JP5936218B2 - 不死化b細胞のリプログラミング - Google Patents
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Description
本発明は、概して、分子生物学および幹細胞の分野に関する。より詳細には、本発明は、体細胞、特に形質転換されたB細胞のリプログラミングに関する。
一般にiPS細胞またはiPSCと略される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導されるある型の多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ある幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに発生能および分化能の点に関して、多くの点で胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と同一であると考えられるが、天然の多能性幹細胞に対するこれらの完全な関連性はなお評価中である。
患者固有の人工多能性細胞(iPSC)の作製は、再生医療の前途を大いに有望にする。エプスタイン・バーウイルス(EBV)で不死化したリンパ芽球様B細胞株(LCS)は、最小量の血液から作製することができ、純種実験母集団の免疫学的または遺伝学的解析用の細胞標準試料として、全世界で預託されている。実施例で実証する通り、フィーダーのないエピソーム法により、転写因子と小分子のカクテルを使用して、2種類のLCLからiPSCを作製した(LCL−iPSC)。LCL由来のiPSCは、正常な核型を示し、多能性マーカーを発現し、oriP/EBNA−1エピソームベクターを消失し、奇形腫を産生し、ドナー同一性を保持し、かつ造血細胞系、心臓細胞系、神経細胞系、および肝細胞系にインビトロで分化した。有意な点は、親LCLは自身の存続のためにウイルスEBNA−1、および他のEBV潜伏関連要素を発現したが、LCL−iPSCでは、これらの存在が検出可能でなかったことである。よって、LCLのリプログラミングは、特にEBV関連疾患に対して、患者固有のiPSCの無限の供給源を提供できる可能性がある。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
不死化したB細胞から人工多能性幹細胞(iPS細胞)を作製する方法であって、
a)1つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス(EBV)要素により不死化された不死化B細胞を取得することと、
b)上記不死化B細胞を、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりiPS細胞を作製することと、
を含む、上記方法。
(項目2)
上記iPS細胞から上記EBV要素を除去することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記EBV要素を本質的に含まないiPS細胞を単離または濃縮することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
不死化前の上記B細胞が血液サンプルから取得されている、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記血液サンプルが約0.01mL〜約5mLの容量を有する、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記血液サンプルが約0.1mL〜約0.5mLの容量を有する、項目5に記載の方法。
(項目7)
上記不死化B細胞が、エプスタイン・バーウイルス(EBV)要素を使用してB細胞を不死化することにより取得される、項目1に記載の方法。
(項目8)
上記不死化させるEBV要素が、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
上記不死化B細胞が、樹立リンパ芽球様細胞株から取得される、項目1に記載の方法。
(項目10)
リプログラミングは、1つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素を上記不死化B細胞に導入することを含む、項目1に記載の方法。
(項目11)
リプログラミングは、上記不死化B細胞をフィーダー層の非存在下で培養することを含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
リプログラミングは、上記不死化B細胞と1つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることをさらに含み、該シグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK−3)阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MEK)阻害剤、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)受容体阻害剤、白血病抑制因子(LIF)、p53阻害剤、NF−κB阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる、項目1に記載の方法。
(項目13)
リプログラミングは、上記不死化B細胞を線維芽細胞成長因子(FGF)と接触させることをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
リプログラミングは、Pax−5に特異的な阻害性ヌクレオチドを上記不死化B細胞に導入することを含まない、項目1に記載の方法。
(項目15)
リプログラミングは、上記不死化B細胞内における外来性C/EBPαの発現を含まない、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記iPS細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞にインビトロで分化させることをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
胚性幹細胞と比較して不完全なB細胞免疫グロブリン可変領域遺伝子セットを含むゲノムを有するヒトiPS細胞であって、外来性遺伝的要素を本質的に含まないヒトiPS細胞。
(項目18)
上記ゲノムが、選択された遺伝マーカーを含む、項目17に記載のヒトiPS細胞。
(項目19)
上記選択された遺伝マーカーが、選択された疾患の遺伝マーカーである、項目18に記載のヒトiPS細胞。
(項目20)
上記ゲノムが不死化B細胞に由来する、項目17に記載のヒトiPS細胞。
(項目21)
正常な核型を有する、項目20に記載のヒトiPS細胞。
(項目22)
項目17に記載のヒトiPS細胞に由来する、分化した細胞、組織、または器官。
患者固有の人工多能性幹細胞(iPSC)は、病因を理解し新規な治療的介入の開発を促進するための、有用なモデルとして機能し得る(Yamanaka、2007)。近年、複数の方法によるリプログラミング因子の送達により、外来性DNAのないiPSCが作製されている。これらの方法には、oriP/EBNA−1(エプスタインバー核抗原−1)をベースとしたエピソームプラスミド(Yuら、2009)、小分子(small molecule)の存在下もしくは非存在下(Linら、2009;OkitaおよびYamanaka、2010;Okitaら、2010)、piggyBACトランスポゾン(Woltjenら、2009)、ミニサークル(iaら、2010)、タンパク質(Zhouら、2009)、主に線維芽細胞を使用するRNAのカクテル(Warrenら、2010)などが含まれる。しかし、これらの方法はいまだリプログラミング効率が比較的低いため、応用は限られている。
組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、比較的高い核/細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。ほとんどの組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、細胞が由来する部位、例えば、皮膚系、消化系、骨髄系、神経系などに基づいて分類される。皮膚系の組織幹細胞には、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。消化系の組織幹細胞には、膵(共通)幹細胞、肝幹細胞などが含まれる。骨髄系の組織幹細胞には、造血幹細胞、間葉幹細胞などが含まれる。神経系の組織幹細胞には、神経幹細胞、網膜幹細胞などが含まれる。
