JP2020534002A - キメラポリペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規ペプチド（例えば、リンカー）及び該リンカーを含むポリペプチド組成物（例えば、融合タンパク質）、並びに該ポリペプチド組成物を使用する方法を提供する。ペプチド（例えば、リンカー）は、タグとして、及び融合タンパク質（例えば、抗原結合分子、ｓｃＦｖ）の操作に有用である。本明細書に記載されるポリペプチドリンカーは、連結されたペプチドの柔軟性を促進し、適切なフォールディング、立体配座、及び免疫原性の低下を可能にする。【選択図】なし

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２，２２３号に対する優先権を主張するものであり、この内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１８年９月２０日付けで作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＫＰＩ−００５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、９５３１バイトのサイズである。

本開示は、新規ペプチド及びかかるペプチドを含むポリペプチド組成物（例えば、リンカー、キメラポリペプチド、抗原結合分子）、並びにそれらを使用及び作製する方法に関する。

抗体を含む抗原結合分子は、免疫療法、並びにバイオセンサー、アフィニティークロマトグラフィー及びイムノアッセイ等の固相ベースの用途に使用される。これらの抗体及び抗原結合分子は、それらの標的を特異的に結合する能力のために有用性を得る。

融合タンパク質はリンカー配列を必要とすることがあり、リンカー配列はバイオテクノロジー及び生物療法用途に用いられる場合にペプチドベースであることが多く、様々な科学的に関連した用途に役立つ可能性がある。例えば、リンカーは、より大きな分子に対して所望の構造特性及び／又は機能特性を与えるためにスペーサー部分として使用することができる。別の例では、リンカーは、より大きな分子に対して構造特性又は機能特性を殆ど又は全く与えることができないが、単により大きな分子を独自に特定する特徴的な特徴部（例えば、「マーカー」又は「バイオマーカー」又は「タグ」）として使用することができる。更に別の例では、リンカーは、ペプチド配列を含むより大きな分子に対する抗体の結合部位として働くことができる認識可能な特徴部を与えるために使用することができる。

本発明は、とりわけ、融合タンパク質の適切な発現、フォールディング、同定及び活性を可能にする新規ペプチド配列を提供する。本明細書に記載される新規ペプチドは、個々のペプチドドメインの柔軟性を促進する融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）内のドメインを接続するために使用され得る。ｓｃＦｖは、ほとんどのＣＡＲコンストラクトの結合ドメインを含む。ｓｃＦｖは、ＩｇＧ可変軽鎖及び重鎖と、これら２つのドメインを接続する柔軟なペプチド（例えば、リンカー）とを含む。リンカーは、ドメインを単一のタンパク質コンストラクトに接続するのに十分な長さでなくてはならない。さらに、リンカー又はタグコンストラクトが免疫原性の潜在的な原因にならないことが望ましい。

一般的に使用されるリンカーは、グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン（Ｇ４Ｓ）（配列番号３２）のリピートを含み、それらの固有の柔軟性及び側鎖の単純性により、治療用途において免疫原性が低くなる可能性がある。１８残基のＷｈｉｔｌｏｗリンカーＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）は、Whitlow et al.によって１９９３年に最初に記載された。本明細書に記載されるペプチドはまた、ペプチドタグとしても使用され得る。幾つかの実施の形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー）に融合されたポリペプチドを含む。

コンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺを含む本明細書に記載される新規キメラポリペプチドは、治療的処置に有用な融合タンパク質への組み込みに適した望ましい属性（例えば、柔軟性及び低減された免疫原性）を併せ持つ。

１つの態様においては、本発明は、６個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸である。一実施の形態では、本発明は、コンセンサス配列がＫＰＧＳＧＥ（配列番号４）であるペプチドを提供する。別の実施の形態では、コンセンサス配列はＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）又はＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号６）である。

１つの態様においては、本発明は、６個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、前記ペプチドがＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）、又はＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない。

１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンであり、前記ペプチドがＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）、又はＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない。

幾つかの実施の形態では、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂはリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施の形態では、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘは独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂはリジン（Ｋ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施の形態では、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むペプチドを提供し、ここで、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施の形態では、Ｚは、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択される負電荷アミノ酸である。幾つかの実施の形態では、Ｚはグルタミン酸（Ｅ）である。

幾つかの実施の形態では、本発明は、コンセンサス配列がＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）又はＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号６）であるペプチドを提供する。幾つかの実施の形態では、コンセンサス配列は、ＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）である。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、コンセンサス配列ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧ（配列番号３１）を含む。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、コンセンサス配列の１つ以上のリピートを含む。幾つかの実施の形態では、リピートは連続している。幾つかの実施の形態では、ペプチドリピートは、１個〜４個のアミノ酸によって隔てられている。幾つかの実施の形態では、ペプチドはｘｘｘＧＫＰＧＳＧＥｘｘｘＧＫＰＧＳＧＥｘｘｘ（配列番号３）であり、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）である。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）、又はＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない。或る特定の実施の形態では、ペプチドはＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）ではない。或る特定の実施の形態では、リンカーはＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）ではない。或る特定の実施の形態では、ペプチドはＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）ではない。或る特定の実施の形態では、ペプチドはＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、６個〜２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、１０個〜２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、１４個〜１９個のアミノ酸を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、１５個〜１７個のアミノ酸を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、１５個又は１６個のアミノ酸を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、１６個のアミノ酸を含む。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む。

１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列とを含むペプチドを提供する。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも６個のアミノ酸が同一である（いずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも６個の同一アミノ酸を含む）アミノ酸配列とを含むペプチドを提供する。

幾つかの実施の形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも７個、少なくとも８個、又は少なくとも９個のアミノ酸が同一である。

幾つかの実施の形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む。

１つの態様においては、本発明は、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、本明細書に記載されるペプチドリンカーとを含む融合タンパク質を提供する。幾つかの態様においては、融合タンパク質は抗原結合分子である。幾つかの実施の形態では、抗原結合分子はｓｃＦｖである。幾つかの実施の形態では、第１のポリペプチドは軽鎖可変ドメインであり、第２のポリペプチドは重鎖可変ドメインである。幾つかの実施の形態では、融合タンパク質はキメラ抗原受容体である。

１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー、タグ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施の形態では、本発明は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。幾つかの実施の形態では、本発明は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え細胞を提供する。幾つかの実施の形態では、組み換え細胞は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。

本明細書に記載される任意の態様又は実施の形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施の形態と組み合わせられ得る。本発明はその詳細な説明と併せて記載されているが、上述の記載は解説を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれる。

本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される米国特許、及び公開又は未公開の米国特許出願はいずれも、引用することにより本発明の一部をなす。本明細書で引用される公開された外国の特許及び特許出願はいずれも引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書で引用される他の公開された参照文献、辞書、文書、原稿及び科学文献はいずれも、引用することにより本明細書の一部をなす。

