JP2024514522A - 遺伝子導入ベクターおよび細胞を操作する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム工学において使用するための組成物および方法に関する。特に、記載された方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づくシステム（例えば、ＭＡＤ７ヌクレアーゼに基づくシステム）を用いて多能性造血幹細胞および／または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）などのｉＰＳＣに導入遺伝子を導入し、ｉＰＳＣに由来する免疫エフェクター細胞を調製するのに有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１７１，８９１の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、ゲノム工学、特に細胞のゲノムの標的化修飾の分野にある。
電子的に提出された配列表への参照
この出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して、ファイル名「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」で作成日が２０２２年３月３１日の、サイズが１１９ｋｂであるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として電子的に提出される配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゲノムＤＮＡの標的化切断のための様々な方法および組成物が記載されている。このような標的化切断イベントを使用して、例えば、標的化突然変異誘発を誘導する、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導する、および所定の染色体遺伝子座での標的化組換えを容易にすることができる。これらの方法は、しばしば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などのエラーが発生しやすい（error-prone）プロセスによる切断の修復、または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的配列の挿入（標的組み込み）をもたらすことができるように、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（nick）を誘導するための人工切断システム（engineered cleavage system）の使用を伴う。切断は、特異的切断を誘導するために、人工のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または人工のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「一本鎖ガイドＲＮＡ（single guide RNA）」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの、特異的ヌクレアーゼの使用によって生じ得る。
人工多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略され、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に派生した多能性幹細胞の一種である。人工多能性幹細胞は、例えば、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに効力および分化能などの多くの点において、胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と同一であると考えられるが、天然の多能性幹細胞との最大限の関係性が依然として評価されている。ＩＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から最初に作製され（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６）、２００７年にヒト細胞から作製された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｙｕら、２００７）。これは、研究者が、研究において重要でありかつ潜在的に治療用途を有する多能性幹細胞を、物議をかもす胚の使用なしに得ることを可能にしたので、幹細胞研究における重要な進歩として挙げられている。
ヒトｉＰＳＣ技術は、がんを含む多数の血液悪性腫瘍および非血液悪性腫瘍の処置のための治療的に実行可能な造血細胞の非常に有望でかつ潜在的に無制限の供給源である。造血細胞治療薬の同種異系供給源としてのヒトｉＰＳＣおよびゲノム改変ヒトｉＰＳＣ技術の有望性を進歩させるために、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＣ）だけでなく、所望の遺伝子改変を有するＴ、Ｂ、ＮＫＴ、およびＮＫリンパ球の多様なサブセットならびにそれらの前駆細胞を含む、免疫エフェクター集団を効率的かつ再現可能に生成することができることが不可欠である。したがって、治療的使用のためのヒトｉＰＳＣへの遺伝要素の効率的な挿入のための方法および複合体が必要とされている。
本開示は、ｉＰＳＣなどの細胞のゲノム工学における使用のための組成物および方法を記載する。具体的には、記載される方法および組成物は、多能性造血幹細胞および／または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）などのｉＰＳＣに導入遺伝子を導入し、ｉＰＳＣに由来する免疫エフェクター細胞を調製するための組成物および方法に関する。より具体的には、本開示の一態様は、導入遺伝子を挿入するためのＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（またはリボ核タンパク質）（ＲＮＰ）複合体組成物に関し、その組成物は、
（Ｉ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼ；
（ＩＩ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ｇＲＮＡは、細胞（例えば、ｉＰＳＣ）におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、そのガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、ｇＲＮＡがＭＡＤ７ヌクレアーゼと複合体を形成すると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７ヌクレアーゼの配列特異的結合を誘導（direct）する、ｇＲＮＡ；および
（ＩＩＩ）導入遺伝子ベクターであって、（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター
を含む。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、導入遺伝子の挿入のためのＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体組成物であり、その組成物は、
（Ｉ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）第１の調節エレメントに作動可能に連結された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列であって、ｇＲＮＡは、細胞（例えば、ｉＰＳＣ）におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢL遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、ガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、転写されると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７複合体の配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡをコードする配列と、
（ｂ）第２の調節エレメントに作動可能に連結された、ＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする配列と
を含む１つまたは複数のベクターによってコードされる、ＭＡＤ７ヌクレアーゼシステム；および
（ＩＩ）導入遺伝子ベクターであって、（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター
を含む。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）に基づくベクターシステムであり、そのベクターシステムは、
（Ｉ）（ａ）第１の調節エレメントに作動可能に連結された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列であって、ｇＲＮＡは、細胞（例えば、ｉＰＳＣ）におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、ガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、転写されると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７複合体の配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡをコードする配列と、（ｂ）第２の調節エレメントに作動可能に連結された、ＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする配列とを含む、１つまたは複数のベクター；および
（ＩＩ）（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター
を含む。
様々な実施形態において、第１および／または第２の調節エレメントはプロモーターである。いくつかの実施形態では、第１および第２の調節エレメントは同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２の調節エレメントは異なる。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含み、任意選択で、ＣＡＲは、膠芽腫（glioblastoma）、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的である。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２０を含む
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態において、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含み、任意選択で、ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的であり、さらにガイド配列は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的なｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２０を含む。
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、人工細胞死ポリペプチド（artificial cell death polypeptide）をコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む。
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、人工細胞死ポリペプチドをコードする配列を含み、ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む。
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、外因性サイトカインをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む。
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、外因性サイトカインをコードする配列を含み、ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２２または１２６を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２４を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２５を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＬＹＢＬ遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は配列番号１２３を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ７０遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は配列番号１２７を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ３８遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は配列番号１２８を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ３３遺伝子座に特異的である。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、配列番号１２９または１３０を含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＡＡＶＳ１の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６０および６１のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６３および６４のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、（ｉ）それぞれ配列番号６６および６７のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメント、あるいは（ｉｉ）それぞれ配列番号１０６および１０７のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＣＬＹＢＬの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６９および７０のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＣＤ７０の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１０９および１１０のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７２および７３のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載の組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７５および７６のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む。
本明細書に記載される組成物またはベクターシステムのいくつかの実施形態において、ＲＮＰ複合体が細胞に導入されると、ｇＲＮＡ分子のガイド配列に相補的な標的配列を含む内因性遺伝子の発現が前記細胞において低減または排除される。
別の態様において、本明細書に記載されるベクターシステムを含む１つまたは複数のレトロウイルスが本明細書で提供される。
別の態様において、本明細書に記載されるＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）組成物によって導入遺伝子で形質転換されたｉＰＳＣが本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載されるベクターシステムまたは本明細書に記載される１つまたは複数のレトロウイルスで形質転換されたｉＰＳＣが本明細書で提供される。
本明細書に記載のｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む。ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、膠芽腫に関連する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２から選択され、卵巣がんに関連する腫瘍抗原は、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ネクチン－４、およびＢ７Ｈ４から選択され、子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲから選択され、肝臓がんに関連する腫瘍抗原は、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰから選択され、血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０から選択され、膀胱がんに関連する腫瘍抗原は、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６から選択される。
本明細書に記載のｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、α－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物から選択される腫瘍抗原に特異的であり得る。
本明細書に記載のｉＰＳＣの一実施形態では、腫瘍抗原はＣＤ１９である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のｉＰＳＣに由来する、操作された免疫エフェクター細胞またはその集団である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである。
別の態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のｉＰＳＣに由来する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物である。
別の態様では、がんを予防または処置するための方法であって、それを必要とする個体に、薬学的有効量の本明細書に記載の免疫エフェクター細胞もしくは集団または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、がんは、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、黒色腫、骨がん、乳がん、結腸がん、白血病、子宮体がん、卵巣がん、リンパ腫、および脳腫瘍からなる群より選択される。
別の態様では、配列番号１２０～１３０からなる群より選択されるガイド配列を含むｇＲＮＡが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１２３、１２４、または１２５のガイド配列を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１２３のガイド配列を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１２４のガイド配列を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１２５のガイド配列を含む。
ＡＡＶＳ１ターゲティングベクターマップを示す。 Ｂ２Ｍターゲティングベクターマップを示す。 ＣＩＩＴＡターゲティングベクターマップを示す。 ＣＬＹＢＬターゲティングベクターマップを示す。 ＮＫＧ２Ａターゲティングベクターマップを示す。 ＴＲＡＣターゲティングベクターマップを示す。 ＡＡＶＳ１部位にＣＡＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図７Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。 ＡＡＶＳ１部位にＣＡＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｂは、ＣＡＲ陽性細胞についてソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 ＡＡＶＳ１部位にＣＡＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｃは、ＣＡＲ陽性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。 Ｂ２Ｍ部位にＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図８Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。 Ｂ２Ｍ部位にＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｂは、ＨＬＡ－Ｅ陽性、Ｂ２Ｍ陰性細胞についてソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 Ｂ２Ｍ部位にＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｃは、ＨＬＡ－Ｅ陽性、Ｂ２Ｍ陰性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＩＩＴＡ部位にＥＧＦＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＩＩＴＡ部位にＥＧＦＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ｂは、ＥＧＦＲ陽性細胞についてソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＩＩＴＡ部位にＥＧＦＲ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ｃは、ＥＧＦＲ陽性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＬＹＢＬ部位にＰＳＭＡ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図１０Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＬＹＢＬ部位にＰＳＭＡ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図１０Ｂは、ＰＳＭＡ陽性細胞についてソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 ＮＫＧ２Ａ部位にＩＬ１５－ＩＬ１５ＲＡ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図１１Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。 ＮＫＧ２Ａ部位にＩＬ１５－ＩＬ１５ＲＡ導入遺伝子が挿入されるように操作された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図１１Ｂは、ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲＡ陽性細胞についてソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 ＣＩＩＴＡターゲティングベクターマップを示す。 ＣＤ７０ターゲティングベクターマップを示す。