再生医療のための細胞のリプログラミングが有する医療的可能性は莫大であることから、最小量の操作で可塑性を示す理想的な細胞型を特定する努力が続けられている。本発明の特定の態様では、エピソームベクター要素、特にEBV要素により不死化された体細胞(例えば血液細胞、より特定的にはB細胞)のリプログラミングに使用する方法および細胞を提供する。リプログラミングされる細胞は、リンパ芽球様細胞であり得、例えば、血液サンプルから樹立または派生し、EBVで形質転換されたB細胞であり得る。B細胞の供給源は、生体または罹病した被験体、例えばヒトから得た少量の血液サンプルであり得る。
特定の態様では、形質転換されたB細胞のリプログラミングを、例えば、リプログラミング発現カセットまたはリプログラミングタンパク質を使用することにより提供し得る。B細胞の追加のリプログラミング因子、例えばPax−5阻害剤やC/EBPαエンハンサーを使用して、元のB細胞の系列特定化状態(lineage specification status)に基づくリプログラミングを亢進させ得る。特定の実施形態では、成熟B細胞をリプログラミングする場合でも、Pax−5阻害剤およびC/EBPαエンハンサーは不要であり得る。
リンパ芽球様細胞株(LCL)は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)やEBV由来エピソームベクター要素などのエピソームベクター要素により、リンパ球(例えば任意の種類のT細胞またはB細胞)をインビトロで形質転換して樹立できる。エプスタイン・バーウイルス(EBV)による末梢Bリンパ球の形質転換は、LCLの作製方法として特に適している。この方法は過去20年間に渡って使用され、高い成功率を示している。リンパ芽球様細胞は、体細胞突然変異率が0.3%で、細胞維持が容易であり、患者の遺伝物質を貯蔵するには現在でも好ましい選択肢である。
生物学者たちは、ヘイフリック限界(DNAの損傷またはテロメアの短縮のため細胞がそれ以上分裂しなくなること)に制限されない細胞を指す語として、「不死」(immortal)を選択した。ヘイフリック限界とは、正常な細胞集団が細胞分裂を停止するまでの分裂回数をいう。細胞分裂が停止するのは、おそらくテロメアが臨界長に達するからだと考えられている。テロメア伸長酵素テロメラーゼを発現することによりアポトーシス(プログラム細胞死)を回避した細胞に対して、不死化(immortalization)という用語が適用された。また、正常な幹細胞および生殖細胞も、不死であると言える。
iPS細胞樹立の成功により、ES細胞に起因する生命倫理上の問題が回避できるようになる。また、この成功は、免疫学的拒絶反応のない再生医療の実現に向けた大きな一歩である。しかしながら、従来のiPS細胞作製方法は、レトロウイルスベクターまたは別の類似のベクターであるレンチウイルスベクターを介した遺伝子導入を伴う。このようなウイルスベクターは、宿主細胞の染色体のランダム位置への遺伝子の組み込みを媒介するので、内在性遺伝子の突然変異または内在性癌遺伝子の活性化を引き起こし得る。再生医療において将来iPS細胞が使われることを考慮すると、このようなウイルスベクターの使用は、発癌性形質転換、機能障害の発生などのリスクを伴うことになる。したがって、将来のiPS細胞の利用に向けた極めて重要な開発の1つは、リプログラミング因子を組み込むゲノムなしでiPS細胞を作製する方法である。
これらのリプログラミング方法は、染色体外で複製するベクター(すなわちエピソームベクター)を利用することもできる。このベクターは、エピソーム複製して、外来性ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないiPS細胞を作製できるベクターである(参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許公開第20100003757号;Yuら、2009を参照)。アデノウイルス、サル空胞ウイルス40(SV40)、EBVもしくはウシパピローマウイルス(BPV)、または出芽酵母ARS(自己複製配列)含有プラスミドなどの多数のDNAウイルスは、哺乳動物細胞内で染色体外複製またはエピソーム複製する。これらのエピソームプラスミドは、組み込み型ベクターに関連したこれらすべての不都合を元来有さない(Bodeら、2001)。例えば、上記に定義したEBV要素を含むリンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとしたベクターは、染色体外で複製し、体細胞へのリプログラミング因子の送達を支援し得る。
エプスタイン・バーウイルス(EBV)は、ヒトヘルペスウイルス4(HHV−4)とも呼ばれ、ヒトヘルペスファミリー(単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびサイトメガロウイルスを含む)のガンマヘルペスウイルスであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスの1つである。
OriPは、DNAの複製を開始する部位またはその近傍であり、反復ファミリー(FR)と二分子対称(DS)として知られる約1キロ塩基対離れた2つのシス作用性配列から構成されている。
エプスタインバー核抗原1(EBNA−1)は、複製因子として、oriPまたはRep*のFRおよびDSに結合して、各細胞分裂中の細胞染色体と協調するが独立して、娘細胞へのEBVプラスミドの複製および忠実な分割を促進するDNA結合タンパク質である。
本発明の特定の態様では、エピソームベクター要素は1つ以上の形質転換遺伝子、例えば、EBNA−1、EBNA−2、EBNA−3A、EBNA−3C、EBNA−LP、またはLMP−1などのEBV由来の形質転換遺伝子を含み得る。
特定の態様では、本発明のエピソームベクターは、核リプログラミング因子をコードする遺伝子用、および/または複製因子をコードする遺伝子用の発現カセットを含む。この発現単位に使用されるプロモーターは、哺乳類細胞に使われる任意のプロモーターでよく、例として、CAGプロモーター、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、SV40プロモーター、PGKプロモーター、およびMuLV LTRプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターの下流に、発現させる遺伝子(DNA)を挿入することにより、遺伝子産物の発現が細胞内で達成される。IRES(配列内リボソーム進入部位)を使用することにより、1つのプロモーターの制御下で複数の遺伝子を発現できる。使用するIRESは特に限定されず、例えばヒトHCV由来IRES、ピコルナウイルス由来IRESなどを使用できる。
特定の実施形態では、本方法は、エピソームベクター要素を消失した細胞を選択または濃縮するステップをさらに含み得る。例えば、ベクターを含む細胞の選択がなければ、ベクター要素は徐々に子孫細胞から消失すると考えられる。また、この選択は、マーカー遺伝子の発現に基づく選択または濃縮を含み得る。
上記の通り、エピソームベクターの存在は、時間が経過するにつれて細胞分裂とともに自然に減少する。細胞分裂を可能にするように培養を継続し、限界希釈法を利用して単一クローンを選択することにより、エピソームベクターを含まずiPS細胞だけからなる集団を取得することができる。
レトロウイルスプロモーターは、未分化細胞において遺伝子発現を駆動しないことか多いが(Gormanら、1985)、このようなプロモーターからの残存遺伝子発現(residual gene expression)が報告されている(Yuら、2009)。多くの報告で、レトロウイルスベクターは未分化細胞内で不活化することが示されている(例えば、Pannellら、2000)。したがって、例えば、テトラウイルスプロモーターの下流で複製因子をコードする遺伝子を保有するエピソームベクターを使用すれば、体細胞からiPS細胞へのリプログラミングの後、複製因子の発現が停止するか大幅に制限される。その結果、このようなエピソームベクターは複製能力を失い、ベクターを含まずiPS細胞だけからなる集団が徐々に形成される。レトロウイルスプロモーターの下流に連結される遺伝子は、複製因子をコードする遺伝子に限定されず、核リプログラミング因子をコードする遺伝子であり得るが、ベクター複製抑制の観点から言えば、複製因子をコードする遺伝子が好ましい。
