JP2015531751A - 選択的対である軽鎖および重鎖を含む免疫グロブリン構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許出願61/674,820(2012年7月23日出願)および米国特許出願61/857,652(2013年7月23日出願)(各記載内容は参照により本明細書中で援用される)の利益を主張する。
本発明の技術分野は、生物学的療法のカスタム開発のための免疫グロブリン構築物の合理的設計である。
諧調により表され、重鎖は、
諧調により表される。異なる鎖の間のジスルフィド結合は、点線で表示される。この重鎖のCH1ドメインは、Fcを生じる第2の重鎖との組み合わせに関与するCH2ドメインおよびCH3ドメインに続いてリンカーに導かれる。この分子は、通常のモノクローナル抗体様IgG1の2つの重鎖間で軸対称となっているのに対し、非対称性の二重特異性抗体の目的は、2つの異なる重鎖および2つの異なる軽鎖の選択的組み合わせに関与する抗体様分子を作成することである。この非対称性二重特異性抗体は、図1Bの別々の鎖のパターンにより表され、第2の重鎖は、
諧調により表され、第2の軽鎖は、
諧調により表される。
[図8B]同上
[図2]定常ドメインポリペプチドに結合する単鎖Fvポリペプチドの設計の図形表示である。この図は、リンカーがVHのC末端およびVLのN末端の間に導入されていることを示している。さらに、第2のリンカーは、CLのC末端、およびCH1ドメインのN末端の間に導入されている。これらのリンカーは、天然のFab様抗原結合を与えるVL−VH幾何学的構造をドメイン間に再構成するように選択される。
[図3]それぞれが定常ドメインポチペプチドに結合した単鎖Fvポリペプチドを含む2つの単量体ポリペプチドを含む、二重特異性免疫グロブリン構築物の図形表示を提供する。
[図4]軽鎖が、重鎖のN末端に融合し、それにより、VL−CL−VH−CH1ドメインを含む単鎖としてFabを発現する単鎖Fabのデザインの図形表示を提供する。VLおよびVHドメインは対となり、CLおよびCH1は対となる。
[図5]FabがVL−CL−VH−CH1ドメインを含む単鎖Fabである単鎖Fabで改変した2つの異なる単鎖Fabセグメントの使用に基づく非対称性二重特異性分子の図形表示を提供する。
[図6A]以下の軽鎖挿入断片(LCI)(6A〜6C)および長いリンカー(LL)形態(6D〜6F)において3つの異なるscFab(4D5、TF、およびNM3E)の発現のSDS−PAGEの結果を示す。
[図6B]同上
[図6C]同上
[図6D]同上
[図6E]同上
[図6F]同上
[図6G]異なるリンカー挿入断片でscFab NM3E2のSDS−PAGEゲルを示す。
[図7]低減条件および非低減条件における各調整物由来のサイズ排除クロマトグラフィーにより単離される単量体単鎖Fab種を示すSDS−PAGEプロファイルを示す。
[図8A]抗原結合(ELISA)を示す。TFに結合するscFab(D3H44のLLおよびLCL型、v665および673)、および対照Fab(v696)。HER2に結合するscFab(4D5のLLおよびLCL型、v654および656)、および対照Fab(v695)。
[図8B]同上
[図9A]異なる変異体にて実施される示差走査熱量測定(DSC)を示す。すべてのDSCの実験は、GEまたはMicroCal VP熱量側的器具を使用して実施した。
[図9B]同上
[図9C]同上
[図9D]同上
[図9E]同上
[図10]単鎖Fab形態のベンチトップ安定性アッセイを示す。左図:第1日目:中央図:第3日目、右図:第7日目。結果から、すべての単鎖Fab試料は、週単位の試験の間、使用される相対希釈濃度で、再多量体化しないことが示される。
[図11]単量体二価scMab(ヘテロダイマーFc)の発現を示す。
[図12]scMabのベンチトップ安定性を例示する、変異体のSDS−PAGE分析を示す。
[図12B]同上
[図12C]同上
[図13]CHO細胞株中の二価二重特異性scMab(ヘテロダイマーFc)の発現および精製を示す。
[図14A]二重特異性scMab(LL/LL)のSECプロファイルおよびSPRサンドイッチアッセイを示す。
[図14B]同上
[図14C]同上
[図14D]同上
[図15A]二重特異性scMab(LCI/LCI)のSECプロファイルおよびSPRサンドイッチアッセイを示す。
[図15B]同上
[図15C]同上
[図16A〜16C]二重特異性scMab(LCI/LCI:1358;LCI/LL:1359)のSECおよび標的結合のプロファイルを示す。
[図16B]同上
[図16C]同上
[図17]スケールアップおよび精製後のD3H44および4D5 scFabのSDS−PAGE分析を示す。
[図18]CD3/CD19、二価二重特異性ScMabのSDS−PAGE発現分析を示す。A、B、およびCは、発現に使用した鎖Bに対する鎖Aの比率を表す。比率A=鎖A/鎖B=1:1、A/B=50%/50%であり、比率B=鎖A/鎖B=2:1、A/B=66%、34%であり、比率C=鎖A/鎖B=1:2、A/B=34%/66%である。
[図19]軽鎖挿入断片形態の分子モデルである。VLおよびVLドメイン、ならびにCLおよびCH1ドメインと結合する多様な長さのリンカーを導入することができる。重鎖(...VSSASTKG)の本来の肘型配列に位置するペプチド結合の位置の1つに切断を導入して、軽鎖挿入断片形態を得るために必要とされる配列トポロジーを可能とすることができる。一部の実施形態では、少数の残基が、この肘型領域の切断部位から除去されてもよい。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.;2nd edition(December 1993参照)。
