JPH0923889A - メタロプロテイナーゼ−３の組織インヒビターに対する新規なプロモーターを用いる細胞特異的遺伝子療法 - Google Patents
メタロプロテイナーゼ−３の組織インヒビターに対する新規なプロモーターを用いる細胞特異的遺伝子療法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞特異的遺伝子療法を可能にするメタロプ
ロテイナーゼ−３の組織インヒビターに対するプロモー
ターの提供。 【解決手段】 以下のヌクレオチド配列 【化１】 の位置≦４６３〜≧−２からなるプロモーター活性ＤＮ
Ａフラグメントより構成されるメタロプロテイナーゼ−
３の組織インヒビターの遺伝子に対するプロモーターを
提供する。
ロテイナーゼ−３の組織インヒビターに対するプロモー
ターの提供。 【解決手段】 以下のヌクレオチド配列 【化１】 の位置≦４６３〜≧−２からなるプロモーター活性ＤＮ
Ａフラグメントより構成されるメタロプロテイナーゼ−
３の組織インヒビターの遺伝子に対するプロモーターを
提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はメタロプロテイナー
ゼ−３の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−３）の遺伝子に
対するプロモーター配列に関する。このインヒビターは
とくに、マクロファージおよび関節の滑膜細胞に見出さ
れている。
ゼ−３の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−３）の遺伝子に
対するプロモーター配列に関する。このインヒビターは
とくに、マクロファージおよび関節の滑膜細胞に見出さ
れている。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子療法のためのベ
クターのインビボ投与における本質的な問題の一つは、
投与されたベクターの標的細胞特異的な発現である。こ
れは原理的には、細胞特異的な転写因子によって活性化
され、その３′末端に結合する遺伝子配列を活性化する
細胞特異的プロモーターエレメントによって達成される
［Mullenの総説、Pharmac．Ther. 63, 199 (1994)；Har
risら，Gene Therapy 1, 170 (1994)］。したがって、
新規な細胞特異的プロモーターにはきわめて大きな需要
がある。
クターのインビボ投与における本質的な問題の一つは、
投与されたベクターの標的細胞特異的な発現である。こ
れは原理的には、細胞特異的な転写因子によって活性化
され、その３′末端に結合する遺伝子配列を活性化する
細胞特異的プロモーターエレメントによって達成される
［Mullenの総説、Pharmac．Ther. 63, 199 (1994)；Har
risら，Gene Therapy 1, 170 (1994)］。したがって、
新規な細胞特異的プロモーターにはきわめて大きな需要
がある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規な細胞特
異的プロモーターとしてＴＩＭＰ−３の遺伝子に対する
プロモーター配列を提供する。すなわち、本発明は以下
のヌクレオチド配列
異的プロモーターとしてＴＩＭＰ−３の遺伝子に対する
プロモーター配列を提供する。すなわち、本発明は以下
のヌクレオチド配列
【化２】 の位置≦４６３〜≧−２からなるプロモーター活性ＤＮ
Ａフラグメントより構成されるＴＩＭＰ−３遺伝子に対
するプロモーターを提供するものである。
Ａフラグメントより構成されるＴＩＭＰ−３遺伝子に対
するプロモーターを提供するものである。
【０００４】本発明はまた、上記ヌクレオチド配列の位
置≦４６３〜≧−１０、または位置≦１１２〜≧−２、
または位置≦１１２〜≧−１０より構成されるＴＩＭＰ
−３遺伝子に対するプロモーターを提供する。
置≦４６３〜≧−１０、または位置≦１１２〜≧−２、
または位置≦１１２〜≧−１０より構成されるＴＩＭＰ
−３遺伝子に対するプロモーターを提供する。
【０００５】本発明はまたさらに、上記遺伝子の発現を
調整するための上記プロモーターの使用、医薬の製造の
ための上記プロモーターの使用、ならびに遺伝子診断お
よび遺伝子療法のための上記プロモーターの使用を包含
する。
調整するための上記プロモーターの使用、医薬の製造の
ための上記プロモーターの使用、ならびに遺伝子診断お
よび遺伝子療法のための上記プロモーターの使用を包含
する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のプロモーター配列の特徴
を以下に詳述する。 １．ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子の５′フランキングプロモ
ーター配列の単離および配列分析 Ｇ０→Ｓ進行時におけるＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの誘導は
主としてＴＩＭＰ−３遺伝子の転写活性化に由来する
［Wickら，J．Biol. Chem. 269, 18963 (1994)］。ヒト
ＴＩＭＰ−３遺伝子の５′フランキング配列がクローン
化され、ＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの転写開始点が決定さ
れ、隣接プロモーター領域が構造／機能分析に付され
た。これらの検討により、Ｇ０→ＳおよびＧ１→Ｓ進行
時における特異的ＴＩＭＰ−３発現の基盤を形成する調
節機構が解明されるはずである。
