JP3162726B2 - プロモーター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は遺伝子工学の分野、特に遺伝子治療の分野に
関する。

背景技術 先天的または後天的に遺伝子に欠陥があるために発症
する病気、即ち遺伝子病に対して、欠陥遺伝子そのもの
を正常な遺伝子と入れ換えたり、補ったりして、病気を
治療しようとするのが遺伝子治療である。遺伝子治療に
関しては、これまで様々な治療技術の検討がなされてき
たが、現在成功を収めているものは、アデノシン・デア
ミネース（ADA）欠損症など、ごく僅かなものに限られ
ている。その大きな理由として、治療用遺伝子の標的細
胞への有効な導入法や導入された遺伝子を細胞内で発現
させる方法の確立が遅れていることが挙げられる。治療
用遺伝子の標的細胞への導入には、これまでリポソー
ム、HVＪ−リポソームやレトロウイルスなどがキャリア
ーとして用いられてきた。しかし、遺伝子の導入効率
は、いずれも満足のいくものではなかった。一方、導入
された遺伝子を発現効率を高めるために、プロモーター
の改良を行うなど様々な試みがなされてきた。しかし、
いずれも目的の遺伝子の発現効率が悪く、遺伝子治療を
行うために充分な量には至っていなかった。そこで、遺
伝子治療の分野において、様々な標的細胞内で治療用遺
伝子を高発現させるベクターの提供が望まれていた。

一方、血液学の分野では、造血幹細胞の増殖にも関与
していると考えられているタンパク質である、Tecチロ
シンキナーゼが、マウスの肝臓において高発現してお
り、さらに、腎臓、心臓や卵巣においても発現している
ことが知られていた（Oncogene.,5,1781−1786（199
0））。また、ヒトにおいては、広範囲の血液系・リン
パ系細胞で高発現をしていることが知られていた（LEUK
EMIA.,8,1663−1672（1994））。

発明の開示 本発明は、広範囲の血液系・リンパ系細胞や肝臓など
の器官の細胞で高度に機能するプロモーターを組み込ん
だベクターを作成し、該ベクターを血液系・リンパ系細
胞における遺伝子治療技術として提供することを目的と
する。

本発明者らは、造血幹細胞の増殖に関与していると考
えられているタンパク質である、Tecチロシンキナーゼ
が広範囲の血液細胞、リンパ系細胞または肝臓などの器
官の細胞で高発現をしていることに着目した。そして、
Tecチロシンキナーゼのプロモーターを、マウスのゲノ
ムDNAから単離した。次いで、該プロモーターを組み込
んだベクターを作成し、該プロモーターの下流に外来遺
伝子を直結させて、細胞内での外来遺伝子の発現を試み
た。この結果、外来遺伝子が、実際に、細胞内で高発現
することを見い出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、 （１） 配列番号:1に記載の塩基配列の少なくとも一部
を含みプロモーター活性を有するDNA、 （２） （１）記載のDNAを含む発現ベクター、および （３） （２）記載の発現ベクターを保持する細胞、 に関する。

本発明において、「プロモーター活性を有するDNA」
とは、該DNAに隣接するDNA領域の転写を誘導する活性を
有するDNAのことを指す。本発明には、配列番号:1に記
載された塩基配列を有するDNAの他に、該塩基配列の一
部を有するDNAでプロモーター活性を有するものも含ま
れる。本発明のDNAは、一般に50bp程度以上の長さを有
するものが好ましく、100bp程度以上の長さを有するも
のがより好ましく、200bp程度以上の長さを有するもの
がより好ましく、300bp程度以上の長さを有するものが
より好ましい。

また、本発明においてプロモーター活性を有するDNA
が導入される骨格となる「ベクター」としては、基本的
には全ての遺伝子導入用ベクターが用いられるが、特に
遺伝子治療においては、レトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど
のウイルスベクターの他、リポソームなどの非ウイルス
ベクターが好適である。

さらに、本発明において「発現ベクターを保持する細
胞」としては、あらゆる種類の細胞が考えられるが、実
際にTecチロシンキナーゼ遺伝子の発現が確認されてい
る造血幹細胞、骨髄系血液細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの
血液細胞、リンパ系細胞や、肝臓、腎臓、心臓、卵巣な
どの体内の器官の細胞が好ましい。

図面の簡単な説明 図１は、本発明におけるマウスのTec遺伝子の５′フ
ランキング領域の塩基配列を示す図である。

図２は、マウスのTec遺伝子の５′フランキング領域
の断片及びそれに直結したルシフェラーゼ遺伝子を組み
込んだpUCOOLucをBA/F3細胞及びNIH 3T3細胞に導入した
際のルシフェラーゼ活性を示す図である。なお、コント
ロールとして、Tec遺伝子の５′フランキング領域の断
片を組み込まないpUCOOLucが用いられている。