本発明の他の特徴及び利点は、図面、及び実施例を含む以下の詳細な説明、並びに特許請求の範囲から明らかとなる。

添付の図面と併せて考慮された場合、上記及び更なる特徴は以下の詳細な説明からより明確に理解される。しかしながら、図面は限定ではなく、解説の目的であるにすぎない。

例示的なペプチド（例えば、リンカー）配列のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。 それぞれ配列番号１、配列番号２１〜配列番号２５、配列番号１及び配列番号２６〜配列番号３０を含むペプチドのエピトープマッピングＥＬＩＳＡ実験の結果の棒グラフを示す図である。 それぞれ配列番号３２、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号１７を含むポリペプチドリンカーの抗体結合プロファイルの結果の棒グラフを示す図である。 ペプチドＫＬ２（配列番号１０）、ＫＬ３（配列番号１１）、ＫＬ４（配列番号７）、ＫＬ５（配列番号１２）、ＫＬ６（配列番号８）、及びＧ４Ｓ２（配列番号１８）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示する細胞を用いて行ったフローサイトメトリー実験の結果を示す一連のプロットである。

定義
本発明がより容易に理解されるように、まず或る特定の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対する更なる定義は、本明細書を通して記載される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、数量を特定していないもの（the singular forms "a," "an" and "the"）は、文脈より別段の明確な指示がない限り複数の指示対象を含む。

具体的に述べられない又は文脈より明らかでない限り、本明細書で使用される「又は」の用語は「又は」と「及び」の両方を含み、それらを包含すると理解される。

本明細書において使用される場合、「及び／又は」の用語は、２つの指定される特徴又は成分の各々ともう一方とを含む、又はもう一方を含まない具体的な開示として理解される。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の句で使用される「及び／又は」の用語は、Ａ及びＢ；Ａ又はＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の句において使用される「及び／又は」の用語は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）の態様の各々を包含することが意図される。

本明細書で使用される「例えば」及び「すなわち」の用語は、限定を意図せずに例として使用されるにすぎず、本明細書において明らかに列挙されるそれらの項目のみを指すものと解釈されるべきではない。

「以上」、「少なくとも」、「それよりも多く」等の用語、例えば「少なくとも１つ」は、限定されないが、示される値よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００以上多い値を含むと理解される。また、任意のより大きな数、又はその間の分数も含まれる。

逆に、「以下」の用語は示される値よりも小さい各値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」は、１００個、９９個、９８個、９７個、９６個、９５個、９４個、９３個、９２個、９１個、９０個、８９個、８８個、８７個、８６個、８５個、８４個、８３個、８２個、８１個、８０個、７９個、７８個、７７個、７６個、７５個、７４個、７３個、７２個、７１個、７０個、６９個、６８個、６７個、６６個、６５個、６４個、６３個、６２個、６１個、６０個、５９個、５８個、５７個、５６個、５５個、５４個、５３個、５２個、５１個、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個及び０個のヌクレオチドを含む。また、任意のより小さな数、又はその間の分数も含まれる。

「複数」、「少なくとも２つ」、「２以上」、「少なくとも第２の」等の用語は、限定されないが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００以上を含むと理解される。また、任意のより大きな数、又はその間の分数も含まれる。

明細書を通して、「含んでいる、含む（comprising）」の文言、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」等の変化形は、示される要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を含むことを含意するが、任意の他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除しないと理解される。本明細書において「含んでいる、含む」の言葉と共に態様が記載される場合はいつでも、「からなる」及び／又は「から本質的になる」の用語で記載される他の類似の態様も提供されると理解される。

具体的に述べられておらず又は文脈より明らかでない限り、本明細書で使用される「約」の用語は、当業者によって決定される特定の値又は組成に対する許容可能な誤差範囲に含まれる値又は組成を指し、その値又は組成がどのように測定され又は決定されるのか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる（comprising essentially of）」は、当該技術分野における１回の実施当たりの１以上の標準偏差の範囲内を意味し得る。「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる」は、最大１０％（すなわち±１０％）の範囲を意味し得る。したがって、「約」は、示される値よりも１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、又は０．００１％大きい又は小さい範囲に含まれると理解され得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇ〜５．５ｍｇの間の任意の量を含み得る。さらに、特に生物学的なシステム又はプロセスに関して、上記用語は、或る値の最大１０倍（an order of magnitude）又は最大５倍を意味する場合がある。特定の値又は組成が本開示で提供される場合、別段の指示がない限り、「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる」の意味は、その特定の値又は組成に対する許容可能な誤差の範囲に含まれるとされる。

本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセンテージの範囲、比率範囲、又は整数の範囲は、別段の指示がない限り、述べられる範囲に含まれる任意の整数、また適切な場合には、その分数（或る整数の１０分の１、及び１００分の１等）の値を含むものと理解される。

本明細書で使用される単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ：Systeme International de Unites）の容認される形態で提示される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press、"The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press、及び"The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Pressは、この開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。

「投与すること、投与する（Administering）」は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれかを使用する、被験体に対する薬剤の物理的な導入を指す。本明細書に開示される製剤に対する例示的な投与経路として、例えば注射又は点滴による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊柱又は他の非経口的な（parenteral：腸管外）投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」の句は、経腸及び局所の投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び点滴、また同様にｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を含む。幾つかの実施形態では、上記製剤は、非経口的ではない経路、例えば経口で投与される。他の非経口的ではない経路として、局所、表皮、又は粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経膣的、直腸、舌下又は局所的なものが挙げられる。また、投与は、例えば１回、複数回、及び／又は１以上の延長された期間に亘って行われ得る。

本明細書で使用されるように、抗原と、第１の結合分子、抗体又はその抗原結合分子との相互作用が、参照結合分子、参照抗体又はその抗原結合分子の抗原と相互作用する能力を遮断する、制限する、阻害する、或いは減少させる場合、抗原結合分子、抗体又はその抗原結合分子は、参照抗体又はその抗原結合分子と「交差競合する」。交差競合は、完全なものであってもよく、例えば、抗原に対する結合分子の結合が、参照結合分子の抗原に結合する能力を完全に遮断するか、又は交差競合は、部分的であってもよく、例えば、抗原に対する結合分子の結合が、参照結合分子の抗原に結合する能力を減少させる。或る特定の実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子と同じ、又はそれと重複するエピトープを結合する。他の実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子とは異なるエピトープを結合する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；固相直接又は間接酵素免疫定量法（ＥＩＡ）；サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552）；及び直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82）を使用して、或る一つの抗原結合分子が他方と競合するかどうかを判断することができる。

「抗原」は、免疫応答を誘発する、又は抗体若しくは抗原結合分子によって結合されることが可能な任意の分子を指す。免疫応答は、抗体産生若しくは特定の免疫適格細胞（immunologically-competent cells）の活性化のいずれか、又はそれらの両方を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役割を果たし得ることを容易に理解する。抗原は内因性に発現され得て、すなわちゲノムＤＮＡによって発現され得るか、又は組み換えによって発現され得る。抗原は、癌細胞等の特定の組織に特異的となり得るか、又は広く発現され得る。さらに、より大きな分子のフラグメントが抗原として作用し得る。一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。

「同種異系」の用語は、一個体に由来する任意の材料を指し、該材料はその後、同種の別の個体に導入される（例えば同種異系Ｔ細胞移植）。

「形質導入」及び「形質導入された」の用語は、外来ＤＮＡがウイルスベクターによって細胞へと導入されるプロセスを指す（Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)を参照されたい）。幾つかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの任意の組み合わせである。

