DE10224242A1 - Frog Prince, ein Transposonvektor für den Gentransfer bei Wirbeltieren - Google Patents

Frog Prince, ein Transposonvektor für den Gentransfer bei Wirbeltieren

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DE10224242A1
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Csaba Miskey
Zsuzsanna Izsvak
Zoltan Ivics
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    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Description

    STAND DER TECHNIK
  • Für die Entwicklung von In-vivo-Genübertragungsstrategien zur Behandlung ererbter und erworbener Erkrankungen beim Menschen (somatischer Gentransfer) sowie zur Transgenese bestimmter Wirbeltierarten für die landwirtschaftliche und medizinische Biotechnologie (Keimstamm-Gentransfer) wurden erhebliche Anstrengungen unternommen. Für eine wirksame Gentherapie ist Folgendes nötig: 1) Erreichen der Übertragung therapeutischer Gene mit hoher Effizienz, insbesondere in relevante Zellen, 2) Expression des Gens über einen längeren Zeitraum, 3) Sicherstellung der Unschädlichkeit beim Einbringen des therapeutischen Gens.
  • Für die Genübertragung zum Zweck der Gentherapie beim Menschen werden mehrere Methoden und Vektoren eingesetzt (Verma und Somia, 1997). Diese Methoden lassen sich grob in virale und nonvirale Technologien unterteilen, und alle haben Vorteile und Grenzen, wobei keine von ihnen eine perfekte Lösung bietet. Im Allgemeinen besitzen Vektoren, die in der Lage sind, das Transgen zu integrieren, auch die Fähigkeit, eine längere Expression zu sichern. Andererseits ist die zufällige Integration in Chromosomen wegen der möglichen Unterbrechung der endogenen Genfunktion an und in der Nähe der Insertionsstelle ein Problem.
  • Die Anpassung von Viren für den Gentransfer ist eine verbreitete Methode, die genetische Konstruktion des Vektors ist aber aufgrund der Beschränkungen des Virus hinsichtlich Größe, Struktur und Expressionsregulation begrenzt. Retrovirale Vektoren (Miller, 1997) integrieren wirksam fremde DNA in die Chromosomen transduzierter Zellen und besitzen ein enormes Potential zur lebenslangen Genexpression. Der Zeitaufwand und die Finanzmittel, die für ihre Präparation erforderlich sind, können für die großtechnische Produktion jedoch ungeeignet sein. Darüber hinaus sind mehrere weitere Faktoren zu berücksichtigen, darunter die Sicherheit, die zufällige Chromosomenintegration und die Notwendigkeit der Zellreplikation für die Integration. Lentivirale Systeme, die auf dem humanen Immundefektvirus (HIV) beruhen, gehören zu den Retroviren, aber sie können teilende und nichtteilende Zellen infizieren. Adenovirale Vektoren sind nachweislich zur In-vivo-Genübertragung von Transgenen auf eine breite Vielzahl teilender und nichtteilender Zellen sowie zur Vermittlung einer hohen, jedoch kurzzeitigen Genexpression in der Lage. Adenoviren besitzen nicht die Fähigkeit, das transferierte Gen in chromosomale DNA zu integrieren, und ihre Präsenz in Zellen ist kurzlebig. Daher müssen rekombinante adenovirale Vektoren wiederholt verabreicht werden und erzeugen aufgrund der Immunogenität des Vektors eine unerwünschte Immunreaktion bei Menschen. Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren besitzen mehrere mögliche Vorteile, die zu untersuchen sind, darunter die Möglichkeit der gezielten Integration des Transgens. Eine der deutlichsten Beschränkungen des AAV-Vehikels ist die geringe maximale Insertionsgröße (3,5-4,0 kb). Zurzeit werden (hybride) Kombinationsvektoren (retroviral/adenoviral, retroviral/AAV usw.) entwickelt, die bestimmte Probleme der einzelnen Viralvektorsysteme lösen können.