特定薬剤の有無の間で培地条件を切り替えることにより、標的遺伝子産物の発現を調節することができる。この系を利用して、特定の薬剤を培地に加えることにより複製因子の発現が停止するようにした場合、複製因子の発現が阻害され、エピソームベクターが複製能力を失い、その後、エピソームベクターを含まずiPS細胞だけからなる集団が徐々に形成される。薬剤調節遺伝子発現系に用いる薬剤は特に限定されず、このような系の実現を支援できる限り、どの薬剤も好適に使用される。
複製因子をコードする遺伝子および/または核リプログラミング因子をコードする遺伝子を保有するだけでなく、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子を保有するように、エピソームベクターを作製する。この場合、iPS細胞選択の後に培地にガンシクロビルまたはアシクロビルを加えることにより、エピソームベクター消失のためチミジンキナーゼの発現を停止するiPS細胞が選択的に残存するようになる。よって、エピソームベクターを含まずiPS細胞だけからなる集団を取得することができる。
本発明のある態様では、不死化体細胞をリプログラミングすることにより、iPS細胞を作製することができる。リプログラミングには、1つ以上の内因性リプログラミング因子の発現を増加させること、或いは、核酸又はタンパク質の形で1つ以上のリプログラミング因子を導入することが含まれ得る。別の態様では、小分子などのシグナル調節因子を用いてリプログラミングの効率を高めることができる。また、フィーダーフリー条件などの培養条件もリプログラミングの促進に用いることができる。
iPS細胞の生成は、リプログラミング因子の使用によって決定される。以下の因子又はそれらの組合せは、本発明に開示される方法において用いることができる。ある態様では、Sox及びOct(好適にはOct3/4)をコードする核酸が、リプログラミングベクターに組み入れられる。例えば、1つ以上のリプログラミングベクターは、Sox2、Oct4、Nanog、及び必要に応じてLin28をコードする発現カセット、又はSox2、Oct4、Klf4、及び必要に応じてc−Mycをコードする発現カセット、又はSox2、Oct4、及び必要に応じてEsrrbをコードする発現カセット、又はSox2、Oct4、Nanog、Lin28、Klf4、c−Myc、及び必要に応じてSV40ラージT抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、又は異なるリプログラミングベクターの中に含まれ得る。
本発明のある態様では、細胞は、リプログラミングプロセスの少なくとも一部の間で、シグナル伝達カスケードに関与するシグナル伝達物質を阻害する1つ以上のシグナル伝達阻害剤の存在下、例えば、MEK阻害剤、GSK−3阻害剤、TGF−β受容体阻害剤、MEK阻害剤及びGSK−3阻害剤の両方、GSK−3阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤の両方、MEK阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤の両方、これら3つの阻害剤すべての組み合わせ、又は、これらと同じ経路内の他のシグナル伝達物質の阻害剤の存在下に維持される場合がある。ある態様では、HA−100若しくはH−1152などのROCK阻害剤、又はブレビスタチンなどのミオシンII ATPアーゼ阻害剤を用いて、リプログラミングした細胞及び得られるiPS細胞のクローン増殖を促進することができる。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK−3)は、特定の細胞基質中でセリン及びスレオニンアミノ酸へのリン酸分子の付加を媒介するセリン/スレオニンタンパク質キナーゼである。GSK−3によるこれらのその他のタンパク質のリン酸化は、通常、標的タンパク質(「基質」とも呼ばれる)を阻害する。すでに述べたように、GSK−3はグリコーゲン合成酵素をリン酸化し、それにより不活性化することで知られている。また、損傷したDNA及びWntのシグナル伝達に対する細胞応答の調節にも関与している。また、GSK−3は、ヘッジホッグ(Hh)経路のCiをリン酸化し、それを不活性型へのタンパク質分解の標的とする。グリコーゲン合成酵素に加えて、GSK−3はほかにも多くの基質を有する。しかし、通常、基質を最初にリン酸化するには「プライミングキナーゼ」を必要とし、この点で他のキナーゼ類とは異なっている。
本発明のある態様では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MAPK/ERKキナーゼ又はMEK)又はそれに関連するMAPKカスケードなどのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、MEK阻害剤を用いることができる。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(sic)は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼをリン酸化するキナーゼ酵素である。また、MAP2Kとしても知られる。細胞外刺激により、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ(MEK、MKK、MEKK、又はMAP2K)、及びMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MKKK又はMAP3K)からなるシグナル伝達カスケード(「MAPKカスケード」)を通じて、MAPキナーゼが活性化される。
TGF−β受容体阻害剤は、TGFシグナル伝達全般の任意の阻害剤、又はTGF−β受容体(例えば、ALK5)阻害剤に特異的な阻害剤を含み、TGF−β受容体(例えば、ALK5)の抗体、その優性阻害変異体、並びにその発現を抑制するsiRNA及びアンチセンス核酸が含まれ得る。TGF−β受容体/ALK5阻害剤の例としては、これらに限定されないが、SB431542(例えば、Inman et al., 2002を参照)、A−83−01、別名3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド(例えば、Tojoet al., 2005を参照、また、例えば、Toicris Bioscienceより入手可能);2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、Wnt3a/BIO(例えば、Dalton,et al.、国際公開第2008/094597号参照;参照により本明細書に取り込まれる)、BMP4(上記Daltonを参照)、GW788388(−(4−[3−(ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ピリジン−2−イル}−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)ベンズアミド)(例えば、Gellibertet al., 2006を参照)、SM16(例えば、Suzuki et al., 2007を参照)、IN−1130(3−((5−(6−メチルピリジン−2−イル)−4−(キノキサリン−6−イル)−1H−イミダゾール−2−イル)メチル)ベンズアミド)(例えば、Kimet al., 2008を参照)、GW6604(2−フェニル−4−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−4−イル)ピリジン)(例えば、deGouville et al., 2006を参照)、SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジンヒドロクロライド)(例えば、DaCostaet al., 2004を参照)、及びピリミジン誘導体(例えば、Stiefl et al.、国際公開第2008/006583号に挙げられるものを参照;参照により本明細書に取り込まれる)が含まれる。