本出願は、とりわけ、ｉＰＳＣなどの細胞のゲノム工学における使用のための組成物および方法を提供する。具体的には、記載される方法および組成物は、導入遺伝子をコードする核酸を多能性造血幹細胞および／または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）などのｉＰＳＣに導入すること、およびｉＰＳＣに由来するＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫エフェクター細胞を調製することに関する。具体的には、ヒト細胞株のゲノム工学のための遺伝子導入ベクターをコードするＤＮＡ配列、および使用される方法が開示される。遺伝子導入ベクター（gene transfer vector）は、ヒト細胞（例えば、ｉＰＳＣ）のＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、および／またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に導入遺伝子を挿入するために設計され、プロモーター配列、ターミネーター配列、および当該の遺伝子座に特異的なホモロジーアームを含む。遺伝子導入ベクターは、ＭＡＤ７ヌクレアーゼに基づくシステムなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づくシステムと共に使用することができる。また、導入遺伝子の挿入のためのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づくシステム、特にＭＡＤ７ヌクレアーゼに基づくシステムと共に使用するための新規なガイド配列も含まれる。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７ヌクレアーゼに基づくシステムは、天然に存在しないまたは操作されたＭＡＤ７ヌクレアーゼを含む。
Ｉ．定義
様々な刊行物、論文および特許が、背景技術および明細書全体において引用または記載されている；これらの参考文献の各々は、あらゆる意図された目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、デバイス、物品などの議論は、本開示の実施形態に関する文脈を提供することを目的としている。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または特許請求される任意の発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本出願が関係する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。その他、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連のあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載される本出願の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験を使用して確認することができる。そのような等価物は、本出願によって包含されることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」または「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、あるいはこれらの任意の他の変形は、指定された整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を排除するものではなく、非排他的またはオープンエンドであることを意図していると理解される。例えば、一覧の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されていない要素、またはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、もしくは装置に固有の他の要素を含むことができる。さらに、反対のことが明示的に述べられていない限り、「または」は、包括的であるまたは／および排他的ではないことを指す。例えば、条件Ａまたは条件Ｂは、以下のいずれかによって満たされる：Ａは真（または存在）でありかつＢは偽（または非存在）である、Ａは偽（または非存在）でありかつＢは真（または存在）である、ＡおよびＢの両方が真（または存在）である。
本明細書で使用されるように、複数の列挙された要素の間の「および／または」という接続詞は、個々の選択肢および組み合わされた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしで第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしで第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１の要素と第２の要素の一緒の適用可能性を指す。これらの選択肢のいずれも、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される用語「および／または」の要件を満たすと理解される。複数の選択肢の同時適用可能性もまた、その意味の範囲内にあり、したがって「および／または」という用語の要件を満たすと理解される。
本明細書で使用される用語「からなる」、またはその変形は、明細書および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、任意の列挙された整数または整数群が含まれるが、追加の整数または整数群は指定の方法、構造、または組成物に追加されないことを意味する。
本明細書で使用される用語「から本質的になる」またはその変形は、本明細書および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、任意の列挙された整数または整数群が含まれ、さらに特定の方法、構造または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数または整数群の任意選択で含まれることを意味する。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．２１１１．０３を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられ、より好ましくはヒトである。
本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概して」、「実質的に」、および同様の用語は、本発明の成分の寸法または特性（例えば、濃度または濃度範囲）に言及する場合、記載された寸法／特性は、厳密な境界またはパラメータではなく、当業者によって理解されるように、機能的に同じまたは同様である、そこからのわずかな変動を除外しないことを意味することを理解されたい。別段の記載がない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。最低限、数値パラメータを含むそのような参照は、当技術分野で許容される数学的および工業的原理（例えば、丸み付け、測定または他の系統誤差、製造公差など）を使用して、最下位桁を変化させないであろう変動を含むであろう。いくつかの実施形態では、数値は、典型的には、列挙された値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値（そのような範囲内の整数および値の分数を含む）を明確に含む。
２つ以上の核酸（例えば、ガイドＲＮＡ配列もしくはホモロジーアーム配列）またはポリペプチド配列（例えば、ＣＡＲポリペプチドおよびそれらをコードするＣＡＲポリヌクレオチド）の文脈において、用語「同一である」または「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目視検査によって測定して、最大の対応となるように比較およびアラインメントされた場合に、同じであるかまたは特定の割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、それに対して試験配列を比較する参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) (Ausubel))によって、実施することができる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulet al., 上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。
累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する；累積スコアが、１つまたは複数の負のスコアを有する残基のアラインメントの累積により、ゼロ以下になる；またはいずれかの配列の終わりに到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は参照配列に類似していると考えられる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、生物学的成分（核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞など）が、その成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、細胞、および組織から、実質的に分離され、それらから離れて生成され、またはそれらから離れて精製されていることを意味する。したがって、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、標準的な精製方法および本明細書に記載の精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞を含む。「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、組成物が核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞の天然環境の一部でなければ、組成物の一部であってもよく、依然として単離されている。この用語はまた、宿主細胞における組み換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と同義的に称され、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には、限定されないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの非通常塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに様々な修飾を施すことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然に典型的に見出されるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」としばしば呼ばれる比較的短い核酸鎖も包含する。
「構築物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、標的細胞への外来遺伝物質の送達または導入を誘導することができる任意の核酸構築物を指し、標的細胞においてそれは複製および／または発現され得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、直鎖状または環状分子であり得る。ベクターは、組み込み型または非組み込み型であり得る。ベクターの主要なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「組み込み（integration）」または「挿入（insertion）」は、外因性構築物の１つまたは複数の配列もしくはヌクレオチドが細胞ゲノムに安定的に挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡもしくはミトコンドリアＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位または「組み込み部位」において細胞の染色体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用される「組み込み」または「挿入」という用語はさらに、組み込み部位における内因性配列または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失ありまたはなしでの、外因性構築物の１つまたは複数の配列またはヌクレオチドの挿入を伴うプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、１つまたは複数の挿入配列またはヌクレオチドによる、欠失された内因性配列または１つまたは複数のヌクレオチドの置換をさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照される活性が宿主細胞に導入されるか、または宿主細胞にとって非天然であることを意味することが意図される。例えば、宿主染色体への組み込みによるなど宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、分子を導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される場合その用語は、発現可能な形態でのコード核酸の細胞への導入を指す。用語「内因性」は、宿主細胞中にその天然形態で存在する参照分子または活性を指す。同様に、「内因性」という用語は、コード核酸の発現に関して使用される場合、細胞内に天然に含まれ、外因的に導入されたものではないコード核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたときにｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡに転写され、場合によっては、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）またはそのフラグメント；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドのバリアント）またはそのフラグメント；操作されたポリペプチドまたはペプチドフラグメント、治療用ペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択マーカーなどをコードし得る。
「作動可能に連結された」とは、核酸配列またはアミノ酸配列の作動連係（operational linkage）を指し、それらは互いに機能的関係にある。例えば、プロモーターは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）場合、そのコード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに、全ての天然に存在する転写後修飾および翻訳後修飾を包含する。発現されたポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）は、宿主細胞の細胞質内にあるか、細胞培養物の増殖培地などの細胞外環境にあるか、または細胞膜に固定され得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。アミノ酸残基の従来の１文字または３文字コードが本明細書で使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すことができる。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含んでいてよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の改変もしくは修飾）によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体を含むポリペプチド、ならびに当技術分野で公知の他の修飾も定義に含まれる。
本明細書に記載されるペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側にあり、Ｃ末端領域が右側にある通常の慣例に従って書かれる。アミノ酸の異性体形態は公知であるが、特に明記しない限り、表されるのはアミノ酸のＬ型である。
ＩＩ．人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）および免疫エフェクター細胞
ＩＰＳＣは、無制限の自己再生能力を有する。ｉＰＳＣの使用は、細胞工学によって、拡大させかつ所望の免疫エフェクター細胞に分化させることができる改変細胞の制御された細胞バンクを作製することを可能にし、大量の同種異系治療製品を供給することができる。
本明細書では、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生細胞（derivative cell）が提供される。本明細書に提供される選択されたゲノム改変は、派生細胞の治療特性を増強する。派生細胞は、機能的に改善され、ゲノム工学を介してｉＰＳＣレベルで細胞に導入される選択的モダリティの組み合わせを受けて、既製の同種異系細胞療法（allogenic off-the-shelf cell therapy）に適している。このアプローチは、サイトカイン放出症候群ＣＲＳ／移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が媒介する副作用を軽減し、優れた有効性を提供しながら長期の自己免疫を予防するのに役立ち得る。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない（「拘束（コミットメント）されていない」）またはあまり特殊化していない細胞が特殊化した細胞（specialized cell）の特徴を獲得するプロセスである。特殊化した細胞には、例えば、血液細胞または筋細胞が含まれる。分化細胞または分化誘導された細胞は、細胞系列内のより特殊化された（「拘束された」）ポジションについた細胞である。用語「拘束された（committed）」は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、特定の細胞タイプまたは細胞タイプのサブセットに分化し続け、通常の状況下では、異なる細胞タイプに分化することもまたあまり分化していない細胞タイプに戻ることもできない地点まで分化経路を進行した細胞を指す。本明細書で使用する場合、「多能性」という用語は、細胞が身体もしくは体細胞または胚体（embryo proper）のすべての系列を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全なまたは部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）まで及ぶ連続性の発生能である。
本明細書で使用するとき、用語「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣは、幹細胞が、３つの胚葉または皮層のすべて（中胚葉、内胚葉、および外胚葉）の組織に分化可能な細胞に誘導または変化またはリプログラムされた、分化した成人、新生児または胎児の細胞から作製されることを意味する。作製されたｉＰＳＣは、天然に見出される細胞ではない。
「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cell）、または「造血前駆体細胞（hematopoietic precursor cell）」という用語は、造血系統に拘束されるが、さらなる造血分化が可能である細胞を指す。造血幹細胞には、例えば、多能性造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞が含まれる。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞タイプを生じる多能性幹細胞である。
本明細書で使用する場合、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫応答は、例えば、免疫エフェクター応答の促進を含む。免疫細胞の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、肥満細胞、および骨髄由来貪食細胞が含まれる。
本明細書で使用する場合、「操作された免疫細胞」または「操作された免疫エフェクター細胞」という用語は、細胞の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の外因性遺伝物質の付加によって遺伝子改変された免疫細胞を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は互換的に使用され、胸腺における成熟を完了し、免疫系において様々な役割を有する白血球のタイプを指す。Ｔ細胞は、例えば、体内の特異的な外来抗原の識別ならびに他の免疫細胞の活性化および不活性化などの役割を有し得る。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞（例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など））、あるいは哺乳動物から得られたＴ細胞など、任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（ｇｄＴ細胞；γδＴ細胞）などを含むがこれらに限定されない任意の発生段階のものであってよい。ヘルパーＴ細胞のさらなるタイプには、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。メモリーＴ細胞のさらなるタイプには、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｒｎ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞など、遺伝子操作されたＴ細胞も指すことができる。Ｔ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化させることができる。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、その表面にＣＤ４を発現し、細胞媒介性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ２、ＩＬ４およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌を含み得る、刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられる。「ＣＤ４」は、Ｔリンパ球上の分化抗原として最初に定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見出される。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答における会合性認識要素として関与している。Ｔリンパ球において、それらはヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、その表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞ならびに細胞傷害性およびサプレッサーＴリンパ球上に見出される分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ拘束性相互作用における会合性認識要素である。
