DE69730825T2

DE69730825T2 - Tec tyrosinkinase promotor

Info

Publication number: DE69730825T2
Application number: DE69730825T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Utsunomiya-shi MANO; Tsuneaki Tsukuba-shi SAKATA; Mamoru Tsukuba-shi HASEGAWA
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: HK1020583A1; EP0894866A1; US6225459B1; CN1187452C; DK0894866T3; ATE277192T1; US20010005589A1; JP3162726B2; EP0894866B1; CA2248541A1; KR100490818B1; WO1997034007A1; KR19990087708A; CN1218511A; DE69730825D1; AU2233297A; EP0894866A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik, insbesondere das Gebiet der Gentherapie.
Hintergrund des Fachgebiets
Die Gentherapie versucht Erkrankungen zu behandeln, die durch angeborene oder erworbene genetische Defekte verursacht werden, das heißt Genstörungen, und zwar durch Ersatz oder Ergänzen defekter Gene durch oder mit normalen Genen. Obwohl verschiedene Behandlungsverfahren zur Gentherapie untersucht wurden, hatte bisher nur eine sehr begrenzte Zahl an Verfahren Erfolg, einschließlich der Behandlung der Adenosin-Desaminase (ADA)-Defizienz. Dies ist hauptsächlich deshalb der Fall, weil Verfahren zum effizienten Einbringen eines therapeutischen Gens in Zielzellen und Verfahren zur Expression eines eingebrachten Gens in der Zelle noch nicht etabliert sind. Bisher wurden Liposomen, HVJ-Liposomen, Retroviren und Ähnliche als Träger zum Einbringen des therapeutischen Gens in Zielzellen verwendet. Keiner dieser Träger besitzt jedoch eine zufriedenstellende Effizienz beim Einbringen des Gens. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, um die Effizienz der Expression des eingebrachten Gens zu steigern, wie zum Beispiel durch die Verbesserung des Promotors. Die Expressionseffizienz des gewünschten Gens war jedoch in allen Fällen immer noch gering, und die Menge des Genprodukts reichte nicht aus, um eine Gentherapie zu ermöglichen. Daher wurde auf dem Gebiet der Gentherapie ein Vektor gesucht, der die Expression eines therapeutischen Gens in einer Vielzahl von Zielzellen in einem hohen Ausmaß ermöglicht.
Auf dem Gebiet der Hämatologie wird die Tec-Tyrosinkinase, ein Protein, von dem man annimmt, dass es an der Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen beteiligt ist, in der Leber der Maus stark exprimiert, und es wird ebenfalls in der Niere, dem Herzen und in den Eierstöcken exprimiert (Oncogene 5, 1781–1786 (1990). Im Menschen wird die Tec-Tyrosinkinase in einem großen Spektrum von Blut- und lymphoiden Zellen stark exprimiert (LEUKEMIA 8, 1663–1672 (1994)).
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektors, der in sich eingebaut einen Promotor enthält, der in einer Vielzahl von Blut- und lymphoiden Zellen sowie in den Zellen von Organen wie z. B. der Leber effizient funktioniert, und dadurch wird ein Gentherapie-Verfahren bereitstellt, mit dem Blut- und lymphoide Zellen gezielt angesteuert werden können.
Die vorliegenden Erfinder haben bemerkt, dass die Tec-Tyrosinkinase, ein Protein, von dem man annimmt, dass es an der Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen beteiligt ist, in einer Vielzahl von Blutzellen, lymphoiden Zellen und in den Zellen von Organen wie z. B. der Leber stark exprimiert wird. Die Erfinder isolierten den Promotor der Tec-Tyrosinkinase aus der genomischen DNA der Maus, konstruierten einen Vektor, der in sich eingebaut den Promotor enthielt, ligierten benachbart dazu ein exogenes Gen stromabwärts und versuchten, das exogene Gen in den Zellen zu exprimieren. Als Ergebnis fanden sie, dass das exogene Gen tatsächlich in den Zellen in einem hohen Ausmaß exprimiert wurde, und dadurch wurde die vorliegende Erfindung fertig gestellt. Somit betrifft die vorliegende Erfindung:

(1) eine DNA, die mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 umfaßt, und die Promotoraktivität besitzt;
(2) einen Expressionsvektor, der die DNA aus (1) umfaßt; und
(3) eine Zelle, die den Expressionsvektor aus (2) enthält.

