、したがって、生物体全体における体液性免疫応答を誘導しにくい。
アミノ酸は、それらの一般的に既知の３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎに推奨される１文字記号により、本明細書中で言及され得る。同様にヌクレオチドは、一般に認められている１文字暗号により言及され得る。
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾変異体」は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の指定タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく表される対応コドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、「サイレント変異」であって、これは、保存的修飾変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての考え得るサイレント変異を表す。核酸における各コドン（ただし、ＡＵＧは、普通はメチオニンに関する唯一のコドンであり、ＴＧＧは、普通はトリプトファンに関する唯一のコドンである）は修飾されて、機能的に同一の分子を産生し得る、と当業者は理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は各記載配列に潜在する。
アミノ酸配列に関しては、コードされた配列中の単一アミノ酸または小部分のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的修飾変異体」であって、ここで変更によりアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる、と当業者は理解する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。このような保存的修飾変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子のほかに存在し、それらを排除しない。
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。以下の８群は、各々、互いに関して保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３参照）。
「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況では、同一である２つ以上の配列または亜配列を指す。配列が比較され、および比較ウィンドウ全体、または指定領域での最大対応のために整列される際に以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または手動整列および目視検査により測定されるように、配列は、それらが、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（すなわち、特定領域に亘って約５０％同一性、約５５％同一性、６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一性）を有すると、「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長である領域全体に、あるいは特定されない場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全配列を通して存在し得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種からのホモログを含み、本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識化プローブを用いる厳しいハイブリダイゼーション条件下でのライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに全長ｃＤＮＡおよび前記ポリヌクレオチド配列を含有するゲノムクローンを単離するステップを包含する工程により獲得され得る。このようなハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知である。
ポリペプチドの誘導体または変異体は、それらのアミノ酸配列が元のペプチドからの１００アミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、そのペプチドと「相同性」を有する、または「相同である」と言われる。ある実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも７５％同一である。ある実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも８５％同一である。ある実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９５％同一である。ある実施形態では、誘導体または変異体は、誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも９９％同一である。
「二重特異性の」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばヘテロ多量体、単量体、タンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むよう意図される。例えば、いくつかの実施形態では、分子は、（ａ）細胞表面標的分子および（ｂ）エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体と結合するか、相互作用し得る。本明細書中に記載のヘテロ多量体のある実施形態では、異なる結合特異性を有する２つのカーゴ分子を同一輸送体ポリペプチドに取り付けることにより形成される少なくとも１つの単量体が二重特異性である。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、異なる特異性を有する少なくとも２つのカーゴ分子を輸送体ポリペプチドに取り付けることにより形成されるヘテロ多量体は、それ自体二重特異性である。
「多重特異性の」または「ヘテロ特異性の」という用語は、２つより多い異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むよう意図される。例えば、分子は、（ａ）細胞表面標的分子、例えば細胞表面抗原（これに限定されない）、（ｂ）エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体、そして任意で（ｃ）少なくとも１つのその他の構成成分、と結合するかまたは相互作用し得る。したがって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の実施形態は、二重特異性、三重特異性、四重特異性およびその他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、これらの分子は、ＣＤ３０などの細胞表面抗原に関するものであり、ならびにその他の標的、例えばエフェクター細胞上のＦｃ受容体に関する。
本明細書中で用いる場合、「単離」ヘテロ多量体は、その天然細胞培養環境の構成成分から同定され、分離され、および／または回収されたヘテロ多量体を意味する。その天然環境の夾雑構成成分は、ヘテロ多量体に関する診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク様または非タンパク様溶質を含み得る。
「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（例えば総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、厳しいハイブリダイゼーション条件下でそのヌクレオチド配列だけに分子が結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。
「厳しいハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野で既知であるように、低イオン強度および高温の条件下での、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の核酸、あるいはその組合せの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、厳しい条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（例えば、総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中のその標的亜配列とハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。厳しい条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ"（１９９３）に見出される。
本明細書中で用いる場合、「抗体」または「免疫グロブリン」は、分析物（抗原）を特異的に結合し、認識する、単数または複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらは、今度は、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを限定する。
例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端ドメインは、主に抗原認識に寄与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖ドメインを指す。ＩｇＧ１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうそれぞれＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうＶＬおよびＣＬドメインからなる。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間にヒンジを含む。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、治療用ポリペプチドに連結されるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥからの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される免疫グロブリン構築物中に含まれる免疫グロブリンドメインは、ダイアボディまたはナノボディのような免疫グロブリンベースの構築物由来である。ある実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、ラクダ科動物抗体のような重鎖抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。ある実施形態では、本明細書中で提供される免疫グロブリン構築物は、哺乳動物抗体、例えばウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ科動物抗体、マウス抗体または任意のキメラ抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。
本明細書中で用いる場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」および「エピトープ」と同義であって、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチ、または非連続アミノ酸の異なる領域から作製される立体配座的立体配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面に、ウィルス感染細胞の表面に、その他の罹患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリクス（ＥＣＭ）中に見出され得る。本明細書中で抗原として言及されるタンパク質（例えば、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ３）は、別記しない限り、任意の脊椎動物起源、例えば哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）からの任意のネイティブ型のタンパク質であり得る。特定の一実施形態では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書中の具体的なタンパク質を参照する場合、当該用語は、「全長」、非プロセス化タンパク質、ならびに細胞中でのプロセシングに起因する任意の形態のタンパク質を包含する。当該用語は、タンパク質の天然変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。抗原として有用な例示的ヒトタンパク質としては、以下の：黒色腫随伴コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４としても既知）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン７０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ． ＮＰ ００１８８８．２）；繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（セプラーゼとしても既知）（Ｕｎｉ Ｐｒｏｔ ｎｏｓ． Ｑ１２８８４、Ｑ８６Ｚ２９、Ｑ９９９９８、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ ００４４５１）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５としても既知）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ０６７３１（バージョン１１９）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ． ＮＰ ００４３５４．２）；ＣＤ３３（ｇｐ６７またはＳｉｇｌｅｃ−３としても既知）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ２０１３８、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ ００１０７６０８７、ＮＰ ００１１７１０７９）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ−１またはＨｅｒｌとしても既知）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ００５３、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ９５８４３９、ＮＰ９５８４４０）、ならびにＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ ０００７２４．１、ヒト配列に関する配列番号２６５；あるいは、ＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号 ＢＡＢ７１８４９．１、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）配列に関する配列番号２６６参照）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子を活性化するＴ細胞は、異なる種からの活性化Ｔ細胞抗原または標的抗原の間で保存されている活性化Ｔ細胞抗原または標的抗原のエピトープと結合する。
「特異的結合」または「選択的結合」とは、結合が抗原に関して選択的であり、求められていないまたは非特異的な相互作用とは区別され得る、と意図される。特異的抗原決定基と結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または当業者に既知のその他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法（ＢＩＡｃｏｒｅ計器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７， ３２３−３２９ （２０００））、ならびに伝統的結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７−２２９ （２００２））により測定され得る。一実施形態では、非関連タンパク質との抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定した場合、抗原との抗原結合部分の結合の約１０％未満である。ある実施形態では、抗原と結合する抗原結合部分、あるいは抗原結合部分を含む抗原結合分子は、＜１μΜ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭまたは＜０．００１ｎＭ（例えば、１０〜８Ｍ以下、例えば１０〜８Ｍ〜１０"１３Ｍ、例えば１０"９Ｍ〜１０"１３Ｍ）の解離定数(ＫＤ)を有する。
「親和性」は、分子（例えば受容体）とその結合相手（例えばリガンド）の単一結合部位間の非共有的相互作用の総和の強度を指す。別記しない限り、本明細書中で用いる場合、「結合親和性」は、結合対の成員（例えば、抗原結合部分および抗原、または受容体およびそのリガンド）間の１:１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、その相手Ｙに関する親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）により表され得るが、これは、解離および会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が依然として同一である限り、等価親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、当該技術分野で既知の十分に確立された方法、例えば本明細書中に記載の方法により測定され得る。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合低減」、例えばＦｃ受容体との結合低減は、例えばＳＰＲにより測定した場合、それぞれの相互作用に関する親和性における減少を指す。明確にすると、当該用語は、親和性のゼロへの（または分析方法の検出限界より下への）低減、すなわち相互作用の完全消失も含む。逆に、「結合増大」は、それぞれの相互作用に関する結合親和性における増大を指す。
「活性化Ｔ細胞抗原」は、本明細書中で用いる場合、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導し得るＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面で発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原の相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導し得る。特定の一実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
「Ｔ細胞活性化」は、本明細書中で用いる場合、以下：増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ以上の細胞性応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導し得る。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書中に記載される当該技術分野で既知である。
「標的細胞抗原」は、本明細書中で用いる場合、標的細胞、例えば癌細胞または腫瘍間質の細胞のような腫瘍中のＢ細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。本明細書中で用いる場合、「第一の」および「第二の」という用語は、抗原結合部分等に関しては、１つより多くの各型の部分が存在する場合、区別を便利にするために用いられる。これらの用語の使用は、そのように明白に記述されない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の具体的順序または配向を付与するよう意図されない。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびに軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬおよびＣＬドメインからなるタンパク質を指す。
「融合された」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子およびＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合により、直接的にまたは１つ以上のペプチドリンカーを介して、連結されることを意図する。
本明細書中で用いる場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合により線状に連結されるアミノ酸単量体を含む分子を指す。ある実施形態では、抗原結合部分のうちの１つは一本鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより連結されて単一ペプチド鎖を形成するＦａｂ分子である。特定のこのような実施形態では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端はＦａｂ重鎖のＮ末端と連結される。他のある実施形態では、抗原結合部分の１つは一本鎖Ｆｖ分子である。
「交差」Ｆａｂ分子（「クロスｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域が交換されたＦａｂ分子を意味し、すなわち、交差Ｆａｂ分子は軽鎖可変領域および重鎖定常領域からなるペプチド鎖を含み、かつ重鎖可変領域および軽鎖定常領域からなるペプチド鎖を含む。明確にすると、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換された交差Ｆａｂ分子では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が交差Ｆａｂ分子の「重鎖」と本明細書中で言及される。逆に、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常領域が交換されたＦａｂ分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、交差Ｆａｂ分子の「重鎖」として本明細書中で言及される。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン:ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）における以下の順序で出現する:ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に、例えばＩｇＧｉ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｉおよびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために本明細書中で用いられる。当該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を包含する。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びるよう規定される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在することもしないこともある。本明細書中で別記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１に記載されているように、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従っている。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書中で用いる場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つを指し、すなわち、安定に自己集合し得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドである。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２およびＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第一および第二サブユニットの会合を促進する修飾」とは、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドが同一ポリペプチドと会合してホモ二量体を形成するのを低減するかまたは防止する、ペプチド主鎖の操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書中で用いる場合、特に、会合することが望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第一および第二サブユニット）の各々に対してなされる別々の修飾を含み、２つのＦｃドメインサブユニットの会合およびヘテロ二量体の形成を促進する。例えば、ある実施形態では、会合を促進する修飾は、それらの会合を有利にするために、Ｆｃドメインサブユニットの一方または両方の構造または電荷を変更し得る。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、これは、抗体アイソタイプに伴って変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃｌｑ結合および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節、およびＢ細胞活性化。
本明細書中で用いる場合、「アルブミン」は、集合的に、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、あるいはアルブミンセグメントまたは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのセグメント（例えば、ＥＰ ２０１２３９、ＥＰ ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）、特に成熟形態のヒトアルブミン、あるいは他の脊椎動物からのアルブミンまたはそのセグメント、あるいはこれらの分子の類似体または変異体、またはその断片を指す。ある実施形態では、アルブミンはアルブミンの切断化バージョンを指す。
「擬似アルブミン」という用語は、全アルブミンと同様の構造および／または機能を有するヘテロ多量体分子を指し、前記ヘテロ多量体分子は、全アルブミンの配列を基礎にして設計される２つ以上の単量体ポリペプチドの集合により形成される。ある実施形態では、単量体ポリペプチドは、ヘテロ多量体対として優先的に会合して擬似タンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは全アルブミンの活性の９０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは全アルブミンの活性の７５％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは全アルブミンの活性の５０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは全アルブミンの活性の５０〜７５％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは全アルブミンの活性の８０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の９０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の８０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の７０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の５０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似アルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の５０％〜７５％を有する。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。「アルブミンおよび血清アルブミン」という用語は、より広範であり、ヒト血清アルブミン（そしてその断片および変異体）、ならびに他の種からのアルブミン（そしてその断片および変異体）を包含する。
ある実施形態では、本明細書中に記載される各アルブミンベースの構築物は、正常ＨＡの変異体を基礎にしている。「変異体」という用語は、保存的または非保存的な、挿入、欠失および置換を含み、この場合、このような変化は、アルブミンの膠質性、有用なリガンド結合および非免疫原性特性、または活性部位、あるいは治療用タンパク質の治療活性を付与する活性ドメインのうちの１つ以上を実質的に変更しない。
ある実施形態では、本明細書中に記載される単離ヘテロ多量体構築物は、ヒトアルブミンの天然多形変異体およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ ３２２０９４に開示される断片（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）、ここで、ｎは３６９〜４１９である）を包含する。
ある実施形態では、アルブミンは、任意の脊椎動物、とくに任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、イヌまたはブタ（これらに限定されない）に由来する。ある実施形態では、アルブミンは、非哺乳動物アルブミン、例えば雌鶏およびサケ（これらに限定されない）に由来する。
ヒトアルブミンの配列は、配列番号１として示されるものである：
Figure 2015528003
。
「アロアルブミン」は、アルブミンの遺伝的変異体である。ある実施形態では、アロアルブミンはヒトアロアルブミン（ＨＡＡ）である。電気泳動移動度がアルブミンと異なるアロアルブミンは、臨床的電気泳動の過程で、または供血者調査において、集団遺伝学調査により同定されている。突然変異および移動のマーカーとして、アロアルブミンは、遺伝学者、生化学者および人類学者にとって興味深いが、しかしこれらのアロアルブミンのほとんどが、疾患と関連付けられていない（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｉ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ２９（８）， １００７−１０１６（２００８））。
（表１）配列番号１のＨＡと比較した場合の、種々のアロアルブミンに含まれる置換の一覧。熱安定性、半減期の情報およびその他のＨＡＡは、Ｋｒｏｇｈ−ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７４７， ８１−８８（２００５）；およびＷＯ２０１１０５１４８９（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）で提供されている。
Figure 2015528003
Figure 2015528003
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「セグメント化」という用語は元のタンパク質配列の精密な内部スプライスを指し、これによりヘテロ多量体として優先的に会合して擬似タンパク質を形成するタンパク質配列の「セグメント」が生じる。
擬似ネイティブ構造：
ネイティブタンパク質またはその構造に関連して、擬似タンパク質および／または「擬似ネイティブ構造」は、ネイティブタンパク質様機能および構造特質を提示する。例えばＸ線結晶学により得られた一つの構造をタンパク質のネイティブ構造とみなしているが、タンパク質は天然には動的分子であり構造的立体配置の集合を示す。そのタンパク質の構造の集合で観察される別の構造的立体配置は、互いに関して、または結晶で観察される構造に関して擬似ネイティブ構造であると考えられる。異なる面では、相同タンパク質配列または共通の構造ファミリーに属するタンパク質は、同様の構造幾何学外形に折りたたまれる傾向がある。このファミリーに属する成員タンパク質は、互いに関して擬似ネイティブ構造を達成すると考えられる。タンパク質ファミリーにおける独特の配列のいくつかはまた、類似の機能的属性を示し、それゆえ互いに関して擬似ネイティブタンパク質として言及され得る。その各々が輸送体ポリペプチド構成成分を有する２つ以上のタンパク質構築物からなるここで記載されるヘテロ多量体の場合、輸送体ポリペプチドは集合して擬似ネイティブ構造を形成する。この場合の参照ネイティブタンパク質は輸送体ポリペプチドが由来するタンパク質であり、参照ネイティブ構造は輸送体ポリペプチドが由来する単量体タンパク質の構造である。本発明者らは、２つ以上の異なるポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体構造を形成し、それ自体は単量体であるネイティブタンパク質と同様の機能的特質を示す場合を記載する。ある実施形態では、アルブミン由来の輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体構築物が提供され、構築物は自己集合してヘテロ多量体を形成し、ＦｃＲｎ結合などのネイティブアルブミン様機能特質および構造特質を示す。これらのヘテロ多量体は擬似ネイティブであると言及される。
「ＣＤ３複合体」とは、本明細書中で用いる場合、成熟Ｔリンパ球中の少なくとも５つの膜結合ポリペプチドの複合体であり、互いに、そしてＴ細胞受容体と非共有結合している。ＣＤ３複合体は、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータおよびイータ鎖（サブユニットとも言及される）を包含する。非ヒトモノクローナル抗体は、ネズミ抗体 ＯＫＴ３、ＳＰ３４、ＵＣＨＴ１または６４．１により例示されるように、これらの鎖のいくつかに対して開発されてきた（例えば、Ｊｕｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５−３９５２（１９８６）；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００（１９８６）；およびＨａｙｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：８７−９２（１９８８）参照）。ある種のＣＤ抗原の発現は特異的細胞系列であるリンパ造血系細胞に高度に制限されており、そして過去数年に亘って、リンパ特異的抗原に対して向けられる抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは動物モデル（５−１３）において有効である処置を開発するために用いられてきた。この点で、ＣＤ１９は非常に有用な標的であることが立証されている。ＣＤ１９は、前Ｂ細胞から成熟Ｂ細胞までの全Ｂ細胞系列で発現され、それは消失せず、すべてのリンパ腫細胞上で均一に発現され、幹細胞には存在しない。
「有効量」という用語は、本明細書中で用いる場合、投与されている多重特異性ヘテロ多量体構築物の量を指し、これは、処置されている疾患、症状または障害の徴候のうちの１つ以上をある程度まで軽減する。本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物を含有する組成物は、予防的、増強的、および／または治療的処置のために投与され得る。
本明細書中で用いる場合、「改変する、改変された、改変すること」という用語は、ペプチド主鎖の任意の操作、あるいは天然または組換えポリペプチドまたはその断片の翻訳後修飾を包含するとみなされる。改変することは、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにこれらのアプローチの組合せを包含する。改変されたタンパク質は、標準の分子生物学技法により発現され産生される。
「単離核酸分子またはポリヌクレオチド」とは、そのネイティブ環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有される、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に保持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製（部分的または実質的）ポリヌクレオチドを包含する。単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子を包含するが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖の形態、および二本鎖形態を包含する。本明細書中に記載される単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるこのような分子をさらに包含する。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ある実施形態では、調節素子、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターを包含する。
例えば本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、当該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一である、ということを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを獲得するためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５'または３'末端位置で、あるいはそれらの末端位置間のどこかで起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するかまたは参照配列内の１つ以上の連続群で散在する。実際には、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばポリペプチドに関して上記されたもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）を用いて慣用的に決定され得る。
「発現カセット」という用語は、組換え的にまたは合成的に生成されるポリヌクレオチドで、標的細胞中の特定核酸の転写を可能にする一連の特殊化核酸要素をもつものを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウィルスまたは核酸断片中に組み入れられ得る。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列のうち特に、転写されるべき核酸配列およびプロモーターを含む。ある実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、特定の遺伝子を導入してその発現を指図するために用いられるＤＮＡ分子を指し、それは標的細胞中で操作可能に実行される。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入されている宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを包含する。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。一旦発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子または遺伝子によりコードされるタンパク質が、細胞の転写および／または翻訳機構により産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は互換的に用いられ、外因性核酸が導入されている細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、継代の数とは関係なく一次形質転換細胞ならびにそれに由来する子孫を包含する。ある実施形態では、子孫は、親細胞と核酸内容が完全に同一というわけではないが、しかし突然変異を含有し得る。元来の形質転換細胞においてスクリーニングされるかまたは選択されるのと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は、本明細書中に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために用いられ得る任意の型の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる関与後に、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実施するシグナル伝達事象を引き出すＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）を包含する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的の溶解を引き起こす免疫機序である。標的細胞は、一般的に、Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体またはその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書中で用いる場合、「低減化ＡＤＣＣ」という用語は、標的細胞周囲の培地中の抗体の所定濃度において、上記のＡＤＣＣの機序により、所定時間に溶解される標的細胞の数の低減として、および／またはＡＤＣＣの機序により、所定時間に所定数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞周囲の培地中の抗体の濃度の増大として定義される。ＡＤＣＣにおける低減は、同一の標準の生成、精製、処方および貯蔵方法（これらは当業者に既知である）を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、改変されていない同一抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較する。例えば、ＡＤＣＣを低減するアミノ酸置換をそのＦｃドメイン中に含む抗体により媒介されるＡＤＣＣにおける低減は、Ｆｃドメインにおけるこのアミノ酸置換を伴わない同一抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較する。
本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体のような作用物質の「有効量」は、それが投与される細胞または組織における生理学的変化を生じるために必要な量を指す。
作用物質、例えば本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体を含む薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投与量で必要な期間の間、有効な量を指す。治療的有効量の作用物質は、例えば、疾患の悪作用を排除し、減少し、遅延し、最小限にし、または防止する。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギおよび齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、個体または対象はヒトである。