本明細書で使用する場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。ＮＫ細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＮＫ細胞などの遺伝子操作されたＮＫ細胞も指すことができる。ＮＫ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化させることができる。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）親細胞株は、米国特許第８，５４６，１４０；同第９，６４４，１８４；同第９，３２８，３３２；および同第８，７６５，４７０において以前に記載されたようなエピソームプラスミドベースのプロセスなどの、非多能性細胞にリプログラミング因子を導入するための任意の公知の方法を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞から作製することができ、それらの完全な開示は、すべての意図された目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。リプログラミング因子は、ポリヌクレオチドの形態であってよく、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドが、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、クローンｉＰＳＣであるか、またはｉＰＳＣのプールから得られ、ゲノム編集は、１つまたは複数の標的化組み込みおよび／または１つまたは複数の選択された部位におけるイン／デル（Ｉｎ／ｄｅｌ）を行うことによって導入される。別の実施形態では、ｉＰＳＣは、米国特許第９，２０６，３９４および同第１０，７８７，６４２（すべての意図された目的のためにその全体が参照により本出願に組み込まれる）に記載されるように、抗原特異性および再構成ＴＣＲ遺伝子を有するヒトＴ細胞から得られる（以下、「Ｔ－ｉＰＳ」細胞とも称する）。
派生免疫エフェクター細胞
別の態様では、本開示は、ｉＰＳＣの分化から派生した細胞、派生免疫エフェクター細胞（derivative immune effector cell）に関する。上記のように、ｉＰＳＣに導入されたゲノム編集は、派生免疫エフェクター細胞において保持される。ｉＰＳＣの分化から得られる派生細胞の特定の実施形態では、派生細胞は造血細胞であり、造血細胞には、ＨＳＣ（造血幹細胞および造血前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、派生細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫エフェクター細胞である。
特定の実施形態では、本出願は、本開示に従って調製された１つまたは複数の導入遺伝子インサートを有するｉＰＳＣに由来するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＴ細胞を提供する。
派生細胞を製造する方法も提供される。本方法は、細胞分化のための条件下でｉＰＳＣを分化させ、それによって派生細胞を得ることを含む。
本出願のｉＰＳＣは、当技術分野で公知の任意の方法によって分化させることができる。例示的な方法は、米国特許第８，８４６，３９５、同第８，９４５，９２２、同第８，３１８，４９１、ならびに国際公開第ＷＯ２０１０／０９９５３９、ＷＯ２０１２／１０９２０８、ＷＯ２０１７／０７０３３３、ＷＯ２０１７／１７９７２０、ＷＯ２０１６／０１０１４８、ＷＯ２０１８／０４８８２８、およびＷＯ２０１９／１５７５９７に記載されており、それらの各々が全ての意図された目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．ｉＰＳＣにおける選択された遺伝子座での標的化ゲノム編集
本出願の実施形態によれば、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、ｉＰＳＣの１つまたは複数の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に挿入される。
ゲノム編集（genome editing もしくはgenomic editing）、または遺伝子編集は、本明細書において互換的に使用される場合、標的細胞のゲノムにおいてＤＮＡが挿入、欠失、および／または置換されるある種の遺伝子操作である。標的化ゲノム編集（targeted genome editing もしくはtargeted genomic editing）（「標的化遺伝子編集」と交換可能である）は、ゲノム中の予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換を可能にする。内因性配列が標的化編集中に挿入部位において欠失または破壊される場合、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子は、配列の欠失または破壊に起因してノックアウトまたはノックダウンされ得る。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。同様に、本明細書では、「標的化組み込み」および「標的化挿入」という用語は、挿入部位における内因性配列の欠失ありまたはなしでの、ゲノム中の予め選択された部位における１つまたは複数の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。
標的化編集は、ヌクレアーゼ非依存性アプローチまたはヌクレアーゼ依存性アプローチのいずれかによって達成することができる。ヌクレアーゼ非依存性標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を通して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって案内される。
あるいは、標的化編集は、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を通してより高い頻度で達成され得る。そのようなヌクレアーゼ依存性標的化編集は、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構を利用する。外因性遺伝物質を含むドナーベクターがないと、ＮＨＥＪはしばしば、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）を引き起こす。比較して、一対のホモロジーアーム（または相同性アーム）に挟まれた外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在すると、相同性組換えによる相同組換え修復（homology directed repair）（ＨＤＲ）中に外来性遺伝物質がゲノムに導入され、その結果「標的化組み込み」が起こる。
標的化ヌクレアーゼには、Ｃａｓ、Ｃｐｆ、Ｃｓｅ、Ｃｓｙ、Ｃｓｎ、Ｃｓｄ、Ｃｓｔ、Ｃｓｈ、Ｃｓａ、Ｃｓｍ、およびＣｍｒを含むファミリー由来のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼなどの天然および組換えヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼなどが含まれる。例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、２つの主要な成分：（１）Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび（２）ガイド核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）を含む。共発現されると、２つの成分は、ＰＡＭおよびＰＡＭ付近のシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員されるリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ガイド核酸は、選択された配列を標的とするようにＣｐｆ１をガイドするために使用することができる。次いで、これらの２つの成分は、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳動物細胞に送達され得る。
代替ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼファミリーの１つのタイプであるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）が、２０１５年の最初の報告（Zetsche et al Cell, 163(3), 759-771）以来、ゲノム編集に使用されてきた。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、例えば、スタガードＤＳＢ、ＴリッチＰＡＭ、およびＣｐｆ１と複合体を形成してＤＮＡを標的とするために１つのガイドＲＮＡ分子のみを天然に使用することなどの、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なる特徴を示す。これらの特徴は、より低いＧＣ含量がＣａｓ９の使用をあまり実現可能でないものにする標的生物または生物のゲノム内の領域において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが使用されることを可能にする。
最近、ＭＡＤ７と呼ばれる代替的なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが米国特許第９，９８２，２７９および同第１０，３３７，０２８に開示されており、その内容は、すべての意図された目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ社は、このヌクレアーゼを全ての商業的または学術的研究のためにフリーにした。したがって、商業的ゲノム編集のためのその使用は非常に興味深い。Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ社は、ＭＡＤ７がユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）から開発され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるその機能性が証明されていることを報告している。ＭＡＤ７は、アシダミノコッカス属菌種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）とわずか３１％の同一性を有し、またＴリッチＰＡＭ部位（５’－ＹＴＴＮ－３’）、および２１ヌクレオチドのプロトスペーサー（ヌクレアーゼをＤＮＡ標的と会合させるｇＲＮＡの領域）長をそれと共有する。本開示のある特定の実施形態は、エンドヌクレアーゼＭＡＤ７との使用に特に適している。このヌクレアーゼは、遺伝子編集のためにｃｒＲＮＡのみを必要とし、ゲノムのＡＴリッチ領域の特異的ターゲティングを可能にする。ＭＡＤ７は、平滑切断を有する化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）と比較して、スタッガード切断（staggered cut）でＤＮＡを切断する。
例示的なＭＡＤ７配列およびガイド核酸の足場配列を表１に提供する。一般に、「足場配列」は、標的化可能なリボヌクレオタンパク質複合体の形成を促進するのに充分な配列を有する任意の配列を含む。標的化可能なリボヌクレオタンパク質複合体は、核酸誘導型ヌクレアーゼ（nucleic acid-guided nuclease）（例えば、ＭＡＤ７）、ならびに足場配列およびガイド配列を含むガイド核酸を含み得る。標的化可能なリボヌクレオタンパク質複合体の形成を促進する足場配列内の充分な配列は、例えば、二次構造の形成に関与する１つまたは２つの配列領域（例えば、シュードノット領域）など、足場配列内の２つの配列領域の長さに沿ってある程度の相補性を含み得る。１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチドに含まれるか、または同じポリヌクレオチド上にコードされ得る。あるいは、１つまたは２つの配列領域は、別々のポリヌクレオチドに含まれるか、または別々のポリヌクレオチド上にコードされ得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、配列番号１１７～１１９のいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、足場配列は配列番号１１７の配列を含み、いくつかの実施形態では、足場配列は配列番号１１８の配列を含む。いくつかの実施形態では、足場配列は、配列番号１１９の配列を含む。
Figure 2024514522000001
Figure 2024514522000002
Figure 2024514522000003
Figure 2024514522000004
Figure 2024514522000005
したがって、本出願の一態様は、ＭＡＤ７エンドヌクレアーゼを利用する標的化ゲノム挿入のための１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の挿入部位に特異的である一対の相同なアームをさらに含み、標的化挿入の方法は、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にするために構築物を細胞に導入することを含む。別の実施形態では、細胞における標的化挿入の方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の挿入部位に特異的であるＤＮＡ結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ ＭＡＤ７発現カセットを細胞に導入することとを含む。具体的には、本開示によれば、細胞における標的化挿入の方法は、ＭＡＤ７ヌクレアーゼと、所望の挿入部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡとを細胞に導入してＭＡＤ７媒介挿入を可能にすることによって、ｉＰＳＣにおける特定の遺伝子座への挿入のために１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することを含む。
一般に、ガイド核酸は、適合性のある核酸誘導型ヌクレアーゼ（nucleic acid-guided nuclease）と複合体を形成することができ、かつ標的配列とハイブリダイズすることができ、それによってヌクレアーゼを標的配列に誘導することができる。ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むことができる。ガイド核酸は、修飾ヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、本明細書に開示されるようなプラスミド、線状構築物、または編集カセットなどのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によってコードされ得る。特に、本開示の特定の実施形態では、ガイド配列は、ｉＰＳＣの特定の遺伝子座への導入遺伝子の挿入のためのＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体で使用するためのものであり、ＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体は、（Ｉ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列は、ｉＰＳＣにおけるセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座）にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、ＭＡＤ７ヌクレアーゼと会合すると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７複合体の配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡポリヌクレオチド配列；（ＩＩ）ＭＡＤ７酵素タンパク質；および（ＩＩＩ）導入遺伝子ベクターであって、（１）セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座）の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）目的の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター；を含む。一実施形態では、ガイド配列は、配列番号１２０～１３０から選択されるヌクレオチド配列を含む。
標的化挿入のための部位としては、限定はされないが、ゲノムセーフハーバーが挙げられ、これは、理論的には、宿主細胞または生物に悪影響を及ぼすことなく、新たに挿入されたＤＮＡの予測可能な発現に適応することができるヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域である。特定の実施形態では、標的化挿入のためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座からなる群より選択される遺伝子の１つまたは複数の遺伝子座である。
他の実施形態では、標的化挿入のための部位は、挿入部位における内因性遺伝子の欠失または発現低下のために選択される。本明細書で使用する場合、遺伝子の発現に関する「欠失」という用語は、遺伝子の発現を無効にする任意の遺伝子改変を指す。遺伝子の発現の「欠失」の例としては、例えば、遺伝子の発現を無効にする、遺伝子のＤＮＡ配列の除去または欠失、遺伝子の遺伝子座における外因性ポリヌクレオチド配列の挿入、および遺伝子内の１つまたは複数の置換が挙げられる。
標的化欠失のための遺伝子には、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。複数のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質が、同種異系拒絶の問題を回避するため、同種異系レシピエントにおいて組織適合性のためにマッチしていなければならない。ＭＨＣ－クラスＩ欠損、もしくはＭＨＣ－クラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＭＨＣ欠損」は、ＭＨＣクラスＩタンパク質ヘテロダイマーおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヘテロダイマーを含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現を欠くか、またはもはや維持しないか、または低下したレベルを有し、その減少したまたは低下したレベルが他の細胞によってまたは人工の方法によって自然に検出可能であるレベルより低いレベルであるような、細胞を指す。ＭＨＣクラスＩ欠損は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、またはβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子およびタパシン（Ｔａｐａｓｉｎ）遺伝子を含むがこれらに限定されない１つまたは複数のＭＨＣクラスＩ関連遺伝子の欠失または発現レベルの低下によって達成することができる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＭＨＣクラスＩヘテロダイマーの細胞表面発現に必須の共通サブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞はＭＨＣ－Ｉ欠損である。ＭＨＣクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または低減によって達成することができる。ＣＩＩＴＡは、クラスＩＩタンパク質発現に必要とされる転写因子ＲＦＸ５の活性化を介して機能する転写コアクチベーターである。ＣＩＩＴＡヌル細胞はＭＨＣ－ＩＩ欠損である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ １、ＴＡＰ ２、タパシン（Ｔａｐａｓｉｎ）、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の１つまたは複数の遺伝子座に挿入し、それによって挿入により遺伝子の発現を欠失または低減させる。
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に挿入され、好ましくは、１つまたは複数の遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン（Ｔａｐａｓｉｎ）、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ ａもしくはｂ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の遺伝子座であるが、ただし、１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、ＭＨＣ遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ １、ＴＡＰ ２、タパシン（Ｔａｐａｓｉｎ）、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰからなる群より選択される遺伝子）の遺伝子座である。好ましくは、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＭＨＣクラスＩ関連遺伝子（例えば、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ １遺伝子、ＴＡＰ ２遺伝子またはタパシン遺伝子など）の遺伝子座；およびＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子（例えば、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、またはＣＩＩＴＡ遺伝子など）の遺伝子座；および任意選択でさらに、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、およびＲＵＮＸ１遺伝子からなる群より選択されるセーフハーバー遺伝子の遺伝子座；に挿入される。より好ましくは、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に挿入される。
