CN117561330A - 从诱导多能干细胞产生γ-δ T细胞的组合物和方法 - Google Patents

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CN117561330A CN202280040272.7A CN202280040272A CN117561330A CN 117561330 A CN117561330 A CN 117561330A CN 202280040272 A CN202280040272 A CN 202280040272A CN 117561330 A CN117561330 A CN 117561330A
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M·沃利特
西村聪修
M·门冬萨
A·莱比德
B·萨兰特斯
K·圣斯特凡诺
M·F·纳索
B·古隆
祝增荣
B·莫尔斯
L·博尔格斯
C·德尔卡萨莱
M·贝基里
L·汤普森
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Abstract

本申请提供从诱导多能干细胞产生γδT细胞的方法。本申请还提供基因工程化的iPSC、γδT细胞、CAR‑γδT细胞及其使用方法。

Description

从诱导多能干细胞产生γ-δT细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月7日提交的美国临时专利申请第63/171,646号和2021年11月16日提交的美国临时专利申请第63/279,837的权益，其中每项申请都整体援引加入本文。
技术领域
本申请提供基因工程化诱导多能干细胞(iPSC)及其衍生细胞，它们表达重排γδT细胞受体(TCR)。本申请还提供iPSC或其衍生细胞表达嵌合抗原受体用于同种异体细胞疗法的用途。本申请还提供相关载体、多核苷酸和药物组合物。
电子提交的序列表的引用
本申请含有序列表，其经由EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名“4US3Sequence Listing”，创建日期2022年3月22日，大小为187kb。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且其整体援引加入本文。
背景技术
胸腺中的T细胞发育是通过一个有序的细胞命运决定过程进行的。当前体细胞进入胸腺(经门脉管系统从骨髓到达)时，它们会遇到一系列膜相关和可溶性蛋白，这些蛋白提供关键的输入。这些蛋白为发育中的胸腺细胞(T细胞前体)提供信号。一些重要的信号传导家族包括Notch、Flt3、Wnt和细胞因子。特别地，Notch信号传导在使前体细胞向T细胞命运驱动中发挥关键作用。在人胸腺中，Notch家族蛋白DLL1、DLL4和Jag2(在胸腺中由基质细胞表达)通过受体Notch1(由早期胸腺细胞表达)传导信号。因此将DLL1、DLL4和Jag2描述为Notch配体。
虽然单个Notch配体或Notch配体组合在人胸腺中的确切作用尚不明确，但体外研究表明，Notch配体对T细胞谱系定型是必不可少的。一旦前体细胞决定成为T细胞，就会发生第一次重大分叉(bifurcation)，形成两种不同类型的T细胞。人基因组拥有4个独特的T细胞受体(TCR)基因簇；alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)和delta(δ)。在它们的种系结构中，这些基因簇都不可以表达为编码功能性蛋白的功能性转录本。相反，这些基因簇中的每一个都必须经历物理重排，通过一个称为TCR重排的过程将远处的亚基因融合在一起。当TCR基因簇被“重排”时，它具有产生功能性蛋白的潜力。由于每个功能性TCR蛋白都是异源二聚体对，因此必须重排至少两个TCR基因簇。有两种类型的TCR异源二聚体–αβ(α簇和β簇重排形成功能性异源二聚体)和γδ(γ簇和δ簇重排形成功能性异源二聚体)。发育中的T细胞如何决定重排一个簇而不是另一个簇仍是未知的，但已知胸腺细胞选择一种或另一种命运–它们成为αβ或γδT细胞。
向γδT谱系的定型发生在胸腺发育早期。与αβT细胞不同，对于发育或功能，γδT细胞不依赖于高度可变的经典人白细胞抗原(HLA)分子。所谓的先天样T细胞，即γδT细胞在感知危险(感染或癌症)时对不变的配体应答。因此，将γδT细胞输注给HLA不匹配的受体时，不太可能引起移植物抗宿主疾病。因此，γδT细胞为同种异体细胞疗法提供了显著的优势。本文描述了从诱导多能干细胞(iPSC)产生γδT细胞的方法。此外，本文还描述了表达嵌合抗原受体(CAR)的方法和过程，所述嵌合抗原受体赋予iPSC衍生的γδT细胞(γδiT细胞)识别和杀伤恶性癌细胞的能力。
发明内容
在一个总的方面，本申请提供一种基因工程化的诱导多能干细胞或其衍生细胞。所述细胞包含：(i)一种或多种编码重组重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸；以及(ii)编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸；
其中重组重排γδTCR对CAR的结合靶标不具有特异性，并且支持iPSC分化为T细胞。
在某些实施方案中，在有丝分裂刺激后，重组重排γδTCR使分化的T细胞扩增。
在某些实施方案中，一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含γTCR可变基因，其选自TRGV2-5、TRGV8和TRGV9基因；γTCR连接基因，其选自TRGJ1、TRGJ2、TRGJP、TRGJP1和TRGJP2基因；以及γTCR恒定基因，其选自TRGC1和TRGC2基因。在某些实施方案中，一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含δTCR可变基因，其选自TRDV1-3基因；δTCR多样性基因，其选自TRDD1、TRDD2和TRDD3基因；δTCR连接基因，其选自TRDJ1、TRDJ2、TRDJ3和TRDJ4；以及δTCR恒定基因TRDC。
在某些实施方案中，一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含γTCR可变基因TRGV9和δTCR可变基因TRDV2。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR被一种或多种磷酸化抗原激活，磷酸化抗原选自异戊烯焦磷酸盐(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)和(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)或化学相似分子的，其中磷酸化抗原作为代谢过程的产物天然存在于细胞中，或者磷酸化抗原由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平，其中磷酸化抗原的活性是通过与γδTCR的直接相互作用或者磷酸化抗原的活性是通过与嗜乳脂蛋白(BTN)BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的相互作用。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR不被磷酸化抗原激活。
在某些实施方案中，iPSC从外周血单个核细胞(PBMC)重编程，优选CD34+造血干细胞(HSC)、αβT细胞或γδT细胞。
在某些实施方案中，在将重编程转录因子加入PBMC以产生iPSC之前，在氨基-双膦酸盐(amino-bisphosphonate)和白介素2(IL2)的存在下扩增PBMC，从而制备iPSC。
在某些实施方案中，氨基-双膦酸盐是唑来膦酸(zoledronic acid)或其盐。
本申请还提供衍生自本申请的iPSC的T细胞。
本申请还提供一种诱导多能干细胞(iPSC)或从其衍生的T细胞，其包含一种或多种编码重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；以及一个或多个以下附加特征：
(a)编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；
(b)B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因中的一个或多个的缺失或减少表达；
(c)RAG1和RAG2基因缺失或减少表达；
(d)编码非天然存在的FcγRIII(CD16)变体的外源多核苷酸；
(e)编码白介素15(IL-15)和/或白介素(IL-15)受体或者其变体或截短的外源多核苷酸；
(f)编码组成型活性IL-7受体或其变体的外源多核苷酸；
(g)编码白介素12(IL-12)或白介素21(IL21)或者其变体的外源多核苷酸；
(h)编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸；
(i)编码白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)和/或CD24的外源多核苷酸；或者
(j)编码一种或多种成像或报告蛋白如PSMA或HSV-tk的外源多核苷酸。
在某些实施方案中，iPSC从γδT细胞重编程，并且重排γδTCR是γδT细胞内源性的。在某些实施方案中，重排γδTCR是重组的。
在某些实施方案中，在有丝分裂刺激后，重排γδTCR使分化的T细胞的扩增相比于不具有重排TCR的T细胞增加。
在某些实施方案中，iPSC或T细胞进一步包含编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸。在某些实施方案中，HLA-E包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，或者HLA-G包含与SEQ ID NO:69具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在细胞染色体上的一个或多个基因座上，基因座选自AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hl l、GAPDH、RUNX1、B2M、TAPI、TAP2、Tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TRAC、TRBC1、TRBC2、RAG1、RAG2、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT基因，条件是外源多核苷酸中的至少一种整合在选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的基因座上，从而导致基因的缺失或减少表达。在一些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在CD38基因座上，从而导致CD38基因的缺失或减少表达。
在某些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在CIITA、AAVS1和B2M基因的基因座上。在某些实施方案中，iPSC或T细胞具有一个或多个B2M或CIITA基因的缺失或减少表达。
在某些实施方案中，CAR包含：
(i)信号肽，其包含信号肽；(ii)胞外域，其包含特异性结合靶细胞上抗原的结合结构域；(iii)铰链区；(iv)跨膜结构域；(v)胞内信号传导结构域；和(vi)共刺激结构域。在某些实施方案中，信号肽是GMCSFR信号肽。在某些实施方案中，胞外域包含scFv或VHH，其衍生自特异性结合癌细胞上表达的抗原的抗体，如CD19抗原。在某些实施方案中，铰链区包含CD28铰链区、CD8铰链区或IgG铰链区。在某些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域或CD8跨膜结构域。在某些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自DAP10、DAP12、Fcε受体Iγ链(FCER1G)、FcRβ、NKG2D、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD5、CD22、CD226、CD66d、CD79A或CD79B。在某些实施方案中，共刺激结构域衍生自CD28、41BB、IL2Rb、CD40、OX40(CD134)、CD80、CD86、CD27、ICOS、NKG2D、DAP10、DAP12或2B4(CD244)。
在某些实施方案中，CAR包含：
(i)信号肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(ii)胞外域，其包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(iii)铰链区，其包含与SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(iv)跨膜结构域，其包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(v)胞内信号传导结构域，其包含与SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；以及
(vi)共刺激结构域，其包含与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，CAR包含：
(i)信号肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)胞外域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(iii)铰链区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(v)胞内信号传导结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(vi)共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽的作用机制是代谢、二聚化诱导或治疗性单克隆抗体介导的。在某些实施方案中，治疗性单克隆抗体介导的人工细胞死亡多肽是失活的细胞表面蛋白，其选自单克隆抗体特异性表位，表位选自替伊莫单抗(ibritumomab,tiuxetan)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、维泊妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、雷珠单抗(ranibizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维得利珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利尤单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地舒单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)或乌司奴单抗(ustekinumab)特异性识别的表位。
在某些实施方案中，失活的细胞表面蛋白为截短的表皮生长因子(tEGFR)变体。在某些实施方案中，tEGFR变体由与SEQ ID NO:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，重排γδTCR包含：
(a)γTCR链，其具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(b)γTCR链，其具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:112的氨基酸序列的CDR3；
(c)γTCR链，其具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:114的氨基酸序列的CDR3；
(d)γTCR链，其具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:116的氨基酸序列的CDR3；
(e)γTCR链，其具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:118的氨基酸序列的CDR3；
(f)γTCR链，其具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:120的氨基酸序列的CDR3；
(g)γTCR链，其具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:122的氨基酸序列的CDR3；
(h)γTCR链，其具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:124的氨基酸序列的CDR3；
(i)γTCR链，其具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:126的氨基酸序列的CDR3；
(j)γTCR链，其具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:128的氨基酸序列的CDR3；
(k)γTCR链，其具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:130的氨基酸序列的CDR3；
(l)γTCR链，其具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:132的氨基酸序列的CDR3；
(m)γTCR链，其具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:153的氨基酸序列的CDR3；或者
(n)γTCR链，其具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQID NO:155的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排γδTCR包含：
(a)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
(b)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；
(c)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3；
(d)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；
(e)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR3；
(f)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3；
(g)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；
(h)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR3；
(i)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3；
(j)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3；
(k)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3；
(l)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3；
(m)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR3；或者
(n)γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR包含：
(a)γTCR链，其包含与SEQ ID NO:133具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQID NO:134具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(b)γTCR链，其包含与SEQ ID NO:135具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQID NO:136具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；或者
(c)γTCR链，其包含与SEQ ID NO:150具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQID NO:151具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
本申请还提供一种诱导多能干细胞(iPSC)或T细胞，其包含：(i)外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的嵌合抗原受体(CAR)；(ii)外源多核苷酸，其编码包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，其具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(iii)一种或多种多核苷酸，其编码重排T细胞受体(TCR)基因座，其包含具有SEQ ID NO:133、135或150的氨基酸序列的γTCR以及具有SEQ ID NO:134、136或151的氨基酸序列的δTCR；以及(iv)任选存在的外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的人白细胞抗原E(HLA-E)；其中一种或多种外源多核苷酸整合在AAVS1、CIITA和B2M基因的基因座上，从而使CIITA和B2M缺失或减少表达。
本申请还提供一种组合物，其包含根据本申请的实施方案的细胞。
在某些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种治疗剂或者与一种或多种治疗剂联合使用，治疗剂选自肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、siRNA、寡核苷酸、单个核血细胞、包含一种或多种所关注的多核酸(polynucleic acid)的载体、抗体、化疗剂或放射性基团(radioactive moiety)或者免疫调节药物(IMiD)。
本申请还提供一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药本申请的细胞或本申请的组合物。在某些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
本申请还提供一种制备本申请的T细胞的方法，其包括在细胞分化的条件下使本申请的iPSC细胞分化，从而获得T细胞。在某些实施方案中，iPSC通过基因组工程化iPSC获得，其中基因组工程化包括靶向编辑。靶向编辑的实例包括但不限于通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其他功能变化进行的缺失、插入或插入/缺失(in/del)。
本申请还提供一种衍生自诱导多能干细胞(iPSC)的CD34+造血祖细胞(HPC)，其包含一种或多种编码重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；以及一个或多个以下附加特征：
(a)编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；
(b)B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因中的一个或多个缺失或减少表达；
(c)RAG1和RAG2基因的缺失或减少表达；
(d)编码非天然存在的FcγRIII(CD16)变体的外源多核苷酸；
(e)编码白介素15(IL-15)和/或白介素(IL-15)受体或者其变体或截短的外源多核苷酸；
(f)编码组成型活性白介素7(IL-7)受体或其变体的外源多核苷酸；
(g)编码白介素12(IL-12)或白介素21(IL21)或者其变体的外源多核苷酸；
(h)编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸；
(i)编码白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)和/或CD24的外源多核苷酸；或者
(j)编码一种或多种成像或报告蛋白如PSMA或HSV-tk的外源多核苷酸。
附图说明
当结合附图阅读时，会更好地理解前述概述以及本申请的优选实施方案的以下详细描述。但是应当理解
图1A-C示出产生诱导多能干细胞(iPSC)作为γδiT细胞来源的方法的示意图。图1A示出使用从血液样品收集的成熟γδT细胞衍生的iPSC产生γδT细胞的方法。图1B示出使用从血液样品收集的CD34+造血干细胞(HSC)衍生的iPSC产生γδiT细胞的方法。图1C示出使用从血液样品收集的成熟αβT细胞衍生的iPSC产生γδiT细胞的方法。
图2A-D示出扩增γδT细胞以衍生T细胞衍生的iPSC(TiPSC)。图2A示出代表性FACS结果图，其显示从CD3+T细胞扩增前和在含有唑来膦酸盐(zoledronate)和IL-2的培养基中扩增14天后(扩增后)分选Vγ9/Vδ2T细胞。图2B示出在含有唑来膦酸和IL-2的培养基中扩增14天(扩增后)的细胞总数图。图2C的表格描述使用PCR分析的四个T细胞衍生的iPSC(TiPSC)系中存在或不存在重排Vγ9、Vδ2或Vδ1TCR基因座。图2D示出从TiPSC系分化的iT细胞(从HPC阶段分化14天)。所示为两个Vγ9/Vδ2TiPSC克隆gdTiPSC4.1和gdTiPSC4.4。左图示出CD3和γδTCR的表达，并且显示第14天时大多数细胞为CD3/TCR阳性。右图以CD3阳性细胞门控(gate)，并且示出所有发育iT细胞都一致使用Vγ9/Vδ2TCR。
图3A-D示出，γδT细胞衍生的iPSC(TiPSC)在体外分化后会产生γδiT细胞。图3A-B示出代表性的FACS结果图，其显示iT分化14天后，细胞一致呈(图3A)CD3阳性和(图3B)γδTCR阳性/αβTCR阴性。图3C示出代表性FACS结果图，其显示TiPSC系工程化为在外源组成型启动子下表达CD19特异性CAR时的CAR表达。图3D示出显示工程化CAR-iT细胞有效地杀伤CD19(+)Reh细胞，但不杀伤已通过基因编辑缺失CD19的Reh细胞(CD19(-))的图。
图4A-B示出产生(图4A)供体衍生和(图4B)iPSC衍生的细胞疗法的工作流程比较。
图5A-B示出，(图5A)T细胞暴露于唑来膦酸和IL-2导致γδT细胞富集(上)，然而在3个供体的2个中，γδT细胞的总增加不足以成功重编程(下)，以及(图5B)，新的扩增方法保留γδT细胞富集(上)，同时将γδT细胞的增殖幅度提高至足以在同样的3个供体中进行iPSC重编程的水平(下)。
图6示出新γδTiPSC系如何从收集供体细胞和富集携带Vγ9/Vδ2TCR的γδT细胞开始产生的。在两周的扩增过程中，Vγ9/Vδ2细胞的频率最初降低(第7天)，但随着两周的扩增，会回升。收集扩增细胞并通过引入多能基因使其进行iPSC重编程。通过显微镜形态鉴定iPSC群，并挑选每个群进行亚培养。用两个供体进行的三次实验获得一致的TiPSC系产量(表)。
图7A示出，为实现靶细胞鉴定，使用CRISPR介导的基因编辑与同源定向修复(HDR)，用嵌合抗原受体(CAR)对γδTiPSC系进行工程化。然后，使CAR-TiPSC系进行第一次分化，以强化CD34+造血祖细胞(HPC)的发育。此时，细胞是一致地CD34+、CD43+和CD45+/-的。然后，使HPC进行第二次分化过程，以执行(enforce)T谱系定型(commitment)和γδCAR-iT细胞的发育。
图7B示出对CD34+造血祖细胞(HPC)进行流式细胞分析的结果，以鉴定CD34+/CD43+细胞(左)、CD45+/-细胞(中)和CD19 CAR+(右)。
图7C示出以执行T谱系定型和γδCAR-iT细胞的发育的第二次分化过程后CD7+、CD45+和CD3/TCRγδ+γδCAR-iT细胞的百分比。
图7D示出，分化四周后，细胞表达CD45、CD3、γδTCR和CD7。具有不同γδTCR的两种不同TiPSC系的比较显示，可以通过分化过程获得的CAR-iT的表型中存在一定的异质性。