「薬学的組成物」という用語は、その中に含有される多重特異性ヘテロ多量体構築物の生物学的活性を有効にさせるような形態であり、かつ処方物が投与される対象に対して非許容可能的に有毒である付加的構成成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的組成物中の一成分を指す。薬学的に許容可能な担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる場合、「処置」（ならびに「処置する」または「処置すること」などのその文法的変形）は、処置されている個体における疾患の自然経過を変更するための試みにおける臨床的介入を指し、かつ予防のために、あるいは臨床的病変の経過中に実施され得る。処置の望ましい作用としては、疾患の発生または再発を防止すること、症候の緩和、疾患の任意の直接または間接的病理学的結果の減少、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少すること、疾患状態の改善または一時的軽減、ならびに寛解または予後改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物は、疾患の発症を遅延するために、または疾患の進行を遅らせるために用いられる。「使用説明書」という用語は治療用製品の市販パッケージ中に慣例的に含まれる使用説明書を指し、このような治療用製品の使用に関する適応症、用途、投薬量、投与、併用療法、禁忌および／または警告についての情報を含有する。
「異種間結合」または「種間結合」という用語は、本明細書中で用いる場合、本明細書中に記載される結合ドメインと、ヒトおよびその他の生物体、例えば非チンパンジー霊長類（これに限定されない）における同一標的分子との結合を意味する。したがって、「異種間結合」または「種間結合」は、異なる種において発現される同一分子「Ｘ」（すなわち、相同体）に対する種間反応性であって、「Ｘ」以外の分子に対する種間反応性ではないと理解されるべきである。非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン、例えばマカク属ＣＤ３イプシロンに対して、例えばヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体の異種間特異性は、例えばＦＡＣＳ分析により測定され得る。ＦＡＣＳ分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、前記ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原をそれぞれ発現するヒトおよび非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカク属サル細胞との結合に関して試験される方法で実行される。適切な分析は、以下の例で示される。上記対象物は、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１ＲおよびＦＡＰα抗原に関して準用する：非チンパンジー霊長類ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１ＲまたはＦＡＰα、例えばマカク属ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１ＲまたはＦＡＰαに対する、例えばヒトＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１ＲまたはＦＡＰαを認識するモノクローナル抗体の異種間特異性は、例えばＦＡＣＳ分析により測定され得る。ＦＡＣＳ分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９、Ｃ−ＭＥＴ、エンドシアリン、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ−１ＲまたはＦＡＰα抗原をそれぞれ発現する上記ヒトおよび非ヒトチンパンジー霊長類細胞、例えばマカク属細胞との結合に関して試験される方法で実行される。
ある実施形態の詳細な説明
免疫グロブリンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物：
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；ならびに前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物、を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが一本鎖Ｆｖ領域を含み；ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７０％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、発現生成物は前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１５％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含む。ある実施形態では、発現生成物は前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約８０％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含む。付加的実施形態では、発現生成物は前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約８５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含む。さらなる実施形態では、発現生成物は前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約９０％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含む。
ある実施形態では、前記第一または第二ポリペプチド構築物が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン第一定常（ＣＨ１）領域のうちの少なくとも１つを欠いている単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
ある実施形態では、第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物（ここで、前記第二ポリペプチド構築物はＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含まない）、を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって；ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、細胞表面受容体、例えばＢ細胞上のＦｃｇＲＩＩｂと相互作用する。ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、正常抗体に比して、ＦｃｇＲＩＩｂ受容体と優先的に相互作用するよう改変される。
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、無視できるほどの受容体結合を示す立体調節因子構築物とを含む第二ポリペプチド構築物、を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって；ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される。ある実施形態では、立体調節因子構築物は、任意の既知の標的組織または細胞表面に実際に結合できず、したがって、多重特異性ヘテロ多量体構築物の相互作用において立体調節の役割を果たすだけのダミーポリペプチドアームとして機能する。いくつかの実施形態では、立体調節因子構築物は、多量体がＴ細胞および／またはＢ細胞と結合する場合、多重特異性ヘテロ多量体の立体的特徴を調節するのを手助けするポリペプチド配列である。ある実施形態では、立体調節因子構築物は、ｄｅ−ｎｏｖｏで設計されるポリペプチドドメインを含む。ある実施形態では、立体調節因子構築物は、その結合特性を除去するよう既知のポリペプチドドメインを改変することにより得られるポリペプチドドメインを含む。例えば、ある実施形態では、立体調節因子構築物は、結合特性を除去するよう改変された改変Ｆａｂ領域またはその断片を含む。
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物（ここで、前記第二ポリペプチド構築物は抗原結合ポリペプチド構築物を含まない）、を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し；この場合、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、すべてのＦｃガンマ受容体との機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む、単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、１より大きい結合価で少なくとも１つのＢ細胞に結合し、かつ少なくとも１つのＢ細胞および少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与する、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される。ある実施形態では、多重特異性ヘテロ多量体は、第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；ならびに前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物を含み；この場合、前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは任意で一本鎖Ｆｖ領域を含み；前記第一および第二重鎖ポリペプチドは前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、前記ヘテロ二量体Ｆｃはネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性を伴って形成され、かつ前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において哺乳動物細胞から発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を約７５％超含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される。前記多重特異性ヘテロ多量体構築物は、第二重鎖上の前記抗原結合ポリペプチド構築物を介してＢ細胞と相互作用し、ならびにＢ細胞上のＦｃｇＲＩＩｂ受容体と前記ヘテロ二量体Ｆｃを介して相互作用して、Ｂ細胞関与中に１より大きい結合価を示し得る。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促すためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインを含む、単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
いくつかの実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａおよびＦｃガンマＩＩｂ受容体のうちの少なくとも１つに選択的に結合するヘテロ多量体が提供される。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがグリコシル化されている単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがアフコシル化されている単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃがアグリコシル化されている単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供される。
ヘテロ二量体化を促すＦｃ領域修飾：
Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方または他方と融合され、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットが典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖からなる、異なる抗原結合部分を含む多重特異性ヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の収率および純度を改良するために、ポリペプチドのＦｃ領域は、所望のポリペプチドの会合を促すよう修飾される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の第一および第二重鎖ポリペプチドは、ネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性で形成され、かつ前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物として哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約７５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の第一および第二重鎖ポリペプチドは、ネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性で形成され、かつ前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物として哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約９０％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の第一および第二重鎖ポリペプチドは、ネイティブホモ二量体Ｆｃに少なくとも匹敵する安定性で形成され、かつ前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物として哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が前記多重特異性ヘテロ多量体を少なくとも約９５％含み、かつ１０％未満の前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を含むような純度で形成される、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
いくつかの実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が約７８％より高い純度で形成される単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が少なくとも約７８％以上の純度で形成され、Ｔｍが少なくとも約７５℃である単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が少なくとも約７５％の純度で形成され、Ｔｍが約７５℃以上である単離多重特異性ヘテロ多量体が本明細書中で提供される。
ある実施形態では、ａ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二輸送体ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；ｂ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列が、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；ｃ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；ｄ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；ｅ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｒ、およびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含むか；あるいはｆ） 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｒ、およびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される。
Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を低減するＦｃ領域修飾：
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物のＦｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促すためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、野生型ＣＨ２ドメインより大きい親和性でＦｃガンマＩＩｂ受容体に選択的に結合する変異体ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体は、野生型ＣＨ２ドメインより大きい親和性でＦｃガンマＩＩＡおよび／またはＦｃガンマＩＩＩＡ受容体に選択的に結合する変異体ＣＨ２ドメインを含む。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物のＦｃ領域は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性低減および／またはエフェクター機能低減を示す。このような一実施形態では、Ｆｃ領域は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、５０％未満、または２０％未満、または１０％未満の、そしていくつかの実施形態では５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示し、および／またはネイティブＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、５０％未満、または２０％未満、または１０％未満、いくつかの実施形態では５％未満のエフェクター機能を示す。
一実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物のＦｃ領域は、実質的には、Ｆｃ受容体と結合せず、または適切なエフェクター機能を誘導しない。ある実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は哺乳動物Ｆｃ受容体である。ある実施形態では、哺乳動物Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的一実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体、さらに具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびサイトカイン分泌からなる群から選択される１つ以上の機能である。特定の一実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を示す。ある実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃと実質的に同様である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物のＦｃ領域が、ＦｃＲｎに対するネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインの結合親和性の約７０％より大きい結合親和性を示す場合に達成され、またはいくつかの実施形態では約８０％より大きい結合親和性、そしていくつかの特定の実施形態では約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物のＦｃ領域は、非改変Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性低減および／またはエフェクター機能低減を示すよう改変される。いくつかの実施形態では、改変突然変異は、下部ヒンジおよびＣＨ２ドメイン中に存在する。特定の実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性および／またはエフェクター機能を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、同一の１つ以上のアミノ酸突然変異が、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの各々に存在する。いくつかの実施形態では、異なるアミノ酸突然変異が、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの各々に導入される。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性を低減する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性を、少なくとも２分の１に、またはいくつかの実施形態では、少なくとも５分の１に、または一実施形態では、少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性を低減する１つより多いアミノ酸突然変異が存在するある実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組合せは、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性を、少なくとも１０分の１に、またはいくつかの実施形態では、少なくとも２０分の１に、またはある実施形態では、少なくとも５０分の１に低減する。ある実施形態では、Ｆｃ受容体に関するＦｃ領域の結合親和性は、ＳＰＲ機器を用いるなどの標準結合アッセイにおいてＦｃ受容体に対する突然変異体Ｆｃのいかなる検出可能な結合も認められない程度に低減される。一実施形態では、改変Ｆｃドメインを含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、Ｆｃ受容体に対する結合を低減するよう改変されないＦｃドメインを含む対応する構築物と比較して、２０％未満の、ある実施形態では１０％未満の、および選択された一実施形態では５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の一実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な一実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、ある実施形態では、ヒトＦｃｙＲＩＩＩａ、ＦｃｙＲＩおよびＦｃｙＲＩＩａのうちの１つである。いくつかの実施形態では、これらの受容体の各々との結合は低減される。いくつかの実施形態では、補体構成成分、例えばＣ１ｑ（これに限定されない）に対する結合親和性も低減される。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減されない。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体のＦｃ領域は、非改変Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能低減を示すよう改変される。ある実施形態では、エフェクター機能低減としては、以下の：補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）低減、サイトカイン分泌低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み低減、ＮＫ細胞との結合低減、マクロファージとの結合低減、単球との結合低減、多形核細胞との結合低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達低減、標的結合抗体の架橋低減、樹状細胞成熟低減、またはＴ細胞プライミング低減のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、エフェクター機能低減は、ＣＤＣ低減、ＡＤＣＣ低減、ＡＤＣＰ低減、およびサイトカイン分泌低減からなる群から選択される１つ以上である。ある実施形態では、エフェクター機能低減は、ＡＤＣＣ低減である。一実施形態では、ＡＤＣＣ低減は、非改変Ｆｃドメイン（または非改変Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。別の実施形態では、ＡＤＣＣ低減は、非改変Ｆｃドメイン（または非改変Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）により誘導されるＡＤＣＣの５０％未満である。さらなる一実施形態では、ＡＤＣＣ低減は、非改変Ｆｃドメイン（または非改変Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）により誘導されるＡＤＣＣの１０％未満である。
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が本明細書中に記載されるようなＦｃガンマ受容体の選択的結合を促すためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインを含む、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
いくつかの実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａおよびＦｃガンマＩＩｂ受容体のうちの少なくとも１つに選択的に結合する、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。
ある実施形態では、多重特異性ヘテロ多量体構築物は、ヘテロ多量体構築物が１より大きい結合価でＢ細胞に結合するよう、少なくとも１つのＢ細胞に結合する変異体ＣＨ２領域を含む。
アルブミンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物：
少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物、を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供され；前記第一および第二輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記輸送体ポリペプチドが自己集合して、前記単量体タンパク質の擬似ネイティブ構造を形成する。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、タンパク質のセグメントと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、タンパク質のセグメントと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、タンパク質のセグメントと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、タンパク質のセグメントと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記輸送体ポリペプチドが抗体に由来しない、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。さらなる一実施形態では、各輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体である、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、アルブミンベースの単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアロアルブミン誘導体である。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドが異なるアロアルブミンに由来する、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、アルブミンのセグメントと少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、アルブミンのセグメントと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、アルブミンのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、アルブミンのセグメントと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、各輸送体ポリペプチドは、アルブミンのセグメントと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一モノマー；少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物、を含むアルブミンベースの単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が本明細書中で提供され；前記第一および第二輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメント化により得られ、かつ各輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、これにより前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブアルブミンを形成し、かつ前記第一カーゴポリペプチドが前記第二カーゴポリペプチド中に存在するいかなる結合ドメインも有さない。
前記第一輸送体ポリペプチドがＡ１９４Ｃ、Ｌ１９８Ｃ、Ｗ２１４Ｃ、Ａ２１７Ｃ、Ｌ３３１ＣおよびＡ３３５Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含む、上記のようなアルブミンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、第二輸送体ポリペプチドは、Ｌ３３１Ｃ、Ａ３３５Ｃ、Ｖ３４３Ｃ、Ｌ３４６Ｃ、Ａ３５０Ｃ、Ｖ４５５Ｃ、およびＮ４５８Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与する、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される。
ある実施形態では、ネイティブアルブミン様機能的特質、例えばＦｃＲｎ結合および構造的特質を示すヘテロ多量体を形成するために自己集合する、アルブミン由来の輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体構築物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載されるアルブミンベースのヘテロ多量体構築物は、それを必要とするヒトに投与される場合、腫瘍細胞に向かう。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は固形腫瘍由来である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は腫瘍細胞に向かい、その後、前記腫瘍細胞と結合する。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、少なくとも１つの腫瘍細胞に向かい、前記腫瘍細胞の溶解を生じるやり方で、前記少なくとも１つの腫瘍細胞および少なくとも１つのＴ細胞と同時に結合する。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、少なくとも１つの腫瘍細胞に向かい、前記腫瘍細胞との結合が前記Ｔ細胞との結合より高い結合価であり、そして前記腫瘍細胞の溶解を引き起こすよう、前記少なくとも１つの腫瘍細胞および少なくとも１つのＴ細胞と同時に結合する。
ＣＤ３複合体結合ポリペプチド構築物：
本明細書中で提供される免疫グロブリンベースのおよびアルブミンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物のある実施形態では、前記ヘテロ多量体構築物は、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３特異的抗体、ナノボディ、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体からの少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインは、前記修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合、免疫原性を低減する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインは、前記修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合、Ｔｍにより測定するその安定性を増大する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの修飾を含まないネイティブＣＤ３結合ドメインと比較した場合、Ｔｍにおける約３度の増大が認められる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの修飾を含まないネイティブＣＤ３結合ドメインと比較した場合、Ｔｍにおける約５度の増大が認められる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの修飾を含まないネイティブＣＤ３結合ドメインと比較した場合、Ｔｍにおける約８度の増大が認められる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの修飾を含まないネイティブＣＤ３結合ドメインと比較した場合、Ｔｍにおける約１０度の増大が認められる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、軽鎖を欠く重鎖抗体であるＣＤ３特異的抗体に由来する少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む。
ある他の実施形態では、本明細書中に記載される少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、非抗体タンパク質足場ドメイン由来の少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む。
ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３結合Ｆａｂ構築物（すなわち、各々、可変および定常領域を含む、重鎖および軽鎖を含む抗原結合構築物）である。いくつかの実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記Ｆａｂ構築物はヒトである。別の実施形態では、前記Ｆａｂ構築物はヒト化されている。さらに別の実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は、ヒト重および軽鎖定常領域のうちの少なくとも１つを含む。さらなる一実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）である。
ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ペプチドリンカーによりＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端と連結されるＣＤ３結合ｓｃＦａｂ構築物を含む。ペプチドリンカーは、Ｆａｂ重および軽鎖の配置に機能的ＣＤ３結合部分を形成させる。ある実施形態では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖を連結するのに適したペプチドリンカーは、グリシン−セリンリンカーを含む配列、例えば（ＧｍＳ）ｎ−ＧＧ、（ＳＧｎ）ｍ、（ＳＥＧｎ）ｍ（式中、ｍおよびｎは０〜２０である）を包含するが、これらに限定されない。ある実施形態では、ｓｃＦａｂ構築物は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常領域が交換される交差構築物である。交差Ｆａｂの別の実施形態では、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換される。
ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３結合Ｆｖ構築物（すなわち、各々、可変領域を含む、重鎖および軽鎖を含む抗原結合構築物）を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｖ構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記Ｆｖ構築物はヒトである。別の実施形態では、前記Ｆｖ構築物はヒト化されている。さらに別の実施形態では、前記Ｆｖ構築物は、ヒト重および軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。さらなる一実施形態では、前記Ｆｖ構築物は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物のＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３複合体の少なくとも１つの構成成分と結合する。具体的一実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタまたはＣＤ３ゼータのうちの少なくとも１つと結合する。ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３イプシロンドメインに結合する。ある実施形態では、結合ポリペプチド構築物はヒトＣＤ３複合体に結合する。ある実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチド構築物は、ＣＤ３複合体の少なくとも１つの成員との異種間結合を示す。
少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物を含む、免疫グロブリンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される（ここで、ＣＤ３発現細胞はＴ細胞である）。ある実施形態では、ＣＤ３発現細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３発現細胞は非ヒト、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
本明細書中で提供される免疫グロブリンベースの、およびアルブミンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物のある実施形態では、構築物は、Ｂ細胞のような標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性活性を活性化し再指向させ得る。特定の一実施形態では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示および／またはＴ細胞の特異性とは独立している。
Ｂ細胞抗原、例えば腫瘍細胞抗原、および活性化Ｔ細胞抗原との同時結合を可能にするヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される。一実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９またはＣＤ２０、および活性化Ｔ細胞抗原、例えばＣＤ３との同時結合によりＴ細胞および標的Ｂ細胞を架橋し得る。一実施形態では、同時結合は、標的Ｂ細胞、例えば腫瘍細胞の溶解を生じる。一実施形態では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を生じる。他の実施形態では、このような同時結合は、Ｔリンパ球、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞性応答を生じるが、細胞性応答は、以下の群から選択される：増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性、および活性化マーカーの発現。一実施形態では、標的細胞抗原との同時結合を伴わないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との結合は、Ｔ細胞活性化を生じない。
Ｂ細胞結合ポリペプチド構築物：
少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む単離ヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞ＣＤ２１−ＣＤ１９−ＣＤ８１複合体の少なくとも１つの成員に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、少なくとも１つのＣＤ１９結合ドメインまたはその断片を含む。一実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、少なくとも１つのＣＤ２０結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９またはＣＤ２０特異的抗体、ナノボディ、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体から得られるＣＤ１９またはＣＤ２０結合ドメインである。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物は、軽鎖を欠く重鎖抗体である抗体からのＣＤ１９またはＣＤ２０結合ドメインである少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、前記修飾を含まない対応する抗原結合ドメインと比較して、免疫原性を低減する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むＣＤ１９またはＣＤ２０結合ドメインである。一実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、前記修飾を含まない対応する抗原結合ドメインと比較して、Ｔｍにより測定するその安定性を増大する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むＣＤ１９またはＣＤ２０結合ドメインである。
ある実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２０のうちの少なくとも１つに結合するＦａｂ構築物である。いくつかの実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記Ｆａｂ構築物はヒトである。別の実施形態では、前記Ｆａｂ構築物はヒト化されている。さらに別の実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のうちの少なくとも１つを含む。さらに一実施形態では、前記Ｆａｂ構築物は、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）である。
