CN117083384A - 工程细胞的基因转移载体和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于诱导性多能干细胞(iPSC)的基因组工程的组合物和方法。特别地，所述方法和组合物可用于使用基于CRISPR核酸酶的系统(例如基于MAD7核酸酶的系统)将转基因引入iPSC(例如多能造血干细胞和/或祖细胞(HSC/PC))中并制备来源于iPSC的免疫效应细胞。

Description

工程细胞的基因转移载体和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月7日提交的美国临时专利申请第63/171,891号的权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开属于基因组工程领域，特别是细胞基因组的靶向修饰。
关于电子提交的序列表
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，该序列表的文件名为“SequenceListing_ST25.txt”，创建日期为2022年3月31日，大小为119kb。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并通过引用整体并入本文。
背景技术
已经描述了用于基因组DNA的靶向切割的各种方法和组合物。此类靶向切割事件可用于例如诱导靶向突变、诱导细胞DNA序列的靶向删除以及促进在预定染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统以诱导靶标DNA序列中的双链断裂(DSB)或切口，从而使得通过易错程序(例如非同源末端连接(NHEJ))进行的断裂修复或使用修复模板进行的修复(同源定向修复或HDR)可以导致基因敲除或感兴趣序列的插入(靶向整合)。切割可以通过使用引导特定切割的特定核酸酶(例如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或具有工程改造的crRNA/tracr RNA(“单链向导RNA”)的CRISPR/Cas系统)来进行。
诱导性多能干细胞(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是通过插入某些基因由非多能细胞(通常为成体体细胞)人工衍生的多能干细胞类型。诱导性多能干细胞被认为在许多方面(例如，某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体形成、畸胎瘤形成、可存活嵌合体形成以及潜能和分化性)与天然多能干细胞(例如胚胎干细胞)相同，但与天然多能干细胞的关系的全部程度仍在评估中。IPS细胞首先于2006年由小鼠细胞产生(Takahashi等，2006)，于2007年由人类细胞产生(Takahashi等，2007；Yu等，2007)，这被认为是干细胞研究的重要进步，因为它使研究人员获得了多能干细胞——这在研究中很重要，并且可能具有治疗用途(无需使用有争议的胚胎)。
人iPSC技术代表了用于治疗多种血液和非血液恶性肿瘤(包括癌症)的治疗上可行的造血细胞的极有前景且可能无限的来源。为了推进人iPSC和基因工程人iPSC技术作为造血细胞疗法的同种异体来源的前景，不仅必须能够高效且可重复地产生造血干细胞和祖细胞(HSC)，还必须能够产生免疫效应细胞群(包括Τ淋巴细胞、Β淋巴细胞、ΝKΤ淋巴细胞和ΝK淋巴细胞的不同亚群)以及它们的具有所需遗传修饰的祖细胞。因此，需要将基因元件有效插入人iPSC中以用于治疗用途的方法和复合体。
发明内容
本公开描述了用于细胞(例如iPSC)的基因组工程的组合物和方法。特别地，所述方法和组合物涉及将转基因引入iPSC(例如多能造血干细胞和/或祖细胞(HSC/PC))以及制备来源于iPSC的免疫效应细胞的组合物和方法。更特别地，本公开的一个方面涉及用于插入转基因的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体组合物，所述组合物包含：(I)MAD7核酸酶；(II)MAD7核酸酶特异性的向导RNA(gRNA)，其中，所述gRNA包含向导序列，所述向导序列能够与细胞(例如iPSC)中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130；当gRNA与MAD7核酸酶复合时，向导序列引导MAD7核酸酶与靶序列的序列特异性结合；(III)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸序列，和(4)转录终止子序列。
另一方面，本文提供了用于插入转基因的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体组合物，所述组合物包含：(I)MAD7核酸酶系统，所述系统由一个以上载体编码，所述载体包含：(a)编码向导RNA(gRNA)的序列，所述序列可操作地连接至第一调控元件，所述gRNA包含能够与细胞(例如iPSC)中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交的向导序列，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130；当进行转录时，所述向导序列引导MAD7复合体与靶序列的序列特异性结合；和(b)编码MAD7核酸酶的序列，所述序列可操作地连接至第二调控元件；以及(II)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸，和(4)转录终止子序列。
另一方面，本文提供了基于MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)的载体系统，所述载体系统包含：(I)一个以上载体，所述载体包含(a)编码向导RNA(gRNA)的序列，所述序列可操作地连接至第一调控元件，所述gRNA包含能够与细胞(例如，iPSC)中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交的向导序列，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130，当进行转录时，所述向导序列引导MAD7复合体与靶序列的序列特异性结合；(b)编码MAD7核酸酶的序列，所述序列可操作地连接至第二调控元件；(II)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸，和(4)转录终止子序列。
在各种实施方式中，第一调控元件和/或第二调控元件是启动子。在一些实施方式中，第一调控元件和第二调控元件是相同的。在一些实施方式中，第一调控元件和第二调控元件是不同的。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，可选地，所述CAR特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。
在一些实施方式中，向导序列特异性针对AAVSl基因座。在一些实施方式中，AAVS1基因座特异性的gRNA向导序列包含SEQ ID NO:120。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，任选地，所述CAR特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。向导序列特异性针对AAVSl基因座。在一些实施方式中，AAVS1基因座特异性的gRNA向导序列包含SEQ ID NO:120。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码人工细胞死亡多肽的序列。
在一些实施方式中，向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或SEQ IDNO:126。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码人工细胞死亡多肽的序列，向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或126。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码外源细胞因子的序列。
在一些实施方式中，向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，转基因包含编码外源细胞因子的序列，向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。在一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:126。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对NKG2A基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:124。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对TRAC基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:125。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CLYBL基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:123。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CD70基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:127。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CD38基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:128。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，gRNA向导序列特异性针对CD33基因座。在一个实施方式中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与AAVS1的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与B2M的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与CIITA的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含：(i)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的核苷酸序列或它们的片段；或(ii)SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与CLYBL的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与CD70的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与NKG2A的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，与TRAC的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76的核苷酸序列或它们的片段。
在本文所述的组合物或载体系统的一些实施方式中，当RNP复合体被引入细胞中时，在所述细胞中，包含与gRNA分子的向导序列互补的靶序列的内源基因的表达降低或消除。
另一方面，本文提供了包含本文所述的载体系统的一种以上逆转录病毒。
另一方面，本文提供了通过本文所述的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)组合物用转基因转化的iPSC。
另一方面，本文提供了用本文所述的载体系统或本文所述的一种以上逆转录病毒转化的iPSC。
在本文所述的iPSC的一些实施方式中，转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。CAR可以特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。在一些实施方式中，与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原选自：HER2、EGFRvIII、EGFR、CD133、PDGFRA、FGFR1、FGFR3、MET、CD70、ROBO1和IL13Rα2；与卵巢癌相关的肿瘤抗原选自：FOLR1、FSHR、MUC16、MUC1、间皮素、CA125、EpCAM、EGFR、PDGFRα、连接蛋白-4(Nectin-4)和B7H4；与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原选自：GD2、MUC1、间皮素、HER2和EGFR；与肝癌相关的肿瘤抗原选自：紧密连接蛋白18.2(Claudin 18.2)、GPC-3、EpCAM、cMET和AFP；与血液恶性肿瘤相关的肿瘤抗原选自：CD19、CD22、CD79、BCMA、GPRC5D、SLAM F7、CD33、CLL1、CD123和CD70；以及，与膀胱癌相关的肿瘤抗原选自：连接蛋白-4和SLITRK6。
在本文所述的iPSC的一些实施方式中，CAR可以特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自：α-甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、碳酸酐酶EX、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD123、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及HCG的亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-I)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、腱生蛋白(tenascin)、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白(fibronectin)、17-1A-抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物和致癌基因产物。
在本文所述的iPSC的一个实施方式中，肿瘤抗原为CD19。
另一方面，本文提供了来源于本文所述的iPSC的工程化免疫效应细胞或工程化免疫效应细胞群。在一些实施方式中，免疫效应细胞为T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，T细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合。
另一方面，本文提供了包含来源于本文所述的iPSC的免疫效应细胞的药物组合物。
另一方面，本文提供了预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用药学有效量的本文所述的免疫效应细胞或免疫效应细胞群，或本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，癌症选自：肺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤、骨癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤和脑癌。
另一方面，本文提供了包含选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130的向导序列的gRNA。在一些实施方式中，gRNA包含SEQ ID NO:123、124或125的向导序列。在一个实施方式中，gRNA包含SEQ ID NO:123的向导序列。在一个实施方式中，gRNA包含SEQ ID NO:124的向导序列。在一个实施方式中，gRNA包含SEQ ID NO:125的向导序列。
附图说明
图1描绘了AAVS1靶向载体的图谱。
图2描绘了B2M靶向载体的图谱。
图3描绘了CIITA靶向载体的图谱。
图4描绘了CLYBL靶向载体的图谱。
图5描绘了NKG2A靶向载体的图谱。
图6描绘了TRAC靶向载体的图谱。
图7A至7C描绘了用插入AAVS1位点的CAR转基因工程改造的细胞的流式细胞术分析。图7A描绘了工程改造后总(bulk)细胞群的流式细胞术分析。图7B描绘了分选后细胞的CAR阳性细胞的流式细胞术分析。图7C描绘了CAR阳性单细胞克隆的流式细胞术分析。
图8A至8C描绘了用插入B2M位点的HLA-E转基因工程改造的细胞的流式细胞术分析。图8A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图8B描绘了分选后细胞的HLA-E阳性、B2M阴性细胞的流式细胞术分析。图8C描绘了HLA-E阳性、B2M阴性单细胞克隆的流式细胞术分析。
图9A至9C描绘了用插入CIITA位点的EGFR转基因工程改造的细胞的流式细胞术分析。图9A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图9B描绘了分选后细胞的EGFR细胞的流式细胞术分析。图9C描绘了EGFR阳性单细胞克隆的流式细胞术分析。
图10A至10B描绘了用插入CLYBL位点的PSMA转基因工程改造的细胞的流式细胞术分析。图10A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图10B描绘了分选后细胞的PSMA阳性细胞的流式细胞术分析。
图11A至11B描绘了用插入NKG2A位点的IL15-IL15RA转基因工程改造的细胞的流式细胞术分析。图11A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图11B描绘了分选后细胞的IL15-IL15RA阳性细胞的流式细胞术分析。
图12描绘了CIITA靶向载体的图谱。
图13描绘了CD70靶向载体的图谱。
具体实施方式
本申请特别提供了用于细胞(例如iPSC)的基因组工程的组合物和方法。特别地，所述方法和组合物涉及将编码转基因的核酸引入iPSC(例如多能造血干细胞和/或祖细胞(HSC/PC))中，以及制备来源于iPSC的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞)。特别地，公开了编码用于人细胞系基因组工程的基因转移载体的DNA序列和所使用的方法。基因转移载体被设计为用于将转基因插入人细胞(例如iPSC)的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33和/或CLYBL基因座，并包括启动子序列、终止子序列和感兴趣的基因座特异性的同源臂。基因转移载体可以与基于CRISPR核酸酶的系统(例如基于MAD7核酸酶的系统)一起使用。还包括与基于CRISPR核酸酶的系统一起使用(特别是与基于MAD7核酸酶的系统一起使用)以插入转基因的新型向导序列。在一些实施方式中，基于MAD7核酸酶的系统包含非天然存在的或工程化MAD7核酸酶。
一、定义
在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利，这些参考文献中的每一篇均出于所有预期目的通过引用整体并入本文。对已包括在本说明书中的文件、行动、材料、设备、文章等的讨论是出于为本公开的实施方式提供上下文的目的；就所公开或要求保护的任何发明而言，此类讨论并不承认任何或所有这些事项构成现有技术的一部分。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。另外，本文中使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。
除非另有说明，一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本申请的特定实施方式的许多等同方式。此类等同方式旨在被本申请所涵盖。
如本文所用的，术语“包含”、“含”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“带有”、“含有”或“有”或它们的任何其他变体将被理解为暗示包含设定的整数或整数组，但不排除任何其他的整数或整数组，并且旨在为非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其他要素或此类组合物、混合物、过程、方法、制品或装置固有的其他要素。此外，除非明确相反地说明，“或”指开放性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件“A或B”通过如下中的任一种满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)、A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
如本文所用，列举的多个要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一个选项指第一个要素在没有第二个要素的情况下的适用性；第二个选项指在没有第一个要素的情况下第二个要素的适用性。第三个选项指第一个要素和第二个要素一起的适用性。这些选项中的任何一个都被理解为落入该含义内，并且因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。多个选项的同时适用也被理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在整个说明书和权利要求书中所使用的术语“由......组成”或变形(例如“由......构成”或“由......形成”)表示包括任何所列举的整数或整数组，以及可选地包括不实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本性质或新颖性质的任何列举的整数或整数组。
如本文所用，在整个说明书和权利要求中所使用的术语“基本上由......组成”或变形(例如“基本上由......构成”或“基本上由......形成”)表示包括任何所列举的整数或整数组，以及可选地包括不实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本特性或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”指任何动物，优选为哺乳动物，最优选为人。本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于：牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选为人。
还应当理解，当涉及本发明的成分的尺寸或特征(例如，浓度或浓度范围)时，本领域普通技术人员将理解，本文所用的术语“约”、“近似”、“总体上”、“基本上”以及类似术语表示所描述的尺寸/特征不是严格的界限或参数，不排除功能上相同或相似的微小变化。除非另有说明，任何数值(例如本文描述的浓度或浓度范围)将被理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。至少，包括数字参数的此类指代将包括使用本领域中接受的数学和工业原理(例如，四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)而不改变最低有效位数的变化。在一些实施方式中，数值通常包括列举值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，使用的数值范围明确地包括该范围内的所有可能的子范围、所有单独的数值(包括该范围内的整数和值的分数)，除非上下文另外明确指出。
在两个以上核酸序列(例如，向导RNA序列或同源臂序列)或多肽序列(例如，CAR多肽和编码它们的CAR多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”指：当进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用如下序列比较算法中的一种或通过目视检查来测量的，两个或多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。
对于序列比较，通常将一条序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标(coordinate)，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列与参考序列的序列同一性百分比。
例如，可以通过如下进行待比较序列的最佳比对：“Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)”的局部同源性算法、“Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)”的同源性比对算法、“Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)”的相似性检索方法、这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,麦迪逊市,威斯康星州)或目视检查(参见generally,Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.(1995增刊)(Ausubel))。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST2.0算法(分别描述于Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字(word)来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的短字比对时，其匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻域字分数阈值(Altschul等，如上)。这些初始邻域字命中作为启动检索以找到包含它们的更长HSP的种子。只要累积比对分数可以增加，那么字命中则沿着每条序列在两个方向上延伸。
对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数，总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用计分矩阵计算累积分数。当累积比对分数从其达到的最大值降低量X、累积分数因一次以上负分残基比对的累积而变成零或低于零或到达任一序列的末端时，中断字命中在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T以及X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3和期望值(E)为10和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较时的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的另外指示是由第一核酸编码的多肽和由第二核酸编码的多肽的免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本相同，例如，两个肽仅因保守取代而不同的情况。两条核酸序列基本上相同的又一指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
如本文所用，术语“分离的”指生物成分(例如核酸、肽、蛋白质或细胞)已基本上从天然存在该成分的生物体的其他生物成分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质、细胞和组织)分离、生产或纯化。因此，已“分离的”核酸、肽、蛋白质和细胞包括通过标准纯化方法和本文描述的纯化方法纯化的核酸、肽、蛋白质和细胞。“分离的”核酸、肽、蛋白质和细胞可以是组合物的一部分，如果该组合物不是所述核酸、肽、蛋白质或细胞的天然环境的一部分，则“分离的”核酸、肽、蛋白质和细胞仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中的重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”(同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”)指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链DNA和双链DNA、单链区域和双链区域混合的DNA、单链RNA和双链RNA以及单链区域和双链区域混合的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或更典型的双链，或单链区域和双链区域的混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语“多核苷酸”还包括含有一个以上修饰的碱基的DNA或RNA以及为了稳定性或其他原因主链被修饰的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不寻常的碱基(例如肌苷)。可以对DNA和RNA进行多种修饰，因此，“多核苷酸”包括自然界中常见的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对短的核酸链，通常称为“寡核苷酸”。
“构建体”指包含在体外或体内待递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用，“载体”指能够指引外来遗传物质递送或转移至靶细胞的任何核酸构建体，其可以在靶细胞中复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包括待递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合的或非整合的。载体的主要类型包括但不限于：质粒、附加型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