ある特定の実施形態では、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の欠失のための標的とされる部位に複数の導入遺伝子が挿入され得る。例えば、（ａ）第１の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の遺伝子座に挿入され；（ｂ）第２の外因性ポリペプチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子座に挿入され；第３の外因性ポリペプチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に挿入され；外因性ポリヌクレオチドの挿入は、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の発現を欠失または低減させる。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶＳ１遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２０のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号６０のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号６１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２１のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号６３のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号６４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２２のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号６６のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号６７のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２６のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号１０６のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号１０７のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２３のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号６９のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号７０のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２４のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号７２のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジーアームは、配列番号７３のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＬＹＢＬ遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２５のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号７５のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジー配列は、配列番号７６またはそのフラグメントから選択される。
ある特定の実施形態では、ＣＤ７０遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２７のガイド配列またはそのバリアントを含み、左ホモロジーアームは、配列番号１０９のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、右ホモロジー配列は、配列番号１１０またはそのフラグメントから選択される。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３８遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２８のガイド配列またはそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３３遺伝子座への挿入のためのガイドＲＮＡは、配列番号１２９もしくは１３０のガイド配列またはそのバリアントを含む。
表２に提供されるのは、例えば、ｉＰＳＣの標的遺伝子の発現を変更するまたはｉＰＳＣの標的遺伝子を改変する際に、本開示の組成物および方法において使用するための、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン配列（targeting domain sequence）（ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列の両方が提供される）ならびに対応するホモロジーアーム配列である。
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ホモロジーアーム
一本鎖か二本鎖かにかかわらず、ドナー鋳型は、一般に、切断されるべき標的配列（例えば、切断部位）内またはその近くの（例えば、フランキングもしくは隣接する）ＤＮＡ（例えば、標的核酸）の領域と相同である１つまたは複数の領域を含む。これらの相同領域は、本明細書では「ホモロジーアーム」と呼ばれ、以下に概略的に示す：
［５’ホモロジーアーム］－［置換配列］－［３’ホモロジーアーム］。
本明細書に記載されるドナー鋳型のホモロジーアームは、ドナー鋳型を必要とするＤＮＡ修復プロセスによる標的核酸上の切断部位の効率的な分割を可能にするのに充分な長さであれば、任意の適切な長さであってよい。特定の実施形態では、ホモロジーアームの例えばＰＣＲによる増幅が所望される場合、ホモロジーアームは、増幅が行われ得るような長さである。特定の実施形態において、ホモロジーアームのシーケンシング（配列決定）が所望される場合、ホモロジーアームは、シーケンシングが行われ得るような長さである。ある実施形態では、アンプリコンの定量的評価が所望される場合、ホモロジーアームは、例えば、同様のＧ／Ｃ含量、増幅温度等を有することによって、各アンプリコンの同様の数の増幅が達成されるような長さである。特定の実施形態では、ホモロジーアームは二本鎖である。特定の実施形態では、ホモロジーアームは一本鎖である。
特定の実施形態では、５’ホモロジーアームは５０～２５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、５’ホモロジーアームは、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、または約２５０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、３’ホモロジーアームは５０～２５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、３’ホモロジーアームは、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、または約２５０ヌクレオチド長である。
５’および３’ホモロジーアームは、同じ長さであってよく、あるいは異なる長さであってもよい。ある特定の実施形態では、５’および３’ホモロジーアームは増幅され、標的核酸での標的化挿入などの遺伝子編集イベントの定量的評価を可能にする。ある特定の実施形態では、遺伝子編集イベントの定量的評価は、単一の増幅反応において単一対のＰＣＲプライマーを使用してホモロジーアームの全体または一部を増幅することによって、標的化挿入部位における５’ジャンクションおよび３’ジャンクションの両方を増幅することに依存し得る。したがって、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームの長さは異なっていてよいが、各ホモロジーアームの長さは、必要に応じて、（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅可能な長さであるべきである。さらに、単一のＰＣＲ反応での５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームの両方の増幅が所望される場合、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームの間の長さの差は、単一対のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲ増幅を可能にすべきである。
ＩＶ．ｉＰＳＣにおける挿入のための導入遺伝子
本出願の実施形態によれば、ｉＰＳＣは、本開示のＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を使用して、１つまたは複数の導入遺伝子の挿入によって操作される。目的の遺伝子を含む多数の異なる導入遺伝子が、本開示にしたがい、ＲＮＰ複合体、ガイド配列およびホモロジーアームを利用して挿入され得る。例示的な導入遺伝子は、以下でさらに考察される。
Ａ．キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）
挿入され得る導入遺伝子の少なくとも１つは、腫瘍抗原を標的とするＣＡＲなどの外因性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするものである。
本明細書中で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、抗原または標的に特異的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを少なくとも含む組換えポリペプチドを指す。ＣＡＲの細胞外ドメインと標的細胞の表面上の標的抗原との係合は、ＣＡＲのクラスター形成をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性をリディレクト（redirect）し、増殖、サイトカイン産生、貪食作用および／または主要組織適合（ＭＨＣ）非依存的に標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する。
本明細書中で使用される場合、用語「シグナルペプチド」は、新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）におけるリーダー配列を指し、これは、翻訳と同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）新生タンパク質を小胞体に誘導し、さらにその後の表面発現を誘導する。
本明細書で使用する場合、「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、または「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、細胞膜の外側に位置し、抗原、標的、またはリガンドに結合することができるＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」という用語は、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接するドメイン、すなわち、ＣＡＲタンパク質の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを接続するＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜を横切って延在し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用する場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」、または「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞膜の内側に位置し、エフェクターシグナルを伝達することができるＣＡＲの部分を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの局面について、刺激様式で受容体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される分子を指す。刺激分子は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、抗原依存性の一次活性化を開始するもの（「一次シグナル伝達ドメイン（primary signaling domain）」と呼ばれる）、および抗原非依存性の様式で作用して二次的な共刺激シグナルを提供するもの（「共刺激シグナル伝達ドメイン（co-stimulatory signaling domain）」と呼ばれる）を含む。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインおよび／または抗原結合フラグメントを含む。抗原結合フラグメントは、例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。本出願の抗原結合フラグメントは、腫瘍抗原に対する高親和性結合；腫瘍抗原に対する高特異性；腫瘍抗原を発現する細胞に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性貪食作用（ＡＤＰＣ）、および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激する能力；ならびに単独でまたは他の抗がん療法と組み合わせて投与したときに、それを必要とする対象および動物モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する能力；を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数の望ましい機能特性を有する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、広義の意味で使用され、モノクローナルまたはポリクローナルである、ヒト抗体、ヒト化抗体、複合（composite）抗体およびキメラ抗体ならびに抗体フラグメントを含む免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体構造は周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。したがって、本出願の抗体は、５つの主要なクラスまたは対応するサブクラスのいずれであってもよい。好ましくは、本出願の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）のいずれかに割り当てることができる。したがって、本出願の抗体は、κまたはλ軽鎖定常ドメインを含むことができる。特定の実施形態によれば、本出願の抗体は、ラットまたはヒト抗体由来の重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖および軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域から構成される抗原結合領域を含み、それらは各々３つのドメイン（すなわち、相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。
本明細書で使用する場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、特定の腫瘍抗原に特異的に結合する単離された抗体は、その腫瘍抗原に結合しない抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。本出願のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、または組換えＤＮＡ法により作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスまたはラットなどのトランスジェニック非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
本明細書で使用する場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化シングルドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの、抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体または親抗体フラグメントが結合する抗原と同じ抗原に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」という用語は、約１５～約２０アミノ酸の短いペプチド（例えば、リンカーペプチド）によって連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、当該分野における従来の単鎖抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「シングルドメイン抗体」という用語は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含むか、または重鎖可変領域のみを含む、当該分野における従来のシングルドメイン抗体を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、または当該分野で公知の任意の技術を使用して作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義には、インタクトなまたは完全長の抗体、そのフラグメント、および／または少なくとも１つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、抗体の抗原結合特性は保持されるが、ヒト体内での抗原性が低下するように、ヒト抗体の配列との配列相同性を高めるように修飾された非ヒト抗体を指す。
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、しばしば、所望の特異性、親和性および能力を有する哺乳動物のある種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に相当するが、定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、哺乳動物の別の種（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に相当する。
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」という用語は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、その複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複するか、または実質的に重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは重複しないか、または実質的に重複しない。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープまたは２つの抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複するか、または実質的に重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体（half antibody）またはそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するＶＨＨと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するＶＨＨとを含む。
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原に特異的に結合する」抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントは、１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、または１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントを指す。用語「ＫＤ」は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して、当技術分野における方法を使用して決定することができる。例えば、抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントのＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用することによって、例えばバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、またはバイオレイヤー干渉法技術、例えばＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用することによって、決定することができる。
抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントのＫＤの値が小さいほど、抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントが標的抗原に結合する親和性が高い。
様々な実施形態において、本開示のＣＡＲにおける使用に適した抗体または抗体フラグメントには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（「ＳＭＩＰ（商標）」）、イントラボディ、ミニボディ、シングルドメイン抗体可変ドメイン、ナノボディ、ＶＨＨ、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗原特異的ＴＣＲに対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。抗体および／または抗体フラグメントは、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはデカボディである。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントはｓｃＦｖフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントはＶＨＨである。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、シングルドメイン抗体またはナノボディを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグはそれぞれＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインはそれぞれＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグはそれぞれｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインはそれぞれ、ｓｃＦｖを含む。