In der vorliegenden Erfindung bedeutet eine "DNA, die Promotoraktivität besitzt", eine DNA, die die Aktivität aufweist, die Transkription einer DNA-Region zu induzieren, welche der DNA benachbart ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt eine DNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält, und die eine Promotoraktivität besitzt, sowie die DNA, welche die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 umfaßt. Die DNA der vorliegenden Erfindung besitzt bevorzugt eine allgemeine Länge von mindestens etwa 50 Bp, noch bevorzugter von mindestens etwa 100 Bp, sogar noch bevorzugter von mindestens etwa 200 Bp und am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 300 Bp.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann im Grunde jeder beliebige Vektor für den Gebrauch zum Einbringen von Genen als "Vektor" verwendet werden, in den die DNA, die Promotoraktivität besitzt, eingebaut werden kann. Insbesondere bei der Gentherapie sollten virale Vektoren wie z. B. Retrovirus-Vektoren, Adenovirus-Vektoren oder Adeno-assoziierte Virus-Vektoren und nicht-virale Vektoren wie z. B. Liposomen verwendet werden.
Die "Zelle, die den Expressionsvektor trägt" der vorliegenden Erfindung umfaßt jede beliebige Zelle. Es sollten Zellen verwendet werden, von denen bestätigt wurde, dass sie das Tec-Tyrosinkinase-Gen tatsächlich exprimieren, einschließlich Blutzellen und lymphoiden Zellen wie z. B. hämatopoetische Stammzellen, myeloide Zellen, B-Zellen, T-Zellen und die Zellen von inneren Organen wie z. B. der Leber, der Niere, des Herzens und der Eierstöcke.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nucleotidsequenz der flankierenden 5'-Region des Tec-Gens der Maus gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Luciferase-Aktivität von BA/F3- und NIH 3T3-Zellen, in die pUC00Luc eingebracht worden war, das ein Fragment der flankierenden 5'-Region des Tec-Gens der Maus sowie ein Luciferase-Gen eingebaut hat, das an das Fragment angrenzt und mit ihm verknüpft ist. Als Kontrolle wurde pUC00Luc verwendet, der das Fragment der flankierenden 5'-Region nicht enthielt.
Das beste Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die vorliegende Erfindung in Einzelheiten zu erläutern, sie sollen jedoch nicht den Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränken.
Beispiel 1 Konstruktion der genomischen Genbank der Maus
Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus BA/F3-Zellen extrahiert. Die DNA wurde mit Sau3AI (Takara Shuzo) teilweise verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP; Takara Shuzo) dephosphoryliert. Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden in den mit BamHI verdauten Vektor EMBL3 (Stratagene) eingebaut und unter Verwendung des "Gigapack Gold-Extrakts" (Stratagene) in vitro verpackt. Die so erhaltenen rekombinanten Phagen wurden zur Infektion des E. coli-Stammes LE392 verwendet.
Beispiel 2 Durchmusterung nach dem Maus-Tec-Promotor
Um die Promotorregion des Tec-Gens der Maus zu erhalten, wurde über PCR eine Sonde für die Durchmusterung wie folgt hergestellt. Zuerst wurden ein Primer, der dem 15. bis einschließlich dem 32. Nucleotid, sowie ein Primer, der dem 122. bis einschließlich dem 141. Nucleotid der Tec-cDNA (SEQ ID Nr. 2; Oncogene 8, 417–424 (1993)) entsprach, synthetisiert und dazu verwendet, die 5'-Region der Maus-Tec-cDNA zu amplifizieren. Die Amplifikation über PCR wurde unter Verwendung von 10 ng der Maus-Tec-cDNA als Matrize durchgeführt. Das PCR-Produkt (etwa 127 Bp) wurde gereinigt, mit ³²P radioaktiv markiert und als Sonde verwendet, um die genomische Genbank der Maus zu durchmustern; dies erfolgte durch Hybridisierung in einer Lösung, die 5 × SSC (1 × SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Na-Citrat), 5 × Denhardt-Lösung (1 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 mg/ml Ficoll), 0,5% SDS, 100 ng/ml Lachssperma-DNA und das mit ³²P markierte PCR-Fragment enthielt, bei 65°C über Nacht. Die Filter wurden zweimal 20 Minuten bei 55°C mit 2 × SSC/0,1% SDS und zweimal 20 Minuten bei 55°C mit 0,2 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Das Signal wurde durch 24 bis 72 Stunden Exposition der Filter gegen "Kodak XAR-Filme" (Kodak) mit Verstärker-Folien bei –80°C nachgewiesen. Als Ergebnis wurden 13 positive Clone erhalten. Die zweite Durchmusterung wurde zum Auffinden dieser positiven Clone durchgeführt und zwar unter Verwendung der Nucleotidsequenz, die den Tec-cDNA-Positionen 15 bis 39 entsprach, als Sonde, die auf die gleiche Weise wie vorstehend radioaktiv markiert worden war; dies erfolgte durch die Durchführung der Hybridisierung unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend, mit der Ausnahme, dass die Temperatur 55°C betrug und die Waschungen jedesmal zweimal 20 Minuten mit 2 × SSC/0,1% SDS bei 55°C durchgeführt wurden. Als Ergebnis wurden zwei positive Clone erhalten.