图8A-D示出CAR-γδiT细胞的体外活性。用IncuCyte测定确定γδCAR-iT细胞消除表达CD19的肿瘤的能力(肿瘤杀伤＝y轴上的信号下降)。(图8A)以NALM-6为靶标，使用相同CD19 CAR，以1:1的效应物与靶标比，比较γδCAR-iT与三种不同供体批次的常规αβCAR-T细胞的活性。(图8B)在相同测定中，以不同E:T比评估效应物的活性。γδCAR-iT细胞的表现与CAR-T一样优异。(图8C)以Reh细胞为靶标，使用相同CD19 CAR，以1:1的效应物与靶标比，比较γδCAR-iT与三种不同供体批次的常规αβCAR-T细胞的活性。(图8D)在相同测定中，以不同的E:T比评估效应物的活性。γδCAR-iT细胞的表现与CAR-T一样优异。
图8E-H示出CAR-γδiT细胞的体外活性。炎性细胞因子表达(例如IFN-γ或TNF)是细胞疗法的顾虑，因为对患者有毒性。与常规CAR-T细胞不同，γδCAR-iT细胞在杀伤测定中与表达CD19的肿瘤细胞相互作用时不会释放(图8E)IFN-γ或(图8G)TNF。(图8F和图8H)CD19基因敲除的NALM-6系用作对照。
图8I-J示出稳态细胞因子对γδCAR-iT细胞持久性和活性的重要性，对其进行评估以正确设计后续的体内研究。最初，将γδCAR-iT细胞暴露于1nM IL-2或1nM IL-5，并培养1小时，分别在0、10、30和60分钟取样。对IL-2或IL-15的反应性通过(图8I)磷酸化STAT3(pSTAT3)和(图8J)pSTAT5的染色来确定。对于IL-2和IL-15，pSTAT5平均荧光强度(MFI)相似，但与IL-2相比，pSTAT3对于IL-15出现得更早，程度更高。
图8K-L示出用于评估γδCAR-iT细胞随着时间和重复靶标暴露的杀伤能力的多次杀伤测定结果，其在IncuCyte上进行，在14天内每天补充靶标而不是效应物。γδCAR-iT细胞能够在(图8K)IL-2或(图8L)Il-15的作用下控制肿瘤14轮。然而，在IL-15的存在下，杀伤似乎更迅速和彻底。
图8M示出当量化效应细胞，多次杀伤结束时的结果，可以明显看出，在杀伤过程中，IL-15而不是IL-2支持γδCAR-iT的扩增。
图9A示出研究的时间线的示意图，研究设计为利用单次与多次给药效应细胞(示意图)，评估γδCAR-iT细胞在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL2/IL15)1-1Jic/JicTac小鼠体内的效力。这个研究的结果见图9B-E。主要结果(第21天时肿瘤生长抑制)用当给药1或3剂量的γδCAR-iT细胞时，动物中萤光素酶标记的NALM-6肿瘤显著减少(分别为86％TGI和95％TGI)获得。多次给药导致小鼠的存活率提高，并且增强γδCAR-iT细胞的持久性。整体上，γCARδ-iT细胞展现出活性和持久性，没有体重损失形式的毒性证据。
图9B示出研究的结果，研究设计为利用单次与多次给药效应细胞(示意图)，评估γδCAR-iT细胞在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL2/IL15)1-1Jic/JicTac小鼠体内的效力。图9B示出当给药零剂(CTL)、1剂(1x剂量)或3剂(3x剂量)的γδCAR-iT细胞时，动物中萤光素酶标记的NALM-6肿瘤的生长(分别为86％TGI和95％TGI)。
图9C示出研究的结果，研究设计为利用单次与多次给药效应细胞(示意图)，评估γδCAR-iT细胞在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL2/IL15)1-1Jic/JicTac小鼠体内的效力。图9C示出当给药零剂(CTL)、1剂(1x剂量)或3剂(3x剂量)的γδCAR-iT细胞时，动物中随时间变化的肿瘤负荷(分别为86％TGI和95％TGI)。整体上，γδCAR-iT细胞展现出活性，没有体重损失形式的毒性证据。
图9D示出研究的结果，研究设计为利用单次与多次给药效应细胞(示意图)，评估γδCAR-iT细胞在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL2/IL15)1-1Jic/JicTac小鼠体内的效力。图9D示出多次给药导致小鼠的存活率提高，并且增强γδCAR-iT细胞的持久性。整体上，γδCAR-iT细胞展现出活性，没有体重损失形式的毒性证据。
图9E示出研究的结果，研究设计为利用单次与多次给药效应细胞(示意图)，评估γδCAR-iT细胞在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL2/IL15)1-1Jic/JicTac小鼠体内的效力。图9E示出当给药零剂(CTL)、1剂(1x剂量)或3剂(3x剂量)的γδCAR-iT细胞时，CAR-iT在动物中随时间变化的持久性。整体上，γδCAR-iT细胞展现出持久性，没有体重损失形式的毒性证据。
图10示出当与各种抗体(例如抗CD20抗体)联合使用时，用于确定γδiT细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的双色incucyte测定的示意图。
图11A-B示出iPSC衍生的CAR-γδT细胞进行ADCC。(图11A)CAR-γδT细胞进行Raji淋巴母细胞B细胞系的ADCC，Raji淋巴母细胞B细胞系正常表达B细胞抗原CD19和CD20，并且用编码红色荧光蛋白的转基因工程化。对两种不同的抗CD20抗体(利妥昔单抗和奥妥珠单抗(Obinutuzumab))进行测试，并与它们的相关同种型对照进行比较。在所有条件下，CAR-γδiT细胞都消除红色肿瘤细胞(CD19+)。(图11B)CAR-γδT细胞进行Raji细胞的ADCC，使用CRISPR基因编辑修饰Raji细胞以敲除(KO)编码CD19的基因，然后用编码绿色荧光蛋白的转基因工程化。对两种不同的抗CD20抗体(利妥昔单抗和奥妥珠单抗)进行测试，并与它们的相关同种型对照进行比较。在同种型对照抗体的存在下，绿色CD19KO肿瘤细胞不会被杀伤。利妥昔单抗或奥滨尤妥珠单抗的存在使CAR-γδiT细胞能经由ADCC杀伤CD19KO细胞。
具体实施方式
在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献每个整体援引加入本文。本说明书中已包括的文件、条例、材料、装置、文章等的讨论仅为了提供本发明的上下文的目的。这样的讨论不是承认任何或全部这些材料形成关于公开或要求保护的任何发明的现有技术的部分。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中示出的含义。
必须注意，当用于本文和所附权利要求时，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数指称。
除非另有说明，任何数值，如本文描述的浓度或浓度范围，应当理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则数值范围的使用明确包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括这类范围内的整数和值的分数。
除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够使用不超过常规实验确定本文描述的本申请的具体实施方案的许多等同物。本申请意图涵盖这类等同物。
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”，或者它们的任何其他变化，将理解为表示包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组，并且意图是非排他的或开放的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不必仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出或者不是这种组合物、混合物、过程、方法、物品或装置固有的其他元素。此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的或而不是排除性的或。例如，条件A或B由以下任一满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
如本文所用，多个引用元素之间的连接术语“和/或”理解为涵盖单独和组合选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项是指没有第二元素的第一元素的适用性。第二选项是指没有第一元素的第二元素的适用性。第三选项是指第一和第二元素一起的适用性。这些选项中的任一种均理解为落在含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的并存适用性也理解为落在含义内，因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用时，术语“由…组成(consistsof)”或者变化如“由…组成(consist of)”或“由…组成(consisting of)”表示包括任何列举的整数或整数的组，但是没有额外的整数或整数的组可以添加至指定的方法、结构或组合物。
如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用时，术语“基本上由…组成(consists essentially of)”或者变化如“基本上由…组成(consist essentially of)”或“基本上由…组成(consisting essentially of)”表示包括任何列举的整数或整数的组，并且任选地包括不实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新特性的任何列举的整数或整数的组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选人。
还应当理解当提到优选发明的组件的尺寸或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“一般”、“基本上”和类似术语表示所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员会理解的。至少，包括数值参数的这类参考会包括使用本领域中接受的数学和工业原理(例如，四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
在两种或更多种核酸或多肽序列(例如，CAR多肽和编码它们的CAR多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“相同性”是指如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量的，在比较和比对最大对应性时，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两种或更多种序列或子序列。
对于序列比较，通常将一种序列用作参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。
用于比较的序列的最佳比对可以这样进行，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过目视检查(一般参见，Current Protocols in MolecularBiology,F.M.Ausubel et al.,eds.,Current Protocols,a joint venture betweenGreene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995Supplement)(Ausubel))。
适合确定百分比序列相同性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短词来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词比对时，其匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称作邻近词评分阈值(上文Altschul et al.)。这些初始的邻近词命中用作开始搜索的种子以发现更长的包含它们的HSP。然后词命中沿每个序列的两个方向延伸，只要累积的比对评分可以增加。
对于核苷酸序列，利用参数M(匹配残基对的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，评分矩阵用来计算累积评分。在以下情况时每个方向的词命中延伸停止：累积的比对评分从其达到的最大值减少数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分变为0或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算百分比序列相同性，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小总概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
如下文所述，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽免疫交叉反应。因此，例如，当两个肽的不同之处仅为保守取代时，多肽通常与第二多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下互相杂交。
如本文所用，术语“分离的”是指生物组分(如核酸、肽、蛋白或细胞)已基本上从该组分天然存在的生物体的其他生物组分，即从其他染色体以及染色体外的DNA和RNA、蛋白、细胞以及组织中分离、产生或纯化。因此已“分离的”核酸、肽、蛋白和细胞包括通过标准纯化方法和本文所述纯化方法纯化的核酸、肽、蛋白和细胞。“分离的”核酸、肽、蛋白和细胞可以是组合物的一部分，并且如果组合物不是核酸、肽、蛋白或细胞的原生环境的一部分，其仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸。
术语“重组”是指一种生物分子：(1)它已从其天然存在的环境中移除；(2)它与自然界中发现此生物分子处的另一生物分子的完全或部分不相关联；(3)可操作地连接至自然界中没有连接至其的另一生物分子；或(4)在自然界中不存在。生物分子的实例包括，例如核酸或多肽。术语“重组”可以用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸或多肽或其类似物，或由异源系统生物合成的多核苷酸或多肽或其类似物，以及由此类重组核酸编码的蛋白和/或mRNA。
如本文所用，术语“多核苷酸”同义地称作“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，是单链和双链区域混合物的DNA，单链和双链RNA，以及是单链和双链区域混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子，其可以是单链或更典型地是双链或者单链和双链区域混合物。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA以及具有出于稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化(tritylated)碱基和不常见的碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA特征的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的核酸链，通常称作寡核苷酸。
“构建体”是指在体内或体外包含待递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。如本文所用，“载体”是指任何能够指导外来遗传物质递送或转移至靶细胞的核酸构建体，在那里它可以复制和/或表达。如本文所用的术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合或非整合的。载体的主要类型包括但不限于质粒、游离型载体(episomal vector)、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
“整合”是指将构建体的一种或多种核苷酸稳定地插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”是指在预先选择的位点或“整合位点”将构建体的核苷酸插入细胞的染色体或线粒体DNA中。如本文所用的术语“整合”进一步指涉及插入构建体的一种或多种外源序列或核苷酸的过程，在整合位点有或没有缺失内源序列或核苷酸。在插入位点有缺失的情况下，“整合”可以进一步包括用一个或多个插入的核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
如本文所用，术语“外源的”表示所指的分子或所指的活性被引入宿主细胞，或不是宿主细胞天然的。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传物质，如通过整合至宿主染色体或作为非染色体遗传物质如质粒来引入分子。因此，在关于编码核酸表达使用时，该术语是指将可表达形式的编码核酸引入细胞。术语“内源的”是指在宿主细胞中以其天然形式存在的所指的分子或活性。相似地，在关于编码核酸表达使用时，该术语是指细胞内天然含有的不是外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“所关注的基因”或“所关注的多核苷酸”是在适当调节序列的控制下转录为RNA并在某些情况下在体内翻译为多肽的DNA序列。所关注的基因或多核苷酸可以包括但不限于原核生物序列、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如，所关注的基因可以编码miRNA、shRNA、天然多肽(即自然界中发现的多肽)或其片段；变体多肽(即与天然多肽具有少于100％序列相同性的天然多肽突变体)或其片段；工程化多肽或肽片段、治疗性肽或多肽、成像标记、可选择标记等。
“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，从而使一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能RNA的表达时(即，编码序列或功能RNA受启动子的转录控制)，启动子与编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接至调节序列。
如本文所用的术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖将基因转录为RNA。该术语还涵盖将RNA翻译为一种或多种多肽，并且进一步包括所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的CAR可以在宿主细胞的细胞质内，进入细胞外环境如细胞培养物的生长培养基或锚定至细胞膜。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白”可以指由氨基酸构成的分子并且可以被本领域技术人员识别为蛋白。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”在本文中可互换地用来指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或支化的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
本文描述的肽序列是根据通常的惯例书写的，其中肽的N-末端区域在左侧，C-末端区域在右侧。尽管氨基酸的异构形式是已知的，但是除非另有明确表示，否则所代表的是氨基酸的L-型。
如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指已通过向细胞的总遗传物质添加DNA或RNA形式的外源遗传物质而进行基因修饰的免疫细胞，也称作免疫效应细胞。
诱导多能干细胞(IPSC)和免疫效应细胞
IPSC具有无限的自我更新能力。使用iPSC可以使细胞工程化以产生可控的修饰细胞的细胞库，这些修饰细胞可以扩增并分化为期望的免疫效应细胞，提供大量同质(homogeneous)的同种异体治疗产品。
本文提供基因工程化iPSC及其衍生细胞。本文提供的所选基因组修饰增强衍生细胞的治疗特性。通过基因组工程化在iPSC水平上将选择性模式的组合引入细胞后，衍生细胞在功能上得到改善，适合同种异体现成的(off-the-shelf)细胞疗法。这种方法在提供良好效力的同时，可以有助于减少CRS/GVHD介导的副作用并防止长期的自身免疫。
根据本发明，本发明的工程化iPSC能够分化成γδT细胞免疫效应细胞。如本文所用，术语“分化”是未特化的(“未定型的(uncommitted)”)或较少特化的细胞获得特化细胞特征的过程。特化细胞包括，例如，血细胞或肌肉细胞。分化或分化诱导的细胞是在细胞谱系内具有更特化的(“定型”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定型”是指在分化通路中进行到某一点的细胞，在正常情况下，它将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下，不可以分化为不同的细胞类型或恢复到较少分化的细胞类型。如本文所用，术语“多能”是指细胞正确地形成身体或体细胞或胚胎的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种多能干细胞，能够从外胚层、中胚层和内胚层三个胚层的每一层形成细胞。多能性是一种连续的发育潜能，从不能产生完整生物体的不完全或部分多能的细胞(例如，上胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或iPSC表示干细胞是由分化的成人、新生儿或胎儿细胞产生的，这些细胞已被诱导或改变或重编程为能够分化为所有三个胚层或真皮层的组织：中胚层、内胚层和外胚层。产生的iPSC并不是指在自然界中发现的细胞。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”是指增加细胞的效力或将细胞去分化为较少分化的状态的方法。例如，与非重编程状态的相同细胞相比，细胞潜力增加的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化为更多的细胞类型)。换句话说，重编程的细胞是与非重编程状态的相同细胞相比，处于较少分化状态的细胞。
术语“造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell)”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前体细胞”或“HPC”是指定型于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞。造血干细胞包括，例如，多能造血干细胞(成血细胞)、髓系祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴系祖细胞。造血干/祖细胞(HSC)是多能干细胞，它能产生所有的血细胞类型，包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，“CD34+造血祖细胞”是指在其表面表达CD34的HPC。
如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞。免疫应答包括，例如，促进免疫效应物应答。免疫细胞的实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，是指一种在胸腺中完成成熟并在免疫系统中具有各种作用的白细胞。T细胞可以具有的作用包括，例如，识别体内的特异性外来抗原以及激活和失活其他免疫细胞。T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或者来自培养的T细胞系的T细胞，例如，Jurkat、SupTl等，或者获得自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以是任何发育阶段的T细胞，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如，Thl和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、外周血单个核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚(naive)T细胞、调节T细胞、gamma delta T细胞(γδT细胞)等。其他类型的辅助性T细胞包括如Th3(Treg)、Thl7、Th9或Tfh细胞的细胞。其他类型的记忆T细胞包括如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tern细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞也可以指基因工程化T细胞，如修饰以表达T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞还可以从干细胞或祖细胞分化。
“CD4+T细胞”是指在其表面表达CD4并与细胞介导的免疫应答相关的T细胞子集。它们的特征在于刺激后的分泌谱，其可以包括如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10的细胞因子的分泌。“CD4”是55-kD的糖蛋白，最初定义为T-淋巴细胞上的分化抗原，但是也在包括单核细胞/巨噬细胞在内的其他细胞上发现。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并认为是MHC(主要组织相容性复合物)II类限制性免疫应答中的关联识别元件(associativerecognition element)。在T-淋巴细胞上，它们定义了辅助/诱导子集。
“CD8+T细胞”是指在其表面表达CD8、MHC I类限制性并作为细胞毒性T细胞发挥作用的T细胞子集。“CD8”分子是在胸腺细胞以及细胞毒性和抑制性T-淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制性相互作用中的关联识别元件。
可以通过使用任何已知的将重编程因子引入非多能细胞的方法，使用本领域已知的方法从外周血单个核细胞(PBMC)或T细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)亲代细胞系。例如，可以使用美国专利号8183038、8268620、8440461、9499786、10,865,381中描述的所谓的“Thompson因子”，或者使用美国专利号8,952,801中描述的Yamanaka因子，这些专利的完整公开援引加入本文。所述方法包括如之前美国专利号8,546,140、9,644,184、9,328,332和8,765,470中描述的基于游离型质粒方法，以及Malik,et al Methods Mol Biol.2013；997:23–33中描述的仙台(Sendai)病毒和其他方法，其完整公开援引加入本文。重编程因子可以是多核苷酸的形式，因此通过载体如逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离体(episome)和微环引入非多能细胞中。在特定实施方案中，通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各种其他实施方案中，通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，iPSC是克隆的iPSC或获得自iPSC池，并且通过在一个或多个所选位点进行一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入基因组编辑。在另一实施方案中，iPSC获得自具有抗原特异性和重构TCR基因的人T细胞(以下也称作“T-iPS”细胞或“T-iPSC”)，如美国专利号9206394和10787642所述，其援引加入本申请。图1A-C示出本申请中用于产生iPSC的示例性方法的示意图。
如本文所用，术语“遗传印迹”是指在源细胞或iPSC中有助于优先治疗属性(preferential therapeutic attribute)的遗传或表观遗传信息，并且可保留在源细胞衍生的iPSC和/或iPSC衍生的造血谱系细胞中。如本文所用，“源细胞”是可以用于通过重编程产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生的iPSC可以进一步分化为特定的细胞类型，包括任何造血谱系细胞。源细胞衍生的iPSC和由此分化的细胞有时根据上下文统称为“衍生的”或“衍生”细胞。例如，在整个申请中使用时，与它们获得自自然/天然来源如外周血、脐带血或其他供体组织的主要对应物相比，衍生效应细胞或者衍生T或“iT”细胞是由iPSC分化的细胞。如本文所用，将赋予优先治疗属性的遗传印迹纳入iPSC中，通过重编程供体、疾病或治疗反应特异性的所选源细胞，或者通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入iPSC。