を以下に詳述する。 １．ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子の５′フランキングプロモ
ーター配列の単離および配列分析 Ｇ０→Ｓ進行時におけるＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの誘導は
主としてＴＩＭＰ−３遺伝子の転写活性化に由来する
［Wickら，J．Biol. Chem. 269, 18963 (1994)］。ヒト
ＴＩＭＰ−３遺伝子の５′フランキング配列がクローン
化され、ＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの転写開始点が決定さ
れ、隣接プロモーター領域が構造／機能分析に付され
た。これらの検討により、Ｇ０→ＳおよびＧ１→Ｓ進行
時における特異的ＴＩＭＰ−３発現の基盤を形成する調
節機構が解明されるはずである。
【０００７】それに先立って、ゲノムのサザンブロット
分析により、ＴＩＭＰ−３がヒトゲノムにおいて単一遺
伝子を表すのか、またはＴＩＭＰ−３遺伝子あるいはさ
らにＴＩＭＰ−３偽似遺伝子には幾つかの遺伝子座が存
在するのかを決定した。この目的では、ゲノムＤＮＡを
ＷＩ−３８細胞から単離し、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ、ＰｓｔＩならびにＨｉｎｄ IIIで処理し、サ
ザンブロット分析に付した。放射標識プローブとしては
６９０ｂｐ長の３′−ＴＩＭＰ−３ｃＤＮＡフラグメン
トを使用した。このプローブはすべての場合、１個の特
異的ＤＮＡフラグメントのみを認識したことから、ヒト
ゲノムには１個のユニークなＴＩＭＰ−３遺伝子のみが
存在すると推定できた。
分析により、ＴＩＭＰ−３がヒトゲノムにおいて単一遺
伝子を表すのか、またはＴＩＭＰ−３遺伝子あるいはさ
らにＴＩＭＰ−３偽似遺伝子には幾つかの遺伝子座が存
在するのかを決定した。この目的では、ゲノムＤＮＡを
ＷＩ−３８細胞から単離し、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ、ＰｓｔＩならびにＨｉｎｄ IIIで処理し、サ
ザンブロット分析に付した。放射標識プローブとしては
６９０ｂｐ長の３′−ＴＩＭＰ−３ｃＤＮＡフラグメン
トを使用した。このプローブはすべての場合、１個の特
異的ＤＮＡフラグメントのみを認識したことから、ヒト
ゲノムには１個のユニークなＴＩＭＰ−３遺伝子のみが
存在すると推定できた。
【０００８】５′フランキングＴＩＭＰ−３遺伝子配列
を単離するためには、ゲノムＷＩ−３８遺伝子ライブラ
リーからの約７×１０5個のファージを、３００ｂｐ長
の５′−ＴＩＭＰ−３ｃＤＮＡフラグメントとハイブリ
ダイズさせた。この初期の検討後に単離された１３個の
組換えファージクローン中の４個はＴＩＭＰ−３ｃＤＮ
Ａの５′末端領域からの３０ｂｐ長オリゴヌクレオチド
によっても認識された。これらのファージは多分ＡＴＧ
開始コドンに隣接する５′配列領域も含有すると考えら
れたことから、ファージクローンの一つを選択して詳細
な特徴の解明と分析を実施した。各種制限エンドヌクレ
アーゼを組み合わせて処理し、ついでサザンブロット分
析を行い、このファージにおける１３ｋｂ長のゲノムＤ
ＮＡインサートは約４７ｋｂの５′フランキングＴＩＭ
Ｐ−３遺伝子配列を含有することが決定できた。約１５
００ｂｐの５′フランキング遺伝子領域のヌクレオチド
配列が二本鎖の配列分析によって決定された。この目的
で、エキソヌクレアーゼ III処理によって調製されたク
ローン化５′遺伝子領域の５′トランケーションを図１
に例示する。
を単離するためには、ゲノムＷＩ−３８遺伝子ライブラ
リーからの約７×１０5個のファージを、３００ｂｐ長
の５′−ＴＩＭＰ−３ｃＤＮＡフラグメントとハイブリ
ダイズさせた。この初期の検討後に単離された１３個の
組換えファージクローン中の４個はＴＩＭＰ−３ｃＤＮ
Ａの５′末端領域からの３０ｂｐ長オリゴヌクレオチド
によっても認識された。これらのファージは多分ＡＴＧ
開始コドンに隣接する５′配列領域も含有すると考えら
れたことから、ファージクローンの一つを選択して詳細
な特徴の解明と分析を実施した。各種制限エンドヌクレ
アーゼを組み合わせて処理し、ついでサザンブロット分
析を行い、このファージにおける１３ｋｂ長のゲノムＤ
ＮＡインサートは約４７ｋｂの５′フランキングＴＩＭ
Ｐ−３遺伝子配列を含有することが決定できた。約１５
００ｂｐの５′フランキング遺伝子領域のヌクレオチド
配列が二本鎖の配列分析によって決定された。この目的
で、エキソヌクレアーゼ III処理によって調製されたク
ローン化５′遺伝子領域の５′トランケーションを図１
に例示する。
【０００９】以下に記載する構造／機能分析によりＴＩ
ＭＰ−３プロモーター機能にとくに重要なことが明らか
にされた配列領域を図２に示す。ＴＩＭＰ−３プロモー
ター配列中に、既知の転写因子の結合部位、とくに４Ｓ
ｐ１結合部位、ＮＦ１と考えられる結合部位およびＣ／
ＥＢＰ結合部位（図２中に表示）に類似する多数のエレ
メントを同定するためにはコンピューター支援分析を使
用した。
ＭＰ−３プロモーター機能にとくに重要なことが明らか
にされた配列領域を図２に示す。ＴＩＭＰ−３プロモー
ター配列中に、既知の転写因子の結合部位、とくに４Ｓ
ｐ１結合部位、ＮＦ１と考えられる結合部位およびＣ／
ＥＢＰ結合部位（図２中に表示）に類似する多数のエレ
メントを同定するためにはコンピューター支援分析を使
用した。
【００１０】２．ＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの転写開始点の