開示する方法を用いて、不死化体細胞にリプログラミング因子を導入した後、これらの細胞を多能性の維持に十分な培養液中で培養することができる。本発明において作製した誘導多能性幹(iPS)細胞の培養には、霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞の培養のために開発された様々な培養液や手法を用いることができ、これらは米国特許出願第20070238170号及び第20030211603号に記載されている。当業者において周知である、ヒト多能性幹細胞の培養及び維持のためのその他の方法も、本発明に使用し得ることが理解される。
本発明のある態様では、リプログラミング因子は、1つ以上のベクターに含まれる発現カセットから発現される。ベクターは、組み込み型ベクター又はエピソームベクターでもよい。別の態様では、リプログラミングタンパク質を、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入することができる(米国特許出願第61/172,079号を参照;参照により本明細書に取り込まれる)。
本発明において、iPS細胞は、リプログラミングタンパク質をコードする特定の核酸又は遺伝子を、例えば形質転換B細胞などの非多能性細胞に組み込むことで、作製することができる。DNAデリバリーは、一般的に、現在の手法においてレトロウイルスなどのウイルスベクターを組み込むことで達成される。導入される遺伝子には、マスター転写調節因子Oct4(Pouf51)及びSox2が含まれるが、他の遺伝子も誘導効率を高めることが示唆されている。臨界期の後、少数の形質導入細胞で、多能性幹細胞との形態学的及び生化学的な類似化が始まり、形態学的な選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質の選択によって単離することができる。
外来性遺伝子改変が標的細胞に導入されるのを防ぐための1つの考えられる方法は、送達される遺伝子の転写に依存するのではなく、リプログラミングタンパク質を直接細胞に導入することである。これまでの研究により、HIV Tatやポリアルギニンなどのタンパク質形質導入を媒介する短ペプチドを結合させることで、様々なタンパク質をインビトロ及びインビボで細胞に送達できることが示されている。ある最近の研究では、組換えリプログラミングタンパク質を直接送達することで、マウス線維芽細胞を多能性幹細胞に完全にリプログラミングできることが示されている(Zhou et al., 2009)。タンパク質形質導入で細胞をリプログラミングする方法に関する更なる詳細は、米国特許出願第61/172,079号に開示されている(参照により本明細書に取り込まれる)。
ある実施形態では、不死化及び/又はリプログラミングのためのベクターは、細胞内に、上述のような不死化遺伝子又はリプログラミング因子などの様々な成分をコードする核酸配列に加えて、他の要素を含むように構築することができる。これらのベクターの成分及び送達方法の詳細を以下に開示する。
当業者においては、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができると考えられる(例えば、Maniatis et al., 1988及びAusubel et al., 1994を参照;ともに参照により本明細書に取り込まれる)。
ベクターに含まれる真核生物発現カセットは、好適には、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライシングシグナル、及び転写停止/ポリアデニル化配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーターを含む(5’から3’方向)。
「プロモーター」は、転写の開始及び速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼや他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して核酸配列の特異的な転写を開始する遺伝子要素を含む場合がある。「作用的に配置された」、「作用的に連結された」、「制御下」及び「転写制御下」とは、プロモーターが核酸配列に対して正しい機能位置及び/又は向きにあって、その配列の転写開始及び/又は発現を制御することを意味する。
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルは、ATG開始コドン又は隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルが必要となる場合もある。当業者においては、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができると考えられる。周知のこととして、挿入断片全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームの「インフレーム」でなければならない。外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって高めることができる。
ベクターは、マルチクローニング部位(MCS)を含むことができ、このMCSは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、どの制限酵素部位も、標準的な組換え技術とともに使用してベクターを消化することができる(例えば、Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998、及びCocea., 1997を参照;参照により本明細書に取り込まれる)。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者において広く知られている。しばしば、ベクターは、MCS内で切断して外来性配列のベクターへのライゲーションを可能にする制限酵素を使用して、線状化又は断片化される。「ライゲーション」とは、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これらの断片は互いに連続していても良いし、連続していなくても良い。制限酵素及びライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者において周知である。
転写された真核生物RNA分子の大部分は、一次転写物からイントロンを取り除くためのRNAスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを行うために、ドナー及び/又はアクセプターのスプライシング部位を必要とする場合がある(例えば、Chandler et al., 1997を参照;参照により本明細書に取り込まれる)。
本発明のベクター又は構築物は、一般に、少なくとも1つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的な終結に関与するDNA配列から構成されている。したがって、ある実施形態では、RNA転写物の産生を終了させる終結シグナルが考えられる。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボで必要となる場合がある。
発現において、特に真核生物の発現では、通常、転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を実施する上で重要とは考えられず、任意のそのような配列を用いることができる。好ましい実施形態では、簡便で様々な標的細胞において十分に機能することが知られているSV40ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させ、又は細胞質輸送を容易にすることができる。
宿主細胞でベクターを増殖させるために、ベクターは、1つ以上の複製部位の起点(しばしば「ori」と呼ばれる)を含むことができ、例えば、複製が開始される特定の核酸配列であるoriPに関して、上述のEBVのoriP、又は分化プログラミングでの機能が同等又は向上した遺伝子組換えoriPに対応する核酸配列がある。また、上述の他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自己複製配列(ARS)を用いることもできる。