「癌」は、身体における異常な細胞の制御されていない増殖を特徴とする、幅広い各種疾患のグループを指す。制御されていない細胞の分裂及び増殖は、隣接する組織に侵入して、リンパ系又は血流によって身体の離れた部分へと転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「癌」又は「癌組織」は、腫瘍を含む場合がある。本発明の方法によって治療され得る癌の例として、限定されないが、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び他の白血球の悪性腫瘍（leukocyte malignancies）を含む免疫系の癌が挙げられる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ：primary mediastinal large B cell lymphoma）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：diffuse large B cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、形質転換後濾胞性リンパ腫（transformed follicular lymphoma）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ：splenic marginal zone lymphoma）、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性又は急性の白血病、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病（chronic myeloid leukemia）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、幼少期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（spinal axis tumor）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、石綿によって誘導されるものを含む、環境によって誘導される癌、他のＢ細胞悪性腫瘍、及び上記癌の組み合わせに由来する腫瘍の腫瘍サイズを減少するため使用され得る。特定の一実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。特定の癌は、化学療法又は放射線療法に反応性となり得るが、そうでなければその癌は難治性となり得る。難治性癌は、外科的処置に適用できない癌を指し、その癌は最初に化学療法若しくは放射線療法に無反応であるか、又はその癌は経時的に無反応となるいずれかである。

本明細書に使用される「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、転移の数の減少、全体生存期間又は無増悪生存期間の増加、平均余命の増加、又は腫瘍と関係する様々な生理学的症状の改善として提示され得る、生物学的効果を指す。また、抗腫瘍効果は、腫瘍の発生の予防、例えばワクチンを指す場合がある。

本明細書で使用される「サイトカイン」は、特異抗原との接触に反応して１つの細胞によって放出される非抗体タンパク質を指し、ここで、サイトカインは第２の細胞と相互作用して、第２の細胞における反応を媒介する。サイトカインは、細胞によって内因性に発現され得るか、又は被験体に投与され得る。サイトカインは、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び肥満細胞を含む免疫細胞によって放出されて、免疫応答を伝播し得る。サイトカインは、レシピエント細胞において様々な反応を誘導し得る。サイトカインは、ホメオスタシスサイトカイン（homeostatic cytokines）、ケモカイン、炎症誘発性サイトカイン、エフェクター及び急性期タンパク質を含み得る。例えば、インターロイキン（ＩＬ）７及びＩＬ−１５を含むホメオスタシスサイトカインは、免疫細胞の生存及び増殖を促進し、炎症誘発性サイトカインは炎症反応を促進し得る。ホメオスタシスサイトカインの例として、限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５及びインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマが挙げられる。炎症誘発性サイトカインの例として、限定されないが、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７ａ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、可溶性細胞間接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）、可溶性血管接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及び胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）が挙げられる。エフェクターの例として、限定されないが、グランザイムＡ、グランザイムＢ、可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦａｓＬ）及びパーフォリンが挙げられる。急性期タンパク質の例として、限定されないが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）が挙げられる。

「ケモカイン」は細胞走化性又は指向性運動を媒介するサイトカインの一種である。ケモカインの例として、限定されないが、ＩＬ−８、ＩＬ−１６、エオタキシン、エオタキシン−３、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ又はＣＣＬ２２）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１又はＣＣＬ２）、ＭＣＰ−４、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１ａ）、ＭＩＰ−１β（ＭＩＰ−１ｂ）、ガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、並びに胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ又はＣＣＬ１７）が挙げられる。

「治療的有効量」、「有効用量」、「有効量」又は「治療的に有効な投薬量」の治療剤、例えば操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、単独で又は別の治療剤と組み合わせて使用された場合に、疾患の発症から被験体を保護する、又は疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度及び持続期間の増加、若しくは疾患の罹患に起因する機能障害若しくは身体障害の予防によって明示される疾患の退縮を促進する、任意の量である。治療剤の疾患の退縮を促進する能力は、熟練した医師に知られている様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト被験体において、ヒトにおける効能を予測する動物モデル系において、又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによって評価され得る。

本明細書で使用される「リンパ球」の用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ：natural killer）細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞を含む。ＮＫ細胞は、生得免疫系の主な成分を占める細胞傷害性（細胞毒性）リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は腫瘍及びウイルスによって感染された細胞を拒絶する。ＮＫ細胞は、アポトーシス又はプログラム細胞死のプロセスによって作用する。ＮＫ細胞は、細胞を死滅させるために活性化を必要としないことから、「ナチュラルキラー」と名付けられた。Ｔ細胞は、細胞媒介免疫（抗体が関与しない）において主な役割を果たす。そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、他の種類のリンパ球からそれら自体を分化させる。免疫系の特殊化された器官である胸腺は、主としてＴ細胞の成熟を担う。６種類のＴ細胞、すなわち、ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔ−キラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はキラーＴ細胞としても知られる）、メモリーＴ細胞（（ｉ）ナイーブ細胞のようなステムメモリーＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋及びＩＬ−７Ｒα＋であるが、それらは、大量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３及びＬＦＡ−１を発現し、メモリー細胞に特有の多数の機能的な属性を示す）；（ｉｉ）セントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ−セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、ＩＦＮγ又はＩＬ−４ではなくＩＬ−２を分泌する；並びに（ｉｉｉ）エフェクターメモリーＴＥＭ細胞はＬセレクチンもＣＣＲ７も発現しないものの、ＩＦＮγ及びＩＬ−４のようなエフェクターサイトカインを産生する）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、サプレッサーＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）及びガンマデルタＴ細胞が存在する。一方、Ｂ細胞は、液性免疫（抗体が関与する）で最も重要な役割を果たす。Ｂ細胞は抗体及び抗原を作り、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割を発揮し、抗原相互作用による活性化後にメモリーＢ細胞となる。哺乳動物において、未成熟Ｂ細胞は骨髄中で形成される。

用語「遺伝子操作された」、「操作された」又は「改変された」は、限定されるものではないが、コーディング領域若しくは非コーディング領域若しくはそれらの一部を欠失させることによる、又はアンチセンス技術による、又はコーディング領域若しくはそれらの一部を導入しているタンパク質の発現の増加による、遺伝子中の欠損の生成を含む細胞の改変方法を指す。幾つかの実施形態では、改変される細胞は、患者又はドナーのいずれかから取得することができる、幹細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）である。細胞を改変して、細胞のゲノムに組み込まれ得る、外因性コンストラクト、例えば、プレＴＣＲαタンパク質、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等を発現させてもよい。

「免疫応答」は、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性若しくは他の異常な細胞、又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合、正常なヒトの細胞若しくは組織の選択的な標的化、それらへの結合、それらに対する損傷、それらの破壊、及び／又は脊椎動物の身体からのそれらの排除をもたらす、免疫系の細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、及び好中球）及びこれらの細胞のいずれか又は肝臓によって産生される可溶性高分子（Ａｂ、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指す。

「免疫療法」の用語は、免疫応答を誘導する、増強する、抑制する、或いは変更することを含む方法による、疾患に冒された、又は疾患にかかる若しくは疾患の再発を患うリスクがある被験体の治療を指す。免疫療法の例として、限定されないが、Ｔ細胞療法が挙げられる。Ｔ細胞療法は、養子Ｔ細胞療法（adoptive T cell therapy）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）免疫療法、自己細胞治療、操作された自己細胞療法（ｅＡＣＴ（商標））、及び同種異系Ｔ細胞移植を含み得る。しかしながら、当業者は、本明細書に開示されるコンディショニング法（conditioning methods）が任意の移植Ｔ細胞療法の有効性を増強し得ることを認識するであろう。Ｔ細胞療法の例は、米国特許出願公開第２０１４／０１５４２２８号及び同第２００２／０００６４０９号、米国特許第５，７２８，３８８号及び国際公開第２００８／０８１０３５号に記載される。