マッピング 転写の開始のための開始点を確立するためには、ＴＩＭ
Ｐ−３ｍＲＮＡの５′末端をプライマー伸長分析によっ
て決定した。これによって、ＡＴＧ開始コドン（図２に
表示）から３６４ｂｐ５′に位置する転写開始点（ヌク
レオチド配列：ＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴＣＧＧ）
が同定された。開始点の上流に位置するヌクレオチド配
列の詳細な検討にもかかわらず、ＴＡＴＡボックスもＴ
ＡＴＡ様配列も見出されなかった。
マッピング 転写の開始のための開始点を確立するためには、ＴＩＭ
Ｐ−３ｍＲＮＡの５′末端をプライマー伸長分析によっ
て決定した。これによって、ＡＴＧ開始コドン（図２に
表示）から３６４ｂｐ５′に位置する転写開始点（ヌク
レオチド配列：ＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴＣＧＧ）
が同定された。開始点の上流に位置するヌクレオチド配
列の詳細な検討にもかかわらず、ＴＡＴＡボックスもＴ
ＡＴＡ様配列も見出されなかった。
【００１１】３．ＴＩＭＰ−３プロモーター配列の活性
の検討 正常に増殖している細胞、静止期細胞および血清刺激細
胞におけるＴＩＭＰ−３プロモーター配列の活性を決定
し、機能的に重要なプロモーター領域の冒頭の指標を得
るためには、配列決定に用いられた５′がトランケート
されたプロモーターフラグメント（図１参照）を、プロ
モーターをもたないｐＸＰ−２ベクター［Nordeen, Bio
techniques 6, 454 (1988)］中のルシフェラーゼ遺伝子
の上流にクローニングした。その著しく低いベースライ
ン活性により、このレポーター構築体は一時的発現分析
の実施にとくに適している。
の検討 正常に増殖している細胞、静止期細胞および血清刺激細
胞におけるＴＩＭＰ−３プロモーター配列の活性を決定
し、機能的に重要なプロモーター領域の冒頭の指標を得
るためには、配列決定に用いられた５′がトランケート
されたプロモーターフラグメント（図１参照）を、プロ
モーターをもたないｐＸＰ−２ベクター［Nordeen, Bio
techniques 6, 454 (1988)］中のルシフェラーゼ遺伝子
の上流にクローニングした。その著しく低いベースライ
ン活性により、このレポーター構築体は一時的発現分析
の実施にとくに適している。
【００１２】３.１．正常増殖および血清刺激ＮＩＨ３
Ｔ３細胞におけるＴＩＭＰ−３プロモーター配列の活性 単離されたＴＩＭＰ−３プロモーター配列が一時的発現
分析において活性であること、すなわち、ルシフェラー
ゼレポーター遺伝子の転写を制御できることを示すため
には、ＴＩＭＰ−３プロモーター欠失構築体−１０１０
（ヌクレオチド−１０１０〜＋２８１から構成される。
図１参照）をＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、
これらの正常増殖または血清刺激トランスフェクト細胞
におけるルシフェラーゼ活性を測定した。比較のため、
ヘルペスウイルスｔｋプロモーター［ｐＴ８１；Lucibe
llo & Mueller, Meth．Mol. Cell Biol. 1, 9 (198
9)］、５×ＴＲＥ最小プロモーター［Angelら, Mol. Cel
l Biol. 7, 2256 (1987)］、ＲＳＶ−ＬＴＲ［Setoyama
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3213 (1986)］も
しくはヒトサイクリンＤ１プロモーターの９３７ｂｐ長
フラグメント［Herberら, Oncogene 9, 1295 (1994)］
を含有する他のルシフェラーゼ−プロモーター構築体に
ついてさらに発現を測定した。これらの検討の結果を表
１に示す。
Ｔ３細胞におけるＴＩＭＰ−３プロモーター配列の活性 単離されたＴＩＭＰ−３プロモーター配列が一時的発現
分析において活性であること、すなわち、ルシフェラー
ゼレポーター遺伝子の転写を制御できることを示すため
には、ＴＩＭＰ−３プロモーター欠失構築体−１０１０
（ヌクレオチド−１０１０〜＋２８１から構成される。
図１参照）をＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、
これらの正常増殖または血清刺激トランスフェクト細胞
におけるルシフェラーゼ活性を測定した。比較のため、
ヘルペスウイルスｔｋプロモーター［ｐＴ８１；Lucibe
llo & Mueller, Meth．Mol. Cell Biol. 1, 9 (198
9)］、５×ＴＲＥ最小プロモーター［Angelら, Mol. Cel
l Biol. 7, 2256 (1987)］、ＲＳＶ−ＬＴＲ［Setoyama
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3213 (1986)］も
しくはヒトサイクリンＤ１プロモーターの９３７ｂｐ長
フラグメント［Herberら, Oncogene 9, 1295 (1994)］
を含有する他のルシフェラーゼ−プロモーター構築体に
ついてさらに発現を測定した。これらの検討の結果を表
１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】正常増殖ＮＩＨ３Ｔ３細胞中ＴＩＭＰ−３
プロモーター構築体Δ−１０１０の発現（表１Ａ）は、
５×ＴＲＥ最小プロモーター構築体の場合よりも約３
倍、サイクリンＤ１プロモーター構築体の場合よりも７
倍、高かった。ＲＳＶ−ＬＴＲレポータープラスミドの
みがより高い活性を示し、ＴＩＭＰ−３プロモーター構
