JP2024519515A - 人工多能性幹細胞からガンマ－デルタｔ細胞を生成するための組成物および方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞からガンマ－デルタｔ細胞を生成するための組成物および方法 Download PDF

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ナーソ，マイケル，フランシス
グルン，ブッダ
シュー，ゼンロン
モース，バリー
ボルヘス，ルイス
カサーレ，クリスティーナ デル
ベキリ，マリルダ
トンプソン，ルーカス
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Abstract

人工多能性幹細胞からγδＴ細胞を生成するための方法が提供される。また、遺伝子操作されたｉＰＳＣ、γδＴ細胞、ＣＡＲ－γδＴ細胞、およびそれを使用する方法も提供される。【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１７１，６４６号明細書、および２０２１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２７９，８３７号明細書の利益を請求し、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本出願は、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する遺伝子操作された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびその誘導体細胞を提供する。また、同種異系細胞療法のためのキメラ抗原受容体を発現させるためのｉＰＳＣまたはその誘導体細胞の使用も提供される。さらに、関連ベクター、ポリヌクレオチド、および医薬組成物が提供される。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、ファイル名「４ＵＳ３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」および２０２２年３月２２日の作成日および１８７ｋｂのサイズを有する、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出される配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂにより提出される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
胸腺におけるＴ細胞発生は、細胞運命決定の秩序だったプロセスを介して進行する。前駆細胞が胸腺に（門脈血管系によって骨髄から到達した上で）進入する時に、それらは重要なインプットを提供する一連の膜結合型および可溶型タンパク質に遭遇する。これらのタンパク質は、発生中の胸腺細胞（Ｔ細胞前駆体）にシグナルを提供する。一部の重要なシグナル伝達ファミリーとしては、Ｎｏｔｃｈ、Ｆｌｔ３、Ｗｎｔ、およびサイトカインが挙げられる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特に、前駆細胞がＴ細胞運命に向かうのを駆動する重要な役割を果たしている。ヒト胸腺では、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質ＤＬＬ１、ＤＬＬ４およびＪａｇ２（胸腺中の間質細胞によって発現される）は、受容体Ｎｏｔｃｈ１（初期胸腺細胞によって発現される）を介してシグナル伝達する。かくして、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４およびＪａｇ２は、Ｎｏｔｃｈリガンドと記載される。
ヒト胸腺における個々のＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈリガンドの組合せの正確な役割はまだ不明確であるが、ＮｏｔｃｈリガンドがＴ細胞系列へのコミットメントにとって必須であることはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験から明らかである。前駆細胞がＴ細胞になることにコミットしたら、２つの異なる型のＴ細胞への最初の主要な分岐が生じる。ヒトゲノムは、４つの独自のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子クラスター；アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、およびデルタ（δ）を有する。その生殖系列構造において、これらの遺伝子クラスターはいずれも、機能性タンパク質をコードする機能性転写物として発現させることができない。その代わりに、これらの遺伝子クラスターはそれぞれ、物理的再構成を受ける必要があり、それによって遠く離れたサブ遺伝子がＴＣＲ再構成と呼ばれるプロセスによって互いに融合される。ＴＣＲ遺伝子クラスターが「再構成」される場合、それは機能性タンパク質をもたらす能力を有する。それぞれの機能性ＴＣＲタンパク質はヘテロ二量体ペアであるため、少なくとも２つのＴＣＲ遺伝子クラスターを再構成させなければならない。２つの型のＴＣＲヘテロ二量体が存在する。アルファクラスターとベータクラスターとの両方が再構成して機能性ヘテロ二量体を作出するαβ、およびガンマクラスターとデルタクラスターとの両方が再構成して機能性ヘテロ二量体を作出するγδである。発生中のＴ細胞がどのように他方のクラスターよりも一方のクラスターを再構成するかを決定するのかは不明であるが、胸腺細胞が一方の運命または他方の運命を選択する、つまり、それらがαβまたはγδＴ細胞になることは知られている。
γδＴ細胞系列へのコミットメントは、胸腺発生の初期に起こる。αβＴ細胞と違って、γδＴ細胞は、発生または機能のために高度に可変性の古典的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子に依存しない。いわゆる自然免疫様Ｔ細胞、γδＴ細胞は、危険（感染またはがん）を感知する時に不変リガンドに応答する。そのため、γδＴ細胞は、ＨＬＡ不一致のレシピエントに輸注した場合、移植片対宿主疾患を引き起こす可能性が低い。かくして、γδＴ細胞は、同種異系細胞療法のための有意な利点を提供する。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からγδＴ細胞を生成するための方法が、本明細書に記載される。さらに、ｉＰＳＣ由来γδＴ細胞（γδｉＴ細胞）に、悪性がん細胞を認識し、これを殺滅する能力を授けるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるための方法およびプロセスが記載される。
１つの一般的な態様では、遺伝子操作された人工多能性幹細胞またはその誘導体細胞が提供される。細胞は、（ｉ）組換え再構成γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；および（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含み、組換え再構成γδＴＣＲはＣＡＲの結合標的に特異的ではなく、ｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、細胞分裂刺激後に分化したＴ細胞の拡大を可能にする。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＴＲＧＶ２～５、ＴＲＧＶ８およびＴＲＧＶ９遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＪＰ、ＴＲＧＪＰ１およびＴＲＧＪＰ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ連結遺伝子；ならびにＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ定常遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＴＲＤＶ１～３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＤＤ１、ＴＲＤＤ２およびＴＲＤＤ３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ多様性遺伝子；ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＪ３およびＴＲＤＪ４からなる群から選択されるδＴＣＲ連結遺伝子；ならびにδＴＣＲ定常遺伝子ＴＲＤＣを含む。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、γＴＣＲ可変遺伝子ＴＲＧＶ９およびδＴＣＲ可変遺伝子ＴＲＤＶ２を含む。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、および（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）から選択される１つもしくは複数のホスホ抗原、または化学的に類似する分子によって活性化され、ホスホ抗原は、代謝プロセスの生成物として細胞中に天然に存在するか、またはホスホ抗原は、ビスホスホネート化学物質を用いた処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積され、ここで、ホスホ抗原の活性は、γδＴＣＲとの直接相互作用によるものであるか、またはホスホ抗原の活性は、ブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、もしくはＢＴＮ３Ａ３との相互作用によるものである。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、ホスホ抗原によって活性化されない。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好ましくは、ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）、αβＴ細胞またはγδＴ細胞から再プログラミングされる。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、アミノ－ビスホスホネートおよびインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下でＰＢＭＣを拡大した後、ＰＢＭＣ中に再プログラミング転写因子を組み込んでｉＰＳＣを生成することによって調製される。
ある特定の実施形態では、アミノ－ビスホスホネートは、ゾレドロン酸またはその塩である。
また、本出願のｉＰＳＣに由来するＴ細胞も提供される。
また、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；ならびに以下のさらなる特徴：
（ａ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうちの１つもしくは複数の欠失もしくは発現低下；
（ｃ）ＲＡＧ１およびＲＡＧ２遺伝子の欠失もしくは発現低下；
（ｄ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しないバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｅ）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）および／もしくはインターロイキン（ＩＬ－１５）受容体またはそのバリアントもしくはトランケーションをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｆ）構成的に活性なＩＬ－７受容体もしくはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｇ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）もしくはインターロイキン２１（ＩＬ－２１）またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｈ）ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／もしくはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｉ）白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）および／もしくはＣＤ２４をコードする外因性ポリヌクレオチド；または
（ｊ）ＰＳＭＡもしくはＨＳＶ－ｔｋなどの、１つもしくは複数のイメージングもしくはリポータータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはそれに由来するＴ細胞も提供される。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、γδＴ細胞から再プログラミングされ、再構成されたγδＴＣＲは、γδＴ細胞に対して内因性である。ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、組換え体である。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、再構成されたＴＣＲを有しないＴ細胞よりも、細胞分裂刺激後に分化したＴ細胞の拡大の増加を可能にする。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたはＴ細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号６６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはＨＬＡ－Ｇは、配列番号６９に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座に組み込まれることによって、遺伝子の欠失または発現低下をもたらすという条件で、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される細胞の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ３８遺伝子座に組み込まれることによって、ＣＤ３８遺伝子の欠失または発現低下をもたらす。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたはＴ細胞は、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つまたは複数の欠失または発現低下を有する。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）シグナルペプチドを含むシグナルペプチド；（ｉｉ）標的細胞上の抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；（ｉｉｉ）ヒンジ領域；（ｉｖ）膜貫通ドメイン；（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および（ｖｉ）共刺激ドメインを含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドである。ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１９抗原などの、がん細胞上で発現される抗原に特異的に結合する抗体に由来するｓｃＦｖまたはＶＨＨを含む。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８ヒンジ領域、またはＩｇＧヒンジ領域を含む。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ８膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、またはＣＤ７９Ｂに由来する。ある特定の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、
（ｉ）配列番号１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
（ｉｉ）配列番号７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２２に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
（ｉｖ）配列番号２４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｖ）配列番号６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（ｖｉ）配列番号２０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
を含む。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドの作用機構は、代謝性、二量体化誘導性または治療的モノクローナル抗体媒介性である。ある特定の実施形態では、治療的モノクローナル抗体媒介性人工細胞死ポリペプチドは、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される不活化された細胞表面タンパク質である。
ある特定の実施形態では、不活化された細胞表面タンパク質は、トランケートされた上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントである。ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、
（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｃ）配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｄ）配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｅ）配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｆ）配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｇ）配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｈ）配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｊ）配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｋ）配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｌ）配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｍ）配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；または
（ｎ）配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖
を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、
（ａ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｂ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびに、ＴＲＤＶ２、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｃ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｄ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｅ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｆ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｇ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｈ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｉ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｊ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｋ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｌ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
（ｍ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；または
（ｎ）ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖
を含む。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、
（ａ）配列番号１３３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖；
（ｂ）配列番号１３５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖；または
（ｃ）配列番号１５０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１５１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖
を含む。
また、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するアポトーシス誘導ドメインを含む人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号１３３、１３５、または１５０のアミノ酸配列を有するγＴＣＲ、および配列番号１３４、１３６、または１５１のアミノ酸配列を有するδＴＣＲを含む再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；ならびに（ｉｖ）必要に応じて、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする外因性ポリヌクレオチドであって、ＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれることによって、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるか、またはその発現を低下させる、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはＴ細胞も提供される。
また、本出願の実施形態による細胞を含む組成物も提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血液細胞、目的の１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含むか、またはそれと共に使用される。
また、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本出願の細胞または本出願の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
また、本出願のＴ細胞を製造する方法であって、細胞分化のための条件下で本出願のｉＰＳＣ細胞を分化させることによって、Ｔ細胞を得ることを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣのゲノム操作であって、標的化編集を含むゲノム操作によって得られる。標的化編集の例としては、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的変形によって実行される欠失、挿入、またはインデルが挙げられる。
また、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；ならびに以下のさらなる特徴：
（ａ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうちの１つもしくは複数の欠失もしくは発現低下；
（ｃ）ＲＡＧ１およびＲＡＧ２遺伝子の欠失もしくは発現低下；
（ｄ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しないバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｅ）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）および／もしくはインターロイキン（ＩＬ－１５）受容体またはそのバリアントもしくはトランケーションをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｆ）構成的に活性なインターロイキン７（ＩＬ－７）受容体もしくはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｇ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）もしくはインターロイキン２１（ＩＬ－２１）またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｈ）ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／もしくはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；
（ｉ）白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）および／もしくはＣＤ２４をコードする外因性ポリヌクレオチド；または
（ｊ）ＰＳＭＡもしくはＨＳＶ－ｔｋなどの、１つもしくは複数のイメージングもしくはリポータータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）も提供される。
前記概要、ならびに本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだ場合により良く理解されるであろう。しかしながら、以下のことが理解されるべきである。
図１Ａ～Ｃは、γδｉＴ細胞の供給源としての人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法の略図を示す。図１Ａは、血液試料から収集された成熟γδＴ細胞に由来するｉＰＳＣを使用してγδＴ細胞を生成する方法を示す。図１Ｂは、血液試料から収集されたＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来するｉＰＳＣを使用してγδｉＴ細胞を生成する方法を示す。図１Ｃは、血液試料から収集された成熟αβＴ細胞に由来するｉＰＳＣを使用してγδｉＴ細胞を生成する方法を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図２Ａ～Ｄは、Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）を誘導するためのγδＴ細胞の拡大を示す。図２Ａは、ゾレドロネートおよびＩＬ－２（拡大後）を含有する培地中での拡大前および拡大の１４日後のＣＤ３＋Ｔ細胞からのＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の選別を示す代表的なＦＡＣＳの結果のグラフを示す。図２Ｂは、ゾレドロネートおよびＩＬ－２（拡大後）を含有する培地中での１４日の拡大にわたる総細胞数のグラフを示す。図２Ｃは、ＰＣＲを使用して分析された４つのＴ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）系に由来する再構成されたＶγ９、Ｖδ２、またはＶδ１ＴＣＲ遺伝子座の存在または非存在を描写する表を示す。図２Ｄは、ＴｉＰＳＣ系から分化したｉＴ細胞（ＨＰＣステージからの１４日の分化）を示す。２つのＶγ９／Ｖδ２ＴｉＰＳＣクローンｇｄＴｉＰＳＣ４．１およびｇｄＴｉＰＳＣ４．４が示される。左パネルは、ＣＤ３およびγδＴＣＲの発現を示し、大部分の細胞が１４日目でＣＤ３／ＴＣＲ陽性であることを示す。右パネルは、ＣＤ３陽性細胞上でゲーティングされ、Ｖγ９／Ｖδ２ＴＣＲが全ての発生中のｉＴ細胞によって均一に使用されたことを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図３Ａ～Ｄは、γδＴ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた場合にγδｉＴ細胞を生じることを示す。図３Ａ～Ｂは、ｉＴ分化の１４日後、細胞は均一に（図３Ａ）ＣＤ３陽性および（図３Ｂ）γδＴＣＲ陽性／αβＴＣＲ陰性であったことを示す代表的なＦＡＣＳの結果のグラフを示す。図３Ｃは、ＴｉＰＳＣ系が外因性構成的プロモーター下でＣＤ１９特異的なＣＡＲを発現するように操作された場合のＣＡＲ発現を示す代表的なＦＡＣＳの結果のグラフを示す。図３Ｄは、操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞がＣＤ１９（＋）Ｒｅｈ細胞を強力に殺滅したが、ＣＤ１９が遺伝子編集によって欠失したＲｅｈ細胞（ＣＤ１９（－））を殺滅しなかったことを示すグラフを示す。 （上記の通り。） 図４Ａ～Ｂは、（図４Ａ）ドナー由来および（図４Ｂ）ｉＰＳＣ由来細胞療法を生成するためのワークフローの比較を示す。 （上記の通り。） 図５Ａ～Ｂは、（図５Ａ）ゾレドロン酸およびＩＬ－２へのＴ細胞の曝露がγδＴ細胞富化（上）をもたらすが、γδＴ細胞の総増加は３人のドナーのうちの２人において再プログラミングの成功には不十分である（下）こと、ならびに（図５Ｂ）新しい拡大方法が、同じ３人のドナーにおけるｉＰＳＣ再プログラミングにとって十分なレベルまでγδＴ細胞増殖の規模を増大させながら（下）、γδＴ細胞富化を保持する（上）ことを示す。 （上記の通り。） 図６は、新しいγδＴｉＰＳＣ系の作出が、ドナー細胞の収集およびＶγ９／Ｖδ２ＴＣＲを有するγδＴ細胞の富化から始まる方法を示す。２週間の拡大の経過にわたって、Ｖγ９／Ｖδ２細胞の頻度は、最初は減少する（７日目）が、細胞が２週間の経過にわたって拡大するにつれて立ち直る。拡大中の細胞を収集し、多能性遺伝子の導入によってｉＰＳＣ再プログラミングにかける。ｉＰＳＣコロニーを、顕微鏡形態によって同定し、各コロニーを二次培養のために拾う。２人のドナーを用いた３回の実験は、一致したＴｉＰＳＣ系収量をもたらした（表）。 図７Ａは、標的細胞同定を可能にするために、γδＴｉＰＳＣ系を、相同性修復（ＨＤＲ）と共にＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集を使用してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関して操作することを示す。次いで、ＣＡＲ－ＴｉＰＳＣ系を１回目の分化プロセスにかけて、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）の発達を強化する。この時点で、細胞は均一にＣＤ３４＋ＣＤ４３＋およびＣＤ４５＋／－である。次いで、ＨＰＣを２回目の分化プロセスにかけて、Ｔ系列へのコミットメントおよびγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の発達を強化する。図７Ｂは、ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋細胞（左）、ＣＤ４５＋／－細胞（中央）、およびＣＤ１９ ＣＡＲ＋（右）を同定するためのＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）上でのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図７Ｃは、Ｔ系列へのコミットメントおよびγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の発達を強化するための２回目の分化プロセス後のＣＤ７＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３／ＴＣＲγδ＋γδＣＡＲ－ｉＴ細胞のパーセンテージを示す。図７Ｄは、分化の４週後、細胞がＣＤ４５、ＣＤ３、γδＴＣＲ、およびＣＤ７を発現することを示す。２つの異なるＴｉＰＳＣ系と、異なるγδＴＣＲとの比較は、分化プロセスによって得ることができるＣＡＲ－ｉＴの表現型においていくらかの異種性が存在することを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図８Ａ～Ｄは、ＣＡＲ－γδｉＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を示す。ＣＤ１９発現腫瘍を除去するγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の能力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイを用いて決定した（腫瘍殺滅＝ｙ軸上のシグナルの減少）。（図８Ａ）γδＣＡＲ－ｉＴの活性を、標的としてＮＡＬＭ－６を使用して１：１のエフェクター：標的比で同じＣＤ１９ ＣＡＲを使用して、従来のαβＣＡＲ－Ｔ細胞の３つの異なるドナーバッチと比較した。（図８Ｂ）エフェクターの活性を、異なるＥ：Ｔ比で同じアッセイにおいて評価した。γδＣＡＲ－ｉＴ細胞はＣＡＲ－Ｔと同様に機能した。（図８Ｃ）γδＣＡＲ－ｉＴの活性を、標的としてＲｅｈ細胞を使用して１：１のエフェクター：標的比で同じＣＤ１９ ＣＡＲを使用して、従来のαβＣＡＲ－Ｔ細胞の３つの異なるドナーバッチと比較した。（図８Ｄ）エフェクターの活性を、異なるＥ：Ｔ比で同じアッセイにおいて評価した。γδＣＡＲ－ｉＴ細胞はＣＡＲ－Ｔと同様に機能した。図８Ｅ～Ｈは、ＣＡＲ－γδｉＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を示す。炎症性サイトカイン発現（例えば、ＩＦＮ－γまたはＴＮＦ）は、患者における毒性のため、細胞療法に対する懸念である。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と違って、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、殺滅アッセイにおいてＣＤ１９発現腫瘍と相互作用する時に、（図８Ｅ）ＩＦＮ－γまたは（図８Ｇ）ＴＮＦを放出しなかった。（図８Ｆ＆図８Ｈ）ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭ－６系を、対照として使用した。図８Ｉ～Ｊは、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞の持続性および活性のための恒常性サイトカインの重要性を示し、これを、その後のｉｎ ｖｉｖｏ試験を適切に設計するために評価した。