  • Nichtvirale Methoden, darunter DNA-Kondensationsmittel, Liposome, Mikroinjektion und "Genpistolen" könnten einfacher und sicherer in der Anwendung sein als Viren. Die Eintritts- und Aufnahmeeffizienz der bloßen DNA ist jedoch gering. Diese kann durch Verwendung von Liposomen gesteigert werden. Im Allgemeinen sind die gegenwärtig verwendeten nichtviralen Systeme nicht geeignet, die Integration in Chromosomen zu fördern. Folglich sind stabile Gentransferfrequenzen unter Verwendung nichtviraler Systeme sehr niedrig. Außerdem führen die meisten nichtviralen Methoden häufig zu Konkatamerisation sowie zu zufälligen Brüchen in der Eingabe-DNA und diese wiederum u. U. zur Genstilllegung.
    • ZU LÖSENDES PROBLEM
  • Zurzeit existiert bei Wirbeltieren kein Genübertragungssystem für somatischen und Keimstamm- Gentransfer, das folgende Eigenschaften verbindet:
    • 1. Fähigkeit zur In-vivo-Genübertragung;
    • 2. breiter Wirts- und Gewebebereich;
    • 3. stabile Geninsertion in Chromosomen;
    • 4. zuverlässige, langfristige Expression der übertragenen Gene;
    • 5. Sicherheit;
    • 6. kostengünstige großtechnische Produktion.
  • Das Problem wurde mit den im Hauptanspruch beschriebenen Maßnahmen gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
    • BESCHREIBUNG
  • Transponierbare Elemente oder kurz Transposons sind mobile Segmente der DNA, die sich innerhalb von Genomen von einem Ort zu einem anderen bewegen können (Plasterk u. a., 1999). Diese Elemente bewegen sich über einen konservativen "Ausschneiden-und-Einfügen"- Mechanismus: die Transposase katalysiert die Exzision des Transposons aus seiner ursprünglichen Position und fördert seine Reintegration an einer anderen Stelle im Genom. Transposase-defiziente Elemente können mobilisiert werden, wenn durch ein anderes Transposasegen die Transposase in trans bereitgestellt wird. So können Transposons als Vehikel genutzt werden, um neue Phänotypen durch Transgenese in Genome einzubringen. Sie sind nicht infektiös, und da sie an ihren Wirt angepasst werden müssen, hielt man sie für weniger schädlich für den Wirt als Viren.
  • DNA-Transposons werden routinemäßig für Insertionsmutagenese, Genmapping und Gentransfer in feststehenden Modellsystemen, die keine Wirbeltiere umfassen, wie z. B. Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans, sowie bei Pflanzen verwendet. Transponierbare Elemente wurden jedoch aus zwei Gründen nicht für die Untersuchung von Wirbeltiergenomen verwendet. Erstens gab es bei diesen Arten bisher keine genau definierten mobilen Elemente auf DNA-Basis. Zweitens war bei Tieren die Artspezifität der Transposition aufgrund der Notwendigkeit von Faktoren, die durch den natürlichen Wirt erzeugt wurden, ein Haupthindernis für den Transfer eines aktiven Transposonsystems von einer Art auf eine andere.
  • Sleeping Beauty (SB) ist ein aktives, Tc1-ähnliches Transposon, das aus Stücken und Teilen inaktiver Elemente rekonstruiert wurde, die in Genomen des Teleostfisches zu finden sind (Ivics u. a., 1997). SB bewirkt bei Fischen, Fröschen und vielen Säugetierarten, darunter auch Mäuse- und Menschenzellen eine effiziente und präzise Transposition durch Ausschneiden und Einfügen (Ivics u. a., 1997; Luo u. a., 1998; Izsvak u. a.,2000; Yant u. a., 2000).
  • Erfindungsgemäß wurde aus inaktiven Elementen, die im Genom der Amphibienart Rana pipiens gefunden wurden, ein neues Transposonsystem entwickelt. Dieses neue System, das Frog Prince genannt wurde, ist ein Vektor für die Insertion von genetischem Material in die Chromosomen von Wirbeltierzellen.