「機能的活性を有するポリペプチド」は、完全長/天然タンパク質に関連する1つ以上の知られている機能的活性を示すことのできるポリペプチドを指す。このような機能的活性は、限定するものではないが、生物学的活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体に結合(または結合するポリペプチドと競合する)性質)、本明細書に記載されるポリペプチドと多量体を形成する性質、およびポリペプチドの受容体またはリガンドと結合する性質が挙げられる。ある実施形態では、機能的活性は、対となるタンパク質の発現および安定性を改善する性質を含む。
一態様では、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、開示される1つ以上の疾患、障害、または症状を処置するために、この構築物、またはそのフラグメントもしくは変異体を患者に投与することを含む抗体系療法を目的とする。本明細書に記載される治療上化合物は、限定するものではないが、本明細書に記載される免疫グロブリン、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物をコードする核酸を含む。
特定の一実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療として、タンパク質の異所性発現および/または活性と関連する疾患または障害を処置し、抑制し、または防止するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を被験体に投与することにより実施される療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療的効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を産生する。当該技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかが用いられ得る。
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物または薬学的組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療的または予防的活性に関して、in vitroで、次いでin vivoで試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのin vitroアッセイは、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の作用を包含する。細胞株および/または組織試料に及ぼす化合物または組成物の作用は、当業者に既知の技法、例えばロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを利用して決定され得る。本発明に従って、具体的な一化合物の投与が必要か否かを決定するために用いられ得るin vitroアッセイはin vitro細胞培養アッセイを包含し、アッセイでは患者組織試料が培養中で増殖され、免疫グロブリン構築物に曝露されるか、またはそうでなければ免疫グロブリン構築物を投与され、かつ組織試料に及ぼすこのような免疫グロブリン構築物の作用が観察される。
有効量の本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物または薬学的組成物の被験体への投与による処置、抑制および予防の方法が提供される。一実施形態では、免疫グロブリン構築物は、実質的に精製される(例えば、その作用を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。ある実施形態では、被験体は、動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等(これらに限定されない)であり、ある実施形態では、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物を発現する少なくとも1つの発現ベクターを含む組成物であって、この免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、組成物が提供される。
単鎖形態のリンカーペプチド結合ドメインは、タンパク質分解性の安定性、立体構造の安定性、再フォールディングの動力学、多量体化の程度、および抗原親和性などの設計タンパク質の特性に影響を与えることができる。本明細書に記載される長いリンカーの設計は、表1に提示される重鎖ドメインに結合するscFabおよびscFvsの上でいくつかのリンカーの長さおよび組成物を試験することにより同定した。GGGS配列が一般的に使用され、変質した水力学的特性を提供するためにリンカーに電荷を導入することができ、これらのリンカーの一部は、らせん二次構造を形成する性向を有する配列を含む。らせん構造を好ましく形成するポリペプチド配列は当業者に公知である(Marqusee,S. and Baldwin,R.L. (1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84, 8898-8902)。これらのポリペプチドは、概して、ポリペプチド配列のiおよび(i+4)th位にお互いに好ましく相互作用する残基を有する。本明細書に記載される構築物は、単鎖形態のFab分子の設計および作成に、このようならせんを形成するポチペプチドの使用が提供されるという、唯一かつ予測し得ない利点を表している。長いリンカー形態のscFabでは、長いリンカーは、CLドメインおよびVHドメインに結合する。表1は、使用されるリンカーを示す。
表1:使用されるリンカー