標的生体分子の高親和性および特異的結合などの類似の機能的特徴を示す、免疫グロブリンドメインの代替足場もまた、本開示のＣＡＲにおいて使用され得る。このような足場は、改善された特徴（例えば、より高い安定性または低減された免疫原性など）を有する分子を生じることが示されている。本開示のＣＡＲにおいて使用され得る代替足場の非限定的な例としては、操作されたテネイシン由来のテネイシンＩＩＩ型ドメイン（例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標））；操作されたγＢ－クリスタリン由来の足場または操作されたユビキチン由来の足場（例えば、Ａｆｆｉｌｉｎｓ）；操作されたフィブロネクチン由来の第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメイン（例えば、モノボディ、ＡｄＮｅｃｔｉｎｓ（商標）、またはＡｄＮｅｘｉｎｓ（商標））；操作されたアンキリン反復モチーフ含有ポリペプチド（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（商標））；操作された低密度リポタンパク質受容体由来のＡドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ）（例えば、Ａｖｉｍｅｒｓ（商標））；リポカリン（例えば、アンチカリン）；操作されたプロテアーゼ阻害剤由来のＫｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２）；操作されたプロテインＡ由来のＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標））；Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（例えば、Ｎａｎｏｆｆｉｔｉｎｓ（登録商標）またはａｆｆｉｔｉｎｓ）；操作されたＦｙｎ由来のＳＨ２ドメイン（例えば、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標））；ＣＴＬＤ３（例えば、テトラネクチン）；チオレドキシン（例えば、ペプチドアプタマー）；ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）；βサンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）；小タンパク質（miniprotein）；Ｃ型レクチン様ドメイン足場；操作された抗体模倣物；ならびにその結合機能性を保持する上述したものの任意の遺伝子操作対応物が挙げられる（Woern A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biolechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23:514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18: 295-304; Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)；あらゆる意図された目的のためにそれぞれが参照によりその全体が組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、代替足場は、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）またはセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、細胞外タグ結合ドメインのＮ末端に位置し得る。リーダー配列は、任意選択で、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に細胞外タグ結合ドメインから切断され得る。当業者に公知の任意の様々なリーダー配列をリーダー配列として用いることができる。リーダー配列が由来し得るペプチドの非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、ＦｃεＲ、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖（ＨＣ）可変領域、ＣＤ８α、またはＴ細胞によって分泌される様々な他のタンパク質のいずれかが挙げられる。様々な実施形態において、リーダー配列は、Ｔ細胞の分泌経路と適合性を有する。特定の実施形態において、リーダー配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）に由来する。
いくつかの実施形態において、リーダー配列は、ＧＭＣＳＦＲに由来する。一実施形態では、ＧＭＣＳＦＲリーダー配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと細胞質ドメインとの間にインフレーム（in frame）で融合された膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、細胞外タグ結合ドメインに寄与するタンパク質、シグナル伝達ドメインもしくは共シグナル伝達（co-signaling）ドメインに寄与するタンパク質に由来してよく、または全く異なるタンパク質に由来してもよい。場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように、選択され、あるいはアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変され得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインと天然に会合するタンパク質の結合を回避するように、選択され、あるいはアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変され得る。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに接続されたドメイン間の柔軟性および／または最適な距離を可能にする追加のアミノ酸を含む。
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に有用な膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られ得る。
いくつかの態様において、ジスルフィド結合することができるシステイン残基を含むζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の膜貫通ドメインを利用することが望ましく、その結果、得られるキメラタンパク質は、それ自体と、またはζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の未修飾バージョンもしくは関連タンパク質とジスルフィド結合ダイマーを形成することができる。場合によっては、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、選択されまたはアミノ酸置換によって改変される。他の場合には、受容体複合体の他のメンバーとの物理的会合を保持するために、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γおよび－β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９またはＣＤ３－γ、ζまたはηの膜貫通ドメインを使用することが望ましい。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。ある態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含み、タグ結合ドメイン、リンカー、および膜貫通ドメインは、互いにインフレームである。
本明細書で使用される「スペーサー領域」という用語は、一般に、タグ結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサー領域は、タグ結合ドメインに対してより柔軟性およびアクセス可能性を提供するために使用することができる。スペーサー領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。スペーサー領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部に由来していてよく、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部に由来し、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来していてもよい。あるいは、スペーサー領域は、天然に存在するスペーサー領域配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成のスペーサー領域配列であってもよい。本開示に従って使用され得るスペーサー領域の非限定的な例としては、ヒトＣＤ８α鎖の一部、ＣＤ２８の部分的細胞外ドメイン、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇヒンジ、またはそれらの機能的フラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインが膜貫通ドメインから最適な距離であることを確実にするために、追加の連結アミノ酸がスペーサー領域に付加される。いくつかの実施形態において、スペーサーがＩｇに由来する場合、スペーサーは、Ｆｃ受容体結合を防ぐために変異され得る。
いくつかの実施形態では、スペーサー領域はヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８または免疫グロブリン（ＩｇＧ）に由来し得る。例えば、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそれらのキメラに由来し得る。
ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジまたはその機能的フラグメントを含む。ある実施形態では、ＩｇＧのヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそれらのキメラに由来する。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはヒンジ領域を含む。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのコアヒンジ領域を含む。用語「コアヒンジ」は、用語「短いヒンジ（short hinge）」（「ＳＨ」としても知られる）と互換的に使用することができる。適切なヒンジドメインの非限定的な例は、コアイムノグロブリンヒンジ領域であり、ＩｇＧ１からのＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５５）、ＩｇＧ２からのＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５６）、ＩｇＧ３からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号５７）、およびＩｇＧ４からのＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号５８）が挙げられる（Wypych et al., JBC 2008 283(23): 16194-16205を参照されたい；あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンヒンジのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。ある態様において、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方がＣＤ８に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方がＣＤ２８に由来する。
Figure 2024514522000008
ある特定の態様では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインはまた、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
細胞質ドメインは、ＣＡＲが配置されている宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能（specialized function）を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。通常、シグナル伝達ドメイン全体が存在するが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分（truncated portion）が使用される場合、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分をインタクトな鎖に代えて使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに充分なシグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲにおいて使用することができるシグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、例えば、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃε受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲ β、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂに由来するシグナル伝達ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一実施態様では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４ （ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ７９Ａ、およびＨＶＥＭに由来する。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは４１ＢＢに由来する。一実施形態では、４１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＩＬ２Ｒｂに由来する。一実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ４０に由来する。ある態様において、ＣＤ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＯＸ４０に由来する。一実施形態では、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ８０に由来する。ある態様において、ＣＤ８０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ８６に由来する。ある態様において、ＣＤ８６共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２７に由来する。ある態様において、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＩＣＯＳに由来する。一実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＮＫＧ２Ｄに由来する。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１２に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。ある態様において、２Ｂ４（ＣＤ２４４）共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、本開示のＣＡＲは、全てＣＤ２８に由来するヒンジ領域、膜貫通領域および共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２８に由来するヒンジ領域、膜貫通領域および共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号５に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号５と少なくとも少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序で配置することができる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの上流にある。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの下流にある。２つ以上の共刺激ドメインが含まれる場合、共刺激シグナル伝達ドメインの順序を入れ替えることができる。
非限定的な例示的ＣＡＲ領域および配列を表４に提供する。
Figure 2024514522000009
Figure 2024514522000010
Figure 2024514522000011
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは抗原に結合する。第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗原中の複数の抗原または複数のエピトープに結合してもよい。例えば、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上の抗原に結合し得る。別の例として、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、同じ抗原中の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上のエピトープに結合し得る。
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する抗原の種類および数に依存し得る。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして機能する抗原を認識するように選択され得る。ある実施形態では、本開示のＣＡＲは、（例えば、腫瘍細胞上の）抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように遺伝子改変することができる。本開示のＣＡＲにおける抗原結合ドメインの標的として機能し得る細胞表面マーカーの非限定的な例として、腫瘍細胞または自己免疫疾患に関連するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態において、２つ以上の腫瘍抗原は、同じ腫瘍に関連する。いくつかの実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、異なる腫瘍に関連する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの自己免疫抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、２つ以上の自己免疫抗原に結合する。いくつかの実施形態において、２つ以上の自己免疫抗原は、同じ自己免疫疾患に関連する。いくつかの実施形態において、２つ以上の自己免疫抗原は、異なる自己免疫疾患に関連する。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する。膠芽腫に関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２が挙げられる。卵巣がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン（Mesothelin）、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＢ７Ｈ４が挙げられる。子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２、およびＥＧＦＲが挙げられる。肝臓がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰが挙げられる。血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０が挙げられる。膀胱がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６が挙げられる。
抗原結合ドメインが標的とし得る抗原のさらなる例としては、α－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、トムゼン－フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカー、またはがん遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、抗原結合ドメインが標的とする抗原はＣＤ１９である。ある態様において、抗原結合ドメインは抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、抗原は、自己免疫疾患または障害に関連する。そのような抗原は、細胞受容体、および「自己」抗体（”self”-directed antibodies）を産生する細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、１型糖尿病、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、重症筋無力症、橋本病、甲状腺機能亢進症（バセドウ病またはグレーブス病）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、クローン病または潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患または障害に関連する。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲが標的とし得る自己免疫抗原には、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、ｓｎＲＮＰ中のＳｍ抗原、膵島細胞抗原、リウマチ因子、および抗シトルリン化タンパク質、シトルリン化タンパク質およびペプチド（例えば、ＣＣＰ－１、ＣＣＰ－２（環状シトルリン化ペプチド））、フィブリノーゲン、フィブリン、ビメンチン、フィラグリン、コラーゲンＩおよびＩＩペプチド、α－エノラーゼ、翻訳開始因子４Ｇ１、核周囲因子、ケラチン、Ｓａ（細胞骨格タンパク質ビメンチン）、関節軟骨の成分（例えば、コラーゲンＩＩ、ＩＸおよびＸＩ）、循環血清タンパク質（例えば、ＲＦ（ＩｇＧ、ＩｇＭ）、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、フェリチン）、核成分（例えば、ＲＡ３３／ｈｎＲＮＰ Ａ２、Ｓｍ、真核生物翻訳伸長因子１α１）、ストレスタンパク質（例えば、ＨＳＰ－６５、－７０、－９０、ＢｉＰ）、炎症／免疫因子（例えば、Ｂ７－Ｈ１、ＩＬ－１α、およびＩＬ－８）、酵素（例えば、カルパスタチン、α－エノラーゼ、アルドラーゼ－Ａ、ジペプチジルペプチダーゼ、オステオポンチン、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）、受容体（例えば、リポコルチン１）、好中球核タンパク質（例えば、ラクトフェリンおよび２５～３５ｋＤ核タンパク質）、顆粒タンパク質（例えば、殺菌性浸透性増大タンパク質（bactericidal permeability increasing protein）（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、膵島細胞抗原、リウマチ因子、ヒストン、リボソームＰタンパク質、カルジオリピン、ビメンチン）、核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、およびＲＮＡ）、リボ核粒子およびタンパク質（例えば、Ｓｍ抗原（ＳｍＤおよびＳｍＢ’／Ｂを含むが、これらに限定されない）、Ｕ１ＲＮＰ、Ａ２／Ｂ１ ｈｎＲＮＰ、Ｒｏ（ＳＳＡ）、およびＬａ（ＳＳＢ）抗原）などが含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、本開示のＣＡＲシステムにおいて使用されるｓｃＦｖフラグメントは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にリンカーを含んでいてよい。リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびＴｈｅである。リンカーは、ＶＨおよびＶＬが互いに対して正しい立体構造を形成して抗原への結合などの所望の活性を保持するように、ＶＨおよびＶＬを連結するのに適切な長さを有するべきである。リンカーは、約５～５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１５～２０アミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、ＧｌｙおよびＳｅｒ含有リンカー、ＧｌｙおよびＡｌａ含有リンカー、ＡｌａおよびＳｅｒ含有リンカー、ならびに他のフレキシブルリンカーである。