発明を実施するための最良の形態 以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ マウスゲノムライブラリーの構成 高分子ゲノムDNAをBA/F3細胞から抽出した。次いで、
このDNAをSau3A I（宝酒造社製）で部分分解し、バクテ
リアのアルカリフォスファターゼ（BAP:宝酒造社製）で
脱リン酸化した。次に、このDNA断片をBamH Iで切断し
たEMBL3ベクター（ストラタジーン社製）に組み込み、
「Gigapack Gold extracts」（ストラタジーン社製）を
用いてインビトロ（in vitro）でパッケイジングし、こ
の組換えファージを大腸菌株LE392に感染させた。

［実施例２］ マウスのTecプロモーターのスクリーニ
ング マウスのTec遺伝子のプロモーター領域を得るため
に、次に述べるようにPCRによってスクリーニングプロ
ーブを作製した。まず、tec cDNA（配列番号:2/On coge
ne,8,417−424（1993）参照）の15〜32番目及び122〜14
1番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドのプライ
マーを合成し、マウスのtec cDNAの５′領域を増幅する
ために使用した。PCRによる増幅は、10ngのマウスのtec
cDNAを鋳型として行った。次に、このPCR生成物（約12
7bp）を精製し、³²Pで放射標識し、これをプローブとし
てマウスのゲノムライブラリーに対しスクリーニングを
行った。ハイブリダイゼーションは、5X SSC（1X SSC:1
50mM NaCl,15mM Na−Citrate）、5Xデンハルト溶液（1m
g/mlポロビニルピロリドン、1mg/mlウシ血清アルブミ
ン、1mg/mlフィコール）、0.5％SDS、100ng/mlサケ精子
DNA、及び、³²Pで放射標識したPCR断片を含む溶液中
で、65℃、一晩行った。フィルターは、2X SSC/0.1％SD
S中、55℃で20分間２回洗浄し、次いで、0.2X SSC/0.1
％SDS中、55℃で20分間２回洗浄した。シグナルは、増
幅スクリーンと共に、フィルターを「Kodak XAR Films
（Kodak）」に−80℃で24〜72時間さらすことにより検
出した。この結果、13個の陽性クローンを得た。この得
られた陽性クローンに対し、tec cDNAの15〜39番目の配
列に対応するヌクレオチドを同様に放射標識してプロー
ブとして用い、二次スクリーニングを行った。ハイブリ
ダイゼーションは、温度条件を55℃とした以外は、上記
の場合と同様の条件で行い、洗浄は、2X SSC/0.1％SDS
中、55℃で20分間２回行った。この結果、２個の陽性ク
ローンが得られた。

［実施例３］ マウスのTec遺伝子の転写開始部位の解
析 マウスのTec遺伝子の転写開始部位の解析を行うため
に、次に述べるようにRACE−PCRを行った。まず、BA/F3
細胞から５μｇのmRNAを抽出し、これに対しアンチセン
スプライマーとしてtec cDNAの358〜374番目（以下塩基
の番号は配列番号:2に従う）のヌクレオチドに対応する
ヌクレオチドである５′−TTAGCATCATGAACAAC−３′
（プライマー１）を用いて、アニーリングを行い、さら
にcDNAの合成及びｄ（Ａ）テイリングを行った。次い
で、これを鋳型として、tec cDNAの227〜247番目のヌク
レオチドに対応するヌクレオチドである５′−CCTTACCC
TCATAGTAGCTCA−３′（プライマー２）及び５′−GACTC
GAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT−３′（プライマー−
３）をプライマーとして用い、一次PCRを行った。一次P
CRは、94℃で40秒、55℃で２分、72℃で３分を40サイク
ル行った。さらに、プライマー２及びプライマー３に代
えて、tec cDNAの122〜141番目のヌクレオチドに対応す
るヌクレオチドである５′−TCAACACTATCCTAGAAGAG−
３′（プライマー４）及び５′−GACTCGAGTCGACATCG−
３′（プライマー５）を用いた以外は、一次PCRと同様
の条件で、二次PCRを行った。なお、本実験のネガティ
ブコントロールとして逆転写酵素を用いずにRACE−PCR
を行った。次いで、このPCR生成物に対しアガロース電
気泳動を行い、エチヂウムブロマイド（EtBr）で染色し
た。この結果、逆転写酵素を用いて、RACE−PCRを行っ
た場合にのみ、約250bpのPCR生成物が検出された。さら
に目的とした領域が増幅されたかを確認するために、PC
R生成物をアガロース電気泳動後に、ニトロセルロース
膜に転写した。これに対し、tec cDNAの15〜39番目のヌ
クレオチドに対応するヌクレオチドである５′−GCAGTT
TGGACGTCGCTCTGTCTTG−３′を³²Pで放射標識し、ハイブ
リダイゼーションを行った。この結果、PCR生成物に
は、tec cDNAの５′領域の大部分が含まれており、RACE
−PCRによって正確にtec mRNAが増幅されたことがわか
った。