表2:軽鎖挿入断片設計に使用したリンカー。一部の実施形態では、N末端および/またはC末端の他の残基は、これらのリンカーの残基を補足するために導入されてもよい。
抗体D3H44の配列は、PDBの1JPS構造から抽出した(ヒト化D3H44Fabを有する複合体中の組織因子)。同様に、抗体4D5の配列は、1N8Z構造(HER2およびハーセプチンFabの細胞外領域の複合体)から取得した。NM3E2(抗CD16)scFvの配列を、文献から取得した[Isolation and characterization of an anti−CD16 single−chain Fv fragment and construction of an anti−HER2/neu/anti−CD16 bispecific scFv that triggers CD16−dependent tumor cytolysis. McCall et al. 1999, Mol Immunol, 36(7):433−445]。単鎖Fabおよび軽鎖挿入断片構造は、上記の表1および2に列挙したリンカーとドメインを結合することによって設計した。これらの構築物を、標準的な組み換えDNA技術を使用して調製した。たとえば、長いリンカーを伴うscFabでは、長いリンカー構築物の特定の設計を表3に示し、LCI構築物の特定の設計を以下の表4に示す。
表3:scFabのリンカー配列および説明
表4:追加のscFabのリンカー配列および説明
GS−15:(GGGGS)3
GS−20:(GGGGS)4
GS−24:(GGGGS)4GGGG
GS−28:(GGGGS)5GGG
GS−30:(GGGGS)6
GST−18:GSTSGSGKPGSGEGSTKG
GST−20:GSTSGSGKPGSGEGSTKGSG
GST−26:GSTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTS
GSE−30:(SGGG)2(SEGGG)4SG
GSE−34:(SGGG)2(SEGGG)4SGGGSG
2mlのHEK293(3つ)において発現を実施した。PEI(1mg/mgの水に溶解したリニアのポリエチレンイミン25kDa、Polysciences、cat# 23966)およびPEI/DNAの比率が2.5:1を1μgDNA/ml細胞で、指数関数増殖期(1,500,000〜2,000,000細胞/ml)に細胞をトランスフェクトした。サケの精子のDNA(70%)を添加して100μgのDNAを得た。PEIを総トランスフェクション量が1/20となるように、トランスフェクション媒体と混合させた。PEI/DNA混合物をボルテックスで混合し、室温で3分インキュベートした。トランスフェクション媒体(室温または37℃で事前に加熱)は、細胞を維持するために使用される媒体と同一である(4mL−グルタミン、0.1%のプルロニックF68および0.025mg/mlG418で懸濁したF17培地)。発現を、還元または非還元条件で、煮沸することなく、MOP緩衝液を使用して、SDS−PAGE4〜12%により評価した。
試料を、500mlのHEK293細胞でスケールアップした。上清中の発現タンパクを125mlまで濃縮し、1ml/分の流速でKappaSelectアフィニティーカラムに充填した。10CVのPBS緩衝液で平衡化および洗浄を行い、pH3.0での0.1Mグリシンを用いてタンパク質の溶出を行った。プール分画および脱塩を、エコパックカラム上で実施し、タンパク質をPBSに貯蔵した。
表5:変異収率、ポストアフィニティ精製の概要
以下の製造業社の指示にしたがい、Superdex S200(16/60)を使用する、標準的なプロトコルによりSECにより変異体を精製した。ランニングバッファーはPBSであった。精製したタンパク質を、SDS−PAGEによりアッセイした。SDS−PAGEゲルの結果を図7に示す。結果を以下の表6にまとめる。
表6:SEC精製の概要
SPRおよびELISA系抗原結合アッセイを、変異体が標的抗原に結合できることを示すSEC精製変異体に関して実施した。SPRでは、scFAbは、抗hlgGで飽和させたチップで補足し、リガンド(Her2またはTF)を、300nMでチップの上を通過させた。ELISAアッセイでは、0.5μg/mlのHer2または10μg/ml〜0.156μg/mlのTFを、PBSを含むアッセイプレート上でプレーティングした。単鎖Fab変異体を、400ng/ml〜6.25ng/mlに段階希釈した。1:5000、1:10,000、および1:20,000の希釈で、特異的なヤギ(Fab′)2抗ヒト(Fab′)2フラグメントを使用して検出を実施した。図8A〜8Bは、変異体654、658、695、および705(図8A)、ならびに変異体685、673、696、および707(図8B)でのELIS系抗原結合アッセイの結果を示す。以下の表7は、SPRを使用して取得した結合データを示す。
表7:SPRによるscFab変異体の結合データ
SECの精製変異体に関して、示差走査熱量計(DSC)を実施し、分子の熱力学的安定性を評価した(図9A〜E)。DSC実験は、GEまたはMicroCal VP−キャピラリー計器を用いて実施した。タンパク質をPBS(pH7.4)に緩衝液交換し、0.3〜0.7mg/mLに希釈して0.137mLで試料セル中に充填し、1℃/分の走査速度にて20℃〜100℃で測定した。データを、Originソフトウェア(GE Healthcare)を用いて分析して、PBS緩衝液バックグラウンドを差し引いた。
表8:scFab変異体のDSC結果