最初に、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞を、１ｎＭのＩＬ－２または１ｎＭのＩＬ－５に曝露し、１時間にわたって培養し、０、１０、３０および６０分で試料採取した。ＩＬ－２またはＩＬ－１５に対する応答性を、（図８Ｉ）リン酸化されたＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）および（図８Ｊ）ｐＳＴＡＴ５に関する染色によって決定した。ｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５について類似していたが、ｐＳＴＡＴ３はＩＬ－２と比較してＩＬ－１５についてより早く、より高い規模であると考えられた。図８Ｋ～Ｌは、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞が経時的に殺滅する能力およびエフェクターではなく標的を１４日間にわたって毎日補充したＩｎｃｕＣｙｔｅ上で実施した反復標的曝露を評価するために使用した連続殺滅アッセイからの結果を示す。γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、（図８Ｋ）ＩＬ－２または（図８Ｌ）ＩＬ－１５に関して１４ラウンドにわたって腫瘍を制御することができた。しかしながら、殺滅は、ＩＬ－１５の存在下でより迅速かつ完全であると考えられた。図８Ｍは、エフェクター細胞を定量した場合の連続殺滅の終わりでの結果を示し、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５が殺滅中にγδＣＡＲ－ｉＴ拡大を支援することが明らかであった。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図９Ａは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ２／ＩＬ１５）１－１Ｊｉｃ／ＪｉｃＴａｃマウスにおけるエフェクター細胞の単回投与対複数回投与（図解）を使用してｉｎ ｖｉｖｏでγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を評価するために設計された試験に関する時系列の略図を示す。この試験の結果を、図９Ｂ～Ｅに提供する。主要転帰（２１日目での腫瘍増殖阻害）は、１または３用量のγδＣＡＲ－ｉＴ細胞を投与した場合、動物においてルシフェラーゼ標識されたＮＡＬＭ－６腫瘍の有意な減少と共に達成された（それぞれ、８６％のＴＧＩおよび９５％のＴＧＩ）。複数回投与は、マウスの生存の改善およびγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の持続性の増強をもたらした。全体として、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、体重減少の形態で毒性を示すことなく、活性および持続性を示した。図９Ｂは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ２／ＩＬ１５）１－１Ｊｉｃ／ＪｉｃＴａｃマウスにおけるエフェクター細胞の単回投与対複数回投与（図解）を使用してｉｎ ｖｉｖｏでγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を評価するために設計された試験の結果を示す。図９Ｂは、０（ＣＴＬ）、１（１ｘ用量）または３（３ｘ用量）用量のγδＣＡＲ－ｉＴ細胞を投与した場合の動物におけるルシフェラーゼ標識されたＮＡＬＭ－６腫瘍増殖を示す（それぞれ、８６％のＴＧＩおよび９５％のＴＧＩ）。図９Ｃは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ２／ＩＬ１５）１－１Ｊｉｃ／ＪｉｃＴａｃマウスにおけるエフェクター細胞の単回投与対複数回投与（図解）を使用してｉｎ ｖｉｖｏでγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を評価するために設計された試験の結果を示す。図９Ｃは、０（ＣＴＬ）、１（１ｘ用量）または３（３ｘ用量）用量のγδＣＡＲ－ｉＴ細胞を投与した場合の動物における経時的な腫瘍負荷を示す（それぞれ、８６％のＴＧＩおよび９５％のＴＧＩ）。全体として、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、体重減少の形態で毒性を示すことなく、活性を示した。図９Ｄは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ２／ＩＬ１５）１－１Ｊｉｃ／ＪｉｃＴａｃマウスにおけるエフェクター細胞の単回投与対複数回投与（図解）を使用してｉｎ ｖｉｖｏでγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を評価するために設計された試験の結果を示す。図９Ｄは、複数回投与が、マウスの生存の改善およびγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の持続性の増強をもたらしたことを示す。全体として、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、体重減少の形態で毒性を示すことなく、活性を示した。図９Ｅは、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ２／ＩＬ１５）１－１Ｊｉｃ／ＪｉｃＴａｃマウスにおけるエフェクター細胞の単回投与対複数回投与（図解）を使用してｉｎ ｖｉｖｏでγδＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を評価するために設計された試験の結果を示す。図９Ｅは、０（ＣＴＬ）、１（１ｘ用量）または３（３ｘ用量）用量のγδＣＡＲ－ｉＴ細胞を投与した場合の動物における経時的なＣＡＲ－ｉＴの持続性を示す。全体として、γδＣＡＲ－ｉＴ細胞は、体重減少の形態で毒性を示すことなく、持続性を示した。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図１０は、種々の抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）と共に使用した場合のγδｉＴ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を決定するための二色Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイの略図を示す。 図１１Ａ～Ｂは、ＡＤＣＣを実施するｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－γδＴ細胞を示す。（図１１Ａ）通常はＢ細胞抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０を発現し、赤色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を用いて操作されたＲａｊｉリンパ芽球Ｂ細胞系のＡＤＣＣを実行するＣＡＲ－γδＴ細胞。２つの異なる抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブおよびオビヌツズマブ）を、その関連するアイソタイプ対照と比較して試験した。赤色の腫瘍細胞（ＣＤ１９＋）を、全ての条件においてＣＡＲ－γδｉＴ細胞によって除去した。（図１１Ｂ）ＣＤ１９をコードする遺伝子をノックアウト（ＫＯ）するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用して改変された後、緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を用いて操作されたＲａｊｉ細胞のＡＤＣＣを実施するＣＡＲ－γδＴ細胞。２つの異なる抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブおよびオビヌツズマブ）を、その関連するアイソタイプ対照と比較して試験した。緑色のＣＤ１９ＫＯ腫瘍細胞は、アイソタイプ対照抗体の存在下で殺滅から免れた。リツキシマブまたはオビヌツズマブの存在は、ＣＡＲ－γδｉＴ細胞に、ＡＤＣＣによってＣＤ１９ＫＯ細胞を殺滅させた。
様々な刊行物、論文および特許が、背景技術に、また、明細書を通して引用または記載されている；これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれた文献、行為、材料、デバイス、論文などの考察は、本発明に関する文脈を提供するためのものである。そのような考察は、これらの事柄が、開示または特許請求される任意の発明に関して先行技術の一部を形成することの承認ではない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。その他、本明細書で使用されるある特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。
別途記述されない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの、任意の数値は、あらゆる場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。かくして、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、本文が別途明確に指摘しない限り、値のそのような範囲および画分内の整数を含む、あらゆる可能なサブ範囲、その範囲内のあらゆる個々の数値を明示的に含む。
別途指摘しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の中の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、規定を超えない実験を使用して、本明細書に記載される本出願の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であろう。そのような均等物は、本出願に包含されることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」またはその任意の他の変形は、任意の他の整数または整数群の排除ではなく、記述される整数または整数群の含有を意味すると理解され、包括的または非限定であることが意図される。例えば、要素の一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、論文、または装置は、これらの要素だけに必ずしも限定されないが、明示的に列挙されていないか、またはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、論文、もしくは装置に固有の他の要素を含んでもよい。さらに、それとは反対に明示的に記述されない限り、「または」は、包括的論理和を指し、排他的論理和を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真（または存在する）であり、Ｂが偽（または存在しない）である、Ａが偽（または存在しない）であり、Ｂが真（または存在する）である、およびＡとＢとが両方とも真（または存在する）である。
本明細書で使用される場合、複数の記載される要素の間の接続用語「および／または」は、個々の選択肢と、組み合わせた選択肢との両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素を含まない第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素の一緒の適用可能性を指す。これらの選択肢のいずれか１つは、その意味の中にあり、したがって、本明細書で使用される用語「および／または」の要件を満たすと理解される。１より多い選択肢の同時的適用可能性も、その意味の中にあり、したがって、用語「および／または」の要件を満たすと理解される。
本明細書で使用される場合、明細書および特許請求の範囲を通じて使用される用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」もしくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変形は、任意の記載される整数または整数群の含有を示すが、追加の整数または整数群を、特定された方法、構造、または組成物に追加することができないことを示す。
本明細書で使用される場合、明細書および特許請求の範囲を通じて使用される用語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変形は、任意の記載される整数または整数群の含有、および特定された方法、構造または組成物の基本的な、または新規の特性を実質的に変化させない、任意の記載される整数または整数群の任意選択による含有を示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトを意味する。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられ、より好ましくは、ヒトである。
また、好ましい発明の構成要素の次元または特徴に関して言う場合に本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「一般的に」、「実質的に」などは、当業者であれば理解できるように、記載される次元／特徴が厳密な境界またはパラメータではなく、機能的に同じか、または類似する、それからのわずかな変化を排除しないことを示すことも理解されるべきである。少なくとも、数値パラメータを含むそのような参照は、当業界で受け入れられている数学的および工業的原理（例えば、丸み付け、測定または他の系統的誤差、製造公差など）を使用して、最下位の数字を変化させない変動を含む。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列（例えば、ＣＡＲポリペプチドおよびそれらをコードするＣＡＲポリヌクレオチド）の文脈における用語「同一」または「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定した場合、比較し、最大一致のために整列させた場合、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列を、コンピュータに入力し、必要に応じて、サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
比較のための最適なアラインメントを、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の部分相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、または目視検査によって（例えば、一般的には、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照されたい）行うことができる。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するための好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Altschulら、上掲）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限り、それぞれの配列に沿って両方の向きに伸長される。
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチする残基に関するリワードスコア；常に０を超える）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に０未満）を使用して、累積スコアを算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ下落する；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、ゼロもしくはそれ未満になる；またはいずれかの配列の末端に達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定付ける。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）。
配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指示を提供する、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、参照配列と類似すると考えられる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指示は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。かくして、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指示は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、生物学的成分（核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞など）が、その成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、細胞、および組織から実質的に分離されている、から離れて生産されている、またはから精製されていることを意味する。かくして、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、標準的な精製方法および本明細書に記載の精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞を含む。「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、および細胞は、組成物の一部であってよく、組成物が核酸、ペプチド、タンパク質、または細胞の天然環境の一部ではない場合、依然として単離されたものであってよい。この用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
用語「組換え」とは、（１）その天然に存在する環境から取り出されている、（２）生体分子が天然に見出される別の生体分子の全部もしくは一部と結合していない、（３）それが天然では連結されていない別の生体分子に作動可能に連結されている、または（４）天然には存在しない生体分子を指す。生体分子の例としては、例えば、核酸またはポリペプチドが挙げられる。用語「組換え」を、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそのアナログ、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそのアナログ、ならびにそのような組換え核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡを参照して使用することができる。
「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と同義的に称される、本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、限定されるものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には、二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の改変塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のため、もしくは他の理由から改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの非通常の塩基が挙げられる。様々な改変を、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して作製することができる；かくして、「ポリヌクレオチド」は、典型的には、天然に見出されるような、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと称されることが多い、比較的短い核酸鎖も包含する。
「構築物」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、外来遺伝物質の、それを複製および／または発現させることができる標的細胞への送達または移動を指令することができる任意の核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子であってもよい。ベクターは、組込み型または非組込み型であってもよい。主な型のベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。
「組込み」とは、構築物の１つまたは複数のヌクレオチドが、細胞ゲノム中に安定に挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合的に連結されることを意味する。「標的化組込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位または「組込み部位」で細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡ中に挿入されることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「組込み」はさらに、組込み部位での内因性配列またはヌクレオチドの欠失あり、またはなしでの、構築物の１つまたは複数の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を含むプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組込み」は、欠失された内因性配列またはヌクレオチドの、１つまたは複数の挿入されたヌクレオチドによる置き換えをさらに含んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、参照された分子または参照された活性が宿主細胞中に導入されるか、または宿主細胞にとって非天然であることを意味することが意図される。分子を、例えば、宿主染色体への組込みなどによる、宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、この用語は、それがコード核酸の発現を参照して使用される場合、発現可能な形態のコード核酸の細胞中への導入を指す。用語「内因性」とは、宿主細胞中にその天然形態で存在する参照された分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現を参照して使用される場合、細胞内に天然に含有され、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡに転写され、一部の場合、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）またはその断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの突然変異体）またはその断片；操作されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療ペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択マーカーなどをコードしてもよい。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸断片上での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響することができる場合（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、そのコード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている。コード配列を、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に作動可能に連結することができる。
本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語は、ＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳も包含し、さらに、全ての天然に存在する転写後および翻訳後改変を包含する。発現されるＣＡＲは、宿主細胞の細胞質内にあってもよい、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境中にあってもよい、または細胞膜に固定されていてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸を含む分子を指してもよく、当業者であれば、タンパク質と認識することができる。アミノ酸残基に関する従来の一文字または三文字コードが本明細書で使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは改変によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当業界で公知の他の改変を含有するポリペプチドもこの定義の中に含まれる。
本明細書に記載のペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側にあり、Ｃ末端領域が右側にある通常の慣例に従って書かれる。アミノ酸の異性形態は公知であるが、別途明示的に示されない限り、表示されるのはＬ型のアミノ酸である。
本明細書で使用される場合、用語「操作された免疫細胞」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の外因性遺伝物質の、細胞の全遺伝物質への付加によって遺伝的に改変された、免疫エフェクター細胞とも称される、免疫細胞を指す。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および免疫エフェクター細胞
ＩＰＳＣは、無制限の自己再生能力を有する。ＩＰＳＣの使用は、大量の均一な同種異系治療生成物を供給する所望の免疫エフェクター細胞に拡大および分化させることができる改変細胞の制御された細胞バンクを生産するための細胞操作を可能にする。
遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその誘導体細胞が、本明細書で提供される。本明細書で提供される選択されたゲノム改変は、誘導体細胞の治療特性を増強する。誘導体細胞は、選択的モダリティの組合せをゲノム操作によってｉＰＳＣのレベルで細胞に導入した後に、機能的に改善されており、同種異系の市販の細胞療法にとって好適である。この手法は、ＣＲＳ／ＧＶＨＤによって媒介される副作用を低減させ、優れた有効性を提供しながら長期の自己免疫を防止するのに役立ち得る。
本発明によれば、これに関して操作されたｉＰＳＣは、ガンマデルタＴ細胞免疫エフェクター細胞に分化させることができる。本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特殊化されていない（「コミットされていない」）か、またはあまり特殊化されていない細胞が、特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。特殊化された細胞としては、例えば、血液細胞または筋肉細胞が挙げられる。分化した、または分化誘導された細胞は、細胞の系列内のより特殊化された（「コミットされた」）位置を獲得したものである。用語「コミットされた」は、分化のプロセスに適用される場合、通常の環境下で、それが特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、通常の環境下で、異なる細胞型に分化することも、あまり分化していない細胞型に復帰することもできない点まで分化経路において進行した細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「多能性」とは、身体もしくは体細胞または胚の全ての系列を適切に形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれに由来する細胞を形成することができる多能性幹細胞の型である。多能性は、完全な生物を生じることができない、不完全に、または部分的に多能性の細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じることができる、より原始的で、より多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までの範囲の一連の発生能力である。
本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣは、幹細胞が、３つ全ての胚葉または皮層：中胚葉、内胚葉、および外胚葉の組織に分化することができる細胞に誘導または変化または再プログラミングされた、分化した成人細胞、新生児細胞または胎児細胞から産生されることを意味する。産生されたｉＰＳＣは、天然に見出される細胞を指さない。
本明細書で使用される場合、用語「再プログラミング」または「脱分化」とは、細胞の能力を増大させるか、または細胞を、あまり分化していない状態に脱分化させる方法を指す。例えば、増大した細胞能力を有する細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より高い発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。換言すれば、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりも、あまり分化していない状態にあるものである。
用語「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆体細胞」、または「造血前駆細胞」または「ＨＰＣ」は、造血系列にコミットされるが、さらに造血分化を行うことができる細胞を指す。造血幹細胞としては、例えば、万能性造血幹細胞（血球母細胞）、骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞が挙げられる。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系列（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、全ての血液細胞型を生じる万能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞」とは、その表面上にＣＤ３４を発現するＨＰＣを指す。
本明細書で使用される場合、用語「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」とは、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫応答は、例えば、免疫エフェクター応答の促進を含む。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、肥満細胞、および骨髄由来食細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、互換的に使用され、胸腺での成熟を完了し、免疫系において様々な役割を有する白血球の種類を指す。Ｔ細胞は、例えば、体内の特異的外来抗原の同定ならびに他の免疫細胞の活性化および脱活性化を含む役割を有してもよい。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、一次Ｔ細胞、または培養されたＴ細胞系、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなどに由来するＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞などの、任意のＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であってもよい。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であってもよく、限定されるものではないが、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などを含む、任意の発生段階のものであってもよい。さらなる型のヘルパーＴ細胞としては、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈｌ７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が挙げられる。さらなる型のメモリーＴ細胞としては、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｒｎ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が挙げられる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの、遺伝子操作されたＴ細胞を指してもよい。Ｔ細胞は、幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」とは、その表面上にＣＤ４を発現し、細胞媒介性免疫応答と関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌を含むことができる、刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられる。「ＣＤ４」は、Ｔリンパ球上の分化抗原として元々定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞上にも見出される。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答における結合認識エレメントとして関与している。Ｔリンパ球上で、それらはヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、その表面上にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞ならびに細胞傷害性および抑制性Ｔリンパ球上に見出される分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用における結合認識エレメントである。