本発明のある実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、インビトロ又はインビボで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、そのマーカーの存在により選択を可能にするマーカーであり、陰性選択マーカーは、そのマーカーの存在により選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例としては、薬剤耐性マーカーがある。
本発明を用いたリプログラミングベクターの細胞への導入では、本明細書に記載する(例えば、ウイルス形質導入)、又は当業者に周知であると考えられる、細胞に核酸を送達するための任意の適切な方法を使用することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、エキソビボトランスフェクション(Wilson et al, 1989、Nabel et al, 1989)、微量注入(Harland and Weintraub,1985;米国特許第5,789,215号;参照により本明細書に取り込まれる)を含む注入(米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、及び第5,580,859号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる);エレクトロポレーション(米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に取り込まれる;Tur-Kaspaet al., 1986;Potter et al., 1984);リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973:Chenand Okayama, 1987;Rippe et al., 1990);DEAE−デキストランに続いてポリエチレングリコールの使用(Gopal, 1985);直接超音波負荷(Fechheimeret al., 1987);リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982;Fraley et al., 1979;Nicolauet al., 1987;Wong et al., 1980;Kaneda et al., 1989;Kato et al., 1991)、及び、受容体媒介トランスフェクション(Wuand Wu, 1987;Wu and Wu, 1988);微粒子銃(国際公開第94/09699号及び第95/06128号;米国特許第5,610,042号、第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号、及び第5,538,880号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる);炭化ケイ素繊維を用いた攪拌(Kaeppleret al., 1990;米国特許第5,302,523号及び第5,464,765号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる);アグロバクテリウム媒介形質転換(米国特許第5,591,616号及び第5,563,055号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる);プロトプラストのPEG媒介形質転換(Omirullehet al., 1993;米国特許第4,684,611号及び第4,952,500号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる);乾燥/阻害媒介によるDNA取り込み(Potrykuset al., 1985)、及びこれらの方法の任意の組み合わせなどによる、DNAの直接送達が含まれる。このような技術を用いることで、細胞小器官、細胞、組織、又は生物を安定的又は一過性に形質転換することができる。
本発明のある実施形態では、核酸は、例えばリポソームなどの脂質複合体の中に閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液中で懸濁されると自然に生じる。脂質成分は、密閉構造物が形成される前に自己再構成され、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を閉じ込める(Ghosh and Bachhawat, 1991)。また、Lipofectamine2000(Gibco BRL)又はSuperfect(Qiagen)と複合体を形成した核酸も考えられる。使用するリポソームの量は、リポソームの性質や用いる細胞によって異なり、例えば、百万〜1千万個の細胞に対して約5〜約20μgのベクターDNAが考えられる。
本発明のある実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞及びDNAの懸濁液を高電圧放電にさらすことを含む。レシピエント細胞は、機械的創傷によってさらに形質転換しやすくなる。また、使用するベクターの量は、用いる細胞の性質によって異なり、例えば、百万〜1千万個の細胞に対して約5〜約20μgのベクターDNAが考えられる。
本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。この技術を用いて、ヒトKB細胞にアデノウイルス5DNAがトランスフェクションされている(Graham and Van Der Eb, 1973)。同様にこの方法により、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV−1、BHK、NIH3T3、及びHeLa細胞に、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクションされ(Chenand Okayama, 1987)、また、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子がトランスフェクションされている(Rippe et al., 1990)。
別の実施形態では、核酸は、DEAE−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方法により、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞及び赤白血病細胞に導入されている(Gopal, 1985)。
本発明の別の実施形態では、直接超音波負荷による核酸の導入が含まれる。超音波負荷により、LTK−線維芽細胞に、チミジンキナーゼ遺伝子がトランスフェクションされている(Fechheimer et al., 1987)。
さらに、核酸は、受容体媒介送達媒体によって標的細胞に送達することができる。これらは、標的細胞内で起こる受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用している。様々な受容体の細胞型特異的分布から考えれば、この送達方法は、本発明に別の段階の特異性をもたらす。
微粒子銃技術は、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織、又は生物に核酸を導入するために用いることができる(米国特許第5,550,318号;第5,538,880号;第5,610,042号;及び国際公開第94/09699号;それぞれ参照により本明細書に取り込まれる)。この方法は、DNA被覆微粒子を高速に加速し、細胞を死滅させることなく、細胞膜を貫通して細胞内に侵入させるという手法による(Klein et al., 1987)。当技術分野で公知の様々な微粒子銃技術が存在し、その多くが本発明に適用可能である。
本発明を用いて、例えばこれらに限定されないが、造血系細胞、筋細胞(例えば、心筋細胞)、神経細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞、並びにそれらに由来する組織及び器官を含む細胞系列にiPS細胞を分化させるためには、様々な方法を用いることができる。iPS細胞の造血系分化の方法の例としては、例えば、米国特許出願第61/088,054号及び第61/156,304号に開示される方法(ともに参照によりその全体が本明細書に取り込まれる)、又は、胚様体(EB)を用いる方法(Chadwick et al., 2003;Ng et al., 2005)がある。Wang et al., 2007に例示されるように、フィブロネクチン分化方法も、血液系分化に用いることができる。iPS細胞の心臓系分化の例示的方法としては、胚様体(EB)による(Zhang,et al., 2009)、OP9間質細胞による方法(Narazaki et al., 2008)、又は、成長因子/化学物質による方法(米国特許公開第20080038820号、第20080226558号、第20080254003号、及び第20090047739号を参照;これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる)が含まれる。