ベンチトップ安定性試験では、分析下での各タンパク質変異体の試料を採取することと、室温(20℃)で週単位の長期間にわたり崩壊および/またはオリゴマー化をモニタリングすることとが行われる。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびUPLCの前に、ウェルあたり2.5 gのタンパク質を充填して、還元型および非還元型SDS−PAGEを使用して評価を実施した。タンパク質濃縮物を、A280ナノドロップにより決定した。各タンパク質試料は、単量体画分に対応するサイズ排除精製タンパク質からなる。実験の開始時(0時間)に採取した最初の試料を用いて、タンパク質を室温でバイアル中に保存した(ベンチトップ)。その後試料を、24時間後、3日後、および7日後に採取した。各試料を、クマシーブルーSDS緩衝液で変性させ、最終的なSDS−PAGE評価まで−80℃で保存した。
表9:ベンチトップ安定性結果の概要
表10:SPR結合データ。新鮮なタンパク質および室温で1週間保存した後のタンパク質に関するデータを取得する。保存した試料は、Her2に結合する標的および組織因子抗原を保持する。
表11に記載する二価単一特異性scMabを構築した。二価単一特異性scMabを、標準的な組み換えDNAクローニング法を使用し、実施例2に記載したscFab設計を使用して構築した。手短に、二価scMabの各ポリペプチドを、野生型IgG1リンカーを介して抗体のFc領域をコードする核酸に関連するscFab(長いリンカーまたはLCI設計)をコードする核酸を融合することにより作成した。Fc領域は、ヘテロダイマー抗体分子の形成を可能にするCH3ドメイン上で、ハーバー(harbor)変異を使用した。(すなわち鎖Aは、L351Y_F405A_Y407変異を有し、かつ鎖Bは、T366L_K392M_T394W変異を有する。)2mlのHEK293またはCHOにおいて発現を実施した。PEI(1mg/mlの水に溶解したポリエチレンイミン(25kda、リニア)、Polysciences、cat# 23966)および2.5:1のPEI/DNAの比率での1μgのDNA/ml細胞で、細胞を指数関数増殖期(1,500,000〜2,000,000細胞/ml)に細胞をトランスフェクトした。サケの精子のDNA(70%)を、100μgDNAを完成させるために添加した。総トランスフェクションの1/20容量でトランスフェクション媒体にPEIを混合した。PEI/DNA混合物をボルテックスし、3分室温でインキュベートした。トランスフェクション媒体(室温または37℃で事前に加温)は、細胞の維持のために使用される媒体(4ml−グルタミン、0.1%プルロニックF68および0.025mg/mlG418)と同一である。
表11
ベンチトップ安定性試験(3回繰り返す)では、分析下で各タンパク質変異体の試料を採取することと、異なる温度で3日の保存課程にわたる崩壊および/オリゴマー化、ならびに−20℃で保存したタンパク質に対する比較物をモニタリングすることとが行われた。還元および非還元SDS−PAGEを使用して、ウェルあたり2.5 gのタンパク質を充填する評価を行った。A280ナノドロップによりタンパク質濃度を判定した。実験の開始時(0時間)に採取した初期の試料を用いて、タンパク質を目的の温度でバイアル中に保存した。その後の試料を、3日後に採取した。各試料を、クマシーブルー緩衝液中で変性させ、最終的なSDS−PAGE評価まで−80℃で保存した。
表12:scMabのベンチ安定性試験の概要
表13に記載される二重特異性Her2(トラスツズマブ)/TF(D3H44)scMabを以下のように構築した。二重特異性scMab分子を作成するために使用される手法は、実施例5に記載されるように設計した重鎖を組み合わせる(すなわち、ヘテロダイマーAb分子の形成を可能にするCH3ドメイン上の変異を許容する)ことであった(すなわち、鎖Aは、L351Y_F405A_Y407V変異を有し、鎖Bは、T366L_K392M_T394W変異を有する)ことであった。これらの二価scMabの重鎖上のCH3ドメイン中の変異は、二重特異性scMabの複数の組み合わせにより、2つの異なる抗原への結合を保持するのみだけでなく、同一または異なるリンカー種(同一の長いリンカーまたはLCI骨格内の短いまたは長いリンカー)および、同一または異なる骨格(すなわち長いリンカー対LCI)を宿すFab領域を有する。二重特異性scMabの以下の群を構築した:同一のリンカーおよび同一の骨格を有する二重特異性分子(すなわちv1353および1357);同一の骨格であるが異なるリンカー(v1352、1354、1355、1358);異なる骨格、異なるリンカー(v1359、1356)。実施例3に記載される50mlのCHO培養物中で発現を実施した。
表13:
表14 scMabの精製の概要
HER2を、GLMセンサーチップ上で固定化し、scMabを最初に補足した。TF結合を、固定化したHER2−scMab上でTFを補足することにより判定した。二量体二重特異性scMabは、HER2およびTFの両方と結合する。
IgG補足型scMabにわたるTF抗原の流れ、IgG捕捉型scMabにわたるHer2抗原の流れ、および固定化したscMabにわたるHer2抗原の流れの方向)で実施したSPR測定の平均である。
表16:4D5およびD3H44Mab(LL/LL、LCI/LCI、およびLL/LCI形態)との二重特異性scMabの二重特異性結合は、標的抗原Herおよび組織因子に対して観察される。両方のアーム上で長いリンカーを備えた変異体scMab1352および1357は、TFを結合できない。