当業界で公知の方法を使用して非多能性細胞に再プログラミング因子を導入するための任意の公知の方法を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）親細胞系を生成することができる。例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１８３，０３８号明細書、第８，２６８，６２０号明細書、第８，４４０，４６１号明細書、第９，４９９，７８６号明細書、第１０，８６５，３８１号明細書に記載された、いわゆる「トンプソン因子」、または米国特許第８，９５２，８０１号明細書に記載された山中因子を使用することができる。方法は、米国特許第８，５４６，１４０号明細書；第９，６４４，１８４号明細書；第９，３２８，３３２号明細書；および第８，７６５，４７０号明細書に記載されたエピソームプラスミドに基づくプロセス、ならびにMalik, et al Methods Mol Biol. 2013 ; 997: 23-33によって記載されたセンダイウイルスおよび他の方法を含み、それらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。再プログラミング因子は、ポリヌクレオチドの形態にあってもよく、かくして、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つの再プログラミング因子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、クローン性ｉＰＳＣであるか、またはｉＰＳＣのプールから得られ、ゲノム編集は、１つまたは複数の選択された部位に、１つまたは複数の標的化組込みおよび／またはインデルを作製することによって導入される。別の実施形態では、ｉＰＳＣは、参照により本出願に組み込まれる米国特許第９，２０６，３９４号明細書および第１０，７８７，６４２号明細書に記載された、抗原特異性および再構成されたＴＣＲ遺伝子を有するヒトＴ細胞（以後、「Ｔ－ｉＰＳ」細胞または「Ｔｉ－ｉＰＳＣ」とも称される）から得られる。図１Ａ～Ｃは、本出願のｉＰＳＣを生成するための例示的方法の略図を示す。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子刷り込み」とは、供給源細胞またはｉＰＳＣ中の優先的治療属性に寄与し、供給源細胞由来ｉＰＳＣ中、および／またはｉＰＳＣ由来造血系列細胞中で保持可能である、遺伝子情報または遺伝子外情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、再プログラミングによってｉＰＳＣを生成するために使用することができる非多能性細胞であり、供給源細胞由来ｉＰＳＣを、任意の造血系列細胞を含む特定の細胞型にさらに分化させることができる。供給源細胞由来ｉＰＳＣ、およびそれに由来する分化した細胞は、文脈に応じて、「由来」または「誘導体」細胞と集合的に呼ばれることもある。例えば、本出願を通して使用される、誘導体エフェクター細胞または誘導体Ｔ細胞または「ｉＴ」細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの自然／天然源から得られたその一次対応物と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用される場合、優先的治療属性を付与する遺伝子刷り込みは、ドナー、疾患、もしくは処置応答特異的である選択された供給源細胞を再プログラミングすることによって、またはゲノム編集を使用して遺伝的に改変されたモダリティをｉＰＳＣに導入することによって、ｉＰＳＣ中に組み込まれる。
１つの一般的な態様では、本出願は、ｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、再構成されたγδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する。
Ｉ．ＴＣＲ発現
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原を特異的に認識するＴ細胞の表面上に見出される膜複合体である。それは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲのアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ鎖はそれぞれ、糖タンパク質であってもよい。Ｉｇ様ドメインを有する、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーとして、ＴＣＲは、例えば、体細胞Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによる個々の体細胞性Ｔ細胞中でのＤＮＡにコードされたセグメントの遺伝子組換えに主に由来する、抗体のものと類似する様式でその多様性を生成する。単一の細胞中では、Ｔ細胞受容体遺伝子座は再構成され、デルタ、ガンマ、ベータ、およびアルファの順に発現される。デルタとガンマとの両方の再構成が機能的な鎖を産生する場合、細胞はデルタおよびガンマを発現する。そうでない場合、細胞は、ベータおよびアルファ遺伝子座の再構成へ進む。しかしながら、抗体と違って、ＴＣＲ遺伝子は、体細胞超変異を受けない。ＴＣＲα遺伝子座は、可変（Ｖ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメント（ＶβおよびＪβ）を含有するが、ＴＣＲβ遺伝子座は、ＶαおよびＪαセグメントに加えて、Ｄ遺伝子セグメントを含有する。したがって、α鎖はＶＪ組換えから生成され、β鎖はＶＤＪ組換えを含めて生成される。同様に、ＴＣＲγ鎖はＶＪ組換えを含めて生成され、ＴＣＲδ鎖はＶＤＪ組換えを含めて生成される。ＴＣＲのための遺伝子セグメントは、Ｉｇ遺伝子セグメントである同じ組換えシグナル配列によって挟まれ、同じＲＡＧ－１およびＲＡＧ－２にコードされるリコンビナーゼならびにＴｄＴが、体細胞組換えにとって必要とされる。
本明細書で使用される場合、「再構成されたＴＣＲ」は、遠いサブ遺伝子が互いに融合される物理的再構成を受けた再構成されたＴＣＲ遺伝子によってコードされたＴＣＲである。ヒトゲノムは、再構成されたＴＣＲ遺伝子によって、それぞれ、ＴＣＲアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ鎖をコードする、４個の独自のＴＣＲ遺伝子クラスター；アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、およびデルタ（δ）を有する。ＴＣＲのそれぞれの鎖は、可変領域と定常領域とを有する。可変領域は、３個の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク残基を含有する。ＣＤＲ３は、主にプロセシングされた抗原を認識するのを担う。Ｔ細胞を活性化するために、ＴＣＲは、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２個のＣＤ３ε鎖を含有するＣＤ３複合体と分子複合体を形成する。
「アルファ－ベータＴ細胞受容体」または「αβＴＣＲ」は、免疫応答にとって必須の抗原特異的Ｔ細胞受容体であり、１個のα（アルファ）鎖と１個のβ（ベータ）鎖とを有する。ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）へのαβＴＣＲの結合は、ＴＣＲ－ＣＤ３細胞内活性化、いくつかのシグナル伝達分子の動員、ならびにシグナル伝達経路の分岐および統合を開始させ、遺伝子発現およびＴ細胞増殖および機能獲得にとって重要である転写因子の移動をもたらす。αβＴＣＲを有するＴ細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体によって提示されるペプチドに対する特異的反応性を有する。
「ガンマ－デルタＴ細胞受容体」または「γδＴＣＲ」は、１個のγ（ガンマ）鎖および１個のδ（デルタ）鎖を有する、γδＴ細胞の細胞表面上に存在する抗原特異的Ｔ細胞受容体である。γδＴ細胞は、抗原プロセシングおよびペプチドエピトープのＭＨＣ提示を必ずしも必要とせず、それらは、非ペプチド抗原によって活性化され得る。γδＴ細胞は、危険（感染またはがん）を感知した時にリガンドに対して応答することができる。γδＴ細胞は、先天性細胞傷害性機能と、抗原提示能力との両方を示す。γδＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢ、およびＵＬ－１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーの様々なメンバーなどの、ＮＫＧ２Ｄとしても知られる、活性化受容体キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＫＬＲＫ１）のＭＨＣ関連リガンドと共に、γδＴＣＲリガンド（例えば、ホスホ抗原）によって活性化される。
「ＨＬＡ拘束性抗原認識」または「ＨＬＡ拘束」とは、Ｔ細胞は、自己主要組織適合性複合体分子に結合した外来ペプチドを認識することができるが、それが特定のＨＬＡ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１）に結合している場合にのみ抗原に応答するという事実を指す。Ｔ細胞発生中に、Ｔ細胞は、胸腺における選択プロセスを経由して、ＴＣＲが自己抗原を提示するＨＬＡ分子を認識しないことを確実にする。選択プロセスは、ある特定のＨＬＡ分子に対してのみ応答するが、他のもの（例えば、非拘束性ＭＨＣ分子）には応答しない特異的ＴＣＲを有するＴ細胞の発生をもたらす。
本明細書で使用される場合、「パブリックＴＣＲ」または「トラステッドＴＣＲ」は、ある特定のＨＬＡ型を有する複数の個体において存在する配列を含むＴＣＲである。これらの配列は、拘束性ＨＬＡアレルを有する人々において頻繁に存在し、それらはＨＬＡ－Ｉアレルの膨大な多様性と適合することが天然で証明されている。かくして、これらのＴＣＲは、非拘束性ＨＬＡ分子を認識することができず、移植片対宿主疾患に関与する可能性が低い。パブリックＴＣＲおよびそれらを同定する方法は、Choo et al., J Virol. 2014 Sep;88(18):10613-23；Valkenburg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 19;113(16):4440-5；Sant et al., Front Immunol. 2018 Jun 27;9:1453；Chen et al., Cell Rep. 2017 Apr 18;19(3):569-583；J Biol Chem. 2016 Nov 18;291(47):24335-24351；およびSong et al., Nat Struct Mol Biol. 2017 Apr;24(4):395-406によって記載されており、その関連する開示は、本明細書に組み込まれる。
Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子座（ＴＲＧ、ＴＣＲＧ、またはＴＲＧ＠）は、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖をコードする。ヒトＴＲＧ遺伝子座は、２個の定常領域遺伝子（ＴＲＧＣ）、５個の結合セグメント（ＴＲＧＪ）および少なくとも１４個の可変γ遺伝子（ＴＲＧＶ）から構成される。ガンマ遺伝子座のいくつかのＶ遺伝子は、タンパク質をコードすることができないことが知られており、偽遺伝子であると考えられる。Ｔ細胞発生中に、Ｖ遺伝子とＪセグメントとを結合する組換え事象がＤＮＡレベルで起こり、Ｃ遺伝子は後にＲＮＡレベルでのスプライシングによって結合される。異なるＶ遺伝子セグメントと、いくつかのＪセグメントとの組換えは、ある範囲の抗原認識を提供する。抗原認識におけるさらなる多様性は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるヌクレオチドの無作為付加の結果生じる結合多様性によって獲得される。ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＧＶ２、ＴＲＧＶ３、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ５、ＴＲＧＶ８、およびＴＲＧＶ９からなる群から選択される可変遺伝子を含む。
Ｔ細胞受容体デルタ遺伝子座（ＴＲＤ、ＴＲＣＤ、ＴＣＲＤＶ１またはＴＲＤ＠）は、Ｔ細胞受容体デルタ鎖をコードする。ヒトでは、δ遺伝子座は、第１４染色体上のα遺伝子座内に埋め込まれている。ヒトＴＲＤ遺伝子座は、１個の定常領域遺伝子（ＴＲＤＣ）、４個の結合セグメント（ＴＲＤＪ）およびわずか３個の真の可変δ遺伝子（ＴＲＤＶ）から構成される。ある特定の実施形態では、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＤＶ１、ＴＲＤＶ２、およびＴＲＤＶ３からなる群から選択される可変遺伝子を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８８に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８９に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９２に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９８に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９９に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１００に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０２に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、γＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０８に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、再構成されたγＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４８に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、δＴＣＲ鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４９に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９、およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９、およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたＴＣＲは、ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、およびＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、配列番号１３３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、配列番号１３５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、配列番号１５０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１５１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、γδＴ細胞に対して内因性である。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、組換え体である。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、１つまたは複数のホスホ抗原によって活性化される。本明細書で使用される場合、「ホスホ抗原」とは、メバロン酸生合成経路の副生成物として細胞によって放出されるリン酸化された代謝物と同一のリン酸化された化合物を指す。ホスホ抗原の例としては、限定されるものではないが、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、または化学的に類似する分子が挙げられる。ホスホ抗原は、代謝プロセスの生成物として細胞中に天然に存在してもよいか、またはホスホ抗原は、ビスホスホネート化学物質による処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積させることができる。ホスホ抗原はまた、合成化合物であってもよい。「ビスホスホネート化学物質」は、２つのホスホネート基に連結された共通のジェミナル炭素原子を有する薬物である。２つのホスホネート基は、これらの化合物に、カルシウムなどの二価イオンに対する高い親和性を与える。パミドロン酸およびゾレドロン酸などのアミノ－ビスホスホネートは、ＦＰＰシンターゼ酵素の基質、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの蓄積を誘導するメバロン酸生合成経路におけるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）シンターゼ酵素を阻害する（van Beek et al., Biochem Biophys Res Commun, 1999; 255, 491-494）。ビスホスホネートに応答するγδＴ細胞の大部分は、Ｖγ９可変遺伝子［ＴＲＧＶ９］およびＶδ２可変遺伝子［ＴＲＤＶ２］の利用をもたらす遺伝子再構成を有する。得られるガンマ鎖およびデルタ鎖ＴＣＲタンパク質は、Ｖγ９／Ｖδ２ＴＣＲヘテロ二量体を形成する。ビスホスホネート応答性γδＴ細胞の全てがＶγ９／Ｖδ２ＴＣＲ対を利用するわけではない。他のＴＣＲ可変遺伝子を利用することもできるが、Ｖγ９／Ｖδ２が最も一般的であり、予測可能な生物活性と共に追跡可能な表現型を呈する。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸［ＨＭＢＰＰ］、または化学的に類似する分子から選択されるホスホ抗原によって活性化される。一部の実施形態では、ホスホ抗原は、代謝プロセスの生成物として細胞中に天然に存在してもよいか、またはホスホ抗原は、ビスホスホネート化学物質による処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積させることができる。ある特定の実施形態では、ビスホスホネート化学物質は、アミノ－ビスホスホネートであり、好ましくは、アミノ－ビスホスホネートは、ゾレドロン酸またはその塩である。
ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、またはＢＴＮ３Ａ３などのブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ファミリーのある特定のメンバーは、ホスホ抗原によってＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激するために必要とされ得る（Harly et al., Blood (2012) 120(11):2269-79；Vavassori et al., Nat. Immunol. (2013) 14(9):908-16）。ある特定の実施形態では、ホスホ抗原の活性は、γδＴＣＲとの直接的相互作用によるものであってよいか、またはホスホ抗原の活性は、ブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、またはＢＴＮ３Ａ３との相互作用によるものであってもよい。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、ホスホ抗原によって活性化されない。
ある特定の実施形態では、ＴＣＲによって認識される特異的抗原は、未知のものであるか、またはまだ同定されていない。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、細胞分裂刺激後に分化したＴ細胞の拡大を可能にする。本明細書で使用される場合、「細胞分裂刺激」または「細胞分裂活性化」とは、マイトジェンへの曝露によって細胞の増殖を刺激するプロセスを指す。γδＴ細胞を刺激するために使用することができるマイトジェンの例としては、限定されるものではないが、抗体標的化表面タンパク質（ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２７または他の共刺激分子）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、およびレクチンが挙げられる。ある特定の実施形態では、γδＴ細胞刺激剤を、一般的なＴ細胞マイトジェン、例えば、ＩＬ－２などの分裂促進性サイトカインと共に使用することができる。ある特定の実施形態では、γδＴＣＲは、ＴＣＲに依存する細胞分裂刺激後に分化したＴ細胞の拡大を可能にする。ある特定の実施形態では、γδＴＣＲは、再構成されたＴＣＲ遺伝子座を有しないＴ細胞よりも、細胞分裂刺激後に分化したＴ細胞の拡大の増加を可能にする。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、全血末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から再プログラミングされる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、アミノ－ビスホスホネートおよびインターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下でＰＢＭＣを拡大した後、末梢血細胞中に再プログラミング転写因子を組み込んでｉＰＳＣを生成することによって調製される。
ＩＩ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現
本出願の実施形態によれば、ｉＰＳＣ細胞またはその誘導体細胞は、（ｉ）組換え再構成γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；および（ｉｉ）腫瘍抗原を標的とするＣＡＲなどのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）とは、抗原または標的に特異的に結合する少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えポリペプチドを指す。標的細胞の表面上でのＣＡＲの細胞外ドメインと、標的抗原との係合は、ＣＡＲのクラスター化をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を向け直し、主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的様式で、標的抗原を発現する細胞の増殖、サイトカイン産生、食作用および／またはその細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する。
本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」とは、新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のリーダー配列を指し、新生タンパク質を小胞体に翻訳同時的または翻訳後的に指向させ、次いで、表面発現を指令する。
本明細書で使用される場合、用語「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」または「細胞外リガンド結合ドメイン」とは、細胞膜の外部に位置し、抗原、標的またはリガンドに結合することができる、ＣＡＲの一部を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」とは、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接ドメイン、すなわち、ＣＡＲタンパク質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを接続するＣＡＲの一部を指す。
本明細書で使用される場合、用語「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜にわたって伸長し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの一部分を指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」、「細胞質シグナル伝達ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、細胞膜の内部に位置し、エフェクターシグナルを伝達することができる、ＣＡＲの一部を指す。
本明細書で使用される場合、用語「刺激分子」とは、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様について、刺激様式で受容体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される分子を指す。刺激分子は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、抗原依存的一次活性化を開始させるもの（「一次シグナル伝達ドメイン」と称される）、および第２の共刺激シグナルを提供する抗原非依存的様式で動作するもの（「共刺激シグナル伝達ドメイン」と称される）を含む。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインおよび／または抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であってもよい。本出願の抗原結合断片は、限定されるものではないが、腫瘍抗原への高親和性結合などの望ましい機能特性を有する。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、広い意味で使用され、モノクローナルまたはポリクローナルである、ヒト、ヒト化、複合およびキメラ抗体ならびに抗体断片を含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体構造は、周知である。免疫グロブリンに、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。したがって、本出願の抗体は、５つの主要なクラスまたは対応するサブクラスのいずれかのものであってもよい。好ましくは、本出願の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖に、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる型、すなわち、カッパおよびラムダのうちの１つを割り当てることができる。したがって、本出願の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインを含有してもよい。特定の実施形態によれば、本出願の抗体は、ラットまたはヒト抗体に由来する重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖および軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域から構成される抗原結合領域を含有し、それらはそれぞれ、３個のドメイン（すなわち、相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的に、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的に、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。
本明細書で使用される場合、用語「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、特異的腫瘍抗原に特異的に結合する単離された抗体は、腫瘍抗原に結合しない抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。本出願のモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、または組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスまたはラットなどのトランスジェニック非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生産することができる。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合断片」とは、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化されたダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、または抗原に結合するが、完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの、抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体または親抗体断片が結合するのと同じ抗原に結合することができる。
本明細書で使用される場合、用語「単鎖抗体」とは、約１５～約２０個のアミノ酸の短いペプチド（例えば、リンカーペプチド）によって接続された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、当業界における従来の単鎖抗体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「単一ドメイン抗体」とは、重鎖可変領域と重鎖定常領域とを含むか、または重鎖可変領域のみを含む、当業界における従来の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体または当業界で公知の任意の技術を使用して作製されたヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトもしくは完全長抗体、その断片、および／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性は保持されるが、ヒト体内でのその抗原性は低減されているような、ヒト抗体のものに対する配列相同性を増大させるように改変されている非ヒト抗体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有するある種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応することが多いが、定常領域は、その種において免疫応答を惹起するのを避けるために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。
本明細書で使用される場合、用語「多重特異性抗体」とは、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指す。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複するか、または実質的に重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複しないか、または実質的に重複しない。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用される場合、用語「二重特異性抗体」とは、２つ以下のエピトープまたは２つの抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複するか、または実質的に重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する、ハーフ抗体、またはその断片および第２のエピトープに対する結合特異性を有するハーフ抗体、またはその断片を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する、ｓｃＦｖ、またはその断片、および第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはその断片を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するＶＨＨおよび第２のエピトープに対する結合特異性を有するＶＨＨを含む。
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原に特異的に結合する」抗原結合ドメインまたは抗原結合断片とは、１ｘ１０－７Ｍ以下、好ましくは、１ｘ１０－８Ｍ以下、より好ましくは、５ｘ１０－９Ｍ以下、１ｘ１０－９Ｍ以下、５ｘ１０－１０Ｍ以下、または１ｘ１０－１０Ｍ以下のＫＤで、腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を指す。用語「ＫＤ」は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮した当業界における方法を使用して決定することができる。例えば、抗原結合ドメインまたは抗原結合断片のＫＤを、バイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することなどの表面プラズモン共鳴を使用することによって、またはＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤー干渉技術を使用することによって決定することができる。
抗原結合ドメインまたは抗原結合断片のＫＤの値が小さいほど、抗原結合ドメインまたは抗原結合断片が標的抗原に結合する親和性が高い。
種々の実施形態では、本開示のＣＡＲにおける使用にとって好適な抗体または抗体断片としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、マスクド抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小型モジュール式免疫医薬品（「ＳＭＩＰ（商標）」、イントラボディ、ミニボディ、単一ドメイン抗体可変ドメイン、ナノボディ、ＶＨＨ、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗原特異的ＴＣＲに対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。抗体および／または抗体断片は、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来してもよい。
一部の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もしくはナノボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはデカボディである。一部の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ断片である。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ナノボディとしても知られる、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダにおいて見出される重鎖抗体を含む、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片；いわゆるＶＨＨ断片である（Hamers-Casterman et al., Nature, 363, 446448 (1993)；参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７５９，８０８号明細書；米国特許第５，８００，９８８号明細書；米国特許第５，８４０，５２６号明細書；および米国特許第５，８７４，５４１号明細書も参照されたい）。軟骨魚類も、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）を有し、そこから、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を取得し、これらのものを本発明において使用することができる。代替的な手法は、ヒトまたはマウスに由来する共通の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に由来する二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体における多くの研究は現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されており、これを用いることもできる。