“整合”或“插入”指外源构建体的一个以上序列或核苷酸稳定地插入细胞的基因组中(即共价连接至细胞的染色体DNA或线粒体DNA内的核酸序列)。“靶向整合”指将构建体的核苷酸插入至细胞的染色体DNA或线粒体DNA内的预选位点或“整合位点”。如本文所用，术语“整合”或“插入”还指涉及插入外源构建体的一个以上序列或核苷酸并在整合位点删除或不删除内源序列或一个以上核苷酸的过程。在插入位点发生删除的情况下，“整合”还可以包括用一个以上插入的序列或核苷酸替换删除的内源序列或一个以上核苷酸。
如本文所用，术语“外源”意指所涉及的分子或所涉及的活性是被引入到宿主细胞中的，或者对于宿主细胞而言是非天然的。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传物质中(例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(例如质粒))来引入分子。因此，该术语在用于涉及编码核酸的表达时指将编码核酸以可表达的形式引入细胞中。术语“内源”指所涉及的分子或所涉及的活性以其天然形式存在于宿主细胞中。类似地，当术语“内源”用于涉及编码核酸的表达时指天然包含在细胞内而非外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“转基因”、“感兴趣的基因”或“感兴趣的多核苷酸序列”指，当被置于适当的调控序列的控制下时，在体内转录为RNA并在某些情况下翻译为多肽的DNA序列。感兴趣的基因或多核苷酸可以包括但不限于：原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列以及合成DNA序列。例如，感兴趣的基因可以编码miRNA、shRNA、天然多肽(即在自然界中发现的多肽)或它们的片段、变体多肽(即，与天然多肽具有小于100％的序列同一性的天然多肽的突变体)或它们的片段、工程化多肽或肽片段、治疗性肽或多肽、成像标志物、选择标志物等。
“可操作地连接”指核酸序列或氨基酸序列的可操作连接，使得它们彼此处于功能性关系中。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达(即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)时，启动子与编码序列或功能性RNA可操作地连接。编码序列可以在有义或反义方向与调控序列可操作地连接。
如本文所用，术语“表达”指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因转录成RNA。该术语还涵盖RNA翻译成一个以上多肽，还涵盖所有天然发生的转录后修饰和翻译后修饰。表达的多肽(例如，CAR)可以在宿主细胞的细胞质内、进入细胞外环境(例如细胞培养的生长培养基)或锚定于细胞膜。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可以指由氨基酸组成的分子并且可以被本领域技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或支化的，可以包含修饰的氨基酸，可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被自然修饰或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰(例如用标记成分缀合)。在定义的范围内还包括例如含有一个以上氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。
本文描述的肽序列根据通常惯例来书写，其中肽的N末端区域在左，C末端区域在右。尽管氨基酸的异构形式是已知的，但除非另外明确指出，否则表示的是氨基酸的L-形式。
二、诱导性多能干细胞(IPSC)和免疫效应细胞
IPSC具有无限的自我更新能力。使用iPSC能够使细胞工程产生可以扩增和分化为所需的免疫效应细胞的修饰细胞的受控细胞库，提供大量同质的同种异体治疗产品。
本文提供了基因工程化的iPSC及它们的衍生细胞。本文提供的选择的基因组修饰增强了衍生细胞的治疗特性。通过基因组工程在iPSC水平上将选择的模式的组合引入细胞后，衍生细胞的功能得到改善，适合现货型(off-the-shelf)同种异体细胞疗法。该方法有助于减少由细胞因子释放综合征CRS/移植物抗宿主病(GVHD)介导的副作用，并预防长期的自身免疫，同时提供优异的疗效。
如本文所用，术语“分化”是非特化(specialized)(“未定型(uncommitted)”)或较不特化的细胞获得特化细胞的特征的过程。特化细胞包括例如血细胞或肌细胞。分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系中占据更特化(“定型”)位置的细胞。当用于分化过程时，术语“定型”指已经在分化途径中进行到一定程度的细胞，在正常情况下，该细胞将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的亚群，而不能在正常情况下分化为不同的细胞类型或恢复为分化程度较低的细胞类型。如本文所用，术语“多能”指细胞形成身体或体细胞或胚胎本身的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种多能干细胞，其能够从三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)中的每一层形成细胞。多能性是从不能产生完整有机体的不完全或部分多能细胞(例如，外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整有机体的更原始、更多能的细胞(例如胚胎干细胞)的发育能力的连续体。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或iPSC指由分化的成体、新生个体或胚胎细胞产生的干细胞，其已被诱导或改变或重编程为能够分化为所有三个胚层(中胚层、内胚层和外胚层)或真皮层的组织的细胞。产生的iPSC并非指自然界中发现的细胞。
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前体细胞”指定型为造血谱系但能够进一步造血分化的细胞。造血干细胞包括例如多能造血干细胞(成血细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是产生所有血细胞类型的多能干细胞，所述血细胞类型包括骨髓谱系(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。
如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”指参与免疫应答的细胞。免疫应答包括例如促进免疫效应物的应答。免疫细胞的示例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞和来源于骨髓的吞噬细胞。
如本文所用，术语“工程化免疫细胞”或“工程化免疫效应细胞”指通过向细胞的总遗传物质中添加DNA或RNA形式的外源遗传物质而进行基因修饰的免疫细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，指在胸腺中完成成熟并在免疫系统中具有多种作用的白细胞类型。T细胞的作用包括例如识别体内的特定外来抗原以及激活和失活其他的免疫细胞。T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞(例如Jurkat细胞、SupT1细胞等)，或从哺乳动物获得的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞、可以是处于任何发育阶段的T细胞，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞、调节性T细胞、γδT细胞(gdT细胞；γδT细胞)等。此外，辅助性T细胞的类型包括Th3(Treg)细胞、Th17细胞、Th9细胞或Tfh细胞等细胞。此外，记忆T细胞的类型包括中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tern细胞和TEMRA细胞)等细胞。T细胞还可以指基因工程化的T细胞(例如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞)。T细胞还可以从干细胞或祖细胞分化而来。
“CD4+T细胞”指在它们的表面表达CD4并与细胞介导的免疫应答相关的T细胞亚群。它们的特征在于刺激后的分泌概况，可以包括细胞因子(例如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10)的分泌。“CD4”是55-kD的糖蛋白，最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也在其他细胞(包括单核细胞/巨噬细胞)上发现。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并被认为是MHC(主要组织相容性复合体)II类限制性免疫应答中的联合识别元件。对于T淋巴细胞，它们定义了辅助/诱导亚群。
“CD8+T细胞”指在它们的表面表达CD8、MHC I类限制性的并作为细胞毒性T细胞的T细胞亚群。“CD8”分子是在胸腺细胞以及细胞毒性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的联合识别元件。
如本文所用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”指由表达CD56或CD16且不存在T细胞受体(CD3)定义的外周血淋巴细胞亚群。NK细胞还可以指基因工程化的NK细胞(例如经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的NK细胞)。NK细胞也可以从干细胞或祖细胞分化而来。
诱导性多能干细胞(iPSC)亲代细胞系可以使用任何已知的将重编程因子引入非多能细胞的方法(例如基于附加型质粒的方法)从外周血单核细胞(PBMC)或T细胞产生，所述方法先前描述于美国专利第8,546,140号、第9,644,184号、第9,328,332号以及第8,765,470号中，它们的完整公开内容出于所有预期目的通过引用整体并入本文。重编程因子可以是多核苷酸的形式，由此通过载体(例如逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、附加体(episome)和微环)引入非多能细胞。在具体实施方式中，编码至少一种重编程因子的一种以上多核苷酸通过慢病毒载体引入。在一些实施方式中，一种以上多核苷酸通过附加型载体引入。在各种其他实施方式中，一种以上多核苷酸通过仙台病毒载体引入。在一些实施方式中，iPSC是克隆iPSC或从iPSC池获得，通过在一个以上选择的位点进行一个以上靶向整合和/或插入/删除来引入基因组编辑。在另一个实施方式中，iPSC获得自具有抗原特异性和重组TCR基因的人T细胞(以下也称为“T-iPS”细胞)，如美国专利第9,206,394号和第10,787,642号中所描述的，出于所有预期目的将它们的全部内容通过引用并入本申请。
衍生免疫效应细胞(Derivative Immune Effector Cell)
另一方面，本公开涉及来源于iPSC分化的细胞，即衍生免疫效应细胞。如上所述，引入iPSC的基因组编辑保留在衍生免疫效应细胞中。在由iPSC分化获得的衍生细胞的某些实施方式中，衍生细胞为造血细胞(包括但不限于HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞。在某些实施方式中，衍生细胞为免疫效应细胞，例如NK细胞或T细胞。
在某些实施方式中，本申请提供了具有根据本公开制备的一个以上转基因插入物的、来源于iPSC的自然杀伤(NK)细胞或T细胞。
还提供了一种制造衍生细胞的方法，所述方法包括在细胞分化条件下使iPSC分化，从而获得衍生细胞。
本申请的iPSC可以通过本领域已知的任何方法来进行分化。示例性的方法描述于美国专利第8,846,395号、第8,945,922号、第8,318,491号以及国际专利申请公开第WO2010/099539号、第WO2012/109208号、第WO2017/070333号、第WO2017/179720号、第WO2016/010148号、第WO2018/048828号和第WO2019/157597号中，出于所有预期目的将其中的每一篇通过引用整体并入本文。
三、iPSC中选择的基因座的靶向基因组编辑
根据本申请的实施方式，将一种以上外源多核苷酸插入iPSC的一条以上染色体上的一个以上基因座中。
基因组编辑，或基因组的编辑，或基因编辑，在本文中可互换使用，是基因工程的一种，其中，在靶细胞的基因组中插入、删除和/或替换DNA。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组的编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中预选位点进行插入、删除和/或替换。在靶向编辑期间，当内源序列在插入位点被删除或破坏时，包含受影响序列的内源基因可以由于序列删除或破坏而被敲除或敲低。因此，靶向编辑也可以用于精确破坏内源基因表达。本文类似地使用术语“靶向整合”和“靶向插入”，指涉及在基因组中的预选位点插入一个以上外源序列并在插入位点删除或不删除内源序列的过程。
靶向编辑可以通过不依赖于核酸酶的方法或通过依赖于核酸酶的方法来实现。在不依赖于核酸酶的靶向编辑方法中，通过宿主细胞的酶促机制，由位于待插入的外源多核苷酸两侧的同源序列来引导同源重组。
或者，靶向编辑可以通过特定的稀有切割(rare-cutting)核酸内切酶特异性地引入双链断裂(DSB)来以更高的频率实现。此类依赖于核酸酶的靶向编辑利用DNA修复机制(包括响应于DSB而发生的非同源末端连接(NHEJ))。如果没有含有外源遗传物质的供体载体，NHEJ通常会导致少量内源核苷酸的随机插入或删除(in/dels)。相比之下，当存在含有两侧有一对同源臂的外源遗传物质的供体载体时，可以在同源定向修复(HDR)过程中通过同源重组将外源遗传物质引入基因组中，产生“靶向整合”。
靶向核酸酶包括天然存在的核酸酶和重组核酸酶，例如，来自包括Cas、Cpf、Cse、Csy、Csn、Csd、Cst、Csh、Csa、Csm和Cmr的家族的CRISPR相关核酸酶、限制性核酸内切酶、大范围核酸酶、归巢核酸内切酶等。例如，CRISPR/Cpf1包含两个主要成分：(1)Cpf1核酸内切酶和(2)向导核酸，所述向导核酸可以是DNA或RNA。当共表达时，两种成分形成核糖核蛋白(RNP)复合体，所述复合体被募集到包含PAM和PAM附近的种子区域(seeding region)的靶DNA序列。向导核酸可用于引导Cpf1靶向选定的序列，然后可以通过转染或转导将这两种成分递送至哺乳动物细胞。
自2015年首次报道(Zetsche等，Cell,163(3),759-771)以来，一类替代性CRISPR核酸酶家族Cpfl(也称为Cas12a)已被用于基因组编辑。Cpf1核酸酶表现出与Cas9核酸酶不同的特征，例如交错DSB、富含T的PAM以及仅天然使用1个向导RNA分子与Cpf1形成复合体并靶向DNA。这些特征使Cpf1核酸酶能够用于靶标有机体或有机体基因组内的区域，其中较低的GC含量使得使用Cas9的可行性较小。
最近，美国专利9,982,279和10,337,028中公开了称为MAD7的替代性CRISPR核酸酶，出于所有目的该专利的内容特此整体并入。Inscripta公司已将这种核酸酶免费用于所有商业或学术研究。因此，它的商业基因组编辑应用引起了极大兴趣。Inscripta报告称，MAD7从直肠真杆菌(Eubacterium rectale)中开发，并已在大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和人HEK293T细胞系中证明了其功能。MAD7与氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1(AsCpf1)仅有31％的同一性，它还与氨基酸球菌属BV3L6 Cpf1共有富含T的PAM位点(5'-YTTN-3')和长度为21个核苷酸的前间隔序列(protospacer)(将核酸酶与DNA靶标相关联的gRNA区域)。本公开的某些实施方式特别适合与内切核酸酶MAD7一起应用。这种核酸酶仅需要crRNA即可进行基因编辑，并且允许特异性靶向基因组中富含AT的区域。与具有平端(blunt)切割的化脓性链球菌(S.pyogenes)相比，MAD7以交错切割来切割DNA。
表1中提供了示例性MAD7序列和向导核酸的支架序列。通常，“支架序列”包括具有足以促进靶向性核糖核蛋白复合体形成的序列的任何序列。靶向性核糖核蛋白复合体可以包含核酸引导的核酸酶(例如MAD7)和包含支架序列和向导序列的向导核酸。支架序列内足以促进靶向性核糖核蛋白复合体形成的序列可以具有沿支架序列内两个序列区域(例如参与形成二级结构的一个或两个序列区域(例如假结区域))长度的一定程度的互补性。一个或两个序列区域可以包含在或编码在同一多核苷酸上。或者，一个或两个序列区域可以包含在或编码在不同的多核苷酸上。在一些实施方式中，支架序列可包含SEQ ID NO:117至119中任一项的序列。在一些实施方式中，支架序列包含SEQ ID NO:117的序列。在一些实施方式中，支架序列包含SEQ ID NO:118的序列。在一些实施方式中，支架序列包含SEQ IDNO:119的序列。
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因此，本申请的一个方面提供了包含一种以上外源多核苷酸的构建体，用于利用MAD7核酸内切酶进行基因组靶向插入。在一个实施方式中，构建体还包含一对针对所需插入位点特异性的同源臂，靶向插入方法包括将构建体引入细胞中以使得通过宿主细胞酶促机制进行位点特异性同源重组。在另一个实施方式中，在细胞中的靶向插入方法包括将包含一种以上外源多核苷酸的构建体引入细胞，将包含针对所需插入位点特异性的DNA结合结构域的CRISPR MAD7表达盒引入细胞。特别地，根据本公开，在细胞中的靶向插入方法包括：通过将MAD7核酸酶和包含针对所需插入位点特异性的向导序列的gRNA引入细胞以实现MAD7介导的插入，来将包含一种以上外源多核苷酸的构建体引入细胞以插入iPSC中的特定基因座中。
一般而言，向导核酸可以与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且可以与靶序列杂交，从而将核酸酶引导至靶序列。向导核酸可以是DNA。向导核酸可以是RNA。向导核酸可包含DNA和RNA。向导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在向导核酸包含RNA的情况下，RNA向导核酸可以由多核苷酸分子(例如本文公开的质粒、线性构建体或编辑盒)上的DNA序列编码。特别地，在本公开的某些实施方式中，向导序列与MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体一起使用，用于将转基因插入iPSC的特定基因座中，包含：(I)MAD7核酸酶特异性的向导RNA(gRNA)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含能够与iPSC中的安全港基因座(例如，AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座)杂交的向导序列。当与MAD7核酸酶缔合时，向导序列引导MAD7复合体与靶序列的序列特异性结合，(II)MAD7酶蛋白，以及(III)转基因载体，其包含：(1)与安全港基因座(例如，AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座)的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码感兴趣的转基因的多核苷酸，和(4)转录终止子序列。在一个实施方式中，向导序列包含选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130的核苷酸序列。
用于靶向插入的位点包括但不限于基因组安全港，基因组安全港是人类基因组的基因内或基因外区域，理论上能够适应新插入的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或有机体产生不利影响。在某些实施方式中，用于靶向插入的基因组安全港为一个以上选自如下基因的基因座：AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座基因。
在其他实施方式中，对靶向插入的位点进行选择以删除或降低插入位点处的内源基因的表达。如本文所用，关于基因表达的术语“删除”指消除基因表达的任何基因修饰。基因表达的“删除”的示例包括例如消除基因表达的基因中DNA序列的去除或删除、在基因的基因座处插入外源多核苷酸序列、以及基因内的一个以上取代。
靶向删除的基因包括但不限于主要组织相容性复合体(MHC)I类和MHC II类蛋白的基因。多种MHC I类和MHC II类蛋白必须在同种异体接受者中组织相容性匹配，以避免同种异体排斥问题。“MHC缺陷”(包括MHC-I类缺陷、或MHC-II类缺陷、或MHC-I类缺陷和MHC-II类缺陷两者)指细胞缺乏或不再维持完整MHC复合体(包含MHC I类蛋白异二聚体和/或MHCII类异二聚体)的表面表达水平，或具有降低的完整MHC复合体(包含MHC I类蛋白异二聚体和/或MHC II类异二聚体)的表面表达水平，使得经减少或经降低的水平低于通过其他细胞或通过合成方法天然可检测的水平。MHC I类缺陷可通过功能性删除MHC I类基因座(染色体6p21)的任何区域，或删除或降低一种以上MHC I类相关基因的表达水平来实现，所述MHCI类相关基因包括但不限于β2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和甲巯蛋白(Tapasin)基因。例如，B2M基因编码对所有MHC I类异二聚体的细胞表面表达至关重要的共同亚基。B2M无效的(null)细胞缺乏MHC-I。MHC II类缺陷可以通过功能性删除或减少MHC-II相关基因来实现，所述MHC-II相关基因包括但不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP。CIITA是一种转录共激活因子，其通过激活II类蛋白表达所需的转录因子RFX5发挥作用。CIITA无效的细胞缺乏MHC-II。在某些实施方式中，将一种以上外源多核苷酸插入选自B2M、TAP 1、TAP 2、甲巯蛋白、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因的一个以上基因的基因座处，从而删除或减少被插入处的基因的表达。
在某些实施方式中，将外源多核苷酸插入到细胞染色体上的一个以上基因座处，优选地，所述一个以上基因座为选自如下的基因：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAPI、TAP2、甲巯蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR a恒定区或b恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、CD70、CD38、CD33或TIGIT基因，前提是所述一个以上基因座中的至少一个是MHC基因，例如选自如下的基因：B2M、TAP 1、TAP 2、甲巯蛋白、RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP基因。优选地，将所述一种以上外源多核苷酸插入到MHC I类相关基因(例如β2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因或甲巯蛋白基因)和MHC-II相关基因(例如RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP或CIITA基因)的基因座处；可选地，还将所述一种以上外源多核苷酸插入到选自如下的安全港基因的基因座处：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原、HTRP、H11、GAPDH、TCR和RUNX1基因。更优选地，将所述一种以上外源多核苷酸插入到CIITA、AAVS1和B2M基因的基因座处。
在某些实施方式中，可以将多个转基因插入到旨在删除复合体(MHC)I类和MHC II类蛋白的靶向位点处。例如，(a)可以将第一外源多核苷酸插入到AAVS1基因的基因座处；(b)可以将第二外源多肽插入到CIITA基因的基因座处；可以将第三外源多肽插入到B2M基因的基因座处；外源多核苷酸的插入删除或减少CIITA和B2M基因的表达。
在某些实施方式中，用于插入AAVSl基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:120的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:60的核苷酸序列或其片段，右同源臂包含SEQ IDNO:61的核苷酸序列或其片段。
在某些实施方式中，用于插入B2M基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:121的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:63的核苷酸序列或其片段，右同源臂包含SEQ IDNO:64的核苷酸序列或其片段。
在某些实施方式中，用于插入CIITA基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:122的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:66的核苷酸序列或其片段，右同源臂包含SEQ IDNO:67的核苷酸序列或其片段。在某些实施方式中，用于插入CIITA基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:126的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列或其片段，右同源臂包含SEQ ID NO:107的核苷酸序列或其片段。
在某些实施方式中，用于插入NKG2A基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:123的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:69的核苷酸序列或其片段，右同源臂包含SEQ IDNO:70的核苷酸序列或其片段。
在某些实施方式中，用于插入TRAC基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:124的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:72的核苷酸序列或其片段，右同源序列包含SEQ IDNO:73的核苷酸序列或其片段。
在某些实施方式中，用于插入CLYBL基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:125的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:75的核苷酸序列或其片段，右同源序列选自SEQID NO:76或其片段。
在某些实施方式中，用于插入CD70基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:127的向导序列或其变体，左同源臂包含SEQ ID NO:109的核苷酸序列或其片段，右同源序列选自SEQ IDNO:110或其片段。
在某些实施方式中，用于插入CD38基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:128的向导序列或其变体。
在某些实施方式中，用于插入CD33基因座的向导RNA包含SEQ ID NO:129或130的向导序列或其变体。
表2提供了用于本公开的组合物和方法(例如，用于改变iPSC靶基因的表达或改变iPSC靶基因)的gRNA分子的靶向结构域序列(提供了RNA和DNA序列)和相应的同源臂序列。
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同源臂
无论是单链还是双链，供体模板通常包含一个以上与待切割的靶序列(例如切割位点)内或附近(例如在两侧或邻接)的DNA(例如靶核酸)区域同源的区域。这些同源区域在本文中被称为“同源臂”，示意性地说明如下：
[5’同源臂]-[替换序列]-[3’同源臂]。
本文描述的供体模板的同源臂可以具有任何合适的长度，只要该长度足以允许通过需要供体模板的DNA修复过程有效分辨靶核酸上的切割位点。在某些实施方式中，当需要通过例如PCR对同源臂进行扩增时，同源臂的长度使得可以进行扩增。在某些实施方式中，当需要对同源臂进行测序时，同源臂的长度使得可以进行测序。在某些实施方式中，当需要对扩增子进行定量评估时，同源臂的长度使得每个扩增子获得相似数量的扩增(例如通过具有相似的G/C含量、扩增温度等)。在某些实施方式中，同源臂是双链的。在某些实施方式中，双链同源臂是单链的。
在某些实施方式中，5’同源臂的长度为50至250个核苷酸。在某些实施方式中，5'同源臂的长度为约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约125个核苷酸、约150个核苷酸、约175个核苷酸、约200个核苷酸、约225个核苷酸或约250个核苷酸。
在某些实施方式中，3’同源臂的长度为50至250个核苷酸。在某些实施方式中，3'同源臂的长度为约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约125个核苷酸、约150个核苷酸、约175个核苷酸、约200个核苷酸、约225个核苷酸或约250个核苷酸。
5’同源臂和3’同源臂可以具有相同的长度或可以具有不同的长度。在某些实施方式中，扩增5’同源臂和3’同源臂以允许对靶核酸处的基因编辑事件(例如靶向插入)进行定量评估。在某些实施方式中，基因编辑事件的定量评估可以依赖于通过在单个扩增反应中使用单对PCR引物扩增同源臂的全部或一部分来对靶向插入位点处的5’接点和3’接点进行的扩增。因此，尽管5’同源臂和3’同源臂的长度可以不同，但每个同源臂的长度应该能够根据需要进行扩增(例如使用PCR)。此外，当需要在单个PCR反应中扩增5’同源臂以及5’同源臂和3’同源臂的长度差时，5'和3'同源臂的长度差应允许使用单对PCR引物的PCR扩增。
四、用于插入iPSC的转基因
根据本申请的实施方式，通过使用本公开所述的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体插入一个以上转基因来工程化改造iPSC。可以利用本公开的RNP复合体、向导序列和同源臂插入包含感兴趣基因的大量不同转基因。下面进一步讨论示例性的转基因：