米国特許第6,458,589号及び国際公開第01/81549号(Geron Corporation)に記載されるように、肝細胞は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を用いることで、hES細胞などの多能性幹細胞から分化することができる。未分化の多能性幹細胞は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤の存在下で培養することが可能である。例示的な方法では、1%DMSO、次いで、2.5mMのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤n−ブチレートにより分化を開始する。得られた細胞は、n−ブチレート、DMSO、及び成長因子(EGF、肝細胞成長因子、及びTGF−αなど)を含む肝細胞培養液中で4日間培養することで、成熟させることができる。
そのため、本発明がもたらす利点から見て、特定の様態では、肝細胞プログラミング下の細胞を培養する培養液は、1つ以上の肝細胞分化剤及び成熟化剤を本質的に含まないか、又はこれらの薬剤の異なる組み合わせを含む培養液を連続的に変更しなくてもよい。
神経細胞は、hES細胞などの多能性幹細胞から、米国特許第6,833,269号;Carpenteret al., 2001;及び国際公開第03/000868号(Geron Corporation)に記載される方法により作製することができる。未分化のhES細胞又は胚様体細胞は、1つ以上のニューロトロフィン及び1つ以上のマイトジェンを含む培養液中で培養され、少なくとも〜60%の細胞がA2B5、ポリシアル酸化NCAM、又はネスチンを発現し、培養中に少なくとも20回倍加することができる細胞集団を作る。マイトジェンの例としては、EGF、塩基性FGF、PDGF、及びIGF−1がある。ニューロトロフィンの例としては、NT−3及びBDNFがある。TGF−βスーパーファミリーアンタゴニスト、又はcAMPとアスコルビン酸の組み合わせを用いることで、ドーパミン系神経細胞の特徴であるチロシンヒドロキシラーゼに対して陽性を示す神経細胞の比率を高めることができる。増殖性細胞は、その後、マイトジェンの非存在下でニューロトロフィンとともに培養することで、末端分化が生じる。
本明細書に記載するiPS細胞は、米国特許出願第2011/0097799号(参照により本明細書に取り込まれる)に記載される方法により、心筋細胞に分化することができる。心筋細胞又は心筋細胞前駆体は、hES細胞などの多能性幹細胞から、国際公開第03/006950号に記載される方法によって作製することができる。同様にして、iPS細胞は、ウシ胎児血清又は血清代替物、さらに必要に応じて、DNAのメチル化に影響を及ぼす5−アザシチジンなどの心臓作用因子(cardiotrophic factor)を含む懸濁液中で培養することができる。また、心筋細胞塊は、固体基質上でアクチビンAとともに培養し、その後、BMP4などの骨形態形成タンパク質とともに培養し、さらに必要に応じてIGF−1などのインスリン様成長因子とともに培養することで、得ることができる。必要であれば、密度遠心分離によって、集団中の自発的収縮細胞を他の細胞から分離することができる。
膵島細胞は、アクチビンA、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(ブチレートなど)、マイトジェン(bFGFなど);及びTGF−βスーパーファミリーアンタゴニスト(ノギンなど)から選択されるいくつかの因子の組み合わせを含む培養液中で培養して分化を開始させることで、hES細胞などの多能性幹細胞から分化させることができる(国際公開第03/050249号、Geron Corp.)。その後、細胞は、ニコチンアミドとともに培養して成熟させ、細胞の少なくとも5%がPdx1、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを発現する細胞集団を得ることができる。細胞塊は、インスリン生産細胞に富んだ芽を形成することができ、該細胞は濾過により回収することができる。国際公開第03/050249号(GeronCorp.)を参照。
リプログラミングのためのMaxi EBV粒子の作製
EBV陽性B細胞のリプログラミングへの受容性がより高いことが示されれば、EBV陰性のB細胞は、リプログラミング因子をコードし得る人工EBV粒子に感染させることで、より感受性を高めることができる。EBVは、ヒトヘルペスウイルスファミリーの一員で、非常に大きな量のDNA(≦165kb)を包含することが可能で、これは分子工学上の望ましい特徴である。EBVの特徴を利用して組換えEBV由来ベクターを作製することができ、これを、ヘルパー細胞株と組み合わせることで、リプログラミング、形質転換などに不可欠なタンパク質を送達する媒体として働くMaxi−EBV粒子の作製に用いることができる(Wendtner et al., 2003;Delecluse et al., 1999;Delecluse et al., 1998;Hettichet al., 2006)。このような粒子を得るために必要となり得るプロセスの概要を以下に記載する:
最初に、感染B細胞株を作製するため、ウイルス欠陥ヘルパー細胞株を293細胞から作製する:完全長EBVゲノム(165kb)を、真核細胞プロモーター由来のマーカー遺伝子(8〜10wks)を同時に含む原核細胞レプリコン上にクローニングする;TR配列を含まない染色体外EBVゲノムを293細胞に導入し、これによりEBVベクターの全パッケージ機能を提供する;そして、トランスフェクションにより得られるクローン群を維持する。「非トランスフェクション」ミニEBVプラスミドを、以下をコードするように作製する:セレクション(ハイグロマイシン、GFP、など)、EBV(TR)の末端反復、2つの複製起点(oriLyt及びoriP)、EBNA−1。ミニEBVプラスミドは、必要に応じて、EBNA−1のリプログラミング遺伝子及び/又は優性阻害誘導体を、場合によっては条件付きオペレーター又はプロモーターとともに、含んでいてもよい。パッケージングしたミニEBVは以下により作製する:人工ウイルス欠陥細胞(上述)にミニEBVプラスミド及びウイルストランス活性化因子を一時的にトランスフェクトする;上清を回収、精製、濃縮する;Hyg抵抗性及び/又はGFP陽性のクローンの感染及びスクリーニングのための試験細胞株を樹立する;そして、より大規模な生産を確立し、ウイルス力価を決定する。その後、一次B細胞をミニEBVとともにインキュベートして感染させ、次いで48時間後の感染効率を評価する(蛍光指標を用いた場合)。
リンパ芽球様細胞株(LCL)及び標準B細胞のリプログラミング
1)リプログラミング試験のための、成熟B細胞集団の前駆体状態への誘導、又はPax−5プロB細胞の前駆細胞型の単離
成熟B細胞集団を前駆細胞型に脱分化させるためには、Pax−5、Blimp1、Oct2、及びBob−1の阻害、又はC/EBPαの発現上昇が必要となる場合がある。
Pax−5の発現を低下させるためには、コハク酸プレドニゾロンナトリウム又はSN38又はSU11274(Kanteti et al., 2009;Marie-Cardine et al., 2008)などのグルココルチコイド(GC)で細胞を処理する(Rahmanet al., 2001)。生存細胞をIL−7含有培養液に入れ、プロB細胞を成長させる。
この方法では、CD34、CD38及びCD10抗原を共発現するリンパ球前駆細胞の単離と精製が含まれ得る。
一次B細胞に対するEBVの効率的な形質転換能力は、リンパ芽球様細胞株(LCL)を樹立、貯蔵するためにインビボで日常的に用いられている。ウイルスタンパク質EBNA−2及びLMP−1によって引き起こされるエプスタイン・バーウイルス(EBV)のIII型潜伏感染プログラムが、インビボでのB細胞の形質転換に直接的に関与している。