在一个总的方面，本申请提供了一种诱导多能干细胞(iPSC)，其包含一种或多种编码重排γδTCR的多核苷酸，其中所述重排γδTCR支持iPSC分化为T细胞。
I.TCR
T细胞受体(TCR)是在T细胞表面发现的膜复合物，其特异性识别抗原。它是由alpha(α)和beta(β)链或者gamma(γ)和delta(δ)链组成的异二聚体。TCR的每个α、β、γ和δ链可以是糖蛋白。作为Ig超家族的成员，TCR具有Ig样结构域，其产生多样性的方式与抗体类似，例如，主要是通过体细胞V(D)J重组，对个体体细胞T细胞中DNA编码区段进行基因重组。在单个细胞中，T细胞受体基因座按δ、γ、β和α的顺序重排和表达。如果δ和γ重排都产生了功能链，细胞表达δ和γ。如果不是，细胞继而重排β和α基因座。然而，与抗体不同，TCR基因不会发生体细胞超突变。TCRα基因座含有可变(V)和连接(J)基因区段(Vβ和Jβ)，而TCRβ基因座除了Vα和Jα区段外，含有D基因区段。因此，α链由VJ重组产生，并且β链涉及VDJ重组而产生。类似地，TCRγ链涉及VJ重组而产生，并且TCRδ基因涉及VDJ重组而产生。TCR的基因区段的侧翼有相同重组信号序列，如同Ig基因区段，并且需要相同的RAG-1和RAG-2编码重组酶及TdT以用于体细胞重组。
如本文所用，“重排TCR”为重排TCR基因编码的TCR，所述重排TCR基因已经历物理重排，由此远距离的亚基因(sub-gene)融合在一起。人基因组具有四个独特TCR基因簇；alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)和delta(δ)，其经由重排TCR基因分别编码TCRα、β、γ和δ链。TCR的每条链具有可变区和恒定区。可变区含有三个高变区或互补决定区(CDR)和框架残基。CDR3主要负责识别加工的抗原。为了激活T细胞，TCR与含有CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链的CD3复合物形成分子复合物。
“α-βT细胞受体”或“αβTCR”为免疫应答所必需的抗原特异性T细胞受体，并且具有一条α(alpha)链和一条β(beta)链。αβTCR与肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的结合引发TCR-CD3胞内活化、大量信号传导分子募集以及分岔及整合信号传导路径，从而引起对于基因表达和T细胞生长以及功能获取重要的转录因子的移动。具有αβTCR的T细胞对经由人白细胞抗原(HLA)系统或复合物呈递的肽具有特定反应性。
“γ-δT细胞受体”或“γδTCR”为存在于γδT细胞的细胞表面上的具有一条γ(gamma)链及一条δ(delta)链的抗原特异性T细胞受体。γδT细胞未必需要肽表位的抗原加工及MHC呈递，并且它们可经非肽抗原激活。当感测到危险(感染或癌症)时，γδT细胞可以对配体应答。γδT细胞呈现先天细胞毒性功能和抗原呈递能力。γδT细胞经γδTCR配体(例如磷酸化抗原)与也称为NKG2D的活化型受体杀伤细胞凝集素样受体亚家族K成员1(KLRK1)的MHC相关配体，例如MHC I类多肽相关序列A(MICA)、MICB及UL16-结合蛋白(ULBP)家族的各种成员的联合的激活。
“HLA限制性抗原识别”或“HLA限制”指这样的事实，T细胞可以识别与自身主要组织相容性复合体分子结合的外来肽，但当其与特定HLA分子(例如HLA-A*0201)结合时，仅对抗原有应答。在T细胞发育期间，T细胞经过胸腺中的选择过程，以确保TCR不会识别呈递自身抗原的HLA分子。选择过程产生仅对某些HLA分子但不会对其他HLA分子(例如非限制性MHC分子)有应答的具有特异性TCR的发育的T细胞。
如本文所用，“公共TCR”或“信任(trusted)TCR”为包含出现在多个具有某种HLA类型的个体中的序列的TCR。这些序列如此频繁地出现在携带限制性HLA等位基因的人中，其已证实在自然界中与大量多种多样的HLA-I等位基因相容。因此，这些TCR无法识别非限制性HLA分子且不太可能参与移植物抗宿主疾病。公共TCR及其鉴别方法已由Choo et al.,JVirol.2014Sep；88(18):10613-23；Valkenburg et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2016Apr 19；113(16):4440-5；Sant et al.,Front Immunol.2018Jun 27；9:1453；Chenetal.,Cell Rep.2017Apr 18；19(3):569-583；J Biol Chem.2016Nov 18；291(47):24335-24351；和Song et al.,Nat Struct Mol Biol.2017Apr；24(4):395-406描述，其相关公开援引加入本文。
T细胞受体γ基因座(TRG、TCRG或TRG@)编码T细胞受体γ链。人TRG基因座由两个恒定区基因(TRGC)、五个连接区段(TRGJ)和至少14个可变γ基因(TRGV)构成。已知γ基因座的若干V基因不能编码蛋白并且视为假基因。在T细胞发育期间，重组事件发生在使V基因与J区段连接的DNA水平下，并且C基因随后通过RNA水平的剪接而连接。不同V基因区段与若干J区段的重组提供一系列的抗原识别。抗原识别中的额外多样性通过连接多样性获得，其由末端脱氧核苷酸基转移酶随机添加核苷酸产生。在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含选自以下的可变基因：TRGV2、TRGV3、TRGV4、TRGV5、TRGV8和TRGV9。
T细胞受体δ基因座(TRD、TCRD、TCRDV1或TRD@)编码T细胞受体δ链。在人中，δ基因座嵌入14号染色体上的α基因座内。人TRD基因座由一个恒定区基因(TRDC)、四个连接区段(TRDJ)以及仅三个真可变δ基因(TRDV)构成。在某些实施方案中，编码δTCR链的多核苷酸包含以下的可变基因：TRDV1、TRDV2和TRDV3。
在某些实施方案中，编码重排γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:83具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:83具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ IDNO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:88具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:88具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:90具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:90具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:91具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:91具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:93具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:93具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:95具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:95具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:97具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:97具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:98具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:98具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:99具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:99具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:100具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:100具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:101具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:101具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:102具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:102具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:103具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:103具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:104具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:104具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:105具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:105具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:106具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:106具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:107具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:107具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:108具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:108具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，编码重排γTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:148具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:148具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成，并且编码δTCR链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:149具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列或者由与SEQ ID NO:149具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR3
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排TCR包含：γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，重排γδTCR包含：γTCR链，其包含与SEQ ID NO:133具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ ID NO:134具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，重排γδTCR包含：γTCR链，其包含与SEQ ID NO:135具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ ID NO:136具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列
在某些实施方案中，重排γδTCR包含：γTCR链，其包含与SEQ ID NO:150具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ ID NO:151具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，重排γδTCR对于γδT细胞是内源的。
在某些实施方案中，重排γδTCR是重组的。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR被一种或多种磷酸化抗原激活。如本文所用，“磷酸化抗原”指与经细胞释放作为甲羟戊酸生物合成路径的副产物的磷酸化代谢物相同的磷酸化化合物。磷酸化抗原的实例包括但不限于异戊烯焦磷酸盐(isopentenylpyrophosphate,IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate,HMBPP)或化学相似分子。磷酸化抗原可以作为代谢过程产物天然存在于细胞中，或者磷酸化抗原可以由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平。磷酸抗原也可以是合成化合物。“双膦酸盐化学物质”为具有连接至两个膦酸根基团的共同偕碳(common germinal)原子的药物。两个膦酸根基团赋予这些化合物对诸如钙的二价离子的高亲和力。诸如帕米膦酸盐(pamidronate)和唑来膦酸的氨基-双膦酸盐抑制甲羟戊酸生物合成路径中的酶法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphonate,FPP)合成酶，从而诱导FPP合成酶的底物IPP及DMAPP的积累(van Beek et al.,Biochem Biophys Res Commun,1999；255,491-494)。大部分对双膦酸盐有反应的γδT细胞携带基因重排，从而引起对Vγ9可变基因[TRGV9]和Vδ2可变基因[TRDV2]的利用。所得的γ链和δ链TCR蛋白形成Vγ9/Vδ2TCR异二聚体。并非所有双膦酸盐反应性γδT细胞都利用Vγ9/Vδ2TCR对。也可利用其他TCR可变基因，然而Vγ9/Vδ2是最常见且呈现具有可预测的生物活性的可追踪的表型。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR被选自异戊烯焦磷酸盐(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐[HMBPP]或化学相似分子的磷酸化抗原激活。在一些实施方案中，磷酸化抗原可以作为代谢过程产物天然存在于细胞中，或者磷酸化抗原可以由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平。在某些实施方案中，双膦酸盐化学物质为氨基-双膦酸盐，优选地，氨基-双膦酸盐为唑来膦酸或其盐。
可以需要诸如BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的嗜乳脂蛋白(BTN)蛋白家族的某些成员来通过磷酸化抗原刺激Vγ9Vδ2T细胞(Harly et al.,Blood(2012)120(11):2269–79；Vavassori et al.,Nat.Immunol.(2013)14(9):908–16)。在某些实施方案中，磷酸化抗原的活性可以是通过与γδTCR的直接相互作用，或者磷酸化抗原的活性可以是通过与嗜乳脂蛋白(BTN)蛋白BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的相互作用。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR不被磷酸化抗原激活。
在某些实施方案中，TCR识别的特异性抗原是未知的或者仍需要鉴定的。
在某些实施方案中，在有丝分裂刺激后，重组重排γδTCR使分化的T细胞扩增。如本文所用，“有丝分裂刺激”或“有丝分裂活化”指通过暴露于有丝分裂原而刺激细胞进行增殖的过程。可以用于刺激γδT细胞的有丝分裂原的实例包括但不限于靶向表面蛋白(CD3、CD28、CD27或其他共刺激分子)的抗体、白介素-2(IL-2)、IL-15、IL-7、IL-21、IL-12、IL-18、植物凝集素(PHA)、刀豆球蛋白A(conA)和凝集素。在某些实施方案中，γδT细胞刺激剂可以与例如有丝分裂细胞因子如IL-2的通用T细胞有丝分裂原组合使用。在某些实施方案中，γδTCR使分化的T细胞在取决于TCR的有丝分裂刺激后扩增。在某些实施方案中，在有丝分裂刺激后，γδTCR使分化的T细胞的扩增相比于不具有重排TCR基因座的T细胞增加。
在某些实施方案中，iPSC从全外周血单个核细胞(PBMC)重编程。在某些实施方案中，通过在氨基-双膦酸盐及白介素2(IL-2)的存在下，使PBMC扩增，然后将重编程转录因子并入外周血细胞中以产生iPSC来制备iPSC。
II.嵌合抗原受体(CAR)表达
根据本申请的实施方案，iPSC细胞或其衍生细胞包含(i)一种或多种编码重组重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸；和(ii)编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，如靶向肿瘤抗原的CAR。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指一种重组多肽，至少包含与抗原或靶标特异性结合的胞外域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。CAR的胞外域与靶细胞表面的靶抗原接触，导致CAR的聚集并向含有CAR的细胞传递激活刺激。CAR重定向免疫效应细胞的特异性，并且以不依赖于主要组织相容性(MHC)的方式触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用和/或介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子的产生。
如本文所用，术语“信号肽”是指新生CAR蛋白氨基末端(N-末端)的前导序列，其共翻译地或翻译后地将新生蛋白引导至内质网并且引导随后的表面表达。
如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外域”或“胞外配体结合结构域”是指位于细胞膜外且能够与抗原、靶标或配体结合的CAR部分。
如本文所用，术语“铰链区”或“铰链结构域”是指连接CAR蛋白的两个相邻结构域，即CAR蛋白的胞外域和跨膜结构域的CAR部分。
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指延伸跨越细胞膜并将CAR锚定在细胞膜上的CAR部分。
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”、“细胞质信号传导结构域”或“胞内信号传导结构域”是指位于细胞膜内且能够转导效应信号的CAR部分。
如本文所用，术语“刺激分子”是指免疫细胞(例如，T细胞)表达的分子，其为免疫细胞信号传导通路的至少一些方面提供初级的细胞质信号传导序列，以刺激的方式调节受体的初级激活。刺激分子包含两类不同的细胞质信号传导序列，启动抗原依赖性初级激活的那些(称作“初级信号传导结构域”)，以及以不依赖于抗原的方式提供次级共刺激信号的那些(称作“共刺激信号传导结构域”)。
在某些实施方案中，胞外域包含抗原结合结构域和/或抗原结合片段。例如，抗原结合片段可以是特异性结合肿瘤抗原的抗体或其抗原结合片段。本申请的抗原结合片段具有期望的功能特性，包括但不限于与肿瘤抗原的高亲和力结合。
如本文所用，术语“抗体”在广义上使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，包括单克隆或多克隆的人、人源化、复合和嵌合抗体以及抗体片段。一般来说，抗体是表现出对特定抗原的结合特异性的蛋白或肽链。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为五大类(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。将IgA和IgG进一步分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类(sub-classified)。因此，本申请的抗体可以是五大类或相应亚类中的任何一种。优选地，本申请的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物种的抗体轻链可以分为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本申请的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方案，本申请的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域，抗体含有抗原结合区，由轻链可变区和重链可变区组成，每个可变区含有三个结构域(即，互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域或者称作LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区结构域或者称作HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含其他具有不同抗原特异性抗体的抗体(例如，与特定肿瘤抗原特异性结合的分离的抗体基本上不含不与肿瘤抗原结合的抗体)。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指获得自基本上同质的抗体群体的抗体，即包含该群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的突变。本申请的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由杂交瘤产生，杂交瘤包括获得自转基因非人动物如转基因小鼠或大鼠的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如，双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体(diabody))、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdAb)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化(camelized)单域抗体、微型抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、轻链可变结构域(VL)、骆驼抗体的可变结构域(VHH)，或者任何其他与抗原结合但不含完整抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原结合。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，由约15至约20个氨基酸的短肽(例如，接头肽)连接。
如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域的常规单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或者仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或者使用本领域已知的任何技术制备的具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这个定义包括完整或全长抗体，其片段，和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指一种非人抗体，将其修饰以增加与人抗体的序列同源性，从而保留抗体的抗原结合特性，但是降低其在人体中的抗原性。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指一种抗体，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种。轻链和重链的可变区通常对应于源自一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，具有期望的特异性、亲和力和能力，而恒定区对应于源自另一种哺乳动物(例如，人)的抗体的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多种免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中多种免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且多种免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原上，例如，相同蛋白(或多聚体蛋白的亚基)。在一实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原上，例如，不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)。在一实施方案中，多特异性抗体包含第三免疫球蛋白可变结构域、第四免疫球蛋白可变结构域或第五免疫球蛋白可变结构域。在一实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一实施方案中，第一和表位第二表位在相同抗原上，例如，相同蛋白(或多聚体蛋白的亚基)。在一实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原上，例如，不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的一半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的一半抗体或其片段。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的VHH，以及对第二表位具有结合特异性的VHH。
如本文所用，“与肿瘤抗原特异性结合”的抗原结合结构域或抗原结合片段是指结合肿瘤抗原的抗原结合结构域或抗原结合片段，其KD为1×10-7M或更小，优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小，1×10-9M或更小，5×10-10M或更小，或者1×10-10M或更小。术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka的比值(即，Kd/Ka)获得，并以摩尔浓度(M)表示。鉴于本公开，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，可以通过使用表面等离子共振，如通过使用生物传感器系统，例如，系统，或通过使用生物膜干涉技术，如Octet RED96系统，确定抗原结合结构域或抗原结合片段的KD。
抗原结合结构域或抗原结合片段的KD值越小，该抗原结合结构域或抗原结合片段与靶抗原结合的亲和力越高。
在各种实施方案中，适合用于本公开的CAR的抗体或抗体片段包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、多肽-Fc融合物、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、掩蔽抗体(masked antibody)(例如，)、小模块免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceutical)("SMIPsTM")、胞内抗体、微型抗体、单域抗体可变结构域、纳米抗体、VHH、双抗体、串联双抗体/>抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗原特异性TCR的抗Id抗体)以及以上任何一种的表位结合片段。抗体和/或抗体片段可以衍生自小鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼抗体可变结构域和人源化版本、鲨鱼抗体可变结构域和人源化版本以及骆驼化抗体可变结构域。