二価二重特異性scMabを、CD3およびCD19に結合するよう設計し、かつ、これらの構築物の記載が表17に見いだされる。これらの構築物を、標準的な組み換えDNA法を使用して調製した。この構築物を、VH、VL、CH、およびCL要素に抗―CD3テプリズマブおよび抗―CD19MOR208のFabの配列を分解することにより調製した。LCI構築物では、第1のリンカーにより軽鎖(VLおよびCLにより構成される)にFabのCHを結合させ、第2のリンカーにより、FabのCHに軽鎖を結合した。その後、Fabを、鎖A上の変異T350V_L351Y_F405A_Y407V、鎖B上の変異T350V_T366L_K392L_T394Wを有するIGG1ヒンジ+Fcに結合した。LL構築物では、完全軽鎖(VLおよびCLにより構成される)を、リンカーで、鎖A上の変異T350V_L351Y_F405A_Y407V、および鎖B上のT350V_T366L_K392L_T394Wを有するIGG1ヒンジ+Fcに結合したFabの重鎖に結合した。変異体1840〜1847に使用した抗CD3(テプリズマブ)および抗CD19(MOR208)のFabの配列を文献から取得した(Tabsデータベース、Craic Computing LLCにより提供されるサービス)。1853で使用されるCD19結合scFvは、ブリナツモマブ(blinatumomab)の配列由来であった。変異1861のCD3結合scFV配列はムロノマブ(muronomab)由来であり、変異体1862配列は、ブリナツモマブ(blinatumomab)由来であった。これらの変異体は、実施例3にも記載される通り発現かつ精製した。これらの変異体の発現を示す例示的なSDS−PAGEゲルを、図18に示す。
表17:結合データの概要
※変異体名は、以下に記載のように作成される。a)scMAB_LCI_CD3×CD19_GS20−GS24_GS20−GS24-単鎖scMab、LCI設計、鎖A上のVH−VL間のGS20リンカーおよびCL−CH間のGS24リンカーを備えたCD3Fab。鎖B上のVH−VL間のGS20リンカーおよびCL−CH間のGS24リンカーを備えたCD19Fab、ならびにb)scMAB_LL_CD3xCD19_HH41_HH41-単鎖Mab、長いリンカー設計、鎖Aの軽鎖および重鎖間のHH41リンカーを備えたCD3Fab、ならびに鎖Bの軽鎖および重鎖間のHH41リンカーを備えたCD19Fab。
表18:対照の結合データ
表16および17におけるELISAの結果の説明。
+++:OD450>2.0 1/60希釈
++:OD450(1.0〜2.0) 1/60希釈
+:OD450<1.0 1/60希釈
+/−:OD450(0.100未満) 1/60希釈、陽性対照より高い(陰性対照より高い)
−:OD450=または<陰性対照1041
以下の表に、これらに列挙される変異体をアミノ酸の配列番号を示す。すべてのアミノ酸および配列は、EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGを含み(これらは、クローニングに使用した制限部位中で産生する単一ペプチド配列および残基を含む)、ストップコドンはアスタリスクで表される。
配列番号1
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT*GS
配列番号2
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT*GS
配列番号3
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT*GS
配列番号4
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号5
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号6
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号7
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号8
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号9
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号10
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号11
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号12
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号13
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号14
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQAPGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPGKAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT*GS
配列番号15
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号16
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号17
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
配列番号18
EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKCLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGCGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*GS
Claims (57)
- 免疫グロブリン構築物であって、