  • Einige Hauptmerkmale eines wünschenswerten Transposonvektors sind: einfache Verwendung, ein relativ breiter Wirtsbereich, eine effiziente Chromosomenintegration und eine stabile Erhaltung einer zuverlässigen Transgenexpression über mehrere Generationen transgener Zellen und Organismen. Das neue System Frog Prince, im weiteren nur "Prince" genannt, erfüllt diese Anforderungen auf der Grundlage der folgenden Ergebnisse.
    • VERSUCHSERGEBNISSE
  • Isolierung von Transposasegenen von Rana pipiens mittels ORF-Trapping. Sämtliche natürlich auftretenden Tc1/mariner-Elemente, die bisher bei Wirbeltierarten isoliert wurden, sind inaktive (nichtautonome) Kopien, die zahlreiche Mutationen in ihren Transposasegenen enthalten. Eine relativ hohe Kopienzahl dieser Elemente in Genomen ist praktisch prohibitiv gegenüber der Isolierung funktioneller Transposasegene unter Verwendung nichtselektiver Verfahren. Bei der Suche nach potentiell aktiven Transposasegenen in Wirbeltieren wurde ein Offener-Leserahmen- (ORF)-Trappingverfahren entworfen. Das Verfahren basiert auf der Erzeugung eines Pools von PCR-Produkten aus genomischer DNA unter Einsatz von Primern, welche die Transposasegensequenzen flankieren (Abb. 1). Der 5'-Primer enthält das vorhergesagte Translationsstartsignal, während dem 3'-Primer das Stoppcodon fehlt. Das PCR-Produkt wird dann in einen Expressionsvektor kloniert, um Fusionsgene mit lacZ zu erzeugen. Die rekombinanten Plasmide werden zu E. coli transformiert und auf X-Gal-Platten plattiert. Blaue Kolonien können nur dann entstehen, wenn die klonierten Sequenzen mit dem lacZ-Gen im Rahmen sind. Das Verfahren sollte für die Selektion von ununterbrochenen ORF hilfreich sein, es filtert jedoch keine Fehlsinnmutationen oder In-Frame-Insertionen oder Deletionen heraus.
  • Die ORF-Falle wurde auf Proben genomischer DNA von Rana pipiens angewendet, wobei PCR-Primer verwendet wurden, die gemäß der veröffentlichten Consensus-Sequenz von Txr- Elementen in Xenopus laevis (Lam u. a., 1996) aufgebaut waren. Nach Transformation der Bank in Bakterien, zeigten vier blaue Kolonien (aus insgesamt etwa 100 Kolonien) die Präsenz von transposasekodierenden Sequenzen an, die keine prämaturen Stoppcodons enthielten. Alle vier klonierten Sequenzen waren länger als das vorhergesagte Consensus-Txr-Transposasegen. Die Rana-Sequeiuen enthielten eine Region, die einen Teil der 5'-terminalen invertierten Wiederholung enthielt, dem Sequenzen folgten, die in den Txr-Kopien fehlten. Anscheinend enthalten Txr- Elemente eine konservierte Deletion von 180 bp, die den N-terminalen Teil des Transposasegens abdecken, was zu einer falschen Vorhersage der Transposasesequenz durch Lam u. a. (1996) führte. In ähnlicher Form wurde eine konservierte Deletion im Fall von Tdr1-Elementen beim Zebrafisch beschrieben (Izsvak u. a., 1995). Der Rest der Rana-Sequenzen und der Txr-kodierenden Bereiche wies eine Ähnlichkeit von 90% auf.
  • Zur Prüfung der Wirksamkeit des neuen ORF-Trapping-Verfahrens wurde die Anzahl genomischer Kopien des Rana-Transposons durch Dot-Blotting geschätzt. Ausgehend von der Annahme, das die Größe des R. pipiens-Haploidgenoms 6,6 × 109 bp beträgt, wurde geschätzt, dass das Transposasegen pro Haploidgenom 8000 Mal vorliegt, was ungefähr 0,1% des R. pipiens- Genom entspricht. Diese Anzahl liegt innerhalb des Bereiches von 0,02 bis 0,6%, der für andere Tc1-ähnliche Elemente bei anderen Arten ermittelt wurde. Diese Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße ORF-Trapping-Verfahren erheblich zur Erkennung von Transposasegenen beitrug, die in einer relativ guten Verfassung sind und die in einem Genom vorliegen, in dem diese Transposonfamilie in starkem Maße vertreten ist.