在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、VHH、VNAR、单域抗体(sdAb)或纳米抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、重链可变区、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、三抗体或十抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是scFv片段。
在某些实施方案中，CAR的抗原结合结构域是单域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体，是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段，包括在驼科动物中发现的重链抗体；所谓的VHH片段。(Hamers-Casterman et al.,Nature,363,446448(1993)；还参见美国专利第5,759,808号；美国专利第5,800,988号；美国专利第5,840,526号和美国专利第5,874,541号，其援引加入本文)。软骨鱼类也有重链抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，从中可以获得称为VNAR片段的单域抗体，并且这些抗体可用于本发明。一种替代方法是将来自人或小鼠的普通免疫球蛋白G(IgG)的二聚可变结构域分成单体。虽然目前对单域抗体的研究大多基于重链可变结构域，但已证明衍生自轻链的纳米抗体也特异性地结合目标表位，因此也可加以使用。
表现出相似功能特征，如对靶生物分子的高亲和力和特异性结合的免疫球蛋白结构域的替代支架，也可以用于本公开的CAR。已表明这类支架能产生具有改进特征的分子，如更大的稳定性或降低的免疫原性。可以用于本公开的CAR的替代支架的非限制性实例包括工程化的、生腱蛋白(tenascin)衍生的生腱蛋白III型结构域(例如，CentyrinTM)；工程化的、γ-B晶体蛋白衍生的支架或工程化的、泛素衍生的支架(例如，Affilins)；工程化的、纤连蛋白衍生的第十纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(例如，单抗体、AdNectinsTM或AdNexinsTM)；工程化的、含有锚蛋白重复基序的多肽(例如，DARPinsTM)；工程化的、低密度脂蛋白受体衍生的A结构域(LDLR-A)(例如，AvimersTM)；脂质运载蛋白(例如，anticalins)；工程化的、蛋白酶抑制剂衍生的Kunitz结构域(例如，EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2)；工程化的、A蛋白衍生的Z结构域(AffibodiesTM)；Sac7d衍生的多肽(例如，或affitins)；工程化的、Fyn衍生的SH2结构域(例如，/>)；CTLD3(例如，Tetranectin)；硫氧还蛋白(例如，肽适配体)；/>β-三明治(例如，iMab)；小蛋白；C型凝集素样结构域支架；工程化的抗体模拟物；以及保留其结合功能性的前述的任何基因操纵的对应物(/>A,Pluckthun A,J Mol Biol 305:989-1010(2001)；Xu L etal.,Chem Biol 9:933-42(2002)；Wikman M et al.,Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004)；Binz H et al.,Nat Biolechnol 23:1257-68(2005)；Hey T et al.,TrendsBiotechnol 23:514-522(2005)；Holliger P,Hudson P,Nat Biotechnol 23:1126-36(2005)；Gill D,Damle N,Curr Opin Biotech 17:653-8(2006)；Koide A,Koide S,Methods Mol Biol 352:95-109(2007)；Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304；Byla P et al.,J Biol Chem285:12096(2010)；Zoller F et al.,Molecules16:2467-85(2011)，其中每个整体援引加入本文)。
在一些实施方案中，替代支架是Affilin或Centyrin。
在一些实施方案中，本公开的CAR的第一多肽包含前导序列。前导序列可以位于胞外标签结合结构域的N-末端。在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中，前导序列可以任选地从胞外标签结合结构域切割。本领域技术人员已知的各种前导序列中的任何一种都可以用作前导序列。可以由其衍生前导序列的肽的非限制性实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)、FcεR、人免疫球蛋白(IgG)重链(HC)可变区、CD8α或T细胞分泌的任何其他蛋白。在各种实施方案中，前导序列与T细胞的分泌通路相容。在某些实施方案中，前导序列衍生自人免疫球蛋白重链(HC)。
在一些实施方案中，前导序列衍生自GMCSFR。在一实施方案中，GMCSFR前导序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:1具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，本公开的CAR的第一多肽包含跨膜结构域，符合读框(inframe)地融合在胞外标签结合结构域和细胞质结构域之间。
跨膜结构域可以衍生自贡献胞外标签结合结构域的蛋白，贡献信号传导或共同信号传导结构域的蛋白，或者完全不同的蛋白。在某些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代、缺失或插入来选择或修饰，以使与CAR复合物其他成员的相互作用最小化。在某些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代、缺失或插入来选择或修饰，以避免与跨膜结构域自然相关的蛋白结合。在某些实施方案中，跨膜结构域包括额外的氨基酸，以允许连接至跨膜结构域的结构域之间的柔性和/或最佳距离。
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本公开中特别可用的跨膜结构域的非限制性实例可以衍生自(即至少包含跨膜区)T细胞受体(TCR)的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下其主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。例如，在合成跨膜结构域的每个末端可以发现苯丙氨酸、色氨酸和/或缬氨酸的三联体。
在一些实施方案中，期望利用ζ、η或FcεR1γ链的跨膜结构域，其含有能够二硫键键合的半胱氨酸残基，这样所得的嵌合蛋白能够与自身或者与ζ,、η或FcεR1γ的未修饰版本或者相关蛋白形成二硫键连接的二聚体。在某些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域以避免这类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，从而使与受体复合物其他成员的相互作用最小化。在其他情况下，期望采用ζ、η或FcεR1γ和-β，MB1(Igα.)，B29或CD3-γ、ζ或η的跨膜结构域，以便保持与受体复合物其他成员的物理联系。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8或CD28。在一实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。在一实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:24具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，本公开的CAR的第一多肽包含胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区，其中结合结构域、接头和跨膜结构域相互符合读框。
如本文所用的术语“间隔区”一般是指能够将结合结构域连接至跨膜结构域的任何寡肽或多肽。间隔区可以用于为结合结构域提供更多柔性和可接近性。间隔区可以包含多达300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，并且最优选25-50个氨基酸。间隔区可以衍生自天然存在的分子的全部或部分，如衍生自CD8、CD4或CD28的全部或部分胞外区，或者衍生自抗体恒定区的全部或部分。或者，间隔区可以是与天然存在的间隔区序列相对应的合成序列，或者可以是完全合成的间隔区序列。根据本公开可以使用的间隔区的非限制性实例包括人CD8α链的一部分、CD28的部分胞外域、FcyRllla受体、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Ig铰链或其功能片段。在一些实施方案中，将额外的连接氨基酸添加至间隔区以确保抗原结合结构域是距离跨膜结构域的最佳距离。在一些实施方案中，当间隔衍生自Ig时，可以将间隔突变以防止Fc受体结合。
在一些实施方案中，间隔区包含铰链结构域。铰链结构域可以衍生自CD8α、CD28或免疫球蛋白(IgG)。例如，IgG铰链可以来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其嵌合体。
在某些实施方案中，铰链结构域包含免疫球蛋白IgG铰链或其功能片段。在某些实施方案中，IgG铰链来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其嵌合体。在某些实施方案中，铰链区包含免疫球蛋白的CH1、CH2、CH3和/或铰链区。在某些实施方案中，铰链区包含免疫球蛋白的核心铰链区。术语“核心铰链”可以与术语“短铰链”(也称为“SH”)互换使用。合适的铰链结构域的非限制性实例是核心免疫球蛋白铰链区，包括来自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:57)，来自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:58)，来自IgG3的ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO:59)和来自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:60)(还参见Wypych et al.,JBC 2008 283(23):16194-16205，为了所有目的，其整体援引加入本文)。在某些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白铰链的片段。
在一些实施方案中，铰链结构域衍生自CD8或CD28。在一实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。在一实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:22具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，跨膜结构域和/或铰链结构域衍生自CD8或CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域和铰链结构域都衍生自CD8。在一些实施方案中，跨膜结构域和铰链结构域都衍生自CD28。
在某些方面，本公开的CAR的第一多肽包含细胞质结构域，其包含至少一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质结构域还包含一个或多个共刺激信号传导结构域。
细胞质结构域负责CAR所处的宿主细胞(例如，T细胞)的至少一种正常效应功能的激活。术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞行使特化功能的蛋白部分。虽然通常整个信号传导结构域是存在的，但是在许多情况下不必使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要它转导效应功能信号，这种截短部分可以用于代替完整链。因此术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应功能信号的信号传导结构域的任何截短部分。
本公开的CAR中可以使用的信号传导结构域的非限制性实例包括，例如，衍生自DAP10、DAP12、Fcε受体Iγ链(FCER1G)、FcRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD2、CD5、CD22、CD226、CD66d、CD79A和CD79B的信号传导结构域。
在一些实施方案中，细胞质结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在一实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:6具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，细胞质结构域进一步包含一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域衍生自CD28、41BB、IL2Rb、CD40、OX40(CD134)、CD80、CD86、CD27、ICOS、NKG2D、DAP10、DAP12、2B4(CD244)、BTLA、CD30、GITR、CD226、CD79A和HVEM。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自41BB。在一实施方案中，41BB共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:8具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自IL2Rb。在一实施方案中，IL2Rb共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:9具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自CD40。在一实施方案中，CD40共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:10具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自OX40。在一实施方案中，OX40共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:11具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自CD80。在一实施方案中，CD80共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:12具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自CD86。在一实施方案中，CD86共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:13具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自CD27。在一实施方案中，CD27共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:14具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自ICOS。在一实施方案中，ICOS共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:15具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自NKG2D。在一实施方案中，NKG2D共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:16具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自DAP10。在一实施方案中，DAP10共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:17具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自DAP12。在一实施方案中，DAP12共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ IDNO:18具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一实施方案中，共刺激信号传导结构域衍生自2B4(CD244)。在一实施方案中，2B4(CD244)共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:19具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，本公开的CAR包含一个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，本公开的CAR包含两个或更多个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，本公开的CAR包含2个、3个、4个、5个、6个或更多个共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按照任何顺序放置。在一些实施方案中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的上游。在一些实施方案中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的下游。在包括两个或更多个共刺激结构域的情况下，共刺激信号传导结构域的顺序可以调换。
表1中提供了非限制性的示例性CAR区和序列。
表1
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在一些实施方案中，第二多肽的抗原结合结构域与抗原结合。第二多肽的抗原结合结构域可以与一个以上的抗原或抗原中一个以上的表位结合。例如，第二多肽的抗原结合结构域可以与2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个抗原结合。作为另一实例，第二多肽的抗原结合结构域可以与同一抗原中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个表位结合。
抗原结合结构域的选择可以取决于定义靶细胞表面的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域来识别与特定疾病状态相关的靶细胞上作为细胞表面标志物的抗原。在某些实施方案中，通过工程化与(例如，肿瘤细胞上的)抗原特异性结合的期望抗原结合结构域，可以对本公开的CAR进行基因修饰以靶向所关注的肿瘤抗原。可以作为本公开的CAR中抗原结合结构域的靶标的细胞表面标志物的非限制性实例包括与肿瘤细胞或自身免疫性疾病相关的那些。
在一些实施方案中，抗原结合结构域与至少一种肿瘤抗原或自身免疫抗原结合。
在一些实施方案中，抗原结合结构域与至少一种肿瘤抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域与两种或更多种肿瘤抗原结合。在一些实施方案中，两种或更多种肿瘤抗原与同一肿瘤相关。在一些实施方案中，两种或更多种肿瘤抗原与不同肿瘤相关。
在一些实施方案中，抗原结合结构域与至少一种自身免疫抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域与两种或更多种自身免疫抗原结合。在一些实施方案中，两种或更多种自身免疫抗原与同一自身免疫性疾病相关。在一些实施方案中，两种或更多种自身免疫抗原与不同自身免疫性疾病相关。
在一些实施方案中，肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液系统恶性肿瘤相关。与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括HER2、EGFRvIII、EGFR、CD133、PDGFRA、FGFR1、FGFR3、MET、CD70、ROBO1和IL13Rα2。与卵巢癌相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括FOLR1、FSHR、MUC16、MUC1、间皮素、CA125、EpCAM、EGFR、PDGFRα、Nectin-4和B7H4。与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括GD2、MUC1、间皮素、HER2和EGFR。与肝癌相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括紧密连接蛋白18.2、GPC-3、EpCAM、cMET和AFP。与血液系统恶性肿瘤相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括CD22、CD79(CD79a和/或CD79b)、BCMA、GPRC5D、SLAM F7、CD33、CLL1、CD123和CD70。与膀胱癌相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括Nectin-4和SLITRK6。
抗原结合结构域可能靶向的抗原的其他实例包括但不限于甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、碳酸酐酶EX、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD123、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-I)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管生成标志物、癌基因标志物或癌基因产物。
在一实施方案中，抗原结合结构域靶向的抗原是CD19。在一实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19 scFv。在一实施方案中，抗CD19 scFv包含重链可变区(VH)，重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。在一实施方案中，抗CD19 scFv包含轻链可变区(VL)，轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:4具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。在一实施方案中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:7具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在一些实施方案中，抗原与自身免疫性疾病或病症相关。这类抗原可以衍生自细胞受体和产生“自我(self)”定向抗体的细胞。在一些实施方案中，抗原与自身免疫性疾病或病症相关，如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、干燥综合征(syndrome)、系统性红斑狼疮、结节病、1型糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、重症肌无力、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、吉兰–巴雷综合征(Guillain-Barresyndrome)、克罗恩病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，本文公开的CAR可以靶向的自身免疫抗原包括但不限于血小板抗原、髓鞘蛋白抗原、snRNP中的Sm抗原、胰岛细胞抗原、类风湿因子和抗瓜氨酸蛋白。瓜氨酸蛋白和肽如CCP-1、CCP-2(环瓜氨酸肽)，纤维蛋白原，纤维蛋白，波形蛋白，聚角蛋白微丝蛋白(fillaggrin)，胶原蛋白I和II肽，α-烯醇化酶，翻译起始因子4G1，核周因子，角蛋白，Sa(细胞骨架蛋白波形蛋白)，关节软骨的组分如胶原蛋白II、IX和XI，循环血清蛋白如RF(IgG、IgM)，纤维蛋白原，血纤维蛋白溶酶原，铁蛋白，核组分如RA33/hnRNP A2，Sm，真核翻译延长因子1α1，应激蛋白如HSP-65、-70、-90，BiP，炎症/免疫因子如B7-H1、IL-1α和IL-8，酶如钙蛋白酶抑制蛋白，α-烯醇化酶，醛缩酶-A，二肽基肽酶，骨桥蛋白，葡萄糖-6-磷酸异构酶，受体如脂皮质蛋白1，嗜中性粒细胞核蛋白如乳铁蛋白和25-35kD核蛋白，颗粒蛋白如杀菌通透性增加蛋白(BPI)，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，髓过氧化物酶，蛋白酶3，血小板抗原，髓鞘蛋白抗原，胰岛细胞抗原，类风湿因子，组蛋白，核糖体P蛋白，心磷脂，波形蛋白，核酸如dsDNA、ssDNA和RNA，核糖核颗粒和蛋白如Sm抗原(包括但不限于SmD's和SmB′/B)，U1RNP，A2/B1 hnRNP，Ro(SSA)和La(SSB)抗原。
在各种实施方案中，本公开的CAR中使用的scFv片段可以包括VH和VL结构域之间的接头。接头可以是肽接头，可以包括任何天然存在的氨基酸。可以包括在接头中的示例性氨基酸是Gly、Ser Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。接头的长度应当足以连接VH和VL，使它们相对于彼此形成正确构象，从而保持期望的活性，如与抗原结合。接头可以长约5-50个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约10-40个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约10-35个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约10-30个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约10-25个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约10-20个氨基酸。在一些实施方案中，接头长约15-20个氨基酸。可以使用的示例性接头是富含Gly的接头、含有Gly和Ser的接头、含有Gly和Ala的接头、含有Ala和Ser的接头以及其他柔性接头。
在一实施方案中，接头是Whitlow接头。在一实施方案中，Whitlow接头包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:3具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。在另一实施方案中，接头是(G4S)3接头。在一实施方案中，(G4S)3接头包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:25具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
其他接头序列可以包括衍生自任何免疫球蛋白重链或轻链同种型的免疫球蛋白铰链区、CL或CH1的一部分。可以使用的示例性接头包括表1中SEQ ID NO:26-56中的任一种。额外的接头描述于，例如，国际专利公开号WO2019/060695中，其整体援引加入本文。