免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド(VH)と、
免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド(VL)と、
免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド(CL)と、
免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポチペプチド(CH1)と
を含む単鎖Fab領域(scFab)を含み、
前記VHと前記VLとが、第1のリンカーにより結合され、単鎖Fv構築物(scFv)を形成する、
免疫グロブリン構築物。 - 前記CLと前記CH1が、第2のリンカーにより結合される、請求項1記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記単鎖Fab領域が、VH−L1−VL−CL−L2−CH1を含む配列を有し、L1およびL2が第1のリンカーおよび第2のリンカーである、請求項1または2記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記単鎖Fab領域が、VH−L1−VL−L3−CL−L2−CH1を含む配列を有し、L1、L2、およびL3が、リンカーである、請求項1または2記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記単鎖Fab領域が、VL−L4−VH−CH1−L5−CLを含む配列を有し、L4およびL5がリンカーである、請求項1または2記載の免疫グロブリン構築物。
- 各リンカーが、約1〜約100のアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーが、Gly(G)、Ser(S)、およびGlu(E)から選択されるアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項6記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーは、式(Gly−Gly−Gly−Ser)nのポリペプチドから構成され、式中、nが4〜10の整数である、請求項7記載の免疫グロブリン構築物。
- 免疫グロブリン構築物であって、
免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド(VH)と、
免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド(VL)と、
免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド(CL)と、
免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポチペプチド(CH1)と
を含み、
前記VHと前記CLとが、リンカーポリペプチドにより結合され、前記リンカーポリペプチドが、らせん構造を形成する性向を示す、
免疫グロブリン構築物。 - 前記単鎖Fabポリペプチドが、VL−CL−L8−VH−CH1を含む配列を有し、L8が、らせん構造を形成する性向を有するポリペプチドである、請求項9記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーポリペプチドが、αへリックス、ポリプロリンIへリックス、ポリプロリンIIへリックス、および310へリックスの少なくとも1つを形成する、請求項9または10記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーが、約1〜約20巻きのらせんを形成する、請求項11記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーが、らせんを安定化させる相互作用を形成する少なくとも一対のアミノ酸を含む、請求項9〜12のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記らせんを安定化させる相互作用が、電荷間相互作用、カチオン−π相互作用、疎水性相互作用、およびサイズコンプリメンタリィ相互作用(size complimentary interaction)の内の少なくとも1つである、請求項13記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーポリペプチドが、Gly(G)、Ser(S)、Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Val(V)、およびIle(I)から選択されるアミノ酸を含む、請求項9〜14のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記リンカーが、少なくとも1つの(Asp−Asp−Ala−Lys−Lys)nモチーフを含むアミノ酸配列を有し、式中、nが1〜10の整数である、、請求項15記載の免疫グロブリン構築物。
- 免疫グロブリン構築物であって、
請求項1〜16のいずれか1項記載の第1のscFabと、第1のCH3領域を含む第1の重鎖ポリペプチドとを含む第1のポリペプチド構築物と、
第2のCH3領域を含む第2の重鎖ポリペプチドを含む、第2のポリペプチド構築物と
を含み、
前記第1の重鎖ポリペプチドおよび前記第2の重鎖ポリペプチドの少なくとも1つが、ヘテロダイマーの形成を促進する変異型CH3領域を任意に含む、