一実施形態では、リンカーはＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。一実施形態では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。別の実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。一実施形態では、（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
他のリンカー配列は、任意の免疫グロブリン重鎖または軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＬまたはＣＨ１の部分を含み得る。使用され得る例示的なリンカーとしては、表４の配列番号２６～５４のいずれかが挙げられる。さらなるリンカーは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／０６０６９５号に記載されており、それは意図されたすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｂ．人工細胞死ポリペプチド
本開示による挿入のための別の潜在的な導入遺伝子は、人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドである。
本明細書で使用する場合、「人工細胞死ポリペプチド」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性または他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。人工細胞死ポリペプチドは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、成長停止、転写および転写後遺伝子調節および／または抗体媒介細胞除去（antibody-mediated depletion）を媒介し得る。場合によっては、人工細胞死ポリペプチドは、外因性分子、例えば、抗体によって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘発する。ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドの作用機序は、代謝性、二量体化誘導性または治療用モノクローナル抗体媒介性である。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、抗体、特にモノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む不活性化細胞表面受容体（inactivated cell surface receptor）であり、これは本明細書ではモノクローナル抗体特異的エピトープとも呼ばれる。ｉＰＳＣまたはその派生細胞によって発現される場合、不活性化細胞表面受容体は、シグナル伝達が不活性であるかまたは顕著に損なわれているが、依然として抗体によって特異的に認識され得る。不活性化細胞表面受容体への抗体の特異的結合は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機構によるｉＰＳＣまたはその派生細胞の排除、ならびに毒素または放射性核種との抗体薬物コンジュゲートによる直接死滅を可能にする。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ ペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、またはウステキヌマブを含むがこれらに限定されない抗体によって特異的に認識されるエピトープから選択されるエピトープを含む。
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１およびＨＥＲ１としても知られる上皮成長因子受容体は、細胞外リガンドの上皮成長因子ファミリーのメンバーのための細胞表面受容体である。本明細書で使用する場合、「切断型ＥＧＦＲ」、「ｔＥＧＦＲ」、「短いＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」は、ＥＧＦＲのＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを欠く不活性なＥＧＦＲバリアントを指す。例示的なｔＥＧＦＲバリアントは、ドメイン２の残基３２２～３３３、ドメイン３および４の全て、ならびにセツキシマブ結合エピトープを含む天然ＥＧＦＲ配列の膜貫通ドメインを含む。細胞表面でのｔＥＧＦＲバリアントの発現は、必要に応じて、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などのｔＥＧＦＲに特異的に結合する抗体による細胞排除を可能にする。ＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが存在しないため、ｔＥＧＦＲは、ｉＰＳＣまたはその派生細胞によって発現された場合に不活性である。
本出願の例示的な不活性化細胞表面受容体は、ｔＥＧＦＲバリアントを含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作された免疫細胞における不活性化細胞表面受容体の発現は、細胞が抗ＥＧＦＲ抗体と接触すると、操作された免疫細胞の細胞自殺を誘導する。不活性化細胞表面受容体を使用する方法は、Ｗ０２０１９／０７０８５６、ＷＯ２０１９／０２３３９６、Ｗ０２０１８／０５８００２に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ｔＥＧＦＲバリアントを含む不活性化細胞表面受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本開示の操作された免疫細胞を以前に受けたことがある対象に、以前に投与された操作された免疫細胞を対象において除去するのに有効な量の抗ＥＧＦＲ抗体が投与され得る。
ある実施態様では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブであり、好ましくは、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７７と少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは配列番号７７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ポラツズマブ ベドチンによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ７９ｂの１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ７９ｂエピトープは、配列番号８１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは配列番号８１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、リツキシマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ２０の１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは配列番号８２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、トラスツズマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、Ｈｅｒ２受容体またはＥｒｂＢの１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号８４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、上記方法を用いて作製されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞のＣＤ２０、ＥｒｂＢ２またはＣＤ７９ｂを含むタンパク質をコードする１つまたは複数の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３またはＣＬＹＢＬなどの異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。
Ｃ．サイトカイン
いくつかの実施形態では、挿入のための導入遺伝子は、インターロイキン－１５またはインターロイキン－２などのサイトカインをコードするものである。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン－１５」または「ＩＬ－１５」は、ＴおよびＮＫ細胞の活性化および増殖を調節するサイトカイン、またはその機能的部分を指す。サイトカインの「機能的部分」（「生物学的に活性な部分」）は、全長または成熟サイトカインの１つまたは複数の機能を保持するサイトカインの部分を指す。ＩＬ－１５のそのような機能には、ＮＫ細胞の生存の促進、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化および増殖の調節、ならびに造血幹細胞からのＮＫ細胞発生の支持が含まれる。当業者によって理解されるように、様々なＩＬ－１５分子の配列が当技術分野において公知である。特定の実施形態において、ＩＬ－１５は野生型ＩＬ－１５である。特定の実施形態において、ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５である。特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号７９と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン－２」は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖を調節するサイトカイン、またはその機能的部分を指す。特定の実施形態において、ＩＬ－２は野生型ＩＬ－２である。特定の実施形態では、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２である。特定の実施形態では、ＩＬ－２は、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、好ましくはオートプロテアーゼ（autoprotease）ペプチド配列によって、サイトカインに作動可能に連結されたモノクローナル抗体特異的エピトープを含む不活性化細胞表面受容体をコードする外因性遺伝子を含み得る。オートプロテアーゼペプチドの例としては、ブタテスコウイルス－１（porcine teschovirus-1）２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマＡ型鼻炎ウイルス（Equine Rhinitis A Virus）（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス（cytoplasmic polyhedrosis virus）２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス（Flacherie Virus）２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、オートプロテアーゼペプチドは、ブタテスコウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）のオートプロテアーゼペプチドである。特定の実施形態では、オートプロテアーゼペプチドは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、オートプロテアーゼペプチド配列によってインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）またはＩＬ－２に作動可能に連結された切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む。特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、シグナル配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、シグナル配列は、配列番号８０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ヒンジドメインをさらに含む。いくつかの態様において、ヒンジドメインはＣＤ８に由来する。ある態様において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８に由来する。ある態様において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、その細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメイン内に、抗体によって特異的に認識される１つまたは複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、エピトープと膜貫通領域との間にヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、抗体によって特異的に認識される複数のエピトープを含み、エピトープは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができ、エピトープは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ［式中、ｎは１～８の整数である（それぞれ、配列番号８７、１０１、２５、３１、３２、および１０２～１０４）］の配列を有するフレキシブルペプチドリンカーなどのペプチドリンカーを介して互いに連結され得る。いくつかの実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、ＩＬ－１５またはＩＬ－２などのサイトカインをさらに含む。ある特定の実施形態では、サイトカインは、不活性化細胞表面受容体の細胞質ドメイン内にある。好ましくは、サイトカインは、本明細書に記載されるものなどのオートプロテアーゼペプチド配列を介して、直接的または間接的に、抗体によって特異的に認識されるエピトープに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、サイトカインは、オートプロテアーゼペプチド配列を介して膜貫通領域に連結することによって、エピトープに間接的に連結される。
非限定的な例示的な不活性化細胞表面受容体の領域および配列を表５に提供する。
Figure 2024514522000012
Figure 2024514522000013
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号８８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８８のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号８９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、不活性化細胞表面受容体は、配列番号９０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024514522000014
Figure 2024514522000015
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Figure 2024514522000021
Ｄ．ＨＬＡの発現
ある特定の実施形態では、本出願のｉＰＳＣは、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）などの免疫回避に関連する１つまたは複数のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってさらに改変され得る。特に、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、全てのＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を排除し、ＮＫ細胞による溶解に脆弱な細胞を「ミッシングセルフ（missing self）」応答を介して残す。外因性ＨＬＡ－Ｅ発現は、ＮＫ媒介溶解に対する抵抗性をもたらすことができる（Gornalusse et al., Nat Biotechnol. 2017; 35(8): 765-772）。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたはその派生細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）およびヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）のうちの少なくとも１つをコードするポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号９１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号９１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、配列番号９５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、リンカーを介してＨＬＡ－Ｅに融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質に作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性ポリペプチドは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、リンカーを介してＨＬＡ－Ｇに融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質に作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性ポリペプチドは、配列番号９６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。
Ｅ．他の任意選択のゲノム編集
上記の細胞の他の実施形態において、本開示のＲＮＰ複合体を用いるゲノム編集は、他の追加の人工細胞死ポリペプチドタンパク質、ターゲティングモダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣもしくはその派生細胞の生着、トラフィッキング、ホーミング、生存性、自己再生、持続性および／または生存を促進するタンパク質をコードする、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含んでいてよい。他の導入遺伝子挿入物として、ＰＥＴレポーター、恒常性サイトカイン、ならびにＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ４などの阻害性チェックポイント阻害タンパク質、ならびにＣＤ４７／シグナル調節タンパク質α（signal regulatory protein alpha）（ＳＩＲＰα）軸を標的とするタンパク質をコードするものが挙げられる。
Ｖ．調節エレメント
ある特定の実施形態では、挿入のためのＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ、または外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも調節エレメントに作動可能に連結される。調節エレメントは、宿主細胞におけるＭＡＤ７、ｇＲＮＡ、および／または導入遺伝子の発現を媒介することができる。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、開始部位、ポリアデニル化（ｐｏｌｙ Ａ）テール、ＩＲＥＳエレメント、応答エレメント、および終結シグナルが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＳＶ４０、ヒトβアクチン、または他の構成的、誘導性、時期特異的、組織特異的、もしくは細胞タイプ特異的プロモーターを含む１つまたは複数の外因性プロモーター；あるいは（２）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＵＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、もしくはＣＬＹＢＬなどの選択された部位、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座に含まれる１つまたは複数の内因性プロモーター；に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の制御下に作動可能に置かれる。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＡＣＣのポリヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号９９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％）同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列を使用することもでき、その例には、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩ．組成物
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞を含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、組成物は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ（small RNA）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその代替因子、１つまたは複数の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群より選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含む。