得られたDNA断片の５′側の配列を決定したところ、
ポリＴ配列に続いて８クローン中７クローンにおいて同
一の配列（５′−CGCAGTTTGG・・・・）が確認されたの
で、該配列の５′末端の「Ｃ」を転写開始点と同定し
た。なお、該転写開始点は図１中矢印で示されている。

［実施例４］ マウスのTec遺伝子の５′フランキング
領域の解析 ジデオキシ法によってマウスのTec遺伝子の５′フラ
ンキング領域の塩基配列の決定を行った。決定された配
列を図１及び配列番号:1に示す。この結果、５′フラン
キング領域には、明確にTATAボックスやCAATボックスと
同定できる配列が存在しなかった。その代わり、GATAや
SP−１因子の結合共通配列が存在した（図１）。

［実施例５］ マウスのTec遺伝子が５′フランキング
領域のプロモーター活性の解析 マウスのTec遺伝子の５′フランキング領域の一部と
エクソン１（−409〜＋22の領域）からなる断片をプロ
モーターを含まない発現ベクターであるpUCOOLucに組み
込み、これをtec mRNAを高発現する細胞であるBA/F3細
胞及びtec mRNAを発現しない細胞であるNIH 3T3細胞に
導入した。この導入には、まず、1X10⁷個の成長期にあ
る細胞をPBSで洗浄後、500μｇのDEAE−デキストラン
（ファルマシア社製）及び10μｇのレポータープラスミ
ドDNAを室温で25分インキュベートした。次いで、この
細胞を100μＭのクロロキンを含む培養液中で、37℃で
１時間培養した。この培養は、５％の二酸化炭素中で行
われた。さらに、この細胞をPBSで洗浄後、培養液中で4
8時間インキュベートし、「Luciferase Assay System」
（プロメガ社製）によるルシフェラーゼ解析のために収
穫した。なお、本実験のコントロールとして５′領域の
断片を組み込まないpUCOOLucを導入したものを用いた。
ルシフェラーゼ活性の解析は常法（「Luciferase Assay
System」（プロメガ社製）のマニュアルに記載の方
法）に従って行った。

この結果、５′領域の断片を組み込んだpUCOOLucを導
入した場合、BA/F3細胞では、NIH 3T3細胞の10倍のルシ
フェラーゼ活性が検出された（図２）。一方、コントロ
ールでは、いずれの細胞でもルシフェラーゼ活性は検出
されなかった（図２）。この結果、マウスのTec遺伝子
の５′フランキング領域には、プロモーター活性がある
ことが示された。

なお、当業者であれば、Exo IIIまたはBal31などのエ
キソヌクレアーゼ分解または制限酵素による分解等を利
用して、配列番号:1に記載の塩基配列を有するプロモー
ターよりも長さの短いDNAを得たのち、本実施例記載の
方法によって、該DNA断片のプロモーター活性を調べる
ことによって、より短い長さのプロモーターを取得し同
定することが可能であることはいうまでもない。

産業上の利用の可能性 本発明によって、広範囲の血液細胞、リンパ系細胞ま
たは肝臓など器官の細胞で高発現をしているTecチロシ
ンキナーゼのプロモーターが、単離され、その構造が解
明された。さらに、本発明によって、該プロモーターを
組み込んだベクターが作成され、造血幹細胞や肝臓細胞
などにおいて外来遺伝子を高発現させることが可能とな
った。これにより、特に、血液細胞や肝臓など器官の細
胞における遺伝子治療の分野において、大きな飛躍が期
待される。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５［12］（1990) ｐ．1781−1786 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８［２］（1993) ｐ．417−424 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，223［２］（14. Ｊｕｎｅ．1996）ｐ．422−426 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも
   一部を含みプロモーター活性を有するDNA。
2. 【請求項２】請求項１記載のDNAを含む発現ベクター。
3. 【請求項３】請求項２記載の発現ベクターを保持する細
   胞。