    • Die beiden Komponenten des Prince-Transposonsystems
  • Das Consensus-Rana-Gen (Abb. 2) kodiert eine typische Tc1-ähnliche Transposase, die eine mutmaßliche N-terminale DNA- Bindungsdomäne enthält, die aus zwei vorhergesagten Helix-Turn-Helix-Motiven (Plasterk u. a., 1999), einem zweigeteilten Kernlokalisierungssignal (Ivics u. a., 1996) und einer katalytischen Domäne mit der DD(34)E-Signatur (Plasterk u. a., 1999) besteht (Abb. 2). Eines der drei verschiedenen dabei isolierten Transposasegene unterschied sich lediglich durch zwei Nukleotide vom Consensus, was zwei Aminosäuresubstitutionen in seinem ORF zur Folge hatte. Eine davon war ein Thr→Ser(152)-Austausch im ersten Teil der katalytischen Domäne der Transposase. Die andere Fehlsinnmutation war auf die Desaminierung eines 5mC-Rests einer CpG-Stelle zurückzuführen, die zu einer Arg→Cys(315)-Substitution nahe des C-Terminus des Proteins führte. Zur Ableitung der Sequenz des Consensus-Rana-Transposasegens wurde ortsspezifische PCR- Mutagenese verwendet (Abb. 2). Die Aminosäuresequenz der FP-Transposase ist in SEQ Nr. 1 gezeigt.
  • Zur Ableitung der Bindungsorte für die Rana-Typ-Transposase, wurde Splinkerette-PCR auf genomische DNA angewendet, um die kompletten invertierten Wiederholungen gemeinsam mit den genomischen flankierenden Sequenzen zu amplifizieren. Anordnungen von fünf verschiedenen Klonen zeigten 214 bp lange, perfekte invertierte Wiederholungen, welche die Transposasegene flankierten (Abb. 2). Die DNA-Sequenzen der invertierten Repeats sind auch in SEQ Nr. 2 gezeigt. Die Rana-Transposons sind typische IR/DR-Typ-Elemente, d. h. die IR enthalten vier Transposase- Bindungsstellen, welche als direkt wiederholte Sequenzen (DR) an den Enden der IR (Ivics u. a., 1997) erscheinen. Die DR haben eine Länge von 21 Nukleotiden und unterscheiden sich in einem Nukleotid zwischen den äußeren und inneren Orten. Die IR-Sequenzen bilden gemeinsam mit dem Consensus-Transposasegen die Komponenten eines neuen Systems transponierbarer Elemente, das Frog Prince genannt wurde (Abb. 2).