免疫療法のＴ細胞は、当該技術分野において知られている任意の起源に由来し得る。例えば、Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで造血幹細胞集団、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞（ＥＳ）から分化させることもでき、又はＴ細胞は被験体から得ることもできる。Ｔ細胞を、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍から得ることができる。さらに、Ｔ細胞は、当該技術分野において利用可能な１以上のＴ細胞系統に由来してもよい。また、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び／又はアフェレーシス（apheresis）等の当業者に知られている任意の多くの技術を使用して被験体から収集された血液単位から得ることもできる。Ｔ細胞療法用のＴ細胞を単離する更なる方法は、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号に開示され、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

「ｅＡＣＴ（商標）」と略記することができ、養子細胞移植としても知られる「操作された自己細胞療法」の用語は、患者自身のＴ細胞を収集し、続いて１以上の特定の腫瘍細胞又は悪性腫瘍の細胞表面上に発現される１つ以上の抗原を認識して標的とするように遺伝的に変更するプロセスである。本明細書で使用される「患者」は、癌（例えばリンパ腫又は白血病）に冒された任意のヒトを含む。「被験体」及び「患者」の用語は、本明細書では区別なく使用される。

本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞」の用語は、ｅｘ ｖｉｖｏで培養される任意の細胞を指す。特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞はＴ細胞を含み得る。

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は区別なく使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含み、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合に、本発明のペプチドは、リンカーとして機能し得る（例えば、２つのペプチド又はポリペプチドを結合する）。本明細書中で使用される場合に、本発明のペプチドは、バイオマーカー又はタグとして機能し得る。ペプチド、タグ、又はリンカーの用語は区別なく使用される。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながれた２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるように、上記用語はまた、当該技術分野において、例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般的に称される短い鎖と、当該技術分野において一般的にはタンパク質と称され、多くの種類が存在する、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」として、例えば、特に、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類縁体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。

本明細書で使用される「刺激」は、その同族のリガンドと刺激分子を結合することによって誘導される一次応答を指し、ここで、その結合はシグナル伝達事象を媒介する。「刺激分子」は、Ｔ細胞上の分子、例えば、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体である。「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上に存在する場合、Ｔ細胞上の刺激分子と特異的に結合することができ、それによって、限定されないが活性化、免疫応答の開始、増殖等を含むＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドである。刺激リガンドとして、限定されないが、抗ＣＤ３抗体、ペプチドがロードされたＭＨＣクラスＩ分子、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体が挙げられる。

本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、限定されないが増殖及び／又は主要な分子の上方制御若しくは下方制御等のＴ細胞の応答をもたらすシグナルを指す。

本明細書で使用される「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子を特異的に結合する抗原提示細胞上の分子を含む。共刺激リガンドの結合は、限定されないが、増殖、活性化、分化等を含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドは、一次シグナルに加えて、刺激分子によって、例えば、ペプチドがロードされた主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子とのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体の結合によって提供されるシグナルを誘導する。共刺激リガンドとして、限定されないが、３／ＴＲ６、４−１ＢＢリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ：herpes virus entry mediator）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、ＩＬＴ４、免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ：immunoglobulin-like transcript）３、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンド、リンフォトキシンベータ受容体、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＯＸ４０リガンド、ＰＤ−Ｌ２、又はプログラム細胞死（ＰＤ）Ｌ１が挙げられ得る。共刺激リガンドとして、限定されないが、４−１ＢＢ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ナチュラルキラー細胞受容体Ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、又は腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４又はＬＩＧＨＴ）等のＴ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体が挙げられる。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、限定されないが増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーである。共刺激分子としては、限定されないが、を含む、「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、限定されないが増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーである。共刺激分子として、限定されないが、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３（アルファ；ベータ；デルタ；イプシロン；ガンマ；ゼータ）、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８））、ＭＨＣクラスＩ分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ；Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、ＴＮＦＲ２、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１若しくはＶＬＡ−６、又はそれらのフラグメント、短縮物（truncations）、若しくは組み合わせが挙げられる。

「減少する、減少させる（reducing）」及び「減じる（decreasing）」の用語は、本明細書において区別なく使用され、本来よりも少ない、あらゆる変化を示す。「減少する、減少させる」及び「減じる」は測定前と測定後との比較を必要とする、相対的な用語である。「減少する、減少させる」及び「減じる」は完全な欠乏を含む。

被験体の「治療（Treatment）」又は被験体を「治療する、治療すること（treating）」は、症状、合併症若しくは病状の発症、進行、発現、重症度若しくは再発、又は疾患と関連する生化学的指標の転換、緩和、改善、阻害、遅延又は予防の目的で、被験体に対して行われる任意の種類の処置若しくはプロセス、又は被験体に対する有効成分の投与を指す。一実施形態では、「治療」又は「治療する、治療すること」は部分寛解を含む。別の実施形態では、「治療」又は「治療する、治療すること」は完全寛解を含む。

パーセント同一性を計算するため、典型的には、配列間の最も大きな一致を与える方法で比較される配列をアラインメントさせる。パーセント同一性を特定するために使用され得るコンピュータープログラムの一例は、ＧＡＰ（Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387、ウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学、Genetics Computer Group）を含むＧＣＧプログラムパッケージである。コンピューターアルゴリズムであるＧＡＰを使用して、パーセント配列同一性が特定される２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドをアラインメントさせる。配列を、それらの各アミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチング（アルゴリズムによって特定される、「一致スパン（matched span）」）についてアラインメントさせる。また或る特定の実施形態では、上記アルゴリズムによって、標準的な比較マトリクス（Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix、Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrixを参照されたい）が使用される。

本発明の様々な態様が以下の小節に更に詳細に記載される。

詳細な説明
キメラポリペプチド又は融合ポリペプチドを作製する（例えば、設計、操作する）手段を提供する組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー）配列は、融合タンパク質の適切な発現、フォールディング及び活性を可能にする。本発明は、とりわけ、新規ポリペプチド（例えば、リンカー）及びそれを含む融合タンパク質を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるペプチド（例えば、リンカー、タグ）又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、ペプチド（例えば、リンカー、タグ）又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。他の実施形態では、本発明は、ペプチド（例えば、リンカー、タグ）又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又は発現ベクターを含む細胞を提供する。本明細書に記載されているのは、ペプチドリンカーを含む新規組成物、ペプチドリンカーによって結合されたポリペプチドを含むポリペプチド組成物、並びに関連するポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び医薬組成物である。幾つかの実施形態では、ペプチド（例えば、リンカー、タグ）は、１つ以上のポリペプチドに融合される。記載されるリンカー配列は、リンカーによって接続されたポリペプチドの発現及び活性（例えば、抗原結合）が永続的かつ最適であるように、目的の２つのペプチド／ポリペプチドを制御可能に結合する。ペプチドリンカー又はタグは、Ｃ末端、Ｎ末端、又はポリペプチド内のどこにでも融合して、所望の機能を達成し得る。