ある実施形態では、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０結合ポリペプチド構築物は、ペプチドリンカーによりＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端と連結されるｓｃＦａｂ構築物を含む。ペプチドリンカーは、Ｆａｂ重および軽鎖の配置に機能的ＣＤ１９および／またはＣＤ２０結合部分を形成させる。ある実施形態では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖を連結するのに適したペプチドリンカーは、グリシン−セリンリンカーを含む配列、例えば（ＧｍＳ）ｎ−ＧＧ、（ＳＧｎ）ｍ、（ＳＥＧｎ）ｍ（式中、ｍおよびｎは０〜２０である）を包含するが、これらに限定されない。ある実施形態では、ｓｃＦａｂ構築物は、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常領域が交換される交差構築物である。交差Ｆａｂの別の実施形態では、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換される。
ある実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２０のうちの少なくとも１つに結合するＦｖ構築物である。いくつかの実施形態では、前記Ｆｖ構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記Ｆｖ構築物はヒトである。別の実施形態では、前記Ｆｖ構築物はヒト化されている。さらに別の実施形態では、前記Ｆｖ構築物は、ヒト重および軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。さらなる一実施形態では、前記Ｆｖ構築物は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
ある実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞の表面上で発現される少なくとも１つの抗原との異種間結合を示す。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物は、哺乳動物ＣＤ１９およびＣＤ２０のうちの少なくとも１つと結合する。ある実施形態では、結合ポリペプチド構築物は、ヒトＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する。
Ｂ細胞抗原、例えば腫瘍細胞抗原、および活性化Ｔ細胞抗原との同時結合が可能であるヘテロ多量体構築物が、本明細書中で提供される。一実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９またはＣＤ２０、および活性化Ｔ細胞抗原、例えばＣＤ３との同時結合により、Ｔ細胞および標的Ｂ細胞を架橋し得る。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、疾患と関連した少なくとも１つのＢ細胞上のＣＤ１９またはＣＤ２０のような標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、疾患は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である。一実施形態では、癌は、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫のうちの少なくとも１つである。ある実施形態では、少なくとも１つのＢ細胞は、リンパ球系または骨髄系の細胞である自己免疫反応性細胞である。
付加的抗原結合構築物：
ある実施形態では、本明細書中に記載されるアルブミンまたは免疫グロブリンベースの多重特異性ヘテロ多量体構築物は、さらに、以下：ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管退縮因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（繊維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＥＰＨＡ４ ＣＤ６３、ＣＤ３ ＢｓＡｂイムノサイトカインＴＮＦ（サイトカインと結合されるＣＤ３抗体を含む）、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＲＡＩＬのうちの少なくとも１つに結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。
翻訳後修飾：
ある実施形態では、翻訳中または翻訳後に異なって修飾される、本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物が提供される。いくつかの実施形態では、修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基、タンパク質分解的切断、ならびに抗体分子または他の細胞性リガンドとの連結による誘導体化のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、既知の技法、例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元;ならびにツニカマイシン存在下での代謝合成により化学的に修飾されるがこれらに限定されない。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体の付加的翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖の化学的修飾、ならびに原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、検出可能な標識で、例えば酵素、蛍光、同位体または親和性標識で修飾されて、タンパク質の検出および単離を可能にする。ある実施形態では、適切な酵素標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、イオウ、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
具体的実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、天然過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野で周知の化学修飾技法により修飾される。ある実施形態では、同一型の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同一または種々の程度で存在し得る。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体からのポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝され、およびいくつかの実施形態では、分枝を伴って、または伴わずに、環状である。環状分枝鎖および分枝鎖環状ポリペプチドは、翻訳後天然過程の結果であるか、あるいは合成方法により作成される。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、システインの生成、ピログルタメートの生成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えばアルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｇｓ． １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）； Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は固体支持体と結合され、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合され、それと結合し、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。このような固体支持体としては、硝子、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド：
本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物をコードするポリヌクレオチド構築物が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。
ある実施形態では、第一および第二ポリペプチド構築物を含む、本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体構築物を発現するための一式の発現ベクターであって、前記一式が、前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列を含む、発現ベクターが提供される。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物または本明細書中で提供されるような配列を有するそのポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、図＿に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物またはそのポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド配列が提供され、前記ポリヌクレオチドは本明細書中で提供されるような保存的な配列の突然変異を含む。
多重特異性ヘテロ多量体構築物の組換えおよび合成的産生の方法；
安定な哺乳動物細胞における、本明細書中に記載されるような多重特異性ヘテロ多量体構築物を含有する発現生成物の産生方法であって、前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列で少なくとも１つの哺乳動物細胞をトランスフェクトし、これにより、前記少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、前記少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列が、予定比率で前記少なくとも１つの哺乳動物細胞にトランスフェクトされて安定な哺乳動物細胞を生成する段階；前記安定哺乳動物細胞を培養して、前記多重特異性ヘテロ多量体を含む前記発現生成物を産生する段階、を包含する方法が提供される。ある実施形態では、少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列:少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率は、約１:１である。ある他の実施形態では、少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列:少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率は、１つの第一ＤＮＡ配列の量が大きくなる方向に傾き、例えば約２:１である。さらなる他の実施形態では、少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列:少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率は、１つの第一ＤＮＡ配列の量が大きくなる方向に傾き、例えば約１:２である。選択的実施形態では、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される。
ある実施形態では、酵母、例えば細菌などの微生物、あるいはヒトまたは動物細胞株からの分泌により組換え分子として産生されるヘテロ多量体が提供される。実施形態では、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
実施形態は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質を発現するよう形質転換される細胞、例えば酵母細胞を包含する。形質転換宿主細胞それ自体に加えて、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、またはモノクローナル培養物由来の培養物が提供される。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞を伴って、あるいはそれらが濾過されまたは遠心分離されていた場合には細胞を伴わずに、ポリペプチドを含有する。多数の発現系が既知であり用いられ得るが、例としては、細菌（例えば、大腸菌（E.coli）および枯草菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびメタノール資化酵母(Pichia pastoris)）、糸状真菌（例えばアスペルギルス(Aspergillus)）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、慣用的方法で、例えば宿主染色体中または遊離プラスミド上に挿入されるコード配列から産生される。酵母は、通常の方法のいずれか、例えば電気穿孔で、所望のタンパク質のためのコード配列で形質転換される。電気穿孔による酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技法により同定され得る。例えば、発現構築物の導入に起因する細胞は、増殖されて、所望のポリペプチドを産生し得る。細胞は収穫され、溶解されて、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８により記載された方法と同様の方法を用いて、ＤＮＡの存在に関してそれらのＤＮＡ含有物が調べられる。または、上清中のタンパク質の存在が、抗体を用いて検出され得る。
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ． ９２０３７， ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であって、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を含む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメア型プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。
相補的付着末端を介してベクターにＤＮＡを操作可能的に連結するために、種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。ベクターおよびＤＮＡセグメントは、次に、相補的ホモポリマー尾部間で水素結合により繋ぎ合わされて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに接合する代替的方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で処理されるが、これらは、それらの３'５'−エキソヌクレオチド分解性活性で突出する一本鎖末端を除去し、それらの重合活性で凹んだ３'末端を充填する酵素である。
したがって、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、多余分モル量のリンカー分子とともにインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を保有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、次に、適切な制限酵素で切断されて、ＤＮＡセグメントの末端と適合性の末端を産生する酵素で切断されている発現ベクターにライゲーションされる。
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、多数の供給元、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， Ｃｏｎｎ．， ＵＳＡから市販されている。
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実行において有用であると意図された酵母の例示的な属は、ピキア(Pichia)（以前はハンセヌラ(Hansenula)として分類されていた）、サッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、トルロプシス(Torulopsis)、トルラスポラ(Torulaspora)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、シテロミセス(Citeromyces)、パキソレン(Pachysolen)、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、デバロミセス(Debaromyces)、トリコデルマ(Trichoderma)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、フミコラ(Humicola)、ムコール(Mucor)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヤロウィア(Yarrowia)、メトシュニコヴィア(Metschunikowia)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ボトリオアスクス(Botryoascus)、スポリジオボルス(Sporidiobolus)、エンドマイコプシス(Endomycopsis)等である。好ましい属は、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、クルイベロミセス、ピキアおよびトルラスポラからなる群から選択される。サッカロミセス種の例は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)、Ｓ．イタリクス(S. italicus)およびＳ．ロウキシイ(S. rouxii)である。
クルイベロミセス種の例は、Ｋ．フラギリス(K. fragilis)、Ｋ．ラクチス(K. lactis)およびＫ．マルキシアヌス(K. marxianus)である。適切なトルラスポラ種は、Ｔ．デルブルエッキイ(T. delbrueckii)である。ピキア（ハンセヌラ）種の例は、Ｐ．アングスタ(P. angusta)（以前はＨ．ポリモルファ(H. polymorpha)）、Ｐ．アノマラ(P. anomala)（以前はＨ．アノマラ(H. anomala)）およびＰ．パストリス(P. pastoris)である。Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)の形質転換のための方法は、一般的に、ＥＰ ２５１ ７４４、ＥＰ ２５８ ０６７およびＷＯ ９０／０１０６３（これらはすべて、その記載内容が参照により本明細書中で援用される）に教示されている。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の合成のために有用なサッカロミセスの例示的な種としては、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクス、Ｓ．ジアスタティクス(S. diastaticus)およびジゴサッカロミセス・ロウキシイ(Zygosaccharomyces rouxii)が挙げられる。クルイベロミセスの好ましい例示的な種としては、Ｋ．フラギリスおよびＫ．ラクチスが挙げられる。ハンセヌラの好ましい例示的な種としては、Ｈ．ポリモルファ（今は、ピキア・アングスタ）、Ｈ．アノマラ（今は、ピキア・アノマラ）およびピキア・カプスラタが挙げられる。ピキアの付加的な好ましい例示的な種としては、Ｐ．パストリスが挙げられる。アスペルギルスの好ましい例示的な種としては、Ａ．ニガー(A. niger)およびＡ．ニヅランス(A. nidulans)が挙げられる。ヤロウィアの好ましい例示的な種としては、Ｙ．リポリチカ(Y. lipolytica)が挙げられる。多数の好ましい酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現において有用である：サッカロミセス・セレビシエ、ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３ ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２２７３１）；サッカロミセス・セレビシエ ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３ ｈｓｐ１５０突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２１２６６）；サッカロミセス・セレビシエ ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３ ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２３７９２）；サッカロミセス・セレビシエ ハンセン、テレオモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；および６２９９５）；サッカロミセス・ジアスタティクス Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号６２９８７）；クルイベロミセス・ラクチス（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ） ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号７６４９２）；ピキア・アングスタ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎ等） Ｋｕｒｔｚｍａｎ、テレモルフ（ハンセヌラ・ポリモルファ ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ ｅｔ Ｍａｉａ、テレモルフとして寄託）（ＡＴＣＣ寄託番号２６０１２）；アスペルギルス・ニガー ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号９０２９）；アスペルギルス・ニガー ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号１６４０４）；アスペルギルス・ニヅランス（Ｅｉｄａｍ） Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号４８７５６）；およびヤロウィア・リポリチカ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ等） ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ ｅｔ ｖｏｎ Ａｒｘ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０１８４７）。
サッカロミセス・セレビシエに関する適切なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２に関連するもの、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、アルファ−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］に関する遺伝子、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および５'調節領域の部分と他のプロモーターの５'調節領域の部分との、または上流の活性化部位とのハイブリッドを包含するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８ ０６７のプロモーター）が挙げられる。
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)において用いるための便利な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５， １０８５７−１０８６４により記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制性プロモーター、ならびにＨｏｆｆｍａｎ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ （１９９０） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２４， ８０７−８１６により記載されたようなグルコース抑制性ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
外来遺伝子の発現のためにピキアを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、ならびに種々のＰｈｉｌｌｉｐｓ特許（例えば、米国特許第４，８５７，４６７号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））に教示されており、ピキア発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ， Ｌｅｅｋ， ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，３４５９−３４６５は、ハンセヌラベクターおよび形質転換に関する情報を包含しており、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；一方、ＥＰ ３６１ ９９１、Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒからのその他の出版物は、クルイベロミセス種における外来タンパク質を発現する方法を教示しており、適切なプロモーターはＰＧＫＩである。
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化のための適正なシグナルを含有する真核生物遺伝子の３'フランキング配列である。適切な３'フランキング配列は、例えば、用いられる発現制御配列と天然に連結された遺伝子の配列であり、すなわち、プロモーターに対応し得る。また、それらは、サッカロミセス・セレビシエＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい場合には異なり得る。
ある実施形態では、所望のヘテロ多量体タンパク質は最初、分泌リーダー配列を伴って発現され、分泌リーダー配列は選択される酵母において有効な任意のリーダーであり得る。サッカロミセス・セレビシエに有用なリーダーとしては、接合因子アルファポリペプチド（ＭＦα−１）由来のものおよびＥＰ−Ａ−３８７ ３１９のハイブリッドリーダーが挙げられる。このようなリーダー（またはシグナル）が酵母により切断された後、成熟アルブミンが周囲培地中に放出される。さらに、このようなリーダーとしては、ＪＰ ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許付与）に開示されたサッカロミセス・セレビシエ インベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦα−１のプレ配列、０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；サッカロミセス・ジアスタティクス グルコアミラーゼＩｌ；サッカロミセス・カールスベルゲンシス α−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；クルイベロミセス・ラクチス キラー毒素；およびカンジダ・グルコアミラーゼのものが挙げられる。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞、ならびに合成および組換え技法によるヘテロ多量体タンパク質の産生が提供される。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスベクターであり得る。レトロウィルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損性であり得る。後者の場合、ウィルス増殖は、一般的に、相補的な宿主細胞でのみ起こる。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含有するベクターと結合される。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に導入され、あるいは荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウィルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージされ、次いで、宿主細胞中に形質導入され得る。
ある実施形態では、ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター、例えばファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウィルスＬＴＲのプロモーター等に、操作可能的に連結される。その他の適切なプロモーターは、当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位を含み、かつ、転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。当該構築物により発現される転写体のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、そして最後に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を包含する。
上記のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーとしては、ジヒドロフォレートレダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、あるいは真核生物培養に関するネオマイシン耐性、ならびに大腸菌およびその他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス（ＡＴＣＣ寄託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞に関する適切な培地および培養条件は、当該技術分野で既知である。
細菌において用いるために選択されるベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ；ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能）。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。酵母系で用いるための好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになる。
一実施形態では、本明細書中に記載される単離多重特異性ヘテロ多量体構築物をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の局在化を原核生物または真核生物細胞の特定区画に向ける、および／または原核生物あるいは真核生物細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指図するシグナル配列と融合される。例えば、大腸菌では、タンパク質の発現をペリプラズム空間に向けたいと考え得る。細菌のペリプラズム空間にポリペプチドの発現を向けるために、ヘテロ多量体タンパク質が融合されるシグナル伝達配列またはタンパク質（またはその断片）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、ならびにアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の局在化を指図する融合タンパク質の構築のためのいくつかのベクターが市販されており、例としては、ｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−．ｒｈｏ．シリーズ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）が挙げられる。具体的一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクテートリアーゼシグナル配列と融合されて、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増大し得る。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照のこと。
哺乳動物細胞におけるその分泌を指図するためにヘテロ多量体タンパク質と融合されるシグナルペプチドの例としては、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）、ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ）、およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウィルス発現系とともに用いられ得る適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）である。
選択可能マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いるベクターは、それぞれ、薬剤メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの存在下で増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、ネズミ骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、内因性遺伝子の働きを防止するために付加的阻害薬を提供することにより、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成成分は、ＰＣＴ公告：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／１００３６；ＷＯ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳述されている。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．）から獲得され得る。ネズミ骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を用いるモノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １１：１（１９９５）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞、ならびに付加的に、当該技術分野で既知の技法を用いて、１つ以上の非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能的に連携するヌクレオチド配列を含有する宿主細胞も提供される。宿主細胞は、高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）、または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であり得、あるいは宿主細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調整するか、あるいは所望の特異的方式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主系統が、選択され得る。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下で増大され得る;したがって、遺伝子改変ポリペプチドの発現は、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）のための特質および特異的機構を有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株が選択され得る。
宿主細胞中への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染またはその他の方法により実行され得る。このような方法は、多数の標準的実験室マニュアル、例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）に記載されている。本発明のポリペプチドは、実際に、組換えベクターを欠く宿主細胞により発現され得る、ということが具体的に意図される。
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞を包含するほかに、本発明は、内因性遺伝物質を欠失するかまたは置換するよう（例えば、カーゴポリペプチドに対応するコード配列がカーゴポリペプチドに対応するヘテロ多量体タンパク質と置換される）、および／または遺伝物質を含むよう改変されている、脊椎動物起源の、特に哺乳動物起源の一次、二次および不死化宿主細胞も包含する。内因性ポリヌクレオチドと操作可能的に連携する遺伝物質は、内因性ポリヌクレオチドを活性化し、変更し、および／または増幅し得る。
さらに、当該技術分野で既知の技法を用いて、非相同ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片または変異体）および／または非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、相同組換えにより、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と操作可能的に連携し得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号 ＷＯ ９６／２９４１１；国際公開番号 ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）参照）。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、周知の方法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡによる）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために用いられる。
ある実施形態では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＱ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＱ、ポロスＤＥＡＦ、トヨパールＱ、トヨパールＱＡＥ、トヨパールＤＥＡＥ、リソース／ソースＱおよびＤＥＡＥ、フラクトゲルＱおよびＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
具体的実施形態では、本明細書中に記載されるタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィー、例えばＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、トヨパールＳＰ、トヨパールＣＭ、リソース／ソースＳおよびＣＭ、フラクトゲルＳおよびＣＭカラムならびにそれらの等価物および匹敵物上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
さらに、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、当該技術分野で既知の技法を用いて化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．ＹおよびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）参照）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、ポリペプチド配列中に置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般のアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、およびアミノ酸類似体が概して挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
アッセイ：
本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、当該技術分野で既知のアッセイを用いて、またはそれを慣例的に修飾して、ならびに本明細書中に記載されるアッセイを用いて、機能的活性（例えば、生物学的活性）に関してアッセイされ得る。
例えば、抗原と結合する、あるいは抗原との結合に関して別のポリペプチドと競合するか、またはＦｃ受容体および／または抗アルブミン抗体と結合する本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の能力に関してアッセイする一実施形態では、当該技術分野で既知の種々のイムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射能測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫核酸アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用）、ウェスタン・ブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集限定、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等（これらに限定されない）などの技法を用いる競合および非競合アッセイ系が用いられ得る。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識の検出により検出される。別の実施形態では、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる一実施形態では、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多数の手段が当該技術分野で既知であり、本発明の範囲内である。
結合相手（例えば、受容体またはリガンド）が、本明細書中に記載されるヘテロ多量体に含まれる抗原結合ドメインに対して同定される、ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体によるその結合相手との結合は、例えば、当該技術分野で周知の手段、例えば還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングによりアッセイされる。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の抗原結合ポリペプチド構築物の基質（単数または複数）と結合するヘテロ多量体タンパク質の生理学的相関物の能力は、当該技術分野で既知の技法を用いて慣例的に検定され得る。
治療的使用：
一態様において、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は抗体ベースの療法に向けられ、この療法は抗体、抗体の断片または変異体であるカーゴポリペプチド（単数または複数）を含む記載のヘテロ多量体を、開示される疾患、障害または症状のうちの１つ以上を処置するために患者に投与する段階を包含する。本明細書中に記載される治療用化合物としては、本明細書中に記載されるヘテロ多量体、本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、増殖性疾患、微小残存癌、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウィルス性疾患、アレルギー反応、寄生生物性反応、移植片対宿主疾患または宿主対移植片疾患、あるいは細胞悪性腫瘍のうちの少なくとも１つの防止、処置または改善のための方法が提供され、前記方法はこのような防止、処置または改善を必要とする対象に本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物を含む薬学的組成物を投与する段階を包含する。