    • Transposition von Prince
  • Sleeping Beauty zeigt starke Transpositionsaktivität in menschlichen Zellen (Ivics u. a., 1997). Daher wurden die einleitenden Tests auf Transpositionsaktivität des Prince-Elements in kultivierten HeLa-Zellen unter Verwendung eines für SB entwickelten Transpositionsassays (Ivics u. a., 1997) durchgeführt. Der Assay basiert auf der Cotransfektion eines Helferplasmids, das die Transposase und das Donor-Konstrukt, welches das Transposon enthält, mit einem Neomycin-Resistenz-(neo)-Gen zwischen den terminalen IR exprimiert. Die Effizienz der durch die Transposase katalysierten Transgenintegration wurde aus der Zahl der G-418-resistenten Kolonien aufgrund chromosomaler Integration und Expression des selektierbaren Markergens ermittelt (Ivics u. a., 1997). Der rekonstruierte Consensus-Rana-Transposase-ORF (in pFV-Prince) und dessen Vorgängergen, das die beiden Aminosäureänderungen (in pFv-mPrince) enthält, wurden entweder gemeinsam mit den Txr-Typ-(pTxr-neo)- oder gemeinsam mit den Prince-Typ-(pPrinceneo)-Substratkonstrukten transfiziert (Abb. 3). Wurde pFV-Prince mit seinem eigenen Substrat, pPrince-neo, cotransfiziert, konnte eine 17fache Steigerung der Kolonienzahl nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein aktives Transposonsystem aus dem Rana pipens-Genom erfolgreich abgeleitet und hergestellt wurde. Die mPrince-Transposase war vollständig inaktiv und zeigte damit die Bedeutung einer oder beider Aminosäuren T(152) und R(315). Interessanterweise konnte eine 5fache Steigerung der Anzahl von G418-resistenten Zellkolonien beobachtet werden, wenn pFV-Prince mit pTxr-neo (Abb. 3) cotransfiziert wurde. Also kann die Rana-Transposase Xenopus-Transposons kreuzmobilisieren, was darauf hindeutet, dass die beiden Transposonfamilien in diesen Arten vor kurzem divergiert sind. Zusammengenommen zeigen die Daten, dass das Prince-Transposonsystem die Effizienz der Transgenintegration aus plasmidgestützten Vektoren in das menschliche Genom erheblich steigern kann.
    • "Ausschneiden-und-Einfügen"-Transposition von Prince in das menschliche Genom
  • Tc1/mariner-Elemente transponieren über einen "Ausschneiden-und-Einfligen"-Mechanismus in TA- Dinukleotide. Die TA-Zieldinukleotide werden verdoppelt und flankieren das integrierte Transposon an beiden Enden. Dies ist ein Kennzeichen der Tc1/mariner-Transposition (Plasterk u. a., 1999). Zur Untersuchung der flankierenden Sequenzen der integrierten Prince-Transposons wurde genomische DNA aus einzelnen G418-resistenten HeLa-Klonen isoliert und Splinkerette-PCR ausgesetzt. Die linken und rechten Verbindungen, welche an drei verschiedene Transposoninsertionen - zwei von ihnen aus Introns und eine aus einer nichtgenomischen Sequenz - angrenzen, kloniert und sequenziert. In allen drei Fällen wurden die Prince-Insertionen an beiden Seiten des Transposons von den erwarteten TA-Dinukleotiden flankiert, gefolgt von Sequenzen, die voneinander abwichen, und denen des Transposon-Donor-Plasmids (Abb. 4). Ähnliche Ergebnisse wurden mit vier anderen flankierenden Sequenzen erzielt, die entweder am rechten oder am linken IR des Transposons angrenzten (Daten nicht angegeben). Die Prüfung der Zielorte ergab, dass sämtliche der Insertionen an TA-Dinukleotiden in verschiedenen menschlichen Chromosomen auftraten (Abb. 4). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Prince einer präzisen Ausschneiden-und-Einfügen- Transposition an die verschiedenen Stellen im menschlichen Genom folgt.
    • Prince ist in verschiedenen Wirbeltierzelllinien aktiv
  • SB hat verschiedene Transpositionsaktivitäten in unterschiedlichen Wirbeltierzelllinien (Izsvak u. a., 2000). SB ist jedoch ein synthetisches Element, das vom Fisch abstammt, und Prince wurde aus dem Genom einer Amphibie rekonstruiert. Daher können gleiche Zellliniensätze für die beiden Transposonsysteme unterschiedliche permissive Umgebungen liefern. Deshalb wurden die Aktivitäten der beiden Systeme in kultivierten Zelllinien - zwei von Säugern, eine von Amphibien und zwei von Fischen - mit dem Standard-Transpositionsassay verglichen. Die für Cotransfektionen verwendeten Plasmide waren pFV-SB und pT/neo (Ivics u. a., 1997) bei SB und pFV-Prince und pPrince-neo beim Prince- System. Die Vektorgerüste, die Promotoren, die Poly-A-Signale und die Transposon-Markergene waren in den Konstrukten der beiden Systeme identisch. Prince ist offensichtlich in allen vier getesteten Zelllinien aktiver (Abb. 5). Jedoch ist der Unterschied bei den transpositionalen Effizienzen der beiden Transposonsysteme moderat und nur in der PAC2-Zebrafisch-Zelllinie statistisch signifikant. Diese Daten zeigen, dass sich die Transposition von Prince nicht auf phylogenetisch nahe Taxa beschränkt und dass es das aktivste transponierbare Element bei Wirbeltierarten ist, das bisher beschrieben wurde.