受容B細胞は、B細胞が生存できる培養液中に置くことができる。トランスフェクション後の最初の数日間では、BLyS、BAFF(B細胞の必須生存因子である、サイトカインのTNFファミリーのメンバー)、又はCD40リガンドを加えることで、リプログラミング因子を含むB細胞の増殖を増加させることができる(Fu et al., 2009)。
Pax−5の予防的阻害又はC/EBPα−R遺伝子の過剰発現を含まない、既知のフィーダーフリー条件を用いたリンパ芽球様細胞株(LCL)のリプログラミング
一次LCLは、10−20%FBSを含むRPMI培地中で得て増殖させた。培養したLCLに、以下のリプログラミング因子を含むEBV由来エピソームベクターを、エレクトロポレーションによりトランスフェクションした。
iPSコロニーから残留EBVを取り除く方法
EBVはB細胞に選択的に感染し(例えば、リンパ芽球株を産生する)、細胞から失われないため、宿主細胞に選択的優位性をもたらす。そのため、可能性の1つとして、EBVのoriPレプリコンを有するプラスミドが、他の細胞型に比べて、これらの細胞内でより有利に遺伝子発現及びプラスミド保持を促進することができる。例えば、これらの感染細胞にすでに存在するEBNA−1は、リプログラミング因子をコードする新たに導入されたoriPプラスミドの保持を促進することで補完し、リプログラミングが確実に行われるように発現のための十分な時間を確保すると考えられる。一旦iPS細胞への移行が起きると、内因性EBV及びトランスフェクションしたoriP由来プラスミドは、細胞に選択的優位性をもたらさないため、自然に細胞から失われると考えられる。一方、これらのエピソームが失われる速度は、望ましい速度からは非常に遅い場合がある。
iPSコロニーから残留EBVを取り除く別の方法
iPSコロニーが形成された後、残留EBVは、試薬を含む培養液を供給し、以下に詳述する方法を用いる第4の方法で取り除くこともできる。生存クローンを選別することで、EBVが存在しないことを示すことができる。
アシクロビル[9−(2−ヒドロキシエトキシメチル)グアニン]、EBVの溶解的複製に対して効果を持つ臨床的に有用な最初の薬剤。
EBVフリーの誘導多能性幹細胞にリプログラミングされたリンパ芽球様B細胞株
簡単に述べると、リンパ芽球様細胞株(LCL)はCoriell Cell Repositoriesより入手し、RPMI1640(Invitrogen)と15%FBS(Hyclone)を用いて維持した。細胞は、前述のoriP/EBNA−1由来のエピソームベクターを用いてトランスフェクションした(Yu et al., 2009;Yu et al., 2007)。トランスフェクション後、マトリゲルでコーティングした組織培養プレート(BD Biosciences)で、細胞をリプログラミング培養液(RM)中に2〜3週間置き(Yuet al.,;2010年12月に提出された文献)、次いで、TeSR−2培地(Stem Cell Technologies)中でさらに2週間維持した。iPSC様コロニーを最初に手動で選択し、マトリゲルコーティングプレート上でTeSR−2培地を用いて増殖させた。フローサイトメトリー、PCR、及びテラトーマ分析により、4つのLCL−iPSCの特性評価を行った(Yuet al., 2009)。iCell Cardiomyocytes(登録商標)、iCell Hepatocytes(登録商標)、及びiCell Neurons(登録商標)(Cellular Dynamics International)の開発において確立されたプロトコールに従って、神経系、造血系、心臓系、及び肝細胞系へのインビトロでの分化を行った。EBVの存在を、RT−PCR、ゲノムDNA PCR、及び免疫組織化学的試験により評価し、EBNA−1タンパク質の検出を行った。LCL−iPSCの核型をGバンド法(WiCell Research Institute)により分析した。親系統との遺伝的同一性を、短反復配列(STR)分析(Cell Line Genetics)により確認した。IgGH受容体再配列分析を、親系統及びLCL−iPSCに対して行った(Hematologics)。
リンパ芽球様細胞(LCL)は、15%FBSを含むRPMI1640を用いて、37℃、5%CO2の加湿インキュベータ内で維持した。LCLからのiPSCの誘導は、マトリゲルでコーティングした組織培養プレート上で行った。トランスフェクションの12時間後に、細胞をリプログラミング培養液に移行した。リプログラミング培養液は、DMEM/F12に、非必須アミノ酸(NEAA)、グルタマックス、N2、B27(すべてInvitrogenから)、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、100ng/mLのゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子(zbFGF)、0.5μΜのPD0325901、3μΜのCHIR99021、0.5μΜのA−83−01(すべてStemgentから)、1000ユニット/mLのhLIF(Millipore)、及び10μΜのHA−100(Santa Cruz)を加えたものからなる。2週間は、1日おきに新しい培養液を細胞に供給した。14〜20日で、培養液をTeSR2に移行した。トランスフェクション後14〜20日では、iPSコロニーと同様の形態のコロニーが容易に観察された。正確なiPSコロニーの存在を、形態学的に、及びTra−1−60抗体による生細胞染色により確認した。すべてのLCL由来iPS細胞を、マトリゲルでコーティングした組織培養皿上で、TeSR−2完全培地(Stem cell Technologies)中で維持した。
oriP/EBNA−1由来エピソームベクターの構築は、Yuらにより述べられている(Yuet al., 2009)。LCL−iPSCの作製には、6つのリプログラミングプラスミドを用いた。簡単に述べると、OSNKは、配列内リボソーム進入部位(IRES2)を媒介したOCT4、SOX2、NANOG及びKLF4の発現を利用するoriP/EBNA−1プラスミドである。以下のプラスミドは、発現のために同じバックボーンを利用する:OSTKは、OCT4、SOX2、SV40ラージT抗原及びKLF4をコードし、OSNLは、OCT4、SOX2、NANOG及びLin28をコードし、OSTNは、OCT4、SOX2、SV40ラージT抗原及びNANOGをコードし、c−mLはc−MYC及びLIN28をコードし、L−mLはL−MYC及びLIN28をコードする。
上述及び図8Bに記載するエピソームベクターの様々な組み合わせを用いたLCLのリプログラミングは、ヒトB細胞96ウェルNucleofectorキット(Lonza)及びプログラムE0〜100を用いたヌクレオフェクションにより、1反応当たり1〜2μgのDNAを用いて実施した。ヌクレオフェクションを行った細胞(1条件当たり〜1.0E+06個の細胞)は、数時間回復させ、マトリゲルでコーティングした6ウェルプレートでリプログラミング培養液中に直接蒔いた。
細胞を、10μgのTra−1−60一次抗体(R&D Systems)とともに1時間インキュベートして、DMEM/F12で簡単に3回洗い、その後、IgM AlexaFluor488複合二次抗体(Invitrogen)を1:100で希釈したものとともに、30分間インキュベートして、Tra−1−60生細胞染色を行った。染色された細胞を洗い、Tra−1−60コロニーを蛍光顕微鏡で可視化した。アルカリホスファターゼ(AP)染色は、Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit III(Vector Laboratories)を用いて、製造者の指示に従って実施した。
各試料の全RNA及びcDNAは、それぞれ、RNeasy Mini Plusキット(Qiagen)とImprom II Reverse Transcriptionキット(Promega)を用いて、製造者の指示に従って調製した。導入遺伝子及び内因性mRNAの発現を分析するRT−PCRは、Yuら(2007)によって述べられたプライマーを用いて実施した。追加されたEBV遺伝子の検出に用いられたプライマーは以下である:EBNA−2 F 5’−CAT AGA AGA AGA AGA GGA TGA AGA −3’(配列番号1)及びEBNA−2 R 5’−GTA GGG ATT CGA GGG AAT TAC TGA−3’(配列番号2)、LMP−2A F 5’−AGG AAC GTG AAT CTA ATG AAG A−3’(配列番号3)及びLMP−2A R 5’−AAG TGA CAA CCG CAG TAA GCA−3’、BZLF−1 F 5’(配列番号4)−CAC GGT AGT GCT GCA GTT GC−3’(配列番号5)及びBZLF−1 R 5’−CCC AGA ATC AAC AGA CTA ACC AAG CCG−3’(配列番号6)。PCRは、1μLの希釈cDNAテンプレート(1:2)を用いて、30〜35サイクルで、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒により行った。