III.人工细胞死亡多肽安全开关
根据本申请的某些实施方案，iPSC细胞或其衍生细胞包含编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸。
如本文所用，术语“人工细胞死亡多肽”是指设计为防止细胞疗法的潜在毒性或其他不利影响的工程化蛋白。人工细胞死亡多肽可以介导诱导细胞凋亡、抑制蛋白合成、DNA复制、生长阻滞、转录和转录后遗传调控和/或抗体介导的消耗。在某些情况下，通过外源分子，例如抗体、抗病毒药物或放射性同位素缀合物药物，激活人工细胞死亡多肽，当激活时，触发治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽的作用机制是代谢的、二聚化诱导的或者治疗性单克隆抗体介导的。
在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽是失活的细胞表面受体，受体包含抗体特异性识别的表位，特别是单克隆抗体，这里也称作单克隆抗体特异性表位。当由iPSC或其衍生细胞表达时，失活的细胞表面受体是无信号传导活性或明显受损的，但是仍然可以被抗体特异性识别。抗体与失活的细胞表面受体的特异性结合可以通过ADCC和/或ADCP机制消除iPSC或其衍生细胞，以及用带有毒素或放射性核素的抗体药物缀合物直接杀伤。
在某些实施方案中，失活的细胞表面受体包含表位，其选自以下抗体的特异性识别的表位，包括但不限于替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、达雷妥尤单抗或乌司奴单抗。
表皮生长因子受体，也称作EGFR、ErbB1和HER1，是胞外配体的表皮生长因子家族成员的细胞表面受体。如本文所用，“截短的EGFR”、“tEGFR”、“短EGFR”或“sEGFR”是指缺少EGFR的EGF结合结构域和胞内信号传导结构域的非活性EGFR变体。示例性tEGFR变体含有结构域2的残基322-333、结构域3和4的全部以及含有西妥昔单抗结合表位的天然EGFR序列的跨膜结构域。tEGFR变体在细胞表面上的表达使得能够根据需要通过与tEGFR特异性结合的抗体，如西妥昔单抗来消除细胞。由于不存在EGF结合结构域和胞内信号传导结构域，tEGFR在被iPSC或其衍生细胞表达时没有活性。
本申请的示例性失活细胞表面受体包含tEGFR变体。在某些实施方案中，当细胞与抗EGFR抗体接触时，失活的细胞表面受体在表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞中的表达诱导工程化免疫细胞的细胞自杀。使用失活的细胞表面受体的方法在WO2019/070856、WO2019/023396、WO2018/058002中描述，其公开内容援引加入本文。例如，可以向先前已接受本公开的工程化免疫细胞的受试者给药有效量的能在受试者体内消除先前给药的工程化免疫细胞的抗EGFR抗体，工程化免疫细胞包含编码包含tEGFR变体的失活细胞表面受体的异源多核苷酸。
在某些实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗、马妥珠单抗、耐昔妥珠单抗或帕尼单抗，优选抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
在某些实施方案中，tEGFR变体包含与SEQ ID NO:71至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ IDNO:71至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在一些实施方案中，失活的细胞表面受体包含CD79b的一个或多个表位，如维泊妥珠单抗特异性识别的表位。在某些实施方案中，CD79b表位包含与SEQ ID NO:78至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:78至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，失活的细胞表面受体包含CD20的一个或多个表位，如利妥昔单抗特异性识别的表位。在某些实施方案中，CD20表位包含与SEQ ID NO:80至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:80至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，失活的细胞表面受体包含Her 2受体或ErbB的一个或多个表位，如曲妥珠单抗特异性识别的表位。在某些实施方案中，单克隆抗体特异性表位包含与SEQ ID NO:82至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:82至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在一些实施方案中，失活的细胞表面受体进一步包含细胞因子。
在一些实施方案中，失活的细胞表面受体进一步包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域衍生自CD8。在一实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在某些实施方案中，失活的细胞表面受体进一步包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8。在一实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或者其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列相同性。
在某些实施方案中，失活的细胞表面受体在其胞外域、跨膜区和细胞质结构域中包含一个或多个由抗体特异性识别的表位。在一些实施方案中，失活的细胞表面受体进一步包含表位和跨膜区之间的铰链区。在一些实施方案中，失活的细胞表面受体包含一个以上由抗体特异性识别的表位，表位可以具有相同或不同的氨基酸序列，并且表位可以经由肽接头连接至一起，如具有(GGGGS)n序列的柔性肽接头，其中n是1-8的整数(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，失活的细胞表面受体进一步包含细胞因子。在某些实施方案中，细胞因子在失活的细胞表面受体的细胞质结构域中。优选地，细胞因子直接地或间接地(经由自体蛋白酶肽序列，如本文描述的那些)可操作地连接至抗体特异性识别的表位。在一些实施方案中，细胞因子经由自体蛋白酶肽序列连接至跨膜区，间接连接至表位。
在其他实施方案中，人工细胞死亡多肽为抗病毒药物识别的病毒酶。在某些实施方案中，病毒酶为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。在某些实施方案中，HSV-tk包含与SEQID NO:143至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:143至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:143的氨基酸序列。这种酶使无毒前药更昔洛韦(ganciclovir)磷酸化，其随后经内源激酶磷酸化变为GCV-三磷酸盐(GCV-triphosphate)，从而在并入DNA中时引起链终止及单链断裂，从而杀伤分裂细胞。在某些实施方案中，当细胞与抗病毒药物接触时，病毒酶在表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞中的表达诱导工程化免疫细胞的细胞死亡。在某些实施方案中，抗病毒药物为更昔洛韦。
在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含小分子化合物靶向的抗原。在某些实施方案中，抗原为如国际专利申请WO2015143029A1和WO2018187791A1所描述的截短的前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽，其公开整体援引加入本申请。在某些实施方案中，前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽包含与SEQ ID NO:144至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:144至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，优选SEQ ID NO:144的氨基酸序列。在某些实施方案中，当细胞与经由小肽结合PSMA的放射性同位素缀合物药物接触时，截短的PSMA在表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞中的表达诱导工程化免疫细胞的细胞死亡。PSMA靶向化合物描述于WO2010/108125，其公开援引加入本文。
在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶经由接头融合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。在某些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含与SEQ ID NO:145至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:145的氨基酸序列。
在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含通过自体蛋白酶肽序列可操作地连接的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。在某些实施方案中，自体蛋白酶肽为明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2A(T2A)肽。在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含与SEQ ID NO:146至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
在某些实施方案中，人工多肽包含通过自体蛋白酶肽序列可操作地连接的前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽和分化簇24(CD24)多肽。在某些实施方案中，自体蛋白酶肽为明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)肽。在某些实施方案中，人工细胞死亡多肽包含与SEQ ID NO:147至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:147的氨基酸序列。
IV.HLA表达
在一方面，可将MHC I和/或MHC II敲除和/或敲低并入细胞以用于“同种异体”细胞疗法，其中细胞获得自受试者，经修饰以敲除或敲低，例如破坏B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因表达，然后返回至不同受试者。如本文所描述敲除或敲低B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因基因可以：(1)防止GvH反应；(2)防止HvG反应；和/或(3)提高T细胞安全性和效力。因此，在某些实施方案中，本发明所公开的发明包含在T细胞中独立地敲除和/或敲低选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的一个或多个基因。在某些实施方案中，本发明所公开的方法包括在T细胞中独立地敲除和/或敲低选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的两个基因，特别是B2M和CIITA，以实现I类和II类HLA破坏。在某些实施方案中，可以通过引入编码诸如非经典HLA I类蛋白(例如HLA-E和HLA-G)的一种或多种免疫逃逸相关蛋白的外源多核苷酸进一步修饰本申请的iPSC或其衍生细胞。特别地，B2M基因的破坏消除所有MHC I类分子的表面表达，使细胞容易被NK细胞通过“丧失自我(missingself)”反应裂解。外源HLA-E表达可以导致对NK介导的裂解的抵抗(Gornalusse et al.,Nat Biotechnol.2017；35(8):765–772)。
在某些实施方案中，iPSC或其衍生细胞包含编码人白细胞抗原E(HLA-E)和人白细胞抗原G(HLA-G)中至少一种的外源多肽。在一特定实施方案中，HLA-E包含与SEQ ID NO:65至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一特定实施方案中，HLA-G包含与SEQ IDNO:68至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在某些实施方案中，外源多核苷酸编码多肽，所述多肽包含可操作地连接至成熟B2M蛋白的信号肽，成熟B2M蛋白经由接头融合至HLA-E。在一特定实施方案中，外源多肽包含至少与SEQ ID NO:66至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在其他实施方案中，外源多核苷酸编码多肽，所述多肽包含可操作地连接至成熟B2M蛋白的信号肽，成熟B2M蛋白经由接头融合至HLA-G。在一特定实施方案中，外源多肽包含至少与SEQ ID NO:69至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
V.其他任选存在的基因组编辑
在某些实施方案中，本申请的细胞进一步包含编码白介素15(IL-15)和/或白介素(IL-15)受体或其变体或截短的外源多核苷酸。如本文所用，“白介素-15”或“IL-15”是指调节T和NK细胞活化和增殖的细胞因子。IL-15的“功能部分”(“生物活性部分”)是指保留全长或成熟IL-15的一种或多种功能的IL-15的部分。这样的功能包括促进NK细胞存活、调节NK细胞和T细胞活化和增殖以及支持造血干细胞发育成NK细胞。如本领域技术人员所了解的，各种IL-15分子的序列为本领域中已知的。在某些实施方案中，IL-15为野生型IL-15。在某些实施方案中，IL-15为人IL-15。
在另一实施方案中，本申请的细胞进一步包含外源多核苷酸，其编码非天然存在的FcγRIII(CD16)变体，例如hnCD16(参见，例如Zhu et al.,Blood 2017,130:4452，其内容整体援引加入本文)。如本文所用，术语“hnCD16a”是指CD16(与抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)相关的低亲和力Fcγ受体)的高亲和力不可切割的变体。通常，CD16在ADCC期间通过蛋白酶切割，而hnCD16 CAR不经历此切割，并因此较长时间地维持ADCC信号。在一些实施方案中，hnCD 16如Blood 2016128:3363中所公开，该文献的内容整体援引明确地加入本文。
在另一实施方案中，本申请的细胞进一步包含编码白介素12(IL-12)或白介素21(IL-21)或其变体的外源多核苷酸。
在另一实施方案中，本申请的细胞进一步包含编码白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)的外源多核苷酸，作为用于克服宿主抗移植物免疫反应性的NK抑制模式(NKinhibitory modality)，以用于同种异体应用。如本文所用，术语“CD47”，有时亦称为“整合素相关蛋白”(IAP)，是指在人中由CD47基因编码的跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，与膜整合素相伴，并且还结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)及信号调节蛋白α(SIRPa)。CD47作为对巨噬细胞的信号，以允许表达CD47的细胞逃脱巨噬细胞攻击。参见例如Deuse-T,et al.,Nature Biotechnology 2019 37:252-258，其完整内容援引加入本文。
在另一实施方案中，本申请的细胞进一步包含编码组成型活化IL-7受体或其变体的外源多核苷酸。IL-7在T细胞的发育和成熟中具有关键作用。它促进幼稚和中枢记忆T细胞子集的产生，并且调控其稳态。先前已报导IL-7延长肿瘤特异性T细胞在体内的存活时间。Cancer Medicine.2014；3(3):550–554。在先前研究中，已报导组成型活化IL-7受体(C7R)可以在不存在配体的情况下或在存在辅助受体(coreceptor)的γ链(γc)的情况下引起IL-7信号传导。Shum et al,Cancer Discovery.2017；7(11):1238–1247。诸如半胱氨酸和/或脯氨酸的跨膜结构域的插入引起IL-7Rα的同源二聚化。在形成同源二聚体之后，JAK1/JAK1的交叉磷酸化激活STAT5，从而激活IL-7的下游信号传导。这样的组成型活化IL-7受体(C7R)组合物的构建体公开于WO2018/038945，其内容援引加入本申请。
在另一实施方案中，本申请的细胞进一步包含编码一种或多种成像或报告蛋白如PSMA或HSV-tk的外源多核苷酸。例如，根据WO2015/143029和WO2018/187791的公开，细胞可以含有编码前列腺特异性膜抗原(PSMA)的外源聚多苷酸作为成像报告子(reporter)，这些文献的公开内容援引加入本文。
在上述细胞的一个实施方案中，在一个或多个所选位点的基因组编辑可以包括插入一种或多种外源多核苷酸，外源多核苷酸编码其他额外的人工细胞死亡多肽蛋白、靶向模式(targeting modality)、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶标候选物，或者促进基因组工程化iPSC或其衍生细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白。
在一些实施方案中，用于插入的外源多核苷酸可操作地连接至(1)一个或多个外源启动子，其包含CMV、EFla、PGK、CAG、UBC或者其他组成型、诱导型、时间型、组织型或细胞类型特异性启动子；或者(2)所选位点中包含的一个或多个内源启动子，其包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、β-2微珠蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或者其他符合基因组安全港标准的位点。在一些实施方案中，使用上述方法产生的基因组工程化iPSC包含一种或多种不同的外源多核苷酸，其编码包含胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B-细胞CD20、ErbB2或CD79b的蛋白，其中当基因组工程化iPSC包含两个或更多个自杀基因时，自杀基因整合在不同的安全港位点中，安全港位点包含AAVSl、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、Hll、β-2微珠蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。其他编码蛋白的外源多核苷酸可以包括编码PET报告蛋白，稳态细胞因子，以及抑制性检查点抑制蛋白如PD1、PD-L1和CTLA4以及靶向CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)轴的蛋白。在一些其他实施方案中，使用本文提供的方法产生的基因组工程化iPSC在与靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶标候选物、免疫应答调节和调制或者抑制iPSC或其衍生细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白相关的一个或多个内源基因包含插入/缺失。
此外，修饰的γδ细胞可以在其基因组中展现出引起靶基因的功能丧失的一种或多种编辑。靶基因的功能丧失的特征在于基于基因组修饰的靶基因表达减少，例如靶基因中的RNA引导的核酸酶介导的切割，引起编码的基因产物的失活或者表达或功能减弱。可以靶向以引起功能丧失的基因的实例包括B2M、PD-1、CISH、CIITA、HLAII类组织相容性α链基因(如HLA-DQA1、HLA-DRA、HLA-DPA1、HLA-DMA-HLA-DQA2和或HLA-DOA)、HLAII类组织相容性β链基因(如HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DQB3、HLA-DRB1、HLADRB3、HLA-DRB4、和/或HLA-DRB5)、CD32B、CTLA4、NKG2A、BIM、CCR5、CCR7、CD96、CDK8、CXCR3、EP4(PGE2受体)、Fas、GITR、IL1R8、KIRDL1、KIR2DL1-3、LAG3、SOCS基因、分拣蛋白(Sortilin)、TIM3、TRAC、RAG1、RAG2和NLRC5。
本申请的修饰的细胞可以展现出任何所描述的编辑以及所描述的这样的编辑的任何组合。
VL.在iPSC中所选基因座的靶向基因组编辑
根据本申请的实施方案，一种或多种外源多核苷酸整合在iPSC染色体上的一个或多个基因座上。
基因组编辑，或基因组的编辑，或基因编辑，在本文中可互换使用，是一种基因工程化，其中在靶向细胞的基因组中插入、缺失和/或置换DNA。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组的编辑”或“靶向基因编辑”互换)使得能够在基因组中的预选位点进行插入、缺失和/或替代。在靶向编辑过程中，当内源序列在插入位点被缺失或破坏时，由于序列缺失或破坏，可以将包含受影响序列的内源基因敲除或敲低。因此，靶向编辑也可以用于精确破坏内源基因表达。在本文中类似使用的是术语“靶向整合”，是指涉及在基因组中的预选位点插入一种或多种外源序列的过程，在插入位点缺失或不缺失内源序列。
靶向编辑可以通过不依赖于核酸酶的方法，或通过依赖于核酸酶的方法来实现。在不依赖于核酸酶的靶向编辑方法中，同源重组是由待插入的外源多核苷酸侧翼的同源序列引导，通过宿主细胞的酶促机制进行。
或者，通过特定的稀有切割(rare-cutting)核酸内切酶特异性地引入双链断裂(DSB)，可以实现更高频率的靶向编辑。这种依赖于核酸酶的靶向编辑利用DNA修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)，这是为了应对DSB而发生的。在没有含有外源遗传物质的供体载体的情况下，NHEJ往往会导致少量内源核苷酸的随机插入或缺失。相比之下，当含有侧翼有一对同源臂的外源遗传物质的供体载体存在时，可以通过同源重组在同源定向修复(HDR)过程中将外源遗传物质引入基因组，导致“靶向整合”。
能够引入特异性和靶向性DSB的可用核酸内切酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)和RNA引导的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)系统。此外，利用phiC31和Bxbl整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也是一种很有前景的靶向整合工具。
ZFN是包含融合至锌指DNA结合结构域的核酸酶的靶向核酸酶。“锌指DNA结合结构域”或“ZFBD”是指通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位来稳定。锌指的实例包括但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计的”锌指结构域是在自然界中不存在的结构域，其设计/组成主要产生自合理的标准，例如，应用取代(substitution)规则和用来处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息的计算机算法。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。“选择的”锌指结构域是自然界中没有发现的结构域，其产生主要来自于经验过程，如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。ZFN在美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中有更详细的描述，其完整的公开内容援引加入本文。本领域中最公认的ZFN实例是Fokl核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。
TALEN是一种靶向核酸酶，其包含融合至TAL效应子DNA结合结构域的核酸酶。“转录激活物样效应子DNA结合结构域”、“TAL效应子DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”是指TAL效应子蛋白的多肽结构域，负责TAL效应子蛋白与DNA的结合。黄单孢菌属的植物病原体在感染期间分泌TAL效应子蛋白。这些蛋白进入植物细胞核，经由它们的DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列，并且经由它们的反式激活结构域激活这些序列上的基因转录。TAL效应子DNA结合结构域的特异性取决于不完美的34个氨基酸重复的效应子可变数量，这些重复在称作重复可变双残基(RVD)的选定的重复位置包含多态性。TALEN在美国专利申请第2011/0145940号中有更详细的描述，其援引加入本文。本领域中最公认的TALEN实例是Fokl核酸酶与TAL效应子DNA结合结构域的融合多肽。
适合本申请的靶向核酸酶的其他实例包括但不限于Spol1、Bxbl、phiC3 l、R4、PhiBTl和Wp/SPBc/TP90l-l，无论单独使用还是联合使用。
靶向核酸酶的其他非限制性实例包括天然存在和重组的核酸酶；来自包括cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr家族的CRISPR相关核酸酶；限制性核酸内切酶；巨核酸酶(meganuclease)；归巢核酸内切酶(homing endonuclease)等。作为一个实例，CRISPR/Cas9需要两个主要组分：(1)Cas9核酸内切酶和(2)crRNA-tracrRNA复合物。当共表达时，两个组分形成复合物，被招募到包含PAM和PAM附近的种子区的靶DNA序列。crRNA和tracrRNA可以结合形成嵌合引导RNA(gRNA)，引导Cas9至目标选定序列。然后可以经由转染或转导将这两个组分递送至哺乳动物细胞。作为另一实例，CRISPR/Cpf1包含两个主要组分：(1)CPf1核酸内切酶和(2)crRNA。当共表达时，两个组分形成核糖核蛋白(RNP)复合物，被招募到包含PAM和PAM附近的种子区的靶DNA序列。crRNA可以结合形成嵌合引导RNA(gRNA)，引导Cpf1至目标选定序列。然后可以经由转染或转导将这两个组分递送至哺乳动物细胞。
MAD7是源自细菌直肠真杆菌(Eubacterium rectale)的工程化Cas12a变体，对5′-TTTN-3′和5′-CTTN-3′PAM位点有偏向性，不需要tracrRNA。参见，例如，PCT公开第2018/236548号，其公开内容援引加入本文。
DICE介导的插入使用一对重组酶，例如，phiC31和Bxbl，提供严格(tightly)限制在每个酶自身的小attB和attP识别位点的外源DNA的单向整合。因为这些靶att位点并不是天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将它们引入基因组，在期望的整合位点。参见，例如，美国申请公开第2015/0140665号，其公开内容援引加入本文。
本申请的一个方面提供一种构建体，其包含一种或多种用于靶向基因组整合的外源多核苷酸。在一实施方案中，构建体进一步包含一对期望整合位点特异性的同源臂，并且靶向整合方法包括将构建体引入细胞，使得能够通过细胞宿主酶促机制进行位点特异性同源重组。在另一实施方案中，在细胞中靶向整合的方法包括将包含一种或多种外源多核苷酸的构建体引入细胞，以及将包含期望整合位点特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒引入细胞，以实现ZFN介导的插入。在另一实施方案中，在细胞中靶向整合的方法包括将包含一种或多种外源多核苷酸的构建体引入细胞，以及将包含期望整合位点特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒引入细胞，以实现TALEN介导的插入。在另一实施方案中，在细胞中靶向整合的方法包括将包含一种或多种外源多核苷酸的构建体引入细胞，将Cpf1表达盒和包含期望整合位点特异性的引导序列的gRNA引入细胞，以实现Cpf1介导的插入。在另一实施方案中，在细胞中靶向整合的方法包括将包含一种或多种外源多核苷酸的构建体引入细胞，将Cas9表达盒和包含期望整合位点特异性的引导序列的gRNA引入细胞，以实现Cas9介导的插入。在另一实施方案中，在细胞中靶向整合的方法包括将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的期望整合位点，将包含一种或多种外源多核苷酸的构建体引入细胞，以及引入DICE重组酶的表达盒，以实现DICE介导的靶向整合。