A.嵌合抗原受体(“CAR”)
可以插入的转基因中的至少一种为编码外源嵌合抗原受体(CAR)的转基因，例如靶向肿瘤抗原的CAR。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)指至少包含特异性地结合抗原或靶标的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的重组多肽。CAR的胞外结构域与靶细胞表面上的靶抗原结合引起CAR聚集，并向含有CAR的细胞传递激活刺激。CAR改变免疫效应细胞的特异性指向，触发增殖、产生细胞因子、吞噬作用和/或产生如下分子：该分子可以以不依赖于主要组织相容性(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡。
如本文所用，术语“信号肽”指位于新生态CAR蛋白的氨基末端(N-末端)的前导序列，其在翻译的同时或翻译后将新生态蛋白引导至内质网以及随后的表面表达。
如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”指位于细胞膜外侧并能够与抗原、靶标或配体结合CAR部分。
如本文所用，术语“铰链区”或“铰链结构域”指连接CAR蛋白的两个相邻结构域(即，CAR蛋白的胞外结构域和跨膜结构域)的CAR部分。
如本文所用，术语“跨膜结构域”指延伸穿过细胞膜并将CAR锚定至细胞膜的CAR部分。
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”、“胞质信号传导结构域”或“胞内信号传导结构域”指位于细胞膜内侧并能够转导效应信号的CAR部分。
如本文所用，术语“刺激分子”指由免疫细胞(例如，T细胞)表达的分子，该分子至少在免疫细胞信号传导通路的某些方面提供以刺激方式调节受体的初级激活的初级细胞质信号传导序列。刺激分子包含两类不同的胞质信号传导序列：启动抗原依赖性初级激活的胞质信号传导序列(称为“初级信号传导结构域”)，以及以不依赖于抗原的方式发挥作用以提供次级共刺激信号的序列(称为“共刺激信号传导结构域”)。
在某些实施方式中，胞外结构域包含抗原结合结构域和/或抗原结合片段。抗原结合片段可以是例如特异性结合肿瘤抗原的抗体或抗体的抗原结合片段。本申请的抗原结合片段具有一种以上期望的功能特性，包括但不限于与肿瘤抗原的高亲和力结合、针对肿瘤抗原的高特异性、刺激针对表达肿瘤抗原的细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性吞噬作用(ADPC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力，以及当单独施用或与其他抗癌疗法组合施用时抑制有需要的受试者和动物模型中的肿瘤生长的能力。
如本文所用，术语“抗体”以广泛意义使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，抗体分子包括单克隆或多克隆的人抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段、复合抗体和抗体片段以及嵌合抗体和抗体片段。通常，抗体是针对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是众所周知的。免疫球蛋白可以根据重链恒定结构域的氨基酸序列分为五个主要类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类。因此，本申请的抗体可以是五个主要类别或相应的亚类中的任何抗体。优选地，本申请的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。脊椎动物的抗体轻链可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列分配至两种明显不同类型(即κ和λ)中的一种。因此，本申请的抗体可以含有κ轻链恒定结构域或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方式，本申请的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区。除了重链恒定区和轻链恒定区之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个可变区含有三个结构域(即互补决定区1-3，CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域可以替代性地称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区结构域可以替代性地称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合特定肿瘤抗原的分离的抗体基本上不含不与该肿瘤抗原结合的抗体)。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，组成该群的各个抗体是相同的(除了可以少量存在的可能天然发生的突变之外)。本申请的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，该杂交瘤包括从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体片段，例如，双抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdAb)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个以上CDR的抗体的部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体、微型抗体(minibody)、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、轻链可变结构域(VL)、骆驼科动物抗体的可变结构域(VHH)、或结合抗原但不具有完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合亲本抗体或亲本抗体片段所结合的同一抗原。
如本文所用，术语“单链抗体”指本领域常规的单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸(例如接头肽)连接的重链可变区和轻链可变区。
如本文所用，术语“单域抗体”指本领域常规的单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。该定义的人抗体包括完整或全长抗体、完整或全长抗体的片段和/或包含至少一条人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”指经过修饰以增加与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性被保留，但抗体在人体中的抗原性降低。
如本文所用，术语“嵌合抗体”指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个以上物种的抗体。轻链和重链的可变区通常与来源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有需要的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区相对应，而恒定区与来源于另一哺乳动物物种(例如人)的抗体的序列相对应以避免在该物种中引发免疫反应。
如本文所用，术语“多特异性抗体”指包含多种免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中，多种免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性，多种免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方式中，第一表位和第二表位在同一抗原(例如相同蛋白质(或多聚蛋白质的亚基))上。在一个实施方式中，第一表位与第二表位重叠或基本上与第二表位重叠。在一个实施方式中，第一表位不与第二表位重叠或基本上不与第二表位重叠。在一个实施方式中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施方式中，多特异性抗体包含第三免疫球蛋白可变结构域、第四免疫球蛋白可变结构域或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体为双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于具有针对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和具有针对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方式中，第一表位和第二表位在同一抗原(例如相同蛋白质(或多聚蛋白质的亚基))上。在一个实施方式中，第一表位与第二表位重叠或基本上与第二表位重叠。在一个实施方式中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施方式中，双特异性抗体包含具有针对第一表位的结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及具有针对第二表位的结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体包含针对第一表位的结合特异性的半抗体或半抗体的片段以及具有针对第二表位的结合特异性的半抗体或半抗体的片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包含具有针对第一表位的结合特异性的scFv或scFv的片段以及具有针对第二表位的结合特异性的scFv或scFv的片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包含具有针对第一表位的结合特异性的VHH和具有针对第二表位的结合特异性的VHH。
如本文所用，“特异性结合肿瘤抗原”的抗原结合结构域或抗原结合片段指结合肿瘤抗原的抗原结合结构域或抗原结合片段，其中KD为1×10-7M以下，优选1×10-8M以下，更优选5×10-9M以下、1×10-9M以下、5×10-10M以下或者1×10-10M以下。术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得并表示为摩尔浓度(M)。可以基于本公开使用本领域的方法来确定抗体的KD值。例如，抗原结合结构域或抗原结合片段的KD可以通过使用表面等离子共振来确定，例如通过使用生物传感器系统(例如系统)，或通过使用生物膜干涉测量技术(例如Octet RED96系统)。
抗原结合结构域或抗原结合片段的KD值越小，抗原结合结构域或抗原结合片段与靶抗原结合的亲和力越高。
在各种实施方式中，适用于本公开的CAR的抗体或抗体片段包括但不限于：单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、多肽-Fc融合物、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、掩蔽抗体(例如)、小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、胞内抗体(intrabody)、微型抗体、单域抗体可变结构域、纳米抗体、VHH、双抗体、串联双抗体/>抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对抗原特异性TCR的抗Id抗体)以及任何以上抗体或抗体片段的表位结合片段。抗体和/或抗体片段可以来源于小鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化版本、鲨鱼抗体可变结构域和人源化版本、以及骆驼化抗体可变结构域。
在一些实施方式中，抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、VHH、VNAR、单域抗体(sdAb)或纳米抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、重链可变区、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、三抗体(triabody)或十抗体(decabody)。在一些实施方式中，抗原结合片段为scFv片段。在一些实施方式中，抗原结合片段为VHH。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含单结构域抗体或纳米抗体。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含VHH。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域和标签各自包含VHH。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、标签和抗原结合结构域各自包含VHH。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含scFv。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域和标签各自包含scFv。
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、标签和抗原结合结构域各自包含scFv。
表现出类似功能特征(例如靶生物分子的高亲和力和特异性结合)的免疫球蛋白结构域的替代性支架也可以用于本公开的CAR中。已表明此类支架产生具有改进特性(例如更高的稳定性或降低的免疫原性)的分子。可用于本公开的CAR中的替代性支架的非限制性示例包括工程化腱生蛋白衍生的腱生蛋白III型结构域(例如CentyrinTM)；工程化γ-B晶状体蛋白衍生的支架或工程化泛素衍生的支架(例如Affilins)；工程化纤连蛋白衍生的纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)(例如单体(monobody)、AdNectinsTM或AdNexinsTM)；工程化含有锚蛋白重复基序的多肽(例如DARPinsTM)；工程化低密度脂蛋白受体衍生的A结构域(LDLR-A)(例如AvimersTM)；脂钙蛋白(lipocalin)(例如抗运载蛋白(anticalin))；工程化蛋白酶抑制剂衍生的Kunitz结构域(例如EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2)；工程化A蛋白衍生的Z结构域(AffibodiesTM)；Sac7d衍生的多肽(例如或affitins)；工程化Fyn衍生的SH2结构域(例如/>)；CTLD3(例如四连蛋白(Tetranectin))；硫氧还原蛋白(例如肽适体)；/>β-三明治(β-sandwich)(例如iMab)；微蛋白(miniprotein)；C型凝集素样结构域支架；工程化抗体模拟物；以及前述物质的保留了其结合功能的任何基因操作对应物(/>A,Pluckthun A,J Mol Biol 305:989-1010(2001)；Xu L等，Chem Biol 9:933-42(2002)；Wikman M等，Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004)；Binz H等，Nat Biolechnol 23:1257-68(2005)；Hey T等，Trends Biotechnol 23:514-522(2005)；Holliger P,Hudson P,Nat Biotechnol 23:1126-36(2005)；Gill D,Damle N,Curr Opin Biotech 17:653-8(2006)；Koide A,Koide S,Methods Mol Biol352:95-109(2007)；Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304；Byla P等，JBiol Chem 285:12096(2010)；Zoller F等，Molecules 16:2467-85(2011)，出于所有预期目的，每个都通过引用整体并入)。
在一些实施方式中，替代性支架为Affilin或Centyrin。
在一些实施方式中，本公开的CAR的第一多肽包含前导序列。前导序列可以位于胞外标签结合结构域的N末端。在CAR的细胞加工和定位到细胞膜的过程中，可选地，前导序列可以从胞外标签结合结构域切割下来。本领域技术人员已知的各种前导序列中的任何一种都可以用作前导序列。作为前导序列的来源的肽的非限制性示例可以包括：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)、FcεR、人免疫球蛋白(IgG)重链(HC)可变区、CD8α或T细胞分泌的任何各种其他蛋白质。在各种实施方式中，前导序列与T细胞的分泌途径相容。在某些实施方式中，前导序列来源于人免疫球蛋白重链(HC)。
在一些实施方式中，前导序列来源于GMCSFR。在一个实施方式中，GMCSFR前导序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，本公开的CAR的第一多肽包含跨膜结构域，所述跨膜结构域符合阅读框(in frame)地融合在胞外标签结合结构域和胞质结构域之间。
跨膜结构域可以来源于贡献了胞外标签结合结构域的蛋白、贡献了信号传导结构域或共信号传导结构域的蛋白，或来源于完全不同的蛋白。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代、删除或插入来选择或修饰，以最小化与CAR复合体的其他成员的相互作用。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代、删除或插入来选择或修饰，以避免与跨膜结构域天然相关的蛋白的结合。在某些实施方式中，跨膜结构域包含额外的氨基酸以允许与跨膜结构域连接的结构域之间的柔性和/或最佳距离。
跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。当来源于天然来源时，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开中特别使用的跨膜结构域的非限制性示例可以来源于(即，至少包含如下的跨膜区)：T细胞受体(TCR)的α、β或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。例如，可以在合成跨膜结构域的每个末端存在苯丙氨酸、色氨酸和/或缬氨酸的三联体。
在一些实施方式中，需要使用包含能够进行二硫键键合的半胱氨酸残基的ζ、η或FcεR1γ链的跨膜结构域，使得所得的嵌合蛋白将能够与其自身形成二硫键连接的二聚体，或使用未经修饰的ζ、η或FcεR1γ链或相关蛋白。在一些情况下，跨膜结构域将通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合体的其他成员的相互作用。在其他情况下，需要使用ζ、η或FcεR1γ和FcεR1γβ、MB1(Igα.)、B29或CD3γ、CD3ζ或CD3η的跨膜结构域，以保持与受体复合体其他成员的物理缔合。
在一些实施方式中，跨膜结构域来源于CD8或CD28。在一个实施方式中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:24具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，本公开的CAR的第一多肽包含在胞外标签结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区，其中，标签结合结构域、接头和跨膜结构域彼此之间符合阅读框。
如本文所用，术语“间隔区”通常指具有将标签结合结构域连接至跨膜结构域的功能的任何寡肽或多肽。间隔区可用于为标签结合结构域提供更大的柔性和可接近性。间隔区可以包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。间隔区可以来源于天然存在的分子的全部或部分，例如来源于CD8、CD4或CD28的胞外区的全部或部分，或者来源于抗体恒定区的全部或部分。或者，间隔区可以是与天然存在的间隔区序列相对应的合成序列，或者可以是完全合成的间隔区序列。本公开可以使用的间隔区的非限制性示例包括：人CD8a链的部分、CD28的部分胞外结构域、FcγRIIIa受体、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Ig铰链或它们的功能片段。在一些实施方式中，将额外的连接氨基酸添加到间隔区以确保抗原结合结构域与跨膜结构域之间的最佳距离。在一些实施方式中，当间隔区来源于Ig时，可以对间隔区进行突变以防止Fc受体的结合。
在一些实施方式中，间隔区包含铰链结构域。铰链结构域可以来源于CD8α、CD28或免疫球蛋白(IgG)。例如，IgG铰链可以来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或它们的嵌合体。
在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白IgG铰链或免疫球蛋白IgG铰链的功能片段。在某些实施方式中，IgG铰链来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或它们的嵌合体。在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白的CH1、CH2、CH3和/或铰链区。在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白的核心铰链区。术语“核心铰链”可以与术语“短铰链”(又名“SH”)互换使用。合适的铰链结构域的非限制性示例为核心免疫球蛋白铰链区，包括：来自IgGl的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:55)、来自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:56)、来自IgG3的ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQID NO:57)，和来自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:58)(另参见Wypych等，JBC 2008 283(23):16194-16205，出于所有目的通过引用将其整体并入本文)。在某些实施方式中，铰链结构域为免疫球蛋白铰链的片段。
在一些实施方式中，铰链结构域来源于CD8或CD28。在一个实施方式中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，跨膜结构域和/或铰链结构域来源于CD8或CD28。在一些实施方式中，跨膜结构域和铰链结构域均来源于CD8。在一些实施方式中，跨膜结构域和铰链结构域均来源于CD28。
表3.铰链序列
在某些方面，本公开的CAR的第一多肽包含胞质结构域，所述胞质结构域包含至少一个胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，胞质结构域还包含一个以上共刺激信号传导结构域。
胞质结构域负责激活其中已放置了CAR的宿主细胞(例如T细胞)的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，术语“信号传导结构域”指转导效应子功能信号并引导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常为整个信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短部分可以用来代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语“胞内信号传导结构域”意在包括任何足以转导效应子功能信号的信号传导结构域的截短部分。
可用于本公开的CAR中的信号传导结构域的非限制性示例包括例如来源于如下的信号传导结构域：DAP10、DAP12、Fcε受体Iγ链(FCER1G)、FcRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD5、CD22、CD226、CD66d、CD79A和CD79B。
在一些实施方式中，胞质结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，CD3ζ信号结构域包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，胞质结构域还包含一个以上共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，所述一个以上共刺激信号传导结构域来源于：CD28、41BB、IL2Rb、CD40、0X40(CD134)、CD80、CD86、CD27、ICOS、NKG2D、DAP10、DAP12、2B4(CD244)、BTLA、CD30、GITR、CD226、CD79A和HVEM。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于41BB。在一个实施方式中，41BB共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:8具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于IL2Rb。在一个实施方式中，IL2Rb共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:9具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于CD40。在一个实施方式中，CD40共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:10具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于0X40。在一个实施方式中，OX40共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:11具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于CD80。在一个实施方式中，CD80共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:12具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于CD86。在一个实施方式中，CD86共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:13具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于CD27。在一个实施方式中，CD27共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:14具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于ICOS。在一个实施方式中，ICOS共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:15具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于NKG2D。在一个实施方式中，NKG2D共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:16具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于DAP10。在一个实施方式中，DAP10共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:17具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于DAP12。在一个实施方式中，DAP12共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:18具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于2B4(CD244)。在一个实施方式中，2B4(CD244)共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:19具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于CD28。在一个实施方式中，CD28共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:20具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施方式中，本公开的CAR包含全都来源于CD28的铰链区、跨膜区和共刺激信号传导结构域。在一个实施方式中，来源于CD28的铰链区、跨膜区和共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，本公开的CAR包含一个共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，本公开的CAR包含两个以上共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，本公开的CAR包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个共刺激信号传导结构域。
在一些实施方式中，信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序放置。在一些实施方式中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的上游。在一些实施方式中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的下游。在包含两个以上共刺激结构域的情况下，可以转换共刺激信号传导结构域的顺序。
表4中提供了非限制性示例的CAR区域和序列。
表4.