ペプチドリンカー
コンセンサス配列ＸＹＰＸＸＸＺＸを含む本明細書に記載される新規キメラポリペプチドリンカーは、治療的処置に有用な融合タンパク質への組み込みに適した望ましい属性を併せ持つ。１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＹＰＸＸＸＺＸとを含むリンカーを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸である。本発明者らは、コンセンサス配列におけるアミノ酸残基の間隔と電荷の両方が、リンカー配列の抗体認識に加えて、リンカーの機能性に寄与することを発見した。

１つの態様においては、本発明は、６個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺとを含むリンカーを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂはリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施形態では、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むリンカーを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂはリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施形態では、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むリンカーを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂはリジン（Ｋ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施形態では、本発明は、８個〜２０個アミノ酸とコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸとを含むリンカーを提供し、ここで、Ｘはグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）であり、Ｐはプロリンである。

幾つかの実施形態では、Ｚは、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択される負電荷アミノ酸である。幾つかの実施形態では、Ｚはグルタミン酸（Ｅ）である。

幾つかの実施形態では、本発明は、コンセンサス配列がＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）又はＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号６）であるリンカーを提供する。幾つかの実施形態では、コンセンサス配列は、ＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）である。

幾つかの実施形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。

リンカーペプチド配列は、目的の１つ以上のタンパク質を接続するために任意の適切な長さとすることができ、接続するペプチドの一方又は両方の適切なフォールディング及び／又は機能及び／又は活性を可能にするように十分柔軟に設計されることが好ましい。したがって、リンカーペプチドは、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、又は２０個以下の長さのアミノ酸を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、又は少なくとも２０個の長さのアミノ酸を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、少なくとも７個かつ２０個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１９個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１８個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１７個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１６個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１５個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１４個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１３個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１２個以下のアミノ酸、又は少なくとも７個かつ１１個以下のアミノ酸を含む。或る特定の実施形態では、リンカーは、１５個〜１７個のアミノ酸を含み、特定の実施形態では、１６個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１０個〜２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１４個〜１９個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１５個〜１７個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１５個又は１６個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸を含む。

本明細書中で使用される、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性又は正に帯電した側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性又は負に帯電した側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。或る特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドリンカー、融合タンパク質、ＣＤＲ（複数の場合もある）内の又は抗体若しくは抗原結合分子（又はそのフラグメント）のフレームワーク領域（複数の場合もある）内の１つ以上のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えてもよい。

本開示に包含される保存的アミノ酸置換は、非天然起源のアミノ酸残基を包含してもよく、これは、典型的には、生体システムにおける合成ではなく化学的ペプチド合成により組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物、及びその他のリバース形態又は反転形態のアミノ酸部分が含まれる。天然起源の残基は、共通する側鎖の特性に基づいて下記のクラスに分類され得る。
疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
酸性（負電荷）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
塩基性（負電荷）：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び、
芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスのメンバーへの交換を含み得る。かかる置換残基は、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、又は分子の非相同領域に導入され得る。例示的な保存的アミノ酸置換を以下の表Ａに述べる。

幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む。

１つの態様においては、本発明は、６個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列とを含むリンカーを提供する。

幾つかの実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、又はＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも５個、６個、７個、８個、又は少なくとも９個のアミノ酸が同一である。

１つの態様においては、本発明は、８個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも６個のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列と含むリンカーを提供する。

幾つかの実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、又はＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも７個、少なくとも８個、又は少なくとも９個のアミノ酸が同一である。

融合タンパク質
１つの態様においては、本発明は、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、本明細書に記載されるリンカーとを含む融合タンパク質を提供する。ポリペプチド組成物及び該ポリペプチド組成物をコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載されており、ポリペプチド組成物は、本明細書に開示されるリンカー配列によって接続された第１及び第２のペプチド／ポリペプチドを含む。本発明者らは、驚くべきことに、本発明によるリンカーが、第１及び第２のペプチドの最適な柔軟性と長さの両方を提供して、立体障害を回避し、正しいフォールディングを可能にすることを見出した。

このようにして生成されたポリペプチド組成物は、一般に、融合又はキメラタンパク質／ポリペプチドと称され、典型的には、適切な系でのポリペプチド組成物をコードする核酸配列の発現（例えば、転写、翻訳）によって作製される。融合及び／又はキメラポリペプチドを作製するための手段は、当技術分野においてよく知られている（例えば、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1992) New Yorkを参照されたい）。

本明細書に記載されるポリペプチド組成物において、２つのポリペプチド（例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）は、上に記載されるリンカーポリペプチドのいずれかによって組み換えにより結合され得て、該リンカーは２つのポリペプチドの間に配置されている。例えば、或る特定の実施形態では、ポリペプチド又は組成物は、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）を含むリンカーによって組み換えにより結合された第１及び第２のポリペプチドを含む。２つのポリペプチドは、２つの異なるタンパク質又は同じタンパク質のいずれかの全長タンパク質、タンパク質フラグメント又は部分、機能的タンパク質フラグメント又は部分、機能的タンパク質ドメイン等を含む任意のアミノ酸配列であり得る。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」又は「ペプチド」の用語は、天然の（例えば、単離された、本質的に精製された又は精製された）又は合成（例えば、化学合成によって）生成され得る、典型的にはペプチド結合のみによって結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。非宿主ＤＮＡ分子の発現により生成されるポリペプチドは、「異種」ペプチド又はポリペプチドである。ポリペプチドを構成する「アミノ酸残基」は、ペプチド結合及び／又はペプチド結合とは異なる結合によって連結された天然又は非天然のアミノ酸残基であり得る。アミノ酸残基は、Ｄ−配置又はＬ−配置であり得る。幾つかの態様では、本明細書で言及されるポリペプチドは、組み換え核酸の発現により生成されるタンパク質、ペプチド又はそれらのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド組成物は、リンカー配列によって接続された２つのポリペプチドを含む。

本明細書で使用される場合、「機能的フラグメント」又は「部分」は、成熟又は天然のタンパク質の所望の生物学的活性の１つ以上を保持するのに十分な（例えば、治療される障害に関する治療的又は改善的な生物学的活性を保持するのに十分な）成熟又は天然タンパク質全体よりも小さいものを指すことが意図される。したがって、アミノ酸配列又はポリペプチドは改変されてもよく、例えば、該改変が機能的物質をコードするポリペプチドの能力を実質的に妨げないように、ポリペプチド配列にアミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換されている。

本明細書に記載されるリンカー又はポリペプチドリンカーは、２つのタンパク質配列を接続（例えば、結合、連結）するように設計されたペプチド配列を指し、該リンカーペプチド配列は、通例、天然には通常２つのタンパク質配列の間には配置されていない。本発明の文脈において、「連結された」又は「結合された」又は「接続された」という語句は、一般に、天然には通常存在しないポリペプチドを生成するための２つの連続する又は隣接するアミノ酸配列間の機能的連結を指す。或る特定の実施形態では、連結は、例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖）のアミノ酸配列の共有結合を指すために使用され得る。一般に、連結されたタンパク質は互いに連続しているか又は隣接しており、結合された場合にそれぞれの操作性及び機能を保持する。本明細書に開示されるキメラポリペプチドを含むペプチドは、１つ以上のアミノ酸を含む挿入されたペプチドリンカーによって連結される。かかるリンカーは、キメラポリペプチドの所望の発現、活性及び／又は立体配座の位置決めを可能にする望ましい柔軟性を提供し得る。典型的なアミノ酸リンカーは、一般に、柔軟であるように、又は２つのタンパク質部分の間にアルファ−ヘリックス等の構造を挿入するように設計される。リンカーは、ポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に融合されてもよく、又は内部に挿入されてもよい。