ある実施形態では、それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載される薬学的組成物を、任意で他の薬学的に活性な分子と組み合わせて含む組成物を哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である。ある他の実施形態では、癌は血液学的癌である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および白血病のうちの１つ以上である。
癌細胞の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物を含む組成物を前記細胞に提供する段階を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、当該方法は、前記ヘテロ多量体を別の治療薬と一緒に提供する段階をさらに包含する。
それを必要とする哺乳動物におけるブリナツモマブに非応答性である癌の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物を含む薬学的組成物を含む組成物を哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、ブリナツモマブによる処置後に退縮する癌細胞の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物を含む薬学的組成物を含む組成物を前記癌細胞に提供する段階を包含する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞の発現により特徴付けられる疾患に罹患している個体の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物を含む薬学的組成物を含む有効量の組成物を前記個体に提供する段階を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、疾患は、抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ２０抗体のうちの少なくとも１つによる処置に応答性でない。ある実施形態では、疾患は、ＣＤ１９またはＣＤ２０溶解性抗体に抵抗性の癌または自己免疫症状である。
それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。ある実施形態では、自己免疫症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である。
それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体を含む有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階を包含する方法が提供される。
本明細書中で提供される教示を備えることで、過度の実験を必要とせずに、診断、モニタリングまたは治療目的のための本明細書中に記載されるヘテロ多量体の使用方法が、当業者には分かるであろう。
少なくとも抗体の断片または変異体を含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者の種と同一種である種起源または種反応性（抗体の場合）の生成物の投与が好ましい。したがって、一実施形態では、ヒト抗体、断片、誘導体、類似体、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
遺伝子療法：
具体的一実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードする配列を含む核酸は、遺伝子療法として、タンパク質の異所性発現および／または活性と関連する疾患または障害を処置し、抑制し、または防止するために投与される。遺伝子療法とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することにより実施される療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療的効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を産生する。当該技術分野で利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれかが用いられ得る。
当該技術分野で記載されるＴ細胞関与二重特異性一本鎖抗体は悪性疾患の処置のための大きな治療的可能性を有するが、これらの二重特異性分子のほとんどが、それらが種特異的でありヒト抗原のみを認識し、および遺伝的類似性のため、チンパンジー同等物を認識し得る、という点で限定される。本発明の利点は、ＣＤ３イプシロン鎖のヒトおよび非チンパンジー霊長類に対する異種間特異性を示す結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体の提供である。
治療的または予防的活性の実証：
本明細書中に記載されるヘテロ多量体または薬学的組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療的または予防的活性に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の作用を包含する。細胞株および／または組織試料に及ぼす化合物または組成物の作用は、当業者に既知の技法、例えばロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを利用して決定され得る。本発明に従って、具体的な一化合物の投与が必要か否かを決定するために用いられ得るｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを包含し、アッセイでは患者組織試料が培養中で増殖され、ヘテロ多量体に曝露されるか、またはそうでなければヘテロ多量体を投与され、かつ組織試料に及ぼすこのようなヘテロ多量体の作用が観察される。
治療的／予防的投与および組成物：
有効量の本明細書中に記載されるヘテロ多量体または薬学的組成物の対象への投与による処置、抑制および予防の方法が提供される。一実施形態では、ヘテロ多量体は、実質的に精製される（例えば、その作用を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある実施形態では、対象は、動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等（これらに限定されない）であり、ある実施形態では、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
種々の送達系が既知であり本明細書中に記載されるヘテロ多量体処方物を投与するために用いることができ、例えばリポソーム、微小粒子、マイクロカプセル中の封入、化合物を発現し得る組換え体細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウィルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および口腔経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の便利な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内張り（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜等）を通した吸収により投与されてよく、また他の生物学的に活性な作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、ある実施形態では、任意の適切な経路により、例えば脳室内およびくも膜下腔内注射により、本明細書中に記載されるヘテロ多量体組成物を中枢神経系に導入することが望ましい；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａレザバーのようなレザバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易になり得る。例えば、吸入器またはネブライザー、ならびにエアロゾル化剤を伴う処方物の使用により、肺内投与も用いられ得る。
具体的一実施形態では、処置を必要とする区域に局所的に、本明細書中に記載されるヘテロ多量体または組成物を投与することが望ましい；これは、例えば外科手術中の局所注入、局所的適用（例えば術後に創傷用包帯とともに）、注射により、カテーテルにより、坐薬により、または移植片により（これらに限定されない）達成され得るが、前記移植片は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質であり、シリコーン膜などの膜、または繊維を含む。好ましくは、本発明のタンパク質、例えば抗体を投与する場合、タンパク質が吸収しない物質を用いるよう注意しなければならない。
別の実施形態では、ヘテロ多量体または組成物は、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）； Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３５３−３６５ （１９８９）； Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書， ｐｐ． ３１７−３２７参照；一般的に同書参照）。
さらに別の実施形態では、ヘテロ多量体または組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー物質が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ （ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照）。さらに別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置され、したがって全身用量の一部を要するだけである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
その他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０））による概説で考察されている。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸を含む具体的一実施形態では、核酸は、それが細胞内に存在するよう適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築することにより、そのコード化タンパク質の発現を促すためにｉｎ ｖｉｖｏで投与でき、例えばレトロウィルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）により、または直接注射により、または微小粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子銃;Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）により、あるいは脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト化剤で被覆することにより、あるいは核に進入することが既知であるホメオボックス様ペプチドと連結してそれを投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）参照）などにより投与され得る。または相同組換えにより、核酸は細胞内に導入されて発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れられ得る。
薬学的組成物も提供される。このような組成物は、治療的有効量の化合物、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む。具体的一実施形態では、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物に、さらに特定的にはヒトに用いるために、連邦政府または州政府の規制行政庁により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知されている薬局方に列挙された、ということを意味する。「担体」という用語は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。薬学的組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射溶液用に用いられ得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性処方物等の形態をとり得る。組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを伴って、坐薬として処方され得る。経口処方物は、標準的担体、例えば薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。このような組成物は、患者への適正投与のための形態を提供するために、治療的有効量の化合物（好ましくは精製形態で）を適量の担体と一緒に含有する。処方物は、投与方式に合わせるべきである。
ある実施形態では、ヘテロ多量体を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合される薬学的組成物として、慣例的手法に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤および局所麻酔薬、例えばリグノカインも含み、注射部位での疼痛を楽にし得る。一般的に、成分は、別々にまたは単位剤形中に一緒に混合して供給され、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物としてアンプルまたはサッシェなどの密閉容器中で活性作用物質の量を示して供給される。組成物が注入により投与されるべきものである場合、それは滅菌薬学的等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るよう、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
ある実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、中性または塩形態として処方される。薬学的に許容可能な塩としては、陰イオンを有して生成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの、および陽イオンを有して生成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものを包含する。
治療用タンパク質の異所性発現および／または活性と関連した疾患または障害の処置、抑制および防止に有効である本明細書中に記載される組成物の量は、標準臨床技法により決定され得る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、最適投与量範囲を同定するのを手助けするために任意で用いられ得る。処方物中に用いられるべき精確な用量は、投与経路、ならびに疾患または障害の重篤度によっても決まり、かつ開業医の判断および各患者環境によって決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推定される。
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、一時点で、または一連の処置の全体を通して、患者に適切に投与される。疾患の型および重症度によって、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初回候補投与量であってよく、例えば、１回以上の別々の投与によるか、または連続注入による。典型的な一日投与量の１つは、上記因子に依存して約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であり得る。数日またはそれより長い間の反復投与に関しては、条件によるが、処置は一般的には、疾患症候の所望の抑圧が起きるまで持続され得る。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の一例示的投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定例では、用量は、約１マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約５マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約１０マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約５０マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約１００マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約２００マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約３５０マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約５００マイクログラム／体重１ｋｇ〜、約１ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約５ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約１０ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約５０ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約１００ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約２００ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約３５０ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約５００ミリグラム／体重１ｋｇ〜、約１０００ｍｇ／体重１ｋｇを含み、またはそれ以上、ならびにその中で導き出せる任意の範囲を１回投与当たりで含み得る。本明細書中に列挙される数字から導き出せる範囲の非限定例では、約５ｍｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約５マイクログラム体重１ｋｇ〜約５００ミリグラム体重１ｋｇ等の範囲が、上記数字に基づいて投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（あるいはその任意の組合せ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。このような用量は、間欠的に、例えば毎週または３週間毎に（例えば、約２〜約２０用量の、または例えば約６用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を患者が摂取するように）投与され得る。初回高負荷用量とその後の１回以上の低用量が、投与され得る。しかしながら、その他の投与量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、慣用的技法およびアッセイにより容易にモニタリングされる。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で用いられる。疾患状態を処置または防止するための使用に関しては、本明細書中に記載されるヘテロ多量体またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与されるかまたは適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与に関しては、治療的有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に概算され得る。次に、細胞培養中で決定されたようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量が処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る。
初期用量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば当該技術分野で周知である技法を用いて、動物モデルからも概算され得る。当業者は、動物データに基づいたヒトへの投与を容易に最適化し得る。
治療効果を保持するのに十分である本明細書中に記載されるヘテロ多量体の血漿レベルを提供するために、投与の量および間隔は個別に調整され得る。注射による投与のための有用な患者投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的有効血漿レベルは、毎日多数回の用量投与を施すことにより達成され得る。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定され得る。
局所投与または選択的取り込みの場合、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の有効局所濃度は、血漿濃度と関連し得ない。当業者は、過度の実験を伴わずに、治療的有効局所投与量を最適化し得る。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物の治療的有効用量は、一般的に、実質的毒性を生じることなく、治療的利益を提供する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の毒性および治療的効力は、細胞培養または実験動物において標準の薬学的手法により決定され得る。細胞培養アッセイおよび動物試験を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％までが致死である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定し得る。毒性と治療的有効性との間の用量比は治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きい治療指数を示すＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施形態では、本発明による本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用に適した投与量の範囲を処方するのに用いられ得る。投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。種々の因子、例えば用いられる剤形、利用される投与経路、対象の状態等によって、投与量はこの範囲内で変化し得る。的確な処方物、投与経路および投与量は、患者の状態に鑑みて、個々の医者により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ，１９７５，ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１参照（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物で処置される患者のための主治医は、毒性、臓器不全などのために投与を終結し、中断し、または調整する方法および時機を知っている。逆に、臨床的応答が適切でない（毒性を除いて）場合、より高レベルに処置を調整することも、主治医は判っている。当該障害の管理における投与用量の規模は、処置されるべき症状の重症度に伴って、投与経路に伴って等で変化する。例えば症状の重症度は、一部は、標準予後評価方法により評価され得る。さらに、用量、そしておそらくは用量投与頻度も、個々の患者の年齢、体重および応答によって変わる。
本明細書中に記載されるヘテロ多量体を含む薬学的組成物の産生方法であって、ヘテロ多量体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階;培養物から生成ヘテロ多量体を回収する段階;および薬学的組成物を産生する段階を包含する方法も提供される。
その他の作用物質および処置：
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、治療に際して、１つ以上のその他の作用物質と組み合わせて投与される。例えば、一実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つの付加的治療薬と同時投与される。「治療薬」という用語は、このような処置を必要とする個体における症候または疾患を処置するために投与される任意の作用物質を包含する。このような付加的治療薬は、処置されている特定の適応症に適した任意の活性成分を含み、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。ある実施形態では、付加的治療薬は、免疫調節薬、細胞増殖抑制薬、細胞接着の阻害薬、細胞傷害薬、細胞アポトーシスの活性化薬、またはアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増大する作用物質である。特定の一実施形態では、付加的治療薬は、抗癌薬、例えば微小管崩壊物質、抗代謝薬、トポイソメラーゼ阻害薬、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法薬、キナーゼ阻害薬、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、または抗血管新生薬である。
このようなその他の作用物質は、意図される目的のために有効である量で組み合わせて適切に存在する。このようなその他の作用物質の有効量は、用いられるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害または処置の型、ならびに上記のその他の因子によって決まる。本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、一般的に、本明細書中で記載されるものと同一投与量且つ投与経路で、あるいは本明細書中に記載される投与量の約１〜９９％で、あるいは適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投与量および任意の経路で、用いられる。
上記のこのような併用療法は、併用投与（この場合、２つ以上の治療薬が同一のまたは別個の組成物中に含まれる）および別々の投与（この場合、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の投与は、付加的治療薬および／またはアジュバントの投与の前、同時に、および／または後に起こり得る）を包含する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、放射線療法と組み合わせても用いられ得る。
製品：
本発明の別の態様では、上記の障害の処置、防止および／または診断のために有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器、ならびに容器上のまたは容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液袋等が挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、単独の組成物、または症状を処置し、防止し、および／または診断するために有効な別の組成物と組み合わせられる組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により刺し貫かれ得る栓を有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性作用物質は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択の症状を処置するために用いられる、ということを示す。さらに、製品は、（ａ）そこに含入される組成物を有する第一容器（組成物は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体を含む）;ならびに（ｂ）そこに含入される組成物を有する第二容器（組成物は、さらなる細胞傷害薬またはそうでなければ治療薬を含む）を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が特定症状を処置するために用いられ得るということを示す添付文書をさらに含み得る。代替的には、または付加的には、製品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）容器をさらに含み得る。それはさらに、商業的およびユーザーの見地から望ましいその他の材料、例えばその他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針および注射器を包含し得る。
以下の具体的且つ非限定的例は、単なる例証として意図されるものであって、いかなる点においても本発明の開示を限定するものではない。さらなる詳細な検討の必要もなく、本明細書中の記載に基づいて、当業者は本発明の開示を最大限利用し得る。本明細書中で引用される出版物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子または識別符号を参照する場合、このような識別子は変化し得るし、インターネットにおける特定情報は移り変わり得るが、しかし等価情報はインターネット検索により見出され得る、と理解される。それを参照することは、このような情報の利用可能性および公的普及を立証する。
実施例１：非対称ＩｇＧ１ Ｆｃと融合された二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓ
ネイティブＦｃホモ二量体に匹敵する安定性を示す非対称ＩｇＧ１ Ｆｃヘテロ二量体と融合された二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓは、ｖ８７３として同定される新規の組成物である。Ｖ８７３は、哺乳動物ＣＨＯ細胞において発現されＡｍｇｅｎ／Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ二重特異性と比較して著しく高い収率で精製され得るＣＤ３ベースの二重特異性ａｚｙｍｅｔｒｉｃＩｇＧ１抗体の新規ファミリーに属する。Ｖ８７３は、予期せぬエフェクター:標的細胞結合、架橋および標的細胞死滅を示す。
Ｖ８７３および二重特異性ＣＤ３ベースのａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体は、罹患細胞の標的化Ｔ細胞媒介性死滅における有用性を有し、それゆえ、癌ならびに自己免疫および炎症性疾患を処置するために有用であり得る。Ｖ８７３は、ａｚｙｍｅｔｒｉｃＩｇＧ１ Ｆｃと融合された二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓである。ｖ８７３は、１つの抗ＣＤ３実用頭部および標的細胞の細胞表面抗原を含む第二実用頭部、およびヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃを含む抗体Ｆｃヘテロ二量体を含む、新規二重特異性ａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体クラスを表す。Ｆｃの鎖ＡまたはＢへのＣＤ３実用頭部の融合は、その新薬開発につながる特性にとって重要である。付加的例として、Ｖ８７４およびＶ８７５は、非対称ＩｇＧ１ Ｆｃと融合された２つの他の二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓであるが、しかし異なるＣＤ３アミノ酸組成を有する。
Ｖ８７３は、Ａｍｇｅｎ／Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ブリナツモマブＣＤ３−ＣＤ１９ ＢｉＴＥタンデムｓｃＦｖｓと比較して、予期せぬ良好な哺乳動物ＣＨＯ発現および精製収率を示す。Ｖ８７３はＴ細胞およびＢ細胞を架橋し、静止およびＩＬ−２活性化ヒトＰＢＭＣを用いて、培養ヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫株）の強力な死滅を生じる。
Ｖ８７３およびその関連二重特異性ＣＤ３−Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体は、Ａｍｇｅｎ／Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＣＤ３−ＣＤ１９ ＢｉＴＥと異なっており、ＦｃｇＲに結合してＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰエフェクター活性を媒介し得るＩｇＧ１ヘテロ二量体Ｆｃを保有する。Ｖ８７３はＦｃＲｎに結合でき、このヘテロ二量体Ｆｃクラスは、カニクイザルにおいて、典型的な抗体産生可能性の特質ならびに８日より大きい長い半減期を示す。これに対し、ブリナツモマブは、非ヒトサルにおいて、ならびにヒト患者において、数時間未満の半減期を有する。
Ｖ８７３および関連二重特異性ＣＤ３ベースの構築物は、タンデムｓｃＦｖｓに関する既知の安定性の問題ならびに一般的に認識されているブリナツモマブの低い産生可能性に対処する。Ｖ８７３は、ブリナツモマブの短いＰＫおよびその野生型ＦｃＲｎ結合親和性によるＣＮＳ副作用ならびに末梢区画へのその分布を制限するＭＷＴに対処する。最後に、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃヘテロ二量体Ｆｃは、付加的な簡素で機能的なＦｃｇＲエフェクターＡＤＣＣ、ＣＤＣ、およびＡＤＣＰ活性を付与し、それゆえ薬剤耐性腫瘍に対する効力を付与する。
ＰＢＭＣ（Ｔ細胞）−Ｂ細胞死滅を媒介するｖ８７３の能力は、全く予想しなかったものである。ブリナツモマブｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３および関連ＢｉＴＥの特性は、柔軟に連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の使用によると報告されており、それらの断片は短いリンカーにより柔軟に連結されタンデムに整列されており、クアドローマ抗体のようなより大きい二重特異性フォーマットで可能な接近よりも、対向する細胞をより接近させ得る。柔軟な連結は、２つのｓｃＦｖアームの自由回転および連結を可能にし、それにより２つの対向する細胞膜上に存在する２つのエピトープの同時認識ならびに細胞溶解性免疫学的情報伝達部の形成を促す、と予期される。それゆえ、ＢｉＴＥに独特であると報告され一般的に受け入れられていることに基づくと、ヘテロ二量体Ｆｃ上のＣＤ３およびＣＤ１９ ｓｃＦｖ実用頭部の著しく異なる構造的提示を有する本明細書中に記載されるような二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９構築物が、Ｔ細胞およびＢ細胞に結合し、架橋し、かつＰＢＭＣ（Ｔ細胞）−Ｂ細胞死滅を媒介し得ることは予測外のことである。その他の適用は、Ｂ細胞駆動性自己免疫および炎症性疾患、例えばＲＡ、狼瘡、ＭＳ、ＩＢＤにおけるＢ細胞の欠失を包含する。さらに、Ｖ８７３関連二重特異性ＣＤ３ベースのａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体は、診断目的のために有用であり得る。
上記に関する付加的詳細は、以下の実施例において見出される。
実施例２．ヘテロ二量体Ｆｃを伴うヘテロ多量体構築物の設計、発現および精製
例示的二重特異性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９ヘテロ二量体抗体
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９抗体の例示的模式的表示は、図１Ａに示されている。
ｖ８７３、ｖ８７４、ｖ８７５は、二重特異性抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９ヘテロ二量体Ｆｃ構築物を例示しており、そして下記のように調製し、試験された。説明がＢｉＴＥへの参照を含む場合、それは、以下で示すような可変重鎖および軽鎖配向（例えば、ＶＨ−ＶＬ）に対する修飾を伴うかまたは伴わない、抗ＣＤ３抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ分子のＶＨまたはＶＬと同一アミノ酸配列を有する抗体構築物を指す。
ｖ８７３は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号２６および２８に対応する］。
Ｖ８７４は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号３０よび３２に対応する］。
Ｖ８７５は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号３４よび３６に対応する］。
ｖ１３７９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）ＢｉＴＥを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号８７および８８に対応する］。
二価単一特異性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体
ｖ８６５、ｖ８６６、ｖ８６７、ｖ８６８は、単一特異性抗ＣＤ３または抗ＣＤ１９二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物を例示しており、下記のように調製し、試験された。
ｖ８６５は、鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ ｓｃＦｖを有し、ＷＴ Ｆｃを伴う（１０５ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号２に対応する］。
ｖ８６６は、鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）および鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、ＷＴ Ｆｃを伴う（１０５ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号４に対応する］。
ｖ８６７は、鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、ＷＴ Ｆｃを伴う（１０５ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号６に対応する］。
ｖ８６８は、鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、ＷＴ Ｆｃを伴う（１０５ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号８に対応する］。
一価単一特異性抗ＣＤ３
ｖ８６９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）ｓｃＦｖ（ＶＬ−ＶＨ）および鎖Ｂ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（８０ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号１０よび１２に対応する］。
ｖ８７０は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（８０ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号１４よび１６に対応する］。
ｖ８７１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（８０ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号１８よび２０に対応する］。
ｖ８７２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（８０ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号２２よび２４に対応する］。
ベンチマーク対照
ｖ８９１は、同一配列ブリナツモマブＢｉＴＥ（商標）抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ ｓｃＦｖを有する（５０ｋＤａ）。［ポリペプチド配列は、配列番号９０に対応する］。
例示的単一特異性または二重特異性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９ヘテロ二量体抗体（ノックアウトＦｃを伴う）
ｖ１３８０は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ＶＨＶＬＢｉＴＥ（商標）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号９３および９４に対応する］。
ｖ１３８１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶI−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号９３および９８に対応する］。
安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有する変異体
以下の変異体は、安定性および収率を改良するための、リンカー長、ＶＨ−ＶＬ配向または点突然変異に対する変化を包含する、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに対する突然変異を含有する。
ｖ１６５３は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１０１および１０２に対応する）。
ｖ１６５４は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１８アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１０５および１０６に対応する）。
ｖ１６５５は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１０アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１０９および１１０に対応する）。
ｖ１６５６は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）ＶＨＶＬ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１１３および１１４に対応する）。
ｖ１６５７は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖ（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）および鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１１７および１１８に対応する）。
ｖ１６５８は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１８アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１２１および１２２に対応する）。
ｖ１６５９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１０アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ_ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１２５および１２６に対応する）。