特定の実施形態では、組成物は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の単離されたポリペプチド、本出願の宿主細胞、および／または本出願のｉＰＳＣもしくはその派生細胞を、薬学的に許容される担体と共に含む製品を意味する。本出願のポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またははｉＰＳＣもしくはその派生細胞、ならびにそれらを含む組成物はまた、本明細書において言及される治療用途のための医薬の製造において有用である。
本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入、または医薬製剤に使用するための当技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されるであろう。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書中に記載される組成物の有効性または本明細書中に記載される組成物の生物学的活性を妨害しない非毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を鑑みて、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞における使用に適した任意の薬学的に許容される担体を使用することができる。
薬学的に許容される担体を用いた薬学的に活性な成分の製剤は、当技術分野において公知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例えば、第２１版（２００５）および任意の後の版）。追加の成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、等張化剤、保存剤、安定剤、およびキレート剤が挙げられる。１つまたは複数の薬学的に許容される担体が、本出願の医薬組成物を製剤化するのに使用され得る。
ＶＩＩ．使用方法
別の一般的な態様では、本出願は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供する。この方法は、治療有効量の本出願の細胞および／または本出願の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある態様において、疾患または状態はがんである。がんは、例えば、固形がんまたは液性がんであり得る。がんは、例えば、肺がん、胃がん、結腸がん、肝細胞がん、腎細胞がん、膀胱尿路上皮がん、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経膠腫、膠芽腫、および他の固形腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫／疾患（ＨＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および他の液性腫瘍からなる群より選択され得る。好ましい実施形態では、がんは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
本出願の実施形態によれば、組成物は、治療有効量の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞を含む。本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、対象において所望の生物学的または医薬的応答を誘発する活性材料または成分の量を指す。治療有効量は、記載された目的に関連して、経験的におよび日常的な方法で決定することができる。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物に関して本明細書で使用される場合、治療有効量は、それを必要とする対象において免疫応答を調節する細胞および／または医薬組成物の量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成するのに充分な治療の量を指す：（ｉ）処置される疾患、障害もしくは状態またはそれに関連する症状の重症度を軽減または改善する；（ｉｉ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の持続時間を短縮する；（ｉｉｉ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の進行を防ぐ；（ｉｖ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の退行を引き起こす；（ｖ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれらに関連する症状の発症または発病を予防する；（ｖｉ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の再発を予防する；（ｖｉｉ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院を減らす；（ｖｉｉｉ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短くする；（ｉｘ）処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の生存率を高める；（ｘｉ）対象において処置される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を阻害または軽減する；および／または（ｘｉｉ）別の療法の予防または治療効果を増強または改善する。
治療有効量または投与量は、治療される疾患、障害もしくは状態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬品、および治療が予防的であるか治療的であるかなどの様々な因子によって変動し得る。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために最適に滴定される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への意図される投与経路に適するように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与に適するように製剤化され得る。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、当業者に公知の任意の好都合な様式で投与することができる。例えば、本出願の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み（implantation）、および／または移植（transplantation）によって対象に投与することができる。本出願の細胞を含む組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内（intranodally）、髄内、筋肉内、胸腔内（inrapleurally）、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与することができる。ある特定の実施形態では、本出願の細胞は、対象のリンパ球枯渇（lymphodepletion）を伴ってまたは伴わずに投与することができる。
本出願の細胞を含む医薬組成物は、滅菌液体調製物、典型的には細胞懸濁液を含む等張水溶液として、または任意選択でエマルジョン、分散液などとして提供することができ、これらは典型的には選択されたｐＨに緩衝される。組成物は、細胞の完全性および生存性ならびに細胞組成物の投与に好適な担体、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを含むことができる。
滅菌注射用溶液は、本出願の細胞を、必要に応じて様々な他の成分と共に、適切な量の適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含むことができ、これらは、細胞組成物との使用およびヒトなどの対象への投与に適している。細胞組成物を提供するための適切な緩衝液は、当技術分野において周知である。使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本出願の細胞の完全性および生存性を保存するのに適合する。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で投与することができる。本出願の細胞を含む細胞集団は、精製された細胞集団を含み得る。当業者は、様々な周知の方法を用いて細胞集団中の細胞を容易に決定することができる。本出願の遺伝子改変細胞を含む細胞集団における純度の範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約１００％であり得る。当業者は投与量を容易に調整することができ、例えば、純度の低下により投与量の増加が必要となる。
本出願の細胞は、概して、細胞および／または細胞を含む医薬組成物が投与される対象の体重のキログラムあたりの細胞（細胞／ｋｇ）に基づく用量として投与される。一般に、細胞用量は、投与方法および位置に応じて、約１０４～約１０１０細胞／ｋｇ体重の範囲、例えば、約１０５～約１０９、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、または約１０５～約１０６である。一般に、全身投与の場合、本出願の免疫細胞が腫瘍および／またはがんの領域に投与される局所投与（regional administration）よりも高用量が使用される。例示的な用量範囲として、１ｘ１０４～１ｘ１０８、２ｘ１０４～１ｘ１０８、３ｘ１０４～１ｘ１０８、４ｘ１０４～１ｘ１０８、５ｘ１０４～６ｘ１０８、７ｘ１０４～１ｘ１０８、８ｘ１０４～１ｘ１０８、９ｘ１０４～１ｘ１０８、１ｘ１０５～１ｘ１０８、１ｘ１０５～９ｘ１０７、１ｘ１０５～８ｘ１０７、１ｘ１０５～７ｘ１０７、１ｘ１０５～６ｘ１０７、１ｘ１０５～５ｘ１０７、１ｘ１０５～４ｘ１０７、１ｘ１０５～４ｘ１０７、１ｘ１０５～３ｘ１０７、１ｘ１０５～２ｘ１０７、１ｘ１０５～１ｘ１０７、１ｘ１０５～９ｘ１０６、１ｘ１０５～８ｘ１０６、１ｘ１０５～７ｘ１０６、１ｘ１０５～６ｘ１０６、１ｘ１０５～５ｘ１０６、１ｘ１０５～４ｘ１０６、１ｘ１０５～４ｘ１０６、１ｘ１０５～３ｘ１０６、１ｘ１０５～２ｘ１０６、１ｘ１０５～１ｘ１０６、２ｘ１０５～９ｘ１０７、２ｘ１０５～８ｘ１０７、２ｘ１０５～７ｘ１０７、２ｘ１０５～６ｘ１０７、２ｘ１０５～５ｘ１０７、２ｘ１０５～４ｘ１０７、２ｘ１０５～４ｘ１０７、２ｘ１０５～３ｘ１０７、２ｘ１０５～２ｘ１０７、２ｘ１０５～１ｘ１０７、２ｘ１０５～９ｘ１０６、２ｘ１０５～８ｘ１０６、２ｘ１０５～７ｘ１０６、２ｘ１０５～６ｘ１０６、２ｘ１０５～５ｘ１０６、２ｘ１０５～４ｘ１０６、２ｘ１０５～４ｘ１０６、２ｘ１０５～３ｘ１０６、２ｘ１０５～２ｘ１０６、２ｘ１０５～１ｘ１０６、３ｘ１０５～３ｘ１０６細胞／ｋｇなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用量は、単回用量が投与されているか、または複数回用量が投与されているかを考慮して、調整することができる。有効用量と考えられる量の正確な決定は、各対象に個別の因子に基づいて行われ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、および「処置（treatment）」はすべて、がんに関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善または逆転を指すことが意図され、これは、対象において必ずしも識別可能ではないが、対象において識別可能であってもよい。用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」はまた、疾患、障害、または状態の退縮を引き起こすこと、進行を防ぐこと、または少なくとも進行を遅らせることを指すことができる。特定の態様において、「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、腫瘍またはより好ましくはがんなどの疾患、障害、または状態に関連する１つまたは複数の症状の軽減、発症もしくは発病の予防、または持続時間の短縮を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、疾患、障害、または状態の再発の予防を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、疾患、障害、または状態を有する対象の生存率の上昇を指す。特定の態様において、「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、対象における疾患、障害、または状態の排除を指す。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物は、１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその代替因子、１つまたは複数の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群より選択される。
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態のいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、開示された実施形態を例示することを意図しており、限定することを意図していない。
実施例１．二段階トランスフェクションプロセスを用いたｉＰＳＣの部位特異的操作
１日目：ｉＰＳＣへのドナーｐＤＮＡのリポフェクタミン－ステム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｓｔｅｍ）トランスフェクション
１００μＭのストックＨ１１５２ Ｒｈｏ阻害剤溶液を、約７０％コンフルエンシーでｉＰＳＣを含むＴ－７５フラスコに１μＭの濃度まで添加する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターで少なくとも１時間インキュベートする。インキュベーション中、ビトロネクチンでコーティングしたＴ７５フラスコを少なくとも１５分間室温にする。コーティング溶液を各フラスコから吸引し、１０ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地＋１μＭ Ｈ１１５２と交換する。プレートを使用まで３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターに入れる。インキュベーション後、ｉＰＳＣを含むＴ－７５フラスコから培地を吸引し、７ｍＬの１×ＤＰＢＳをフラスコの側面に沿って添加し、穏やかに旋回させて洗浄する。ＤＰＢＳを吸引し、２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを細胞に直接添加する。細胞を３７℃で３～５分間インキュベートし、続いて１０ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地をフラスコに添加する。細胞をピペッティングによってプレートから浮遊させ、次いで滅菌５０ｍＬコニカルチューブに移す。細胞を２００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地に再懸濁する。ＮＣ－２００ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒを用いて細胞を計数する。Ｔ－７５フラスコに、２Ｅ６細胞を各フラスコに播種する。トランスフェクションに必要とされるまで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターでインキュベートする。以下の表に従って、滅菌１５ｍＬ遠心分離チューブにおいてトランスフェクションミックスを以下に列挙するようにセットアップし、必要に応じてスケールアップする：
チューブ＃１
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １２５０μｌ
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｓｔｅｍ ５０μｌ

チューブ＃２
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １２５０μｌ
・ｐＤＮＡ ５μｇ
チューブ２の成分をチューブ１に加えることによって、チューブ１とチューブ２を混合し、次いで周囲温度で１０分間インキュベートする。混合物すべてを適切なフラスコに滴下する。フラスコを穏やかに揺らし、３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターに入れる。
２日目：ｉＰＳＣのフィーディング
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地を周囲温度にする（≧１５分）。ｉＰＳＣ培養物からの使用済み培地を、容器あたり１４ｍＬの新鮮なＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地と交換し、フィーディングが完了した直後に培養物を３７℃の低酸素５％ＣＯ２加湿インキュベーターに戻す。継代の日のｉＰＳＣ培養物に対するフィーディング／培地交換は、これがコロニーの剥離を有意に減少させるので、実施されない。
３日目：リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の作製
ドナーｐＤＮＡによるｉＰＳＣのトランスフェクションの４０～４８時間後にエレクトロポレーションを実施する。以下のものを滅菌ＰＣＲチューブ中で組み合わせ、よく混合する（適切な数の条件について体積を乗じる＋過剰用に１）：
・１．４μＬ １ｘＤＰＢＳ
・１．６μＬ １００μＭ Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＤ７ ｃｒＲＮＡ
・２μＬ Ａｌｔ－Ｒ ＭＡＤ７ Ｕｌｔｒａ Ｎｕｃｌｅａｓｅ
溶液を短時間遠心分離し、周囲温度で１０～２０分間インキュベートし、次いでエレクトロポレーションに必要となるまで２～８℃で保存する。
細胞を含むＴ－７５フラスコから使用済み培地を吸引し、７ｍＬの１×ＤＰＢＳを添加して洗浄する。１×ＤＰＢＳを吸引し、２ｍＬのＴｒｙｐＬＥと交換する。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターに３～５分間置き、続いて１０ｍＬのＥ８完全培地を添加し、３～４回ピペットで上下させて細胞を取り除く。細胞を５０ｍＬコニカルに移し、２００×ｇで５分間遠心分離する。遠心分離中、コーティング溶液を各ウェルから吸引し、２ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地＋１μＭ Ｈ１１５２を各ウェルに添加することによって、適切な数のコーティングされた６ウェルプレートを調製する。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再懸濁し、続いて２００×ｇで５分間さらに遠心分離する。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再懸濁する。細胞をＮＣ－２００細胞計数器で計数し、記録する。
細胞を２００×ｇで５分間遠心分離し、周囲温度に予め平衡化したＯｐｔｉ－ＭＥＭに２ｘｌ０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。ＢＴＸ ＥＣＭ－８３０エレクトロポレータを以下のようにセットする：
・１５０Ｖ
・１０ｍｓ
・１パルス
各エレクトロポレーションについて、以下のものを、２ｍｍのギャップ幅を有するＢＴＸエレクトロポレーションキュベットに添加する。
・５μｌ ＲＮＰ複合体
・１．４μＬ Ｃｐｆ１エレクトロポレーションエンハンサー
・２００μＬの細胞
キュベットを軽くたたいて、全ての内容物が底に落ちるようにし、エレクトロポレーションセーフティースタンドに入れ、ドームを閉じ、開始ボタンを押す。
各キュベットを備えた滅菌トランスファーピペットを用いて、調製した６ウェルプレートの適切なウェルに細胞を滴下し、次いで３７℃、５％ＣＯ２の低Ｏ２インキュベーターに入れる。
実施例２．ＡＡＶＳ１遺伝子座の編集
ＣＡＲ導入遺伝子ドナープラスミドで特異的に操作して、ＡＡＶＳ１部位にＣＡＲを挿入した。図７Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｂは、ＣＡＲ陽性細胞についてのソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｃは、ＣＡＲ陽性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。
実施例３．Ｂ２Ｍ遺伝子座の編集
ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子ドナープラスミドで特異的に操作して、Ｂ２Ｍ部位にＨＬＡ－Ｅを挿入した。図８Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｂは、ＨＬＡ－Ｅ陽性、Ｂ２Ｍ陰性細胞についてのソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図８Ｃは、ＨＬＡ－Ｅ陽性、Ｂ２Ｍ陰性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。
実施例４．ＣＩＩＴＡ遺伝子座の編集
ＥＧＦＲ導入遺伝子ドナープラスミドで特異的に操作して、ＣＩＩＴＡ部位にＥＧＦＲを挿入した。図９Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ｂは、ＥＧＦＲ細胞についてのソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ｃは、ＥＧＦＲ陽性単一細胞クローンのフローサイトメトリー分析を示す。
実施例５．ＣＹＢＹＬ遺伝子座の編集
ＰＳＭＡ導入遺伝子ドナープラスミドで特異的に操作して、ＣＬＹＢＬ部位にＰＳＭＡを挿入した。図１０Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１０Ｂは、ＰＳＭＡ陽性細胞についてのソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
実施例６．ＮＫＧ２Ａ遺伝子座の編集
ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲＡ導入遺伝子ドナープラスミドで特異的に操作して、ＮＫＧ２Ａ部位にＩＬ１５－ＩＬ１５ＲＡを挿入した。図１１Ａは、操作後の細胞のバルク集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１１Ｂは、ＩＬ－１５－ＩＬ１５ＲＡ陽性細胞についてのソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (75)

  1. 導入遺伝子の挿入のためのＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体組成物であって、
    （Ｉ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼ；
    （ＩＩ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ｇＲＮＡは、細胞におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、前記ガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、ｇＲＮＡがＭＡＤ７ヌクレアーゼと複合体を形成すると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７ヌクレアーゼの配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡ；