標的生体分子の高親和性および特異的結合などの、類似する機能特性を示す免疫グロブリンドメインに対する代替的な足場を、本開示のＣＡＲにおいて使用することもできる。そのような足場は、より高い安定性または低減された免疫原性などの、改善された特性を有する分子をもたらすことが示されている。本開示のＣＡＲにおいて使用することができる代替的な足場の非限定例としては、操作された、テナシン由来、テナシンＩＩＩ型ドメイン（例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標））；操作された、ガンマ－Ｂクリスタリン由来足場または操作された、ユビキチン由来足場（例えば、アフィリン）；操作された、フィブロネクチン由来、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメイン（例えば、モノボディ、ＡｄＮｅｃｔｉｎ（商標）、またはＡｄＮｅｘｉｎ（商標））；操作された、アンキリンリピートモチーフ含有ポリペプチド（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（商標））；操作された、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ）（例えば、Ａｖｉｍｅｒ（商標））；リポカリン（例えば、アンチカリン）；操作された、プロテアーゼ阻害剤由来Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２）；操作された、プロテインＡ由来Ｚドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））；Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（例えば、Ｎａｎｏｆｆｉｔｉｎ（登録商標）またはアフィチン）；操作されたＦｙｎ由来ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標））；ＣＴＬＤ３（例えば、テトラネクチン）；チオレドキシン（例えば、ペプチドアプタマー）；ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）；β－サンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）；ミニタンパク質；Ｃ型レクチン様ドメイン足場；操作された抗体模倣体；およびその結合機能を保持する上記のものの任意の遺伝子操作された対応物（それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001)；Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002)；Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004)；Binz H et al., Nat Biolechnol 23: 1257-68 (2005)；Hey T et al., Trends Biotechnol 23:514-522 (2005)；Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005)；Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006)；Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)；Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18: 295-304；Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010)；Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)）が挙げられる。
一部の実施形態では、代替的な足場は、アフィリンまたはセンチリンである。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、細胞外タグ結合ドメインのＮ末端に位置してもよい。必要に応じて、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に、細胞外タグ結合ドメインからリーダー配列を切断してもよい。当業者には公知の任意の種々のリーダー配列を、リーダー配列として使用することができる。リーダー配列を誘導することができるペプチドの非限定例としては、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、ＦｃεＲ、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖（ＨＣ）可変領域、ＣＤ８α、またはＴ細胞によって分泌される任意の種々の他のタンパク質が挙げられる。種々の実施形態では、リーダー配列は、Ｔ細胞の分泌経路と適合する。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）に由来する。
一部の実施形態では、リーダー配列は、ＧＭＣＳＦＲに由来する。一実施形態では、ＧＭＣＳＦＲリーダー配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと、細胞質ドメインとの間でインフレームに融合された、膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、細胞外結合ドメインに寄与するタンパク質、シグナル伝達もしくは共シグナル伝達ドメインに寄与するタンパク質、または完全に異なるタンパク質に由来してもよい。一部の例では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換、欠失、または挿入によって選択または改変して、ＣＡＲ複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化することができる。一部の例では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換、欠失、または挿入によって選択または改変して、膜貫通ドメインと天然に会合したタンパク質の結合を回避することができる。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに接続されたドメイン間の可撓性および／または最適距離を可能にする追加のアミノ酸を含む。
膜貫通ドメインは、天然源または合成源に由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してもよい。本開示における特定の使用の膜貫通ドメインの非限定例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来してもよい(すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含んでもよい)。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、それはロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むであろう。例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはバリンのトリプレットを、合成膜貫通ドメインのそれぞれの末端に見出すことができる。
一部の実施形態では、得られるキメラタンパク質が、それ自身と、またはζ、ηもしくはＦｃεＲ１γ鎖の非改変バージョンもしくは関連タンパク質と、ジスルフィド結合した二量体を形成することができるような、ジスルフィド結合を可能とするシステイン残基を含有するζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の膜貫通ドメインを利用することが望ましい。一部の例では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換によって選択または改変して、そのようなドメインの、同じか、または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化する。他の場合、受容体複合体の他の膜との物理的会合を保持するために、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γおよび－β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９またはＣＤ３－γ、ζ、もしくはηの膜貫通ドメインを使用することが望ましいであろう。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または配列番号２３との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、または配列番号２４との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含み、結合ドメイン、リンカー、および膜貫通ドメインは、互いにインフレームである。
本明細書で使用される用語「スペーサー領域」は一般に、結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。スペーサー領域を使用して、結合ドメインに対するより高い可撓性および接近性を提供することができる。スペーサー領域は、最大で３００個のアミノ酸、好ましくは、１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは、２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。スペーサー領域は、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部などに由来する、天然に存在する分子の全部または一部に由来してもよい。あるいは、スペーサー領域は、天然に存在するスペーサー領域配列に対応する合成配列であってもよいか、または完全に合成のスペーサー領域配列であってもよい。本開示に従って使用することができるスペーサー領域の非限定例としては、ヒトＣＤ８α鎖の一部、ＣＤ２８の部分的細胞外ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇヒンジ、またはその機能的断片が挙げられる。一部の実施形態では、追加の連結アミノ酸をスペーサー領域に付加して、抗原結合ドメインが膜貫通ドメインから最適な距離にあることを確保する。一部の実施形態では、スペーサーがＩｇに由来する場合、スペーサーを突然変異させて、Ｆｃ受容体結合を防止することができる。
一部の実施形態では、スペーサー領域は、ヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、または免疫グロブリン（ＩｇＧ）に由来してもよい。例えば、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのキメラに由来してもよい。
ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンＩｇＧヒンジまたはその機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそのキメラに由来する。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはヒンジ領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのコアヒンジ領域を含む。用語「コアヒンジ」は、用語「ショートヒンジ」（「ＳＨ」としても知られる）と互換的に使用することができる。好適なヒンジドメインの非限定例は、コア免疫グロブリンヒンジ領域であり、ＩｇＧ１に由来するＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５７）、ＩｇＧ２に由来するＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５８）、ＩｇＧ３に由来するＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号５９）、およびＩｇＧ４に由来するＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号６０）が挙げられる（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wypych et al., JBC 2008 283(23): 16194-16205も参照されたい）。ある特定の実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンヒンジの断片である。
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、または配列番号２１との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２２との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインとヒンジドメインとは両方とも、ＣＤ８に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインとヒンジドメインとは両方とも、ＣＤ２８に由来する。
ある特定の態様では、本開示のＣＡＲの第１のポリペプチドは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞質ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインも含む。
細胞質ドメインは、ＣＡＲが入れられた宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）の少なくとも１つの正常なエフェクター機能の活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。かくして、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを変換し、特殊化された機能を実施するように細胞を指令するタンパク質の部分を指す。通常はシグナル伝達ドメイン全体が存在するが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される程度で、そのようなトランケートされた部分が、エフェクター機能シグナルを変換する限り、それをインタクトな鎖の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、かくして、エフェクター機能シグナルを変換するのに十分なシグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲにおいて使用することができるシグナル伝達ドメインの非限定例としては、例えば、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂに由来するシグナル伝達ドメインが挙げられる。
一部の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列、または配列番号６との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、細胞質ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ７９Ａ、およびＨＶＥＭに由来する。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢに由来する。一実施形態では、４１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒｂに由来する。一実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、または配列番号９との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４０に由来する。一実施形態では、ＣＤ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０に由来する。一実施形態では、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１１との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８０に由来する。一実施形態では、ＣＤ８０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、または配列番号１２との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８６に由来する。一実施形態では、ＣＤ８６共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、または配列番号１３との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７に由来する。一実施形態では、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、または配列番号１４との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳに由来する。一実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１５との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに由来する。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または配列番号１６との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、または配列番号１７との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。一実施形態では、２Ｂ４（ＣＤ２４４）共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、または配列番号１９との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、２、３、４、５、６つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序で入れてもよい。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの上流にある。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの下流にある。２つ以上の共刺激ドメインが含まれる場合、共刺激シグナル伝達ドメインの順序を切り替えてもよい。
ＣＡＲ領域および配列の非限定例は、表１に提供される。
Figure 2024519515000002
Figure 2024519515000003
Figure 2024519515000004
一部の実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗原に結合する。第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、１つより多い抗原または抗原中の１つより多いエピトープに結合することができる。例えば、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、８個以上の抗原に結合することができる。別の例として、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、同じ抗原中の２、３、４、５、６、７、８個以上のエピトープに結合することができる。
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する抗原の種類および数に依存してもよい。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態と関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲを遺伝的に改変して、抗原（例えば、腫瘍細胞上の）に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することによって目的の腫瘍抗原を標的化することができる。本開示のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのための標的として作用し得る細胞表面マーカーの非限定例としては、腫瘍細胞または自己免疫疾患と関連するものが挙げられる。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、同じ腫瘍と関連する。一部の実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、異なる腫瘍と関連する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの自己免疫抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の自己免疫抗原に結合する。一部の実施形態では、２つ以上の自己免疫抗原は、同じ自己免疫疾患と関連する。一部の実施形態では、２つ以上の自己免疫抗原は、異なる自己免疫疾患と関連する。
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、グリア芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵がん、腎細胞癌、膀胱がん、または血液悪性腫瘍と関連する。グリア芽腫と関連する腫瘍抗原の非限定例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２が挙げられる。卵巣がんと関連する腫瘍抗原の非限定例としては、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ネクチン－４、およびＢ７Ｈ４が挙げられる。子宮頸がんまたは頭頸部がんと関連する腫瘍抗原の非限定例としては、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２、およびＥＧＦＲが挙げられる。肝臓がんと関連する腫瘍抗原の非限定例としては、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰが挙げられる。血液悪性腫瘍と関連する腫瘍抗原の非限定例としては、ＣＤ２２、ＣＤ７９（ＣＤ７９ａおよび／またはＣＤ７９ｂ）、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０が挙げられる。膀胱がんと関連する腫瘍抗原の非限定例としては、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６が挙げられる。
抗原結合ドメインによって標的化することができる抗原のさらなる例としては、限定されるものではないが、アルファ－フェトタンパク質、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、カルボニックアンヒドラーゼＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ （ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン増殖因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テナシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカーまたはがん遺伝子産物が挙げられる。
一実施形態では、抗原結合ドメインによって標的化される抗原は、ＣＤ１９である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、または配列番号２との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、または配列番号４との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、または配列番号７との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、抗原は、自己免疫疾患または障害と関連する。そのような抗原は、細胞受容体および「自己」指向性抗体を産生する細胞に由来してもよい。一部の実施形態では、抗原は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、１型糖尿病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応製関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、クローン病または潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患または障害と関連する。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲによって標的化することができる自己免疫抗原としては、限定されるものではないが、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、ｓｎＲＮＰにおけるＳｍ抗原、島細胞抗原、リウマチ因子、および抗シトルリン化タンパク質、シトルリン化タンパク質およびペプチド、例えば、ＣＣＰ－１、ＣＣＰ－２（環状シトルリン化ペプチド）、フィブリノゲン、フィブリン、ビメンチン、フィラグリン、コラーゲンＩおよびＩＩペプチド、アルファ－エノラーゼ、翻訳開始因子４Ｇ１、核周囲因子、ケラチン、Ｓａ（細胞骨格タンパク質ビメンチン）、関節軟骨の成分、例えば、コラーゲンＩＩ、ＩＸおよびＸＩ、循環血清タンパク質、例えば、ＲＦ（ＩｇＧ、ＩｇＭ）、フィブリノゲン、プラスミノーゲン、フェリチン、核成分、例えば、ＲＡ３３／ｈｎＲＮＰＡ２、Ｓｍ、真核翻訳伸長因子１アルファ１、ストレスタンパク質、例えば、ＨＳＰ－６５、７０、９０、ＢｉＰ、炎症／免疫因子、例えば、Ｂ７－Ｈ１、ＩＬ－１アルファ、およびＩＬ－８、酵素、例えば、カルパスタチン、アルファ－エノラーゼ、アルドラーゼ－Ａ、ジペプチジルペプチダーゼ、オステオポンチン、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、受容体、例えば、リポコルチン１、好中球核タンパク質、例えば、ラクトフェリンおよび２５～３５ｋＤ核タンパク質、顆粒タンパク質、例えば、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、島細胞抗原、リウマチ因子、ヒストン、リボソームＰタンパク質、カルジオリピン、ビメンチン、核酸、例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、およびＲＮＡ、リボ核粒子およびタンパク質、例えば、Ｓｍ抗原（限定されるものではないが、ＳｍＤ’およびＳｍＢ’／Ｂを含む）、Ｕ１ＲＮＰ、Ａ２／Ｂ１ ｈｎＲＮＰ、Ｒｏ（ＳＳＡ）、およびＬａ（ＳＳＢ）抗原が挙げられる。
種々の実施形態では、本開示のＣＡＲにおいて使用されるｓｃＦｖ断片は、ＶＨとＶＬドメインとの間にリンカーを含んでもよい。リンカーは、ペプチドリンカーであってもよく、任意の天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。リンカーに含有させることができる例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＨｉｓおよびＴｈｅである。リンカーは、ＶＨとＶＬとが、抗原への結合などの、所望の活性を保持するように互いに対して正確なコンフォメーションを形成するように、それらを連結するのに十分な長さを有するべきである。リンカーは、約５～５０アミノ酸長であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１０～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１５～２０アミノ酸長である。使用することができる例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、ＧｌｙおよびＳｅｒを含有するリンカー、ＧｌｙおよびＡｌａを含有するリンカー、ＡｌａおよびＳｅｒを含有するリンカー、ならびに他の可撓性リンカーである。
一実施形態では、リンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーである。一実施形態では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。一実施形態では、（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
他のリンカー配列は、任意の免疫グロブリン重鎖または軽鎖アイソタイプに由来する、免疫グロブリンヒンジ領域ＣＬまたはＣＨ１の一部を含んでもよい。使用することができる例示的なリンカーとしては、表１中の配列番号２６～５６のいずれかが挙げられる。さらなるリンカーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０６０６９５号パンフレットに記載されている。
ＩＩＩ．人工細胞死ポリペプチド安全スイッチ
本出願のある特定の実施形態によれば、ｉＰＳＣ細胞またはその誘導体細胞は、人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「人工細胞死ポリペプチド」は、細胞療法の潜在的な毒性またはそうでなければ副作用を防止するために設計された操作されたタンパク質を指す。人工細胞死ポリペプチドは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写および転写後遺伝子調節および／または抗体媒介性枯渇を媒介する。一部の例では、人工細胞死ポリペプチドは、外因性分子、例えば、抗体、抗ウイルス薬、または放射性同位体コンジュゲート薬によって活性化され、活性化された場合、治療細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘発する。ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドの作用機構は、代謝性、二量体化誘導または治療的モノクローナル抗体媒介性である。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、モノクローナル抗体特異的エピトープとも本明細書で称される、抗体、特に、モノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む不活化された細胞表面受容体である。ｉＰＳＣまたはその誘導体細胞によって発現された場合、不活化された細胞表面受容体は、シグナル伝達が不活性であるか、または大きく減少しているが、依然として抗体によって特異的に認識され得る。不活化された細胞表面受容体への抗体の特異的結合は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機構によるｉＰＳＣまたはその誘導体細胞の除去、ならびに毒素または放射性核種との抗体薬物コンジュゲートを用いた直接的殺滅を可能にする。
ある特定の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、限定されるものではないが、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブを含む抗体によって特異的に認識されるエピトープから選択されるエピトープを含む。
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１およびＨＥＲ１としても知られる、上皮増殖因子受容体は、細胞外リガンドの上皮増殖因子ファミリーのメンバーのための細胞表面受容体である。本明細書で使用される場合、「トランケートされたＥＧＦＲ」、「ｔＥＧＦＲ」、「ショートＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」とは、ＥＧＦＲのＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを欠く不活性ＥＧＦＲバリアントを指す。例示的なｔＥＧＦＲバリアントは、セツキシマブ結合エピトープを含有する天然ＥＧＦＲ配列のドメイン２の残基３２２～３３３、ドメイン３および４および膜貫通ドメインの全部を含有する。細胞表面上でのｔＥＧＦＲバリアントの発現は、必要に応じて、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などのｔＥＧＦＲに特異的に結合する抗体による細胞除去を可能にする。ＥＧＦ結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインの非存在に起因して、ｔＥＧＦＲは、ｉＰＳＣまたはその誘導体細胞によって発現された場合、不活性である。
本出願の例示的な不活化された細胞表面受容体は、ｔＥＧＦＲバリアントを含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作された免疫細胞中での不活化された細胞表面受容体の発現は、細胞を抗ＥＧＦＲ抗体と接触させた場合、操作された免疫細胞の細胞自殺を誘導する。不活化された細胞表面受容体を使用する方法は、国際公開第２０１９／０７０８５６号パンフレット、同第２０１９／０２３３９６号パンフレット、同第２０１８／０５８００２号パンフレットに記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ｔＥＧＦＲバリアントを含む不活化された細胞表面受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、本開示の操作された免疫細胞を以前に受けたことがある対象に、以前に投与された操作された免疫細胞を対象において除去するのに有効な量の抗ＥＧＦＲ抗体を投与することができる。
ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブであり、好ましくは、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。