築体の場合よりも約２倍高かった。これらの結果は、ヒ
トＴＩＭＰ−３プロモーターは比較的高い転写活性をも
つことを指示している。表１Ｂおよび図３に示すよう
に、ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体Δ−１０１０はま
た、２日間血清を枯渇させたのちに２０％ＦＣＳで４時
間刺激した細胞中でも明らかに誘導された。静止期（Ｇ
０）細胞と比較して、この場合の発現は約７〜８倍まで
増大し、これは５×ＴＲＥレポーター構築体およびサイ
クリンＤ１プロモーター構築体の場合に認められた誘導
より、それぞれ約３５倍および２４倍高かった。これに
対し、単純ヘルペスｔｋプロモーター−ルシフェラーゼ
構築体（ｐＴ８１）では、血清刺激後、その発現を認め
なかった
プロモーター構築体Δ−１０１０の発現（表１Ａ）は、
５×ＴＲＥ最小プロモーター構築体の場合よりも約３
倍、サイクリンＤ１プロモーター構築体の場合よりも７
倍、高かった。ＲＳＶ−ＬＴＲレポータープラスミドの
みがより高い活性を示し、ＴＩＭＰ−３プロモーター構
築体の場合よりも約２倍高かった。これらの結果は、ヒ
トＴＩＭＰ−３プロモーターは比較的高い転写活性をも
つことを指示している。表１Ｂおよび図３に示すよう
に、ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体Δ−１０１０はま
た、２日間血清を枯渇させたのちに２０％ＦＣＳで４時
間刺激した細胞中でも明らかに誘導された。静止期（Ｇ
０）細胞と比較して、この場合の発現は約７〜８倍まで
増大し、これは５×ＴＲＥレポーター構築体およびサイ
クリンＤ１プロモーター構築体の場合に認められた誘導
より、それぞれ約３５倍および２４倍高かった。これに
対し、単純ヘルペスｔｋプロモーター−ルシフェラーゼ
構築体（ｐＴ８１）では、血清刺激後、その発現を認め
なかった
【００１５】図３は、静止期細胞の血清刺激後における
Δ−１０１０ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体の誘導の
キネティクスを示す。ルシフェラーゼ活性は１時間後に
のみ上昇を示し、４時間後に最高値、７倍誘導に到達し
た。
Δ−１０１０ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体の誘導の
キネティクスを示す。ルシフェラーゼ活性は１時間後に
のみ上昇を示し、４時間後に最高値、７倍誘導に到達し
た。
【００１６】要約すると、これらの結果から、使用した
Δ−１０１０ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体は、効率
的な転写および血清による誘導性に要求される、すべて
ではないとしても必須の調整エレメントを有すると結論
できる。
Δ−１０１０ＴＩＭＰ−３プロモーター構築体は、効率
的な転写および血清による誘導性に要求される、すべて
ではないとしても必須の調整エレメントを有すると結論
できる。
【００１７】３.２．ＴＩＭＰ−３プロモーター配列の
構造および機能分析 単離されたＴＩＭＰ−３プロモーター配列の構造および
機能分析では、ベースライン発現および血清誘導性のた
めに機能的に重要なプロモーター領域の冒頭の指標の提
供が意図された。この目的では、プロモーターの配列決
定のために調製しｐＸＰ２ベクター中に再クローン化さ
れた各種ＴＩＭＰ−３プロモーター欠失構築体（図１参
照）の活性を一時的発現分析で測定した。正常増殖ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞中での各種欠失構築体のベースライン発現
の分析により（図４）３つの重要な結果が得られた。
構造および機能分析 単離されたＴＩＭＰ−３プロモーター配列の構造および
機能分析では、ベースライン発現および血清誘導性のた
めに機能的に重要なプロモーター領域の冒頭の指標の提
供が意図された。この目的では、プロモーターの配列決
定のために調製しｐＸＰ２ベクター中に再クローン化さ
れた各種ＴＩＭＰ−３プロモーター欠失構築体（図１参
照）の活性を一時的発現分析で測定した。正常増殖ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞中での各種欠失構築体のベースライン発現
の分析により（図４）３つの重要な結果が得られた。
【００１８】１．最も強い発現はプロモーター構築体Δ
−１０１０によって示された．さらに８５ｂｐまでトラ
ンケートすると（構築体Δ−９２５）、プロモーター活
性にほぼ２分の１までの低下を生じた。これは転写の活
性化に関与する１もしくは２以上のエレメントが位置−
１０１０〜−９２５の間の領域に存在することを指示す
るものである。
−１０１０によって示された．さらに８５ｂｐまでトラ
ンケートすると（構築体Δ−９２５）、プロモーター活
性にほぼ２分の１までの低下を生じた。これは転写の活
性化に関与する１もしくは２以上のエレメントが位置−
１０１０〜−９２５の間の領域に存在することを指示す
るものである。
【００１９】２．５′末端を位置−１１２までさらにト
ランケートしてもプロモーター活性には有意な影響はな
かった。したがって、この−９２５〜−１１２の領域に
は、多分プロモーター活性に重要な配列領域は含まれて
いないと考えられる。
ランケートしてもプロモーター活性には有意な影響はな
かった。したがって、この−９２５〜−１１２の領域に
は、多分プロモーター活性に重要な配列領域は含まれて
いないと考えられる。
【００２０】３．これに対し、位置−１３００〜−１０
１０の領域はプロモーター活性に悪影響を及ぼすものと