免疫グロブリン構築物。 - 前記第1のポリペプチド構築物および前記第2のポリペプチド構築物が、抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、請求項17記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記抗原結合ポリペプチド構築物が、scFvまたはscFabの少なくとも1つである、請求項18記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記scFabが、請求項1〜16のいずれか1項記載のscFabである、請求項19記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記第1の重鎖ポリペプチドおよび前記第2の重鎖ポリペプチドが、ヘテロダイマーFcを形成する、請求項16〜20のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記ヘテロダイマーFcが、少なくとも1つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンのCH3ドメインを含む、請求項21記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸変異が、天然のホモダイマーFcと比較可能な安定性を有する前記ヘテロダイマーFcの形成を促進する、請求項22記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記変異型CH3ドメインが、約73℃以上の融解温度(Tm)を有する、請求項22または23記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記ヘテロダイマーFcが、少なくとも約70%の純度で形成される、請求項22または23記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記ヘテロダイマーFcが、少なくとも約70%の純度で形成され、前記Tmが少なくとも約73℃である、請求項22〜25のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記ヘテロダイマーFcが、少なくとも約75%の純度で形成され、前記Tmが約75℃である、請求項22〜25のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記第1の重鎖ポリペプチドおよび前記第2の重鎖ポリペプチドの少なくとも1つが、前記Fcガンマ受容体の少なくとも1つへの選択的結合を促進するためのアミノ酸変異を含む変異型CH2ドメインをさらに含む、請求項17〜27のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記第1の重鎖ポリペプチドおよび前記第2の重鎖ポリペプチドの少なくとも1つが、前記Fcガンマ受容体の少なくとも1つへの機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異型CH2ドメインまたはヒンジを含む、請求項17〜28のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記Fc領域がグリコシル化される、請求項17〜29のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記Fc領域がアグリコシル化(aglycosylated)される、請求項17〜30のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記免疫グロブリン構築物が、多重特異性免疫グロブリン構築物である、請求項17〜31のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記免疫グロブリン構築物が、二重特異性である、請求項32記載の免疫グロブリン構築物。
- 免疫グロブリン構築物であって、
第1の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第1の単鎖Fvポリペプチドを含む、第1の単量体ポリぺプチドと、
前記第1のFvポリペプチドと異なり、前記第1の定常ドメインポリペプチドと異なる第2の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第2の単鎖Fvポリペプチドを含む、第2の単量体ポチペプチドと
を含み、
前記定常ドメインポリペプチドのそれぞれが、CL領域、CH1領域、およびCH3領域、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも1つを含み、
前記CL領域と前記CH1領域とが、リンカーにより結合され、前記第1の定常ドメインポリペプチドと前記第2の定常ドメインポリペプチドとが、Fc領域を形成する、
免疫グロブリン構築物。 - 前記構築物が、CH2ドメインを一切含まない、請求項34記載の免疫グロブリン構築物。
- 免疫グロブリン構築物であって、
第1の定常ドメインポリペプチドと融合する第1のscFabポリペプチドを含む第1の単量体ポチペプチドと、
前記第1のFabポリペプチドと異なり、第2の定常ドメインポリペプチドと融合する第2のscFabポリペプチドを含む、第2の単量体ポチペプチドと
を含み、
前記第1のscFabポリペプチドおよび前記第2のscFabポリペプチドの少なくとも1つが、らせん構造を形成する性向を備えたリンカーポリペプチドを含み、
前記第1の定常ドメインポリペプチドおよび前記第2の定常ドメインポリペプチドが、天然のホモダイマーFcと比較可能な安定性を有する前記ヘテロダイマーの形成を促進する、少なくとも1つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンCH3領域を含む、ヘテロダイマーFc領域を形成する、