リンカーを含むポリペプチド組成物において、リンカーペプチド配列（例えば、アミノ酸配列）の５’端（例えば、末端）は、１つのタンパク質配列（第１のペプチド）（例えば、全長タンパク質、又はタンパク質のドメイン、フラグメント若しくはバリアント）の３’端に隣接して共有結合され、さらに、リンカーアミノ酸配列の３’端は、別のタンパク質配列（第２のペプチド）の５’端に隣接して共有結合される。

抗原結合分子
幾つかの態様において、融合タンパク質は抗原結合分子である。幾つかの実施形態では、第１のポリペプチドは軽鎖可変ドメインであり、第２のポリペプチドは重鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を結合するための本明細書に記載されるリンカーの使用は、立体障害を回避し、抗原結合ドメインの正しいフォールディングを可能にする最適な柔軟性及び長さを可能にするという利点を提供する。第１及び第２のペプチドの適切な立体配座は、抗原の認識及び結合に不可欠である。

本明細書で使用される場合、「可変領域」又は「可変ドメイン」の用語は区別なく使用され、抗体の一部、一般的には、軽鎖又は重鎖の一部、典型的には抗体のアミノ末端を意味し、重鎖中の約１００個〜１３０個のアミノ酸及び軽鎖中の約９０個〜１１５個のアミノ酸を含み、それらは、抗体間で配列が広範囲に異なり、特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される。配列における可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される領域に濃縮されるのに対し、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗体の抗原との相互作用及び特異性を主として担うものである。

或る特定の実施形態では、抗原結合分子の可変領域はヒト可変領域である。更なる実施形態では、可変領域は、齧歯類、ヒト又はマウスのＣＤＲ、及びヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。更なる実施形態では、可変領域は霊長類（例えば非ヒト霊長類）の可変領域である。また更なる実施形態では、可変領域はウサギ可変領域である。他の実施形態では、可変領域は、ヒトＣＤＲ及び非ヒト（例えばウサギ、マウス、ラット又は非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。他の実施形態では、可変領域は非ヒト（例えばウサギ、マウス、ラット又は非ヒト霊長類）ＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

「ＶＨ」、「ＶＨドメイン」及び「ＶＨ鎖」の用語は区別なく使用され、抗原結合分子、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域を意味する。本明細書で使用される場合、抗体に関して使用される際の「重鎖」の用語は、任意の異なるタイプ、例えば定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）を指す場合があり、ＩｇＧのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのクラスの抗体をそれぞれ生じる。

「ＶＬ」、「ＶＬドメイン」及び「ＶＬ鎖」の用語は区別なく使用され、抗原結合分子、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域を意味する。本明細書で使用される場合、抗体に関して使用される際の「軽鎖」の用語は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、任意の異なるタイプ、例えばカッパ（κ）又はラムダ（λ）を指す場合がある。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野でよく知られている。特定の実施形態では、軽鎖はヒト軽鎖である。

「抗原結合分子」、「抗原結合部分」、又は「抗体フラグメント」は、その分子が由来する抗体の抗原結合部分（例えば、ＣＤＲ）を含む任意の分子を指す。抗原結合分子は、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖフラグメント、ｄＡｂ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、並びに抗原結合分子から形成された多重特異性抗体が挙げられる。ペプチボディ（すなわち、ペプチド結合ドメインを含むＦｃ融合分子）は、適切な抗原結合分子の別の例である。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は腫瘍細胞上の抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、又はウイルス抗原若しくは細菌抗原に結合する。更なる実施形態では、抗原結合分子は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上を含む抗体又はそのフラグメントである。更なる実施形態では、抗原結合分子は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」及び「一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」の用語は区別なく使用され、ＶＬ及びＶＨ領域が連続タンパク質鎖を形成するようにリンカーによって結合され、タンパク質鎖がそれ自体に折り重なり、一価抗原結合部位を形成するようにリンカーが十分に長い抗原結合分子を意味する（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-26及びHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83 (1988)を参照されたい）。ＦＭＣ６３（Nicholson et al., (1997) Mol. Immunol. 34:(16-17) 1157-65）がｓｃＦｖの具体例であり、ＣＤ１９に特異的である。

幾つかの実施形態では、抗原結合分子はｓｃＦｖである。

幾つかの実施形態では、本発明は、コンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺ、ＸＢＰＸＸＸＺＸ、又は本明細書に記載される例示的なリンカー配列（例えば、ＫＰＧＳＧＥ（配列番号４）、ＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）、ＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号６）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）を含む、ｓｃＦｖを含む抗原結合分子を提供する。幾つかの実施形態では、これらの配列を含む分子及びかかる分子を提示する細胞、抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドも提供され、本開示の態様を形成する。

本明細書で使用される場合、「結合親和性」の用語は、分子（例えば、抗体等の抗原結合分子）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の合計の強さを意味する。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的には、解離定数（Ｋ_ｄ）によって表され得る。親和性は、限定されないが、平衡解離定数（Ｋ_ｄ）及び平衡会合定数（Ｋ_ａ）を含む、当該技術分野で知られている多くの方法で測定され得る及び／又は表され得る。Ｋ_ｄはｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの商から計算されるが、Ｋ_ａはｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆの商から計算される。ｋ_ｏｎは、例えば抗原に対する抗体の会合速度定数を指し、ｋ_ｏｆｆは、例えば抗原に対する抗体の解離を指す。ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆは、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡ又は表面プラズモン共鳴等の当業者に知られている標準的な技法によって決定され得る。

或る特定の実施形態では、抗原結合分子は一本鎖を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が本明細書に記載されるリンカーによって接続されてｓｃＦｖ（例えば、本開示の抗原結合分子）を形成する。幾つかの実施形態では、ＶＨはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＬはリンカーのＣ末端に位置する。他の実施形態では、ＶＬはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＨはリンカーのＣ末端に位置する。幾つかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約５個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、又は少なくとも約１００個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、約８個のアミノ酸〜約１８個のアミノ酸（例えば、１６個のアミノ酸）を含む。

キメラ抗原受容体
抗原結合分子は、ＣＡＲ又はＴＣＲのコンポーネントを形成し得て、ＣＡＲ又はＴＣＲに目的の標的を認識するように指示する役割を果たす場合がある。ＣＡＲ又はＴＣＲの文脈に関連して、本明細書で使用される場合、抗原結合分子は、ＣＡＲ又はＴＣＲを所望の標的に向け、その標的と会合するＣＡＲ又はＴＣＲの任意のコンポーネントを意味する。特定の実施形態では、ＣＡＲ又はＴＣＲの抗原結合分子コンポーネントは、本明細書に記載されるリンカーによって結合された重鎖及び軽鎖の可変領域を含むｓｃＦｖを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、同じ抗体又は２つの異なる抗体に由来し得る。ＣＡＲ又はＴＣＲで使用される抗原結合分子は、目的の標的に結合することが知られているか又はそれが疑われる抗体に由来し得る。