思われ、これはプロモーター構築体Δ−１０１０に比較
してΔ−１３００欠失構築体の発現における約４分の１
への低下として表れる。
１０の領域はプロモーター活性に悪影響を及ぼすものと
思われ、これはプロモーター構築体Δ−１０１０に比較
してΔ−１３００欠失構築体の発現における約４分の１
への低下として表れる。
【００２１】最後の実験では、各種ＴＩＭＰ−３プロモ
ーター欠失構築体の血清誘導性を分析した。表１に記載
のようにして実施されたこれらの発現分析の結果を図４
ｂに示す。正常増殖細胞（図４ａ）、静止期細胞および
血清刺激細胞（図４ｂ）の間の発現像には顕著な類似性
が認められる。しかしながら、静止期細胞における発現
レベルは増殖細胞の場合の約２分の１程度低く、４時間
の血清刺激後に２９〜８５倍に誘導された。増殖細胞で
示されたように（図４ａ）、静止期細胞および血清刺激
細胞においても、位置−１３００〜−１０１０の領域は
プロモーター活性に悪影響を及ぼすが、構築体Δ−１３
００の血清誘導性には影響はみられなかった（８５倍の
誘導）。この場合にも、最高のルシフェラーゼ活性は同
様に欠失構築体−１０１０で測定された。さらに、位置
−６６０までの５′末端のトランケーションでもプロモ
ーター活性には１５分の１から２分の１への低下を生じ
たのみであった。しかしながら、これらの構築体（Δ−
１３００、Δ−１０１０、Δ−９２５、Δ−６６０）は
すべて、血清添加後に６〜８倍の明らかな誘導を示し
た。さらに２００ｂｐの位置−４６３までのトランケー
ション（Δ−４６３）でも、活性はさらに約２分の１に
低下したが、構築体の血清誘導性には同様に影響はなか
った。構築体Δ−１１２ではじめて血清誘導性に５０〜
６５％の低下を示し、血清刺激後にも発現は３倍にしか
増大しなかった。これは位置−４６３〜−１１２の領域
に、ＴＩＭＰ−３プロモーターの血清誘導性に重要な１
もしくは２以上のエレメントが含まれていることを指示
するものである。位置−４６３と−６６０の間および−
９２５と−１０１０の間の付加的な領域は、一般に、細
胞周期非依存性に、血清誘導プロモーター活性を増大さ
せる。
ーター欠失構築体の血清誘導性を分析した。表１に記載
のようにして実施されたこれらの発現分析の結果を図４
ｂに示す。正常増殖細胞（図４ａ）、静止期細胞および
血清刺激細胞（図４ｂ）の間の発現像には顕著な類似性
が認められる。しかしながら、静止期細胞における発現
レベルは増殖細胞の場合の約２分の１程度低く、４時間
の血清刺激後に２９〜８５倍に誘導された。増殖細胞で
示されたように（図４ａ）、静止期細胞および血清刺激
細胞においても、位置−１３００〜−１０１０の領域は
プロモーター活性に悪影響を及ぼすが、構築体Δ−１３
００の血清誘導性には影響はみられなかった（８５倍の
誘導）。この場合にも、最高のルシフェラーゼ活性は同
様に欠失構築体−１０１０で測定された。さらに、位置
−６６０までの５′末端のトランケーションでもプロモ
ーター活性には１５分の１から２分の１への低下を生じ
たのみであった。しかしながら、これらの構築体（Δ−
１３００、Δ−１０１０、Δ−９２５、Δ−６６０）は
すべて、血清添加後に６〜８倍の明らかな誘導を示し
た。さらに２００ｂｐの位置−４６３までのトランケー
ション（Δ−４６３）でも、活性はさらに約２分の１に
低下したが、構築体の血清誘導性には同様に影響はなか
った。構築体Δ−１１２ではじめて血清誘導性に５０〜
６５％の低下を示し、血清刺激後にも発現は３倍にしか
増大しなかった。これは位置−４６３〜−１１２の領域
に、ＴＩＭＰ−３プロモーターの血清誘導性に重要な１
もしくは２以上のエレメントが含まれていることを指示
するものである。位置−４６３と−６６０の間および−
９２５と−１０１０の間の付加的な領域は、一般に、細
胞周期非依存性に、血清誘導プロモーター活性を増大さ
せる。
【００２２】５′フランキングＴＩＭＰ−３遺伝子領域
の特徴の解明ならびに構造および機能分析の結果は次の
ようにまとめることができる。すなわち、ＴＩＭＰ−３
はＴＡＴＡボックスを含まない遺伝子である。しかしな
がら転写は、ＡＴＧ開始コドンの３６４ｂｐ上流の１個
の開始点のみで開始される。他のプロモーターに比べて
ＴＩＭＰ−３プロモーター配列は比較的高い活性を有
し、これには最初の１１２ｂｐで十分である。この領域
には多くのＳｐ１結合部位が配置されている。さらに、
静止期細胞の血清刺激後にはその活性の明らかな誘導が
認められ、そのキネティクスはＧ０→Ｓ進行時における
ＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの発現に相当する。その血清誘導
性に関与する調整エレメントは位置−１１２と−４６３
の間の領域に配置されている。
の特徴の解明ならびに構造および機能分析の結果は次の
ようにまとめることができる。すなわち、ＴＩＭＰ−３
はＴＡＴＡボックスを含まない遺伝子である。しかしな
がら転写は、ＡＴＧ開始コドンの３６４ｂｐ上流の１個
の開始点のみで開始される。他のプロモーターに比べて
ＴＩＭＰ−３プロモーター配列は比較的高い活性を有
し、これには最初の１１２ｂｐで十分である。この領域
には多くのＳｐ１結合部位が配置されている。さらに、
静止期細胞の血清刺激後にはその活性の明らかな誘導が
認められ、そのキネティクスはＧ０→Ｓ進行時における
ＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡの発現に相当する。その血清誘導
性に関与する調整エレメントは位置−１１２と−４６３
の間の領域に配置されている。
【図１】５′フランキングＴＩＭＰ−３遺伝子領域のエ
キソヌクレアーゼ IIIトランケーションの模式図であ