ｖ１６６０は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１９アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１２９および１３０に対応する）。
安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有するＦｃノックアウト変異体
以下の変異体は、安定性および収率を改良するための、リンカー長、ＶＨ−ＶＬ配向または点突然変異に対する変化を包含する、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに対する突然変異を含有するＦｃノックアウトである。
ｖ１６６１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号３８および４０に対応する］。
ｖ１６６２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖ（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号４２および４４に対応する］。
ｖ１６６３は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１８アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１３３および１３４に対応する］。
ｖ１６６４は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１０アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１３７および１３８に対応する］。
ｖ１６６５は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１４１および１４２に対応する］。
ｖ１６６６は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１９アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列は、配列番号４６および４８に対応する］。
ｖ１６６７は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１４５および１４６に対応する］。
ｖ１６６８は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖ（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）を有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１４９および１５０に対応する］。
ｖ１６６９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１８アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１５３および１５４に対応する］。
ｖ１６７０は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に１０アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１５７および１５８に対応する］。
ｖ１６７１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１６１および１６２に対応する］。
ｖ１６７２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１９アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＮ２９７Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。［ポリペプチド配列、配列番号１６５および１６６に対応する］。
一価抗ＣＤ３抗体
以下の変異体は、安定性および収率を改良するための、リンカー長、ＶＨ−ＶＬ配向または点突然変異に対する変化を包含する、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに対する突然変異を含有する。
ｖ１６７３は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖ（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）および鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１６９および１７０に対応する）。
ｖ１６７４は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に１８アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１７３および１７４に対応する）。
ｖ１７９８は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂ上に１０アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ａ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１７７および１７８に対応する）。
ｖ１７９９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に１９アミノ酸リンカーを伴う抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にＦｃを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列 配列番号１８１および１８２に対応する）。
二重特異性ジスルフィド４４−１００安定化変異体
以下の変異体は、可変軽鎖における位置１００および可変重鎖における位置４４でのジスルフィド安定化のための点突然変異を含有する（４４−１００ＳＳと表示される）。
ｖ１８００は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）４４−１００ＳＳを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列、配列番号１８５および１８６に対応する）。
ｖ１８０１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ３ ＯＫＴ３（ＶＬ−ＶＨ）（ＶＨ ＣＤＲ３の位置１００ＡにＣ→Ｓ突然変異を有する）４４−１００ＳＳを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列、配列番号１８９および１９０に対応する）。
ｖ１８０２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列、配列番号１９３および１９４に対応する）。
ｖ４５４１は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上に抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上に抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（商標）（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列、配列番号５０および５２に対応する）。
ジスルフィド４４−１００安定化を伴うかまたは伴わないｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３およびノックアウト変異体
ｖ４５４２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＯＲ２０８（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号５４および５６に対応する）。
ｖ４５４３は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＯＲ２０８（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号５８および６０に対応する）。
ｖ４５４４は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＯＲ２０８（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号６２および６４に対応する）。
ｖ４５４５は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＯＲ２０８（ＶＬ−ＶＨ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号６６および６８に対応する）。
ｖ４５４６は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＤＸ−１３４２（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号７０および７２に対応する）。
ｖ４５４７は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＤＸ−１３４２（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号７４および７６に対応する）。
ｖ４５４８は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＤＸ−１３４２（ＶＬ−ＶＨ）ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号７８および８０に対応する）。
ｖ４５４９は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）１２Ｃ（ＶＨ−ＶＬ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖおよび鎖Ｂ上にｃｙｎｏ／ヒト交差反応性抗ＣＤ１９ ＭＤＸ−１３４２（ＶＬ−ＶＨ）４４−１００ＳＳ ｓｃＦｖを有し、以下の突然変異を伴う：鎖Ａ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖおよび鎖Ｂ上のＤ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ。（ポリペプチド配列は、配列番号８２および８４に対応する）。
抗体および抗体対照を、以下のようにクローン化し、発現させた。ヒト／哺乳動物発現のために最適化されたコドンを用いて、遺伝子合成により、抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を構築した。Ｆａｂ配列を既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ Ｐ１８５ Ｈｅｒ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８９，４２８５）から生成し、ＦｃはＩｇＧ１アイソタイプであった。ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＯＡＡ配列を、既知の抗ＣＤ３およびＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＢｉＴＥ抗体（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ． ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ：７７，７６３−７７２）、抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ抗体（ＵＳ２０１１／０２７５７８７）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ参照番号：ＤＢ０００７５）、抗ＣＤ１９抗体ＭＤＸ−１３４２（ＷＯ２００９０５４８６３；ＷＯ２００７００２２２３）から生成した。
最終遺伝子生成物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）にサブクローン化して、ＣＨＯ細胞中で発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ．， Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，Ｅ９（２００２））。
水性の１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰＥＩ:ＤＮＡ比 ２．５:１で、対数増殖期（１５０万〜２百万 細胞／ｍＬ）に、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体を形成するための最適濃度範囲を決定するために、重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）および重鎖Ｂの最適ＤＮＡ比（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂの比＝５０:５０％（ＯＡＡ；ＨＣ／Ｆｃ、５０:５０％））で、ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を５〜６日後に収穫し、培地を４０００ｒｐｍで遠心分離後に収集して、０．４５μｍフィルターを用いて清澄化した。
清澄化培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに添加して、１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄した。１０カラム体積のクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３．６で、抗体を溶離し、抗体を含有するプール化分画を、ＴＲＩＳで、ｐＨ１１で中和した。最後に、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、タンパク質を脱塩した。
いくつかの場合、タンパク質は、下記のような方法によるプロテインＬクロマトグラフィーにより、さらに精製される。Ｃａｐｔｏ Ｌ樹脂ＰＢＳをＰＢＳで平衡化し、プロテインＡ精製ｖ８７５（１Ｍ トリスで中和）を樹脂に添加し、室温で３０分間インキュベートした。樹脂をＰＢＳで洗浄し、フロースルーを収集し、結合タンパク質を０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ３で溶離した。
いくつかの場合、ゲル濾過によりタンパク質をさらに精製し、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮して、１ｍＬ／分の流量で、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣによりＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に添加した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、１ｍＬ／分の流量で用いた。精製抗体に対応する分画を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮して、−８０℃で保存した。
参照ｖ８９１と比較した場合の例示的ｖ８７３、８７４、８７５およびその他のａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体の一過性発現を、図７に示す。図７におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥは、すべての例示的ヘテロ多量体が、ＣＨＯ ３Ｅ７細胞中で＞８０％の細胞生存度で一過的に発現され得ることを示す。
実施例３：ヘテロ多量体ｖ８７３はＪｕｒｋａｔ ＣＤ３Ｔ細胞およびＲａｊｉ ＣＤ１９Ｂ細胞を架橋し得る
Ｔ細胞およびＢ細胞を架橋するｖ８７３の能力を、以下のようにＦＡＣＳ分析により試験した。
ＦＡＣＳによる全細胞架橋
ＲＰＭＩ中に懸濁された１×１０６細胞／ｍｌを、０．３μＭの適切なＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識で標識して、混合し、３７℃で２５分間、水浴中でインキュベートした。
ペレットを２ｍｌのＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３中に再懸濁して、最終濃度を５×１０６細胞／ｍｌとした。
細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して（１／５希釈液）、適切な細胞ラベリングおよびレーザー設定を確認した。フローチェックおよびフローセットＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓを用いて、計器標準化、光学的アラインメントおよび流体工学を確認した。
フローサイトメトリー確認後、および架橋前に、各細胞株を所望の比率で、１×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で、一緒に混合した。
Ｔ：Ｔ架橋をＪｕｒｋａｔ−バイオレット＋Ｊｕｒｋａｔ−ＦａｒＲｅｄで評価し、Ｂ：ＢをＲＡＪＩ−バイオレット＋ＲＡＪＩ−ＦａｒＲｅｄで評価し、そしてＴ：Ｂ架橋をＪｕｒｋａｔ−バイオレット＋ＲＡＪＩ−ＦａｒＲｅｄで評価した。
抗体を室温でＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３中で二倍希釈し、次いで、細胞に添加し、その後、静かに混合して、３０分間インキュベートした。
３０分インキュベーション後、２μｌのヨウ化プロピジウムを添加し、ゆっくり混合して、フローサイトメトリーにより直ちに分析した。
架橋割合（％）は、バイオレットおよびＦａｒ-Ｒｅｄで同時標識された事象のパーセンテージとして算定した。
図１Ｂは、ＦＡＣＳによるＪｕｒｋａｔ ＣＤ３Ｔ細胞（上左象限）をＲａｊｉ ＣＤ１９Ｂ細胞（下右象限）と架橋するｖ８７３およびブリナツモマブＣＤ１９−ＣＤ３ ＢｉＴＥ（ｖ８９１、ＭＴ−１０３）の能力を示す。架橋化Ｔ−Ｂ細胞は、上右象限に見える。この結果は、３００ｎＭで、ヘテロ多量体ｖ８７３は、ＢｉＴＥ（総細胞の２１％）と同程度（総細胞の２３％）に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を特異的に架橋し得る、ということを実証する。
実施例４：ヘテロ多量体はＣＤ３発現細胞およびＣＤ１９発現細胞と選択的に結合する
例示的ヘテロ多量体ｖ８７３がＣＤ３およびＣＤ１９と特異的に結合する能力を、ＦＡＣＳ分析により評価した。ＣＤ３およびＣＤ１９に対する単腕抗体（ＯＡＡ）も、実施例２に記載されたように調製し、以下で記載される全細胞ＦＡＣＳ結合アッセイにおける対照として試験した。
ＦＡＣＳプロトコルによる全細胞結合：
２×１０６細胞／ｍｌの細胞（生存度＞８０％）を、Ｌ１０＋ＧＳ１培地中に再懸濁して、抗体希釈液と混合し、氷上で１時間インキュベートした。
１０ｍｌの冷却Ｒ−２緩衝液を添加することにより細胞を洗浄し、４℃で１０分間、２３３ｇで遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌ（Ｌ１０＋ＧＳ１培地中の１／１００希釈液）の蛍光標識化抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧとともに再懸濁して、室温で１時間インキュベートした。
前記のように１０ｍｌの冷却Ｒ−２を添加することにより細胞処理物を洗浄し、細胞ペレットを４００μｌの冷却Ｌ−２で再懸濁し、Ｎｉｔｅｘを通して試料を濾過し、４μｌのヨウ化プロピジウムを含有する試験管に添加した。
試料を、フローサイトメトリーにより分析した。
結果を図２に示す。図２は、ｖ８７３が、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（下パネル）ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞（上パネル）と選択的に結合して架橋し得ることを実証する。図２はまた、単腕化抗ＣＤ３抗体がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と特異的に結合しＣＤ１９発現Ｂ細胞とは交差反応しないこと、および単腕化抗ＣＤ１９抗体がＲａｊｉ Ｂ細胞と特異的に結合しＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは交差反応しないことを実証する。
この実験を反復した。結果を図９に示す。前記実験と同様に、ＦＡＣＳアッセイは、ｖ８７３がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合することを示す（図９Ｂ）。図９Ａは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞上のｈＩｇＧ ＦｃとＣＤ３２Ｂとの相互作用から予測されるように、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と結合せずＲａｊｉ Ｂ細胞との結合レベルは低いことを示す。図９Ａは、抗ＣＤ１９ ＯＡＡがＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と交差反応しない、ということも示す。
ｖ８７３がＣＤ３またはＣＤ１９を発現しない対照細胞株と結合しないことを確認するためにも、ＦＡＣＳアッセイ実行した。図１０は、ｖ８７３が、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しないＫ５６２細胞株と結合しないことを示す。図１１は、ｖ８７３はまたＣＤ１９あるいはＣＤ３を発現しないマウスリンパ細胞とも結合しないことを示す。
実施例５：ヘテロ多量体は標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞のＰＢＭＣ死滅を媒介する
予備実験において、例示的ヘテロ多量体 ｖ８７３が標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対するＴ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を、以下のようにＩＬ−２刺激ＰＢＭＣを用いて測定した。
個々の試験のためのヒト血液（１２０〜１４０ｍＬ）を、選択ドナーから２日続けて収集した。両日に、ＰＢＭＣをドナーから新たに単離して、必要な場合、ＰＭＢＣの一部を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の濃縮のために、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）カラムに通した。第一日に、ＰＢＭＣおよび濃縮分画を、１０００〜３０００単位／ｍＬのＩＬ−２とともに一晩インキュベートして活性化した。培養をネガティブ選択カラムにかけて、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を単離した。次に、細胞を標識し、サイトメトリーにより分析して、調製物中のＣＤ６９＋細胞の内容物を評価した。第二日からのＰＢＭＣおよび濃縮分画を、ＩＬ−２活性化を伴わないか、または静止期である場合、アッセイに用いた。
静止およびＩＬ−２活性化ＰＢＭＣならびに精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋をエフェクター細胞として、およびＲａｊｉ ヒトＢ細胞を標的細胞として、細胞傷害性アッセイに用いた。ＰＢＭＣに関して３０:１、精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋に関して１５：１の、エフェクター:標的比を試験した。２０ｕｇ／ｍＬでのｈｅｔ−ＦＣの存在下でもＰＢＭＣを試験して、細胞性細胞傷害性を種々の濃度の試験物でアッセイした。
試験品で細胞を２０〜２６時間インキュベート後、Ｐｒｏｍｅｇａ ＬＤＨ酵素キットを用いて、ＬＤＨ分析のために５０ｕＬの細胞培養上清を収集した。いくつかの試験において、培養中のそれらのそれぞれの割合ならびにそれらの７ＡＡＤ＋細胞内容物に関して、自家Ｔ細胞およびＢ細胞および／または同種異系Ｂ細胞を評価した。
ＣＦＳＥを、Ｒａｊｉおよび自家Ｂ細胞間の差別化標識として用いて、試験した。Ｒａｊｉ標的細胞を少量のＣＦＳＥで予め標識した後、試験物を用いて、または用いずに、エフェクターとともにインキュベートした。細胞ペレットを、フローサイトメトリー分析のために種々の抗体カクテル中に再懸濁した。Ｇｕａｖａ８ＨＴフローサイトメーターを、細胞亜集団の分析のために用いた。別記しない限り、抗体はすべてＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
試験した各条件は適切な対照を包含した; 全ドナーについて、すべてのエフェクターおよび標的細胞型を別々に有するウェルを、効力アッセイに用いられる全試験物をすべての濃度で含んでインキュベートした。
試験物とそれらの標的（ＣＤ３およびＣＤ１９）の結合間のあらゆる妨害を回避するために、Ｂ細胞およびＴ細胞染色に用いられるマーカーは、図２３に示した試験で、それぞれ抗ＣＤ２０および抗ＣＤ７であった。このアッセイは静止およびＩＬ２−活性化ＰＢＭＣ、精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で実施した。
データ分析：
ＬＤＨ分析のために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｅｍａｘを用いて、各ウェルに関して、４９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。ＬｉｂｒｅＯｆｆｉｃｅ Ｃａｌｃソフトウェアを用いて、データ分析を実施した。以下の分析スキームを適用して、細胞傷害性応答を算定する。
先ず、細胞傷害性応答を評価する前に平均化培地バックグラウンドシグナル（ＯＤ値）を全ウェルから差し引く。界面活性剤が誘導する純粋な標的細胞の最大放出について、界面活性剤の存在に相当する体積補正特異的バックグラウンドシグナルを用いて、最大放出ＯＤ値から差し引く。
試験される各エフェクター集団（ＰＢＭＣ、ＣＤ４およびＣＤ８陰性選択集団）に関して、いずれの試験物も含まないウェルから、エフェクターおよび結合した標的の自発的放出を得る。試験系のバックグラウンドＬＤＨ活性は、いずれの試験物も存在せずにエフェクター−標的集団の実験混合物を含有するウェルにおいて、よりよく評価される。
全ドナーの全プレート間で、Ｒａｊｉ細胞、培地対照ウェル、およびＬＤＨ陽性対照ウェルからの自発的および最大ＬＤＨ放出を用いて、プレート間変動をモニタリングした。
図３Ａは、３つのドナーからの標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞を死滅させるためにＩＬ−２活性化ＰＢＭＣを再指向させるｖ８７３の能力を示す。図３Ｂは、ｖ８７３が、ドナーのうちの１つにおいてｖ８９１より高い再指向性Ｔ細胞性細胞傷害性を媒介できることを実証する。これらの予備的結果は、ｖ８７３により例示されるようなヘテロ多量体がｖ８９１より高いＴ細胞性細胞傷害性を媒介し得ることを示す。
ヒトＩｇＧ１対照と比較した場合の、３つのドナーにおけるＲａｊｉ Ｂ細胞のＰＢＭＣ死滅を媒介するｖ８７３の能力を評価した。この実験の方法は、実施例５に概略したものに従うが、以下の修正を伴う：ＰＢＭＣのＩＬ−２刺激を１０００〜３０００単位／ｍＬで試験した。
図８に示された結果は、個々のドナーにわたり比較した場合、ｖ８７３が陰性対照ヒトＩｇＧ１（Ｇ１）と比較して、標的Ｂ細胞に対するより高い細胞傷害性（％）を誘導することを示した。いくつかの場合、３０００単位／ｍＬのより高濃度のＩＬ−２での刺激は、標的Ｂ細胞に対するより高い細胞傷害性（％）を生じた。
実施例６：ヘテロ多量体は静止およびＩＬ−２活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の再指向性の死滅を媒介する
例示的ヘテロ多量体 ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０が標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を、実施例５に記載したように測定した。
図１６Ａは、ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０がＲａｊｉ Ｂ細胞に対する再指向性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による抗体依存性Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を示す。図１６の上パネルは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。これらの結果は、ｖ８７５、ｖ１３８０およびｖ８９１が、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてより顕著な濃度依存性細胞傷害性応答を引き出すことを示す。図１６の下パネルは、標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対するＩＬ−２刺激性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。これらの結果は、ｖ８７５およびｖ１３７９が、ｖ８９１とＩＬ−２活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞に比べて、類似のＲａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を引き出すことを示す。すべての場合に、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞でより大きい細胞傷害性応答が引き出された。これらの結果はまた、ＦｃＧｒノックアウト変異体であるｖ１３８０は標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対して細胞傷害性であるが、ＷＴヘテロ二量体Ｆｃを有するｖ８７５およびｖ１３７９（最大の細胞障害性 約６０％）と比べると有効性がわずかに低い（最大の細胞障害性 約４０％ｍａｘ細胞傷害性）ことも示す。
図１６Ｂ〜ＥはヒトＩｇＧで正規化された図１６Ａのデータの表示を示しており、ｖ８７５（図１６ＢおよびＣ）、ならびにｖ１３７９およびｖ１３８０（図１６ＤおよびＥ）に関して、各試験抗体濃度で示される細胞傷害性（％）を含む。図１６Ｂは、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を用いたｖ８７５での標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性（％）を示す。図１６Ｃは、静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を用いたｖ８７５での標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する細胞傷害性（％）を示す。図１６ＤおよびＥは、ＩＬ−２活性化（図１６Ｄ）および静止（図１６Ｅ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｖ１３７９（ＷＴ Ｆｃ）およびｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）の直接比較を示す。標的Ｂ細胞性細胞傷害性に対するＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト（ｖ１３８０）の最も顕著な影響は、ＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において観察され（図１６Ｄ、左パネル）、ここでｖ１３８０はｖ１３７９と比較して細胞傷害性が低い。
図１９に示すように、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を標的とするエフェクター細胞として静止（図１９Ａ）およびＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１９Ｂ）を用いて、ｖ８７５、ｖ８７３およびヒトＩｇＧに関して実験を反復した。図１９Ａは、ｖ８７５およびｖ８７３が、エフェクターとしてＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する＞３０％細胞傷害性を引き出し、最大標的細胞死滅が３ｎＭ濃度で観察されることを示す。図１９Ｂは、ｖ８７５およびｖ８７３が、エフェクターとして静止ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する用量依存性（＞２０％）細胞傷害性を引き出すことを示す。より多くの標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞死滅が、エフェクター細胞としてＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた場合に観察される。
図２０に示すように実験を反復して、０．０６〜１０．０ｎＭの範囲のｖ８７５濃度でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞死滅の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する相対的寄与を比較した。図２０Ａは、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたｖ８７５の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて引き出される標的Ｂ細胞死滅パーセントは、０．０６ｎＭを超えるｖ８７５濃度では増大しなかった。予期されたとおり、標的Ｂ細胞死滅は、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞でより大きい。図２０Ｂは、ｖ８７５と静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。静止ＣＤ８＋細胞で引き出される標的Ｂ細胞死滅パーセントは、０．１ｎＭを超えるｖ８７５濃度では大きく増大しない。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を用いる場合、ｖ８７５およびｖ８７３で用量依存性Ｂ細胞死滅が観察される。予期されるように、標的Ｂ細胞死滅は、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞でより大きい。
実施例７：ヘテロ二量体Ｆｃは標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性に寄与する
例示的ヘテロ多量体 ｖ８７５およびｖ８７３がＦｃの存在下または非存在下で、標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を、実施例５に記載したように測定した。
図１７は、ＬＤＨアッセイにより測定されるように、ｖ８７５およびｖ８７３Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ抗体が、Ｆｃ遮断の存在下または非存在下で、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣおよび標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性を媒介したことを示す。図１７Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断が、標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％をわずかに低減（ｖ８７５）させるか、または全く低減させない（ｖ８７３）ことを示す。図１７Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断が、ｖ８７５およびｖ８７３に関する標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性（％）を低減させることを示す。
実験を反復し、その結果を図１８に示す。図１８Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断が、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％を低減させたことを示す。図１８Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断が、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％を低減させたことを示す。図１７および１８は、Ｆｃが、ヘテロ二量体ｖ８７５およびｖ８７３抗体における標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性に寄与することを示す。
実施例８:ヘテロ多量体は自家Ｂ細胞性細胞傷害を媒介する
例示的ヘテロ多量体 ｖ８７５およびｖ８７３が自家Ｂ細胞を死滅させる能力を、総ＰＢＭＣおよび静止ＩＬ−２刺激ＰＢＭＣにおいて測定し、ここでｖ８７５およびｖ８７３とのインキュベーション（３００ｎＭ、ｎ＝３ドナー）後のＣＤ１９＋７ＡＡＤ＋細胞のパーセントを、実施例５に記載したようにフローサイトメトリーにより測定した。
図２１は、非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に対して、ｖ８７５およびｖ８７３（３００ｎＭ）が、総静止ＰＢＭＣ（左パネル）および総ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣにおける自家Ｂ細胞死滅を媒介することを示す。
実施例９：ヘテロ多量体ｖ８７５はＢｉＴＥと比較して自家Ｔ細胞性細胞傷害性を残す
自家Ｔ細胞集団に及ぼす例示的ヘテロ多量体ｖ８７５およびｖ８７３処理の作用を、総ＰＢＭＣおよび静止ＩＬ−２刺激ＰＢＭＣにおいて評価し、ここでｖ８７５およびｖ８７３とのインキュベーション（３００ｎＭ、ｎ＝３ドナー）後のＣＤ３＋７ＡＡＤ＋細胞のパーセントを、実施例５に記載したようにフローサイトメトリーにより測定した。
図２２は、非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に対して、ｖ８７５が、ｖ８７３およびｖ８９１と比較して、より多くの自家Ｔ細胞を残しておくことにより、より多くの選択的Ｂ細胞死滅を有することを示す。
実施例１０：アルブミン足場を有するヘテロ多量体の設計、発現および精製
アルブミン足場を基礎にした以下の例示的ＣＤ３−ＣＤ１９結合ヘテロ多量体を、以下のように設計し、調製した。
抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに関する配列を、現在臨床試験中であり、安定性および産生に関して十分に実証されかつ試験されている２つの分子から選択した。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを、ＢｉＴＥ分子ブリナツモマブから直接採用した。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＢｉＴＥで用いられるものと一致するＶＨ−ＶＬ配向で選択した。ベンチマーク分子は、ＢｉＴＥ（ｖ８９１）を基礎にしたｓｃＦｖ分子であった。断片１の天然Ｎ末端に抗ＣＤ３実用頭部を結合し、および断片２のＣ末端に抗ＣＤ１９を結合することにより、ＡｌｂｕＣＯＲＥ＿１（ＡＢＨ２）ＣＤ３／ＣＤ１９融合体を作製した（ｖ１０９２、配列番号２６４および２６６に対応するポリペプチド配列）。用いたリンカーは、多価ＨＥＲ２ ＡｌｂｕＣＯＲＥ実験のために用いられるものと同一であった：断片１のＮ末端にＧＧＧＳおよび断片２のＣ末端に（ＧＧＳＧ）４ＧＧ。実用頭部を逆転させた第二分子を作製した（すなわち、断片１の天然Ｎ末端に抗ＣＤ１９実用頭部および断片２のＣ末端に抗ＣＤ３、ｖ１０９３）。アルブミンポリペプチドの天然末端に２つの異なる融合体を収容するよう、ｖ１０９４を設計した（配列番号２６８に対応するポリペプチド配列）。ｓｃＦｖ融合体を、Ｎ末端でＧＧＳリンカーをそしてＣ末端でＧＧＳＧリンカーを介して、アルブミン分子と連結した。リンカーの長さは、異なる配列型を有していても、ＭＭ−１１１分子で用いられるものを反映する。
Ｖ２２１は、ｖ１０９２を構築するために用いられるアルブミンベースのヘテロ多量体であるが、カーゴ分子を有さない（配列番号２６９および２７０に対応するポリペプチド配列）。
多価ＨＥＲ２に関して前記されているように、発現および精製を実施した。
実施例１１：アルブミン足場を有するヘテロ多量体はＣＤ３発現細胞またはＣＤ１９発現細胞と特異的に結合する
抗ＣＤ３×ＣＤ１９ ｓｃＦｖを備えるＡｌｂｕＣＯＲＥ−１（ｖ１０９２）の、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞に対する能力を、ＦＡＣＳを用いて評価して、同一抗ＣＤ ｓｃＦｖを備えるＷＴ−ＨＳＡ（ｖ１０９４）と比較した。
結果を図４に示す。図４は、ｖ１０９２およびｖ１０９４がいずれもＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞と結合し得ることを実証する。
実施例１２：ヘテロ二量体Ｆｃまたはアルブミン足場を有するヘテロ多量体は同等のＢ細胞ターゲッティングおよびＴ細胞架橋を示す
異なる足場を有するヘテロ多量体が、Ｂ細胞ターゲッティングおよびＴ細胞架橋を指向する能力を、実施例３に記載した方法に従って、ＦＡＣＳ分析により比較した。実施例４に記載した方法に従って、Ｂ細胞およびＴ細胞結合に関して、ｖ８７３およびｖ８９１ ＢｉＴＥ対照に対して、ｖ１０９２構築物を付加的に試験した。
結果を図５Ａに示す。図５Ａは、試験濃度で、ｖ１０９３が総細胞の３１％を架橋でき、およびｖ８７３が総細胞の２５％を架橋し得たことを示す（下パネル）。上パネルは対照として培地を用いた結果である。実施例３で記載したように、Ｂ細胞およびＴ細胞を架橋するｖ８７３の能力は、ｖ８９１ＢｉＴＥ対照のものに匹敵する。図５Ａは、Ｂ細胞およびＴ細胞を架橋するｖ１０９３の能力がｖ８７３のものに匹敵することをさらに示す。
追加の実験において、Ｔ細胞およびＢ細胞を架橋するｖ１０９２の能力を、ｖ２２１対照と、ならびにｖ８７３およびｖ８９１対照と直接比較した。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂは、ｖ１０９２が、ｖ２２１より大きい程度に、そしてｖ８９１およびｖ８７３と同程度に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋し得ることを示す。
実施例１３：例示的ヘテロ多量体はＦＡＣＳにより測定した場合にＴ細胞およびＢ細胞との結合において、より高い抗ＣＤ３ ＫＤおよびより高いＢｍａｘを有する
例示的ヘテロ多量体 ｖ８７３およびｖ８７５のＫＤを、実施例４に記載したようにＦＡＣＳにより評価し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータ分析および曲線適合を実施した。
この実験の結果を図１２に示す。図１２は、ｖ８７３およびｖ８７５がともに、ｖ８９１と比較して、より高い抗ＣＤ３親和性を有することを示す。ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞と結合するｖ８７３およびｖ８７５のＫＤは、全抗体を通して同様であり、ｖ８９１に匹敵する。図１２ＡおよびＢは、ｖ８７３、ｖ８７５およびｖ８９１の、ＣＤ３発現ＨＰＢ−ＡＬＬおよびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞との、ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞とのＦＡＣＳ結合曲線を示す。図１２Ｂはまた、ｖ８９１と比較した場合、ｖ８７５が、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞との結合に関してより高いＢｍａｘを有することも示す。表１は、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ細胞と結合するｖ８７５、ｖ８７３、およびｖ８９１のＫＤ値のまとめである。