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在一些实施方式中，第二多肽的抗原结合结构域与抗原结合。第二多肽的抗原结合结构域可以结合超过一种抗原或抗原中的超过一个表位。例如，第二多肽的抗原结合结构域可以结合两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种抗原。作为另一个示例，第二多肽的抗原结合结构域可以结合同一抗原中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个表位。
抗原结合结构域的选择可以取决于界定靶细胞表面的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别靶细胞上作为与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的抗原。在某些实施方式中，可以通过工程设计需要的特异性结合抗原(例如，在肿瘤细胞上)的抗原结合结构域来对本公开的CAR进行基因修饰以靶向感兴趣的肿瘤抗原。可以作为本公开的CAR中的抗原结合结构域的靶标的细胞表面标志物的非限制性示例包括与肿瘤细胞或自身免疫性疾病相关的那些。
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种肿瘤抗原或自身免疫性抗原。
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种肿瘤抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合两种以上肿瘤抗原。在一些实施方式中，两种以上肿瘤抗原与同一肿瘤相关。在一些实施方式中，两种以上肿瘤抗原与不同的肿瘤相关。
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种自身免疫性抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合两种以上自身免疫性抗原。在一些实施方式中，两种以上自身免疫性抗原与同一自身免疫性疾病相关。在一些实施方式中，两种以上自身免疫性抗原与不同的自身免疫性疾病相关。
在一些实施方式中，肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：HER2、EGFRvIII、EGFR、CD133、PDGFRA、FGFR1、FGFR3、MET、CD70、ROBO1和IL13Rα2。与卵巢癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：FOLR1、FSHR、MUC16、MUC1、间皮素、CA125、EpCAM、EGFR、PDGFRα、连接蛋白-4和B7H4。与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：GD2、MUC1、间皮素、HER2和EGFR。与肝癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：紧密连接蛋白18.2、GPC-3、EpCAM、cMET和AFP。与血液恶性肿瘤相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：CD22、CD79、BCMA、GPRC5D、SLAM F7、CD33、CLL1、CD123和CD70。与膀胱癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括：连接蛋白-4和SLITRK6。
抗原结合结构域可以靶向的抗原的另外的示例包括但不限于：α-甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、碳酸酐酶EX、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD123、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及HCG的亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-I)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物或致癌基因产物。
在一个实施方式中，抗原结合结构域靶向的抗原是CD19。在一个实施方式中，抗原结合结构域包含抗CD19 scFv。在一个实施方式中，抗CD19 scFv包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，抗CD19 scFv包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，抗原与自身免疫性疾病或病症相关。此类抗原可以来源于细胞受体和产生“自体”定向抗体的细胞。在一些实施方式中，抗原与例如如下自身免疫性疾病或病症相关：类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、干燥综合征、系统性红斑狼疮、结节病、1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳肉芽肿、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在一些实施方式中，本文公开的CAR可以靶向的自身免疫性抗原包括但不限于：血小板抗原、髓磷脂蛋白抗原、snRNP中的Sm抗原、胰岛细胞抗原、类风湿因子、抗瓜氨酸化蛋白、瓜氨酸化蛋白和肽(例如CCP-1、CCP-2(环瓜氨酸化肽))、纤维蛋白原、纤维蛋白、波形蛋白、丝聚蛋白、I型和II型胶原蛋白肽、α-烯醇化酶、翻译起始因子4G1、核周因子、角蛋白、Sa(细胞骨架蛋白波形蛋白)、关节软骨的成分(例如胶原蛋白II、IX和XI)、循环血清蛋白(例如RF(IgG、IgM))、纤维蛋白原、纤溶酶原、铁蛋白、核组分(例如RA33/hnRNP A2、Sm、真核翻译延伸因子1α1)、应激蛋白(例如HSP-65、HSP-70、HSP-90)、BiP、炎症/免疫因子(例如B7-H1、IL-1α和IL-8)、酶(例如钙蛋白酶抑制蛋白、α-烯醇化酶、醛缩酶-A、二肽基肽酶)、骨桥蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、受体(例如脂皮质素1)、中性粒细胞核蛋白(例如乳铁蛋白和25-35kD的核蛋白)、颗粒蛋白(例如杀菌性通透性增加蛋白(BPI))、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶、蛋白酶3、血小板抗原、髓磷脂蛋白抗原、胰岛细胞抗原、类风湿因子、组蛋白、核糖体P蛋白、心磷脂、波形蛋白、核酸(例如dsDNA、ssDNA、RNA)、核糖核颗粒和蛋白质(例如Sm抗原(包括但不限于SmD's和SmB'/B))、U1RNP、A2/B1 hnRNP、Ro(SSA)以及La(SSB)抗原。
在各种实施方式中，本公开的CAR中使用的scFv片段可以包括VH结构域和VL结构域之间的接头。接头可以是肽接头，并且可以包含任何天然存在的氨基酸。接头中可以包含的示例性氨基酸为Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。接头的长度应当足以连接VH和VL以使它们相对于彼此形成正确的构象，从而使它们保留所需的活性(例如与抗原的结合)。接头的长度可以为约5至50个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至40个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至35个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至30个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至25个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至20个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约15至20个氨基酸。可以使用的示例性接头为富含Gly的接头、包含Gly和Ser的接头、包含Gly和Ala的接头、包含Ala和Ser的接头以及其他柔性接头。
在一个实施方式中，接头为Whitlow接头。在一个实施方式中，Whitlow接头包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在另一个实施方式中，接头是(G4S)3接头。在一个实施方式中，(G4S)3接头包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:25具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
其他接头序列可以包括来源于任何免疫球蛋白重链或轻链同种型的免疫球蛋白铰链区、CL或CH1的部分。可以使用的示例性接头包括表4中的SEQ ID NO:26至54的任意序列。另外的接头描述于例如国际专利申请公开第WO2019/060695号，出于所有预期目的通过引用将其整体并入本文。
B.人工细胞死亡多肽
本公开的另一种可能用于插入的转基因是编码人工细胞死亡多肽的外源多核苷酸。
如本文所用，术语“人工细胞死亡多肽”指设计以防止细胞疗法的潜在毒性或其他副作用的工程化蛋白。人工细胞死亡多肽可以介导细胞凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、DNA复制、生长停滞、转录和转录后基因调节和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，人工细胞死亡多肽由外源分子(例如抗体)激活，当被激活时，触发治疗性细胞的细胞凋亡和/或细胞死亡。在某些实施方式中，人工细胞死亡多肽的作用机制是代谢、二聚化诱导或治疗性单克隆抗体介导的。
在某些实施方式中，人工细胞死亡多肽为失活的细胞表面受体，所述细胞表面受体包含由抗体(特别是单克隆抗体)特异性识别的表位(在本文中也称为单克隆抗体特异性表位)。当由iPSC或iPSC的衍生细胞表达时，失活的细胞表面受体的信号传导失活或显著受损，但仍可被抗体特异性识别。抗体与失活的细胞表面受体的特异性结合使得能够通过ADCC和/或ADCP机制消除iPSC或iPSC的衍生细胞，以及用具有毒素或放射性核素的抗体药物缀合物直接杀死PSC或iPSC的衍生细胞。
在某些实施方式中，失活的细胞表面受体包含选自抗体特异性识别的表位，所述抗体包括但不限于替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英夫利西单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、培赛利珠单抗(certolizumab pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、雷珠单抗(ranibizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)或优特克单抗(ustekinumab)。
表皮生长因子受体，也称为EGFR、ErbB1和HER1，是胞外配体的表皮生长因子家族成员的细胞表面受体。如本文所用，“截短的EGFR”、“tEGFR”、“短EGFR”或“sEGFR”指缺乏EGFR的EGF结合结构域和胞内信号传导结构域的无活性EGFR变体。示例性的tEGFR变体含有结构域2的322至333氨基酸残基、结构域3和4的全部以及含有西妥昔单抗结合表位的天然EGFR序列的跨膜结构域。tEGFR变体在细胞表面的表达使得能够根据需要通过特异性结合tEGFR的抗体(例如西妥昔单抗)来消除细胞。由于不存在EGF结合结构域和胞内信号传导结构域，tEGFR在由iPSC或iPSC的衍生细胞表达时是失活的。
本申请的示例性的失活的细胞表面受体包含tEGFR变体。在某些实施方式中，当表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞与抗EGFR抗体接触时，该工程化免疫细胞中表达的失活的细胞表面受体诱导该工程化免疫细胞的细胞自杀。使用失活的细胞表面受体的方法描述于WO2019/070856、WO2019/023396、WO2018/058002中，它们的公开内容通过引用并入本文。例如，可以向先前已接受本公开的工程化免疫细胞的受试者施用有效量的抗EGFR抗体以消除受试者体内的先前施用的工程免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含编码包含tEGFR变体的失活的细胞表面受体的异源多核苷酸。
在某些实施方式中，抗EGFR抗体为西妥昔单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)或帕尼单抗，优选地，抗EGFR抗体为西妥昔单抗。
在某些实施方式中，tEGFR变体包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:77具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方式中，失活的细胞表面受体包含CD79b的一个以上表位，例如被泊洛妥珠单抗特异性识别的表位。在某些实施方式中，CD79b表位包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:81具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一些实施方式中，失活的细胞表面受体包含CD20的一个以上表位，例如被利妥昔单抗特异性识别的表位。在某些实施方式中，CD20表位包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:82具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在一些实施方式中，失活的细胞表面受体包含Her 2受体或ErbB的一个以上表位，例如被曲妥珠单抗特异性识别的表位。在某些实施方式中，单克隆抗体特异性表位包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:84具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在一些实施方式中，使用上述方法产生的基因组工程化的iPSC包含一种以上不同的编码蛋白质的外源多核苷酸，所述蛋白质包括半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、ErbB2或CD79b，其中，当基因组工程化的iPSC包含两个以上自杀基因时，将自杀基因整合在不同的安全港基因座(例如AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL)中。
C.细胞因子
在一些实施方式中，用于插入的转基因是编码细胞因子(例如白细胞介素15或白细胞介素2)的转基因。
如本文所用，“白细胞介素-15”或“IL-15”指调节T细胞和NK细胞活化和增殖的细胞因子或其功能部分。细胞因子的“功能部分”(“生物活性部分”)指保留全长细胞因子或成熟细胞因子的一种以上功能的细胞因子的一部分。IL-15的此类功能包括促进NK细胞存活、调节NK细胞和T细胞的活化和增殖以及支持NK细胞自造血干细胞的发育。如本领域技术人员将理解的，多种IL-15分子的序列是本领域已知的。在某些实施方式中，IL-15为野生型IL-15。在某些实施方式中，IL-15为人IL-15。在某些实施方式中，IL-15包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:79具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
如本文所用，“白细胞介素-2”指调节T细胞和NK细胞的活化和增殖的细胞因子或其功能部分。在某些实施方式中，IL-2为野生型IL-2。在某些实施方式中，IL-2为人IL-2。在某些实施方式中，IL-2包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:85具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在某些实施方式中，转基因可以包括编码失活的细胞表面受体的外源基因，所述失活的细胞表面受体包含与细胞因子可操作地连接(优选通过自剪切蛋白酶(autoprotease)肽序列可操作地连接)的单克隆抗体特异性表位。自剪切蛋白酶肽的示例包括但不限于选自如下的肽序列：猪捷申病毒1型2A(P2A)、口蹄疫病毒(FMDV)2A(F2A)、马甲型鼻炎病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)以及它们的组合。在一个实施方式中，自剪切蛋白酶肽为猪捷申病毒1型2A(P2A)的自剪切蛋白酶肽。在某些实施方式中，自剪切蛋白酶肽包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:78具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在某些实施方式中，失活的细胞表面受体包含通过自剪切蛋白酶肽序列可操作地与白细胞介素-15(IL-15)或IL-2连接的截短的上皮生长因子(tEGFR)变体。在一个特定实施方式中，失活的细胞表面受体包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:86具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在一些实施方式中，失活的细胞表面受体还包含信号序列。在某些实施方式中，信号序列包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:80具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，失活的细胞表面受体还包含铰链结构域。在一些实施方式中，铰链结构域来源于CD8。在一个实施方式中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在某些实施方式中，失活的细胞表面受体还包含跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域来源于CD8。在一个实施方式中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在某些实施方式中，失活的细胞表面受体包含在其胞外结构域中的被抗体特异性识别的一个以上表位、跨膜区和胞质结构域。在一些实施方式中，失活的细胞表面受体还包含铰链区，所述铰链区在表位和跨膜区之间。在一些实施方式中，失活的细胞表面受体包含超过一个被抗体特异性识别的表位，这些表位可以具有相同或不同的氨基酸序列，这些表位可以通过肽接头连接在一起，所述肽接头为例如具有(GGGGS)n序列的柔性肽接头，其中n是1-8的整数(分别为SEQ ID NO:87、101、25、31、32和102至104)。在一些实施方式中，失活的细胞表面受体还包含细胞因子，例如IL-15或IL-2。在某些实施方式中，细胞因子在失活的细胞表面受体的胞质结构域中。优选地，细胞因子通过自剪切蛋白酶肽序列(例如本文所描述的那些)直接或间接地可操作地连接至被抗体特异性识别的表位。在一些实施方式中，细胞因子通过由自剪切蛋白酶肽序列连接至跨膜区而间接连接至表位。
表5中提供了非限制性示例性的失活的细胞表面受体区域和序列。
表5.
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在一个特定实施方式中，失活的细胞表面受体包含如下氨基酸序列：与SEQ IDNO:88具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ IDNO:88的氨基酸序列。
在一个特定实施方式中，失活的细胞表面受体包含如下氨基酸序列：与SEQ IDNO:89具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ IDNO:89的氨基酸序列。
在一个特定实施方式中，失活的细胞表面受体包含如下氨基酸序列：与SEQ IDNO:90具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ IDNO:90的氨基酸序列。
表6.
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D.HLA表达
在某些实施方式中，本申请的iPSC还可以通过引入编码一种以上与免疫逃避相关的蛋白(例如非经典HLA I类蛋白(例如HLA-E和HLA-G))的外源多核苷酸来进行修饰。特别地，破坏B2M基因消除了所有MHC I类分子的表面表达，使细胞容易通过“自我丢失(missingself)”反应而被NK细胞裂解。外源HLA-E表达可导致对NK介导的裂解的抗性(Gornalusse等，Nat Biotechnol.2017；35(8):765-772)。
在某些实施方式中，iPSC或iPSC的衍生细胞包含编码人白细胞抗原E(HLA-E)和人白细胞抗原G(HLA-G)中的至少一种的多肽。在特定实施方式中，HLA-E包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:91具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在特定实施方式中，HLA-G包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:95具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:95。
在某些实施方式中，外源多核苷酸编码包含与成熟B2M蛋白可操作地连接的信号肽的多肽，所述成熟B2M蛋白通过接头与HLA-E融合。在特定实施方式中，外源多肽包含与SEQ ID NO:93具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列。
在其他实施方式中，外源多核苷酸编码包含与成熟B2M蛋白可操作地连接的信号肽的多肽，所述成熟B2M蛋白通过接头与HLA-G融合。在特定实施方式中，外源多肽包含与SEQ ID NO:96具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的氨基酸序列。
E.其他可选的基因组编辑
在上述细胞的其他实施方式中，使用本公开的RNP复合体的基因组编辑可以包括：插入编码其他另外的人工细胞死亡多肽蛋白、靶向行式、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶标候选物或促进基因组工程化iPSC或iPSC的衍生细胞的植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白的一种以上多核苷酸。其他插入的转基因可以包括编码PET报告基因、稳态细胞因子和抑制性检查点抑制蛋白(例如PD1、PD-L1和CTLA4)以及靶向CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)轴的蛋白的那些。
五、调控元件
在某些实施方式中，编码MAD7核酸酶、gRNA的多核苷酸或用于插入的外源多核苷酸可操作地与至少一个调控元件连接。调控元件能够介导MAD7、gRNA和/或转基因在宿主细胞中的表达。调控元件包括但不限于启动子、增强子、起始位点、聚腺苷酸(polyA)尾巴、IRES元件、响应元件和终止信号。
在一些实施方式中，用于插入的外源多核苷酸可操作地连接至(1)一个以上外源启动子，所述启动子包括CMV、EFla、PGK、CAG、UBC、SV40、人β肌动蛋白或其他组成型、诱导型、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)包含在所选位点中的一个以上内源启动子，所选位点为例如AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL，或满足基因组安全港标准的其他基因座。
在一些实施方式中，启动子为CAG启动子。在一些实施方式中，CAG启动子包含与SEQ ID NO:98具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，用于插入的外源多核苷酸可操作地置于Kozak共有序列的控制下。在一些实施方式中，Kozak序列包含多核苷酸序列GCCACC或其变体。
在某些实施方式中，用于插入的外源多核苷酸可操作地连接至终止子/聚腺苷酸化信号。在一些实施方式中，终止子/聚腺苷酸化信号为SV40信号。在某些实施方式中，SV40信号包含与SEQ ID NO:99具有至少90％(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的多核苷酸序列。也可以使用其他终止子序列，示例性的其他终止子序列包括但不限于BGH、hGH和PGK。
六、组合物
在另一个总体方面，本申请提供了包含本申请的分离的多核苷酸、本申请的宿主细胞和/或iPSC或iPSC的衍生细胞的组合物。
在某些实施方式中，组合物还包含一种以上选自如下的治疗剂：肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞成分或其替代因子、包含一种以上感兴趣的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
在某些实施方式中，所述组合物为药物组合物，所述药物组合物包含本申请的分离的多核苷酸、本申请的宿主细胞和/或iPSC或iPSC的衍生细胞以及药学上可接受的媒介物(carrier)。如本文所用，术语“药物组合物”指包含本申请的分离的多核苷酸、本申请的分离的多肽、本申请的宿主细胞和/或本申请的iPSC或iPSC的衍生细胞以及药学上可接受的媒介物的产品。本申请的多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或iPSC或iPSC的衍生细胞以及包含它们的组合物还可以用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“媒介物”指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的囊泡、微球、脂质体包囊或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，媒介物、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的媒介物”指不干扰本文所述的组合物的有效性或本文所述的组合物的生物活性的无毒材料。根据特定实施方式，可以基于本公开使用适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或iPSC或iPSC的衍生细胞的任何药学上可接受的媒介物。
药物活性成分与药学上可接受的媒介物的制剂是本领域已知的(例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如，第21版(2005)和任何后续版本))。额外成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。本申请的药物组合物可以使用一种以上药学上可接受的媒介物来配制。
七、应用方法
在另一个总体方面，本申请提供了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的细胞和/或本申请的组合物。在某些实施方式中，疾病或病况是癌症。例如，癌症可以是实体癌症或液体癌症。例如，癌症可以选自：肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤/霍奇金病(HD)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体瘤。在优选的实施方式中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
根据本申请的实施方式，组合物包含治疗有效量的分离的多核苷酸、分离的多肽、宿主细胞和/或iPSC或iPSC的衍生细胞。如本文所用，术语“治疗有效量”指在受试者中引发需要的生物或医学反应的活性成分或组分的量。治疗有效量可以根据明确的目的以常规方式经验性地确定。
如本文所用，关于本申请的细胞和/或本申请的药物组合物，治疗有效量指在有需要的受试者中调节免疫应答的细胞和/或药物组合物的量。
根据特定的实施方式，治疗有效量指足以实现如下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗量：(i)降低或改善待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的严重性；(ii)缩短待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的持续时间；(iii)阻止待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的发展；(iv)引起待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的消退；(v)阻止待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的发作或发展；(vi)阻止待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状的复发；(vii)减少患有待治疗的疾病、病症或病况或具有与所述疾病、病症或病况相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)缩短患有待治疗的疾病、病症或病况或具有与所述疾病、病症或病况相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗的疾病、病症或病况或具有与所述疾病、病症或病况相关的症状的受试者的存活率；(xi)抑制或减轻受试者中待治疗的疾病、病症或病况或与所述疾病、病症或病况相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可以依据多种因素而变化，例如，待治疗的疾病、病症或病况、施用方式、靶点、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康状况)、受试者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量经过最佳滴定以优化安全性和功效。
根据特定的实施方式，本文描述的组合物被配制为适合预期的向受试者施用的途径。例如，本文所述的组合物可配制为适合于静脉内、皮下或肌内施用。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以以本领域技术人员已知的任何方便的方式施用。例如，本申请的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄取、输液、植入和/或移植施用于受试者。本申请的包含细胞的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、胸膜内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用。在某些实施方式中，本申请的细胞可以在对受试者进行或不进行淋巴细胞耗竭的情况下施用。
本申请的包含细胞的药物组合物可以以无菌液体制剂的形式提供，通常是具有细胞悬浮物的等渗水溶液或可选的乳液、分散体等(通常被缓冲至选择的pH)。组合物可以包含适合于细胞的完整性和活力并且适合于细胞组合物的施用的媒介物，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。
可以根据需要通过将本申请的细胞混入适量的具有多种其他成分的合适溶剂中来制备无菌注射溶液。此类组合物可以包含适合与细胞组合物一起使用并且适合向受试者(例如人)施用的药学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。用于提供细胞组合物的合适缓冲液是本领域众所周知的。使用的任何运载物(vehicle)、稀释剂或添加剂都与保持本申请的细胞的完整性和活力相容。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以在任何生理学上可接受的运载物中施用。包含本申请的细胞的细胞群可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法容易地确定细胞群中的细胞。包含本申请的基因修饰细胞的细胞群的纯度可以为约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量，例如，纯度降低可能需要增加剂量。
本申请的细胞通常以基于被施用细胞和/或包含细胞的药物组合物的受试者每千克体重的细胞数(细胞/kg)的剂量来施用。通常，取决于施用方式和施用位置，细胞剂量为约104至约1010(例如约105至约109、约105至约108、约105至约107、或约105至约106)个细胞/kg体重；通常，在全身施用的情况下使用比局部施用(在肿瘤和/或癌症的区域中施用本申请的免疫细胞)更高的剂量。示例性的剂量范围包括但不限于：1x104至1x108、2x104至1x108、3x104至1x108、4x104至1x108、5x104至6x108、7x104至1x108、8x104至1x108、9x104至1x108、1x105至1x108、1x105至9x107、1x105至8x107、1x105至7x107、1x105至6x107、1x105至5x107、1x105至4x107、1x105至4x107、1x105至3x107、1x105至2x107、1x105至1x107、1x105至9x106、1x105至8x106、1x105至7x106、1x105至6x106、1x105至5x106、1x105至4x106、1x105至4x106、1x105至3x106、1x105至2x106、1x105至1x106、2x105至9x107、2x105至8x107、2x105至7x107、2x105至6x107、2x105至5x107、2x105至4x107、2x105至4x107、2x105至3x107、2x105至2x107、2x105至1x107、2x105至9x106、2x105至8x106、2x105至7x106、2x105至6x106、2x105至5x106、2x105至4x106、2x105至4x106、2x105至3x106、2x105至2x106、2x105至1x106、3x105至3x106个细胞/kg等。另外，可以根据以单剂量施用还是以多剂量施用来调整剂量。有效剂量的精确确定可以基于每个受试者的个体因素。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”和“医治”均旨在指与癌症相关的至少一种可测量的身体参数的改善或逆转，所述改善或逆转不必要在受试者中可辨别，但能够在受试者中辨别。术语“治疗”、“处理”和“医治”还可以指引起疾病、病症或病况的消退、预防或至少减缓疾病、病症或病况的发展。在一个特定实施方式中，“治疗”、“处理”和“医治”指缓解、预防与疾病、病症或病症(例如肿瘤或更优选癌症)相关的一种以上症状的发展或发作，或减少所述一种以上症状的持续时间。在特定实施方式中，术语“治疗”、“处理”和“医治”指预防疾病、病症或病况的复发。在一个特定实施方式中，“治疗”、“处理”和“医治”指患有疾病、病症或病况的受试者的存活率增加。在一个特定实施方式中，“治疗”、“处理”和“医治”是指消除受试者的疾病、病症或病况。
本申请的细胞和/或本申请的药物组合物可以与一种以上另外的治疗剂组合施用。在某些实施方式中，一种以上治疗剂选自：肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞成分或其替代因子、包含一种以上感兴趣的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
实施例
提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方式。这些实施例旨在说明而非限制所公开的实施方式。
实施例1.使用两步转染法对iPSC进行位点特异性工程改造
第1天：通过Lipofectamine-stem将供体pDNA转染到iPSC中
将100μM H1152 Rho抑制剂储备溶液添加到装有约70％汇合度的iPSC的T-75培养瓶中至1μM的浓度。细胞在37℃、5％ CO2、低O2培养箱中孵育至少1小时。在孵育期间，使玻连蛋白包被的T75培养瓶达到室温至少15分钟。从每个培养瓶中吸出包被溶液，替换为10mL完全Essential 8培养基+1μM H1152。将板置于37℃、5％ CO2、低O2培养箱中直至使用。孵育后，从装有iPSC的T-75培养瓶中吸出培养基，沿培养瓶侧壁添加7mL 1x DPBS，轻柔旋转清洗。吸出DPBS，将2mL TrypLE Select直接添加至细胞。将细胞在37℃下孵育3至5分钟，然后向培养瓶中添加10mL完全Essential 8培养基。通过移液管移液将细胞从板上吸起，然后转移到50mL无菌锥形管中。将细胞以200x g离心5分钟。吸出上清液，将细胞重悬于10mL完全Essential 8培养基中。使用NC-200NucleoCounter对细胞进行计数。将细胞以每个培养瓶2E6个细胞接种到T-75培养瓶中。将细胞在37℃、5％ CO2、低O2培养箱中孵育，直至需要转染。根据下表在15mL无菌离心管中按如下所列来设置转染混合物(根据需要按比例放大)：
管#1
·Opti-MEM 1250μl
·Lipofectamine Stem 50μl
管#2
·Opti-MEM 1250μl
·pDNA 5μg
通过将管2中的成分添加到管1中来混合管1和管2，然后在环境温度下孵育10分钟。将全部混合物逐滴添加到合适的培养瓶中。轻轻摇动培养瓶并放置于37℃、5％CO2、低O2培养箱中。
第2天：对iPSC进行补料
使完全Essential 8培养基达到环境温度(≥15分钟)。每个容器用14mL新鲜完全Essential 8培养基替换iPSC培养物中用过的培养基，在补料完成后立即将培养物放回37℃、低氧、5％CO2湿润培养箱中。在传代当天不进行iPSC培养物的补料/培养基交换，因为这会显着减少集落的分离。
第3天：产生核糖核蛋白(RNP)复合体
在用供体pDNA转染iPSC后40至48小时进行电穿孔。将如下物质合并在无菌PCR管中并充分混合(针对适当数量的条件乘以体积+1表示过量)
ο1.4μL 1x DPBS
ο1.6μL 100μM Alt-R CRISPR-MAD7 crRNA
ο2μL Alt-R MAD7 Ultra核酸酶
对溶液进行短暂离心，在环境温度下孵育10至20分钟，然后在2至8℃下储存直到需要进行电穿孔。
从装有细胞的T-75培养瓶中吸出用过的培养基，加入7mL 1x DPBS进行清洗。吸出1x DPBS，用2mL TrypLE替换。将培养瓶置于37℃、5％ CO2下的低O2培养箱中3至5分钟，然后加入10mL完全E8培养基，用移液管上下吹打3至4次以使细胞移动。将细胞转移至50mL锥形瓶中，以200x g离心5分钟。在离心期间，通过从每个孔中吸出包被溶液并向每个孔中加入2mL完全Essential 8培养基+1μM H1152来制备适当数量的经包被的6孔板。吸出上清液，将细胞重悬于10mL冷Opti-MEM培养基中，然后再次以200x g离心5分钟。吸出上清液，将细胞再次重悬于10mL冷Opti-MEM培养基中。在NC-200细胞计数仪上对细胞进行计数并记录。
将细胞以200x g离心5分钟，以2x106个细胞/mL的浓度重悬于先前平衡至环境温度的Opti-MEM中。
BTX ECM-830电穿孔仪设置为：
ο150V
ο10ms
ο1脉冲
对于每次电穿孔，将以下物质添加到间隙宽度为2mm的BTX电穿孔比色皿中。
ο5μl RNP复合体
ο1.4μL Cpf1电穿孔增强剂
ο200μl细胞
轻敲比色皿以确保所有内容物落至底部并放置在电穿孔安全架中，关闭顶盖，按下启动按钮。
使用每个比色皿配备的无菌移液管将细胞逐滴添加到准备的6孔板的适当的孔中，然后置于37℃、5％ CO2下的低O2培养箱中。
实施例2.AAVS1基因座的编辑
对CAR转基因供体质粒进行特定的工程改造以将CAR插入AAVSl位点。图7A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图7B描绘了分选后细胞的CAR阳性细胞的流式细胞术分析。图7C描绘了CAR阳性单细胞克隆的流式细胞术分析。
实施例3.B2M基因座的编辑
对HLA-E转基因供体质粒进行特定的工程改造以将HLA-E插入B2M位点。图8A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图8B描绘了分选后细胞的HLA-E阳性、B2M阴性细胞的流式细胞术分析。图8C描绘了HLA-E阳性、B2M阴性单细胞克隆的流式细胞术分析。
实施例4.CIITA基因座的编辑
对EGFR转基因供体质粒进行特定的工程改造以将EGFR插入CIITA位点。图9A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图9B描绘了分选后细胞的EGFR细胞的流式细胞术分析。图9C描绘了EGFR阳性单细胞克隆的流式细胞术分析。
实施例5.CYBYL基因座的编辑
对PSMA转基因供体质粒进行特定的工程改造以将PSMA插入CLYBL位点。图10A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图10B描绘了分选后细胞的PSMA阳性细胞的流式细胞术分析。
实施例6.NKG2A基因座的编辑
对IL15-IL15RA转基因供体质粒进行特定的工程改造以将IL15-IL15RA插入NKG2A位点。图11A描绘了工程改造后总细胞群的流式细胞术分析。图11B描绘了分选后细胞的IL15-IL15RA阳性细胞的流式细胞术分析。
****
本公开的范围不限于本文描述的特定实施方式。事实上，除了本文描述的那些之外，对本领域技术人员而言，对本发明的各种修改将基于前面的描述变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用整体并入本文，如同实际存在于本说明书中。
序列表
<110> 世纪治疗股份有限公司（Century Therapeutics, Inc.）
<120> 工程细胞的基因转移载体和方法
<130> PUSCNN237627T
<150> 63/171,891
<151> 2021-04-07
<160> 130
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 2
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Whitlow接头
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
180 185 190
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
210 215 220
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Thr
245