ある特定の実施形態では、ｔＥＧＦＲバリアントは、配列番号７１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号７１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、ポラツズマブベドチンによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ７９ｂの１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ７９ｂエピトープは、配列番号７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、リツキシマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ２０の１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、配列番号８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、トラスツズマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、Ｈｅｒ２受容体またはＥｒｂＢの１つまたは複数のエピトープを含む。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号８２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、サイトカインをさらに含む。
一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、ヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、または配列番号２１との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または配列番号２３との少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、その細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメイン中に、抗体によって特異的に認識される１つまたは複数のエピトープを含む。一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、エピトープと膜貫通領域との間にヒンジ領域をさらに含む。一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、抗体によって特異的に認識される１つより多いエピトープを含み、エピトープは、同じか、または異なるアミノ酸配列を有してもよく、エピトープを、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１～８の整数である）の配列（配列番号２５）を有する可撓性ペプチドリンカーなどの、ペプチドリンカーを介して互いに連結することができる。一部の実施形態では、不活化された細胞表面受容体は、サイトカインをさらに含む。ある特定の実施形態では、サイトカインは、不活化された細胞表面受容体の細胞質ドメイン中にある。好ましくは、サイトカインは、本明細書に記載されるものなどの、自己プロテアーゼペプチド配列を介して、直接的または間接的に、抗体によって特異的に認識されるエピトープに作動可能に連結される。一部の実施形態では、サイトカインは、自己プロテアーゼペプチド配列を介して膜貫通領域に接続することによってエピトープに間接的に連結される。
他の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、抗ウイルス薬によって認識されるウイルス酵素である。ある特定の実施形態では、ウイルス酵素は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）である。ある特定の実施形態では、ＨＳＶ－ｔｋは、配列番号１４３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。この酵素は、非毒性プロドラッグであるガンシクロビルをリン酸化した後、内因性キナーゼによってＧＣＶ－三リン酸にリン酸化されるようになり、ＤＮＡへの組込み時に鎖終結および一本鎖切断を引き起こし、それによって、分裂細胞を殺滅する。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作された免疫細胞中でのウイルス酵素の発現は、細胞を抗ウイルス薬と接触させた場合、操作された免疫細胞の細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、抗ウイルス薬は、ガンシクロビルである。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、低分子化合物によって標的化される抗原を含む。ある特定の実施形態では、抗原は、国際公開第２０１５１４３０２９Ａ１号パンフレットおよび第２０１８１８７７９１Ａ１号パンフレット（これらの開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる）に記載されたトランケートされた前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドは、配列番号１４４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作された免疫細胞中でのトランケートされたＰＳＭＡの発現は、細胞を、小さいペプチドを介してＰＳＭＡに結合する放射性同位体コンジュゲート薬と接触させた場合、操作された免疫細胞の細胞死を誘導する。ＰＳＭＡ標的化化合物は、国際公開第２０１０／１０８１２５号パンフレットに記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、リンカーを介して前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に融合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、配列番号１４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、自己プロテアーゼペプチド配列によって作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドである。ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、配列番号１４６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、人工ポリペプチドは、自己プロテアーゼペプチド配列によって作動可能に連結された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドおよび分化抗原群２４（ＣＤ２４）ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドである。ある特定の実施形態では、人工細胞死ポリペプチドは、配列番号１４７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。
ＩＶ．ＨＬＡ発現
一態様では、ＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩノックアウトおよび／またはノックダウンを、「同種異系」細胞療法における使用のために細胞中に組み込むことができ、その細胞は、対象から収集され、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子発現をノックアウトまたはノックダウン、例えば、破壊するように改変された後、異なる対象に戻される。本明細書に記載されるＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、（１）ＧｖＨ応答を防止する；（２）ＨｖＧ応答を防止する；ならびに／または（３）Ｔ細胞の安全性および有効性を改善する。したがって、ある特定の実施形態では、ここで開示される発明は、Ｔ細胞中のＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を独立にノックアウトおよび／またはノックダウンすることを含む。ある特定の実施形態では、ここで開示される方法は、Ｔ細胞中のＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される２つの遺伝子、特に、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡを独立にノックアウトおよび／またはノックダウンして、クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡの破壊を達成することを含む。ある特定の実施形態では、本出願のｉＰＳＣまたはその誘導体細胞を、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）などの、免疫回避と関連する１つまたは複数のタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってさらに改変することができる。特に、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、全てのＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を除去し、細胞を、「自己喪失」応答を介してＮＫ細胞による溶解に対して脆弱にする。外因性ＨＬＡ－Ｅ発現は、ＮＫ媒介性溶解に対する耐性をもたらし得る（Gornalusse et al., Nat Biotechnol. 2017; 35(8): 765-772）。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣまたはその誘導体細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）およびヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）の少なくとも一方をコードする外因性ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、配列番号６５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、配列番号６８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、リンカーを介してＨＬＡ－Ｅに融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質に作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性ポリペプチドは、配列番号６６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、リンカーを介してＨＬＡ－Ｇに融合された成熟Ｂ２Ｍタンパク質に作動可能に連結されたシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
Ｖ．他の任意選択のゲノム編集
ある特定の実施形態では、本出願の細胞は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）および／もしくはインターロイキン（ＩＬ－１５）受容体またはそのバリアントもしくはトランケーションをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書で使用される場合、「インターロイキン－１５」または「ＩＬ－１５」は、ＴおよびＮＫ細胞の活性化および増殖を調節するサイトカインを指す。ＩＬ－１５の「機能的部分」（「生物活性部分」）とは、完全長または成熟ＩＬ－１５の１つまたは複数の機能を保持するＩＬ－１５の一部を指す。そのような機能は、ＮＫ細胞生存の促進、ＮＫ細胞の調節およびＴ細胞の活性化および増殖ならびに造血幹細胞からのＮＫ細胞発生の支援を含む。当業者によって理解されるように、種々のＩＬ－１５分子の配列が当業界で公知である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、野生型ＩＬ－１５である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５である。
別の実施形態では、本出願の細胞は、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しないバリアント、例えば、ｈｎＣＤ１６をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む（例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhu et al., Blood 2017, 130:4452を参照されたい）。本明細書で使用される場合、用語「ｈｎＣＤ１６ａ」とは、ＣＤ１６の高親和性の非切断性バリアント（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する低親和性Ｆｃγ受容体）を指す。典型的には、ＣＤ１６は、プロテアーゼによってＡＤＣＣ中に切断されるが、ｈｎＣＤ１６ ＣＡＲは、この切断を受けず、かくして、ＡＤＣＣシグナルをより長く持続させる。一部の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、その内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれるBlood 2016 128:3363に開示された通りである。
別の実施形態では、本出願の細胞は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）もしくはインターロイキン２１（ＩＬ－２１）またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
別の実施形態では、本出願の細胞は、同種異系適用のために宿主対移植片免疫反応製を克服するためのＮＫ阻害モダリティとして、白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書で使用される場合、「インテグリン関連タンパク質」（ＩＡＰ）とも称されることがある、用語「ＣＤ４７」は、ヒトにおいてはＣＤ４７遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質を指す。ＣＤ４７は、膜インテグリンとのパートナーである免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、リガンドであるトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）およびシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）にも結合する。ＣＤ４７は、ＣＤ４７を発現する細胞に、マクロファージ攻撃を逃れさせるマクロファージに対するシグナルとして作用する。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deuse-T, et al., Nature Biotechnology 2019 37: 252-258を参照されたい。
別の実施形態では、本出願の細胞は、構成的に活性なＩＬ－７受容体またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生および成熟において重要な役割を有する。それは、ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞サブセットの生成を促進し、その恒常性を調節する。ＩＬ－７はｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍特異的Ｔ細胞の生存時間を延長させたことが以前に報告されている。Cancer Medicine. 2014;3(3):550-554。以前の研究では、構成的に活性化されたＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）は、リガンドの非存在下で、または共受容体のガンマ鎖（γｃ）の存在下で、ＩＬ－７シグナル伝達をもたらすことが報告された。Shum et al, Cancer Discovery. 2017;7(11):1238-1247。システインおよび／またはプロリンなどの膜貫通ドメインの挿入は、ＩＬ－７Ｒαのホモ二量体化をもたらした。ホモ二量体の形成時に、ＪＡＫ１／ＪＡＫ１の交差リン酸化は、ＳＴＡＴ５を活性化し、それによって、ＩＬ－７の下流のシグナル伝達を活性化する。そのような構成的に活性化されたＩＬ－７受容体（Ｃ７Ｒ）組成物のための構築物は、国際公開第２０１８／０３８９４５号パンフレットに開示されており、その内容は参照により本出願に組み込まれる。
別の実施形態では、本出願の細胞は、ＰＳＭＡまたはＨＳＶ－ｔｋなどの、１つまたは複数のイメージングもしくはリポータータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、細胞は、国際公開第２０１５／１４３０２９号パンフレットおよび同第２０１８／１８７７９１号パンフレットの開示（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）によるイメージングリポーターとして前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有してもよい。
上記細胞の一実施形態では、１つまたは複数の選択された部位でのゲノム編集は、他のさらなる人工細胞死ポリペプチドタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはゲノム操作されたｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己再生、持続性、および／もしくは生存を促進するタンパク質をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、もしくは他の構成的、誘導的、時間、組織、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む１つもしくは複数の外因性プロモーター；または（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲもしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択された部位に含まれる１つもしくは複数の内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、上記方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、ＥｒｂＢ２またはＣＤ７９ｂを含むタンパク質をコードする１つまたは複数の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳｌ、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、Ｈｌｌ、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。タンパク質をコードする他の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＥＴリポーター、恒常性サイトカイン、および阻害チェックポイント阻害タンパク質、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ４をコードするものならびにＣＤ４７／シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）軸を標的とするタンパク質を含んでもよい。一部の他の実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節およびモジュレーション、またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己再生、持続性、および／もしくは生存を抑制するタンパク質と関連する１つまたは複数の内因性遺伝子にインデルを含む。
さらに、改変されたγδ細胞は、標的遺伝子における機能喪失をもたらす、そのゲノム中の１つまたは複数の編集を示してもよい。標的遺伝子の機能喪失は、ゲノム改変に基づく標的遺伝子の発現の低下、例えば、コードされた遺伝子産物の不活化、または発現もしくは機能の減少をもたらす標的遺伝子中のＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ媒介性切断を特徴とする。機能喪失のために標的化することができる遺伝子の例としては、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性アルファ鎖遺伝子（例えば、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＭＡ－ＨＬＡ－ＤＱＡ２および／またはＨＬＡ－ＤＯＡ）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性ベータ鎖遺伝子（例えば、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、および／またはＨＬＡ－ＤＲＢ５）、ＣＤ３２Ｂ、ＣＴＬＡ４、ＮＫＧ２Ａ、ＢＩＭ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ９６、ＣＤＫ８、ＣＸＣＲ３、ＥＰ４（ＰＧＥ２受容体）、Ｆａｓ、ＧＩＴＲ、ＩＬ１Ｒ８、ＫＩＲＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ１－３、ＬＡＧ３、ＳＯＣＳ遺伝子、ソルチリン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＣ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２およびＮＬＲＣ５が挙げられる。
本出願の改変された細胞は、記載された編集のいずれか、ならびに記載されたそのような編集の任意の組合せを示してもよい。
ＶＩ．ｉＰＳＣにおける選択された遺伝子座での標的化ゲノム編集
本出願の実施形態によれば、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣの染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれる。
本明細書で互換的に使用される、ゲノム編集、またはゲノミック編集、または遺伝子編集は、ＤＮＡが、標的化される細胞のゲノム中で挿入、欠失、および／または置換される遺伝子操作の型である。標的化ゲノム編集（「標的化ゲノミック編集」または「標的化遺伝子編集」と互換的である）は、ゲノム中の予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換を可能にする。内因性配列が標的化編集中に挿入部位で欠失または破壊される場合、影響される配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失または破壊に起因してノックアウトまたはノックダウンされたものであってよい。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。同様に本明細書で使用されるのは、挿入部位に内因性配列の欠失を有する、または有しない、ゲノム中の予め選択された部位への１つまたは複数の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す用語「標的化組込み」である。
標的化編集を、ヌクレアーゼ非依存的手法によって、またはヌクレアーゼ依存的手法によって達成することができる。ヌクレアーゼ非依存的標的化編集手法では、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドを挟む相同配列によって相同組換えが誘導される。
あるいは、標的化編集を、特異的レアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入によってより高い頻度で達成することができる。そのようなヌクレアーゼ依存的標的化編集は、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構を利用する。外因性遺伝物質を含有するドナーベクターがなければ、ＮＨＥＪは、少数の内因性ヌクレオチドの無作為の挿入または欠失（インデル）をもたらすことが多い。比較して、一対の相同アームによって挟まれた外因性遺伝物質を含有するドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝物質を、相同組換えによる相同性修復（ＨＤＲ）の間にゲノム中に導入し、「標的化組込み」をもたらすことができる。
特異的かつ標的化されたＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復）系が挙げられる。さらに、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂｌインテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）系も、標的化組込みのための有望な手段である。
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」とは、１つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例としては、限定されるものではないが、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、およびＣ４ジンクフィンガーが挙げられる。「設計された」ジンクフィンガードメインは、設計／組成が、原則として、合理的基準、例えば、存在するＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報をプロセシングするための置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用の結果得られる、天然には存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい；また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレットおよび同第０３／０１６４９６号パンフレットを参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、産生が主に、ファージディスプレイ、相互作用捕捉またはハイブリッド選択などの経験的プロセスの結果得られる、天然には見出されないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書および米国特許第７，９７２，８５４号明細書により詳細に記載されており、これらの完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。当業界におけるＺＦＮの最も認識された例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼと、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合を担うＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染の間にキサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に進入し、そのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、その転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン特異性は、反復可変性２残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置に多型性を含む、エフェクター可変数の不完全な３４アミノ酸の反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書により詳細に記載されている。当業界におけるＴＡＬＥＮの最も認識された例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼと、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとの融合ポリペプチドである。
本出願にとって好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例としては、限定されるものではないが、個別に使用されるにしても、組み合わせて使用されるにしても、Ｓｐｏｌ１、Ｂｘｂｌ、ｐｈｉＣ３ ｌ、Ｒ４、ＰｈｉＢＴｌ、およびＷｐ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０ｌ－ｌが挙げられる。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定例としては、天然に存在するヌクレアーゼおよび組換えヌクレアーゼ；ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリーに由来するＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な成分：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。同時発現された場合、２つの成分は、複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭの近くのシード領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成させて、Ｃａｓ９を誘導して選択された配列を標的化することができる。次いで、これらの２つの成分を、トランスフェクションまたは形質導入によって哺乳動物細胞に送達することができる。別の例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、２つの主要な成分：（１）Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡを含む。同時発現された場合、２つの成分は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭの近くのシード領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡを組み合わせて、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成させて、Ｃｐｆ１を誘導して選択された配列を標的化することができる。次いで、これらの２つの成分を、トランスフェクションまたは形質導入によって哺乳動物細胞に送達することができる。
ＭＡＤ７は、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＴＮ－３’ＰＡＭ部位に対する優先性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないユーバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）細菌を起源とする操作されたＣａｓ１２ａバリアントである。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／２３６５４８号パンフレットを参照されたい。
ＤＩＣＥ媒介性挿入は、一対のリコンビナーゼ、例えば、ｐｈｉＣ３１とＢｘｂｌとを使用して、それぞれの酵素自身の小さいａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位に厳密に制限される、外因性ＤＮＡの単方向性組込みをもたらす。これらの標的ａｔｔ部位は哺乳動物ゲノム中に天然に存在しないため、それらを、所望の組込み部位で最初にゲノム中に導入しなければならない。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０１４０６６５号パンフレットを参照されたい。
本出願の一態様は、標的化ゲノム組込みのための１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組込み部位に特異的な一対のホモロジーアームをさらに含み、標的化組込みの方法は、構築物を細胞に導入して、細胞宿主の酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞中での標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、および所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮ媒介性挿入を可能にすることを含む。さらに別の実施形態では、細胞中での標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、および所望の組込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮ媒介性挿入を可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞中での標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、Ｃｐｆ１発現カセットを導入すること、および所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃｐｆ１媒介性挿入を可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞中での標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、Ｃａｓ９発現カセットを導入すること、および所望の組込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９媒介性挿入を可能にすることを含む。さらに別の実施形態では、細胞中での標的化組込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つまたは複数のａｔｔ部位を含む構築物を、細胞中の所望の組込み部位に導入すること、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入すること、およびＤＩＣＥリコンビナーゼのための発現カセットを導入して、ＤＩＣＥ媒介性標的化組込みを可能にすることを含む。
標的化組込みのための部位としては、限定されるものではないが、理論的には、宿主細胞または生物に対する有害効果なしに、新しく組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現を提供することができる、ヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域であるゲノムセーフハーバーが挙げられる。ある特定の実施形態では、標的化組込みのためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲおよびＲＵＮＸ１遺伝子からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の遺伝子座である。
他の実施形態では、標的化組込みのための部位は、挿入部位での内因性遺伝子の欠失または発現の低下のために選択される。本明細書で使用される場合、遺伝子の発現に関する用語「欠失」とは、遺伝子の発現を無効化する任意の遺伝子改変を指す。遺伝子の発現の「欠失」の例としては、例えば、遺伝子の発現を無効化する、遺伝子のＤＮＡ配列の除去または欠失、遺伝子の遺伝子座での外因性ポリヌクレオチド配列の挿入、および遺伝子内の１つまたは複数の置換が挙げられる。