  • Zusammengefasst besitzt das erfindungsgemäße Prince-System mehrere Vorteile für den Gentransfer bei Wirbeltieren:
    • - Prince kann unterschiedlichste Wirbeltierzellen umwandeln;
      da Prince ein Transposon auf DNA-Basis ist, besteht keine Notwendigkeit der reversen Transkription des Transgens, die Mutationen in retrovirale Vektorstämme einbringt;
      da Transposonen nicht infektiös sind, sind Vektoren auf Transposonbasis nicht replikationskompetent und breiten sich daher nicht auf andere Zellpopulationen aus;
    • - Prince erfordert lediglich etwa 230 bp transposoninvertierter Repetitions-DNA, die zur Mobilisierung ein Transgen auf jeder Seite flankiert;
      Transposition ist induzierbar und erfordert nur das Transposaseprotein; auf diese Weise können Position und Moment des Sprungs durch Kontrolle der Transposaseexpression einfach gesteuert werden;
    • - Prince bewirkt die stabile Integration von Genen in Einzelkopie in Chromosomen; damit wird die Grundlage langfristiger Expression durch mehrere Generationen transgener Zellen und Organismen gelegt;
      sobald sie integriert sind, verhalten sich Prince-Elemente sich als stabile, dominante genetische Determinanten in den Genomen umgewandelter Zellen weil 1) die Präsenz von Prince-Transposase in Zellen nur vorübergehend und auf ein Zeitfenster beschränkt ist, wenn die Transposition katalysiert wird und 2) keine endogene Transposasequelle in Wirbeltierzellen nachgewiesen wird, die integrierte Prince-Elemente aktivieren und mobilisieren könnte;
      mit Ausnahme einiger Froscharten gibt es in Wirbeltiergenomen keine endogenen Sequenzen mit ausreichender Homologie zu Prince, die die Rekombination und Freisetzung transpositional kompetenter (autonomer) Elemente ermöglichen würde;
      zur effizienten Einbringung in Zellen könnte Prince mit DNA-Zufuhragenzien wie Adenoviren und Liposomen kombiniert werden;
    • - Prince ist ein Vektor auf Plasmidbasis, der einfach und preiswert hergestellt werden kann. SEQ1

      SEQ2

    LITERATUR Ivics, Z., Izsvák, Z., Minter, A. & Hackett, P. B. (1996). Identifikation of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5008-13.
    Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H. & Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell 91, 501-510 (1997).
    Izsvák, Zs., Ivics, Z. and Hackett, P. B. (1995). Characterization of a Tc1-like transposable element in zebrafish (Danio rerio). Mol. Gen. Genet. 247: 312-322.
    Izsvák, Z., Ivics, Z., and Plasterk, R. H. (2000) Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J. Mol. Biol. 302, 93-102.
    Lam, W. L., Seo, P., Robison, K., Wirk, S. & Gilbert, W. (1996). Discovery of amphibian Tc1-like transposon families. J. Mol. Biol. 257, 359-66.
    Luo, G., Ivics, Z., Izsvak, Z. & Bradley, A. (1998). Chromosomal transposition of a Tc1/marinerlike element in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10769-10773.
    Miller, A. D. (1997). Development and applications of retroviral vectors. in Retroviruses (eds. Coffm, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E.) 843 pp. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,).
    Plasterk, R. H., Izsvák, Z. & Ivics, Z. (1999). Resident aliens: the Tc1/mariner superfamily of transposable elements. Trend Genet. 15, 326-32.
    Verma, LM. and Somia, N. (1997). Gene therapy - promises, problems and prospects. Nature 389, 239-242.