Beispiel 3 Die Analyse der Transkriptions-Initationsstelle des Maus-Tec-Gens
Um die Transkriptions-Initationsstelle des Maus-Tec-Gens zu analysieren, wurde eine RACE-PCR wie folgt durchgeführt. Zuerst wurden 5 μg der mRNA aus BA/F3-Zellen extrahiert, und es wurde die Anlagerung unter Verwendung des Oligonucleotids 5'-TTAGCATCATGAACAAC-3' (Primer 1), das den Nucleotid-Positionen 358 bis einschließlich 374 der Tec-cDNA entspricht (hierin werden nachstehend die gleichen Nucleotid-Positionen wie in SEQ ID Nr. 2 verwendet), als Antisense-Primer gegen diese mRNA durchgeführt. Das Produkt der Anlagerung wurde der c-DNA-Synthese unterworfen und ein d(A)-Schwanz wurde angehängt. Dann wurde die primäre PCR unter Verwendung des vorstehenden Primers als Matrize und des Oligonucleotids 5'-CCTTACCCTCATAGTAGCTCA-3' (Primer 2), das den Nucleotid-Positionen 227 bis einschließlich 247 der Tec-cDNA entspricht, und des Oligonucleotids 5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (Primer 3) als Primer durchgeführt. Die primäre PCR erfolgte über 40 Zyklen mit jeweils 40 s bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72°C. Zusätzlich wurde eine sekundäre PCR unter den gleichen Bedingungen wie die primäre PCR durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Oligonucleotid 5'-TCAACACTATCCTAGAAGAG-3' (Primer 4), das den Nucleotid-Positionen 122 bis einschließlich 141 der Tec-cDNA entspricht, und das Oligonucleotid 5'-GACTCGAGTCGACATCG-3' anstelle des Primers 2 und des Primers 3 verwendet wurden. Als negative Kontrolle für dieses Experiment wurde eine RACE-PCR ohne die reverse Transkriptase durchgeführt. Als Nächstes wurden die PCR-Produkte über Agarose-Elektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid (EtBr) gefärbt. Nur wenn die RACE-PCR mit der reversen Transkriptase durchgeführt worden war, wurde als Ergebnis ein PCR-Produkt von etwa 250 Bp nachgewiesen. Um zu bestätigen, dass der gewünschte Bereich amplifiziert worden war, wurden die PCR-Produkte nach der Agarose-Elektrophorese auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, und die Membran wurde unter Verwendung des mit ³²P markierten Oligonucleotids 5'-GCAGTTTGGACGTCGCTCTGTCTTG-3' hybridisiert, das den Nucleotid-Positionen 15 bis einschließlich 39 der Tec-cDNA entspricht. Das Ergebnis zeigte, dass die PCR-Produkte den größten Teil der 5'-Region der Tec-cDNA enthielten und dass die Tec-mRNA durch die RACE-PCR exakt amplifiziert worden war.
Wenn die 5'-gelagerten Sequenzen der so erhaltenen DNA-Fragmente bestimmt wurden, wurde in sieben von acht Clonen eine identische Sequenz (5'-CGCAGTTTGG ...) nach der polyT-Sequenz gefunden, und daher wurde das 5'-terminale "C" der Sequenz als Transkriptions-Initiationsstelle identifiziert. Die Transkriptions-Initiationsstelle ist in 1 durch Pfeile angegeben.