（表１）ＦＡＣＳにより測定されるＴおよびＢ細胞結合のＫＤのまとめ
Figure 2015528003
例示的ヘテロ多量体 ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ１３８１、およびｖ８９１のＫＤを、実施例４に記載したようにＦＡＣＳによりＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞との結合に関して評価し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータ分析および曲線適合を実施した。
この実験の結果を図１３Ａおよび表２に示す。これらは、ヘテロ多量体 ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ１３８１、およびｖ８９１が、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞との結合に関して同様のＫＤを有することを示す。図１３Ａは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験された抗体に関して得られたＦＡＣＳ結合曲線を示す。表２は、ＦＡＣＳ結合実験から得られたＫＤ（ｎＭでの）、Ｂｍａｘおよびヒル勾配のまとめである。図１３Ａはまた、試験したヘテロ多量体が、ＢｉＴＥと比較して、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞との結合に関してより高いＢｍａｘを有することも示す。
（表２）Ｒａｊｉ Ｂ細胞とのヘテロ多量体の結合特性のまとめ
Figure 2015528003
ＨＢＰ−ＡＬＬ Ｔ細胞とのＦＡＣＳ結合の結果を図１３Ｂおよび表３に示す。これらは、ヘテロ多量体ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０が、ｖ８９１と比較して、より低いＫＤを有することを示す。図１３Ｂは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験された抗体を用いて得られたＦＡＣＳ結合曲線を示す。表３は、ＦＡＣＳ結合実験から得られたＫＤ（ｎＭでの）、Ｂｍａｘおよびヒル勾配のまとめである。図１３Ｂはまた、試験したヘテロ多量体が、ｖ８９１と比較して、ＨＢＰ−ＡＬＬとの結合に関してより高いＢｍａｘを有することも示す。
（表３）ＨＢＰ−ＡＬＬ Ｔ細胞とのヘテロ多量体の結合特性のまとめ
Figure 2015528003
実施例１４：ヘテロ多量体 ｖ８７５はＪｕｒｋａｔ ＣＤ３Ｔ細胞およびＲａｊｉ ＣＤ１９Ｂ細胞を架橋し得る
ヘテロ多量体 ｖ８７５がＴ細胞およびＢ細胞を架橋する能力を、実施例３に記載したようにＦＡＣＳ分析により試験した。
この実験の結果を図１４に示す。図１４は、ｖ８７５およびｖ８９１がいずれも、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間で同等に架橋を促すことを示す。対照ヒトＩｇＧの使用によりＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞間に２．５％の架橋を生じたが、一方、ｖ８７５は総細胞の２２．９％の架橋を促進し、またｖ８９１は総細胞の１４．５％の架橋を促した。これらの結果は、バックグラウンドに対する倍加架橋としても提示され、ここでｖ８７５は、バックグラウンドに対する架橋の９．２倍増を媒介し、一方、ｖ８９１は、バックグラウンドに対する架橋の５．８倍増を媒介した。
実施例１５：ヘテロ多量体によるＢ細胞およびＴ細胞の架橋は種々の抗体濃度または細胞比であっても頑強である
種々の濃度でｖ８７５がＢ細胞およびＴ細胞を架橋する能力を、実施例３に記載したようにＦＡＣＳにより評価した。但し、ｖ８７５の３つの異なる濃度でのエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比を変更する（１：１または１５：１）修正を加えた。
結果を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ａは、０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度での１：１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。図１５Ｂは、０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度での１５:１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。ｖ８７５で試験した両Ｅ:Ｔ比率（１：１および１５：１）は、バックグラウンドに対する倍率として表した場合、類似の総Ｔ細胞−Ｂ細胞架橋を生じた。
実施例１６：ＢおよびＴ細胞の架橋は別様に改変されたヘテロ多量体構築物であっても頑強である
ｖ８７５がＲａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｂ:Ｔ）、ならびにＲａｊｉ:Ｒａｊｉ Ｂ細胞架橋（Ｂ:Ｂ）およびＪｕｒｋａｔ:Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｔ:Ｔ）を架橋する能力を、実施例３に記載したようにＦＡＣＳにより評価した。
結果を図３５Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃに示す。図３４Ａは、３回の反復実験に亘るｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ８９１、ｖ１３８１、市販のＯＫＴ３、およびヒトＩｇＧの、Ｔ:Ｂ、Ｂ:ＢおよびＴ:Ｔ架橋の量を示す。これらの結果は、すべてのヘテロ二量体抗体が高パーセンテージのＴ:Ｂ架橋を媒介し、すべての変異体がｖ８９１より高いＴ:Ｂ架橋（％）を有することを示す。これらの結果はまた、全変異体に関して、Ｔ:Ｂ架橋に比してＴ:ＴおよびＢ:Ｂ架橋(%)のパーセンテージが低いことも示す。
図３４Ｂは、安定性増強のために改変した抗ＣＤ３実用頭部を有する変異体（ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、ｖ１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００、ｖ１８０２）、ｖ８７５、およびヒトＩｇＧの、Ｔ:Ｂ、Ｂ:ＢおよびＴ:Ｔ架橋の量を示す。これらの結果は、すべてのヘテロ二量体抗体（ｖ８７５、ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、ｖ１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００、ｖ１８０２）がヒトＩｇＧ陰性対照と比較して、より高いパーセンテージのＴ:Ｂ架橋を媒介し、すべての変異体が低Ｔ:Ｔ架橋を媒介することを示す。これらの結果はまた、いくつかの変異体（ｖ１６６０、ｖ１６５４およびｖ１６５５）が、Ｔ:Ｂ架橋に比してＢ:Ｂ架橋をより多く媒介することも示す。
図３４Ｃは、安定性増強のために改変したＣＤ３実用頭部を有する（ｖ１６６６）か、またはヒト／カニクイザル交差反応性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓを有する（ｖ４５４１、ｖ４５４３、ｖ４５４５、ｖ４５４８）Ｆｃノックアウト変異体、市販のＯＫＴ３抗ＣＤ３対照、ｖ２１７６抗ＣＤ１９対照およびヒトＩｇＧ陰性対照の、Ｔ:Ｂ、Ｂ:ＢおよびＴ:Ｔ架橋の量を示しており、すべての変異体が低Ｔ:Ｔ架橋を媒介する。これらの結果は、すべてのヘテロ二量体抗体（ｖ１６６６、ｖ４５４１、ｖ４５４３、ｖ４５４５、ｖ４５４８）が、ヒトＩｇＧ陰性対照に比して、より高いパーセンテージのＴ:Ｂ架橋を媒介することを示す。これらの結果はまた、いくつかの変異体（ｖ１６６６、ｖ４５４８）が、Ｔ：Ｂ架橋に比してＢ:Ｂ架橋をより多く媒介することも示す。
実施例１７：ｖ８７５、ｖ１３８０、ｖ１３７９がＩＬ−２活性化および静止ＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団に及ぼす作用
ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０処理がＩＬ−２活性化または静止ＴおよびＢ細胞培養中のＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼす作用を、７ＡＡＤ＋染色およびＦＡＣＳにより調べて、実施例５に記載したようにアイソタイプ対照（ｎ＝４ドナー）で正規化した。
結果を図２３に示す。図２３は、例示的ヘテロ多量体 ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０が、ヒトＩｇＧ対照に比して、ＣＤ２０＋Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介するが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞性細胞傷害性は媒介しないことを示す。図２３Ａは、ｖ８７５がＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼす作用を示す。図２３Ｂは、ｖ８７５が静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼす作用を示す。図２３Ｃは、ｖ１３７９およびｖ１３８０がＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼす作用を示す。図２３Ｄは、ｖ１３７９およびｖ１３８０が静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼす作用を示す。ＣＤ２０＋Ｂ細胞性細胞傷害性に対するＷＴ Ｆｃの関与も図２３ＣおよびＤに示されているが、ここでｖ１３７９は、ＩＬ−２活性化および静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれにおいてもより大きいＣＤ２０＋Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介する。
実施例１８：例示的ヘテロ多量体ｖ８７５およびｖ８７３は、細胞傷害性作用を媒介するためにエフェクターＴ細胞および標的Ｂ細胞の両方の存在を必要とする
ｖ８７５およびｖ８７３を単独で、エフェクター細胞または標的細胞とともにインキュベートすることの影響を、実施例５に記載したようなＬＤＨ放出により、そして以下の修正を加えて、評価した。合計３００，０００個の静止およびＩＬ−２活性化ＰＢＭＣ、１５０，０００個のＣＤ８＋エフェクター細胞または１０，０００個のＲａｊｉ標的細胞を、３００ｎＭでの抗体の各々と、各条件の試験物を含まない対照とともに、一晩インキュベートした。提示されるデータは、３ドナーからの平均結果である。
静止エフェクターおよびＲａｊｉ Ｂ細胞における抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を図２４Ａに示し、活性化エフェクターにおける抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を図２４Ｂに示す。図２４Ａは、ｖ８７５およびｖ８７３が、非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に比して、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団に対して細胞傷害性でないことを示す。図２４Ａはまた、ｖ８７５およびｖ８７３が、総ＰＢＭＣ集団において細胞傷害性を増大することも示し、これは標的Ｂ細胞に対するエフェクターＴ細胞の再指向性死滅のためと考えられる。さらに、図２４Ａは、エフェクターＴ細胞の非存在下では、ｖ８７５およびｖ８７３は、培地およびヒトＩｇＧ対照に比して、Ｒａｊｉ Ｂ細胞集団に対して細胞傷害性でないことを示す。
図２４Ｂは、活性化エフェクターＰＢＭＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｖ８７５およびｖ８７３媒介性ＬＤＨ放出の結果を示す。これらの結果は、ｖ８７５およびｖ８７３を活性化ＰＢＭＣとともにインキュベートすると細胞死が増大することを示すが、これはエフェクターＴおよび標的Ｂ細胞の存在下でヘテロ二量体抗体により媒介される再指向性Ｂ細胞死滅のためと考えられる。図２４Ｂはまた、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞とともにｖ８７５をインキュベートすると、ｖ８７３ならびに培地およびヒトＩｇＧ対照に比して、より高いパーセンテージの細胞死を生じることも示す。
実施例１９:例示的ヘテロ多量体は、標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞に対するＡＤＣＣまたはＡＤＣＣの低下を媒介し得る
以下の方法により、標的Ｂ細胞としてＤａｕｄｉ細胞を、およびエフェクター細胞としてＦｃＲγ３ａ固定化ＮＫ９２細胞を用いて（ＧＳ１９３７６１）、ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０で、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣ）を実施した。
あらかじめ最適化したエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比（５：１）で、種々の濃度の試料を用いて、用量−応答試験を実施した。エフェクター細胞および抗体を伴わない細胞対照にトリトンＸ−１００を最終濃度１％で添加して標的細胞を溶解し、それを、最大溶解対照とした。アッセイ緩衝液をエフェクター細胞および抗体を有さない細胞対照中に添加し、それを最小ＬＤＨ放出対照とした。抗体の非存在下でエフェクター細胞とともにインキュベートした標的細胞を、両細胞が一緒にインキュベートされた場合の非特異的ＬＤＨ放出のバックグラウンド対照として設定した。
試験品を、３７℃、５％ＣＯ２で５〜６時間、細胞とともにインキュベートして、ＬＤＨキットを用いて細胞生存度を評価した。吸光度を、ＯＤ４９２ｎｍおよびＯＤ６５０ｎｍで読み取った。細胞溶解のパーセンテージ（ＯＤ４９２ｎｍ）を、以下の式により算定した：
細胞溶解（％）＝１００＊（１−（ＯＤ試料データ − ＯＤ腫瘍細胞プラスエフェクター細胞）／（ＯＤ最大放出 − ＯＤ最小放出））
５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、Ｓ字状の用量−応答非線形回帰適合で分析した。
結果を、図２５ＡおよびＢに示す。これらは、ＷＴ Ｆｃを有するヘテロ多量体（ｖ８７５およびｖ１３７９）がＡＤＣＣを媒介し（最大の細胞溶解 約４０％）、一方、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５ＡノックアウトＦｃ突然変異を有するｖ１３８０は標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞に対するＡＤＣＣが低下することを示す。図２５ＡおよびＢは、内部陽性対照リツキシマブとの比較を提示する。
実施例２０：例示的ヘテロ多量体はＤａｕｄｉ Ｂ細胞のＣＤＣ媒介性溶解の低下を有する
標的Ｂ細胞としてＤａｕｄｉ細胞を用いて、ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０で細胞ベースの補体依存性細胞傷害性アッセイ（ＣＤＣ）を実施した。健常ドナーからのヒト血清（ＮＨＳ）を、補体の供給源として用いた。１０μｌのＮＨＳ（４０反応体積中の最終濃度１０％）を各ウェルに添加してＣＤＣカスケードを開始し、２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイキットを用いて、細胞生存度を測定した。
細胞生存度のパーセンテージを、次式を用いて算定した：
細胞生存度（％）＝１００×（（ＲＬＵ試料）／（ＲＬＵ細胞＋ＮＨＳ））
（式中、ＮＨＳは正常ヒト血清を意味する）。５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、Ｓ字状の用量−応答非線形回帰適合で分析した。
図２５Ｃおよび２５Ｄは、陽性対照リツキシマブと比較した場合の、標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞のｖ１３８０およびｖ１３７９（図２５Ｃ）ならびにｖ８７５（図２５Ｄ）を用いたＣＤＣアッセイの結果を示す。すべてのヘテロ多量体が、リツキシマブに比してＣＤＣの低下を示し、媒介する最大の標的細胞溶解は１５％以下である。
実施例２１：例示的ヘテロ多量体の細胞増殖およびサイトカイン放出評価
例示的ヘテロ多量体をインキュベートすることが細胞増殖およびサイトカイン放出に及ぼす影響を、ＰＢＭＣおよびＰＢＭＣ由来亜集団で調べた。ＰＢＭＣ由来亜集団は、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞を伴わないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−Ｂ）、ＮＫ細胞を伴わないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−ＮＫ）、ＮＫおよびＢ細胞を伴わないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−ＮＫ−Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ細胞を伴う）、およびＣＤ８＋（Ｂ細胞を伴わない）を包含する。手短に説明すると、４日および６日のインキュベーション期間中に、４つの（４）ドナーをＰＢＭＣおよびＰＢＭＣ由来亜集団（ＣＤ１９−、ＣＤ５６−またはＣＤ１９／ＣＤ５６−欠失ＰＢＭＣ集団）に関して試験し、および２つの（２）ドナーをＣＤ８およびＣＤ８プラスＢ細胞に関して試験した。２つの異なる濃度（０．３および１００ｎＭ）で、試験物に関して増殖アッセイを実施し、各々増殖読取りとしてチミジン取り込みを用いた。下記の方法により、フローサイトメトリー上のＣＢＡ（細胞数測定ビーズアレイ）プラットフォームを用いて、サイトカインを測定した。
血液試料を６つの正常ドナー（ＣＤ８パネルで用いた候補ドナーのＣＤ８計数はあらかじめ測定した）から採取し、その内の高ＣＤ８計数を有する２ドナーを、ＣＤ８実験パネル用に選択した。さらにまた、１ドナーを、バックアップとして用意した。１日目に約１３５ｍＬの血液を４ドナーの各々から採取し（ＰＢＭＣパネル用）、一方、２日目に、約１６５ｍｌの血液を２ドナーの各々から採取した（ＣＤ８パネル用）。両日に、ＰＢＭＣを新たに単離して、陽性選択によるＣＤ１９および／またはＣＤ５６欠失（１日目）ならびに陰性選択によるＣＤ８（±ＣＤ１９）の濃縮（２日目）のために、ＰＭＢＣをＥａｓｙＳｅｐカラム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に通した。
両日に関する選択亜集団の組成／純度／生存度を確認するために、ＣＤ８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５６−ＰＥ／７ＡＡＤ／ＣＤ１９−ＰＥＣＹ７／ＣＤ２０−ＡＰＣからなる抗体カクテルを用いた。
（細胞と希釈後の）最終濃度を０．３ｎＭおよび１００ｎＭとするために、２倍濃度で試験物を調製し、１００ｕｌの体積中に添加した。ＰＢＭＣを１００ｕｌの懸濁液中で２５０，０００細胞／ウェルでプレートに播いた。ＣＤ８分画を１５０，０００細胞／ウェルでプレートに播いた。混合物をそれぞれ３日および５日間インキュベートし、その後、５０ｕｌ／ウェルの細胞上清を低結合プレート中に移して、その後のサイトカイン分析のために凍結した。５０ｕｌのトリチウム化チミジンを細胞含有ウェルに添加して、最終的に０．５ｕＣｉ チミジン／ウェルとした。プレートをさらに１８時間インキュベートして、その後、プレートを凍結した。総インキュベーション時間は、４日および６日であった。
プレートを２日後に解凍し、濾過して、β線計数器を用いて計数した（ＣＰＭ）。
試験物の２つの濃度（０．３および１００ｎＭ）で、細胞増殖をアッセイした。平均から、刺激指数（ＳＩ）を以下：
試験物の平均ＣＰＭ／培地のみの平均ＣＰＭ
のように算定して、データを表にした。
ＰＢＭＣおよびＣＤ８の濃縮細胞集団の組成／生存度（トリパンブルー、７ＡＡＤ）を、抗ＣＤ８／ＣＤ５６／７ＡＡＤ／ＣＤ２０／ＣＤ５６を含む抗体カクテルを用いた選択後に、それらのそれぞれの割合に関して評価した。
増殖結果を分析した時点で、複製物からの上清をプールし、同定された外れ値をすべて増殖結果から除去した。プールした上清をサイトカイン測定に用い、ＣＢＡ ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、二重反復実験で行った。このキットは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦおよびＩＦｇを測定する。
細胞増殖４日間インキュベーションアッセイからの結果を、０．３ｎＭ（上パネル）および１００ｎＭ（下パネル）濃度に関して、図２６に示す。図２６の上パネルは、０．３ｎＭで、ｖ８７５およびｖ１３８０は、ヒトＩｇＧと比較して、ＰＢＭＣ増殖を誘導しないことを示す。図２６の下パネルは、１００ｎＭの抗体濃度の結果を示しており、ｖ８７５、ｖ１３８０およびｖ８９１が、ヒトＩｇＧに比して、より高い細胞増殖を誘導することを示す。図２６（下パネル）はまた、１００ｎＭで、ｖ８７５は、４つのＰＢＭＣ集団すべてにおいて抗ＣＤ３ ＯＫＴ３と比較して同様の増殖指数を有することを示す。しかしながら、ｖ８７５と比較して、ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト変異体）およびｖ８９１は、低減された細胞増殖を媒介し、および細胞増殖についてＢ細胞依存性傾向を示すが、ここで細胞増殖はＰＢＭＣ−ＢおよびＰＢＭＣ−Ｂ−ＮＫ亜集団でより低い。
図２８は、４日インキュベーション時点での精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２８Ａ）および１００ｎＭ（図２８Ｂ）濃度でのｖ８７５により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。図２８Ａは、０．３ｎＭで、ｖ８７５が、ヒトＩｇＧと比較してより高い刺激指数を、およびＯＫＴ３と比較してより低い刺激指数を有することを示す。図２８Ａはまた、ｖ８７５が、標的Ｂ細胞の存在下で（ＣＤ８＋Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い刺激指数を有することも示す。図２８Ｂは、１００ｎＭで、ｖ８７５が、ＯＫＴ３と比較して同様の刺激指数を有し、およびヒトＩｇＧと比較してより高い刺激指数を有しており、標的Ｂ細胞集団の影響はほとんどまたは全くないことを示す。
図２９は、４日インキュベーション時点での精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２９Ａ）および１００ｎＭ（図２９Ｂ）濃度でのｖ１３８０により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。図２９Ａは、０．３ｎＭで、ｖ１３８０が、ヒトＩｇＧと比較してより高い刺激指数を、およびＯＫＴ３と比較してより低い刺激指数を有することを示す。図２８Ａはまた、ｖ１３８０が、標的Ｂ細胞の非存在下で（ＣＤ８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い刺激指数を有することも示す。図２９Ｂは、１００ｎＭで、ｖ１３８０が、ＯＫＴ３と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の同様の刺激指数を有し、およびヒトＩｇＧと比較してより高い刺激指数を有することを示す。０．３ｎＭデータと同様に、ｖ１３８０は、標的Ｂ細胞の非存在下で（ＣＤ８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い刺激指数を有する。ｖ１３８０におけるＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト突然変異は、例示的ＷＴ Ｆｃ変異体ｖ８７５で明らかであったＣＤ８＋Ｔ細胞のＢ細胞依存性刺激を低減すると思われる。
サイトカイン放出アッセイからの結果を、図２７に示す。これは、０．３ｎＭ濃度で４日間、試験物に関してインキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＴＮＦα（図２７Ａ）、ＩＮＦγ（図２７Ｂ）、ＩＬ−２（図２７Ｃ）、ＩＬ−４（図２７Ｄ）およびＩＬ−１０（図２７Ｅ）レベルのまとめのプロットを包含する（グラフ：ｙ軸は、４ドナーからのｐｇ／ｍＬでの対数サイトカインレベルを表す）。図２７は、ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。
実施例２２：例示的ヘテロ多量体はエフェクターＴ細胞当たり２つ以上の標的Ｂ細胞を架橋し得る
実施例３に記載した方法に以下の修正を加えた方法を用いて、顕微鏡により、例示的ヘテロ多量体ｖ８７５で、Ｂ細胞と架橋するＴ細胞の能力および架橋Ｔ細胞対Ｂ細胞の数の比を調べた。
標識化Ｒａｊｉ Ｂ細胞（赤色）および標識化Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（青色）を、室温で３０分間、３ｎＭのヒトＩｇＧまたはｖ８７５とともにインキュベートした。１８０μｌの上清を除去することにより、細胞懸濁液を濃縮した。細胞を残りの体積中に再懸濁して、２００倍および４００倍で画像を撮った。
図３０は、倍率２００倍および４００倍でｖ８７５およびヒトＩｇＧ（３ｎＭ）を比較した、Ｔ：Ｂ細胞の架橋についての顕微鏡からの結果を示す：位相画像（上パネル）、蛍光画像（中パネル）および反転蛍光画像（下パネル）が提示されている。図３０Ａは、倍率２００倍でのヒトＩｇＧおよびｖ８７５の直接比較を示し、ヒトＩｇＧと比較して、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間により多量の架橋がみられることを示す。図３０Ｂおよび図３０Ｃは、倍率４００倍でのｖ８７５（図３０Ｂ）およびヒトＩｇＧ（図３０Ｃ）に関する２つの実視野を示す。図３０Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（蛍光反転画像での暗灰色細胞）およびＲａｊｉ Ｂ細胞（蛍光反転画像での明灰色細胞）間のｖ８７５媒介性免疫複合体形成の画像を示し、１つのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞が１〜３個のＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋し得ることを示す。図３０Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞とともにヒトＩｇＧをインキュベートした後の画像を示す。図３０Ｃは、図３０Ｂで観察されるｖ８７５媒介性Ｊｕｒｋａｔ:Ｒａｊｉ架橋と比較して、ヒトＩｇＧとともにインキュベートした後にはＪｕｒｋａｔ−Ｒａｊｉ架橋が存在しないことを示す。
実施例２３：表面プラズモン共鳴により評価した場合のＦｃγ受容体と結合する例示的ヘテロ多量体
ＦｃγＲ ＣＤ１６ａおよびＣＤ３２ａ／ｂと結合する例示的ヘテロ多量体抗体の能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて調べた。
表面プラズモン共鳴分析：ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システム（ＢＩＯＲＡＤ）を用いたＳＰＲにより、抗体Ｆｃに対するＦｃγＲ受容体の親和性を測定した。安定なベースラインを確立するために緩衝液を注入後に、２５□Ｌ／分で２４０秒間注入して（約５００ＲＵを生じる）精製抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９ベースの抗体を間接的に捕捉した。
ＦｃγＲ濃度（１０，０００、３３３３、１１１１、３７０、１２３ｎＭ）を６０μＬ／分で１２０秒間注入し、１８０秒の解離相で、結合センサーグラムの一式を得た。その結果生じるＫＤ値を、結合等温線から測定して、３つの個々の実験の平均として報告される値を用いて、１：１ラングミュア結合モデルに全体的に適合させた。
ＳＰＲ結合試験の結果を、表４に示す。
（表４）Ｆｃガンマ受容体と結合するヘテロ二量体抗体に関するＫＤ
Figure 2015528003
表４は、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ａＶ１５８、ＣＳ３２ａ、ＣＤ３２ａＲ１３１、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ｂＹ１６３と結合する例示的ヘテロ多量体に関するＫＤデータをまとめたものである。これらの結果は、ＷＴ Ｆｃ変異体 ｖ８７５、ｖ１３７９およびＷＴ ハーセプチンがすべてのＦｃγ受容体と結合することを示す。これらの結果はまた、Ｆｃノックアウト変異体が、いくつかの（ｖ１３８０）またはすべての（ｖ１３８１）Ｆｃガンマ受容体との結合の低下を有することも示す。
実施例２４：例示的ヘテロ多量体はヒトおよびカニクイザルＣＤ３ Ｔ細胞受容体と結合し得る
ヒトＣＤ３およびカニクイザル受容体との結合のための例示的ヘテロ多量体の結合を、以下の方法によるＥＬＩＳＡにより調べた。
ヒトまたはカニクイザルＣＤ３受容体抗原を、Ｃｏｓｔａｒ ３６９０高結合半区域高結合マイクロプレート中で、ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌに希釈して、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中のＢＳＡ １％で３０分間ブロックした（５０ｕｌ／ウェル）。一次ヘテロ多量体抗体を指示濃度でＢＳＡ １％中に希釈し、室温で２時間インキュベートして、ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３６−０６２：抗マウスまたは７０９−０３６−０９８ 抗ヒトＦｃガンマ特異的）を、ＢＳＡ １％中で１／５０００希釈して（２５μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＴＭＢ基質を、２５〜３０分間、添加し（２５μｌ／ウェル）、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１２．５μｌ／ウェル）で反応を停止させて、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡデータを図３５に示す。図３５は、ＥＬＩＳＡにより測定した場合の、ヒトＣＤ３との結合（上パネル）およびカニクイザルＣＤ３受容体との結合（下パネル）を示す。図３５は、ｖ４５４３、ｖ４５４５、およびｖ４５４８が、カニクイザルＣＤ３受容体に対する最高度の交差反応性を示すことを示している（図３５下パネル）。
実施例２５：ヘテロ多量体の発現および精製
例示的ヘテロ多量体の発現および精製に用いられる方法の説明は、実施例２に記載されている。
図３１Ａは、プロテインＡおよびＳＥＣ精製後の、および４℃で４７日貯蔵後の、ｖ８７５、ｖ１３８０、ｖ１３７９およびｖ８９１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。ｖ８９１試料における２つの明らかなタンパク質バンドは、貯蔵によるこの試料の分解生成物を示す。
図３１Ｂは、プロテインＡおよびＳＥＣ精製後のｖ８７５、ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、ｖ１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００、およびｖ１８０２を含む追加の例示的ヘテロ多量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。
実施例２６：例示的ヘテロ多量体は＞９９％ヘテロ二量体純度および＜１％凝集体に精製され得る
例示的ヘテロ多量体の純度を、ＬＣ−ＭＳにより試験した。実施例２に記載したように、プロテインＡ、プロテインＬおよびＳＥＣ精製により、ヘテロ多量体を先ず精製した。ヘテロ二量体純度に関するＬＣ−ＭＳ分析を、以下のように実施した。
精製試料を、３７℃で６時間、ＰＮＧアーゼＦで脱グリコシル化した。ＭＳ分析前に、試料をＰｏｒｏｓ Ｒ２カラム上に注入して、２０〜９０％ＡＣＮ、０．１％ＦＡを用いた勾配で、３分で溶離して、１つの単一ピークを生じた。
ＬＣカラムのピークを、以下の設定を用いてＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分光計で分析した：Ｃｏｎｅ電圧：５０Ｖ' Ｔｕｂｅレンズ：２１５Ｖ；ＦＴ解像度：７，５００。質量スペクトルを、ソフトウェアＰｒｏｍａｓｓまたはＭａｘ Ｅｎｔ．で積分して、分子量プロフィールを作成した。
ｖ８７５に関するＭａｘ Ｅｎｔ．分子量プロフィールのＬＣ−ＭＳ結果を図３２に示し、結果を表５にまとめる。
（表５）ｖ８７５のヘテロ二量体純度
Figure 2015528003
表５は、プロテインＡおよびＳＥＣ精製後、ｖ８７５が９９．２７％のヘテロ二量体純度（Ｈ１Ｈ２）および１％未満の抗ＣＤ３ホモ二量体（Ｈ２Ｈ２）および抗ＣＤ１９ホモ二量体（Ｈ１Ｈ１）で構成されていることを示す。
例示的プロテインＡおよびＳＥＣ精製ヘテロ多量体の純度および凝集パーセントを、記載済みの方法によりＵＰＬＣ−ＳＥＣにより測定した。
０．４ｍｌ／分で３０℃に設定したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレススチール、１．７μｍ粒子）を用いて、ＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析を実施した。実行時間は７分で、１回注入当たりの総体積は２．８ｍＬで、実行緩衝液は、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ７．１；および１５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．４〜７．１であった。吸光度による検出を１９０〜４００ｎｍで行い、蛍光による検出は２８０ｎｍで励起し３００〜３６０ｎｍから発光を収集して行った。ピーク積分を、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアにより分析した。
例示的ヘテロ多量体に関するＬＣ−ＭＳおよびＵＰＬＣ−ＳＥＣ結果を、表６にまとめる。表６は、すべてのヘテロ多量体が、ＬＣ−ＭＳにより測定した場合＞９５％のヘテロ二量体純度を有し、すべてのヘテロ多量体がＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析により測定した場合に＜２％凝集体を有することを示す。
（表６）例示的ヘテロ二量体のＬＣ−ＭＳおよびＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析のまとめ
Figure 2015528003
実施例２７：例示的ヘテロ多量体は７５℃より高いＣＨ３ Ｔｍを有する
以下の方法を用いて、ＤＳＣにより、例示的ヘテロ多量体のＣＨ３ドメイン安定性を調べた。ＤＳＣ実験はすべて、ＧＥ ＶＰ−キャピラリー計器を用いて実行した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて緩衝液交換し、０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬに希釈して、０．１３７ｍＬを試料セル中に添加し、１℃／分の走査速度にて２０℃〜１００℃で測定した。データを、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析して、ＰＢＳ緩衝液バックグラウンドを差し引いた。
図３３Ａ、ＢおよびＣに示したＤＳＣの結果は、ｖ８７５が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞７６℃を有し（図３３Ａ）、ｖ１３８０が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．３℃を有し（図３３Ｂ）、そしてｖ１３７９が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．５℃を有する（図３３Ｃ）ことを示している。
実施例２８：ＣＤ３／ＣＤ２０および追加のＣＤ３／ＣＤ１９ヘテロ多量体構築物の設計、発現および精製
Ｖ５８５０（ポリペプチド配列：配列番号２０３、２０５および２０７に対応する）、ｖ５８５１（ポリペプチド配列:配列番号２０９、２１１および２１３に対応する）、ｖ５８５２（ポリペプチド配列:配列番号２１５、２１７および２１９に対応する）、ｖ６３２４（ポリペプチド配列:配列番号２２１、２２３および２２５に対応する）、ｖ６３２５（ポリペプチド配列:配列番号２２５、２２７および２２９に対応する）、ｖ１８１３（ポリペプチド配列:配列番号２３１、２３３および２３５に対応する）、ｖ１８２１（ポリペプチド配列:配列番号２３７、２３９および２４１に対応する）、ｖ１８２３（ポリペプチド配列:配列番号２４３、２４５および２４７に対応する）は、二重特異性ＣＤ３／ＣＤ１９またはＣＤ３／ＣＤ２０ハイブリッドヘテロ二量体Ｆｃ構築物を例示する。二重特異性ハイブリッド変異体は、交互ポリペプチド鎖上のｓｃＦｖ−Ｆｃと対合される鎖ＡまたはＢ上のＦ（ａｂ'）からなる。ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａは、以下の突然変異：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖで構成され、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂは、以下の突然変異：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗで構成される。ｖ６３２４は、二重特異性ＣＤ３／ＣＤ２０ ｓｃＦｖヘテロ二量体Ｆｃ構築物を例示する。Ｖ１８１３、ｖ１８２１、および ｖ１８２３は、ＣＤ３／ＣＤ２０共通軽鎖ヘテロ二量体Ｆｃ構築物を例示する。共通の軽鎖変異体は、各々が相補的ヘテロ二量体Ｆｃ上にある２つの異なるＦ（ａｂ'）からなり、単一軽鎖を共有する。特異的変異体組成物を、表７に示す。
重鎖および軽鎖間に（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを用いて、公表済みの可変重鎖配列を表７に示される可変軽鎖配列と融合することにより、ｖ５８５２で用いられる抗ＣＤ１９ ＭＯＲ２０８＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＶＨＶＬ）を生成した。可変ドメインをヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂと融合した。
重鎖および軽鎖間に（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを用いて、公表済みの可変重鎖配列を表７に示される可変軽鎖配列と融合することにより、ｖ６３２４およびｖ６３２５で用いられる抗ＣＤ２０ オファツムマブ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＶＨＶＬ）を生成した。可変ドメインをヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂと融合した。
クローニング、発現および精製を、実施例２に示したように実施した。
変異体の収率および純度を表８に示す。実施例２６に従ってＬＣＭＳ分析により、ヘテロ二量体純度を測定した。すべての変異体は７３．８％を上回るヘテロ二量体純度を示し、試験したすべての変異体の平均純度は８９．６％であった。試料は、総生成物の０〜５．３％の範囲で低量の不正確に対合されたホモ二量体を含む。報告値は、すべての観察されたホモ二量体種の合計を表す。半抗体の存在は、ホモ二量体より一般的に観察され、総生成物の０〜２０．７％の範囲である。報告値は、すべての観察された半抗体種の合計を表す。
（表７）ＣＤ３／ＣＤ１９またはＣＤ２０ハイブリッド変異体の組成
Figure 2015528003
（表８）変異体の発現および純度
Figure 2015528003
＊ＬＣＭＳ結果から検出された未知の種
実施例２９：ＣＤ３／ＣＤ２０および追加のＣＤ３／ＣＤ１９ヘテロ多量体変異体はＴ細胞およびＢ細胞と結合する
例示的ＣＤ３／ＣＤ２０ヘテロ多量体 ｖ５８５０、ｖ６３２４、ｖ６３２５、ｖ１８１３、ｖ１８２１、ｖ１８２３がＣＤ３およびＣＤ２０細胞と結合する能力を、実施例４に記載した手順に従って、ＦＡＣＳ分析により評価した。さらに、例示的ＣＤ３／ＣＤ１９ヘテロ多量体 ｖ５８５１およびｖ５８５２がＣＤ３およびＣＤ１９細胞と結合する能力を同様に評価した。追加の変異体 ｖ８７５（ＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥ Ｆｃ抗体構築物）も調製し、ベンチマークとして試験した。ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞におけるｖ８７５、ｖ５８５０およびｖ５８５１に関する代表的結合曲線を、図３６Ａ＆３８Ｂに示す。動力学定数ＢｍａｘおよびＫｄで表される各変異体に関する結合結果を、以下の表９および１０に列挙する。表８は、ＣＤ１９およびＣＤ２０発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞との結合を記載し、一方、表１０は、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞との結合を記載する。Ｒａｊｉ結合試験（表９）において、変異体はすべて、８７５と比較して、より大きいＢｍａｘおよびより高いＫｄで結合した。Ｊｕｒｋａｔ結合試験（表１０）では、ｖ１８２３以外の全変異体は、８７５より高いＢｍａｘで結合し、ある範囲のＫＤを有した。
（表９）（Ｒａｊｉ）
Figure 2015528003
（表１０）（Ｊｕｒｋａｔ）
Figure 2015528003
実施例３０：ＣＤ３／ＣＤ２０および付加的ＣＤ３／ＣＤ１９ヘテロ多量体変異体はＴ細胞およびＢ細胞を架橋する
６つの例示的ＣＤ３／ＣＤ２０ヘテロ多量体変異体、すなわち、ｖ５８５０、ｖ６３２４、ｖ６３２５、ｖ１８１３、ｖ１８２１およびｖ１８２３、ならびに２つの例示的ＣＤ３／ＣＤ１９ヘテロ多量体変異体、すなわち、ｖ５８５１およびｖ５８５２がＴ細胞およびＢ細胞を架橋する能力を、実施例３に記載した手順に従って、ＦＡＣＳ分析により試験した。追加の構築物、すなわち、ｖ７９２およびｖ８７５も調製し、対照として試験した。Ｖ７９２は、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａおよび鎖Ｂ上にトラスツズマブを基礎にした同一の抗Ｈｅｒ２ Ｆ（ａｂ'）を有し、以下の突然変異を伴う：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（鎖Ａ上）およびＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（鎖Ｂ上）（ｄｒｕｇ ｂａｎｋ寄託番号 ＤＢ０００７２）。
表１１および１２は、各変異体に関するＪｕｒｋａｔ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ−ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ−Ｒａｊｉ間の結合パーセンテージを提供する。各表は、個々の実験を表す。変異体はすべて、ＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ細胞を架橋するのに有効であった。さらに、２つのＪｕｒｋａｔ細胞を架橋した変異体はなく、またいくつかのＲａｊｉ−Ｒａｊｉ細胞架橋が異なる程度で観察された。