    Yant, S. R., Meuse, L., Chiu, W., Ivics, Z., Izsvak, Z., and Kay, M. A. (2000) Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat. Genet. 25, 35-41. Legenden zu den Abbildungen Abb. 1 Strategie zum Abfangen von Transposase-ORF aus dem Rana pipiens-Genom
  • Transposasegene werden von genomischer DNA PCR-amplifiziert, wobei Primer (durch Pfeile angedeutet) eingesetzt werden, die zum Flankieren der vorhergesagten Gensequenzen ausgelegt sind. Es kann eine Reihe von transposasekodierenden Bereichen (durch leere Kästchen dargestellt) amplifiziert werden. Die große Mehrheit dieser Gene ist aufgrund von Punktmutationen (τ), Rasterverschiebungen (Φ) und prämaturen Translationsstoppcodons (λ) defekt. Ununterbrochene ORF können durch Klonieren der PCR-Produkte in Fusion mit dem LacZ-Gen, getrieben durch den CMV-Promotor, Transformation in E. coli und Plattieren auf X-Gal-Platten selektiert werden.
    • Abb. 2 Abgeleitete Consensus-Sequenz des transponierbaren Prince-Elements in vollständiger Länge
  • Die IR werden auf schwarzem Hintergrund dargestellt. Die DR mit einer Länge von 21 bp werden in weißen Kästchen angezeigt. Die kodierte Aminosäuresequenz der Transposase wird unter der DNA-Sequenz angegeben. Die neuidentifizierten Sequenzen, die beim Xenopus-Txr-Consensus fehlen, sind unterstrichen. Die Sternchen weisen auf Basenpaarpositionen hin, an denen die Sequenzen zwischen den Rana und Xenopus-Elementen innerhalb der Transposasebindungsstellen unterschiedlich sind und an denen zur Ableitung der Consensus-Sequenz Ersetzungen im Transposasegen eingeführt wurden.
    • Abb. 3 Transposition und Substraterkennung von Prince in menschlichen HeLa-Zellen
  • Verschiedene Kombinationen von in der Tabelle angegebenen Donor- und Helferplasmiden wurden in HeLa-Zellen cotransfiziert. Als Kontrolle diente die Transfektion von pCMV-βgal mit den Donor-Plasmiden. Die Effizienz der Transgenintegration wurde mittels Zählung der antibiotikaresistenten Kolonien nach Plattierung von Zellen unter G418-Selektion geschätzt. Die Zahlen auf der linken Seite stellen die Mittelwerte der Anzahl von Kolonien pro 105 plattierter Zellen dar. Die Ergebnisse geben mindestens drei Transfektionsexperimente wieder. Die Fehlerbalken deuten auf SEM hin.
    • Abb. 4 Durch Prince vermittelte "Ausschneiden-und-Einfügen"-Transposition in menschliche Chromosomen
  • Oben wird ein Schema des Prince-neo-Elements gezeigt. IR werden durch schwarze Pfeile, der SV40-Promotor und das Neomycin-Resistenz-Markergen (neo) jeweils in dem weißen Pfeil und Kästchen dargestellt. Benachbarte pUC19-Vektorgerüstsequenzen, welche das Element im Donorkonstrukt flankieren, sind kursiv dargestellt. Nachfolgend werden drei Regionen der menschlichen Genomsequenzen, die als Zielorte für die Transposase dienten, dargestellt. Präzise "Ausschneiden-und-Einfügen"-Transposition führte zur Verdopplung der genomischen TA- Zieldinukleotide. Diese sind fettgedruckt.