Ｔ細胞は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され得る。ＣＡＲ陽性（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞はＣＡＲを発現するように操作されている。ＣＡＲは、例えば、特定の腫瘍抗原に対する特異性を有する細胞外一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含んでもよく、ｓｃＦｖは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分に直接的又は間接的に連結され、少なくとも１つの活性化ドメインに直接的又は間接的に連結されて、コンポーネントは任意の順序で配置され得る。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８又は４−１ＢＢに由来し得て、活性化ドメインは、例えば、任意の形態のＣＤ３−ゼータに由来し得る。或る特定の実施形態では、ＣＡＲは、２個、３個、４個、又はそれ以上の共刺激ドメインを有するように設計される。ＣＡＲ ｓｃＦｖは、例えば、全ての正常なＢ細胞、並びにＮＨＬ、ＣＬＬ、及び非Ｔ細胞ＡＬＬ等のＢ細胞悪性腫瘍を含む、Ｂ細胞系統の細胞によって発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ１９等を標的とするように設計され得る。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインが別個のポリペプチド鎖として発現されるように操作される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法及びそのコンストラクトの例は、あらゆる目的で引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号、同第２０１４／０２２７２３７号、同第２０１４／００９９３０９号、及び同第２０１４／００５０７０８号に記載されている。

本開示の抗原結合分子はまた、完全にヒトのモノクローナル抗体であってもよく、そこからｓｃＦｖが生成され得て、次いで、本明細書で提供されるＣＡＲ又はＴＣＲのコンポーネントを形成し得る。完全にヒトのモノクローナル抗体は、当業者が精通している数々の手法によって生成され得る。かかる方法としては、限定されないが、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニックマウスに由来する脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリからの単離、又は当技術分野で知られている本明細書の開示に基づく他の手順が挙げられる。

非ヒト動物においてヒトモノクローナル抗体を生成する手順が開発されている。例えば、１つ以上の内在性免疫グロブリン遺伝子を様々な手段によって不活性化したマウスが作製された。ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに導入し、不活性化マウス遺伝子を置き換えた。この技法では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素を、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞系に由来するマウスの株に導入する（Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58も参照されたい）。

必要に応じて、本明細書に記載される様々なドメイン及び領域は、いわゆる「トランス」配置で、抗原結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び活性化ドメインとは別の鎖で発現され得ることが更に理解される。したがって、一実施形態では、活性化ドメインは１つの鎖で発現され得るのに対して、抗原結合分子、及び／又は細胞外ドメイン、及び／又は膜貫通ドメイン及び／又は共刺激ドメイン（ＣＡＲ又はＴＣＲの望ましい構築に応じて）は別々の鎖で発現され得る。

さらに、本開示のＣＡＲのコンポーネントのＮ末端からＣ末端への、又は細胞外から細胞内への順序は、必要に応じて変更されてもよい。抗原結合分子（ｓｃＦｖ）は、標的抗原と会合するために細胞外にあり、細胞膜から最も遠位のｓｃＦｖのＮ末端にリーダー又はシグナルペプチドを含めることができる。

ポリヌクレオチド
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるリンカーをコードするポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、本明細書に記載されるリンカーを含む、抗体及びｓｃＦｖ等の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、この配列を含む分子、並びにかかる分子を提示する細胞に関する。

発現ベクター
１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されるリンカー又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。或る特定の態様では、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるリンカー又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はベクターのセットに関する。他の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される、抗体又はその抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はベクターのセットに関する。

当該技術分野で既知の任意のベクターは、本開示に適切であり得る。幾つかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、又はそれらの任意の組み合わせである。本開示の幾つかの実施形態では、１つ、２つ、又はそれ以上のベクターを利用することができる。

組み換え細胞
幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるリンカー又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え細胞を提供する。幾つかの実施形態では、組み換え細胞は、本明細書に記載されるリンカー又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。幾つかの態様においては、本開示のポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるリンカー又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞等の宿主細胞に関する。幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に関する。

適切な宿主細胞は、哺乳動物、植物、鳥（例えば、鳥類の系）、昆虫、酵母、及び細菌を含むがこれらに限定されない様々な生物に由来し得る。幾つかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。細胞培養及びポリペプチドを発現しやすい任意の哺乳動物細胞を、本発明に従って宿主細胞として用いることができる。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（オランダ国ライデンのCruCell））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ−１０８０）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖のためサブクローン化された２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト細胞株ＣＡＰ及びＡＧＥ１．ＨＮ、並びにGlycotopeのパネルが挙げられる。

本発明に適した宿主細胞の非限定的な例としては、酵母の場合、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）；昆虫の場合、スポドプテラ・フルギペルダ、トリコプルシア・ニ、ドロソフィラ・メラノガスター、及びマンデュカ・セキタ（Manduca sexta）；並びに細菌の場合、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ディフィシル；並びに両生類の場合、ゼノパス・レイヴィス（Xenopus Laevis）に由来する細胞及び細胞株が挙げられる。

さらに、本発明に従って、数々の入手可能なハイブリドーマ細胞株を用いることができる。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が最適な増殖のためと、ポリペプチド又はタンパク質発現のためとで、異なる栄養要件を有する可能性があり、及び／又は異なる培養条件を必要とする可能性があり、また必要に応じて条件を修正してもよいことを理解する。

本発明の或る特定の化合物、組成物及び方法を、或る特定の実施形態に従って具体的に記載したが、以下の実施例は、本発明の化合物を例示するためだけの役割を果たし、本発明を限定することを意図しない。

実施例１：リンカーのコンセンサス配列を同定するためのエピトープマッピング
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）のリンカー配列を含むＣＡＲに対して生じた抗体クローン８及びクローン１６の特異的結合を、完全長の配列番号１、及びＮ末端又はＣ末端のいずれかで切断され、Ｎ末端にビオチン部分又はＣ末端にビオチン部分を持つリジン残基のいずれかを含むバリアント（配列番号２１〜配列番号３０）のエピトープマッピングＥＬＩＳＡ実験に使用した。

プロテインＧ（Pierce）でプレコートされたプレートを使用して、抗体を９６ウェルプレートフォーマットで捕捉した。プレートをＰＢＳＴバッファーで６回洗浄した後、標的ペプチドとインキュベートした。ＰＢＳＴで更に６回洗浄し、抗体をストレプトアビジン−ＨＲＰと共に更にインキュベートした。ＰＢＳＴで最後に６回洗浄して、シグナルを検出し、増強化学発光キット（enhanced chemiluminescense kit）（GE Healthcare製のＥＣＬ）及びＶａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈプレートリーダー（Thermo Fisher）により定量した。図２に示すエピトープマッピングＥＬＩＳＡ実験の結果は、いずれの抗体も完全長の１８ｍｅｒ（配列番号１）に結合するが、クローン８は７ｍｅｒサブシーケンスＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）に特異的に結合し、クローン１６は５ｍｅｒサブシーケンスＫＰＧＳＧ（配列番号１６）に特異的に結合することを実証する。まとめると、これらのデータを、クローン８及びクローン１６に対する最小結合エピトープに基づいてコンセンサス配列を生成するために使用した。