（表１１）
Figure 2015528003
（表１２）
Figure 2015528003
実施例３１：ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ多量体構築物の設計、発現および精製
ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二重特異性ヘテロ多量体構築物の種々の特性を評価するために、以下のように２つのフォーマットおよび種々の対照を生成して、精製した。ヘテロ二量体Ｆｃ領域上にＨＥＲ２結合およびＨＥＲ３結合ｓｃＦｖを融合することにより、第一構築物を産生した（ｖ８７８、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ Ｈｅｔ−Ｆｃ）。アルブミンベースのプラットフォーム上にＨｅｒ２およびＨｅｒ３ ｓｃＦｖを融合することにより、第二構築物を調製した（ｖ１０９０、ＡｌｂｕＣＯＲＥ抗Ｈｅｒ３×Ｈｅｒ２）。種々の対照、例えばＨｅｒ２ Ｏｎｅ−Ａｒｍｅｄ ｈｅｔ−Ｆｃ、Ｈｅｒ３ ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ ｈｅｔ−Ｆｃおよび対照ＨＳＡ−融合タンパク質 ｖ１０８７も対照として生成した。
設計
ｈｅｔ−ＦｃまたはＡｌｂｕＣＯＲＥプラットフォーム上にＨｅｒ２およびＨｅｒ３ ｓｃＦｖを融合することにより、二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３構築物を産生した。
１． 変異体８７８： 一価単腕化抗Ｈｅｒ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖Ａ上のｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａに突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、そして鎖ＢにＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン１である。
２． 変異体８７９： 一価単腕化抗Ｈｅｒ３抗体であり、Ｈｅｒ３結合ドメインは鎖Ｂ上のｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａに突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、そして鎖ＢにＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。
３． 変異体８８０： 二重特異性抗Ｈｅｒ２、抗Ｈｅｒ３抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖Ａ上のｓｃＦｖであり、Ｈｅｒ３結合ドメインは鎖Ｂ上のｓｃＦｖであり、そしてＦｃ領域は、鎖Ａに突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖ＢにＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。
４． 変異体１０８７： ＭＭ−１１１分子は、修飾化ヒト血清アルブミンタンパク質のそれぞれＣおよびＮ末端と連結される２つのｓｃＦｖ 抗Ｈｅｒ２（Ｂ１Ｄ２）および抗Ｈｅｒ３（Ｈ３）の単一ポリペプチド融合タンパク質であり、そしてＭｅｒｒｉｍａｃｋにより生成される。その結果生じる分子は、二重特異性および二価である。対照として、ＭＭ−１１１分子の一バージョンを構築し、ここで抗Ｈｅｒ３（Ｈ３）実用頭部を短いＡＡＳリンカーによりアルブミンのＮ末端と融合し、一方、ＡＡＡＬリンカーを介して抗Ｈｅｒ２（Ｂ１Ｄ２）をＣ末端と融合して、ベンチマーク対照変異体１０８７を作成した。この対照変異体は、それらのＭＭ−１１１分子においてＭｅｒｒｉｍａｃｋにより本来導入されるＣ３４Ｓ／Ｎ５０４Ｑ突然変異を欠いており、配列番号２５８に対応するポリペプチド配列を有する。
５． 変異体１０９０： ＧＧＧＳリンカーを介してそのＮ末端で抗ＨＥＲ３と融合された断片１［配列番号２６０］およびＧＧＧＳリンカーを介してそのＣ末端でＨＥＲ２（Ｂ１Ｄ２）と融合された断片２［配列番号２６２］を組み合わせることにより、アルブミンベースのヘテロ多量体を形成した（変異体番号１０９０）。この分子は、実用頭部またはカーゴポリペプチドをシスで有し、かつｖ１０８７とほとんど同一である。１０８７ポリペプチドと１０９０との間の主な差異は、１）１０８７ポリペプチドに用いられるリンカーはより疎水性である一方、１０９０変異体上で用いられるリンカーはポリＧＬＹ（Ｓ）であったこと、および２）１０９０変異体は、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋにより本来導入されるＣ３４Ｓ／Ｎ５０４Ｑ突然変異を欠くということである。
変異体８７８、８７９、および８８０を、実施例２に記載したように発現し、精製した。変異体１０８７および１０９０を、実施例１０に記載したように発現し、精製した。
実施例３２：ＦｃベースのＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ多量体構築物はＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞上のＨｅｒ２およびＨｅｒ３受容体と二重特異的に結合する
ｖ８７８、ｖ８７９およびｖ８８０ ＨＥＲ２およびＨＥＲ３構築物がＨｅｒ２およびＨｅｒ３と結合する能力を、ＦＡＣＳ分析を用いて評価した。
一用量範囲の２つの単腕一価変異体（抗ＨＥＲ２単腕ｖ８７８および抗ＨＥＲ２単腕ｖ８７９）ならびに二重特異性抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体 ｖ８８０を、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ黒色腫細胞とともにインキュベートし、その後、ＦＡＣＳ分析して、実施例４に記載したように各分子の結合親和性を測定した。
図３７Ａおよび３７Ｂは、それぞれ、線形および対数スケールでの親和性を示す。図に示すように、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｈｅｔ−Ｆｃ構築物は、二重特異性および結合活性をともに示す。
実施例３３：アルブミンベースのＨＥＲ２／ＨＥＲ３ベースの構築物はＭＡＬＭＥ−３細胞上のＨｅｒ２およびＨｅｒ３受容体と二重特異的に結合する
シス立体配置で抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３ ｓｃＦｖを備えたアルブミンベースのヘテロ多量体のＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対する結合親和性を評価し、ｖ１０８７対照と比較した。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に関する例示的アルブミンベースのヘテロ多量体変異体１０９０（抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ３ ＡＢＨ２）の結合親和性を、実施例４に記載したように、ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とともにＦＡＣＳを用いて評価した。
図３８は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞における対照１０８７と比較した場合の変異体１０９０の結合を図示し、ｖ１０９０が標的ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対してｖ１０８７と同様の結合を有することを示している。
実施例３４：一価単腕化抗ＣＤ３抗体はＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋し得る
Ｔ細胞およびＢ細胞を架橋する一重特異的抗ＣＤ３抗体 ｖ８７０、ｖ８７１、ｖ８７２の能力を、実施例３に記載したようにＦＡＣＳ分析により試験した。
結果を表１３にまとめる。表１３は、ｖ８７０、ｖ８７１およびｖ８７２が、培地およびヒトＩｇＧ対照と比較して、より高いパーセンテージのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋することを示す。表１３はまた、ｖ８７０、ｖ８７１およびｖ８７２が、二重特異性抗ＣＤ３抗ＣＤ１９抗体 ｖ８７３と比較して、より低いパーセンテージのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋することも示す。
（表１３）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞の一価抗ＣＤ３抗体架橋
Figure 2015528003
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示目的のために過ぎず、それに鑑みて、種々の修正または変更が当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきものである、と理解されるべきである。
本明細書中で定義されるようなヘテロ多量体を含むキット、ならびにその使用説明書も提供される。
[本発明1001]
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合するＣＤ3結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
前記ＣＤ3結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも1つが一本鎖Ｆｖ領域を含み；
ＣＤ3発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも1つのＢ細胞および前記少なくとも1つのＣＤ3発現細胞に同時に関与し；かつ
前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ3領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約70％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を10％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1002]
前記第一または第二ポリペプチド構築物が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン第一定常（ＣＨ1）領域のうちの少なくとも1つを欠いている、本発明1001の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1003]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、すべてのＦｃガンマ受容体との機能的に有効な結合を妨げるアミノ酸修飾を含む、変異体ＣＨ2ドメインまたはヒンジを含む、本発明1001〜1002のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1004]
アミノ酸修飾を含む前記変異体ＣＨ2ドメインまたはヒンジが、補体タンパク質（Ｃ1ｑ複合体）との機能的に有効な結合も妨げる、本発明1003の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1005]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合を増強するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ2ドメインまたはヒンジを含む、本発明1001〜1002のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1006]
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合するＣＤ3結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
前記ＣＤ3結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも1つが任意で一本鎖Ｆｖ領域を含み；
前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ3領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が70％より多い前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を10％未満含むような純度で形成され；かつ
前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が1より大きい結合価で前記少なくとも1つのＢ細胞に結合し、かつＣＤ3発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体は同時に前記少なくとも1つのＢ細胞および前記少なくとも1つのＣＤ3発現細胞に関与する、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1007]
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合するＣＤ3結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、無視できるほどの受容体結合を示す立体調節因子構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
ＣＤ3発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも1つのＢ細胞および前記少なくとも1つのＣＤ3発現細胞に同時に関与し；かつ
前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ3領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約75％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を10％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1008]
第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合するＣＤ3結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物であって、抗原結合ポリペプチド構築物を含まない、第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
ＣＤ3発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が少なくとも1つのＢ細胞および前記少なくとも1つのＣＤ3発現細胞に同時に関与し；かつ
前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ3領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約75％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を10％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1009]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ2ドメインを含む、本発明1001〜1008のいずれかの単離多重変異性ヘテロ多量体。
[本発明1010]
前記変異体ＣＨ2ドメインが、野生型ＣＨ2ドメインより多くＦｃガンマＩＩｂ受容体に選択的に結合する、本発明1009の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1011]
前記変異体ＣＨ2ドメインが、野生型ＣＨ2ドメインより多くＦｃガンマＩＩＩａおよびＦｃガンマＩＩａ受容体のうちの少なくとも1つに選択的に結合する、本発明1009の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1012]
前記変異体ＣＨ3ドメインが、約73℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1001〜1011のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1013]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約90％より高い純度で形成される、本発明1001〜1012のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1014]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約95％以上の純度で形成され、Ｔｍが少なくとも約75℃である、本発明1001〜1013のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1015]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、少なくとも約90％の純度で形成され、Ｔｍが約75℃である、本発明1001〜1013のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1016]
ａ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｌ351Ｙ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含み、かつ第二輸送体ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ366Ｌ、Ｋ392Ｍ、およびＴ394Ｗを含むか；
ｂ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｌ351Ｙ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ366Ｌ、Ｋ392Ｌ、およびＴ394Ｗを含むか；
ｃ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｌ351Ｙ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｔ366Ｌ、Ｋ392Ｍ、およびＴ394Ｗを含むか；
ｄ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｌ351Ｙ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｔ366Ｌ、Ｋ392Ｌ、およびＴ394Ｗを含むか；
ｅ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ366Ｌ、Ｎ390Ｒ、Ｋ392Ｒ、およびＴ394Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｌ351Ｙ、Ｓ400Ｅ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含むか；あるいは
ｆ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｔ366Ｌ、Ｎ390Ｒ、Ｋ392Ｒ、およびＴ394Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ3配列がアミノ酸修飾Ｔ350Ｖ、Ｌ351Ｙ、Ｓ400Ｅ、Ｆ405Ａ、およびＹ407Ｖを含む、本発明1001〜1015のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1017]
前記ヘテロ二量体Ｆｃがグリコシル化されている、本発明1001〜1016のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1018]
前記ヘテロ二量体Ｆｃがアフコシル化（afucosylated）されている、本発明1001〜1016のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1019]
前記ヘテロ二量体Ｆｃがアグリコシル化（aglycosylated）されている、本発明1001〜1016のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1020]
少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物が、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも1つの標的抗原結合ドメインを含む、本発明1001〜1006および1009〜1019のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1021]
前記抗体が、軽鎖を欠く重鎖抗体である、本発明1020の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1022]
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのＣＤ19結合ドメインを含む、本発明1001〜1006および1009〜1021のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1023]
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのＣＤ20結合ドメインを含む、本発明1001〜1006および1009〜1021のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1024]
少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合する少なくとも1つのＣＤ3結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；
少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも1つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
前記第一および第二輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記単量体タンパク質の擬似ネイティブ構造を形成する、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1025]
前記輸送体ポリペプチドが抗体に由来しない、本発明1024の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1026]
各輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体である、本発明1024〜1025のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1027]
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、本発明1026の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1028]
少なくとも1つの輸送体ポリペプチドがアロアルブミン誘導体である、本発明1024〜1025のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1029]
各輸送体ポリペプチドが異なるアロアルブミンに由来する、本発明1024〜1025、および1028のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1030]
少なくとも1つのＣＤ3発現細胞上のＣＤ3複合体と結合する少なくとも1つのＣＤ3結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；
少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも1つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
前記第一および第二輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメント化により得られ、各輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、これにより前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブアルブミンを形成し、かつ第一カーゴポリペプチドが第二カーゴポリペプチド中に存在するいかなる結合ドメインも有さない、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
[本発明1031]
ＣＤ3発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が、前記少なくとも1つのＢ細胞および前記少なくとも1つのＣＤ3発現細胞に同時に関与する、本発明1024〜1030のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1032]
少なくとも1つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物が、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも1つの標的抗原結合ドメインを含む、本発明1024〜1030のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1033]
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのＣＤ19結合ドメインを含む、本発明1024〜1032のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1034]
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのＣＤ20結合ドメインを含む、本発明1024〜1032のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1035]
前記少なくとも1つのＣＤ3結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ3特異的抗体、ナノボディ、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも1つのＣＤ3結合ドメインを含む、本発明1001〜1034のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1036]
前記少なくとも1つのＣＤ3結合ドメインが、修飾を含まない対応するＣＤ3結合ドメインと比較した場合に免疫原性を低減させる少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1035の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1037]
前記少なくとも1つのＣＤ3結合ドメインが、修飾を含まない対応するＣＤ3結合ドメインと比較した場合にＴ ｍ により測定されるその安定性を増大させる少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001〜1036のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1038]
前記ＣＤ3特異的抗体が、軽鎖を欠く重鎖抗体である、本発明1036〜1037のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1039]
前記少なくとも1つのＣＤ3結合ポリペプチド構築物が、非抗体タンパク質足場ドメイン由来の少なくとも1つのＣＤ3結合ドメインを含む、本発明1036〜1037のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1040]
前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも1つが、一本鎖Ｆｖポリペプチドをさらに含む、本発明1001〜1039のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1041]
前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも1つが、一本鎖Ｆａｂポリペプチドをさらに含む、本発明1001〜1040のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1042]
ＣＤ3発現細胞がＴ細胞である、本発明1001〜1041のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1043]
十分な親和性でＴ細胞と結合し、Ｔ細胞とＢ細胞が架橋される際にＢ細胞死滅活性を示すようＴ細胞を誘導する十分な能力でＴ細胞を修飾する、本発明1042の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1044]
ＣＤ3発現細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1043のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1045]
ＣＤ3発現細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、本発明1001〜1044のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1046]
少なくとも1つのＣＤ3結合ポリペプチド構築物が、多数の種にまたがるＣＤ3構築物と結合する、本発明1001〜1045のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1047]
少なくとも1つのＢ細胞が疾患と関連する、本発明1001〜1046のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1048]
前記疾患が、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である、本発明1047の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1049]
前記癌が、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫のうちの少なくとも1つである、本発明1048の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1050]
少なくとも1つのＢ細胞が、リンパ球系または骨髄系の細胞である自己免疫反応性細胞である、本発明1001〜1049のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1051]
以下：ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＨＥＲ−2ｎｅｕ、ＨＥＲ−3、ＨＥＲ−4、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−1（ムチン）、ＭＵＣ2、ＭＵＣ3、ＭＵＣ4、ＭＵＣ5、ＭＵＣ7、ＣＣＲ4、ＣＣＲ5、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ33、ＣＤ30、ガングリオシドＧＤ3、9−Ｏ−アセチル−ＧＤ3、ＧＭ2、ポリＳＡ、ＧＤ2、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ44ｖ6、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−1、形質細胞抗原、（膜結合）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ8、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ33抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−6；デスモグレイン4、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ25、ＣＡ19−9マーカー、ＣＡ−125マーカーおよびミュラー管退縮因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−72）、ＦＡＰ（繊維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＥＰＨＡ4 ＣＤ63、ＣＤ3 ＢｓＡｂイムノサイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−2、およびＴＲＡＩＬのうちの少なくとも1つに結合する少なくとも1つの結合ドメインをさらに含む、本発明1001〜1050のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1052]
任意で少なくとも1つのリンカーを含む、本発明1001〜1051のいずれかの単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1053]
前記少なくとも1つのリンカーが、約1〜約100個のアミノ酸を含むポリペプチドである、本発明1052の単離多重特異性ヘテロ多量体。
[本発明1054]
本発明1001〜1053のいずれかの多重特異性ヘテロ多量体を発現するための一式の発現ベクターであって、前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも1つの第一ＤＮＡ配列および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも1つの第二ＤＮＡ配列を含む、一式の発現ベクター。
[本発明1055]
安定な哺乳動物細胞で、本発明1001〜1053のいずれかの多重特異性ヘテロ多量体を含有する発現生成物の産生方法であって、
前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも1つの第一ＤＮＡ配列および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも1つの第二ＤＮＡ配列で少なくとも1つの哺乳動物細胞をトランスフェクトし、これにより前記少なくとも1つの第一ＤＮＡ配列、前記少なくとも1つの第二ＤＮＡ配列が、予定比率で前記少なくとも1つの哺乳動物細胞にトランスフェクトされて安定な哺乳動物細胞を生成する段階；
前記安定な哺乳動物細胞を培養して前記多重特異性ヘテロ多量体を含む前記発現生成物を産生する段階
を包含する、方法。
[本発明1056]
少なくとも1つの第一ＤＮＡ配列：少なくとも1つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率が、約1:1である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ0、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ138、ＢＨＫ、ＣＯＳ−7、Ｃａｃｏ−2およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される、本発明1055〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
本発明1001〜1053のいずれかで定義されるような多重特異性ヘテロ多量体、および適切な賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1059]
本発明1057の薬学的組成物の産生方法であって、
ａ． 本発明1001〜1053のいずれかで定義されるようなヘテロ多量体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階；
ｂ． 培養物から産生ヘテロ多量体を回収する段階;および
薬学的組成物を生成する段階
を包含する、方法。
[本発明1060]
増殖性疾患、微小残存癌、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウィルス性疾患、アレルギー反応、寄生生物性反応、移植片対宿主疾患または宿主対移植片疾患、あるいは細胞悪性腫瘍のうちの少なくとも1つの防止、処置または改善のための方法であって、
このような防止、処置または改善を必要とする対象に本発明1058の薬学的組成物を投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1061]
それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、
有効量の本発明1058の薬学的組成物を任意で他の薬学的に活性な分子と組み合わせて含む組成物を哺乳動物に投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1062]
前記癌が固形腫瘍である、本発明1061の方法。
[本発明1063]
前記固形腫瘍が肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの1つ以上である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記癌が血液学的癌である、本発明1061の方法。
[本発明1065]
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病のうちの1つ以上である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
癌細胞の処置方法であって、
本発明1001〜1053のいずれかで提供されるヘテロ多量体を含む組成物を前記細胞に提供する段階
を包含する、方法。
[本発明1067]
前記ヘテロ多量体を別の治療薬と一緒に提供する段階
をさらに包含する、本発明1066の方法。
[本発明1068]
それを必要とする哺乳動物における、ＣＤ19溶解性抗体、ＣＤ20溶解性抗体およびブリナツモマブのうちの少なくとも1つに非応答性である癌の処置方法であって、
有効量の本発明1058の薬学的組成物を哺乳動物に投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1069]
ブリナツモマブによる処置後に退縮する癌細胞の処置方法であって、
有効量の本発明1058の薬学的組成物を含む組成物を前記癌細胞に提供する段階
を包含する、方法。
[本発明1070]
Ｂ細胞の発現により特徴付けられる疾患に罹患している個体の処置方法であって、
有効量の本発明1058の薬学的組成物を含む有効量の組成物を前記個体に提供する段階
を包含する、方法。
[本発明1071]
前記疾患が、抗ＣＤ19抗体および抗ＣＤ20抗体のうちの少なくとも1つによる処置に応答性でない、本発明1070の方法。
[本発明1072]
それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、
有効量の本発明1058で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1073]
前記自己免疫症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および1型糖尿病のうちの1つ以上である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、
本発明1001〜1053のいずれかで提供されるヘテロ多量体を含む有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階
を包含する、方法。
[本発明1075]
本発明1001〜1053のいずれかで定義されるようなヘテロ多量体を含むキット、ならびにその使用説明書。