る。配列決定を容易にするために、５′フランキングＴ
ＩＭＰ−３遺伝子領域の約１６００ｂｐを５′末端から
始めエキソヌクレアーゼ IIIで処理してトランケート
し、Bluescript SK (-) ベクターにクローニングした。
プラスミドの名称は５′トランケーションを表示する
（たとえばΔ−１３００は転写開始点から１３００ｂｐ
５′を含有する）。転写開始点は＋１で示す（図２参
照）。
キソヌクレアーゼ IIIトランケーションの模式図であ
る。配列決定を容易にするために、５′フランキングＴ
ＩＭＰ−３遺伝子領域の約１６００ｂｐを５′末端から
始めエキソヌクレアーゼ IIIで処理してトランケート
し、Bluescript SK (-) ベクターにクローニングした。
プラスミドの名称は５′トランケーションを表示する
（たとえばΔ−１３００は転写開始点から１３００ｂｐ
５′を含有する）。転写開始点は＋１で示す（図２参
照）。
【図２】ヒトＴＩＭＰ−３プロモーターの５００ｂｐお
よび５′非翻訳領域１０１ｂｐのヌクレオチド配列を示
す図である。ＧＣボックス（Ｓｐ１結合部位）、ＮＦ１
結合部位の可能性のある両半分、およびＣ／ＥＢＰ結合
部位に類似するエレメントに表示を付す。転写開始点は
矢印で指示する。
よび５′非翻訳領域１０１ｂｐのヌクレオチド配列を示
す図である。ＧＣボックス（Ｓｐ１結合部位）、ＮＦ１
結合部位の可能性のある両半分、およびＣ／ＥＢＰ結合
部位に類似するエレメントに表示を付す。転写開始点は
矢印で指示する。
【図３】２０％ＦＣＳによる刺激後静止期ＮＩＨ３Ｔ３
RT細胞におけるΔ−１０１０−ＴＩＭＰ−３プロモータ
ー−ルシフェラーゼ構築体の誘導キネティクスを示すグ
ラフである。７μｇのプラスミドＤＮＡをＤＥＡＥトラ
ンスフェクトしたのち、ＮＩＨ３Ｔ３RT細胞を無血清培
地中にて４０時間インキュベートし、２０％ＦＣＳで刺
激し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を指示さ
れた時間に測定した。
RT細胞におけるΔ−１０１０−ＴＩＭＰ−３プロモータ
ー−ルシフェラーゼ構築体の誘導キネティクスを示すグ
ラフである。７μｇのプラスミドＤＮＡをＤＥＡＥトラ
ンスフェクトしたのち、ＮＩＨ３Ｔ３RT細胞を無血清培
地中にて４０時間インキュベートし、２０％ＦＣＳで刺
激し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を指示さ
れた時間に測定した。
【図４】正常増殖、静止期および血清刺激ＮＩＨ３Ｔ３
RT細胞における５′トランケートＴＩＭＰ−３プロモー
ター−ルシフェラーゼ構築体の一時的発現分析を示す図
であり、プラスミドはそれらのトランケーションに従っ
て命名された（図１参照）。（ａ）は正常増殖ＮＩＨ３
Ｔ３RT細胞における分析結果を示し、（ｂ）は静止期お
よび２０％ＦＣＳで４時間刺激後のＮＩＨ３Ｔ３RT細胞
における（ａ）の場合と同じ構築体の分析結果を示す。
（ａ）および（ｂ）における実験は表１の場合と同様
に、互いに独立に調製されたプラスミドＤＮＡを用いて
３回行われた。標準偏差はバーで示す。バーがない場合
は標準偏差がきわめて小さく、グラフに表示できないこ
とを示す。
RT細胞における５′トランケートＴＩＭＰ−３プロモー
ター−ルシフェラーゼ構築体の一時的発現分析を示す図
であり、プラスミドはそれらのトランケーションに従っ
て命名された（図１参照）。（ａ）は正常増殖ＮＩＨ３
Ｔ３RT細胞における分析結果を示し、（ｂ）は静止期お
よび２０％ＦＣＳで４時間刺激後のＮＩＨ３Ｔ３RT細胞
における（ａ）の場合と同じ構築体の分析結果を示す。
（ａ）および（ｂ）における実験は表１の場合と同様
に、互いに独立に調製されたプラスミドＤＮＡを用いて
３回行われた。標準偏差はバーで示す。バーがない場合
は標準偏差がきわめて小さく、グラフに表示できないこ
とを示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 以下のヌクレオチド配列 【化１】 の位置≦４６３〜≧−２からなるプロモーター活性ＤＮ
Ａフラグメントより構成されるメタロプロテイナーゼ−
３の組織インヒビターの遺伝子に対するプロモーター。 - 【請求項２】 請求項１に掲げたヌクレオチド配列の 位置≦４６３〜≧−１０、または 位置≦１１２〜≧−２、または 位置≦１１２〜≧−１０ より構成されるメタロプロテイナーゼ−３の組織インヒ
ビターの遺伝子に対するプロモーター。 - 【請求項３】 遺伝子の発現を調整するための請求項１
または２に記載のプロモーターの使用。 - 【請求項４】 医薬の製造のための請求項１〜３に記載
のプロモーターの使用。 - 【請求項５】 診断方法のための請求項１〜３に記載の
プロモーターの使用。 - 【請求項６】 遺伝子療法のための請求項１〜３に記載
のプロモーターの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19524720:5 | 1995-07-12 | ||
| DE19524720A DE19524720A1 (de) | 1995-07-12 | 1995-07-12 | Zellspezifische Gentherapie mit Hilfe eines neuen Promotors für den "Tissue Inhibitor of Metalloproteinasn-3" |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0923889A true JPH0923889A (ja) | 1997-01-28 |
Family