靶向整合的位点包括但不限于基因组安全港，这是人基因组的基因内或基因外区域，理论上能够容纳新整合的DNA的可预测表达，而不会对宿主细胞或生物体产生不利影响。在某些实施方案中，靶向整合的基因组安全港是选自AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、GAPDH、TCR和RUNX1基因的一个或多个基因座。
在其他实施方案中，为了在插入位点的内源基因的缺失或减少表达，选择靶向整合的位点。如本文所用，关于基因表达的术语“缺失”是指废除基因表达的任何遗传修饰。基因表达“缺失”的实例包括，例如，基因的DNA序列的去除或缺失，在基因的基因座插入外源多核苷酸序列，以及基因内的一个或多个取代，其废除基因的表达。
靶向缺失的基因包括但不限于主要组织相容性复合物(MHC)I类和MHC II类蛋白的基因。多种MHC I类和II类蛋白必须在同种异体受体中进行组织相容性匹配，以避免同种异体排斥问题。“MHC缺陷”，包括MHC-I类缺陷，或MHC-II类缺陷，或两者，是指缺乏包含MHCI类蛋白异源二聚体和/或MHC II类异源二聚体的完整MHC复合物的表面表达水平，或不再保持其表面表达水平，或降低其表面表达水平的细胞，从而减弱或降低的水平低于其他细胞或合成方法可自然检测的水平。MHC I类缺陷可以通过MHC I类基因座(染色体6p2l)的任何区域的功能性缺失，或者缺失或降低一个或多个MHC I类相关基因的表达水平来实现，这些基因包括但不限于β-2微珠蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和Tapasin基因。例如，B2M基因编码对于所有MHC I类异源二聚体的细胞表面表达至关重要的共同亚基。B2M裸细胞是MHC-I缺陷的。MHC II类缺陷可以通过MHC-II相关基因的功能性缺失或减少来实现，这些基因包括但不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP。CIITA是转录共激活物，通过激活II类蛋白表达所需的转录因子RFX5来发挥作用。CIITA裸细胞是MHC-II缺陷的。在某些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP的基因的一个或多个基因座上，从而通过整合使基因缺失或减少表达。
用于靶向缺失的其他基因包括但不限于重组活化基因1和2(RAG1和RAG2)。RAG1和RAG2编码蛋白复合物的部分，其通过在重组信号序列(RSS)与编码区段之间的边界处引入双链断裂来引发V(D)J重组。RAG1/RAG2基因的缺失或表达水平减少防止细胞中的额外TCR重排，因此防止自体反应性TCR的意外产生(Minagawa et al.,Cell Stem Cell.2018Dec6；23(6):850-858)。
在某些实施方案中，外源多核苷酸整合在细胞染色体上的一个或多个基因座上，优选一个或多个基因座是选自以下基因的基因座：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、GAPDH、RUNX1、B2M、TAPI、TAP2、Tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TRAC、TRBC1、TRBC2、RAG1、RAG2、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT基因，条件是一个或多个基因座中至少一个是MHC基因的基因座，如选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的基因。在一些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在CD38基因座上，从而导致CD38基因的缺失或减少表达。优选地，一种或多种外源多核苷酸整合在MHC I类相关基因的基因座上，如β-2微珠蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因或Tapasin基因；以及在MHC-II相关基因的基因座上，如RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP或CIITA基因；以及任选地进一步在选自AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、GAPDH、TCR和RUNX1基因的安全港基因的基因座上。更优选地，一种或多种外源多核苷酸整合在CIITA、AAVS1和B2M基因的基因座上。
在某些实施方案中，(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸整合在AAVS1基因的基因座上；(ii)编码人工细胞死亡多肽的外源多肽整合在CIITA基因的基因座上；并且(iii)编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多肽整合在B2M基因的基因座上；其中外源多核苷酸的整合使CIITA和B2M基因缺失或减少表达。
VII.衍生细胞
在另一方面，本发明涉及一种衍生自本申请的iPSC分化的细胞，即衍生细胞。如上文所描述，衍生细胞中保留引入iPSC细胞中的基因组编辑。在获得自iPSC分化的衍生细胞的某些实施方案中，衍生细胞为T细胞。在其他实施方案中，衍生细胞为CD34+造血祖细胞(HPC)。
在某些实施方案中，本申请提供一种衍生自诱导多能干细胞(iPSC)的CD34+造血祖细胞(HPC)，其包含：(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；和(ii)编码重排γδT细胞受体(TCR)的一种或多种多核苷酸，其中重排γδTCR支持iPSC分化成T细胞。在某些实施方案中，本申请提供一种衍生自诱导多能干细胞(iPSC)的CD34+造血祖细胞(HPC)，其包含：(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；(ii)编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；(iii)B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5、RAG1/RAG2和RFXAP基因中一个或多个的缺失或减少表达；和(iv)编码重排γδT细胞受体(TCR)的一种或多种多核苷酸，其中重排γδTCR支持iPSC分化成T细胞。
在某些实施方案中，本申请提供一种T细胞，其包含：(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；和(ii)编码重排γδT细胞受体(TCR)的一种或多种多核苷酸，其中重排γδTCR支持iPSC分化成T细胞。在某些实施方案中，本申请提供一种衍生自诱导多能干细胞(iPSC)的CD34+造血祖细胞(HPC)，其包含：(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；(ii)编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；(iii)B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因中一个或多个的缺失或减少表达；(iv)RAG1/RAG2基因的缺失或减少表达；和(v)编码重排γδT细胞受体(TCR)的一种或多种多核苷酸，其中重排γδTCR支持iPSC分化成T细胞。
在某些实施方案中，iPSC从全(whole)外周血单个核细胞(PBMC)重编程。
在某些实施方案中，iPSC从外周血CD34+造血祖细胞(HPC)重编程。
在某些实施方案中，iPSC从外周血αβT细胞重编程。
在某些实施方案中，iPSC从外周血γδT细胞重编程。在某些实施方案中，iPSC从γδT细胞重编程，并且重排γδTCR对于γδT细胞是内源的。
在某些实施方案中，γδTCR是重组的。
在某些实施方案中，在有丝分裂刺激后，重排γδTCR使分化自iPSC的T细胞的扩增相比于不具有重排TCR的T细胞增加。
在某些实施方案中，编码重排γδTCR的一种或多种多核苷酸包含：γTCR可变基因，其选自TRGV1-5、TRGV5P、TRGV8-11和TRGVA基因；γTCR连接基因，其选自TRGJ1、TRGJ2、TRGJP、TRGJP1和TRGJP2基因；以及γTCR恒定基因，其选自TRGC1和TRGC2基因。
在某些实施方案中，编码重排γδTCR的一种或多种多核苷酸包含：δTCR可变基因，其选自TRDV1-3基因；δTCR多样性基因，其选自TRDD1、TRDD2和TRDD3基因；δTCR连接基因，其选自TRDJ1、TRDJ2、TRDJ3和TRDJ4；和δTCR恒定基因TRDC。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR被选自戊烯焦磷酸盐(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)或化学相似分子的一种或多种磷酸化抗原激活，其中磷酸化抗原作为普通代谢过程的一部分天然存在于细胞中，或者其中磷酸化抗原可以由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平，其中磷酸化抗原的活性可以是通过与γδTCR的直接相互作用或者其中磷酸化抗原的活性可以是通过与嗜乳脂蛋白(BTN)BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的相互作用。
在某些实施方案中，重组重排γδTCR不被磷酸化抗原激活，并且TCR识别的特异性抗原是未知的。
在某些实施方案中，T细胞进一步包含编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸。
在某些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在细胞染色体上的一个或多个基因座上，基因座选自AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hl l、GAPDH、RUNX1、B2M、TAPI、TAP2、Tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TRAC、TRBC1、TRBC2、RAG1、RAG2、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT基因，条件是外源多核苷酸中的至少一种整合在选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的基因座上，从而导致基因的缺失或减少表达。在某些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在CIITA、AAVS1和B2M基因的基因座上。在一些实施方案中，一种或多种外源多核苷酸整合在CD38基因座上，从而导致CD38基因的缺失或减少表达。
在某些实施方案中，编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸整合在AAVS1基因的基因座上；编码人工细胞死亡多肽的外源多肽整合在CIITA基因的基因座上；并且编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多肽整合在B2M基因的基因座上；其中外源多核苷酸的整合导致CIITA和B2M的缺失或减少表达。
本申请还提供一种T细胞，其包含：
(i)外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)外源多核苷酸，其编码包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，其具有SEQID NO:71的氨基酸序列；
(iii)一种或多种多核苷酸，其编码重排T细胞受体(TCR)基因座，其包含具有SEQID NO:133、135或150的氨基酸序列的γTCR以及具有SEQ ID NO:134、136或151的氨基酸序列的δTCR；以及
(iv)任选存在的外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的人白细胞抗原E(HLA-E)；
其中一种或多种外源多核苷酸整合在AAVS1、CIITA和B2M基因的基因座上，从而使CIITA和B2M缺失或减少表达。
本申请还提供一种制备本申请的T细胞的方法，其包括使本申请的iPSC细胞在细胞分化的条件下分化，从而获得T细胞。
本申请的iPSC可以通过本领域已知的任何方法来分化。示例性方法描述于US8372642、US8574179、US10100282、US10865381、WO2010/099539、WO2012/109208、WO2017/070333、WO2017/070337、WO2018/067836、WO2018/195175、WO2020/061256、WO2017/179720、WO2016/010148和WO2018/048828，其各自整体援引加入本文。分化方案可以使用饲养细胞或可为无饲养细胞的。如本文所用，“饲养细胞”或“饲养(feeder)”为描述一种类型的细胞的术语，其与第二类型的细胞共培养以提供其中第二类型的细胞可以生长、扩增或分化的环境，因为饲养细胞提供用于支持第二细胞类型的刺激、生长因子和营养物。
特别地，Notch信号传导在使前体细胞向T细胞命运驱动中发挥关键作用。在人胸腺中，Notch家族蛋白DLL1、DLL4和Jag2(由胸腺中的基质细胞表达)通过受体Notch1(由早期胸腺细胞表达)传导信号。在某些实施方案中，分化方案包括在包含重组δ样蛋白4(DLL4)的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，重组DLL4为变体DLL4。非限制性示例性DLL4变体和序列提供于表2中。在某些实施方案中，分化方案包括在包含重组Jagged 2(JAG2)的培养基中培养细胞。在其他实施方案中，在存在或不存在蛋白G包被的情况下使用聚多巴胺固定重组蛋白，以促进重组蛋白的正确定向。
表2
胞外域(ECD)；表皮生长因子(EGF)重复；N＝氨基末端
VIII.多核普酸、载体和宿主细胞
(1)编码CAR的核酸
在另一个总的方面，本发明涉及一种分离的核酸，其编码根据本申请的实施方案可用于本发明的嵌合抗原受体(CAR)。本领域技术人员会理解可以在不改变蛋白氨基酸序列的情况下改变CAR的编码序列(例如，置换、缺失、插入等)。因此，本领域技术人员会理解可以改变编码本申请的CAR的核酸序列而不改变蛋白的氨基酸序列。
在某些实施方案中，分离的核酸编码靶向CD19的CAR。在一特定实施方案中，编码CAR的分离的核酸包含与SEQ ID NO:62至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:62的多核苷酸序列。
在另一个总的方面，本申请提供一种载体，其包含编码根据本申请的实施方案可用于本发明的CAR的多核苷酸序列。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体如质粒。载体可以包括任何元件以建立表达载体的常规功能，例如，启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。许多能够将核酸递送至细胞的表达载体是本领域已知的，并且可以在本文中用于在细胞中产生CAR。常规克隆技术或人工基因合成可以用来产生根据本申请的实施方案的重组表达载体。
在一特定方面，本申请提供根据本申请的实施方案可用于本发明的CAR的靶向整合的载体。在某些实施方案中，载体包含外源多核苷酸，按5’至3’的顺序具有(a)启动子；(b)编码根据本申请的实施方案的CAR的多核苷酸序列；以及(c)终止子/多腺苷酸化信号。
在某些实施方案中，启动子是CAG启动子。在某些实施方案中，CAG启动子包含与SEQ ID NO:63至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他启动子，其实例包括但不限于EF1a、UBC、CMV、SV40、PGK1和人β肌动蛋白。
在某些实施方案中，终止子/多腺苷酸化信号是SV40信号。在某些实施方案中，SV40信号包含与SEQ ID NO:64至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他终止子序列，其实例包括但不限于BGH、hGH和PGK。
在某些实施方案中，编码CAR的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:62至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，载体进一步包含外源多核苷酸侧翼的左同源臂和右同源臂。如本文所用，“左同源臂”和“右同源臂”是指外源多核苷酸侧翼的一对核酸序列，并且促进外源多核苷酸整合至指定的染色体基因座中。可以基于所关注的整合位点设计左右臂同源臂的序列。在一些实施方案中，左同源臂或右同源臂与整合位点的左侧或右侧序列同源。
在某些实施方案中，左同源臂包含与SEQ ID NO:80至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，右同源臂包含与SEQ ID NO:81至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。
在一特定实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:82至少85％，如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:82的多核苷酸序列。
(2)编码失活的细胞表面受体的核酸
在另一个总的方面，本发明涉及一种分离的核酸，其编码根据本申请的实施方案可用于本发明的失活的细胞表面受体。本领域技术人员会理解可以在不改变蛋白氨基酸序列的情况下改变失活的细胞表面受体的编码序列(例如，置换、缺失、插入等)。因此，本领域技术人员会理解可以改变编码本申请的失活的细胞表面受体的核酸序列而不改变蛋白的氨基酸序列。
在某些实施方案中，分离的核酸编码本文所述的任何失活的细胞表面受体，如包含单克隆抗体特异性表位和细胞因子，其中单克隆抗体特异性表位和细胞因子通过自体蛋白酶肽序列可操作地连接。
在一些实施方案中，分离的核酸编码失活的细胞表面受体，失活的细胞表面受体包含抗体，如替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、达雷妥尤单抗或乌司奴单抗特异性识别的表位。
在某些实施方案中，分离的核酸编码具有截短的表皮生长因子(tEGFR)变体的失活的细胞表面受体。优选地，失活的细胞表面受体包含西妥昔单抗、马妥珠单抗、耐昔妥珠单抗或帕尼单抗特异性识别的表位，优选西妥昔单抗。
在某些实施方案中，分离的核酸编码具有CD79b的一个或多个表位的失活的细胞表面受体，如维泊妥珠单抗特异性识别的表位。
在某些实施方案中，分离的核酸编码具有CD20的一个或多个表位的失活的细胞表面受体，如利妥昔单抗特异性识别的表位。
在某些实施方案中，分离的核酸编码具有Her 2受体的一个或多个表位的失活的细胞表面受体，如曲妥珠单抗特异性识别的表位。
在某些实施方案中，自体蛋白酶肽序列是1型猪捷申病毒2A(P2A)。
在某些实施方案中，截短的表皮生长因子(tEGFR)变体由与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，维泊妥珠单抗特异性识别的单克隆抗体特异性表位由与SEQID NO:74至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，利妥昔单抗特异性识别的单克隆抗体特异性表位由与SEQ IDNO:75至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，曲妥珠单抗特异性识别的单克隆抗体特异性表位由与SEQ IDNO:76至少90％，如至少90％、91％、82％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，自体蛋白酶肽具有与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
在另一个总的方面，本申请提供一种载体，其包含编码根据本申请的实施方案可用于本发明的失活的细胞表面受体的多核苷酸序列。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体如质粒。载体可以包括任何元件以建立表达载体的常规功能，例如，启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。许多能够将核酸递送至细胞的表达载体是本领域已知的，并且可以在本文中用于在细胞中产生失活的细胞表面受体。常规克隆技术或人工基因合成可以用来产生根据本申请的实施方案的重组表达载体。
在一特定方面，本申请提供根据本申请的实施方案，可用于本发明的失活的细胞表面受体的靶向整合的载体。在某些实施方案中，载体包含外源多核苷酸，按5’至3’的顺序具有(a)启动子；(b)编码失活的细胞表面受体的多核苷酸序列，如包含截短的表皮生长因子(tEGFR)变体的细胞表面受体。
在某些实施方案中，启动子是CAG启动子。在某些实施方案中，CAG启动子包含与SEQ ID NO:63至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他启动子，其实例包括但不限于EF1a、UBC、CMV、SV40、PGK1和人β肌动蛋白。
在某些实施方案中，终止子/多腺苷酸化信号是SV40信号。在某些实施方案中，SV40信号包含与SEQ ID NO:64至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他终止子序列，其实例包括但不限于BGH、hGH和PGK。
在一些实施方案中，载体进一步包含外源多核苷酸侧翼的左同源臂和右同源臂。
(3)编码HLA构建体的核酸
在另一个总的方面，本发明涉及一种分离的核酸，其编码根据本申请的实施方案可用于本发明的HLA构建体。本领域技术人员会理解可以在不改变蛋白氨基酸序列的情况下改变HLA构建体的编码序列(例如，置换、缺失、插入等)。因此，本领域技术人员会理解可以改变编码本申请的HLA构建体的核酸序列而不改变蛋白的氨基酸序列。
在某些实施方案中，分离的核酸编码HLA构建体，其包含信号肽(如HLA-G信号肽)，可操作地连接至HLA编码序列，如成熟B2M和/或成熟HLA-E的编码序列。在一些实施方案中，HLA编码序列编码通过4X GGGGS接头可操作地连接的HLA-G和B2M和/或通过3X GGGGS接头可操作地连接的B2M和HLA-E。在一特定实施方案中，编码HLA构建体的分离的核酸包含与SEQ ID NO:67至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:67的多核苷酸序列。在另一实施方案中，编码HLA构建体的分离的核酸包含与SEQ ID NO:70至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:70的多核苷酸序列。
在另一个总的方面，本申请提供一种载体，其包含编码根据本申请的实施方案可用于本发明的HLA构建体的多核苷酸序列。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体如质粒。载体可以包括任何元件以建立表达载体的常规功能，例如，启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。许多能够将核酸递送至细胞的表达载体是本领域已知的，并且可以在本文中用于在细胞中产生HLA构建体。常规克隆技术或人工基因合成可以用来产生根据本申请的实施方案的重组表达载体。
在一特定方面，本申请提供根据本申请的实施方案可用于本发明的HLA构建体的靶向整合的载体。在某些实施方案中，载体包含外源多核苷酸，按5’至3’的顺序具有(a)启动子；(b)编码HLA构建体的多核苷酸序列；以及(c)终止子/多腺苷酸化信号。
在某些实施方案中，启动子是CAG启动子。在某些实施方案中，CAG启动子包含与SEQ ID NO:63至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他启动子，其实例包括但不限于EF1a、UBC、CMV、SV40、PGK1和人β肌动蛋白。
在某些实施方案中，终止子/多腺苷酸化信号是SV40信号。在某些实施方案中，SV40信号包含与SEQ ID NO:64至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。也可以使用其他终止子序列，其实例包括但不限于BGH、hGH和PGK。
在某些实施方案中，编码HLA构建体的多核苷酸序列包含信号肽(如HLA-G信号肽)、成熟B2M和成熟HLA-E，其中HLA-G和B2M通过4X GGGGS接头(SEQ ID NO:31)可操作地连接，B2M转基因和HLA-E通过3X GGGGS接头(SEQ ID NO:25)可操作地连接。在特定实施方案中，HLA构建体包含与SEQ ID NO:67至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:67的多核苷酸序列。在另一实施方案中，HLA构建体包含与SEQ ID NO:70至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:70的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，载体进一步包含外源多核苷酸侧翼的左同源臂和右同源臂。
在某些实施方案中，左同源臂包含与SEQ ID NO:77至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，右同源臂包含与SEQ ID NO:78至少90％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列。
在一特定实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:79至少85％，如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％相同的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO:79的多核苷酸序列。
(4)宿主细胞
在另一个总的方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本申请的载体和/或编码本申请的构建体的分离的核酸。本领域技术人员鉴于本公开已知的任何宿主细胞可以用于本申请的外源多核苷酸的重组表达。根据特定实施方案，通过常规方法如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化至宿主细胞中，其中它被稳定地整合至宿主细胞基因组中，从而有效表达重组核酸。
宿主细胞的实例包括，例如，含有本申请的载体或分离的核酸的重组细胞，可用于产生所关注的载体或构建体；或者含有本申请的一种或多种分离的核酸的工程化iPSC或其衍生细胞，优选整合在一个或多个染色体基因座上。本申请的分离的核酸的宿主细胞也可以是免疫效应细胞，如T细胞，包含本申请的一种或多种分离的核酸。免疫效应细胞可以通过本申请的工程化iPSC的分化获得。鉴于本公开，本领域中任何合适的方法都可以用于分化。免疫效应细胞也可以通过用本申请的一种或多种分离的核酸转染免疫效应细胞而获得。
IX.组合物
在另一个总的方面，本申请提供一种组合物，其包含本申请的分离的多核苷酸、宿主细胞和/或本申请的iPSC或其衍生细胞。
在某些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种治疗剂，治疗剂选自肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、siRNA、寡核苷酸、单个核血细胞、包含一种或多种所关注的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性基团或者免疫调节药物(IMiD)。