実施例２：例示的なリンカー配列の抗体結合プロファイル
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）のリンカー配列、リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）、又は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖクローンＦＭＣ６３を含むＣＡＲに対して生成された抗体パネルの特異的結合を、本明細書に記載されるように、それぞれＫＩＰ−１抗体、ＫＩＰ−４抗体、及びＫＩＰ−３抗体からの例示的なリンカー配列の抗体結合プロファイルを決定するために使用した。このアッセイには、図１に記載される、リンカー配列ＫＬ１（配列番号９）、ＫＬ２（配列番号１０）、ＫＬ３（配列番号１１）、及び切断型Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号１７）を含むペプチドも含まれていた。プロテインＧ（Pierce）でプレコートされたプレートを使用して、抗体を９６ウェルプレートフォーマットで捕捉した。プレートをＰＢＳＴバッファーで６回洗浄した後、標的ペプチドとインキュベートした。ＰＢＳＴで更に６回洗浄し、抗体をストレプトアビジン−ＨＲＰと共に更にインキュベートした。ＰＢＳＴで最後に６回洗浄して、シグナルを検出し、増強化学発光キット（GE Healthcare製のＥＣＬ）及びＶａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈプレートリーダー（Thermo Fisher）により定量した。図３に示す抗体プロファイルＥＬＩＳＡ実験の結果は、本発明によるリンカーの抗体結合の幅を実証している。

実施例３：キメラリンカーを含むＣＡＲ発現細胞のフローサイトメトリーの結果
プロテインＬを対照として使用するフローサイトメトリーによりＣＡＲ Ｔ細胞をアッセイし、配列番号１（ＦＭＣ６３ ＷＴ）又は配列番号２（ＦＭＣ６３ Ｇ４Ｓ）のリンカー配列を含む各ＣＡＲコンストラクトの発現を確認した。これらの結果は、Ｔ細胞の表面でのＣＡＲコンストラクトの発現を確認する。図４に示すように、ＣＡＲ Ｔ細胞をｓｃＦｖ ＦＭＣ６３及び２４Ｃ１ ｓｃＦｖのコンテキストで生成した。ＫＬ２（配列番号１０）、ＫＬ３（配列番号１１）、ＫＬ４（配列番号７）、ＫＬ５（配列番号１２）、ＫＬ６（配列番号８）、及びＧ４Ｓ２（配列番号１８）のリンカーを使用して、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとを連結した。

配列及び配列番号
本開示は、幾つかの核酸及びポリペプチド配列を含む。便宜上、下記表Ｂは、各配列をその適切な配列番号と関連付ける。

等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。本発明の範囲は、上記の明細書に限定することが意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に述べられる通りである。

請求項の要素を修飾する、特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」等の序数の使用は、それ自体で、１つの請求項の要素の別の請求項の要素に対する優先順位も、優位性も、順序も暗示するものでもなければ、方法の動作が実行される時間的な順序も暗示するものでもなく、請求項の要素を区別するために、単に、或る特定の名称を有する１つの請求項の要素を、同じ（序数の用語の使用を除く）名称を有する別の要素と区別するラベルとして用いられているにすぎない。

数量を特定していない冠詞（The articles "a" and "an"）は本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、明らかに反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるものとする。１つ以上の群の成員の間に「又は」を含むクレーム又は記載は、反対の指示がない限り又は文脈から明らかでない限り、群の成員の１つ、２つ以上又は全てが所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、正確に１つの群の成員が所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する実施形態を含む。本発明は、２つ以上又は全ての群の成員が所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する実施形態も含む。さらに、他に指定のない限り又は矛盾若しくは不一致が生じ得ることが当業者に明らかでない限り、本発明が１つ以上の限定、要素、条項、記述用語等が記載の１つ以上のクレームから同じ基本クレームに従属する別のクレーム（又は適切な場合に、任意の他のクレーム）へと導入される全ての変更、組合せ及び置換を包含することが理解される。要素が（例えば、マーカッシュ群又は同様のフォーマットで）リストとして提示される場合、各々の要素の部分群も開示され、任意の要素（複数の場合もある）を群から除外することができることが理解される。概して、本発明又は本発明の態様が特定の要素、特徴等を含むと称される場合、或る特定の本発明の実施形態又は本発明の態様が、かかる要素、特徴等からなるか又はそれらから本質的になることを理解されたい。簡潔さを目的として、これらの実施形態はいずれの場合も具体的に文字通り規定されていない。具体的な除外が本明細書に列挙されるかに関わらず、本発明の任意の実施形態又は態様が明示的に特許請求の範囲から除外され得ることも理解されたい。本発明の背景を説明し、その実施に関する付加的な詳細を与えるために本明細書で言及される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は引用することにより本明細書の一部をなす。

Claims (30)

1. ６個〜２０個のアミノ酸及びコンセンサス配列ＢＰＸＸＸＺとを含み、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、前記ペプチドがＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）、又はＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない、ペプチド。
2. ８個〜２０個のアミノ酸及びコンセンサス配列ＸＢＰＸＸＸＺＸを含み、Ｘはそれぞれ独立してグリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｂは正電荷アミノ酸であり、Ｚはグリシン（Ｇ）又は負電荷アミノ酸であり、前記ペプチドがＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１３）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号１４）、又はＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１５）ではない、ペプチド。
3. Ｂがリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）である、請求項１又は２に記載のペプチド。
4. ＢがＫである、請求項３に記載のペプチド。
5. ＺがＧである、先行請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
6. Ｚが、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択される負電荷アミノ酸である、先行請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
7. ＺがＥである、請求項６に記載のペプチド。
8. 前記コンセンサス配列がＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号５）又はＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号６）である、請求項２〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
9. 前記コンセンサス配列がＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧ（配列番号３１）である、請求項１又は２に記載のペプチド。
10. 前記ペプチドが１０個〜２０個のアミノ酸を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
11. 前記ペプチドがＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
12. 前記ペプチドがＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
13. 前記ペプチドがＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
14. 前記ペプチドがＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
15. 前記ペプチドがＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
16. 前記ペプチドがＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０又は１１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド。
17. 前記ペプチドがＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０又は１１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド。
18. ８個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、を含むペプチド。
19. ８個〜２０個のアミノ酸と、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のいずれか１つに見られる１０個の連続するアミノ酸のうち少なくとも６個の同一アミノ酸を含むアミノ酸配列と、を含むペプチド。
20. アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）を含むペプチド。
21. 融合タンパク質であって、
    ａ）第１のポリペプチドと、
    ｂ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のペプチドと、
    を含む、融合タンパク質。
22. 融合タンパク質であって、
    ａ）第１のポリペプチドと、
    ｂ）第２のポリペプチドと、
    ｃ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のペプチドと、
    を含む、融合タンパク質。
23. 前記融合タンパク質が抗原結合分子である、請求項２２に記載の融合タンパク質。
24. 前記抗原結合分子がｓｃＦｖである、請求項２２に記載の融合タンパク質。
25. 前記第１のポリペプチドが軽鎖可変ドメインであり、前記第２のポリペプチドが重鎖可変ドメインである、請求項２２に記載の融合タンパク質。
26. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
27. 請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
28. 請求項２６又は２７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
29. 請求項２６又は２７に記載のポリヌクレオチドを含む組み換え細胞。
30. 請求項２８に記載の発現ベクターを含む組み換え細胞。

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