全細胞性DNA及びウイルスDNAを、DNeasy Blood and Tissueキット(Qiagen)を用いて、製造者の指示に従って単離した。エピソームリプログラミングベクター及びウイルスDNAを検出するPCRを、前述のプライマー(Yu et al., 2009;Yu et al., 2007)又は上述のプライマーセットを用いて実施した。PCRは、1反応当たり150ngのgDNAを用いて、30〜35サイクルで、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒により行った。
すべてのインビトロ分化試験では、マトリゲル上で25継代を超えて維持されているLCL−iPSCを用いた。
マトリゲルコーティングプレート上でTeSR−2の存在下で維持したLCL−iPSCを、コラゲナーゼIVを用いて回収し、SCID/ベージュマウス(Harlan Laboratories、ウィスコンシン州マディソン)の後肢に筋肉内投与した。1細胞株につき3個体のマウスにそれぞれ6ウェルプレートの細胞を投与した。投与前に、細胞懸濁液に総体積の1/3のマトリゲルを加えた。8〜10週目に腫瘍が形成され、ウィスコンシン大学マディソン校に設置されたDepartment of SurgeryのImmunohistochemical Core Serviceによって、ヘマトキシリン及びエオシン染色、並びに組織学的解析のための処理が行われた。動物実験は、すべて、Cellular Dynamics International Animal Care and Use Committeeに認可された関連する国内及び国際ガイドラインに従って実施した。
DNeasy Blood and Tissueキット(Qiagen)を用いて、LCL−iPSC及び親LCLからゲノムDNAを単離した。試料は、WiCell Research Institute及びCell Line Geneticsに送り、短反復配列(STR)分析を行った。8つのSTR遺伝子座の遺伝子型について、親LCL及びLCL−iPSCで分析を行った。
WiCell Research Instituteによって、Gバンド分析が行われた。
製造者のプロトコールに従って(DNeasy Blood and Tissueキットを用いて)、親LCL及びLCL−iPSCからゲノムDNAを単離した。3つの免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域の特徴的なモノクローナルアンプリコンを検出するため、Hematologicsにより、多重PCR反応を用いたIgG重鎖遺伝子再配列アッセイが実施された。
マトリゲル上で維持したLCL−iPSCを回収し、Tra−1−81(AlexaFluor488複合TRA−1−81、Millipore)、及びSSEA−4(BD Pharmingen、クローンMC813−70)の存在に対して染色を行った。ヨウ化プロピジウムで染色した死細胞は、分析から除外した。2%パラホルムアルデヒドで固定化し、PBS+0.1%サポニンで透過処理した細胞に、細胞内OCT3/4(BD、クローン40/OCT−3)染色を行った。細胞は一晩かけて行い、翌日にフローサイトメーター(Accuri)で分析した。イソタイプの抗体(BD Pharmingen)を対照として用いた。
以下の参考文献は、本明細書に記載するものを補足する例示的な方法又は他に関する詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明示的に取り込まれる。
Claims (12)
- 不死化したB細胞からヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)を作製する方法であって、
a)1つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス(EBV)要素により不死化された不死化ヒトB細胞を取得することと、
b)前記不死化B細胞を、フィーダー層の非存在下、既知条件下で1つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素を導入し、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりiPS細胞を作製することであって、該1つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素が、Oct遺伝子とSox遺伝子とを含む1つ以上のリプログラミング発現カセットを含む、ことと、
c)前記iPS細胞から前記EBVおよびエピソームベクター要素を除去して、外来性のEBVおよびエピソームベクター要素を含まないヒトiPS細胞を提供することと、
を含む、前記方法。 - 前記リプログラミング発現カセットが、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子、Klf遺伝子、Myc遺伝子、または、SV40ラージT抗原遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記EBV要素を含まないiPS細胞を単離または濃縮することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 不死化前の前記B細胞が血液サンプルから取得されている、請求項1に記載の方法。
- 前記血液サンプルが0.01mL〜5mLの容量を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記血液サンプルが0.1mL〜0.5mLの容量を有する、請求項4または5に記載の方法。
- 前記不死化B細胞が、エプスタイン・バーウイルス(EBV)要素を使用してB細胞を不死化することにより取得される、請求項1に記載の方法。
- 前記不死化させるEBV要素が、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記不死化B細胞が、樹立リンパ芽球様細胞株から取得される、請求項1に記載の方法。
- リプログラミングは、以下:
i)前記不死化B細胞と1つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることであって、該シグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK−3)阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MEK)阻害剤、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)受容体阻害剤、白血病抑制因子(LIF)、p53阻害剤、NF−κB阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる、不死化B細胞と1つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させること、あるいは
ii)前記不死化B細胞を線維芽細胞成長因子(FGF)と接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - リプログラミングは、以下:
i)Pax−5に特異的な阻害性ヌクレオチドを前記不死化B細胞に導入することも
ii)前記不死化B細胞内における外来性C/EBPαの発現
も含まない、請求項1に記載の方法。 - 前記iPS細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞にインビトロで分化させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
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