本明細書中で提供されるヘテロ多量体構築物の例示的模式図を示す。例えば、免疫グロブリンベースの抗ＣＤ３×ＣＤ１９構築物はヘテロ多量体の異なる態様を示し、例えば、漫画風の図は、第一および第二ポリペプチド構築物を示し、ここで第一ポリペプチド構築物はＣＨ３結合構築物（黒色）を含み、第二ポリペプチド構築物は抗原結合構築物（青色）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、存在しないか、あるいは立体調節構築物に取って代わられる。第一および第二ポリペプチド構築物の変異体ＣＨ３領域により形成されるＦｃヘテロ多量体も示されている。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物（ｖ８７３）ならびにヘテロ多量体Ｆｃを含まない構築物（ブリナツモマブＣＤ１９−ＣＤ３ ＢｉＴＥ（ｖ８９１、ＭＴ−１０３））の、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ３ Ｔ細胞（上左象限）をＲａｊｉ ＣＤ１９Ｂ細胞（下右象限）と架橋させる能力をＦＡＣＳにより示す。 本明細書中に記載されるヘテロ多量体（ｖ８７３）が、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（下右パネル）ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞（上右パネル）と選択的に結合し架橋し得ることを実証する。図２はまた、単腕抗ＣＤ３抗体がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と特異的に結合し（下中パネル）ＣＤ１９発現Ｂ細胞とは交差反応しない（上中パネル）ことを実証し、かつ単腕抗ＣＤ１９抗体がＲａｊｉ Ｂ細胞と特異的に結合し（上左パネル）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは交差反応しない（下左パネル）ことを実証する。 図３Ａは、３つのドナーからの標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞を死滅させるようＩＬ−２活性化ＰＢＭＣを再指向させる、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３）の能力を示す。図３Ｂは、ドナーの１つにおいて本明細書中に記載のヘテロ多量体が、ヘテロ二量体Ｆｃを欠く構築物よりも高い再指向性Ｔ細胞性細胞傷害性を媒介できることを実証する。 本明細書中に記載のヘテロ多量体が、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と結合しかつＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞と結合し得ることを示す。 試験した濃度において、ｖ１０９２（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が総細胞の３１％を架橋でき、またｖ８７３（本明細書中に記載の別のヘテロ多量体）が総細胞の２５％を架橋できたことを示す。 ｖ１０９２がｖ２２１より大きい程度に、そしてｖ８９１およびｖ８７３と同程度に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＲａｊｉ Ｂ細胞を架橋し得たことを実証する。 ある種の適応症の処置のために本明細書中に記載のヘテロ多量体とともに提供され得る抗体治療薬を示す。 本明細書中に記載の例示的ヘテロ多量体構築物が、＞８０％の細胞生存度で、ＣＨＯ３Ｅ７細胞中で一時的に発現されることを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 個々のドナーにわたって比較する場合、陰性対照ヒトＩｇＧ１（Ｇ１）と比較して、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３）が標的Ｂ細胞に対してより高い細胞傷害性(%)を誘導することを示す。 図９Ａは、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは結合せず、Ｒａｊｉ Ｂ細胞との低レベル結合を有することを示す。図９Ａはまた、抗ＣＤ１９単腕構築物がＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とは交差反応しないことを示す。図９Ｂは、ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）がＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞ならびにＲａｊｉ Ｂ細胞と選択的に結合することを示すＦＡＣＳアッセイを示す。 ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しないＫ５６２細胞株と結合しないことを示す。 ｖ８７３（本明細書中に記載のヘテロ多量体）が、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しないマウスリンパ様細胞と結合しないことを示す。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、本明細書中に記載のヘテロ多量体（ｖ８７３、ｖ８７５）ならびにヘテロ二量体Ｆｃを欠く構築物（ｖ８９１）の、ＣＤ３発現ＨＰＢ−ＡＬＬおよびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ならびにＣＤ１９発現Ｒａｊｉ Ｂ細胞とのＦＡＣＳ結合曲線を示す。 図１３Ａは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験した、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ細胞と結合するヘテロ多量体構築物ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ１３８１および対照ｖ８９１に関するＦＡＣＳ結合曲線を示す。図１３Ｂは、０．１〜３００ｎＭの範囲で試験したＨＢＰ−ＡＬＬ Ｔ細胞と結合するヘテロ多量体構築物ｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０に関するＦＡＣＳ結合曲線を示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物（ｖ８７５およびｖ８９１）が、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間の同等な架橋を促進することを示す。対照ヒトＩｇＧの使用はＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞間の２．５％架橋を生じたが、一方ｖ８７５は総細胞の２２．９％の架橋を促進し、そしてｖ８９１は総細胞の１４．５％の架橋を促進した。 ０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度で、１：１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。 ０．３ｎＭ〜３ｎＭの範囲のヘテロ多量体濃度で、１５:１比のＴ細胞対Ｂ細胞を用いた架橋の量を示す。ｖ８７５で試験した両Ｅ:Ｔ比率（１：１および１５：１）は、バックグラウンドに対する倍率として表した場合、同様の総Ｔ細胞−Ｂ細胞架橋を生じた。 ｖ８７５、ｖ１３７９およびｖ１３８０が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＲａｊｉ Ｂ細胞への再指向による抗体依存性Ｂ細胞性細胞傷害性を媒介する能力を示す。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５（図１６Ｂ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５（図１６Ｃ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ８７５ｖ１３７９（図１６Ｄ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１６ＡのデータをヒトＩｇＧで正規化した表示をｖ１３８０（図１６Ｅ）に関して示しており、各試験抗体濃度において示された細胞傷害性％を含む。 図１７Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％がわずかに低減（ｖ８７５）するか、または全く低減しない（ｖ８７３）ことを示す。図１７Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関する標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。 図１８Ａは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全ての抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。図１８Ｂは、静止ＰＢＭＣのＦｃ遮断により、ｖ８７５およびｖ８７３に関して試験した全ての抗体濃度で標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞の細胞傷害性％が低減することを示す。 図１９Ａは、ｖ８７５およびｖ８７３がエフェクターとしてＩＬ−２活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する＞３０％細胞傷害性を引き起こし、かつ最大標的細胞死滅が３ｎＭ濃度で観察されることを示す図１９Ｂは、ｖ８７５およびｖ８７３がエフェクターとして静止ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞に対する用量依存性（＞２０％）細胞傷害性を引き起こすことを示す。 図２０Ａは、ＩＬ−２活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたｖ８７５の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。図２０Ｂは、静止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたｖ８７５の標的Ｒａｊｉ Ｂ細胞性細胞傷害性を示す。 非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に関して、ｖ８７５およびｖ８７３（３００ｎＭ）が、総静止ＰＢＭＣおよび総ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣにおける自家Ｂ細胞死滅を媒介することを示す。 非処理培地およびヒトＩｇＧ対照に対して、ｖ８７５はより多くの自家Ｔ細胞を残しておくことにより、ｖ８７３およびｖ８９１と比べより選択的なＢ細胞死滅を有することを示す。 ＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ８７５の作用を示す。 静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ８７５の作用を示す。 ＩＬ−２活性化細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ１３７９およびｖ１３８０の作用を示す。 静止細胞培養におけるＣＤ２０＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋小集団の生存度に及ぼすｖ１３７９およびｖ１３８０の作用を示す。 図２４Ａは、静止エフェクターおよびＲａｊｉ Ｂ細胞における抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を示す。図２４Ｂは、活性化エフェクターにおける抗体媒介性ＬＤＨ放出の結果を示す。 リツキシマブによる、ならびにＷＴ Ｆｃを用いた本明細書中に記載のヘテロ多量体による（ｖ８７５）ＡＤＣＣの媒介を示す（約４０％の最大細胞溶解）。 ＷＴ Ｆｃをもつｖ１３７９（本明細書中に記載のヘテロ多量体）はＡＤＣＣを媒介し得るが、一方、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５ＡノックＦｃ突然変異をもつｖ１３８０は、標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞へのＡＤＣＣが低下することを示す。 陽性対照リツキシマブと比較した、ｖ１３８０およびｖ１３７９（図２５Ｃ）を用いた標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す。 陽性対照リツキシマブと比較した、ｖ８７５（図２５Ｄ）を用いた標的Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す。 ０．３ｎＭで、ｖ８７５およびｖ１３８０は、ヒトＩｇＧと比較して、ＰＢＭＣ増殖を誘導しないことを示す。図２６の下パネルは、１００ｎＭ抗体濃度の結果を示しており、ｖ８７５、ｖ１３８０およびｖ８９１が、ヒトＩｇＧと比較して、より高い細胞増殖を誘導することを示す。図２６（下パネル）はまた、１００ｎＭで、ｖ８７５は、４つのＰＢＭＣ集団すべてにおいて抗ＣＤ３ ＯＫＴ３と比較して同様の増殖指数を有することを示す。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＴＮＦα（図２７Ａ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＮＦγ（図２７Ｂ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−２（図２７Ｃ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−４（図２７Ｄ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ｖ１３８０（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ Ｆｃノックアウト）は、ｖ８７５（ＷＴ Ｆｃ）およびＯＫＴ３と比較した場合、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のより低いサイトカイン放出を誘導することを示す。図２７Ａ〜２７Ｅに示すようにサイトカイン放出アッセイからの結果は、０．３ｎＭ濃度で試験物と４日間インキュベーション後の、ＰＢＭＣ上清 ＩＬ−１０（図２７Ｅ）のプロットの概要を包含する（グラスのｙ軸は、４つのドナーからの対数サイトカインレベルをｐｇ／ｍＬで表す）。 ４日インキュベーション時点における精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２８Ａ）および１００ｎＭ（図２８Ｂ）濃度のｖ８７５により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。 ４日インキュベーション時点における精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非存在下または存在下での、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における０．３ｎＭ（図２９Ａ）および１００ｎＭ（図２９Ｂ）濃度のｖ１３８０により誘導される平均刺激指数からの結果を示す。 倍率２００倍および４００倍でｖ８７５およびヒトＩｇＧ（３ｎＭ）を比較するＴ：Ｂ細胞の架橋について顕微鏡からの結果を示す。図３０Ａは、倍率２００倍でのヒトＩｇＧおよびｖ８７５の直接比較を示し、ヒトＩｇＧと比較して、ＲａｊｉＢ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞間にみられるより多量の架橋を示す。 倍率４００倍でのｖ８７５（図３０Ｂ）に関する２つの実視野を示す。 倍率４００倍でのヒトＩｇＧ（図３０Ｃ）に関する２つの実視野を示す。 プロテインＡおよびＳＥＣ精製後の、そして４℃で４７日貯蔵後の、ｖ８７５、ｖ１３８０、ｖ１３７９およびｖ８９１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。 プロテインＡおよびＳＥＣ精製後のｖ８７５、ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、ｖ１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００およびｖ１８０２を含む追加の例示的ヘテロ多量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および相対純度を示す。 ｖ８７５に関するＭａｘＥｎｔ．分子量プロフィールのＬＣ−ＭＳ結果を示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ８７５が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞７６℃を有することを示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ１３８０が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．３℃を有することを示す。 本明細書中に記載のヘテロ多量体構築物に関するＤＳＣ結果を示し、ｖ１３７９が概算ＣＨ３ Ｔｍ＞８２．５℃を有することを示す。 ＦＡＣＳにより評価した、本明細書中に記載のヘテロ多量体の、Ｒａｊｉ Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｂ:Ｔ）の架橋能力、ならびにＲａｊｉ:Ｒａｊｉ Ｂ細胞架橋（Ｂ:Ｂ）の能力、およびＪｕｒｋａｔ:Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞架橋（Ｔ:Ｔ）の能力を示す。図３４Ａは、３回の反復実験に亘るｖ８７５、ｖ１３７９、ｖ１３８０、ｖ８９１、ｖ１３８１、市販のＯＫＴ３およびヒトＩｇＧの、Ｔ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示す。 安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有する変異体（ｖ１６５３、ｖ１６５４、ｖ１６５５、１６５６、ｖ１６６０、ｖ１８００、ｖ１８０２）およびｖ８７５、ならびにヒトＩｇＧのＴ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示す。 安定性増強のための改変抗ＣＤ３実用頭部を有する（ｖ１６６６）か、またはヒト／カニクイザル交差反応性抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓを有する（ｖ４５４１、ｖ４５４３、ｖ４５４５、ｖ４５４８）Ｆｃノックアウト変異体、市販のＯＫＴ３抗ＣＤ３対照、ｖ２１７６抗ＣＤ１９対照およびヒトＩｇＧ陰性対照の、Ｔ:Ｂ、Ｂ:Ｂ、およびＴ:Ｔ架橋の量を示しており、すべての変異体が低Ｔ:Ｔ架橋を媒介する。 ＥＬＩＳＡにより測定した、本明細書中に記載のヘテロ多量体のヒトＣＤ３への結合（上パネル）、およびカニクイザルＣＤ３受容体への結合（下パネル）を示す。 ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｈｅｔ−Ｆｃ構築物のそれぞれ線形および対数スケールでの親和性を示し、二重特異性および抗体結合力の両方を実証している。 ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞における、対照１０８７と比較した変異体１０９０の結合を図示し、ｖ１０９０が標的ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対してｖ１０８７と同様の結合を有することを示している。
結果を図５Ａに示す。図５Ａは、試験濃度で、ｖ１０９２が総細胞の３１％を架橋でき、およびｖ８７３が総細胞の２５％を架橋し得たことを示す（下パネル）。上パネルは対照として培地を用いた結果である。実施例３で記載したように、Ｂ細胞およびＴ細胞を架橋するｖ８７３の能力は、ｖ８９１ＢｉＴＥ対照のものに匹敵する。図５Ａは、Ｂ細胞およびＴ細胞を架橋するｖ１０９２の能力がｖ８７３のものに匹敵することをさらに示す。

Claims (75)

  1. 第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
    前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが一本鎖Ｆｖ領域を含み；
    ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ
    前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約７０％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を１０％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  2. 前記第一または第二ポリペプチド構築物が、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン第一定常（ＣＨ１）領域のうちの少なくとも１つを欠いている、請求項１記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  3. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、すべてのＦｃガンマ受容体との機能的に有効な結合を妨げるアミノ酸修飾を含む、変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  4. アミノ酸修飾を含む前記変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジが、補体タンパク質（Ｃ１ｑ複合体）との機能的に有効な結合も妨げる、請求項３記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  5. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合を増強するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  6. 第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
    前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する抗原結合ポリペプチド構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    前記ＣＤ３結合ポリペプチド構築物および前記抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが任意で一本鎖Ｆｖ領域を含み；
    前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が７０％より多い前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を１０％未満含むような純度で形成され；かつ
    前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が１より大きい結合価で前記少なくとも１つのＢ細胞に結合し、かつＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体は同時に前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に関与する、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  7. 第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
    前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドと、無視できるほどの受容体結合を示す立体調節因子構築物とを含む第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ
    前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約７５％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を１０％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  8. 第一重鎖ポリペプチドと、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合するＣＤ３結合ポリペプチド構築物とを含む第一ポリペプチド構築物；
    前記第一重鎖ポリペプチドとは異なる第二重鎖ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物であって、抗原結合ポリペプチド構築物を含まない、第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与し；かつ
    前記第一および第二重鎖ポリペプチドが、前記ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促す少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む変異体免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは少なくともネイティブホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴って形成され、かつ
    前記ヘテロ二量体Ｆｃは、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が発現生成物において安定な哺乳動物細胞から同時発現される場合、前記発現生成物が少なくとも約７５％の前記多重特異性ヘテロ多量体を含み、かつ前記第一または第二ポリペプチド構築物の単量体またはホモ二量体を１０％未満含むような純度で形成される、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  9. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するためのアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離多重変異性ヘテロ多量体。
  10. 前記変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインより多くＦｃガンマＩＩｂ受容体に選択的に結合する、請求項９記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  11. 前記変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインより多くＦｃガンマＩＩＩａおよびＦｃガンマＩＩａ受容体のうちの少なくとも１つに選択的に結合する、請求項９記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  12. 前記変異体ＣＨ３ドメインが、約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  13. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％より高い純度で形成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  14. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９５％以上の純度で形成され、Ｔｍが少なくとも約７５℃である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  15. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、少なくとも約９０％の純度で形成され、Ｔｍが約７５℃である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  16. ａ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二輸送体ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；
    ｂ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；
    ｃ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、およびＴ３９４Ｗを含むか；
    ｄ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗを含むか；
    ｅ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｒ、およびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含むか；あるいは
    ｆ． 第一重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｒ、およびＴ３９４Ｗを含み、かつ第二重鎖ポリペプチドの変異体ＣＨ３配列がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  17. 前記ヘテロ二量体Ｆｃがグリコシル化されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  18. 前記ヘテロ二量体Ｆｃがアフコシル化（afucosylated）されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  19. 前記ヘテロ二量体Ｆｃがアグリコシル化（aglycosylated）されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  20. 少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物が、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つの標的抗原結合ドメインを含む、請求項１〜６および９〜１９のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  21. 前記抗体が、軽鎖を欠く重鎖抗体である、請求項２０記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  22. 前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも１つのＣＤ１９結合ドメインを含む、請求項１〜６および９〜２１のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  23. 前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも１つのＣＤ２０結合ドメインを含む、請求項１〜６および９〜２１のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  24. 少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；
    少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    前記第一および第二輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記単量体タンパク質の擬似ネイティブ構造を形成する、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  25. 前記輸送体ポリペプチドが抗体に由来しない、請求項２４記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  26. 各輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体である、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  27. 前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２６記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  28. 少なくとも１つの輸送体ポリペプチドがアロアルブミン誘導体である、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  29. 各輸送体ポリペプチドが異なるアロアルブミンに由来する、請求項２４〜２５、および２８のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  30. 少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体と結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物と融合された第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；
    少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物と融合された、前記第一輸送体ポリペプチドとは異なる第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
    を含む単離多重特異性ヘテロ多量体構築物であって、
    前記第一および第二輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメント化により得られ、各輸送体ポリペプチドがアルブミンのセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、これにより前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブアルブミンを形成し、かつ第一カーゴポリペプチドが第二カーゴポリペプチド中に存在するいかなる結合ドメインも有さない、単離多重特異性ヘテロ多量体構築物。
  31. ＣＤ３発現細胞が活性化され、それによりＢ細胞の死滅を誘導するよう、前記多重特異性ヘテロ多量体構築物が、前記少なくとも１つのＢ細胞および前記少なくとも１つのＣＤ３発現細胞に同時に関与する、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  32. 少なくとも１つのＢ細胞上の標的抗原と結合する前記抗原結合ポリペプチド構築物が、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つの標的抗原結合ドメインを含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  33. 前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも１つのＣＤ１９結合ドメインを含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  34. 前記抗原結合ポリペプチド構築物が、少なくとも１つのＣＤ２０結合ドメインを含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  35. 前記少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３特異的抗体、ナノボディ、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメイン、またはその変異体もしくは誘導体に由来する少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  36. 前記少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインが、修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合に免疫原性を低減させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項３５記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  37. 前記少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインが、修飾を含まない対応するＣＤ３結合ドメインと比較した場合にＴｍにより測定されるその安定性を増大させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  38. 前記ＣＤ３特異的抗体が、軽鎖を欠く重鎖抗体である、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  39. 前記少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物が、非抗体タンパク質足場ドメイン由来の少なくとも１つのＣＤ３結合ドメインを含む、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  40. 前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが、一本鎖Ｆｖポリペプチドをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  41. 前記第一および第二ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つが、一本鎖Ｆａｂポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  42. ＣＤ３発現細胞がＴ細胞である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  43. 十分な親和性でＴ細胞と結合し、Ｔ細胞とＢ細胞が架橋される際にＢ細胞死滅活性を示すようＴ細胞を誘導する十分な能力でＴ細胞を修飾する、請求項４２記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  44. ＣＤ３発現細胞がヒト細胞である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  45. ＣＤ３発現細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  46. 少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチド構築物が、多数の種にまたがるＣＤ３構築物と結合する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  47. 少なくとも１つのＢ細胞が疾患と関連する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  48. 前記疾患が、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である、請求項４７記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  49. 前記癌が、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫のうちの少なくとも１つである、請求項４８記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  50. 少なくとも１つのＢ細胞が、リンパ球系または骨髄系の細胞である自己免疫反応性細胞である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  51. 以下：ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管退縮因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（繊維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＬＧ、ＳＡＳ、ＥＰＨＡ４ ＣＤ６３、ＣＤ３ ＢｓＡｂイムノサイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＲＡＩＬのうちの少なくとも１つに結合する少なくとも１つの結合ドメインをさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  52. 任意で少なくとも１つのリンカーを含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  53. 前記少なくとも１つのリンカーが、約１〜約１００個のアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項５２記載の単離多重特異性ヘテロ多量体。
  54. 請求項１〜５３のいずれか一項に記載の多重特異性ヘテロ多量体を発現するための一式の発現ベクターであって、前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列を含む、一式の発現ベクター。
  55. 安定な哺乳動物細胞で、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の多重特異性ヘテロ多量体を含有する発現生成物の産生方法であって、
    前記第一ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列および前記第二ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列で少なくとも１つの哺乳動物細胞をトランスフェクトし、これにより前記少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列、前記少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列が、予定比率で前記少なくとも１つの哺乳動物細胞にトランスフェクトされて安定な哺乳動物細胞を生成する段階；
    前記安定な哺乳動物細胞を培養して前記多重特異性ヘテロ多量体を含む前記発現生成物を産生する段階
    を包含する、方法。
  56. 少なくとも１つの第一ＤＮＡ配列：少なくとも１つの第二ＤＮＡ配列の前記予定比率が、約１:１である、請求項５５記載の方法。
  57. 前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される、請求項５５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 請求項１〜５３のいずれか一項で定義されるような多重特異性ヘテロ多量体、および適切な賦形剤を含む、薬学的組成物。
  59. 請求項５７記載の薬学的組成物の産生方法であって、
    ａ． 請求項１〜５３のいずれか一項で定義されるようなヘテロ多量体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階；
    ｂ． 培養物から産生ヘテロ多量体を回収する段階;および
    薬学的組成物を生成する段階
    を包含する、方法。
  60. 増殖性疾患、微小残存癌、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウィルス性疾患、アレルギー反応、寄生生物性反応、移植片対宿主疾患または宿主対移植片疾患、あるいは細胞悪性腫瘍のうちの少なくとも１つの防止、処置または改善のための方法であって、
    このような防止、処置または改善を必要とする対象に請求項５８記載の薬学的組成物を投与する段階
    を包含する、方法。
  61. それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、
    有効量の請求項５８記載の薬学的組成物を任意で他の薬学的に活性な分子と組み合わせて含む組成物を哺乳動物に投与する段階
    を包含する、方法。
  62. 前記癌が固形腫瘍である、請求項６１記載の方法。
  63. 前記固形腫瘍が肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である、請求項６２記載の方法。
  64. 前記癌が血液学的癌である、請求項６１記載の方法。
  65. 前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病のうちの１つ以上である、請求項６４記載の方法。
  66. 癌細胞の処置方法であって、
    請求項１〜５３のいずれか一項で提供されるヘテロ多量体を含む組成物を前記細胞に提供する段階
    を包含する、方法。
  67. 前記ヘテロ多量体を別の治療薬と一緒に提供する段階
    をさらに包含する、請求項６６記載の方法。
  68. それを必要とする哺乳動物における、ＣＤ１９溶解性抗体、ＣＤ２０溶解性抗体およびブリナツモマブのうちの少なくとも１つに非応答性である癌の処置方法であって、
    有効量の請求項５８記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する段階
    を包含する、方法。
  69. ブリナツモマブによる処置後に退縮する癌細胞の処置方法であって、
    有効量の請求項５８記載の薬学的組成物を含む組成物を前記癌細胞に提供する段階
    を包含する、方法。
  70. Ｂ細胞の発現により特徴付けられる疾患に罹患している個体の処置方法であって、
    有効量の請求項５８記載の薬学的組成物を含む有効量の組成物を前記個体に提供する段階
    を包含する、方法。
  71. 前記疾患が、抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ２０抗体のうちの少なくとも１つによる処置に応答性でない、請求項７０記載の方法。
  72. それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、
    有効量の請求項５８で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階
    を包含する、方法。
  73. 前記自己免疫症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である、請求項７２記載の方法。
  74. それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、
    請求項１〜５３のいずれか一項で提供されるヘテロ多量体を含む有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与する段階
    を包含する、方法。
  75. 請求項１〜５３のいずれか一項で定義されるようなヘテロ多量体を含むキット、ならびにその使用説明書。
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