在某些实施方案中，组合物是药物组合物，其包含本申请的分离的多核苷酸、宿主细胞和/或本申请的iPSC或其衍生细胞以及药学可接受的载剂。如本文所用的术语“药物组合物”是指包含本申请的分离的多核苷酸、本申请的分离的多肽、本申请的宿主细胞和/或本申请的iPSC或其衍生细胞以及药学可接受的载剂的产品。本申请的多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或iPSC或其衍生细胞以及包含它们的组合物也可用于制备本文提到的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“载剂”是指本领域众所周知的用于药物制剂的任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的囊泡、微球、脂质体包封或其他物质。应当理解载剂、赋形剂或稀释剂的特征取决于特定应用的给药途径。如本文所用，术语“药学可接受的载剂”是指不干扰本文所述组合物的有效性或本文所述组合物的生物活性的无毒物质。根据特定实施方案，鉴于本公开，可以使用任何适合用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或iPSC或其衍生细胞的药学可接受的载剂。
具有药学可接受的载剂的药学活性成分的制剂是本领域已知的，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)和任何后续版本)。额外成分的非限制性实例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂(tonicityregulating agent)、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学可接受的载剂可以用于配制本申请的药物组合物。
X.使用方法
在另一个总的方面，本申请提供一种治疗有此需要的受试者的疾病或病况的方法。所述方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本申请的细胞和/或本申请的组合物。在某些实施方案中，疾病或病况是癌症。例如，癌症可以是实体癌症或液体癌症。例如，癌症可以选自肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤/疾病(HD)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。在一优选实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
根据本申请的实施方案，组合物包含治疗有效量的分离的多核苷酸、分离的多肽、宿主细胞和/或iPSC或其衍生细胞。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引发期望的生物学或医学反应的活性成分或组分的量。治疗有效量可以根据所述目的以经验和常规方式确定。
如本文所用，关于本申请的细胞和/或药物组合物，治疗有效量是指在有此需要的受试者中调节免疫应答的细胞和/或药物组合物的量。
根据特定实施方案，治疗有效量是指足以实现以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗量：(i)降低或改善待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的持续时间；(iii)防止待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的进展；(iv)导致待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的消退；(v)防止待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的发展或发作；(vi)防止待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的复发；(vii)减少患有待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中待治疗的疾病、病症或病况或者与之相关的症状；和/或(xii)增强或提高另一疗法的预防或治疗效果。
在特定的实施方案中，本发明的细胞对于治疗的患者是同种异体的。
治疗有效量或剂量可以根据各种因素而变化，如待治疗的疾病、病症或病况，给药方式，靶位点，受试者的生理状态(包括，例如，年龄、体重、健康)，受试者是人还是动物，给药的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。优化调整(titrate)治疗剂量以优化安全性和效力。
根据特定实施方案，将本文所述的组合物配制为适合于受试者的预期给药途径。例如，本文所述的组合物可以配制为适合静脉内、皮下或肌肉内给药。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以以本领域技术人员已知的任何方便方式给药。例如，本申请的细胞可以通过雾化吸入、注射、摄取、输注(transfusion)、植入和/或移植向受试者给药。包含本申请的细胞的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、胸膜内、通过静脉内(i.v.)注射或腹腔内给药。在某些实施方案中，本申请的细胞可以在有或没有受试者的淋巴细胞清除(lymphodepletion)的情况下给药。
包含本申请的细胞的药物组合物可以在无菌液体制品中提供，通常是具有细胞悬浮液的等渗水性溶液，或者任选为乳剂、分散剂等，通常缓冲至选定的pH。组合物可以包含载剂，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等，适合细胞的完整性和活力，并且适合细胞组合物的给药。
无菌可注射溶液可以根据需要通过将本申请的细胞纳入适量的含各种其他成分的适当溶剂中来制备。这类组合物可以包括药学可接受的载剂、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等，适合与细胞组合物一起使用，并且适合向受试者如人给药。用于提供细胞组合物的合适缓冲液是本领域众所周知的。使用的任何媒介物(vehicle)、稀释剂或添加剂与保持本申请的细胞的完整性和活力相容。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以在任何生理可接受的媒介物中给药。包含本申请的细胞的细胞群可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法容易地确定细胞群中的细胞。包含本申请的遗传修饰细胞的细胞群的纯度范围可以为从约50％至约55％，从约55％至约60％，从约60％至约65％，从约65％至约70％，从约70％至约75％，从约75％至约80％，从约80％至约85％，从约85％至约90％，从约90％至约95％或从约95％至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量，例如，纯度降低可能需要剂量增加。
本申请的细胞一般以基于细胞/千克(细胞/kg)受试者体重的剂量给药，向受试者给药细胞和/或包含细胞的药物组合物。一般来说，细胞剂量在约104至约1010个细胞/kg体重的范围内，例如，约105至约109，约105至约108，约105至约107或约105至约106，取决于给药方式和部位。一般来说，在全身给药的情况下，使用的剂量高于区域给药，其中本申请的免疫细胞在肿瘤和/或癌症的区域中给药。示例性剂量范围包括但不限于1x104-1x108、2x104-1x108、3x104-1x108、4x104-1x108、5x104-6x108、7x104-1x108、8x104-1x108、9x104-1x108、1x105-1x108、1x105-9x107、1x105-8x107、1x105-7x107、1x105-6x107、1x105-5x107、1x105-4x107、1x105-4x107、1x105-3x107、1x105-2x107、1x105-1x107、1x105-9x106、1x105-8x106、1x105-7x106、1x105-6x106、1x105-5x106、1x105-4x106、1x105-4x106、1x105-3x106、1x105-2x106、1x105-1x106、2x105-9x107、2x105-8x107、2x105-7x107、2x105-6x107、2x105-5x107、2x105-4x107、2x105-4x107、2x105-3x107、2x105-2x107、2x105-1x107、2x105-9x106、2x105-8x106、2x105-7x106、2x105-6x106、2x105-5x106、2x105-4x106、2x105-4x106、2x105-3x106、2x105-2x106、2x105-1x106、3x105-3x106个细胞/kg等。此外，可以调整剂量以考虑是否给药单剂量或是否给药多剂量。可以基于每个受试者的个人因素准确确定什么被认为是有效剂量。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating、treatment)”均意指改善或逆转与癌症相关的至少一个可测量的物理参数，这在受试者中不必是可辨别的，但是可以在受试者中可辨别。术语“治疗”还可以指引起消退，防止进展或至少减缓疾病、病症或病况的进展。在一特定实施方案中，“治疗”是指减轻、防止与疾病、病症或病况相关的一种或多种症状(如肿瘤或更优选癌症)的发展或发作，或者减少持续时间。在一特定实施方案中，“治疗”是指防止疾病、病症或病况的复发。在一特定实施方案中，“治疗”是指增加患有疾病、病症或病况的受试者的存活。在一特定实施方案中，“治疗”是指消除受试者的疾病、病症或病况。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以与一种或多种额外的治疗剂联合给药。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂选自肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、siRNA、寡核苷酸、单个核血细胞、包含一种或多种所关注的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性基团或者免疫调节药物(IMiD)。可以与本发明的细胞一起使用的有用的次级或附加治疗剂的实例包括但不限于：化疗剂，包括烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺，烷基磺酸盐类，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(corboquone)；乙烯亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altreamine)、三亚乙基蜜胺(triethy1enemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietyelenephosphoramide)；δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydocannabinol)；喜树碱(Camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪内酯(scopolectin)和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素类(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TMl)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfanide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、胆固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，如烯二炔抗生素类(例如卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γll(calicheamicin gammall)及卡奇霉素ωll(calicheamicinomegall)(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素类(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂/>和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、诸如丝裂霉素C的丝裂霉素类、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)/>卡培他滨(capecitabine)/>埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂(replenisher)，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；亚胺醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类化合物(maytansinoids)，如美登素(maytansine)和安丝菌素类(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；米托肼(2-ethylhydrazide)；甲基苄肼(procarbazine)；/>多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯类(trichothecene)(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)/>达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷("Ara-C")；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)/>紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(ABRAXANETTM)及多西他赛(doxetaxel)/>苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱/>铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)诺肖林(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；环孢菌素(cyclosporine)、西罗莫司(sirolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、雷帕霉素类似物(rapalog)、伊班膦酸盐(ibandronate)；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；类视黄醇(retinoid)，如视黄酸；CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(prednisolone)的联合疗法的缩写，和FOLFOX，用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)联合5-FU、亚叶酸的治疗方案的缩写；抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷诺昔酚(raloxifene)/>屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)/>抗孕酮类(anti-progesterone)；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群(fulvestrant)/>用以抑制卵巢或使卵巢停止运转的药剂，例如促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂，如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(/>及/>)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及调控肾上腺中雌激素产生的抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)/>依西美坦(exemestane)/>福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)/>来曲唑(letrozole)/>和阿那曲唑(anastrozole)双膦酸盐类，如氯膦酸盐(clodronate)(例如/>或OST/>)、依替膦酸盐(etidronate)/>NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)/>阿仑膦酸盐(alendronate)/>帕米膦酸盐(pamidronate)/>替鲁膦酸盐(tiludronate)/>或利塞膦酸盐(risedronate)/>曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；适体，其描述于例如美国专利第6,344,321号中，其整体援引加入本文；抗HGF单克隆抗体(例如来自Aveo的AV299、来自Amgen的AMG102)；截短的mTOR变体(例如来自Compugen的CGEN241)；阻断mTOR诱导的通路的蛋白激酶抑制剂(例如来自Arqule的ARQ197、来自Exelexis的XL880、来自SGX Pharmaceuticals的SGX523、来自Supergen的MP470、来自Pfizer的PF2341066)；疫苗，如/>疫苗和基因疗法疫苗，例如/>疫苗、/>疫苗及/>疫苗；拓朴异构酶1抑制剂(例如/>)；rmRH(例如/>)；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，如塞来昔布(celecoxib)4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-lH-吡唑-1-基)苯磺酰胺(4-(5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-lH-pyrazol-l-yl)benzenesulfonamide)；以及以上任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。
实施例
实施例1.产生iPSC衍生的γδT细胞(γδiT细胞)
可以使用三种用于产生用于制备γδCAR-iT细胞的iPSC的方法。一种途径使用自供体血液收集的γδT细胞。这些T细胞具有重排γ和δ基因簇，因此当其重编程变成iPSC时，所得的TiPSC(T细胞衍生的iPSC)具有相同基因重排(图1A)。另一方法以来自供体的非T细胞开始。细胞类型可以为任何体细胞，优选地，用于此过程的细胞为由表面蛋白CD34的表达界定的外周血造血干细胞(HSC)。这些PiPSC(外周血CD34 HSC衍生的iPSC)可以经由基因工程改造转化成T-PiPSC(表达TCR的PiPSC)以敲入重排γδTCR转基因的集(图1B)。第三种方法使用自供体血液收集的αβT细胞。αβT细胞可以经由基因工程改造转化成T-iPSC(表达TCR的iPSC)以敲入重排γδTCR转基因的集(图1C)。用于γ和δ链的重排TCR转基因以单一多顺反子构建体递送或者以两种单独的构建体递送：一个为γ，一个为δ。
产生T细胞衍生的iPSC(TiPSC)
首先，自健康供体收集外周血单个核细胞(PBMC)。通过分选从这些PBMC富集γδT细胞，从而86.2％的活细胞为CD3+T细胞，并且通过常规实验室细胞分选，62.3％的活CD3+T细胞为Vγ9/Vδ2T细胞(图2A)。在包含白介素-2(IL-2)和唑来膦酸盐的培养基中培养富集的γδT细胞达至多两周，引起稳健的T细胞增殖。在培养结束时，大部分细胞为Vγ9/Vδ2型γδT细胞。在14天之后，细胞总数增加至～6300万个细胞，证实响应于双膦酸盐化学物质唑来膦酸盐和IL-2的稳健增殖(图2B)。
使增殖的γδT细胞进行iPSC重编程，并且成功地衍生若干TiPSC系。使用本领域中已知的方法重编程iPSC。示例性iPSC重编程方法描述于美国专利号8,183,038；8,268,620；8,440,461；9,499,786；10,865,381；8,952,801；8,546,140；9,644,184；9,328,332；和8,765,470，其各自整体援引加入本文。使用检测重排Vγ9、Vδ2或Vδ1TCR基因的存在的PCR方法分析四个TiPSC系。所得TiPSC系中的两个为Vγ9/Vδ2，一个系为Vγ9/Vδ1，一个系未利用测试的TCR基因的任一个(图2C)。图2D所示的结果表明，在第14天时两个Vγ9/Vδ2克隆系中大部分细胞为CD3/TCR阳性的。
分化TiPSC
为了从TiPSC产生造血祖细胞(HPC)，在HDM基础培养基中培养TiPSC，该培养基由补充有B-27补充剂、XenoFree、去除维生素A(1×)、非必需氨基酸(1×)、L-抗坏血酸磷酸镁盐n-水合物(250μM)、硫代甘油(100μM)及肝素(100ng/ml)的50％Iscove改良杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)及50％Ham's F-12营养混合物(Ham's F12Nutrient Mixture)构成。在第0天，使HDM基础培养基补充有H1152(1μM)、CHIR99021(2μM)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)。在第1天，移除80％的培养基并用补充有CHIR99021(2μM)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第2天、第3天及第4天，移除80％的培养基，并用补充有BMP4(25ng/ml)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第5天、第6天、第7天、第8天，移除80％的培养基，并用补充有BMP4(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、TPO(50ng/ml)、FLT3L(20ng/ml)和IL-3(20ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第7天至第9天收获HPC。
为了从HPC产生γδiPSC衍生的T(γδiT)细胞，可以通过正选择表达CD34的细胞来纯化HPC。随后，在重组δ样蛋白4(DLL4；0.42μg/cm 2)和RetroNectin(0.42μg/cm2)的存在下，培养纯化HPC和或未纯化的HPC达14天。每24-72小时用TCDM饲养细胞。用于将HPC分化成iT细胞的TCDM基础培养基由补充有CTS免疫细胞血清替代物(10％)、Glutamax补充剂(1×)、L-抗坏血酸磷酸镁盐n-水合物(250μM)和烟酰胺(2mM)的CTS AIM V培养基构成。使用补充有SCF(50ng/ml)、FLT3L(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、IL-7(50ng/ml)的TCDM基础培养基更换培养基。随后，在包括IL-2(5ng/ml)的有丝分裂刺激物的存在下进一步扩增iT细胞。
当经受iT细胞分化条件时，TiPSC产生表达γδTCR和T细胞谱系标志物CD3的iT细胞(图2D)。TiPSC方法也用于γδTiPSC系，其在无任何富集或扩增双膦酸盐反应性γδT细胞的尝试的情况下由健康供体T细胞重编程。
所得的细胞一致地为CD3阳性及γδTCR阳性/αβTCR阴性的(图3A-B)。也工程化TiPSC系以在外源组成型启动子下表达CD19 CAR，从而引起CD19 CAR在iT细胞中的表达(图3C)。当在基于IncuCyte的杀伤测定中以1:10的效应物:靶标比(1个iT细胞/10个Reh B细胞白血病细胞)使用CAR-iT细胞时，iT细胞强效杀伤CD19+Reh细胞，但不杀伤Reh细胞，其中通过基因编辑以使CD19缺失(3D)。
实施例2.鉴定功能γδTCR对
为了将TCR转基因递送至PiPSC，选择功能TCR对是重要的。γ及δ链不仅必须表达，而且其必须能够组装成功能异二聚体。因为胸腺选择测试TCR对的功能(缺乏功能TCR异二聚体的发育T细胞在胸腺中消除)，所以成熟外周血T细胞通常会具有功能TCR异二聚体。为了鉴定信任TCR，分选单T细胞并利用RNA测序来鉴定作为功能γδTCR异二聚体一起发挥作用的特异性重排多核苷酸序列。纯化使用双膦酸盐扩增的Vγ9/Vδ2γδT细胞(图2A)。随后，将这些细胞分选为单细胞并通过测序确定各重排TCR基因的CDR3区。表3为鉴定的13个TCR对列表。因为用于表3的T细胞使用双膦酸盐(唑来膦酸盐)进行扩增，所以推定所列的TCR为双膦酸盐反应性的。使用这些CDR3区、插补的(imputed)V基因种系序列以及种系γ和δ恒定区(TRGC1、TRGC2或TRDC)来组装复现(recapitulate)原始TCR配对的合成TCR构建体。
表3.来自单γδT细胞的TCRγδ对
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实施例3.产生具有重组TCR的iPSC衍生的γδT细胞(γδiT细胞)
产生外周血CD34 HSC衍生的iPSC(PiPSC)
首先，从健康供体收集外周血单个核细胞(PBMC)。随后，分离由表面蛋白CD34的表达界定的造血干细胞(HSC)。
使增殖的HSC进行iPSC重编程。iPSC重编程方法为本领域众所周知的并且任何方法可以用于本公开描述的方法。示例性iPSC重编程方法描述于美国专利号8,183,038；8,268,620；8,440,461；9,499,786；10,865,381；8,952,801；8,546,140；9,644,184；9,328,332；和8,765,470，其各自整体援引加入本文。基因工程化CD34+HSC衍生的iPSC(PiPSC)以表达重组重排γδTCR。γ和δ链的重排TCR转基因以单一多顺反子构建体递送或者以以下两种单独的构建体递送：一个为γ，一个为δ。重排γδTCR可以为表3中所列的重排γδTCR中的任一个。重排γδTCR可以包含具有SEQ ID NO:133、135或150的氨基酸序列的γTCR链以及具有SEQ ID NO:134、136或151的氨基酸序列的δTCR链。重组重排γδTCR整合在细胞染色体的基因座上，基因座选自TRAC、TRBC1、TRBC2的。额外的基因编辑可以在PiPSC阶段进行，包括但不限于基因敲入和敲除。
分化PiPSC
为了从PiPSC产生HPC，在HDM基础培养基中培养PiPSC，培养基由补充有B-27补充剂、XenoFree、去除维生素A(1×)、非必需氨基酸(1×)、L-抗坏血酸磷酸镁盐n-水合物(250μM)、硫代甘油(100μM)和肝素(100ng/ml)的50％Iscove改良杜氏培养基和50％Ham's F-12营养混合物构成。在第0天，使HDM基础培养基补充有H1152(1μM)、CHIR99021(2μM)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)。在第1天，移除80％的培养基并用补充有CHIR99021(2μM)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第2天、第3天及第4天，移除80％的培养基并用补充有BMP4(25ng/ml)、bFGF(50ng/ml)和VEGF(50ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第5天、第6天、第7天、第8天，移除80％的培养基并用补充有BMP4(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、TPO(50ng/ml)、FLT3L(20ng/ml)和IL-3(20ng/ml)的HDM基础培养基置换。在第7天至第9天收获HPC，这取决于用于衍生iPSC的原始细胞类型。HPC定义为细胞表面的CD34+、CD43+、+/-CD45。