    （ＩＩＩ）導入遺伝子ベクターであって、（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の前記標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター；
    を含む、組成物。
  2. 前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含み、任意選択で、前記ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ガイド配列は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ｇＲＮＡガイド配列は配列番号１２０を含む、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 前記導入遺伝子は、人工細胞死ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である、請求項１または５に記載の組成物。
  7. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む、請求項５または６に記載の組成物。
  8. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む、請求項５または６に記載の組成物。
  9. 前記導入遺伝子は、外因性サイトカインをコードする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である、請求項１または９に記載の組成物。
  11. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む、請求項９または１０に記載の組成物。
  13. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２４を含む、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２５を含む、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＬＹＢＬ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２３を含む、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ７０遺伝子座に特異的であり、配列番号１２７を含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ３８遺伝子座に特異的であり、配列番号１２８を含む、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＤ３３遺伝子座に特異的であり、配列番号１２９または１３０を含む、請求項１に記載の組成物。
  19. ＡＡＶＳ１の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号６０および６１のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  20. Ｂ２Ｍの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号６３および６４のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む、請求項１、５～７、および９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  21. ＣＩＩＴＡの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）それぞれ、配列番号６６および６７、または（ｉｉ）それぞれ、配列番号１０６および１０７のヌクレオチド配列、あるいはそれらのフラグメントを含む、請求項１、５、６、８、９、１０および１２のいずれか一項に記載の組成物。
  22. ＣＬＹＢＬの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号６９および７０のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１または１５に記載の組成物。
  23. ＣＤ７０の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号１０９および１１０のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１または１６に記載の組成物。
  24. ＮＫＧ２Ａの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号７２および７３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１または１３に記載の組成物。
  25. ＴＲＡＣの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号の７５および７６ヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１または１４に記載の組成物。
  26. ＲＮＰ複合体が細胞に導入されると、該記細胞において、ｇＲＮＡ分子のガイド配列に相補的な標的配列を含む内因性遺伝子の発現が低減または排除される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の組成物によって導入遺伝子で形質転換されたｉＰＳＣ。
  29. 前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む、請求項２８に記載のｉＰＳＣ。
  30. 前記ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的である、請求項２９に記載のｉＰＳＣ。
  31. 膠芽腫に関連する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２から選択され、卵巣がんに関連する腫瘍抗原は、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ネクチン－４、およびＢ７Ｈ４から選択され、子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲから選択され、肝臓がんに関連する腫瘍抗原は、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰから選択され、血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０から選択され、膀胱がんに関連する腫瘍抗原は、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６から選択される、請求項３０に記載のｉＰＳＣ。
  32. 前記腫瘍抗原は、α－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物から選択される、請求項３０に記載のｉＰＳＣ。
  33. 前記腫瘍抗原はＣＤ１９である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  34. 請求項２８～３３のいずれか一項に記載のｉＰＳＣに由来する操作された免疫エフェクター細胞またはその集団。
  35. 前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項３４に記載の操作された免疫エフェクター細胞または集団。
  36. 前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項３５に記載の操作された免疫エフェクター細胞または集団。
  37. 導入遺伝子の挿入のためのＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体組成物であって、
    （Ｉ）ＭＡＤ７ヌクレアーゼシステムであって、
    （ａ）第１の調節エレメントに作動可能に連結された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列であって、前記ｇＲＮＡは、細胞におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢL遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、前記ガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、転写されると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７複合体の配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡをコードする配列と、
    （ｂ）第２の調節エレメントに作動可能に連結された、ＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする配列と
    を含む１つまたは複数のベクターによってコードされる、ＭＡＤ７ヌクレアーゼシステム；および
    （ＩＩ）導入遺伝子ベクターであって、（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の前記標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター
    を含む、組成物。
  38. ＭＡＤ７／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）に基づくベクターシステムであって、
    （Ｉ）（ａ）第１の調節エレメントに作動可能に連結された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列であって、前記ｇＲＮＡは、細胞におけるＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含み、前記ガイド配列は配列番号１２０～１３０から選択され、転写されると、ガイド配列は標的配列へのＭＡＤ７複合体の配列特異的結合を誘導する、ｇＲＮＡをコードする配列と、（ｂ）第２の調節エレメントに作動可能に連結された、ＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする配列とを含む、１つまたは複数のベクター；および
    （ＩＩ）（１）ＡＡＶＳ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＲＡＣ、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ＣＤ３３またはＣＬＹＢＬ遺伝子座の前記標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列、（２）導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（３）に作動可能に連結されたプロモーター、および（４）転写ターミネーター配列を含む、導入遺伝子ベクター
    を含む、ベクターシステム。
  39. 前記細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項３７に記載の組成物または請求項３８に記載のベクターシステム。
  40. 前記第１および／または第２の調節エレメントはプロモーターである、請求項３７もしくは３９に記載の組成物、または請求項３８もしくは３９に記載のベクターシステム。
  41. 前記第１および第２の調節エレメントが同じである、請求項３７、３９～４０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４０のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  42. 前記第１および第２の調節エレメントが異なる、請求項３７、３９～４０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４０のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  43. 前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含み、任意選択で、前記ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的である、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  44. 前記ガイド配列は、ＡＡＶＳ１遺伝子座に特異的である、請求項３７および３９～４３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４３のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  45. 前記ｇＲＮＡガイド配列は配列番号１２０を含む、請求項４３もしくは４４に記載の組成物、または請求項４３もしくは４４に記載のベクターシステム。
  46. 前記導入遺伝子は、人工細胞死ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  47. 前記ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である、請求項３７、３９～４２および４６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２および４６のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  48. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む、請求項４６もしくは４７に記載の組成物、または請求項４６もしくは４７に記載のベクターシステム。
  49. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む、請求項４６もしくは４７に記載の組成物、または請求項４６もしくは４７に記載のベクターシステム。
  50. 前記導入遺伝子は、外因性サイトカインをコードする配列を含む、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  51. 前記ガイド配列は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的である、請求項３７、３９～４２および５０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２および５０のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  52. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２１を含む、請求項５０もしくは５１に記載の組成物、または請求項５０もしくは５１に記載のベクターシステム。
  53. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２２または１２６を含む、請求項５０もしくは５１に記載の組成物、または請求項５０もしくは５１に記載のベクターシステム。
  54. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２４を含む、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  55. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２５を含む、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  56. 前記ｇＲＮＡガイド配列は、ＣＬＹＢＬ遺伝子座に特異的であり、配列番号１２３を含む、請求項３７および３９～４２のいずれか一項に記載の組成物または請求項３８～４２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  57. ＡＡＶＳ１の標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号６０および６１のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む、請求項３７および３９～４５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４５のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  58. Ｂ２Ｍの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号６３および６４のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含む、請求項３７、３９～４２、４６～４８および５０～５２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２、４６～４８および５０～５２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  59. ＣＩＩＴＡの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、（ｉ）それぞれ、配列番号６６および６７、または（ｉｉ）それぞれ、配列番号１０６および１０７のヌクレオチド配列、あるいはそれらのフラグメントを含む、請求項３７、３９～４２、４６、４７、４９～５１および５３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２、４６、４７、４９～５１および５３のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  60. ＣＬＹＢＬの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号６９および７０のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項３７、３９～４２、および５６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２および５６のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  61. ＮＫＧ２Ａの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号７２および７３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項３７、３９～４２、および５４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２および５４のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  62. ＴＲＡＣの標的配列の左右のアームに相同である左右のポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号の７５および７６ヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む、請求項３７、３９～４２、および５５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８～４２および５５のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  63. ＲＮＰ複合体が細胞に導入されると、該細胞において、ｇＲＮＡ分子のガイド配列に相補的な標的配列を含む内因性遺伝子の発現が低減または排除される、請求項３７および３９～６２のいずれか一項に記載の組成物または請求項３８～６２のいずれか一項に記載のベクターシステム。
  64. 請求項３８～６３のいずれか一項に記載のベクターシステムを含む１つまたは複数のレトロウイルス。
  65. 請求項３８～６３のいずれか一項に記載のベクターシステムまたは請求項６４に記載の１つまたは複数のレトロウイルスで形質転換されたｉＰＳＣ。
  66. 前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む、請求項６５に記載のｉＰＳＣ。
  67. 前記ＣＡＲは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に特異的である、請求項６６に記載のｉＰＳＣ。
  68. 膠芽腫に関連する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２から選択され、卵巣がんに関連する腫瘍抗原は、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ネクチン－４、およびＢ７Ｈ４から選択され、子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲから選択され、肝臓がんに関連する腫瘍抗原は、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰから選択され、血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０から選択され、膀胱がんに関連する腫瘍抗原は、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６から選択される、請求項６７に記載のｉＰＳＣ。
  69. 前記腫瘍抗原は、α－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物から選択される、請求項６７に記載のｉＰＳＣ。
  70. 前記腫瘍抗原はＣＤ１９である、請求項６５～６９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  71. 請求項６５～７０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣに由来する免疫エフェクター細胞またはその集団。
  72. 請求項２８～３３および６５～７０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣに由来する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物。
  73. がんを予防または処置する方法であって、薬学的有効量の請求項３４～３６および７１のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞もしくは集団または請求項７２に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。
  74. 前記がんは、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、黒色腫、骨がん、乳がん、結腸がん、白血病、子宮体がん、卵巣がん、リンパ腫、および脳腫瘍からなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. 配列番号１２０～１３０からなる群より選択されるガイド配列を含むｇＲＮＡ。

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