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 9
<211> 94
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
85 90
<210> 10
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln
1 5 10 15
Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr
20 25 30
Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln
50 55 60
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg
1 5 10 15
Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
20 25
<210> 13
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr
1 5 10 15
Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys
20 25 30
Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe
50 55 60
<210> 14
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 15
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 16
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser
50
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 18
<211> 52
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 20
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 21
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)3
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头3
<400> 26
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser
20
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头4
<400> 27
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头5
<400> 28
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头6
<400> 29
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头7
<400> 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头8
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头9
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头10
<400> 33
Ile Arg Pro Arg Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头11
<400> 34
Gly Lys Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头12
<400> 35
Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Lys Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头13
<400> 36
Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头14
<400> 37
Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头15
<400> 38
Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头16
<400> 39
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头17
<400> 40
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头18
<400> 41
Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly
1 5 10 15
Lys Gly Lys Ser
20
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头19
<400> 42
Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp
1 5 10
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头20
<400> 43
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头21
<400> 44
Gly Gly Glu Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头22
<400> 45
Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头23
<400> 46
Gly Gly Gly Glu Ser Gly Gly Glu Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头24
<400> 47
Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly
1 5 10 15
Glu Gly Glu Ser
20
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头26
<400> 48
Pro Arg Gly Ala Ser Lys Ser Gly Ser Ala Ser Gln Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头27
<400> 49
Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头28
<400> 50
Gly Thr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头30
<400> 51
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头31
<400> 52
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头32
<400> 53
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头33
<400> 54
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
20 25 30
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 55
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 56
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 57
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 58
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 59
tttatctgtc ccctccaccc caca 24
<210> 60
<211> 1205
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAVS1左同源臂
<400> 60
actctgcccc aggcctcctt accattcccc ttcgacctac tctcttccgc attggagtcg 60
ctttaactgg ccctggcttt ggcagcctgt gctgacccat gcagtcctcc ttaccatccc 120
tccctcgact tcccctcttc cgatgttgag cccctccagc cggtcctgga ctttgtctcc 180
ttccctgccc tgccctctcc tgaacctgag ccagctccca tagctcagtc tggtctatct 240
gcctggccct ggccattgtc actttgcgct gccctcctct cgcccccgag tgcccttgct 300
gtgccgccgg aactctgccc tctaacgctg ccgtctctct cctgagtccg gaccactttg 360
agctctactg gcttctgcgc cgcctctggc ccactgtttc cccttcccag gcaggtcctg 420
ctttctctga cctgcattct ctcccctggg cctgtgccgc tttctgtctg cagcttgtgg 480
cctgggtcac ctctacggct ggcccagatc cttccctgcc gcctccttca ggttccgtct 540
tcctccactc cctcttcccc ttgctctctg ctgtgttgct gcccaaggat gctctttccg 600
gagcacttcc ttctcggcgc tgcaccacgt gatgtcctct gagcggatcc tccccgtgtc 660
tgggtcctct ccgggcatct ctcctccctc acccaacccc atgccgtctt cactcgctgg 720
gttccctttt ccttctcctt ctggggcctg tgccatctct cgtttcttag gatggccttc 780
tccgacggat gtctcccttg cgtcccgcct ccccttcttg taggcctgca tcatcaccgt 840
ttttctggac aaccccaaag taccccgtct ccctggcttt agccacctct ccatcctctt 900
gctttctttg cctggacacc ccgttctcct gtggattcgg gtcacctctc actcctttca 960
tttgggcagc tcccctaccc cccttacctc tctagtctgt gctagctctt ccagccccct 1020
gtcatggcat cttccagggg tccgagagct cagctagtct tcttcctcca acccgggccc 1080
ctatgtccac ttcaggacag catgtttgct gcctccaggg atcctgtgtc cccgagctgg 1140
gaccacctta tattcccagg gccggttaat gtggctctgg ttctgggtac ttttatctgt 1200
cccct 1205
<210> 61
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AAVS1右同源臂
<400> 61
ccaccccaca gtggggccac tagggacagg attggtgaca gaaaagcccc atccttaggc 60
ctcctccttc ctagtctcct gatattgggt ctaaccccca cctcctgtta ggcagattcc 120
ttatctggtg acacaccccc atttcctgga gccatctctc tccttgccag aacctctaag 180
gtttgcttac gatggagcca gagaggatcc tgggagggag agcttggcag ggggtgggag 240
ggaagggggg gatgcgtgac ctgcccggtt ctcagtggcc accctgcgct accctctccc 300
agaacctgag ctgctctgac gcggccgtct ggtgcgtttc actgatcctg gtgctgcagc 360
ttccttacac ttcccaagag gagaagcagt ttggaaaaac aaaatcagaa taagttggtc 420
ctgagttcta actttggctc ttcacctttc tagtccccaa tttatattgt tcctccgtgc 480
gtcagtttta cctgtgagat aaggccagta gccagccccg tcctggcagg gctgtggtga 540
ggaggggggt gtccgtgtgg aaaactccct ttgtgagaat ggtgcgtcct aggtgttcac 600
caggtcgtgg ccgcctctac tccctttctc tttctccatc cttctttcct taaagagtcc 660
ccagtgctat ctgggacata ttcctccgcc cagagcaggg tcccgcttcc ctaaggccct 720
gctctgggct tctgggtttg agtccttggc aagcccagga gaggcgctca ggcttccctg 780
tcccccttcc tcgtccacca tctcatgccc ctggctctcc tgccccttcc ctacaggggt 840
tcctggctct gctcttcaga ctgagccccg ttcccctgca tccccgtacc cctgcatccc 900
ccttcccctg catcccccag aggccccagg ccacctactt ggcctggacc ccacgagagg 960
ccaccccagc cctgtctacc aggctgcctt ttgggtggat tctcctccaa ctgtggggtg 1020
actgcttggc aaactcactc ttcggggtat cccaggaggc ctggagcatt ggggtgggct 1080
ggggttcaga gaggagggat tcccttctca ggttacgtgg ccaagaagca ggggagctgg 1140
gtttgggtca ggtctgggtg tggggtgacc agcttatgct gtttgcccag gacagcctag 1200
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 62
tttactcacg tcatccagca gaga 24
<210> 63
<211> 1042
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B2M左同源臂
<400> 63
gcatataaaa cctcagcaga aataaagagg ttttgttgtt tggtaagaac ataccttggg 60
ttggttgggc acggtggctc gtgcctgtaa tcccaacact ttgggaggcc aaggcaggct 120
gatcacttga agttgggagt tcaagaccag cctggccaac atggtgaaat cccgtctcta 180
ctgaaaatac aaaaattaac caggcatggt ggtgtgtgcc tgtagtccca ggaatcactt 240
gaacccagga ggcggaggtt gcagtgagct gagatctcac cactgcacac tgcactccag 300
cctgggcaat ggaatgagat tccatcccaa aaaataaaaa aataaaaaaa taaagaacat 360
accttgggtt gatccactta ggaacctcag ataataacat ctgccacgta tagagcaatt 420
gctatgtccc aggcactcta ctagacactt catacagttt agaaaatcag atgggtgtag 480
atcaaggcag gagcaggaac caaaaagaaa ggcataaaca taagaaaaaa aatggaaggg 540
gtggaaacag agtacaataa catgagtaat ttgatggggg ctattatgaa ctgagaaatg 600
aactttgaaa agtatcttgg ggccaaatca tgtagactct tgagtgatgt gttaaggaat 660
gctatgagtg ctgagagggc atcagaagtc cttgagagcc tccagagaaa ggctcttaaa 720
aatgcagcgc aatctccagt gacagaagat actgctagaa atctgctaga aaaaaaacaa 780
aaaaggcatg tatagaggaa ttatgaggga aagataccaa gtcacggttt attcttcaaa 840
atggaggtgg cttgttggga aggtggaagc tcatttggcc agagtggaaa tggaattggg 900
agaaatcgat gaccaaatgt aaacacttgg tgcctgatat agcttgacac caagttagcc 960
ccaagtgaaa taccctggca atattaatgt gtcttttccc gatattcctc aggtactcca 1020
aagattcagg tttactcacg tc 1042
<210> 64
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B2M右同源臂
<400> 64
atccagcaga gaatggaaag tcaaatttcc tgaattgcta tgtgtctggg tttcatccat 60
ccgacattga agttgactta ctgaagaatg gagagagaat tgaaaaagtg gagcattcag 120
acttgtcttt cagcaaggac tggtctttct atctcttgta ctacactgaa ttcaccccca 180
ctgaaaaaga tgagtatgcc tgccgtgtga accatgtgac tttgtcacag cccaagatag 240
ttaagtgggg taagtcttac attcttttgt aagctgctga aagttgtgta tgagtagtca 300
tatcataaag ctgctttgat ataaaaaagg tctatggcca tactaccctg aatgagtccc 360
atcccatctg atataaacaa tctgcatatt gggattgtca gggaatgttc ttaaagatca 420
gattagtggc acctgctgag atactgatgc acagcatggt ttctgaacca gtagtttccc 480
tgcagttgag cagggagcag cagcagcact tgcacaaata catatacact cttaacactt 540
cttacctact ggcttcctct agcttttgtg gcagcttcag gtatatttag cactgaacga 600
acatctcaag aaggtatagg cctttgtttg taagtcctgc tgtcctagca tcctataatc 660
ctggacttct ccagtacttt ctggctggat tggtatctga ggctagtagg aagggcttgt 720
tcctgctggg tagctctaaa caatgtattc atgggtagga acagcagcct attctgccag 780
ccttatttct aaccatttta gacatttgtt agtacatggt attttaaaag taaaacttaa 840
tgtcttcctt ttttttctcc actgtctttt tcatagatcg agacatgtaa gcagcatcat 900
ggaggtaagt ttttgacctt gagaaaatgt ttttgtttca ctgtcctgag gactatttat 960
agacagctct aacatgataa ccctcactat gtggagaaca ttgacagagt aacattttag 1020
cag 1023
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 65
tttaccttgg ggctctgaca ggta 24
<210> 66
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CIITA左同源臂
<400> 66
acaggaggta accatttaac aagaaagcag agtgatgtta gattatagca agatactgtt 60
gactgtagaa ggctctgagg ctagagagct gctttctata aaacagagtg atcatatatt 120
agaagaggtg ttaaagacat gttcacacca agctgagact tcctccttga taccaccagg 180
aggatgggca gagactggaa aagacactaa ctttctccct atgggagtca gtattattta 240
gcatcacttt ggcgggtcac cccaaaccat ctgactacaa gggtaccata tttgggttaa 300
cactcttttg gtataattta tgttttagtc caatgtcttg ggatgaaaat gacaggtggg 360
ccacttatga tctccagaga aattcagggc aatttggtgt gggagtaggc atggtagagg 420
agagcagcat ctaagaagtc cccagcagag gctctcagct tgtcttgagg catctgggcg 480
gagggctatg atactggccc catcctgcag aaggtggcag atattggcag ctggcaccag 540
tgcggttcca ttgtgatcat catttctgaa cgtcagactg ttgaaggttc ccccaacaga 600
ctttctgtgc aactttctgt cttcaccaaa ttcagtccac agtaaggaag tgaaattaat 660
ttcagaggtg tggggagggc ttaagggagt gtggtaaaat tagagggtgt tcagaaacag 720
aaatctgacc gcttggggcc accttgcagg gagagttttt ttgatgatcc ctcacttgtt 780
tctttgcatg ttggcttagc ttggcgggct cccaactggt gactggttag tgatgaggct 840
agtgatgagg ctgtgtgctt ctgagctggg catccgaagg catccttggg gaagctgagg 900
gcacgaggag gggctgccag actccgggag ctgctgcctg gctgggattc ctacacaatg 960
cgttgcctgg ctccacgccc tgctgggtcc tacctgtcag 1000
<210> 67
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CIITA右同源臂
<400> 67
agccccaagg taaaaaggcc gggaaagcat cttaatttag cgtgcagtct cagctggtcc 60
tgccattcca gataaacaga gaaaccattc tgaattgggg atgggggtga ggatgggaac 120
aggagtctgt gtcctgctgg ggcaggccat tggaagatgt gaaagagttg tctatttcct 180
tccaccggag ggagacttca ggtcagccag gtgtctggag tatgaaccat gtatcagcac 240
cgaaaggttc tagaagtcag actttcgggc agtgtgtcac taactctcag catgctggcc 300
tggctcggcc cacagcaagg tcttctcgcc tccctttggg taaatactga ggggtgcctc 360
tgcaggacgg gacctctgcc agactccact ccatacccag agaagcaggg aaaccaaaat 420
tggagtcagc cttgaggtgt agctgttgag ccctcagcag ctggggagag ctggcggatg 480
ctgccctccc cccagtttcc taatggtgtt gtttaaaaag ggtcagggga cgggggaaca 540
gatggtggga agagcacagt gcagacacct ggcaccggct ctgaaggcag catggcagct 600
acaccgttgg ctgggaaggg tgtgcccctg aagaagtcgt ttacattctc gagtcaattt 660
tcctggagtg tacaatggac ctgtgggaaa gcctgtatga aagggtaatg atgagggacc 720
tagcacagtg tccaatattt tataggaact ggaattgagc tcataggagc tcaattttat 780
tggcattgct gttgttggat ggttaaaggg gtggtatccc ttttctcaga ctcccctgaa 840
atgtatggtt tgctttgaac ccagagactg atgacaggtc tgccggtgtg gttgggtgca 900
gccttaagtt gctacgggaa agtgttggag ggggagaagt cagaggtaac cttgccccct 960
ccctcaattc cagatgagga aattcaggcc tgaaaaggga 1000
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 68
agagtgatca cagctctgac taaa 24
<210> 69
<211> 1046
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CLYBL左同源臂
<400> 69
gtccagactc aggaggactt agttctcttc ataaaaagtt gatcaccttt gctttctcct 60
ttgcatgggc aataaagaag tgaaaaataa attcccagtg agcttgcatt ctgcttggga 120
acaacatagc acatccattt tctagagagc tgtccagtcc ccatttgagg gctgctagcc 180
acatgtcaag caggaaccca gagtataacc aggaaaatgt ctgtggtaga ccccagtgat 240
tcatgcctcc catctccaca ccctcctgta gtcccctccc acgctgattc tggactaggc 300
cacatggctt ggccagtgga acacatgcag gcttgcacgt ctggaactct gccacctaat 360
ttaggatccc agactctcct actggagaca caggtcctta gtgacagtct gcaccaccat 420
tcagacaagt cagtagggcc atcttagatc atccagccct agtcaagcca ccagataact 480
gtacccacat aagtgacccc tggcgagacc agcaggagaa tcatgccaat gggccaatat 540
acattctgac ccacagtttc ataataaaat aaaatggttg tggttgtaag ccactatgtt 600
tcagagtggt ttgttacaca gcaataaata actaatatag taggcatacc atcaagtcca 660
aagtaggtag agaagaatgt aaatagcaga gcaaaacagc atgactggtg gctgggaggc 720
ttaaaactgg gacaggatca gagtcatgaa agaagtcaaa gaaatggttc agaagtaagg 780
ctgagactga cttacaaaag ctgaaagtcc ctttaagttg gtgtttggtg cattggcagg 840
ggcaggtatg gtgacttaaa agagccatgc tcaacaagat caagcacaac acaatcacgg 900
gtcaccccag cagaccttag cgagtctagc catttctttg gtggtggtca cagtcatgct 960
tcagcccagt ttccacttgg acaaatggta catattttca atgagatgaa aattaagata 1020
caatccatgt gctcagagag tgatca 1046
<210> 70
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CLYBL右同源臂
<400> 70
atcatgtctg ctcgacagct ctgactaaac actgtgcccc aaagtgttga ggaattggga 60
aaacctagct gagttagtgg tctcttttct gttacaataa agctcataat gaaaattagc 120
cttctttgtt cttccccaag tctttctttc tagacgaaac tactttcaac tgttttaact 180
tccttactgt taacttccat atttctagat agtatggtca gactgttatt tcttgacttt 240
taaatgtaag atattatcta ctgacttcct tctatgtaag atgaggattg agctctctta 300
cccttctccc atttcctcat ccttccaaca taaatatatt ttgggattat atcaacattc 360
aatgttactt aaagtgacct tgtaaatatt ttcacaactg agccatgttt gatttgtata 420
cttatgttta ctttactgtt tttcctgaag ttaataattg ccttgaattt atttatttct 480
ttaaaaatgt ttcattactc aggactgtag tttacattac gattctttgt gttatacagt 540
tgatgggttt cttttctttc ttaatttctt taaaaaatag agatggggtc ttactatatt 600
acccaggctg gtcttgaagt cctgggctca agtgatcttc ctgtctcagc ctaccaagta 660
gctgagacta taggtgcaaa aaagccacta tacctggcta gtttacaggt tttaacaaat 720
gcattatgcc acgtatccat tattacagga tcacacaaga tattttcatt accctgaaag 780
catccctgtg ttccaccaat tcatcctgcc tccatgagcc gctggcaacc actgatctct 840
atagttttgc cttttctaaa atgtcatata attggaatca tacagtctgt agcattttca 900
gactagcttt taaaatttgg caatatgcat ttaaggttcc tccttaaatg tgaagggcat 960
agccaatgtg gcttgatagc tcatttcttt ttattggtga atatttcatt gtctggatgt 1020
tccacagttt gtttatcctc gagagcttgg cgt 1053
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 71
ctcagacctg aatctgcccc caaa 24
<210> 72
<211> 1045
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2A左同源臂
<400> 72
gacctggcct ccgttttatg tagtgttcct aatactattt aggttatgca taagttaact 60
gtgtcacata gcattttctg tcatatacaa atatttaatt ttttataatt tttaataaat 120
aatttttaat aatttcttag aacatttcag ccattaagaa aagaccattt aattacctct 180
attgattttc attaatgtgt ataaattact aattaaaagt aatgtagtgc aagaaatttt 240
tatatatata tatgtcaact ttactattac tcatgtgcag accacatagt cttaaccatt 300
actggatttc aaaattaaca taaaaatgag tgcagaagtt tttctaatac aacattttaa 360
tttttaacac aggtaaaaca tcagacttta agaaatatat ttttattcct gaacttcttt 420
attccttagt aatttattgc ttctcattgc cccagcaata atattttgtc aaatgcagaa 480
aatttatctt ttttttttga gtcggagtct cactctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg 540
cacaatctcc gctcactgca acctctgccg cccatgttca agagattctc ctgcctcagc 600
ctcccgagta gctaggacta caggcgcctg acatcatgcc cgactacttt ttgtattttt 660
agtagagacg gagtttcacc gtgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcgtgatc 720
ggcatgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccgc gcccggccta 780
aaaatctttt tttaaaacaa atattcataa gaaacgtgtt taggcttgaa gaaaatcaga 840
gaaagaactt tagattattt aatgcaaaat gagctccaat actcgttctc cacctcaccc 900
ttttaattgc actagggaat cctgtatata aaccatttat taacttctta actactgtta 960
ttatagagta cagtccctga catcacacac tgcagagatg gataaccaag gagtaatcta 1020
ctcagacctg aacggtacca acgcg 1045
<210> 73
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2A右同源臂
<400> 73
aatctgcccc caaacccaaa gaggcagcaa cgaaaaccta aaggcaataa aaactccatt 60
ttagcaactg aacaggaaat aacctatgcg gaattaaacc ttcaaaaagc ttctcaggat 120
tttcaaggga atgacaaaac ctatcactgc aaaggtaaag catttaaaag atcctcaata 180
taacagtcta ggatgtgcag cttggggtac aggaatgtgg ggaaagagaa gggagtgctc 240
atatatcttc tatttgcaaa gatcagaatt ccaagttgag atatgctatt tcaatgtaaa 300
gtatgaagac tgattgaact cattgttgaa gtttgtagtc tttgtcaaat aattcatgga 360
gcattatttt tcctgaaaat tcaatggtat attattctga gaaaaagatt acaatgggag 420
atgagggttt ggggtccaag tttctctgta tgattcctgt gcattcaggt tctcttgtct 480
gtgaatcttc taaacgactg tatccacctc tcctttcgca ctgttcccat ttctctccct 540
gcagatttac catcagctcc agagaagctc attgttggga tcctgggaat tatctgtctt 600
atcttaatgg cctctgtggt aacgatagtt gttattccct gtaagtctat tttcgaagat 660
tacaagggga attttcacgt taatgattga atgtgcctct aaacatttca tattttcagg 720
gaatagagtt ctcattgtaa tgtatatatt tggactaaat gtggaatgat tattctgaat 780
ttgtcaaaga ataaatgaaa gaataattgt tgaaagtatt cgcttctgat gcaatcgtat 840
gtatatattt ggatttcata actcaaaaat atgttctagg agtctgaaaa accttactga 900
gaaatagaaa ttaatttttg aaagtagtta aatcaagaat tataagaact atatgagatg 960
gtgaaatttg gttctttaga tctatgaaat acttttccaa aaaaccacca ttactttatc 1020
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 74
gtgtaccagc tgagagactc taaa 24
<210> 75
<211> 1229
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC左同源臂
<400> 75
cgactctaga ctcgaagctg gatgtctgca ttgccgaggc caccagggct ggctcagcaa 60
ctgtcgggga atcaccaggg tctgagaaat cttgtgcgca tgtgaggggc tgtgggagca 120
gagaaccact gggtgggaaa ttctaatccc caccctgctg gaaactctct gggtggcccc 180
aacatgctaa tcctccggca aacctctgtt tcctcctcaa aaggcaggag gtcggaaaga 240
ataaacaatg agagtcacat taaaaacaca aaatcctacg gaaatactga agaatgagtc 300
tcagcactaa ggaaaagcct ccagcagctc ctgctttctg agggtgaagg atagacgctg 360
tggctctgca tgactcacta gcactctatc acggccatat tctggcaggg tcagtggctc 420
caactaacat ttgtttggta ctttacagtt tattaaatag atgtttatat ggagaagctc 480
tcatttcttt ctcagaagag cctggctagg aaggtggatg aggcaccata ttcattttgc 540
aggtgaaatt cctgagatgt aaggagctgc tgtgacttgc tcaaggcctt atatcgagta 600
aacggtagtg ctggggctta gacgcaggtg ttctgattta tagttcaaaa cctctatcaa 660
tgagagagca atctcctggt aatgtgatag atttcccaac ttaatgccaa cataccataa 720
acctcccatt ctgctaatgc ccagcctaag ttggggagac cactccagat tccaagatgt 780
acagtttgct ttgctgggcc tttttcccat gcctgccttt actctgccag agttatattg 840
ctggggtttt gaagaagatc ctattaaata aaagaataag cagtattatt aagtagccct 900
gcatttcagg tttccttgag tggcaggcca ggcctggccg tgaacgttca ctgaaatcat 960
ggcctcttgg ccaagattga tagcttgtgc ctgtccctga gtcccagtcc atcacgagca 1020
gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg ccagccccac 1080
agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg ggcaaagagg 1140
gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag aaccctgacc 1200
ctgccgtgta ccagctcgag aaggatctg 1229
<210> 76
<211> 1130
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC右同源臂
<400> 76
atcatgtctg ggatctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg 60
attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca 120
aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca 180
acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct 240
tcttccccag cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag 300
gaatggccag gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg 360
gtctcggcct tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag tgagccttgt 420
tctggcagtc cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga agagaaggtg gcaggagagg 480
gcacgtggcc cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc ctgcctgcct ttgctcagac 540
tgtttgcccc ttactgctct tctaggcctc attctaagcc ccttctccaa gttgcctctc 600
cttatttctc cctgtctgcc aaaaaatctt tcccagctca ctaagtcagt ctcacgcagt 660
cactcattaa cccaccaatc actgattgtg ccggcacatg aatgcaccag gtgttgaagt 720
ggaggaatta aaaagtcaga tgaggggtgt gcccagagga agcaccattc tagttggggg 780
agcccatctg tcagctggga aaagtccaaa taacttcaga ttggaatgtg ttttaactca 840
gggttgagaa aacagctacc ttcaggacaa aagtcaggga agggctctct gaagaaatgc 900
tacttgaaga taccagccct accaagggca gggagaggac cctatagagg cctgggacag 960
gagctcaatg agaaaggaga agagcagcag gcatgagttg aatgaaggag gcagggccgg 1020
gtcacagggc cttctaggcc atgagagggt agacagtatt ctaaggacgc cagaaagctg 1080
ttgatcggct tcaagcaggg gagggacacc taattgatcc gatccgagct 1130
<210> 77
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> tEGFR
<400> 77
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys
20 25 30
Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
35 40 45
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
50 55 60
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
65 70 75 80
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
85 90 95
Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala
100 105 110
Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile
115 120 125
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
130 135 140
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
165 170 175
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
195 200 205
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp
225 230 235 240
Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser
245 250 255
Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile
260 265 270
Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr
275 280 285
Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
290 295 300
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys
305 310 315 320
His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
325 330 335
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly
340 345 350
Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly
355 360 365
Leu Phe Met
370
<210> 78
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2A
<400> 78
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 79
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-15
<400> 79
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 80
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 信号序列
<400> 80
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD79b表位
<400> 81
Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser
1 5 10 15
Arg Ile Trp Gln Ser
20
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20模拟表位
<400> 82
Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 83
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 84
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ErbB表位
<400> 84
Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln
20 25 30
Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr
35 40 45
Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
50 55 60
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala
65 70 75 80
Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser
85 90 95
Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp
100 105 110
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys
115 120 125
Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
130 135 140
Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val
145 150 155 160
Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
<210> 85
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2氨基酸序列
<400> 85
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 86
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> tEGFR-P2A-IL15氨基酸序列
<400> 86
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys
20 25 30
Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
35 40 45
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
50 55 60
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
65 70 75 80
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
85 90 95
Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala
100 105 110
Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile
115 120 125
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
130 135 140
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
165 170 175
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
195 200 205
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp
225 230 235 240
Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser
245 250 255
Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile
260 265 270
Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr
275 280 285
Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
290 295 300
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys
305 310 315 320
His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
325 330 335
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly
340 345 350
Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly
355 360 365
Leu Phe Met Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
370 375 380
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro
385 390 395 400
His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn
405 410 415
Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys
420 425 430
Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile
435 440 445
Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp
450 455 460
Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr
465 470 475 480
Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser
485 490 495
Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala
500 505 510
Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys
515 520 525
Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser
530 535 540
Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
545 550 555
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 87
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 88
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD79b-P2A-IL15
<400> 88
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser
20 25 30
Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
35 40 45
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
50 55 60
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
85 90 95
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Ala Thr Asn Phe Ser Leu
100 105 110
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile
115 120 125
Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu
130 135 140
Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile
145 150 155 160
Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val
165 170 175
Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met
180 185 190
His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys
195 200 205
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser
210 215 220
Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile
225 230 235 240
Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser
245 250 255
Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe
260 265 270
Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
275 280 285
<210> 89
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD20模拟表位-P2A-IL15
<400> 89
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Cys Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu
35 40 45
Cys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
85 90 95
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
100 105 110
Val Ile Thr Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
115 120 125
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser
130 135 140
Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu
145 150 155 160
Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly
165 170 175
Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
180 185 190
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
195 200 205
Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
210 215 220
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
225 230 235 240
Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
245 250 255
Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
275 280 285
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295
<210> 90
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ErbB表位-P2A-IL15
<400> 90
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His
20 25 30
Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu
35 40 45
Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro
50 55 60
Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys
65 70 75 80
Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln
85 90 95
Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg
100 105 110
Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys
115 120 125
Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr
130 135 140
His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg
145 150 155 160
Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu
165 170 175
Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
195 200 205
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser
210 215 220
Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu
225 230 235 240
Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly
245 250 255
Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
260 265 270
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
275 280 285
Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
290 295 300
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
305 310 315 320
Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
325 330 335
Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
340 345 350
Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
355 360 365
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
370 375
<210> 91
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-E
<400> 91
His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly
1 5 10 15
Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val
20 25 30
Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg Ala Pro
35 40 45
Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Ser
50 55 60
Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr Leu Arg
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp Met
85 90 95
His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu
100 105 110
Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu Asp Leu
115 120 125
Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu Gln Lys
130 135 140
Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Asp
145 150 155 160
Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys Glu Thr
165 170 175
Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile
180 185 190
Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
195 200 205
Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His Thr Gln
210 215 220
Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
225 230 235 240
Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr
245 250 255
Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu Arg Trp
260 265 270
Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly
275 280 285
Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala Ala Val
290 295 300
Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser Leu
325 330 335
<210> 92
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G信号肽
<400> 92
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile
20 25 30
Leu
<210> 93
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G信号肽-B2M-HLA-E氨基酸
<400> 93
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile
20 25 30
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser
50 55 60
Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val
65 70 75 80
Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly
85 90 95
Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp
100 105 110
Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys
115 120 125
Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys
130 135 140
Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His
165 170 175
Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val
180 185 190
Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala
195 200 205
Ser Pro Arg Met Val Pro Arg Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser
210 215 220
Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile
225 230 235 240
Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu
245 250 255
Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro
260 265 270
Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys
275 280 285
Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp
290 295 300
Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala
305 310 315 320
Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His
325 330 335
Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro
340 345 350
Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu
355 360 365
Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp
370 375 380
Gln Gln Asp Gly Glu Gly His Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr
385 390 395 400
Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val
405 410 415
Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly
420 425 430
Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr
435 440 445
Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val
450 455 460
Val Ser Gly Ala Val Val Ala Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser
465 470 475 480
Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala
485 490 495
Gln Gly Ser Glu Ser His Ser Leu
500
<210> 94
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G信号肽-B2M-HLA-E核苷酸
<400> 94
atggtggtca tggcccctag aacactgttc ctgctgctgt ctggcgccct gacactgaca 60
gagacatggg ccgtgatggc ccccagaacc ctgatcctgg gcggcggtgg ttcaggcgga 120
ggaggttcag gaggaggggg tagtggaggt ggtggttcta tccagcggac ccctaagatc 180
caggtgtaca gcagacaccc cgccgagaac ggcaagagca acttcctgaa ctgctacgtg 240
tccggctttc accccagcga cattgaggtg gacctgctga agaacggcga gcggatcgag 300
aaggtggaac acagcgatct gagcttcagc aaggactggt ccttctacct gctgtactac 360
accgagttca cccctaccga gaaggacgag tacgcctgca gagtgaacca cgtgacactg 420
agccagccta agatcgtgaa gtgggatcgc gatatgggcg gaggcggatc tggtggcgga 480
ggaagtggcg gcggaggatc tggctcccac tccttgaagt atttccacac ttccgtgtcc 540
cggcccggcc gcggggagcc ccgcttcatc tctgtgggct acgtggacga cacccagttc 600
gtgcgcttcg acaacgacgc cgcgagtccg aggatggtgc cgcgggcgcc gtggatggag 660
caggaggggt cagagtattg ggaccgggag acacggagcg ccagggacac cgcacagatt 720
ttccgagtga atctgcggac gctgcgcggc tactacaatc agagcgaggc cgggtctcac 780
accctgcagt ggatgcatgg ctgcgagctg gggcccgacg ggcgcttcct ccgcgggtat 840
gaacagttcg cctacgacgg caaggattat ctcaccctga atgaggacct gcgctcctgg 900
accgcggtgg acacggcggc tcagatctcc gagcaaaagt caaatgatgc ctctgaggcg 960
gagcaccaga gagcctacct ggaagacaca tgcgtggagt ggctccacaa atacctggag 1020
aaggggaagg agacgctgct tcacctggag cccccaaaga cacacgtgac tcaccacccc 1080
atctctgacc atgaggccac cctgaggtgc tgggccctgg gcttctaccc tgcggagatc 1140
acactgacct ggcagcagga tggggagggc catacccagg acacggagct cgtggagacc 1200
aggcctgcag gggatggaac cttccagaag tgggcagctg tggtggtgcc ttctggagag 1260
gagcagagat acacgtgcca tgtgcagcat gaggggctac ccgagcccgt caccctgaga 1320
tggaagccgg cttcccagcc caccatcccc atcgtgggca tcattgctgg cctggttctc 1380
cttggatctg tggtctctgg agctgtggtt gctgctgtga tatggaggaa gaagagctca 1440
ggtggaaaag gagggagcta ctctaaggct gagtggagcg acagtgccca ggggtctgag 1500
tctcacagct tgtaa 1515
<210> 95
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G
<400> 95
His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly
1 5 10 15
Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val
20 25 30
Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro
35 40 45
Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn
50 55 60
Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met
85 90 95
Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu
100 105 110
Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu
115 120 125
Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys
130 135 140
Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly
145 150 155 160
Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met
165 170 175
Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val
180 185 190
Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
195 200 205
Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln
210 215 220
Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
225 230 235 240
Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr
245 250 255
Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp
260 265 270
Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly
275 280 285
Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val
290 295 300
Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
305 310
<210> 96
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G信号肽-B2M-HLA-G
<400> 96
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln
20 25 30
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro
35 40 45
Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn
50 55 60
Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp
85 90 95
Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu
100 105 110
Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val
115 120 125
Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His
145 150 155 160
Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu
165 170 175
Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg
180 185 190
Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp
195 200 205
Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr
210 215 220
Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly
225 230 235 240
Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile
245 250 255
Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln
260 265 270
Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg
275 280 285
Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys
290 295 300
Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr
305 310 315 320
Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu
325 330 335
Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe
340 345 350
Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala
355 360 365
Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp
370 375 380
Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys
385 390 395 400
Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys
405 410 415
His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Lys
420 425 430
Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu
435 440 445
Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu
450 455 460
Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
465 470
<210> 97
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-G信号肽-B2M-HLA-G