標的欠失のための遺伝子としては、限定されるものではないが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の遺伝子が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質は、同種異系拒絶問題を回避するために、同種異系レシピエントにおける組織適合性について一致しなければならない。ＭＨＣクラスＩ欠損、またはＭＨＣクラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＭＨＣ欠損」とは、減少または低下したレベルが、他の細胞または合成法によって天然に検出可能なレベルより低くなるような、ＭＨＣクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現を欠く、または最早維持しない、またはそのレベルが低下している細胞を指す。ＭＨＣクラスＩ欠損を、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２ｌ）の任意の領域の機能的欠失、または限定されるものではないが、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子およびタパシン遺伝子を含む１つまたは複数のＭＨＣクラスＩ関連遺伝子の欠失またはその発現レベルの低下によって達成することができる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＭＨＣクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現にとって必須の共通サブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞は、ＭＨＣ－Ｉ欠損である。ＭＨＣクラスＩＩ欠損を、限定されるものではないが、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰを含むＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または低下によって達成することができる。ＣＩＩＴＡは、クラスＩＩタンパク質発現にとって必要とされる転写因子ＲＦＸ５の活性化によって機能する転写コアクチベーターである。ＣＩＩＴＡヌル細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ欠損である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の遺伝子座に組み込むことによって、組込みを有する遺伝子を欠失させるか、またはその発現を低下させる。
標的欠失のための他の遺伝子としては、限定されるものではないが、組換え活性化遺伝子１および２（ＲＡＧ１およびＲＡＧ２）が挙げられる。ＲＡＧ１およびＲＡＧ２は、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）とコードセグメントとの間の境界に二本鎖切断を導入することによってＶ（Ｄ）Ｊ組換えを開始させるタンパク質複合体の部分をコードする。ＲＡＧ１／ＲＡＧ２遺伝子の欠失またはその発現レベルの低下は、細胞中でのさらなるＴＣＲ再構成を防止し、かくして、自己反応性ＴＣＲの予想外の生成を防止する（Minagawa et al., Cell Stem Cell. 2018 Dec 6;23(6):850-858）。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子座のうちの少なくとも１つが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子などのＭＨＣ遺伝子のものであるという条件で、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれ、好ましくは、１つまたは複数の遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される遺伝子のものである。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ３８遺伝子座に組み込まれることによって、ＣＤ３８遺伝子の欠失または発現低下をもたらす。好ましくは、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子またはタパシン遺伝子などのＭＨＣクラスＩ関連遺伝子の遺伝子座；およびＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、またはＣＩＩＴＡ遺伝子などのＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子の遺伝子座；および必要に応じてさらに、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲおよびＲＵＮＸ１遺伝子からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。より好ましくは、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；（ｉｉ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリペプチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；ならびに（ｉｉｉ）ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリペプチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；ここで、外因性ポリヌクレオチドの組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させるか、またはその発現を低下させる。
ＶＩＩ．誘導体細胞
別の態様では、本発明は、本出願のｉＰＳＣの分化に由来する細胞、誘導体細胞に関する。上記のように、ｉＰＳＣ細胞中に導入されたゲノム編集は、誘導体細胞中で保持される。ｉＰＳＣ分化から得られる誘導体細胞のある特定の実施形態では、誘導体細胞は、Ｔ細胞である。他の実施形態では、誘導体細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。
ある特定の実施形態では、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；および（ｉｉ）再構成されたγδＴＣＲがｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、（ｉｉ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２およびＲＦＸＡＰ遺伝子の１つまたは複数の欠失またはその発現の低下、ならびに（ｉｖ）再構成されたγδＴＣＲがｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；および（ｉｉ）再構成されたγδＴＣＲがｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むＴ細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、（ｉｉ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子の１つまたは複数の欠失またはその発現の低下、（ｉｖ）ＲＡＧ１／ＲＡＧ２遺伝子の欠失またはその発現の低下、ならびに（ｖ）再構成されたγδＴＣＲがｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を提供する。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から再プログラミングされる。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）から再プログラミングされる。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血αβＴ細胞から再プログラミングされる。
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血γδＴ細胞から再プログラミングされる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、γδＴ細胞から再プログラミングされ、再構成されたγδＴＣＲは、γδＴ細胞に対して内因性である。
ある特定の実施形態では、γδＴＣＲは、組換え体である。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲは、再構成されたＴＣＲを有しないＴ細胞よりも、細胞分裂刺激後にｉＰＳＣから分化したＴ細胞の拡大の増加を可能にする。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＴＲＧＶ１～５、ＴＲＧＶ５Ｐ、ＴＲＧＶ８～１１およびＴＲＧＶＡ遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＪＰ、ＴＲＧＪＰ１およびＴＲＧＪＰ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ連結遺伝子；ならびにＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ定常遺伝子を含む。
ある特定の実施形態では、再構成されたγδＴＣＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＴＲＤＶ１～３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＤＤ１、ＴＲＤＤ２およびＴＲＤＤ３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ多様性遺伝子；ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＪ３およびＴＲＤＪ４からなる群から選択されるδＴＣＲ連結遺伝子；ならびにδＴＣＲ定常遺伝子ＴＲＤＣを含む。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、または化学的に類似する分子から選択されるホスホ抗原によって活性化され、ホスホ抗原は、通常の代謝プロセスの一部として細胞中に天然に存在するか、またはホスホ抗原は、ビスホスホネート化学物質を用いた処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積され、ここで、ホスホ抗原の活性は、γδＴＣＲとの直接相互作用によるものであるか、またはホスホ抗原の活性は、ブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、もしくはＢＴＮ３Ａ３との相互作用によるものであってもよい。
ある特定の実施形態では、組換え再構成γδＴＣＲは、ホスホ抗原によって活性化されず、ＴＣＲによって認識される特異的抗原は未知である。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座に組み込まれることによって、遺伝子の欠失または発現低下をもたらすという条件で、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される細胞の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ３８遺伝子座に組み込まれることによって、ＣＤ３８遺伝子の欠失または発現低下をもたらす。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＡＡＶＳ１遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリペプチドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；ならびにヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリペプチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれる；ここで、外因性ポリヌクレオチドの組込みは、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子を欠失させるか、またはその発現を低下させる。
また、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するアポトーシス誘導ドメインを含む人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号１３３、１３５、または１５０のアミノ酸配列を有するγＴＣＲおよび配列番号１３４、１３６、または１５１のアミノ酸配列を有するδＴＣＲを含む再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；および（ｉｖ）必要に応じて、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むＴ細胞であって、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドがＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれていることによって、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるか、またはその発現を低下させる、Ｔ細胞も提供される。
また、本出願のＴ細胞を製造する方法であって、細胞分化のための条件下で本出願のｉＰＳＣ細胞を分化させることによって、Ｔ細胞を得ることを含む方法も提供される。
本出願のｉＰＳＣを、当業界で公知の任意の方法によって分化させることができる。例示的な方法は、米国特許第８，３７２，６４２号明細書、同第８，５７４，１７９号明細書、同第１０，１００，２８２号明細書、同第１０，８６５，３８１号明細書、国際公開第２０１０／０９９５３９号パンフレット、同第２０１２／１０９２０８号パンフレット、同第２０１７／０７０３３３号パンフレット、同第２０１７／０７０３３７号パンフレット、同第２０１８／０６７８３６号パンフレット、同第２０１８／１９５１７５号パンフレット、同第２０２０／０６１２５６号パンフレット、同第２０１７／１７９７２０号パンフレット、同第２０１６／０１０１４８号パンフレット、および同第２０１８／０４８８２８号パンフレットに記載されており、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。分化プロトコールは、フィーダー細胞を使用してもよいか、またはフィーダーフリーであってもよい。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、フィーダー細胞は第２の細胞型の支援のための刺激、増殖因子および栄養素を提供するため、第２の型の細胞が増殖、拡大、または分化することができる環境を提供するために、第２の型の細胞と同時培養されるある型の細胞を記述する用語である。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特に、前駆細胞がＴ細胞運命に向かうのを駆動する重要な役割を果たしている。ヒト胸腺では、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質ＤＬＬ１、ＤＬＬ４およびＪａｇ２（胸腺中の間質細胞によって発現される）は、受容体Ｎｏｔｃｈ１（初期胸腺細胞によって発現される）を介してシグナル伝達する。ある特定の実施形態では、分化プロトコールは、組換えデルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）を含む培地中で細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、組換えＤＬＬ４は、バリアントＤＬＬ４である。ＤＬＬ４バリアントおよび配列の非限定例は、表２に提供される。ある特定の実施形態では、分化プロトコールは、組換えＪａｇｇｅｄ２（ＪＡＧ２）を含む培地中で細胞を培養することを含む。さらなる実施形態では、組換えタンパク質は、組換えタンパク質の適切な順応を容易にするためにプロテインＧコーティングの存在下または非存在下でポリドーパミンを使用して固定される。
Figure 2024519515000005
ＶＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
（１）ＣＡＲをコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、ＣＡＲのコード配列を変化させる（例えば、置き換える、欠失させる、挿入するなど）ことができることが当業者によって理解されるであろう。したがって、当業者であれば、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく本出願のＣＡＲをコードする核酸配列を変更することができることを理解するであろう。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードする。特定の実施形態では、ＣＡＲをコードする単離された核酸は、配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号６２のポリヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。プラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなどの、本開示を考慮した当業者には公知の任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含んでもよい。プロモーターは、構成的、誘導的、または抑制的プロモーターであってもよい。核酸を細胞に送達することができるいくつかの発現ベクターが当業界で公知であり、細胞中でのＣＡＲの産生のために本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なＣＡＲの標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’の順に、（ａ）プロモーター；（ｂ）本出願の実施形態によるＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列；および（ｃ）ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを有する外因性ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターを使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列を使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、外因性ポリヌクレオチドを挟む左側ホモロジーアームおよび右側ホモロジーアームをさらに含む。本明細書で使用される場合、「左側ホモロジーアーム」および「右側ホモロジーアーム」は、外因性ポリヌクレオチドを挟み、外因性ポリヌクレオチドの特殊化された染色体遺伝子座への組込みを容易にする一対の核酸配列を指す。左側および右側ホモロジーアームの配列を、目的の組込み部位に基づいて設計することができる。一部の実施形態では、左側または右側ホモロジーアームは、組込み部位の左側または右側配列と相同である。
ある特定の実施形態では、左側ホモロジーアームは、配列番号８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、右側ホモロジーアームは、配列番号８１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号８２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号８２のポリヌクレオチド配列を含む。
（２）不活化された細胞表面受容体をコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による本発明にとって有用な不活化された細胞表面受容体をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、不活化された細胞表面受容体のコード配列を変化させる（例えば、置き換える、欠失させる、挿入するなど）ことができることが当業者によって理解されるであろう。したがって、当業者であれば、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく本出願の不活化された細胞表面受容体をコードする核酸配列を変更することができることを理解するであろう。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、モノクローナル抗体特異的エピトープ、およびサイトカインを含むものなどの、本明細書に記載の任意の不活化された細胞表面受容体をコードし、ここで、モノクローナル抗体特異的エピトープとサイトカインとは、自己プロテアーゼペプチド配列によって作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、単離された核酸は、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブなどの抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む、不活化された細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、トランケートされた上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを有する不活化された細胞表面受容体をコードする。好ましくは、不活化された細胞表面受容体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブ、好ましくは、セツキシマブによって特異的に認識されるエピトープを含む。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、ポラツズマブベドチンによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ７９ｂの１つまたは複数のエピトープを有する不活化された細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、リツキシマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、ＣＤ２０の１つまたは複数のエピトープを有する不活化された細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、トラスツズマブによって特異的に認識されるエピトープなどの、Ｈｅｒ２受容体の１つまたは複数のエピトープを有する不活化された細胞表面受容体をコードする。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチド配列は、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）である。
ある特定の実施形態では、トランケートされた上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントは、配列番号７１のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、ポラツズマブベドチンによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号７４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、リツキシマブによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、トラスツズマブによって特異的に認識されるモノクローナル抗体特異的エピトープは、配列番号７６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用な不活化された細胞表面受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。プラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなどの、本開示を考慮した当業者には公知の任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含んでもよい。プロモーターは、構成的、誘導的、または抑制的プロモーターであってもよい。核酸を細胞に送達することができるいくつかの発現ベクターが当業界で公知であり、細胞中での不活化された細胞表面受容体の産生のために本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用な不活化された細胞表面受容体の標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’の順に、（ａ）プロモーター；（ｂ）トランケートされた上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントを含む不活化された細胞表面受容体などの、不活化された細胞表面受容体をコードするポリヌクレオチド配列を有する外因性ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターを使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列を使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、外因性ポリヌクレオチドを挟む左側ホモロジーアームおよび右側ホモロジーアームをさらに含む。
（３）ＨＬＡ構築物をコードする核酸
別の一般的な態様では、本発明は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、ＨＬＡ構築物のコード配列を変化させる（例えば、置き換える、欠失させる、挿入するなど）ことができることが当業者によって理解されるであろう。したがって、当業者であれば、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく本出願のＨＬＡ構築物をコードする核酸配列を変更することができることを理解するであろう。
ある特定の実施形態では、単離された核酸は、成熟Ｂ２Ｍ、および／または成熟ＨＬＡ－Ｅのコード配列などの、ＨＬＡコード配列に作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むＨＬＡ構築物をコードする。いくつかの実施形態では、ＨＬＡコード配列は、４Ｘ ＧＧＧＧＳリンカーによって作動可能に連結されているＨＬＡ－ＧおよびＢ２Ｍ、および／または３Ｘ ＧＧＧＧＳリンカーによって作動可能に連結されているＢ２ＭおよびＨＬＡ－Ｅをコードする。特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸は、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードする単離された核酸は、配列番号７０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号７０のポリヌクレオチド配列を含む。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。プラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターなどの、本開示を考慮した当業者には公知の任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含んでもよい。プロモーターは、構成的、誘導的、または抑制的プロモーターであってもよい。核酸を細胞に送達することができるいくつかの発現ベクターが当業界で公知であり、細胞中でのＨＬＡ構築物の産生のために本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術または人工遺伝子合成を使用して、本出願の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。
特定の態様では、本出願は、本出願の実施形態による本発明にとって有用なＨＬＡ構築物の標的化組込みのためのベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、５’から３’の順に、（ａ）プロモーター；（ｂ）ＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列；および（ｃ）ターミネーター／ポリアデニル化シグナルを有する外因性ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。ある特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号６３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターを使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＥＦ１ａ、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、およびヒトベータアクチンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ターミネーター／ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０シグナルである。ある特定の実施形態では、ＳＶ４０シグナルは、配列番号６４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他のターミネーター配列を使用することもでき、その例としては、限定されるものではないが、ＢＧＨ、ｈＧＨ、およびＰＧＫが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、成熟Ｂ２Ｍ、および成熟ＨＬＡ－Ｅを含み、ここで、ＨＬＡ－ＧおよびＢ２Ｍは、４Ｘ ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１）によって作動可能に連結されており、Ｂ２Ｍ導入遺伝子およびＨＬＡ－Ｅは、３Ｘ ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号２５）によって作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ＨＬＡ構築物は、配列番号６７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号６７のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ＨＬＡ構築物は、配列番号７０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号７０のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、外因性ポリヌクレオチドを挟む左側ホモロジーアームおよび右側ホモロジーアームをさらに含む。
ある特定の実施形態では、左側ホモロジーアームは、配列番号７７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、右側ホモロジーアームは、配列番号７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、配列番号７９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％などの少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号７９のポリヌクレオチド配列を含む。
（４）宿主細胞
別の一般的な態様では、本出願は、本出願のベクターおよび／または本出願の構築物をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示を考慮した当業者には公知の任意の宿主細胞を、本出願の外因性ポリヌクレオチドの組換え発現のために使用することができる。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、化学的トランスフェクション、ヒートショック、またはエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞中に形質転換され、そこで、それは組換え核酸が有効に発現されるように宿主細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる。
宿主細胞の例としては、例えば、目的のベクターもしくは構築物の産生にとって有用な本出願のベクターもしくは単離された核酸を含有する組換え細胞；または好ましくは、１つもしくは複数の染色体遺伝子座に組み込まれた、本出願の１つもしくは複数の単離された核酸を含有する操作されたｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞が挙げられる。本出願の単離された核酸の宿主細胞はまた、本出願の１つまたは複数の単離された核酸を含む、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞であってもよい。免疫エフェクター細胞を、本出願の操作されたｉＰＳＣの分化によって取得することができる。本開示を考慮して、当業界における任意の好適な方法を、分化のために使用することができる。免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞に、本出願の１つまたは複数の単離された核酸をトランスフェクトすることによって取得することもできる。
ＩＸ．組成物
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血液細胞、目的の１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、組成物は、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の宿主細胞および／またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体と共に、本出願の単離されたポリヌクレオチド、本出願の単離されたポリペプチド、本出願の宿主細胞、および／または本出願のｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞を含む生成物を意味する。本出願のポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞ならびにそれらを含む組成物はまた、本明細書に記載の治療適用のための薬剤の製造においても有用である。