为了从HPC产生γδiPSC衍生的T细胞，可以通过正选择表达CD34的细胞来纯化HPC。随后，在重组δ样蛋白4(SEQ ID NO:139-141)(DLL4；0.42μg/cm 2)和RetroNectin(0.42μg/cm 2)的存在下，培养纯化的HPC和/或未纯化HPC达至多35天。在一些实施方案中，包括DLL4的变体(SEQ ID NO:142-144)以及其他纤连蛋白，联合或替代RetroNectin。在某些实施方案中，使用重组Jagged 2(JAG2)。在其他实施方案中，可以在存在或不存在蛋白G包被的情况下使用聚多巴胺固定重组蛋白以促进重组蛋白的正确定向。每24-72小时用TCDM饲养细胞，并且通常每7天收集以在前述蛋白组合的存在下进行传代。用于将HPC分化成iT细胞的TCDM基础培养基由补充有CTS免疫细胞血清替代物(10％)、Glutamax补充剂(1×)、L-抗坏血酸磷酸镁盐n-水合物(250μM)及烟酰胺(2mM)的CTS AIM V培养基构成。使用补充有SCF(50ng/ml)、FLT3L(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、IL-7(50ng/ml)的TCDM基础培养基更换培养基。培养基可进一步包含CHIR99021(2μM)和/或IL-2(5ng/ml)。γδiT细胞定义为CD3+、γδTCR+、CD45RA+/-、CD7+、CD5+/-、CD56+/-、CD8a+/-。iT细胞对标志物CD62L、CD27、CD28或CCR7中的至少一个是阳性的。
实施例4.iPSC衍生的CAR-γδT细胞行使抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
制备两个肿瘤细胞系用于ADCC测定。对于ADCC测定，在Incucyte细胞杀伤测定中将两种细胞类型以相等比率混合，随后进行孵育，其中iPSC衍生的CAR-γδT细胞(iT细胞)为效应物。这些CAR-γδiT细胞表达CD19特异性CAR(FMC63抗CD19 scFv)，并且预期消除CD19+肿瘤细胞。因为已知γδT细胞有时表达Fc-γ受体CD16，所以我们评估CAR-γδiT细胞经由ADCC杀伤靶标的能力。CAR-γδT细胞行使Raji淋巴母细胞B细胞系的ADCC，其通常表达B细胞抗原CD19和CD20并且经编码红色荧光蛋白的转基因工程化(图11A)。测试两种不同的抗CD20抗体(利妥昔单抗和奥滨尤妥珠单抗)，与其相关同种型对照进行比较。在所有条件下通过CAR-γδiT细胞消除红色肿瘤细胞(CD19+)。CAR-γδT细胞行使Raji细胞的ADCC，其使用CRISPR基因编辑进行修饰以敲除(KO)编码CD19的基因，并且随后用编码绿色荧光蛋白的转基因工程化(图11B)。测试两种不同的抗CD20抗体(利妥昔单抗和奥滨尤妥珠单抗)，与其相关同种型对照进行比较。在同型对照抗体的存在下，绿色CD19KO肿瘤细胞免受杀伤。利妥昔单抗或奥滨尤妥珠单抗的存在使得CAR-γδiT细胞能够经由ADCC杀伤CD19KO细胞。
本领域技术人员会理解，可以对上文描述的实施方案进行改变而不背离其广泛的发明构思。因此，应当理解本发明不限于所公开的特定实施方案，而是意图涵盖如本说明书定义的本发明的精神和范围内的修改。

Claims (69)

1.一种诱导多能干细胞(iPSC)，其包含
(i)一种或多种编码重组重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸；以及
(ii)编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸；
其中所述重组重排γδTCR对CAR的结合靶标不具有特异性，并且支持iPSC分化为T细胞。
2.权利要求1的iPSC，其中，在有丝分裂刺激后，所述重组重排γδTCR使分化自iPSC的T细胞扩增。
3.权利要求1的iPSC，其中所述一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含γTCR可变基因，其选自TRGV2-5、TRGV8和TRGV9基因；
γTCR连接基因，其选自TRGJ1、TRGJ2、TRGJP、TRGJP1和TRGJP2基因；以及
γTCR恒定基因，其选自TRGC1和TRGC2基因。
4.权利要求1的iPSC，其中所述一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含δTCR可变基因，其选自TRDV1-3基因；
δTCR多样性基因，其选自TRDD1、TRDD2和TRDD3基因；
δTCR连接基因，其选自TRDJ1、TRDJ2、TRDJ3和TRDJ4；以及
δTCR恒定基因TRDC。
5.权利要求1-4中任一项的iPSC，其中所述一种或多种编码重组重排γδTCR的多核苷酸包含γTCR可变基因TRGV9和δTCR可变基因TRDV2。
6.权利要求1-5中任一项的iPSC，其中所述重组重排γδTCR被一种或多种磷酸化抗原激活，所述磷酸化抗原选自异戊烯焦磷酸盐(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)和(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)或化学相似分子的，其中所述磷酸化抗原作为代谢过程的产物天然存在于细胞中，或者所述磷酸化抗原由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平，其中所述磷酸化抗原的活性是通过与所述γδTCR的直接相互作用或者所述磷酸化抗原的活性是通过与嗜乳脂蛋白(BTN)BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的相互作用。
7.权利要求1-5中任一项的iPSC，其中所述重组重排γδTCR不被磷酸化抗原激活。
8.权利要求1-7中任一项的iPSC，其中所述iPSC从外周血单个核细胞(PBMC)重编程，优选CD34+造血干细胞(HSC)、αβT细胞或γδT细胞。
9.权利要求8的iPSC，其中在将重编程转录因子加入PBMC以产生iPSC之前，在氨基-双膦酸盐和白介素2(IL2)的存在下扩增PBMC，从而制备所述iPSC。
10.权利要求9的iPSC，其中所述氨基-双膦酸盐是唑来膦酸或其盐。
11.一种T细胞，其衍生自权利要求1-10中任一项的iPSC。
12.一种诱导多能干细胞(iPSC)或从其衍生的T细胞，其包含一种或多种编码重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；以及
一个或多个以下附加特征：
a.编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；
b.B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因中的一个或多个的缺失或减少表达；
c.RAG1和RAG2基因缺失或减少表达；
d.编码非天然存在的FcγRIII(CD16)变体的外源多核苷酸；
e.编码白介素15(IL-15)和/或IL-15受体或者其变体或截短的外源多核苷酸；
f.编码组成型活性白介素7(IL-7)受体或其变体的外源多核苷酸；
g.编码白介素12(IL-12)或白介素21(IL21)或者其变体的外源多核苷酸；
h.编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸；
i.编码白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)和/或CD24的外源多核苷酸；或者
j.编码一种或多种成像或报告蛋白如PSMA或HSV-tk的外源多核苷酸。
13.权利要求12的iPSC或T细胞，其中，在有丝分裂刺激后，所述重排γδTCR使T细胞的扩增相比于不具有所述重排TCR的T细胞增加。
14.权利要求13的iPSC或T细胞，其中所述iPSC从外周血单个核细胞(PBMC)重编程，优选CD34+造血干细胞(HSC)、αβT细胞或γδT细胞。
15.权利要求12的iPSC或T细胞，其中所述重排γδTCR被一种或多种磷酸化抗原激活，所述磷酸化抗原选自异戊烯焦磷酸盐(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸盐(DMAPP)和(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)或化学相似分子，其中所述磷酸化抗原作为正常代谢过程的一部分天然存在于细胞中，或者所述磷酸化抗原由于双膦酸盐化学物质的处理而在细胞中积累到较高水平，其中所述磷酸化抗原的活性是通过与所述γδTCR的直接相互作用或者所述磷酸化抗原的活性是通过与嗜乳脂蛋白(BTN)BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3的相互作用。
16.权利要求12的iPSC或T细胞，其中所述重排γδTCR不被磷酸化抗原激活。
17.权利要求12-16中任一项的iPSC或T细胞，其包含编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸。
18.权利要求12-17中任一项的iPSC或T细胞，其中一种或多种外源多核苷酸整合在细胞染色体上的一个或多个选自以下的基因座上：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、Hll、GAPDH、RUNX1、B2M、TAPI、TAP2、Tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TRAC、TRBC1、TRBC2、RAG1、RAG2、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT基因，条件是外源多核苷酸中的至少一种整合在选自B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的基因座上，从而导致所述基因的缺失或减少表达。
19.权利要求18的iPSC或T细胞，其中一种或多种外源多核苷酸整合在CIITA、AAVS1和B2M基因的基因座上。
20.权利要求19的iPSC或T细胞，其具有一个或多个B2M或CIITA基因的缺失或减少表达。
21.权利要求12-20中任一项的iPSC或T细胞，其中一种或多种外源多核苷酸整合在CD38基因座上，从而导致CD38基因的缺失或减少表达。
22.权利要求1-21中任一项的iPSC或T细胞，其中所述CAR包含：
(i)信号肽，其包含信号肽；
(ii)胞外域，其包含特异性结合靶细胞上抗原的结合结构域；
(iii)铰链区；
(iv)跨膜结构域；
(v)胞内信号传导结构域；以及
(vi)共刺激结构域。
23.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述信号肽为GMCSFR信号肽。
24.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述胞外域包含scFv或VHH，其衍生自特异性结合癌细胞上表达的抗原的抗体。
25.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述铰链区包含CD28铰链区、CD8铰链区或IgG铰链区。
26.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域或CD8跨膜结构域。
27.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述胞内信号传导结构域衍生自DAP10、DAP12、Fcε受体Iγ链(FCER1G)、FcRβ、NKG2D、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD5、CD22、CD226、CD66d、CD79A或CD79B。
28.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述共刺激结构域是衍生自CD28、41BB、IL2Rb、CD40、OX40(CD134)、CD80、CD86、CD27、ICOS、NKG2D、DAP10、DAP12或2B4(CD244)的共刺激信号传导结构域。
29.权利要求22的iPSC或T细胞，其中所述CAR包含：
(i)信号肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(ii)胞外域，其包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(iii)铰链区，其包含与SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(iv)跨膜结构域，其包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
(v)胞内信号传导结构域，其包含与SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；以及
(vi)共刺激结构域，其包含与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
30.权利要求21的iPSC或T细胞，其中所述CAR包含：
(i)信号肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)胞外域，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(iii)铰链区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(iv)跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(v)胞内信号传导结构域，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(vi)共刺激结构域，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
31.权利要求12-30中任一项的iPSC或T细胞，其中所述人工细胞死亡多肽的作用机制是代谢、二聚化诱导或治疗性单克隆抗体介导的。
32.权利要求31的iPSC或T细胞，其中治疗性单克隆抗体介导的人工细胞死亡多肽是失活的细胞表面蛋白，其选自单克隆抗体特异性表位，所述表位选自替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、达雷妥尤单抗或乌司奴单抗特异性识别的表位。
33.权利要求32的iPSC或T细胞，其中所述失活的细胞表面蛋白为截短的表皮生长因子(tEGFR)变体。
34.权利要求33的iPSC或T细胞，其中所述tEGFR变体由与SEQ ID NO:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成。
35.权利要求17的iPSC或T细胞，其中
所述HLA-E包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，或者
所述HLA-G包含与SEQ ID NO:69具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
36.权利要求12-35中任一项的iPSC或T细胞，其中
(i)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸整合在AAVS1基因的基因座上；
(ii)编码人工细胞死亡多肽的外源多肽整合在CIITA基因的基因座上；并且
(iii)编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多肽整合在B2M基因的基因座上，
其中外源多核苷酸的整合使CIITA和B2M缺失或减少表达。
37.权利要求12-36中任一项的iPSC或T细胞，其中所述CAR特异性结合CD38。
38.一种诱导多能干细胞(iPSC)或T细胞，其包含：
(i)外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)外源多核苷酸，其编码包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，其具有SEQ IDNO:71的氨基酸序列；
(iii)多核苷酸，其编码重排T细胞受体(TCR)基因座，其包含具有SEQ ID NO:133、135或150的氨基酸序列的γTCR以及具有SEQ ID NO:134、136或151的氨基酸序列的δTCR；以及
(iv)任选存在的外源多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的人白细胞抗原E(HLA-E)；
其中一种或多种外源多核苷酸整合在AAVS1、CIITA和B2M基因的基因座上，从而使CIITA和B2M缺失或减少表达。
39.一种组合物，其包含权利要求11-38中任一项的T细胞。
40.权利要求39的组合物，其进一步包含一种或多种治疗剂或者与一种或多种治疗剂联合使用，所述治疗剂选自肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、siRNA、寡核苷酸、单个核血细胞、包含一种或多种所关注的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性基团或者免疫调节药物(IMiD)。
41.权利要求40的组合物，其包含抗体，其中所述抗体为抗CD20抗体。
42.权利要求40的组合物，其包含抗体，其中所述抗体包括选自以下的一种或多种：替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、奥滨尤妥珠单抗、达雷妥尤单抗或乌司奴单抗。
43.权利要求41或42的组合物，其中所述抗体包括利妥昔单抗和奥滨尤妥珠单抗之一或两者。
44.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者给药权利要求1-43中任一项的细胞或者权利要求37和38中任一项的组合物。
45.权利要求44的方法，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。
46.权利要求44或45的方法，其进一步包括给药选自以下的一种或多种抗体：替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、奥滨尤妥珠单抗、达雷妥尤单抗或乌司奴单抗。
47.的方法。
48.一种制备权利要求11或12的T细胞的方法，其包括在细胞分化的条件下分化权利要求1的iPSC，从而获得所述T细胞。
49.权利要求46的方法，其中所述iPSC通过基因组工程化iPSC获得，其中所述基因组工程化包括靶向编辑。
50.权利要求47的方法，其中所述靶向编辑包括通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其他功能变化进行的缺失、插入或插入/缺失。
51.一种衍生自诱导多能干细胞(iPSC)的CD34+造血祖细胞(HPC)，其包含一种或多种编码重排γδT细胞受体(TCR)的多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；以及一个或多个以下附加特征：
(a)编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸；
(b)B2M、TAP 1、TAP 2、Tapasin、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因中的一个或多个缺失或减少表达；
(c)RAG1和RAG2基因的缺失或减少表达；
(d)编码非天然存在的FcγRIII(CD16)变体的外源多核苷酸；
(e)编码白介素15(IL-15)和/或白介素(IL-15)受体或者其变体或截短的外源多核苷酸；
(f)编码组成型活性白介素7(IL-7)受体或其变体的外源多核苷酸；
(g)编码白介素12(IL-12)或白介素21(IL21)或者其变体的外源多核苷酸；
(h)编码人白细胞抗原E(HLA-E)和/或人白细胞抗原G(HLA-G)的外源多核苷酸；
(i)编码白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)和/或CD24的外源多核苷酸；或者
(j)编码一种或多种成像或报告蛋白如PSMA或HSV-tk的外源多核苷酸。
52.权利要求49的CD34+HPC，其中所述iPSC由全外周血单个核细胞(PBMC)重编程。
53.权利要求1-52中任一项的iPSC、T细胞、组合物、方法或HPC，其中所述重排γδTCR包含：
(a)γTCR链，其具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:110的氨基酸序列的CDR3；
(b)γTCR链，其具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:112的氨基酸序列的CDR3；
(c)γTCR链，其具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:114的氨基酸序列的CDR3；
(d)γTCR链，其具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:116的氨基酸序列的CDR3；
(e)γTCR链，其具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:118的氨基酸序列的CDR3；
(f)γTCR链，其具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:120的氨基酸序列的CDR3；
(g)γTCR链，其具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:122的氨基酸序列的CDR3；
(h)γTCR链，其具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:124的氨基酸序列的CDR3；
(i)γTCR链，其具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:126的氨基酸序列的CDR3；
(j)γTCR链，其具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:128的氨基酸序列的CDR3；
(k)γTCR链，其具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的CDR3；
(l)γTCR链，其具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:132的氨基酸序列的CDR3；
(m)γTCR链，其具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:153的氨基酸序列的CDR3；或者
(n)γTCR链，其具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，和δTCR链，其具有SEQ IDNO:155的氨基酸序列的CDR3。
54.权利要求52的iPSC、T细胞、组合物、方法或HPC，其中所述重排γδTCR包含：
a.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR3；
b.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；
c.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR3；
d.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR3；
e.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR3；
f.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3；
g.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR3；
h.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR3；
i.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3；
j.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3；
k.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3；
l.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3；
m.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR3；或者
n.γTCR链，其包含TRGV9和TRGJP基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR3，以及δTCR链，其包含TRDV2、TRDD3和TRDJ1基因编码的氨基酸序列，并且具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3。
55.权利要求1-52中任一项的iPSC、T细胞、方法或HPC，其中所述重排γδTCR包含：
a.γTCR链，其包含与SEQ ID NO:133具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ IDNO:134具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；
b.γTCR链，其包含与SEQ ID NO:135具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ IDNO:136具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；或者
c.γTCR链，其包含与SEQ ID NO:150具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，以及δTCR链，其包含与SEQ IDNO:151具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
56.一种人工细胞死亡多肽，其包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶经由接头融合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。
57.权利要求56的人工细胞死亡多肽，其中所述接头包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
58.权利要求56的人工细胞死亡多肽，其包含与SEQ ID NO:145至少90％相同的氨基酸序列。
59.权利要求56的人工细胞死亡多肽，其包含通过自体蛋白酶肽序列可操作地连接的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。
60.权利要求59的人工细胞死亡多肽，其中所述自体蛋白酶肽是明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)肽。
61.权利要求60的人工细胞死亡多肽，其包含与SEQ ID NO:146至少90％相同的氨基酸序列。
62.一种人工细胞死亡多肽，其包含通过自体蛋白酶肽序列可操作地连接的前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽和分化簇24(CD24)多肽。
63.权利要求62的人工细胞死亡多肽，其中所述自体蛋白酶肽是明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)肽。
64.权利要求63的人工细胞死亡多肽，其包含与SEQ ID NO:147至少90％相同的氨基酸序列。
65.一种iPSC或T细胞，其包含权利要求56-61中任一项的人工细胞死亡多肽。
66.一种iPSC或T细胞，其包含权利要求62-64中任一项的人工细胞死亡多肽。
67.一种诱导多能干细胞(iPSC)或从其衍生的T细胞，其包含：
一种或多种多核苷酸，其编码
(a)重排γδT细胞受体(TCR)；
(b)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源多核苷酸；以及
(c)人工细胞死亡多肽，其包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，所述单纯疱疹病毒胸苷激酶经由接头融合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。
68.一种重组DLL4变体多肽，其具有选自SEQ ID No:140-142的氨基酸序列。
69.一种将iPSC分化成T细胞的方法，其包括在培养基中培养细胞，所述培养基包含选自权利要求68的多肽的重组δ样蛋白4(DLL4)。
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