<400> 97
gccaccatgg tggtcatggc gccccgaacc ctcttcctgc tgctctcggg ggccctgacc 60
ctgaccgaga cctgggcgcg gatcattccc cgacatctgc aactgggagg cggcggttca 120
ggagggggcg gatcgatcca acgcaccccc aagatccagg tctactccag acacccggcc 180
gaaaacggaa agtcgaactt cctgaactgc tatgtgtcag gattccaccc gtccgacatc 240
gaggtggacc tcctgaagaa cggcgaacgc attgagaagg tcgagcactc cgatctgtcg 300
ttctccaagg actggtcctt ctaccttctc tactataccg aattcacccc gaccgagaag 360
gacgaatacg cctgccgggt caaccacgtg accctgagcc agccaaagat cgtgaaatgg 420
gaccgcgata tgggaggagg aggttccggc ggaggaggaa gcggaggcgg aggttccggc 480
tcccactcca tgaggtattt cagcgccgcc gtgtcccggc ctggccgcgg agagcctcgc 540
ttcatcgcca tgggatacgt ggacgacacc cagttcgtca gattcgacag cgacagcgcc 600
tgtcctcgga tggaacctag agcaccttgg gtcgagcaag agggccctga gtactgggaa 660
gaagagacac ggaacaccaa ggctcacgcc cagaccgaca gaatgaacct gcagaccctg 720
cggggctact acaatcagtc tgaggccagc agccatactc tgcagtggat gatcggctgc 780
gatctgggct ctgatggcag actgctgaga ggctacgagc agtacgccta cgacggcaag 840
gattatctgg ccctgaacga ggacctgcgg tcttggacag ctgccgatac agccgctcag 900
atcagcaaga gaaagtgcga ggccgccaat gtggccgaac agagaagggc ttacctggaa 960
ggcacctgtg tggaatggct gcacagatac ctggaaaacg gcaaagagat gctgcagcgg 1020
gccgatcctc ctaagacaca tgtgacccac catcctgtgt tcgactacga ggccacactg 1080
agatgttggg ccctgggctt ttaccctgcc gagatcatcc tgacctggca gcgagatggc 1140
gaggatcaga cccaggatgt ggaactggtg gaaaccagac ctgccggcga cggcaccttt 1200
cagaaatggg ctgctgtggt ggtgcccagc ggagaggaac agagatacac ctgtcacgtg 1260
cagcacgagg gactgcctga acctctgatg ctgagatgga agcagagcag cctgcctaca 1320
atccccatca tgggaatcgt ggccggactg gtggttctgg ccgctgttgt tacaggtgct 1380
gcagtggctg ccgtgctgtg gcggaagaaa agcagcgact ga 1422
<210> 98
<211> 1724
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAG启动子
<400> 98
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 60
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 120
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 180
tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 240
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 300
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 360
tcatcgctat taccatgggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc 420
cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg 480
ggggcggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 540
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 600
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 660
cgctgcgttg ccttcgcccc gtgccccgct ccgcgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 720
ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg 780
taattagcgc ttggtttaat gacggctcgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttaa 840
agggctccgg gagggccctt tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 900
tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggcccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg 960
cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcgtgtg cgcgagggga gcgcggccgg gggcggtgcc 1020
ccgcggtgcg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg 1080
ggtgagcagg gggtgtgggc gcggcggtcg ggctgtaacc cccccctgca cccccctccc 1140
cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtgcggggcg tggcgcgggg 1200
ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct 1260
cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg gagcgccggc ggctgtcgag 1320
gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc 1380
ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg 1440
gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg 1500
tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg gctgccgcag ggggacggct 1560
gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcgggatat 1620
ctacgaagcg gccgccctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 1680
tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaa 1724
<210> 99
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SV40终止子
<400> 99
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
t 121
<210> 100
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> tEGFR-P2A-IL15核苷酸序列
<400> 100
atgaggccct caggcactgc cggggccgcc ctcctggccc tgttagccgc tttgtgtcca 60
gcaagccgcg ccggagtgcg gaaatgtaag aaatgcgaag gaccctgccg gaaggtatgc 120
aacggcattg ggattggcga attcaaggac agcctgagca ttaatgctac aaacatcaag 180
cactttaaga attgcaccag cattagcggc gatctgcata tactgccagt ggctttccga 240
ggcgactctt ttactcatac ccctccgctg gaccctcaag agctggacat tctcaagact 300
gtgaaggaaa ttacggggtt tctgctcatt caggcctggc ctgaaaaccg cacggatttg 360
catgcctttg agaatctgga aataatcaga ggccggacga aacagcatgg ccagttcagc 420
ctcgcggtcg tctctttgaa tattacgtca ctcggcctca ggtccctcaa agagatttct 480
gatggcgatg tcatcatctc tggtaataag aatctgtgtt acgcaaatac catcaattgg 540
aagaagctct ttgggacctc aggtcaaaag actaaaatta tctccaaccg cggcgagaac 600
agctgtaagg ctacaggcca ggtttgccac gcgctctgct ccccagaggg ttgctggggg 660
cctgagccaa gggattgcgt ttcatgtcgc aacgtgtctc ggggcagaga atgcgtggat 720
aaatgtaacc tcttagaggg cgaacctcgc gagtttgttg agaactcaga atgtatacag 780
tgccaccccg aatgtcttcc tcaggccatg aatatcacat gcaccggacg cggaccagac 840
aactgtatcc aatgtgctca ctacattgac ggacctcatt gtgtgaaaac atgccccgca 900
ggagttatgg gagaaaacaa caccctcgtt tggaaatatg ccgatgcagg tcacgtatgt 960
cacctgtgcc acccaaactg cacttatggg tgcaccgggc cgggcctgga ggggtgccct 1020
acgaatggac caaaaattcc cagtattgca actgggatgg tcggggcact gttgttgctg 1080
cttgtggttg ccctcgggat aggcctgttt atgtctggct ccggcgccac caatttcagc 1140
ctgctgaaac aggcaggcga cgtcgaagaa aatccaggac caatgcgaat atcaaaacca 1200
cacttgcgca gcatttctat acagtgctat ttgtgcttgt tgctgaactc tcacttcctc 1260
acagaggctg ggatacacgt tttcatactt ggatgttttt cagctgggct gccgaagaca 1320
gaggcgaatt gggtgaatgt aatttcagac ctcaagaaga tcgaggatct catccagtcc 1380
atgcacatcg acgctactct gtacacagag agcgatgtcc acccttcttg taaggttacc 1440
gccatgaaat gcttcctttt ggaactccaa gtcatctcat tggaatcagg ggatgcgtcc 1500
attcatgaca ccgtggaaaa cctgataata ctggctaaca acagcttgtc aagtaatggg 1560
aatgttactg agtccggttg taaagaatgt gaagagctgg aggagaagaa cattaaggaa 1620
tttttgcaat cttttgtaca tattgttcag atgtttatta acacaagc 1668
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)2
<400> 101
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 102
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)6
<400> 102
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 103
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)7
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 104
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)8
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 105
tttctgccca acttctgctg gcat 24
<210> 106
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CIITA Ex5左同源臂序列
<400> 106
aaacttctac caccgtcacc tatctctcag ggtttcctaa acatactctg aacaagtttc 60
ctcactctgc cactgtgacc cagaaagcta tctgttctcc ttctcccaga ctctgcctca 120
tctttcaagg cctggttcca ggatcccttc ctccaggaag ccttccctga ttgccctatt 180
ccaccataca ccttttttct cggacttcat gtcatggtgc ctatattcca agggctctga 240
gccatgtacc cctttatata gttaccacta tttactgagt gcctactgta taccagctac 300
tgtgttggat gctctagatg tagaacctct aattatcacc atcgattcct gggtagtagg 360
cattatttat tcatcttaca cagatgagaa aatggaggcc cacagtggtt aaataagtag 420
cccaagattg cacagctagt agggctagtg gaaagtagag gtggaatttg aactcaaatc 480
ctgcagtaac tctaccattc tgccttgctc ttctttgtag cagtagataa gttttcatgg 540
atacatacct catccttttg attagattaa gggcccctgg agtgtcagtg ttcattcatt 600
tgtttgatca ttcattcatt caacaaacat ttcttgagtc cccactgtgt gccaggccca 660
gaggttcccc agcccaaggc ctggcacaca gtgggccttc agttagacct tgttgattga 720
ctgcgctttt ccttgtctgg gcagcggaac tggaccagta tgtcttccag gactcccagc 780
tggagggcct gagcaaggac attttcagta agtttgtggt gggtggggag gtcttggctc 840
agcctgcatt tcctgccttg ttccctgggg ggtgccctaa tacctgacga ccattcattg 900
atgggcagtc agacccctct ccccaaggtg ggtacaatag agactcacct tgggctttca 960
ttgattgtgt gagttggtct ctggtttttc tcaaagtaga gcacatagga ccagatgaag 1020
tgatcggtga gagtatggag atgccagcag 1050
<210> 107
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CIITA Ex5右同源臂序列
<400> 107
aagttgggca gaaaagtcag aaaagacgtg agtgagcccc tccctgatcc aacctagcct 60
tgcttgagac ctggcctttc cttgactcca aagcctgctg tgggtccaac ttgcttccct 120
cgctaagtcc tgtctggttg ggaggccctt taaaagccaa caggagcctt aaaatgtaca 180
tctgattatt tcatggccct gataaccctc caatggctac aaaatacatg ccacaaggcc 240
tgtatggccc ttcctccctc tccaaaccca ctatgagaca ccacacttca gccaccacca 300
gcttctccac tcctataacc catgtgccct ttcaagcctc ggggcctttg cagttgctat 360
agtctctatc tggaatgccc ttcccccagt tcttcccatg gctgactcct ttgaatcttt 420
ctggtgttgg ctaaactgtc acctcttcct ggaacccttc tctgaccatc cttccatgta 480
gattagctca gttattctca ccttgtgtgt ctttttcctt gcagtttagc actcattacc 540
atctggacat attttacgcc ttgctctccc actgtgagga cagggacctt gtctttcttg 600
ctcgtgactg tttccccagc atctagtgca gtgcctggta tgcagtagca cctcagtaga 660
tatctgttga atgaaaacat ctgtaaaatg ggtgtaacag ttaactgagt acttattatg 720
ggtctgacca tgtgtaagtc ctgtatctat ttattcagtt cttaaacagg tgaatcgcac 780
acagggtatg agattttaaa agtgcaaaga atattcagtg aaggctgggc gcagcggctc 840
acacctgtaa tcccagcagt ttgggaggcc aagggggacg gatcacttga ggtcaggagt 900
ttgatacctg cctggccaac atggtgaaac cgcgtctcta ccaaaaaata caaaaattag 960
ccgggtgtgg tggtgcacgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatc 1020
gcttgaaccc aggaggtgga ggttgcagtg ag 1052
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 108
tttggtccca ttggtcgcgg gctt 24
<210> 109
<211> 973
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD70 Ex1左同源臂序列
<400> 109
aaaaataaaa aataaaaata ttaacttaat ttaactttaa acaaaaaagc aggtggtctc 60
caagaatgca ggagataact gaccgggtgc agtgtctcat gcctttaatc ccagcacttt 120
ggaaggccaa ggcgggtgga tcacccaagg tcaggagttc aagtccagcc tggccaacat 180
ggtgaaaccc catctctact aaaaatacaa aaaattagcc aggcatggtg gcgcgcgcat 240
gttactccca gctactcgcg aggctcagac aggagaatcg cttgaaccca ggagatcgag 300
gttgcggcga gctgagatgg cgccactgca ctccagcctg ggtgacagag ggagacctcc 360
gtctcaaaaa caaaacaaat caaaaaaatg caggagaggg gtacacgaat atttggggag 420
cacccccaat tcttggatgt ctgctgtatc cccagtgcac agcacaatct aatccctaat 480
aaatgtgcag tggaggtttg ttgaataaat gaatgggccc cagaagaatg aggtggagag 540
gggaatagga agattgaatg tctcctgcct gaaggtcggg cggggagggg ttgggggcag 600
gcaactctga ggctcacccg gggccactgc ctgcatcctg gcaactgcct ccacccactt 660
taggatcttc agactggcag cggttggagg gaatttcccc tcgccaattg ctcaagtccc 720
tcccctcgac cggccggaca tccccagaga ggggcaggct ggtcccctga caggttgaag 780
caagtagacg cccaggagcc ccgggagggg gctgcagttt ccttccttcc ttctcggcag 840
cgctccgcgc ccccatcgcc cctcctgcgc tagcggaggt gatcgccgcg gcgatgccgg 900
aggagggttc gggctgctcg gtgcggcgca ggccctatgg gtgcgtcctg cgggctgctt 960
tggtcccatt ggt 973
<210> 110
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD70 Ex1右同源臂序列
<400> 110
cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc ttcgcacagg ctcagcagca 60
gctgccgctc gagtcacttg gggtgagttg agatggaaaa gttgggaaga aaacatagag 120
aggcgcgtga ccgaaaagac agaatgagat gggtacaaag aggccagaga ggaagatctg 180
gtagggcaga gacagagacc agaacaggga ggcgaggcgg ggaccaggct gcccggtgta 240
ggggctacga gacaggcagc cctgccagga ggtacaggga gatcccggga tgggaaaggt 300
aggcacacat ggaaatggaa gatgactcgg ctctggtgtt cccccggcag gctgactcag 360
aggctgctgg gggcttcaca aggctgggcg tgggggcttc ctggggcctc ctaggacggg 420
atggccccag ccactcgctc cgggtggggg aggggtccct ttggggaccg cgccgggcgc 480
ctttgcagcg tagagagtcc gctgcgcgcg gtgctctcgc gcccagtgac atccaggaaa 540
acgattcggg aaacgaagaa gttcttttga aggtctcgac ttcacgttcc ccgctggttc 600
agacctgctt cctctttaag aagtcttaag agtaaaaaaa aataaaatga aataaaatca 660
ccagtgcgcg ccgtgggatg agaggtggaa aggaggatgg acagagaaaa gagagctcct 720
ggcacagggg acacatagaa cctctctgct tacgtccgtg ccctgttttc tggtcttttc 780
ttccagtggg acgtagctga gctgcagctg aatcacacag gtaacacggg ggacgtggag 840
ggacggggag aagaagaggc acagagagag aaggaaggag aggtagaaag acaagtgggg 900
agagacagag agaaagagac acagacagag acggagggag agagggaggg agagataggg 960
agggaaacgg agagggggag acagagagaa gacagagagg 1000
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 111
tttcccgaga ccgtcctggc gcg 23
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 112
tttgtctgca gggaaacaag agacc 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 靶向结构域
<400> 113
tttggagtgg ccgggttcta gagtg 25
<210> 114
<211> 3792
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WT MAD7核酸序列
<400> 114
atgaataatg gaacaaataa ctttcagaat tttatcggaa tttcttcttt gcagaagact 60
cttaggaatg ctctcattcc aaccgaaaca acacagcaat ttattgttaa aaacggaata 120
attaaagaag atgagctaag aggagaaaat cgtcagatac ttaaagatat catggatgat 180
tattacagag gtttcatttc agaaacttta tcgtcaattg atgatattga ctggacttct 240
ttatttgaga aaatggaaat tcagttaaaa aatggagata acaaagacac tcttataaaa 300
gaacagactg aataccgtaa ggcaattcat aaaaaatttg caaatgatga tagatttaaa 360
aatatgttca gtgcaaaatt aatctcagat attcttcctg aatttgtcat tcataacaat 420
aattattctg catcagaaaa ggaagaaaaa acacaggtaa ttaaattatt ttccagattt 480
gcaacgtcat tcaaggacta ttttaaaaac agggctaatt gtttttcggc tgatgatata 540
tcttcatctt cttgtcatag aatagttaat gataatgcag agatattttt tagtaatgca 600
ttggtgtata ggagaattgt aaaaagtctt tcaaatgatg atataaataa aatatccgga 660
gatatgaagg attcattaaa ggaaatgtct ctggaagaaa tttattctta tgaaaaatat 720
ggggaattta ttacacagga aggtatatct ttttataatg atatatgtgg taaagtaaat 780
tcatttatga atttatattg ccagaaaaat aaagaaaaca aaaatctcta taagctgcaa 840
aagcttcata aacagatact gtgcatagca gatacttctt atgaggtgcc gtataaattt 900
gaatcagatg aagaggttta tcaatcagtg aatggatttt tggacaatat tagttcgaaa 960
catatcgttg aaagattgcg taagattgga gacaactata acggctacaa tcttgataag 1020
atttatattg ttagtaaatt ctatgaatca gtttcacaaa agacatatag agattgggaa 1080
acaataaata ctgcattaga aattcattac aacaatatat tacccggaaa tggtaaatct 1140
aaagctgaca aggtaaaaaa agcggtaaag aatgatctgc aaaaaagcat tactgaaatc 1200
aatgagcttg ttagcaatta taaattatgt tcggatgata atattaaagc tgagacatat 1260
atacatgaaa tatcacatat tttgaataat tttgaagcac aggagcttaa gtataatcct 1320
gaaattcatc tggtggaaag tgaattgaaa gcatctgaat taaaaaatgt tctcgatgta 1380
ataatgaatg cttttcattg gtgttcggtt ttcatgacag aggagctggt agataaagat 1440
aataattttt atgccgagtt agaagagata tatgacgaaa tatatccggt aatttcattg 1500
tataatcttg tgcgtaatta tgtaacgcag aagccatata gtacaaaaaa aattaaattg 1560
aattttggta ttcctacact agcggatgga tggagtaaaa gtaaagaata tagtaataat 1620
gcaattattc tcatgcgtga taatttgtac tatttaggaa tatttaatgc aaaaaataag 1680
cctgacaaaa agataattga aggtaataca tcagaaaata aaggggatta taagaagatg 1740
atttataatc ttctgccagg accaaataaa atgatcccca aggtattcct ctcttcaaaa 1800
accggagtgg aaacatataa gccgtctgcc tatatattgg agggctataa acaaaacaag 1860
catattaaat cctctaagga ttttgatata acattttgtc acgatttgat tgattatttt 1920
aagaactgta tagcaataca tcctgaatgg aagaattttg gctttgattt ttctgacacc 1980
tccacatatg aagatatcag cggattttac agagaagtcg aattacaagg ttataaaatc 2040
gactggacat atatcagcga aaaggatatt gatttgttgc aggaaaaagg acagttatat 2100
ttattccaaa tatataacaa agatttttcc aagaaaagta ccggaaatga taatcttcat 2160
actatgtatt tgaagaattt gtttagtgaa gagaatttaa aggatattgt actgaaatta 2220
aacggtgagg cggaaatctt ctttagaaaa tcaagcataa agaatccaat aattcataaa 2280
aaaggctcta ttcttgttaa tagaacatat gaagcagagg aaaaagatca atttggaaat 2340
atccagatag tcagaaaaaa cataccggaa aatatatatc aggagcttta taaatatttc 2400
aatgataaaa gtgataaaga actttcggat gaagcagcta agcttaagaa tgtagtaggt 2460
catcatgagg ctgctacaaa catagtaaaa gattatagat atacatatga taaatatttt 2520
cttcatatgc ctattacaat caattttaaa gccaataaga caggctttat taatgacaga 2580
atattacaat atattgctaa agaaaaggat ttgcatgtaa taggcattga tcgtggtgaa 2640
agaaacctga tatatgtttc agtaattgat acttgtggaa atattgttga acaaaaatcg 2700
tttaacattg ttaatggata tgattatcag attaagctca agcagcagga gggggcgcga 2760
caaatcgcac gaaaagaatg gaaagaaatc ggcaaaataa aagaaattaa agaaggctat 2820
ttatctcttg taattcatga aatttcaaag atggttatta aatataatgc cataattgca 2880
atggaggatt taagctacgg atttaaaaaa ggtcgtttca aggttgagcg acaggtttac 2940
cagaagtttg agacaatgct tatcaacaaa ctcaactatc tggtatttaa agatatatcc 3000
ataacggaaa acggtggtct tctaaaggga taccagctta catatattcc agataaactg 3060
aaaaatgtgg gtcatcaatg tggctgtata ttttatgtac ctgctgccta tacatcaaaa 3120
atagatccta caaccggatt tgtaaatata ttcaaattta aagatttaac agttgatgcg 3180
aagagagaat ttataaaaaa atttgacagt atcagatatg attcagaaaa aaatctgttt 3240
tgttttacat tcgattataa taactttatt acgcaaaata ctgttatgtc aaagtcaagc 3300
tggagtgtat atacgtacgg agttaggata aaaagaagat ttgtcaatgg caggttctca 3360
aatgaatcgg atacaattga tataacaaaa gatatggaaa aaacactcga aatgacagat 3420
ataaattgga gagatggtca tgatctgagg caggatatta ttgattatga aatcgtacaa 3480
cacatatttg agatttttag attgactgta caaatgagaa acagtttaag tgaattagaa 3540
gacagggatt atgaccgttt gatttctccg gtgctcaatg aaaataatat attttatgat 3600
tcagctaaag caggagatgc gttacctaaa gacgcagatg ctaatggtgc atattgtata 3660
gctctaaaag gcttgtatga aatcaaacaa attacagaga attggaaaga agacggtaag 3720
ttttcaagag ataaacttaa aatttccaat aaggactggt ttgactttat tcaaaataaa 3780
aggtatttat aa 3792
<210> 115
<211> 3792
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的核酸序列
<400> 115
atgaacaacg gcacaaataa ttttcagaac ttcatcggga tctcaagttt gcagaaaacg 60
ctgcgcaatg ctctgatccc cacggaaacc acgcaacagt tcatcgtcaa gaacggaata 120
attaaagaag atgagttacg tggcgagaac cgccagattc tgaaagatat catggatgac 180
tactaccgcg gattcatctc tgagactctg agttctattg atgacataga ttggactagc 240
ctgttcgaaa aaatggaaat tcagctgaaa aatggtgata ataaagatac cttaattaag 300
gaacagacag agtatcggaa agcaatccat aaaaaatttg cgaacgacga tcggtttaag 360
aacatgttta gcgccaaact gattagtgac atattacctg aatttgtcat ccacaacaat 420
aattattcgg catcagagaa agaggaaaaa acccaggtga taaaattgtt ttcgcgcttt 480
gcgactagct ttaaagatta cttcaagaac cgtgcaaatt gcttttcagc ggacgatatt 540
tcatcaagca gctgccatcg catcgtcaac gacaatgcag agatattctt ttcaaatgcg 600
ctggtctacc gccggatcgt aaaatcgctg agcaatgacg atatcaacaa aatttcgggc 660
gatatgaaag attcattaaa agaaatgagt ctggaagaaa tatattctta cgagaagtat 720
ggggaattta ttacccagga aggcattagc ttctataatg atatctgtgg gaaagtgaat 780
tcttttatga acctgtattg tcagaaaaat aaagaaaaca aaaatttata caaacttcag 840
aaacttcaca aacagattct atgcattgcg gacactagct atgaggtccc gtataaattt 900
gaaagtgacg aggaagtgta ccaatcagtt aacggcttcc ttgataacat tagcagcaaa 960
catatagtcg aaagattacg caaaatcggc gataactata acggctacaa cctggataaa 1020
atttatatcg tgtccaaatt ttacgagagc gttagccaaa aaacctaccg cgactgggaa 1080
acaattaata ccgccctcga aattcattac aataatatct tgccgggtaa cggtaaaagt 1140
aaagccgaca aagtaaaaaa agcggttaag aatgatttac agaaatccat caccgaaata 1200
aatgaactag tgtcaaacta taagctgtgc agtgacgaca acatcaaagc ggagacttat 1260
atacatgaga ttagccatat cttgaataac tttgaagcac aggaattgaa atacaatccg 1320
gaaattcacc tagttgaatc cgagctcaaa gcgagtgagc ttaaaaacgt gctggacgtg 1380
atcatgaatg cgtttcattg gtgttcggtt tttatgactg aggaacttgt tgataaagac 1440
aacaattttt atgcggaact ggaggagatt tacgatgaaa tttatccagt aattagtctg 1500
tacaacctgg ttcgtaacta cgttacccag aaaccgtaca gcacgaaaaa gattaaattg 1560
aactttggaa taccgacgtt agcagacggt tggtcaaagt ccaaagagta ttctaataac 1620
gctatcatac tgatgcgcga caatctgtat tatctgggca tctttaatgc gaagaataaa 1680
ccggacaaga agattatcga gggtaatacg tcagaaaata agggtgacta caaaaagatg 1740
atttataatt tgctcccggg tcccaacaaa atgatcccga aagttttctt gagcagcaag 1800
acgggggtgg aaacgtataa accgagcgcc tatatcctag aggggtataa acagaataaa 1860
catatcaagt cttcaaaaga ctttgatatc actttctgtc atgatctgat cgactacttc 1920
aaaaactgta ttgcaattca tcccgagtgg aaaaacttcg gttttgattt tagcgacacc 1980
agtacttatg aagacatttc cgggttttat cgtgaggtag agttacaagg ttacaagatt 2040
gattggacat acattagcga aaaagacatt gatctgctgc aggaaaaagg tcaactgtat 2100
ctgttccaga tatataacaa agatttttcg aaaaaatcaa ccgggaatga caaccttcac 2160