免疫グロブリン構築物。 - 前記構築物が、抗原を発現する少なくとも1つの細胞と結合でき、前記細胞が、白血球、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮下細胞、乳房、胃、子宮、神経、筋肉、分泌細胞および生殖細胞などの免疫細胞を含む一覧から選択される、請求項17〜36のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記構築物が、抗原を発現する少なくとも1つの細胞と結合でき、前記細胞が、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞を含む一覧から選択される、請求項17〜36のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記T細胞がヒト細胞である、請求項38記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記T細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項38記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記少なくとも1つの細胞が疾患と関連する、請求項38記載の単離型免疫グロブリン構築物。
- 前記疾患が、骨髄腫、芽腫、乳頭腫、腺腫、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である、請求項41記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記癌が、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫の少なくとも1つである、請求項42記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記少なくとも1つの細胞が、自己免疫応答性細胞である、請求項38記載の免疫グロブリン構築物。
- 前記免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項1〜44のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物を発現する少なくとも1つのベクターを含む、組成物。
- 安定した哺乳動物細胞中で、請求項1〜44のいずれか1項記載の免疫グロブリン構築物を含む発現生成物を生成する方法であって、前記方法は、
安定した哺乳動物細胞を産生するために前記免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも1つのDNA配列で少なくとも1つの哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、
前記免疫グロブリン構築物を含む前記発現生成物を産生する前記安定した哺乳動物細胞を培養することと
を含む、方法。 - 前記哺乳動物細胞が、VERO、HeLa、HEK、NS0、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、W138、BHK、COS−7、Caco−2およびMDCK細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される、請求項46記載の方法。
- 請求項1〜44のいずれか1項に定義される単離型免疫グロブリン構築物、および適切な賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項48記載の薬学的組成物の製造方法であって、
請求項1〜44のいずれか1項で定義されるような免疫グロブリン構築物の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、
前記培養物から産生した免疫グロブリン構築物を回収することと、
薬学的組成物を生成することと
を包含する工程。 - それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、有効量の請求項48記載の薬学的組成物を含む組成物を哺乳動物に投与することを包含する方法。
- 前記癌が固形腫瘍である、請求項48記載の方法。
- 前記固形腫瘍が肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの1つ以上である、請求項51記載の方法。
- 前記癌が、B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病のうちの1つ以上である請求項50記載の方法。
- それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、有効量の請求項48で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法。
- 前記自己免疫症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および1型糖尿病のうちの1つ以上である、請求項54記載の方法。
- それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、請求項48で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法。
- 請求項1〜44のいずれか1項で定義されるような免疫グロブリン構築物を含むキット、ならびにその使用説明書。
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