ID=7766219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8181760A Pending JPH0923889A (ja) | 1995-07-12 | 1996-07-11 | メタロプロテイナーゼ−３の組織インヒビターに対する新規なプロモーターを用いる細胞特異的遺伝子療法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5854019A (ja) |
| EP (1) | EP0753580A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0923889A (ja) |
| CA (1) | CA2181022A1 (ja) |
| DE (1) | DE19524720A1 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999038429A1 (fr) * | 1998-01-28 | 1999-08-05 | Toto Ltd. | Radiateur thermique |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9506466D0 (en) | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
| CA2198462A1 (en) | 1994-08-26 | 1996-03-07 | Hans-Harald Sedlacek | Genetic therapy of diseases caused by the immune system, said therapy using a cell-specific active substance regulated by the cell cycle |
| DE19605279A1 (de) | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Hoechst Ag | Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung |
| DE19617851A1 (de) | 1996-05-03 | 1997-11-13 | Hoechst Ag | Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für Transportsignale |
| DE19639103A1 (de) * | 1996-09-24 | 1998-03-26 | Hoechst Ag | Nukleinsäurekonstrukte mit Hybridpromotoren für gentherapeutische Maßnahmen |
| DE19651443A1 (de) | 1996-12-11 | 1998-06-18 | Hoechst Ag | Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme |
| DE19701141C1 (de) * | 1997-01-16 | 1998-04-09 | Hoechst Ag | Genkonstrukte für durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen |
| EP0860445A1 (en) | 1997-02-18 | 1998-08-26 | Hoechst Aktiengesellschaft | New nucleotide sequences for the cell cycle regulated expression of structural genes |
| DE19751587A1 (de) | 1997-11-21 | 1999-07-29 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme |
| DE19756975A1 (de) | 1997-12-20 | 1999-06-24 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie einer Erkrankung |
| CZ121599A3 (cs) * | 1998-04-09 | 1999-10-13 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu |
| DE19900743A1 (de) | 1999-01-12 | 2000-07-13 | Aventis Pharma Gmbh | Neue komplexbildende Proteine |
| US20040248826A1 (en) * | 2003-06-03 | 2004-12-09 | Alberto Auricchio | Treatment of cancer by in vivo gene-transfer induced TIMP-3 expression |
| US7943374B2 (en) * | 2005-08-21 | 2011-05-17 | Markus Hildinger | Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb |
| US20090074733A1 (en) * | 2005-12-09 | 2009-03-19 | Medin Jeffrey A | Thymidylate kinase mutants and uses thereof |