    • Abb. 5 Aktivität von Prince bei verschiedenen Wirbeltierarten
  • Die Donor- und Helferplasmide von Prince und SB wurden in HeLa- (Mensch), CHO-K1- (Hamster), A6-(Xenopus laevis), FHM- (fettköpfige Elritze) und PAC2-(Zebrafisch)-Zelllinien cotransfiziert. Die Transpositionseffizienzen wurden durch Ableitung der Verhältnisse zwischen der Anzahl der in Anwesenheit der Transposasen und der Anzahl der in Abwesenheit der Transposasen erzielten G418-resistenten Zellklone berechnet. Die Aktivitäten von Prince (dargestellt durch schwarze Säulen) wurden mit denen von SB (weiße Säulen) verglichen. Relative Effizienzen sind auf der y-Achse dargestellt, wobei die Aktivität von SB in einer gegebenen Zelllinie willkürlich auf den Wert 1 gesetzt wird. Die angezeigten Zahlen sind Mittelwerte, die durch mindestens drei Transfektionswiederholungen erzielt wurden. Die Fehlerbalken deuten auf SEM hin. SEQUENZPROTOKOLL











Claims (53)

1. Verfahren zur Verwendung des Gentransfersystems Prince für den somatischen Gentransfer zur stabilen Insertion von DNA in die Chromosomen lebender Wirbeltiere, dadurch gekenzeichnet, daß die beiden Komponenten des Systems Prince zu gentherapeutischen Zwecken oder für Diagnosen in die somatischen Zellen eines Tiers transferiert werden.
2. Gentransfersystem Prince, umfassend a) ein Transposase Protein, bevozugt mit der Sequenz SEQ1, und b) ein Transposon mit invertierten Wiederholungen, bevorzugt mit der Sequenz SEQ2.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Menschen stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Fisch stammt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Frosch stammt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Reptil stammt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Vogel stammt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen von Säugetieren stammt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Mensch ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Fisch ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Frosch ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Reptil ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Vogel ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Säugetier ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transposasequelle ein Transposaseprotein ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transposasequelle eine mRNA ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transposasequelle eine Plasmid-DNA ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zufuhrmethode eine Genpistole ist.
19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit Liposomen kombiniert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit PEI (Polyethylenimin) kombiniert wird.
21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit Adenovirus-Polylysin-DNA- Komplexen - rezeptorvermittelter Gentransfer kombiniert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit einem rekombinanten Retrovirus kombiniert wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Zufuhrverfahren Transduktion ist.
24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit mit einem rekombinanten Adenovirus kombiniert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Zufuhrverfahren Infektion ist.
26. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit einem rekombinanten Herpesvirus kombiniert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Prince mit einem rekombinanten adenoassoziiertem Virus kombiniert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transposase mindestens eine 90%ige Sequenzidentität mit SEQ1 hat.
29. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die transposoninvertierten Wiederholungen mindestens eine 90%ige Sequenzidentität mit SEQ2 haben.
30. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das transferierbare Gen zur Korrektur eines einzelnen Gendefekts verwendet wird.
31. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Gen bei der Krebsgentherapie eingesetzt wird.
32. Verfahren zur Verwendung des Systems Prince für den Keimstamm-Gentransfer bei Wirbeltierorganismen, umfassend:
- das Einbringen der beiden Komponenten des Systems Prince in eine Keimstammzelle, um eine transgene Zelle zu erzielen,
- das Einwachsen der transgenen Zelle in ein transgenes Tier.
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zelle pluripotent oder totipotent ist.
34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Zufuhrverfahren Mikroinjektion ist.
35. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Zufuhrverfahren eine Genpistole ist.
36. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Zufuhrverfahren Sperma verwendet, welches das Prince-System trägt.
37. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Transposase mindestens eine 90%ige Sequenzidentität mit SEQ1 hat.
38. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die transposoninvertierten Wiederholungen mindestens eine 90%ige Sequenzidentität mit SEQ2 haben.
39. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Menschen stammt.
40. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Fisch stammt.
41. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Frosch stammt.
42. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Reptil stammt.
43. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen vom Vogel stammt.
44. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in das Transposon Prince eingefügte transferierbare Gen von Säugetieren stammt.
45. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Mensch ist.
46. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Fisch ist.
47. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Frosch ist.
48. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Reptil ist.
49. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Vogel ist.
50. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Wirbeltier ein Säugetier ist.
51. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Transposasequelle ein Transposaseprotein ist.
52. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Transposasequelle eine mRNA ist.
53. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Transposasequelle eine Plasmid-DNA ist.
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