本明細書で使用される場合、用語「担体」とは、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソーム封入剤、または医薬製剤における使用について当業界で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の適用のための投与経路に依存することが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、本明細書に記載の組成物の有効性または本明細書に記載の組成物の生物活性を阻害しない非毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮すると、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞における使用にとって好適な任意の薬学的に許容される担体を使用することができる。
薬学的に活性な成分と、薬学的に許容される担体との製剤は、当業界において、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例えば、第２１版（２００５）、およびその後の版）で公知である。さらなる成分の非限定例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、等張性調節剤、保存剤、安定剤、およびキレート剤が挙げられる。１つまたは複数の薬学的に許容される担体を、本出願の医薬組成物を製剤化する際に使用することができる。
Ｘ．使用方法
別の一般的な態様では、本出願は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本出願の細胞および／または本出願の組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、がんである。がんは、例えば、固形がんまたは液体がんであってもよい。がんは、例えば、肺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膵がん、子宮内膜がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経膠腫、グリア芽腫、および他の固形腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫／ホジキン病（ＨＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および他の液体腫瘍からなる群から選択することができる。好ましい実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
本出願の実施形態によれば、組成物は、治療有効量の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、宿主細胞、および／またはｉＰＳＣもしくはその誘導体細胞を含む。本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、対象において所望の生物学的応答または薬学的応答を惹起する活性成分または成分の量を指す。治療有効量を、記述される目的に関して、経験的に、および日常的な様式で決定することができる。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物を参照して本明細書で使用される場合、治療有効量とは、それを必要とする対象における免疫応答をモジュレートする細胞および／または医薬組成物の量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療有効量とは、以下の効果：（ｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態の重症度またはそれと関連する症状を低減させる、もしくは改善する；（ｉｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状の持続期間を低減させる；（ｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状の進行を防止する；（ｉｖ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状の退縮を引き起こす；（ｖ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状の発達もしくは開始を防止する；（ｖｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状の再発を防止する；（ｖｉｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状を有する対象の入院を減らす；（ｖｉｉｉ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状を有する対象の入院の長さを減らす；（ｉｘ）処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状を有する対象の生存を増加させる；（ｘｉ）対象における処置しようとする疾患、障害もしくは状態、またはそれと関連する症状を阻害する、もしくは低減させる；および／または（ｘｉｉ）別の療法の予防もしくは治療効果を増強する、もしくは改善する、のうちの１、２、３、４つ、またはそれ以上を達成するのに十分な療法の量を指す。
特定の実施形態では、本発明の細胞は、処置される患者にとって同種異系である。
治療有効量または投与量は、処置しようとする疾患、障害または状態、投与の手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬剤、および処置が予防的または治療的であるかどうかなどの、種々の因子に応じて変化してもよい。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために最適に滴定される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載の組成物は、対象への意図される投与経路にとって好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物を、静脈内、皮下、または筋肉内投与にとって好適であるように製剤化することができる。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物を、当業者には公知の任意の都合のよい様式で投与することができる。例えば、本出願の細胞を、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋込み、および／または移植によって対象に投与することができる。本出願の細胞を含む組成物を、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、胸膜内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内的に投与することができる。ある特定の実施形態では、本出願の細胞を、対象のリンパ球枯渇なしで、またはありで投与することができる。
本出願の細胞を含む医薬組成物を、滅菌液体調製物、典型的には、細胞懸濁液との等張性水性溶液中で、または必要に応じて、典型的には、選択されたｐＨに緩衝化される、エマルジョン、分散体として提供することができる。組成物は、担体、例えば、細胞の完全性および生存性にとって、ならびに細胞組成物の投与にとって好適な、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水などを含んでもよい。
本出願の細胞を、必要に応じて、様々な他の成分と共に好適な量の適切な溶媒中に組み入れることによって、滅菌注射溶液を調製することができる。そのような組成物は、細胞組成物と一緒の使用にとって、およびヒトなどの対象への投与にとって好適である、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含んでもよい。細胞組成物を提供するための好適な緩衝剤は、当業界で周知である。使用されるビヒクル、希釈剤、または添加剤はいずれも、本出願の細胞の完全性および生存性の保存と適合する。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物を、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で投与することができる。本出願の細胞を含む細胞集団は、精製された細胞集団を含んでもよい。当業者であれば、様々な周知の方法を使用して細胞集団中の細胞を容易に決定することができる。本出願の遺伝的に改変された細胞を含む細胞集団中の純度の範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約１００％であってもよい。当業者であれば、投与量を容易に調整することができ、例えば、純度の低下は、投与量の増加を必要とし得る。
本出願の細胞は一般に、細胞および／または細胞を含む医薬組成物が投与される対象の体重１キログラムあたりの細胞数（細胞／ｋｇ）に基づく用量として投与される。一般に、細胞用量は、投与の様式および位置に応じて、約１０４～約１０１０、例えば、約１０５～約１０９、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、または約１０５～約１０６細胞／ｋｇ体重の範囲である。一般に、全身投与の場合、本出願の免疫細胞が、腫瘍および／またはがんの領域において投与される領域投与よりも高い用量が使用される。例示的な用量範囲としては、限定されるものではないが、１ｘ１０４～１ｘ１０８、２～１０４～１ｘ１０８、３ｘ１０４～１ｘ１０８、４ｘ１０４～１ｘ１０８、５ｘ１０４～６ｘ１０８、７ｘ１０４～１ｘ１０８、８ｘ１０４～１ｘ１０８、９ｘ１０４～１ｘ１０８、１ｘ１０５～１ｘ１０８、１ｘ１０５～９ｘ１０７、１ｘ１０５～８ｘ１０７、１ｘ１０５～７ｘ１０７、１ｘ１０５～６ｘ１０７、１ｘ１０５～５ｘ１０７、１ｘ１０５～４ｘ１０７、１ｘ１０５～４ｘ１０７、１ｘ１０５～３ｘ１０７、１ｘ１０５～２ｘ１０７、１ｘ１０５～１ｘ１０７、１ｘ１０５～９ｘ１０６、１ｘ１０５～８ｘ１０６、１ｘ１０５～７ｘ１０６、１ｘ１０５～６ｘ１０６、１ｘ１０５～５ｘ１０６、１ｘ１０５～４ｘ１０６、１ｘ１０５～４ｘ１０６、１ｘ１０５～３ｘ１０６、１ｘ１０５～２ｘ１０６、１ｘ１０５～１ｘ１０６、２ｘ１０５～９ｘ１０７、２ｘ１０５～８ｘ１０７、２ｘ１０５～７ｘ１０７、２ｘ１０５～６ｘ１０７、２ｘ１０５～５ｘ１０７、２ｘ１０５～４ｘ１０７、２ｘ１０５～４ｘ１０７、２ｘ１０５～３ｘ１０７、２ｘ１０５～２ｘ１０７、２ｘ１０５～１ｘ１０７、２ｘ１０５～９ｘ１０６、２ｘ１０５～８ｘ１０６、２ｘ１０５～７ｘ１０６、２ｘ１０５～６ｘ１０６、２ｘ１０５～５ｘ１０６、２ｘ１０５～４ｘ１０６、２ｘ１０５～４ｘ１０６、２ｘ１０５～３ｘ１０６、２ｘ１０５～２ｘ１０６、２ｘ１０５～１ｘ１０６、３ｘ１０５～３ｘ１０６細胞／ｋｇなどが挙げられる。さらに、単回用量が投与されるかどうか、または複数用量が投与されるかどうかを説明するために、用量を調整することができる。どの有効用量が考慮されるかの正確な決定は、各対象にとって個別の因子に基づくものであってよい。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は全て、対象において必ず識別できるわけではないが、対象において識別可能であってもよい、がんと関連する少なくとも１つの測定可能な身体パラメータの改善または好転を指すことが意図される。用語「処置する」、「処置すること」および「処置」はまた、疾患、障害、または状態の退縮を引き起こすこと、その進行を防止すること、またはその進行を少なくとも減速させることを指してもよい。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、腫瘍またはより好ましくは、がんなどの疾患、障害、または状態と関連する１つまたは複数の症状の軽減、その発達もしくは開始の防止、またはその持続期間の低減を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、疾患、障害、または状態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、疾患、障害、または状態を有する対象の生存の増加を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、対象における疾患、障害、または状態の除去を指す。
本出願の細胞および／または本出願の医薬組成物を、１つまたは複数の追加の治療剤と共に投与することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血液細胞、目的の１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される。本発明の細胞と共に使用することができる有用な第２の治療剤または補助治療剤としては、限定されるものではないが、化学療法剤、例えば、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclophaophamide）など、アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、コルボクオン；エチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）、例えば、アルトレタミン（altreamine）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール；カンプトテシン、イリノテカン、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭＩを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；窒素マスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）など；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンガンマＩＩおよびカリケアミシンオメガＩＩ（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照されたい）；ジネミシン、例えば、ジネミシンＡなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン剤、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎抗体、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル（mopidanmol）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（leucovovin）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；シクロスポリン、シロリムス、ラパマイシン、ラパログ、イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の省略形であるＣＨＯＰ、および５－ＦＵ、ロイコボリンと併せてオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いる処置レジメンの省略形であるＦＯＬＦＯＸ；抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹＩ１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））など；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体ダウンレギュレータ（ＥＲＤ）；エストロゲン受容体アンタゴニスト、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））など；卵巣を抑制するか、または閉鎖するように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリンなど；他の抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなど；ならびに副腎におけるエストロゲン産生を調節するアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタン（formestanie）、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））など；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））など；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３４４，３２１号明細書に記載されたアプタマー；抗ＨＧＦモノクローナル抗体（例えば、ＡｖｅｏからのＡＶ２９９、ＡｍｇｅｎからのＡＭＧ１０２）；トランケートされたｍＴＯＲバリアント（例えば、ＣｏｍｐｕｇｅｎからのＣＧＥＮ２４１）；ｍＴＯＲ誘導経路を遮断するタンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、ＡｒｑｕｌｅからのＡＲＱ１９７、ＥｘｅｌｅｘｉｓからのＸＬ８８０、ＳＧＸ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＳＧＸ５２３、ＳｕｐｅｒｇｅｎからのＭＰ４７０、ＰｆｉｚｅｒからのＰＦ２３４１０６６）；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても知られる、ＥｒｂＢ－２およびＥＧＦＲのデュアルチロシンキナーゼ低分子阻害剤）；ＣＯＸ－２阻害剤、例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４－（５－（４－メチルフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ベンゼンスルホンアミド；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
[実施例１]
ｉＰＳＣ由来γδＴ細胞（γδｉＴ細胞）の生成
γδＣＡＲ－ｉＴ細胞を作製するために使用されるｉＰＳＣを作出するために、３つの方法を使用することができる。１つの方法は、ドナーの血液から収集されるγδＴ細胞を使用する。これらのＴ細胞は、再構成されたγおよびδ遺伝子クラスターを有し、したがって、それらがｉＰＳＣになるように再プログラミングされた場合、得られるＴｉＰＳＣ（Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ）は、同じ遺伝子再構成を有する（図１Ａ）。別の方法は、ドナーに由来する非Ｔ細胞から始まる。細胞型は、任意の体細胞であってよく、好ましくは、このプロセスのために使用される細胞は、表面タンパク質ＣＤ３４の発現によって定義される末梢血造血幹細胞（ＨＳＣ）である。これらのＰｉＰＳＣ（末梢血ＣＤ３４ ＨＳＣ由来ｉＰＳＣ）を、再構成されたγδＴＣＲ導入遺伝子のセットをノックインする遺伝子操作によってＴ－ＰｉＰＳＣ（ＴＣＲを発現するＰｉＰＳＣ）に変換することができる（図１Ｂ）。第３の方法は、ドナーの血液から収集されるαβＴ細胞を使用する。αβＴ細胞を、再構成されたγδＴＣＲ導入遺伝子のセットをノックインする遺伝子操作によってＴ－ｉＰＳＣ（ＴＣＲを発現するｉＰＳＣ）に変換することができる（図１Ｃ）。γおよびδ鎖に関する再構成されたＴＣＲ導入遺伝子は、単一の多シストロン性構築物として、または２つの別々の構築物：１つのガンマおよび１つのデルタとして送達される。
Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）の生成
最初に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから収集した。これらのＰＢＭＣから、γδＴ細胞を、選別によって富化したところ、従来の実験室細胞選別により、生細胞の８６．２％がＣＤ３＋Ｔ細胞であり、生きたＣＤ３＋Ｔ細胞の６２．３％がＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞であった（図２Ａ）。富化されたγδＴ細胞を、インターロイキン－２（ＩＬ－２）およびゾレドロネートを含む培地中で、最大２週間にわたって培養し、ロバストなＴ細胞増殖を得た。培養の終わりに細胞の大部分はＶγ９／Ｖδ２型γδＴ細胞であった。１４日後、総細胞数は、約６３００万個の細胞に増加したが、これは、ビスホスホネート化学物質であるゾレドロネートおよびＩＬ－２に応答したロバストな増殖を示している（図２Ｂ）。
増殖しているγδＴ細胞を、ｉＰＳＣ再プログラミングにかけたところ、いくつかのＴｉＰＳＣ系が上手く誘導された。ｉＰＳＣを、当業界で公知の方法を使用して再プログラミングした。ｉＰＳＣ再プログラミングの例示的な方法は、米国特許第８，１８３，０３８号明細書；同第８，２６８，６２０号明細書；同第８，４４０，４６１号明細書；同第９，４９９，７８６号明細書；同第１０，８６５，３８１号明細書；同第８，９５２，８０１号明細書；同第８，５４６，１４０号明細書；同第９，６４４，１８４号明細書；同第９，３２８，３３２号明細書；および同第８，７６５，４７０号明細書に記載されており、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる。４つのＴｉＰＳＣ系を、再構成されたＶγ９、Ｖδ２、またはＶδ１ＴＣＲ遺伝子の存在を検出するＰＣＲ法を使用して分析した。２つの得られたＴｉＰＳＣ系は、Ｖγ９／Ｖδ２であり、一方の系はＶγ９／Ｖδ１であり、一方の系は試験したＴＣＲ遺伝子のいずれも使用しなかった（図２Ｃ）。図２Ｄに示される結果は、大部分の細胞が、２つのＶγ９／Ｖδ２クローン系において１４日目にＣＤ３／ＴＣＲ陽性であったことを示す。
ＴｉＰＳＣの分化
ＴｉＰＳＣからの造血前駆細胞（ＨＰＣ）の生成のために、Ｂ－２７補給物質、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ（１Ｘ）、非必須アミノ酸（１Ｘ）、Ｌ－アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩ｎ－水和物（２５０μＭ）、モノチオグリセロール（１００μＭ）、およびヘパリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した、５０％Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地および５０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物から構成されるＨＤＭ基本培地中でＴｉＰＳＣを培養した。０日目に、ＨＤＭ基本培地に、Ｈ１１５２（１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１日目に、８０％の培地を除去し、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換した。２、３および４日目に、８０％の培地を除去し、ＢＭＰ４（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換した。５、６、７、８日目に、８０％の培地を除去し、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ－３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換した。ＨＰＣを、７～９日目の間に収集した。
ＨＰＣに由来するガンマデルタｉＰＳＣ由来Ｔ（γδｉＴ）細胞の生成のために、ＣＤ３４を発現する細胞に関して陽性選択することによって、ＨＰＣを精製することができる。次いで、精製された、および／または精製されていないＨＰＣを、組換えデルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４；０．４２μｇ／ｃｍ２）およびレトロネクチン（０．４２μｇ／ｃｍ２）の存在下で１４日間培養した。細胞に、２４～７２時間毎にＴＣＤＭを供給した。ＨＰＣをｉＴ細胞に分化させるために使用したＴＣＤＭ基本培地は、ＣＴＳ免疫細胞血清代替物（１０％）、グルタマックス補給物質（１Ｘ）、Ｌ－アスコルビン酸リン鎖マグネシウム塩ｎ－水和物（２５０μＭ）、およびニコチンアミド（２ｍＭ）を添加したＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地から構成されていた。ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＣＤＭ基本培地を使用して、培地を交換する。次いで、ｉＴ細胞を、ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）を含む細胞分裂刺激の存在下でさらに拡大させた。
ｉＴ細胞分化条件にかけた場合、ＴｉＰＳＣは、γδＴＣＲおよびＴ細胞系列マーカーＣＤ３を発現するｉＴ細胞をもたらした（図２Ｄ）。ビスホスホネート応答性γδＴ細胞について富化する、またはそれを拡大する試みなく、健康なドナーのＴ細胞から再プログラミングされたγδＴｉＰＳＣ系と共に、ＴｉＰＳＣ手法をも使用した。
得られた細胞は、均一にＣＤ３陽性であり、γδＴＣＲ陽性／αβＴＣＲ陰性であった（図３Ａ～Ｂ）。また、ｉＴ細胞中でＣＤ１９ ＣＡＲ発現をもたらす外因性構成的プロモーター下でＣＤ１９ ＣＡＲを発現するようにＴｉＰＳＣ系を操作した（図３Ｃ）。ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、１：１０のエフェクター：標的比（１０個のＲｅｈＢ細胞白血病細胞あたり１個のｉＴ細胞）でＩｎｃｕＣｙｔｅに基づく殺滅アッセイにおいて使用した場合、ｉＴ細胞はＣＤ１９＋Ｒｅｈ細胞を強力に殺滅したが、ＣＤ１９が遺伝子編集によって欠失されたＲｅｈ細胞を殺滅しなかった（図３Ｄ）。
[実施例２]
機能的γδＴＣＲ対の同定
ＴＣＲ導入遺伝子をＰｉＰＳＣに送達するためには、機能的なＴＣＲ対を選択することが重要である。γおよびδ鎖は、発現される必要があるだけでなく、機能的ヘテロ二量体として一緒にアセンブリすることができなければならない。胸腺選択は機能に関してＴＣＲ対を試すため（機能的ＴＣＲヘテロ二量体を欠く発生中のＴ細胞は胸腺中で除去される）、成熟末梢血Ｔ細胞は、一般に、機能的ＴＣＲヘテロ二量体を有する。トラステッドＴＣＲを同定するために、単一のＴ細胞を選別し、ＲＮＡ配列決定を使用して、機能的なγδＴＣＲヘテロ二量体として一緒に動作する特異的な再構成されたポリヌクレオチド配列を同定した。ビスホスホネートを使用して拡大されたＶγ９／Ｖδ２ γδＴ細胞を精製した（図２Ａ）。次いで、これらの細胞を、単一の細胞として選別し、それぞれの再構成されたＴＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を配列決定によって決定した。表３は、同定された１３個のＴＣＲ対の一覧である。表３のために使用したＴ細胞はビスホスホネート（ゾレドロネート）を使用して拡大されたため、列挙されたＴＣＲはビスホスホネート応答性であると推定される。これらのＣＤＲ３領域、帰属したＶ遺伝子生殖系列配列、ならびに生殖系列γおよびδ定常領域（ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、またはＴＲＤＣ）を使用して、元のＴＣＲ対を要約する合成ＴＣＲ構築物をアセンブリさせる。
Figure 2024519515000006
［実施例３］
組換えＴＣＲを用いたｉＰＳＣ由来γδＴ細胞（γδｉＴ細胞）の生成
末梢血ＣＤ３４ ＨＳＣ由来ｉＰＳＣ（ＰｉＰＳＣ）の生成
最初に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから収集する。次いで、表面タンパク質ＣＤ３４の発現によって定義される造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離する。
増殖中のＨＳＣを、ｉＰＳＣ再プログラミングにかける。ｉＰＳＣ再プログラミングの方法は、当業界で周知であり、そのいずれかを本開示を考慮して記載された方法において使用することができる。ｉＰＳＣ再プログラミングの例示的な方法は、米国特許第８，１８３，０３８号明細書；同第８，２６８，６２０号明細書；同第８，４４０，４６１号明細書；同第９，４９９，７８６号明細書；同第１０，８６５，３８１号明細書；同第８，９５２，８０１号明細書；同第８，５４６，１４０号明細書；同第９，６４４，１８４号明細書；同第９，３２８，３３２号明細書；および同第８，７６５，４７０号明細書に記載されており、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる。ＣＤ３４＋ＨＳＣ由来ｉＰＳＣ（ＰｉＰＳＣ）は、組換え再構成γδＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。γおよびδ鎖に関する再構成されたＴＣＲ導入遺伝子は、単一の多シストロン性構築物として、または２つの別々の構築物：１つのガンマおよび１つのデルタとして送達される。再構成されたγδＴＣＲは、表３に列挙されたもののいずれか１つであってもよい。再構成されたγδＴＣＲ鎖は、配列番号１３３、１３５、または１５０のアミノ酸配列を有するγＴＣＲおよび配列番号１３４、１３６、または１５１のアミノ酸配列を有するδＴＣＲ鎖を含んでもよい。組換え再構成γδＴＣＲは、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２の群から選択される細胞の染色体上の遺伝子座に組み込まれる。限定されるものではないが、遺伝子ノックインおよび遺伝子ノックアウトを含む、追加の遺伝子編集を、ＰｉＰＳＣ段階で行ってもよい。
ＰｉＰＳＣの分化
ＰｉＰＳＣからのＨＰＣの生成のために、Ｂ－２７補給物質、ＸｅｎｏＦｒｅｅ、マイナスビタミンＡ（１Ｘ）、非必須アミノ酸（１Ｘ）、Ｌ－アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩ｎ－水和物（２５０μＭ）、モノチオグリセロール（１００μＭ）、およびヘパリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した、５０％Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地および５０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２栄養混合物から構成されるＨＤＭ基本培地中でＰｉＰＳＣを培養する。０日目に、ＨＤＭ基本培地に、Ｈ１１５２（１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。１日目に、８０％の培地を除去し、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換する。２、３および４日目に、８０％の培地を除去し、ＢＭＰ４（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換する。５、６、７、８日目に、８０％の培地を除去し、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ－３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＤＭ基本培地と交換する。ＨＰＣを、ｉＰＳＣを誘導するのに使用した元の細胞型に応じて、７～９日目の間に収集する。ＨＰＣは、細胞表面上のＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋、＋／－ＣＤ４５と定義される。
ＨＰＣに由来するγδｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の生成のために、ＣＤ３４を発現する細胞に関して陽性選択することによって、ＨＰＣを精製することができる。次いで、精製された、および／または精製されていないＨＰＣを、組換えデルタ様タンパク質４（配列番号１３９～１４１）（ＤＬＬ４；０．４２μｇ／ｃｍ２）およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（０．４２μｇ／ｃｍ２）の存在下で最大３５日間培養する。一部の実施形態では、ＤＬＬ４のバリアント（配列番号１４２～１４４）ならびにＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎと組み合わせて、またはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの代わりに、他のフィブロネクチンタンパク質を含有させる。ある特定の実施形態では、組換えＪａｇｇｅｄ２（ＪＡＧ２）を使用する。さらなる実施形態では、組換えタンパク質は、組換えタンパク質の適切な順応を容易にするためにプロテインＧコーティングの存在下または非存在下でポリドーパミンを使用して固定してもよい。細胞は、２４～７２時間毎にＴＣＤＭを供給され、典型的には、７日毎に、上記タンパク質の組合せの存在下で継代のために収集される。ＨＰＣをｉＴ細胞に分化させるために使用されるＴＣＤＭ基本培地は、ＣＴＳ免疫細胞血清代替物（１０％）、グルタマックス補給物質（１Ｘ）、Ｌ－アスコルビン酸リン鎖マグネシウム塩ｎ－水和物（２５０μＭ）、およびニコチンアミド（２ｍＭ）を添加したＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地から構成される。ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＣＤＭ基本培地を使用して、培地を交換する。培地は、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）および／またはＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）をさらに含んでもよい。γδｉＴ細胞は、ＣＤ３＋、γδＴＣＲ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋／－、ＣＤ７＋、ＣＤ５＋／－、ＣＤ５６＋／－、ＣＤ８ａ＋／－と定義される。ｉＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、またはＣＣＲ７のマーカーのうちの少なくとも１つについて陽性である。
[実施例４]
ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－γδＴ細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を実行する