accatgtacc tgaaaaatct tttctcagaa gaaaatctta aggatatcgt cctgaaactt 2220
aacggcgaag cggaaatctt cttcaggaag agcagcataa agaacccaat cattcataaa 2280
aaaggctcga ttttagtcaa ccgtacctac gaagcagaag aaaaagacca gtttggcaac 2340
attcaaattg tgcgtaaaaa tattccggaa aacatttatc aggagctgta caaatacttc 2400
aacgataaaa gcgacaaaga gctgtctgat gaagcagcca aactgaagaa tgtagtggga 2460
caccacgagg cagcgacgaa tatagtcaag gactatcgct acacgtatga taaatacttc 2520
cttcatatgc ctattacgat caatttcaaa gccaataaaa cgggttttat taatgatagg 2580
atcttacagt atatcgctaa agaaaaagac ttacatgtga tcggcattga tcggggcgag 2640
cgtaacctga tctacgtgtc cgtgattgat acttgtggta atatagttga acagaaaagc 2700
tttaacattg taaacggcta cgactatcag ataaaactga aacaacagga gggcgctaga 2760
cagattgcgc ggaaagaatg gaaagaaatt ggtaaaatta aagagatcaa agagggctac 2820
ctgagcttag taatccacga gatctctaaa atggtaatca aatacaatgc aattatagcg 2880
atggaggatt tgtcttatgg ttttaaaaaa gggcgcttta aggtcgaacg gcaagtttac 2940
cagaaatttg aaaccatgct catcaataaa ctcaactatc tggtatttaa agatatttcg 3000
attaccgaga atggcggtct cctgaaaggt tatcagctga catacattcc tgataaactt 3060
aaaaacgtgg gtcatcagtg cggctgcatt ttttatgtgc ctgctgcata cacgagcaaa 3120
attgatccga ccaccggctt tgtgaatatc tttaaattta aagacctgac agtggacgca 3180
aaacgtgaat tcattaaaaa atttgactca attcgttatg acagtgaaaa aaatctgttc 3240
tgctttacat ttgactacaa taactttatt acgcaaaaca cggtcatgag caaatcatcg 3300
tggagtgtgt atacatacgg cgtgcgcatc aaacgtcgct ttgtgaacgg ccgcttctca 3360
aacgaaagtg ataccattga cataaccaaa gatatggaga aaacgttgga aatgacggac 3420
attaactggc gcgatggcca cgatcttcgt caagacatta tagattatga aattgttcag 3480
cacatattcg aaattttccg tttaacagtg caaatgcgta actccttgtc tgaactggag 3540
gaccgtgatt acgatcgtct catttcacct gtactgaacg aaaataacat tttttatgac 3600
agcgcgaaag cgggggatgc acttcctaag gatgccgatg caaatggtgc gtattgtatt 3660
gcattaaaag ggttatatga aattaaacaa attaccgaaa attggaaaga agatggtaaa 3720
ttttcgcgcg ataaactcaa aatcagcaat aaagattggt tcgactttat ccagaataag 3780
cgctatctct aa 3792
<210> 116
<211> 1263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAD7氨基酸序列
<400> 116
Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser
1 5 10 15
Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln
20 25 30
Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly
35 40 45
Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly
50 55 60
Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser
65 70 75 80
Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Ile Lys Glu Gln Thr Glu Tyr Arg Lys Ala Ile His Lys Lys
100 105 110
Phe Ala Asn Asp Asp Arg Phe Lys Asn Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala
130 135 140
Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe
145 150 155 160
Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser
165 170 175
Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys His Arg Ile Val Asn Asp Asn
180 185 190
Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys Ile Ser Gly Asp Met Lys Asp
210 215 220
Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys
245 250 255
Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu
260 265 270
Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Gln Lys Leu His Lys Gln Ile Leu Cys
275 280 285
Ile Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Val Pro Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Glu
290 295 300
Glu Val Tyr Gln Ser Val Asn Gly Phe Leu Asp Asn Ile Ser Ser Lys
305 310 315 320
His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr
325 330 335
Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser
340 345 350
Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile
355 360 365
His Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Gly Asn Gly Lys Ser Lys Ala Asp Lys
370 375 380
Val Lys Lys Ala Val Lys Asn Asp Leu Gln Lys Ser Ile Thr Glu Ile
385 390 395 400
Asn Glu Leu Val Ser Asn Tyr Lys Leu Cys Ser Asp Asp Asn Ile Lys
405 410 415
Ala Glu Thr Tyr Ile His Glu Ile Ser His Ile Leu Asn Asn Phe Glu
420 425 430
Ala Gln Glu Leu Lys Tyr Asn Pro Glu Ile His Leu Val Glu Ser Glu
435 440 445
Leu Lys Ala Ser Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Val Ile Met Asn Ala
450 455 460
Phe His Trp Cys Ser Val Phe Met Thr Glu Glu Leu Val Asp Lys Asp
465 470 475 480
Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Pro
485 490 495
Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro
500 505 510
Tyr Ser Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Gly Ile Pro Thr Leu Ala
515 520 525
Asp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Tyr Ser Asn Asn Ala Ile Ile Leu
530 535 540
Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys
545 550 555 560
Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp
565 570 575
Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile
580 585 590
Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro
595 600 605
Ser Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Tyr Lys Gln Asn Lys His Ile Lys Ser
610 615 620
Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe
625 630 635 640
Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp
645 650 655
Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu
660 665 670
Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys
675 680 685
Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile
690 695 700
Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu His
705 710 715 720
Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile
725 730 735
Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser
740 745 750
Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg
755 760 765
Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln Phe Gly Asn Ile Gln Ile Val
770 775 780
Arg Lys Asn Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Phe
785 790 795 800
Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser Asp Glu Ala Ala Lys Leu Lys
805 810 815
Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala Thr Asn Ile Val Lys Asp Tyr
820 825 830
Arg Tyr Thr Tyr Asp Lys Tyr Phe Leu His Met Pro Ile Thr Ile Asn
835 840 845
Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile Asn Asp Arg Ile Leu Gln Tyr
850 855 860
Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu
865 870 875 880
Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile Asp Thr Cys Gly Asn Ile Val
885 890 895
Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile Lys
900 905 910
Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln Ile Ala Arg Lys Glu Trp Lys
915 920 925
Glu Ile Gly Lys Ile Lys Glu Ile Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Val
930 935 940
Ile His Glu Ile Ser Lys Met Val Ile Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala
945 950 955 960
Met Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Phe Lys Lys Gly Arg Phe Lys Val Glu
965 970 975
Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Thr Met Leu Ile Asn Lys Leu Asn
980 985 990
Tyr Leu Val Phe Lys Asp Ile Ser Ile Thr Glu Asn Gly Gly Leu Leu
995 1000 1005
Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Ile Pro Asp Lys Leu Lys Asn Val
1010 1015 1020
Gly His Gln Cys Gly Cys Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr
1025 1030 1035
Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Ile Phe Lys Phe
1040 1045 1050
Lys Asp Leu Thr Val Asp Ala Lys Arg Glu Phe Ile Lys Lys Phe
1055 1060 1065
Asp Ser Ile Arg Tyr Asp Ser Glu Lys Asn Leu Phe Cys Phe Thr
1070 1075 1080
Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Ile Thr Gln Asn Thr Val Met Ser Lys
1085 1090 1095
Ser Ser Trp Ser Val Tyr Thr Tyr Gly Val Arg Ile Lys Arg Arg
1100 1105 1110
Phe Val Asn Gly Arg Phe Ser Asn Glu Ser Asp Thr Ile Asp Ile
1115 1120 1125
Thr Lys Asp Met Glu Lys Thr Leu Glu Met Thr Asp Ile Asn Trp
1130 1135 1140
Arg Asp Gly His Asp Leu Arg Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Glu Ile
1145 1150 1155
Val Gln His Ile Phe Glu Ile Phe Arg Leu Thr Val Gln Met Arg
1160 1165 1170
Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Asp Arg Asp Tyr Asp Arg Leu Ile
1175 1180 1185
Ser Pro Val Leu Asn Glu Asn Asn Ile Phe Tyr Asp Ser Ala Lys
1190 1195 1200
Ala Gly Asp Ala Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr
1205 1210 1215
Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Thr Glu
1220 1225 1230
Asn Trp Lys Glu Asp Gly Lys Phe Ser Arg Asp Lys Leu Lys Ile
1235 1240 1245
Ser Asn Lys Asp Trp Phe Asp Phe Ile Gln Asn Lys Arg Tyr Leu
1250 1255 1260
<210> 117
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 支架序列
<400> 117
gttaagttat atagaataat ttctactgtt gtaga 35
<210> 118
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 支架序列
<400> 118
ctctacaact gataaagaat ttctactttt gtagat 36
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 支架序列
<400> 119
gtctggcccc aaattttaat ttctactgtt gtagat 36
<210> 120
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 120
uuuaucuguc cccuccaccc caca 24
<210> 121
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 121
uuuacucacg ucauccagca gaga 24
<210> 122
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 122
uuuaccuugg ggcucugaca ggua 24
<210> 123
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 123
agagugauca cagcucugac uaaa 24
<210> 124
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 124
cucagaccug aaucugcccc caaa 24
<210> 125
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 125
guguaccagc ugagagacuc uaaa 24
<210> 126
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 126
uuucugccca acuucugcug gcau 24
<210> 127
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 127
uuugguccca uuggucgcgg gcuu 24
<210> 128
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 128
uuucccgaga ccguccuggc gcg 23
<210> 129
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 129
uuugucugca gggaaacaag agacc 25
<210> 130
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 向导RNA
<400> 130
uuuggagugg ccggguucua gagug 25

Claims (75)

1.一种用于插入转基因的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体组合物，所述组合物包含：
(I)MAD7核酸酶；
(II)MAD7核酸酶特异性的向导RNA(gRNA)，其中，所述gRNA包含向导序列，所述向导序列能够与细胞中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130，当所述gRNA与所述MAD7核酸酶复合时，所述向导序列引导所述MAD7核酸酶与靶序列的序列特异性结合；以及
(III)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸序列，和(4)转录终止子序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，可选地，所述CAR是肿瘤抗原特异性的，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述向导序列特异性针对AAVS1基因座。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:120。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述转基因包含编码人工细胞死亡多肽的序列。
6.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，所述向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
8.根据权利要求5或6所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:126。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述转基因包含编码外源细胞因子的序列。
10.根据权利要求1或9所述的组合物，其中，所述向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
12.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:126。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对NKG2A基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:124。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对TRAC基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:125。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CLYBL基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:123。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CD70基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:127。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CD38基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:128。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中，gRNA向导序列特异性针对CD33基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，与AAVS1的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的核苷酸序列或它们的片段。
20.根据权利要求1、5至7和9至11中任一项所述的组合物，其中，与B2M的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的核苷酸序列或它们的片段。
21.根据权利要求1、5、6、8、9、10和12中任一项所述的组合物，其中，与CIITA的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含：(i)SEQ ID NO:66和SEQID NO:67的核苷酸序列或它们的片段；或(ii)SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107的核苷酸序列或它们的片段。
22.根据权利要求1或15所述的组合物，其中，与CLYBL的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的核苷酸序列或它们的片段。
23.根据权利要求1或16所述的组合物，其中，与CD70的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的核苷酸序列或它们的片段。
24.根据权利要求1或13所述的组合物，其中，与NKG2A的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73的核苷酸序列或它们的片段。
25.根据权利要求1或14所述的组合物，其中，与TRAC的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76的核苷酸序列或它们的片段。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中，当RNP复合体被引入细胞中时，包含与gRNA分子的向导序列互补的靶序列的内源基因在所述细胞中的表达降低或消除。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中，所述细胞为诱导性多能干细胞(iPSC)。
28.通过权利要求1至27中任一项所述的组合物用转基因转化的iPSC。
29.根据权利要求28所述的iPSC，其中，所述转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。
30.根据权利要求29所述的iPSC，其中，所述CAR特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。
31.根据权利要求30所述的iPSC，其中，与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原选自：HER2、EGFRvIII、EGFR、CD133、PDGFRA、FGFR1、FGFR3、MET、CD70、ROBO1和IL13Rα2；与卵巢癌相关的肿瘤抗原选自：FOLR1、FSHR、MUC16、MUC1、间皮素、CA125、EpCAM、EGFR、PDGFRα、连接蛋白-4和B7H4；与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原选自：GD2、MUC1、间皮素、HER2和EGFR；与肝癌相关的肿瘤抗原选自：紧密连接蛋白18.2、GPC-3、EpCAM、cMET和AFP；与血液恶性肿瘤相关的肿瘤抗原选自：CD19、CD22、CD79、BCMA、GPRC5D、SLAM F7、CD33、CLL1、CD123和CD70；与膀胱癌相关的肿瘤抗原选自：连接蛋白-4和SLITRK6。
32.根据权利要求30所述的iPSC，其中，所述肿瘤抗原选自：α-甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、碳酸酐酶EX、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD123、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及HCG的亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-I)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物和致癌基因产物。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的iPSC，其中，所述肿瘤抗原为CD19。
34.来源于权利要求28至33中任一项所述的iPSC的工程化免疫效应细胞或工程化免疫效应细胞群。
35.根据权利要求34所述的工程化免疫效应细胞或工程化免疫效应细胞群，其中，所述免疫效应细胞为T细胞或NK细胞。
36.根据权利要求35所述的工程化免疫效应细胞或工程化免疫效应细胞群，其中，所述T细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合。
37.一种用于插入转基因的MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体组合物，所述组合物包含：
(I)MAD7核酸酶系统，其中，所述系统由一个以上载体编码，所述载体包含：(a)编码向导RNA(gRNA)的序列，所述序列可操作地连接至第一调控元件，所述gRNA包含能够与细胞中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交的向导序列，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130；当进行转录时，所述向导序列引导MAD7复合体与靶序列的序列特异性结合；和(b)编码MAD7核酸酶的序列，所述序列可操作地连接至第二调控元件；以及
(II)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸，和(4)转录终止子序列。
38.一种基于MAD7/gRNA核糖核蛋白(RNP)的载体系统，所述载体系统包含：
(I)一个以上载体，所述载体包含(a)编码向导RNA(gRNA)的序列，所述序列可操作地连接至第一调控元件，所述gRNA包含能够与细胞中的AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列杂交的向导序列，所述向导序列选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130，当进行转录时，所述向导序列引导MAD7复合体与靶序列的序列特异性结合；(b)编码MAD7核酸酶的序列，所述序列可操作地连接至第二调控元件；以及
(II)转基因载体，所述转基因载体包含：(1)与AAVS1、B2M、CIITA、NKG2A、TRAC、CD70、CD38、CD33或CLYBL基因座的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列，(2)启动子，所述启动子可操作地连接至(3)编码转基因的多核苷酸，和(4)转录终止子序列。
39.根据权利要求37所述的组合物或根据权利要求38所述的载体系统，其中，所述细胞为诱导性多能干细胞(iPSC)。
40.根据权利要求37和39中任一项所述的组合物或根据权利要求38和39中任一项所述的载体系统，其中，所述第一调控元件和/或所述第二调控元件为启动子。
41.根据权利要求37、39至40中任一项所述的组合物或根据权利要求38至40中任一项所述的载体系统，其中，所述第一调控元件和所述第二调控元件相同。
42.根据权利要求37、39至40中任一项所述的组合物或根据权利要求38至40中任一项所述的载体系统，其中，所述第一调控元件和所述第二调控元件不同。
43.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，所述转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，可选地，所述CAR特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。
44.根据权利要求37和39至43中任一项所述的组合物或根据权利要求38至43中任一项所述的载体系统，其中，所述向导序列特异性针对AAVS1基因座。
45.根据权利要求43或44所述的组合物或根据权利要求43或44所述的载体系统，其中，gRNA向导序列包含SEQ ID NO:120。
46.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，所述转基因包含编码人工细胞死亡多肽的序列。
47.根据权利要求37、39至42和46中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42和46中任一项所述的载体系统，其中，所述向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。
48.根据权利要求46或47所述的组合物或根据权利要求46或47所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
49.根据权利要求46或47所述的组合物或根据权利要求46或47所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或126。
50.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，所述转基因包含编码外源细胞因子的序列。
51.根据权利要求37、39至42和50中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42和50中任一项所述的载体系统，其中，所述向导序列特异性针对B2M或CIITA基因座。
52.根据权利要求50或51所述的组合物或根据权利要求50或51所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对B2M基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:121。
53.根据权利要求50或51所述的组合物或根据权利要求50或51所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对CIITA基因座，所述gRNA向导序列包含SEQ ID NO:122或SEQ IDNO:126。
54.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对NKG2A基因座，所述gRNA向导序列包含SEQID NO:124。
55.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对TRAC基因座，所述gRNA向导序列包含SEQID NO:125。
56.根据权利要求37和39至42中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42中任一项所述的载体系统，其中，gRNA向导序列特异性针对CLYBL基因座，所述gRNA向导序列包含SEQID NO:123。
57.根据权利要求37和39至45中任一项所述的组合物或根据权利要求38至45中任一项所述的载体系统，其中，与AAVS1的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的核苷酸序列或它们的片段。
58.根据权利要求37、39至42、46至48和50至52中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42、46至48和50至52中任一项所述的载体系统，其中，与B2M的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的核苷酸序列或它们的片段。
59.根据权利要求37、39至42、46、47、49至51和53中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42、46、47、49至51和53中任一项所述的载体系统，其中，与CIITA的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含：(i)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的核苷酸序列或它们的片段；或(ii)SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107的核苷酸序列或它们的片段。
60.根据权利要求37、39至42和56中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42和56中任一项所述的载体系统，其中，与CLYBL的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的核苷酸序列或它们的片段。
61.根据权利要求37、39至42和54中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42和54中任一项所述的载体系统，其中，与NKG2A的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73的核苷酸序列或它们的片段。
62.根据权利要求37、39至42和55中任一项所述的组合物或根据权利要求38至42和55中任一项所述的载体系统，其中，与TRAC的靶序列的左臂和右臂同源的左多核苷酸序列和右多核苷酸序列分别包含SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76的核苷酸序列或它们的片段。
63.根据权利要求37和39至62中任一项所述的组合物或根据权利要求38至62中任一项所述的载体系统，其中，当RNP复合体被引入细胞中时，包含与gRNA分子的向导序列互补的靶序列的内源基因在所述细胞中的表达降低或消除。
64.一种以上逆转录病毒，所述逆转录病毒包含权利要求38至63中任一项所述的载体系统。
65.用权利要求38至63中任一项所述的载体系统或权利要求64所述的一种以上逆转录病毒转化的iPSC。
66.根据权利要求65所述的iPSC，其中，所述转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。
67.根据权利要求66所述的iPSC，其中，所述CAR特异性针对肿瘤抗原，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。
68.根据权利要求67所述的iPSC，其中，与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原选自：HER2、EGFRvIII、EGFR、CD133、PDGFRA、FGFR1、FGFR3、MET、CD70、ROBO1和IL13Rα2；与卵巢癌相关的肿瘤抗原选自：FOLR1、FSHR、MUC16、MUC1、间皮素、CA125、EpCAM、EGFR、PDGFRα、连接蛋白-4和B7H4；与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原选自：GD2、MUC1、间皮素、HER2和EGFR；与肝癌相关的肿瘤抗原选自：紧密连接蛋白18.2、GPC-3、EpCAM、cMET和AFP；与血液恶性肿瘤相关的肿瘤抗原选自：CD19、CD22、CD79、BCMA、GPRC5D、SLAM F7、CD33、CLL1、CD123和CD70；与膀胱癌相关的肿瘤抗原选自：连接蛋白-4和SLITRK6。
69.根据权利要求67所述的iPSC，其中，所述肿瘤抗原选自：α-甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、碳酸酐酶EX、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD123、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及HCG的亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-I)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物和致癌基因产物。
70.根据权利要求65至69中任一项所述的iPSC，其中，所述肿瘤抗原为CD19。
71.来源于权利要求65至70中任一项所述的iPSC的免疫效应细胞或免疫效应细胞群。
72.一种药物组合物，其包含来源于权利要求28至33和65至70中任一项所述的iPSC的免疫效应细胞。
73.一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括：向有需要的个体施用药学有效量的权利要求34至36和71中任一项所述的免疫效应细胞或免疫效应细胞群或权利要求72所述的药物组合物。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述癌症选自：肺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤、骨癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤和脑癌。
75.一种gRNA，其包含选自SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:130的向导序列。
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