| US20090068158A1 (en) * | 2005-12-09 | 2009-03-12 | Medin Jeffrey A | Thymidylate kinase mutants and uses thereof |
| EP2514823B1 (en) | 2006-03-03 | 2018-05-02 | ProMIS Neurosciences Inc. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases |
| CA2584494A1 (en) * | 2007-03-27 | 2008-09-27 | Jeffrey A. Medin | Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells |
| ES2654303T3 (es) | 2007-05-04 | 2018-02-13 | University Health Network | Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer |
| AU2008307643B9 (en) | 2007-09-28 | 2014-04-17 | Intrexon Corporation | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
| US8568709B2 (en) | 2008-03-20 | 2013-10-29 | University Health Network | Thymidylate kinase fusions and uses thereof |
| EP2920319B1 (en) | 2012-11-16 | 2020-02-19 | Poseida Therapeutics, Inc. | Site-specific enzymes and methods of use |
| EP3929286A1 (en) | 2015-06-17 | 2021-12-29 | Poseida Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome |
| WO2019126578A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Poseida Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6562596B1 (en) * | 1993-10-06 | 2003-05-13 | Amgen Inc. | Tissue inhibitor of metalloproteinase type three (TIMP-3) composition and methods |
| CA2198462A1 (en) * | 1994-08-26 | 1996-03-07 | Hans-Harald Sedlacek | Genetic therapy of diseases caused by the immune system, said therapy using a cell-specific active substance regulated by the cell cycle |
-
1995
- 1995-07-12 DE DE19524720A patent/DE19524720A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-07-08 EP EP96110962A patent/EP0753580A3/de not_active Withdrawn
- 1996-07-11 CA CA002181022A patent/CA2181022A1/en not_active Abandoned
- 1996-07-11 JP JP8181760A patent/JPH0923889A/ja active Pending
- 1996-07-12 US US08/679,217 patent/US5854019A/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO1999038429A1 (fr) * | 1998-01-28 | 1999-08-05 | Toto Ltd. | Radiateur thermique |
| US6294758B1 (en) | 1998-01-28 | 2001-09-25 | Toto Ltd | Heat radiator |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
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| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
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| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0753580A2 (de) | 1997-01-15 |
| EP0753580A3 (de) | 1998-10-07 |
| DE19524720A1 (de) | 1997-01-16 |
| CA2181022A1 (en) | 1997-01-13 |
| US5854019A (en) | 1998-12-29 |
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