２つの腫瘍細胞系を、ＡＤＣＣアッセイのために調製した。ＡＤＣＣアッセイのために、両方の細胞型を等しい比で混合した後、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－γδＴ細胞（ｉＴ細胞）がエフェクターであるＩｎｃｕｃｙｔｅ細胞殺滅アッセイにおいてインキュベートした。これらのＣＡＲ－γδｉＴ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＦＭＣ６３抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現し、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を除去すると予想された。γδＴ細胞はＦｃ－ガンマ受容体ＣＤ１６を発現することもあることが知られているため、本発明者らは、ＣＡＲ－γδｉＴ細胞がＡＤＣＣによって標的を殺滅する能力を評価した。ＣＡＲ－γδＴ細胞は、通常はＢ細胞抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０を発現し、赤色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を用いて操作されたＲａｊｉリンパ芽球Ｂ細胞系のＡＤＣＣを実行した（図１１Ａ）。２つの異なる抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブおよびオビヌツズマブ）を、その関連するアイソタイプ対照と比較して試験した。赤色の腫瘍細胞（ＣＤ１９＋）を、全ての条件においてＣＡＲ－γδｉＴ細胞によって除去した。ＣＤ１９をコードする遺伝子をノックアウト（ＫＯ）するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用して改変された後、緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を用いて操作されたＲａｊｉ細胞のＡＤＣＣを実行するＣＡＲ－γδＴ細胞（図１１Ｂ）。２つの異なる抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブおよびオビヌツズマブ）を、その関連するアイソタイプ対照と比較して試験した。緑色のＣＤ１９ＫＯ腫瘍細胞は、アイソタイプ対照抗体の存在下で殺滅から免れた。リツキシマブおよびオビヌツズマブの存在は、ＣＡＲ－γδｉＴ細胞に、ＡＤＣＣによってＣＤ１９ＫＯ細胞を殺滅させた。
当業者であれば、広い発明の概念から逸脱することなく、上記の実施形態に対して変更を加えることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されないが、本明細書によって定義される本発明の精神および範囲内の改変を包含することが意図されることが理解される。

Claims (69)

  1. 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、
    （ｉ）組換え再構成γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；および
    （ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド
    を含み、
    前記組換え再構成γδＴＣＲが、ＣＡＲの結合標的に特異的ではなく、前記ｉＰＳＣのＴ細胞への分化を支援する、
    前記人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
  2. 前記組換え再構成γδＴＣＲが、細胞分裂刺激後に前記ｉＰＳＣから分化したＴ細胞の拡大を可能にする、請求項１に記載のｉＰＳＣ。
  3. 前記組換え再構成γδＴＣＲをコードする前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、ＴＲＧＶ２～５、ＴＲＧＶ８およびＴＲＧＶ９遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＪＰ、ＴＲＧＪＰ１およびＴＲＧＪＰ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ連結遺伝子；ならびにＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣ２遺伝子からなる群から選択されるγＴＣＲ定常遺伝子を含む、請求項１に記載のｉＰＳＣ。
  4. 前記組換え再構成γδＴＣＲをコードする前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、ＴＲＤＶ１～３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ可変遺伝子；ＴＲＤＤ１、ＴＲＤＤ２およびＴＲＤＤ３遺伝子からなる群から選択されるδＴＣＲ多様性遺伝子；ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＪ３およびＴＲＤＪ４からなる群から選択されるδＴＣＲ連結遺伝子；ならびにδＴＣＲ定常遺伝子ＴＲＤＣを含む、請求項１に記載のｉＰＳＣ。
  5. 前記組換え再構成γδＴＣＲをコードする前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、γＴＣＲ可変遺伝子ＴＲＧＶ９およびδＴＣＲ改変遺伝子ＴＲＤＶ２を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  6. 前記組換え再構成γδＴＣＲが、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、および（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）から選択される１つもしくは複数のホスホ抗原、または化学的に類似する分子によって活性化され、前記ホスホ抗原が、代謝プロセスの生成物として細胞中に天然に存在するか、または前記ホスホ抗原が、ビスホスホネート化学物質を用いた処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積され、ここで、前記ホスホ抗原の活性が、γδＴＣＲとの直接相互作用によるものであるか、または前記ホスホ抗原の活性が、ブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、もしくはＢＴＮ３Ａ３との相互作用によるものである、請求項１から５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  7. 前記組換え再構成γδＴＣＲが、ホスホ抗原によって活性化されない、請求項１から５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  8. 前記ｉＰＳＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好ましくは、ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）、αβＴ細胞またはγδＴ細胞から再プログラミングされている、請求項１から７のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
  9. 前記ｉＰＳＣが、アミノ－ビスホスホネートおよびインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下で前記ＰＢＭＣを拡大した後、前記ＰＢＭＣ中に再プログラミング転写因子を組み込んで前記ｉＰＳＣを生成することによって調製されている、請求項８に記載のｉＰＳＣ。
  10. 前記アミノ－ビスホスホネートが、ゾレドロン酸またはその塩である、請求項９に記載のｉＰＳＣ。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣに由来するＴ細胞。
  12. 再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；ならびに以下のさらなる特徴：
    ａ．人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｂ．Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうちの１つもしくは複数の欠失もしくは発現低下；
    ｃ．ＲＡＧ１およびＲＡＧ２遺伝子の欠失もしくは発現低下；
    ｄ．ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しないバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｅ．インターロイキン１５（ＩＬ－１５）および／もしくはＩＬ－１５受容体またはそのバリアントもしくはトランケーションをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｆ．構成的に活性なインターロイキン７（ＩＬ－７）受容体もしくはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｇ．インターロイキン１２（ＩＬ－１２）もしくはインターロイキン２１（ＩＬ－２１）またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｈ．ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／もしくはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；
    ｉ．白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）および／もしくはＣＤ２４をコードする外因性ポリヌクレオチド；または
    ｊ．ＰＳＭＡもしくはＨＳＶ－ｔｋなどの、１つもしくは複数のイメージングもしくはリポータータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはそれに由来するＴ細胞。
  13. 前記再構成されたγδＴＣＲが、前記再構成されたＴＣＲを有しないＴ細胞よりも、細胞分裂刺激後にＴ細胞の拡大の増加を可能にする、請求項１２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  14. 前記ｉＰＳＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好ましくは、ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）、αβＴ細胞またはγδＴ細胞から再プログラミングされている、請求項１３に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  15. 前記再構成されたγδＴＣＲが、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、および（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）から選択される１つもしくは複数のホスホ抗原、または化学的に類似する分子によって活性化され、前記ホスホ抗原が、通常の代謝プロセスの一部として細胞中に天然に存在するか、または前記ホスホ抗原が、ビスホスホネート化学物質を用いた処理に起因してより高レベルで細胞中に蓄積され、ここで、前記ホスホ抗原の活性が、γδＴＣＲとの直接相互作用によるものであるか、または前記ホスホ抗原の活性が、ブチロフィリン（ＢＴＮ）タンパク質ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、もしくはＢＴＮ３Ａ３との相互作用によるものである、請求項１２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  16. 前記再構成されたγδＴＣＲが、ホスホ抗原によって活性化されない、請求項１２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  17. ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  18. 少なくとも１つの前記外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座に組み込まれていることによって、遺伝子の欠失または発現低下をもたらすという条件で、１つまたは複数の前記外因性ポリヌクレオチドが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈｌｌ、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴ遺伝子からなる群から選択される細胞の染色体上の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれている、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  19. １つまたは複数の前記外因性ポリヌクレオチドが、ＣＩＩＴＡ、ＡＡＶＳ１およびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれている、請求項１８に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  20. Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つまたは複数の欠失または発現低下を有する、請求項１９に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  21. １つまたは複数の前記外因性ポリヌクレオチドが、ＣＤ３８遺伝子座に組み込まれていることによって、前記ＣＤ３８遺伝子の欠失または発現低下をもたらす、請求項１２から２０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  22. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）シグナルペプチドを含むシグナルペプチド；
    （ｉｉ）標的細胞上の抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）ヒンジ領域；
    （ｉｖ）膜貫通ドメイン；
    （ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）共刺激ドメイン
    を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  23. 前記シグナルペプチドが、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチドである、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  24. 前記細胞外ドメインが、がん細胞上に発現される抗原に特異的に結合する抗体に由来するｓｃＦｖまたはＶＨＨを含む、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  25. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８ヒンジ領域、またはＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  26. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  27. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、またはＣＤ７９Ｂに由来する、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  28. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  29. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
    （ｉｉ）配列番号７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２２に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
    （ｉｖ）配列番号２４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
    （ｖ）配列番号６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）配列番号２０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
    を含む、請求項２２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  30. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
    （ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む細胞外ドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域；
    （ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン；
    （ｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    （ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン
    を含む、請求項２１に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  31. 人工細胞死ペプチドの作用機構が、代謝性、二量体化誘導性または治療的モノクローナル抗体媒介性である、請求項１２から３０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  32. 前記治療的モノクローナル抗体媒介性人工細胞死ポリペプチドが、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択されるモノクローナル抗体特異的エピトープの群から選択される不活化された細胞表面タンパク質である、請求項３１に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  33. 前記不活化された細胞表面タンパク質が、トランケートされた上皮増殖因子（ｔＥＧＦＲ）バリアントである、請求項３２に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  34. 前記ｔＥＧＦＲバリアントが、配列番号７１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項３３に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  35. 前記ＨＬＡ－Ｅが、配列番号６６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または前記ＨＬＡ－Ｇが、配列番号６９に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  36. （ｉ）前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドがＡＡＶＳ１遺伝子の遺伝子座に組み込まれ；
    （ｉｉ）前記人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子座に組み込まれ；および
    （ｉｉｉ）前記ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれており；
    前記外因性ポリヌクレオチドの組込みが、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるか、またはその発現を低下させる、請求項１２から３５のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  37. 前記ＣＡＲがＣＤ３８に特異的に結合する、請求項１２から３６のいずれか一項に記載のｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  38. 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはＴ細胞であって、
    （ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するアポトーシス誘導ドメインを含む人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）配列番号１３３、１３５、または１５０のアミノ酸配列を有するγＴＣＲおよび配列番号１３４、１３６、または１５１のアミノ酸配列を有するδＴＣＲを含む再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｖ）必要に応じて、配列番号６６のアミノ酸配列を有するヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする外因性ポリヌクレオチド
    を含み、
    １つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドがＡＡＶＳ１、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子座に組み込まれていることによって、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを欠失させるか、またはその発現を低下させる、
    前記ｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  39. 請求項１１から３８のいずれか一項に記載のＴ細胞を含む組成物。
  40. ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、単核血液細胞、目的の１つもしくは複数のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）からなる群から選択される１つまたは複数の治療剤をさらに含むか、またはそれと共に使用される、請求項３９に記載の組成物。
  41. 抗ＣＤ２０抗体である抗体を含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記抗体を含み、前記抗体が、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、オビヌツズマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブからなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記抗体がリツキシマブおよびオビヌツズマブの一方または両方を含む、請求項４１または４２に記載の組成物。
  44. それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、請求項１から４３のいずれか一項に記載の細胞または請求項３７および３８のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  45. 前記がんが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項４４に記載の方法。
  46. イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ポラツズマブベドチン、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、オビヌツズマブ、ダラツムマブ、またはウステキヌマブからなる群から選択される１つまたは複数の抗体を投与することをさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. に記載の方法。
  48. 細胞分化のための条件下で請求項１に記載のｉＰＳＣ細胞を分化させることによって、Ｔ細胞を得ることを含む、請求項１１または１２に記載のＴ細胞を製造する方法。
  49. 前記ｉＰＳＣが、前記ｉＰＳＣのゲノム操作であって、標的化編集を含むゲノム操作によって得られる、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記標的化編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的変形によって実行される欠失、挿入、またはインデルを含む、請求項４７に記載の方法。
  51. 再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；ならびに以下のさらなる特徴：
    （ａ）人工細胞死ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｂ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰ遺伝子のうちの１つもしくは複数の欠失もしくは発現低下；
    （ｃ）ＲＡＧ１およびＲＡＧ２遺伝子の欠失もしくは発現低下；
    （ｄ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しないバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｅ）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）および／もしくはインターロイキン（ＩＬ－１５）受容体またはそのバリアントもしくはトランケーションをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｆ）構成的に活性なインターロイキン７（ＩＬ－７）受容体もしくはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｇ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）もしくはインターロイキン２１（ＩＬ－２１）またはそのバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｈ）ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／もしくはヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチド；
    （ｉ）白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）および／もしくはＣＤ２４をコードする外因性ポリヌクレオチド；または
    （ｊ）ＰＳＭＡもしくはＨＳＶ－ｔｋなどの、１つもしくは複数のイメージングもしくはリポータータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）。
  52. 前記ｉＰＳｃが、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から再プログラミングされている、請求項４９に記載のＣＤ３４＋ＨＰＣ。
  53. 前記再構成されたＴＣＲが、
    （ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｃ）配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｄ）配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｅ）配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｆ）配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｇ）配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｈ）配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｊ）配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｋ）配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｌ）配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    （ｍ）配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；または
    （ｎ）配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、および配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖
    を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ、Ｔ細胞、組成物、方法またはＨＰＣ。
  54. 前記再構成されたＴＣＲが、
    ａ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１０９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｂ．ＴＲＧＶ９、およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｃ．ＴＲＧＶ９、およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｄ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｅ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｆ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１１９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｇ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｈ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｉ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｊ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｋ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｌ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；
    ｍ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖；または
    ｎ．ＴＲＧＶ９およびＴＲＧＪＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するγＴＣＲ鎖、ならびにＴＲＤＶ２、ＴＲＤＤ３、およびＴＲＤＪ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を有するδＴＣＲ鎖
    を含む、請求項５２に記載のｉＰＳＣ、Ｔ細胞、組成物、方法またはＨＰＣ。
  55. 前記再構成されたＴＣＲが、
    ａ．配列番号１３３に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖；
    ｂ．配列番号１３５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１３６に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖；または
    ｃ．配列番号１５０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むγＴＣＲ鎖、および配列番号１５１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むδＴＣＲ鎖
    を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ、Ｔ細胞、組成物、方法またはＨＰＣ。
  56. リンカーを介して前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に融合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）を含む人工細胞死ポリペプチド。
  57. 前記リンカーが配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  58. 配列番号１４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  59. 自己プロテアーゼペプチド配列によって作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドを含む、請求項５６に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  60. 前記自己プロテアーゼペプチドが、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドである、請求項５９に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  61. 配列番号１４６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  62. 自己プロテアーゼペプチド配列によって作動可能に連結された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドおよび分化抗原群２４（ＣＤ２４）ポリペプチドを含む人工細胞死ポリペプチド。
  63. 前記自己プロテアーゼペプチドが、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドである、請求項６２に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  64. 配列番号１４７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の人工細胞死ポリペプチド。
  65. 請求項５６から６１のいずれか一項に記載の人工細胞死ポリペプチドを含むｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  66. 請求項６２から６４のいずれか一項に記載の人工細胞死ポリペプチドを含むｉＰＳＣまたはＴ細胞。
  67. （ａ）再構成されたγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、および（ｃ）リンカーを介して前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチドに融合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）を含む人工細胞死ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはそれに由来するＴ細胞。
  68. 配列番号１４０～１４２から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＤＬＬ４バリアントポリペプチド。
  69. ｉＰＳＣをＴ細胞に分化させる方法であって、請求項６８に記載のポリペプチドから選択される組換えデルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）バリアントを含む培地中で細胞を培養することを含む、前記方法。
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