Beispiel 4 Die Analyse der flankierenden 5'-Region des Maus-Tec-Gens
Die Nucleotidsequenz der flankierenden 5'-Region des Maus-Tec-Gens wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Die so bestimmte Sequenz wird in 1 und in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Das Ergebnis zeigte, dass keine Sequenz vorhanden ist, die eindeutig als eine TATA-Box oder als eine CAAT-Box in der flankierenden 5'-Region identifiziert werden konnte. Statt dessen war eine GATA-Stelle und eine Konsensus-Sequenz für die SP1-Faktor-Bindestelle vorhanden (1).
Beispiel 5 Die Analyse der Promotoraktivität der flankierenden 5'-Region des Maus-Tec-Gens
Ein Fragment, das aus einem Teil der flankierenden 5'-Region des Maus-Tec-Gens und dem Exon 1 (d. h. der Region von –409 bis +22) bestand, wurde in den Expressionsvektor pUC00Luc eingebaut, der keinen Promotor enthielt, und dann in BA/F3-Zellen eingebracht, welche die Tec-mRNA stark exprimieren, sowie in NIH 3T3-Zellen, welche die Tec-mRNA nicht exprimieren; dies erfolgte wie nachstehend beschrieben. Zuerst wurden 1 × 10⁷ Zellen in der Wachstumsphase mit PBS gewaschen und mit 500 μg DEAE-Dextran (Pharmacia) sowie 10 μg der Reporter-Plasmid-DNA 25 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen in einem Medium, das 100 μM Chloroquin enthielt, 1 Stunde bei 37°C angezogen. Die Anzucht erfolgte in 5% Kohlendioxid. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, 48 Stunden in dem Kulturmedium inkubiert und zur Analyse der Luciferase unter Verwendung des "Luciferase-Assay-System" (Promega) geerntet. Als Kontrolle zu vorstehendem Experiment wurden Zellen verwendet, in die pUC00Luc eingebracht worden war, der kein Fragment der 5'-Region enthielt. Der Luciferase-Aktivität-Testansatz wurde gemäß dem üblichen Verfahren durchgeführt (dem Verfahren gemäß dem Handbuch des "Luciferase-Assay-System (Promega)).
Aus den erhaltenen Ergebnissen ergab sich, dass BA/F3-Zellen eine 10-fach höhere Luciferase-Aktivität als NIH 3T3-Zellen aufwiesen, wenn pUC00Luc, der das Fragment der 5'-Region enthielt, in diese Zellen eingebracht worden war (2). Im Gegensatz dazu wurde bei dem Kontrollexperiment keine Luciferase-Aktivität in beiden Zelllinien nachgewiesen. Folglich wurde offenbar, dass die flankierende 5'-Region des Maus-Tec-Gens Promotor-Aktivität besitzt.
Es wird anerkannt, dass Fachleute in der Lage sind, ein kürzeres DNA-Fragment herzustellen und zu identifizieren, und zwar durch die Herstellung eines kürzeren Promotors, der die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 aufweist; dies kann durch ein Verdau mit Exonucleasen wie z. B. ExoIII und Bal31 oder mit Restriktionsenzymen und Untersuchung der Promotoraktivität der DNA-Fragmente gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren erfolgen.
Industrielle Anwendbarkeit
In der vorliegenden Erfindung wurde der Promotor der Tec-Tyrosinkinase isoliert, der in einer großen Vielzahl von Blutzellen, lymphoiden Zellen und den Zellen von Organen wie z. B. der Leber stark exprimiert wird, und seine Struktur wurde aufgeklärt. Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Vektors, der in sich eingebaut den Promotor enthält, sowie die Expression eines exogenen Gens in hämatopoetischen Stammzellen, Leberzellen und Ähnlichen in hohen Spiegeln. Es wird ein wichtiger Durchbruch erwartet, insbesondere auf dem Gebiet der Gentherapie, das sich mit der gezielten Ansteuerung von Blutzellen oder den Zellen von Organen wie z. B. der Leber beschäftigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA mit mindestens einem Teil der Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 1, wobei der Teil Promotoraktivität besitzt.
Expressionsvektor, umfassend die DNA nach Anspruch 1.
Zelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 2 trägt.
Arzneimittel, umfassend die DNA nach Anspruch 1, den Expressionsvektor nach Anspruch 2 und/oder die Zelle nach Anspruch 3.
Arzneimittel nach Anspruch 4 für die Verwendung in der Gentherapie.
Verwendung der DNA nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Vektors zur Gentherapie in Zellen, die das Tec-Tyrosinkinase-Gen exprimieren, wobei der Vektor eine exogene DNA in Zellen exprimieren kann, die stromabwärts der DNA nach Anspruch 1 ligiert ist.