JP2002520043A

JP2002520043A - 成長分化因子プロモーターおよびその用途

Info

Publication number: JP2002520043A
Application number: JP2000560157A
Authority: JP
Inventors: リアング，リ−フアング
Original assignee: メタモーフイクス・インコーポレーテツド
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-15
Publication date: 2002-07-09
Also published as: EP1097233B1; WO2000004051A3; HK1038572A1; US20070161002A1; AU5542799A; ES2318900T3; DK1097233T3; EP1097233A2; WO2000004051A9; ATE416257T1; US6555672B1; CA2333465A1; DE69940022D1; WO2000004051A2; CA2333465C

Abstract

(57)【要約】ＧＤＦプロモーター（例えばＧＤＦ−８プロモーター）を記述する。組織特異的な遺伝子発現を調節するため、およびＧＤＦ発現を調節する化合物を同定するためのＧＤＦプロモーターの使用方法もまた記述する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ＧＤＦ−８プロモーターのようなＧＤＦプロモーター、ならびにそ
れらの使用方法、例えばＧＤＦ−８発現の調節化合物のスクリーニング方法に関
する。

【０００２】（発明の背景）ＧＤＦ−８はＴＧＦ−βスーパーファミリーの１メンバーであり、このスーパ
ーファミリーは、胚の発生の調節および成体の哺乳動物における組織恒常性の維
持で重要な役割を演じる成長および分化因子の大きな一群を包含する。ＧＤＦ−
８は、骨格筋の成長の負の調節物質として特異的に機能するものとみなされ、従
って、筋系およびタンパク質の含量が比較的多くそして脂肪含量が少ない乳牛、
ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウおよびサカナのような家畜および狩猟
動物の生産で潜在的用途を有する。加えて、ＧＤＦ−８は、多様な細胞の増殖お
よび分化障害、とりわけヒトおよび動物双方の筋、神経および脂肪組織を巻き込
むもので潜在的用途を有する。ＧＤＦ−８はまた、ブドウ糖輸送にも関与してい
るようであり、そして、従って、糖尿病のようなブドウ糖輸送に関連する障害の
治療もしくは診断で潜在的用途を有する。

【０００３】筋およびタンパク質の含量を増大させかつ望ましくない高い脂肪および／もし
くはコレステロールのレベルを低下させるのに役立つとみられる多くの薬物およ
び食餌計画が存在するが、しかし、こうした治療は、一般的には事後に投与され
、そして、脈管構造に対してかなりの損傷が起こった後でのみ開始される。従っ
て、脂肪レベルのいかなる従属的な増大も伴わずにより高い筋含量を有する素因
を遺伝子的につくられている動物を生産することが望ましいとみられる。１９９
８年２月５日に出願されかつ「成長分化因子−８（ＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ−８）」と題された米国特許出願第０９／０
１９，０７０号、発明者リー（Ｓｅ−ＪｉｎＬｅｅ）とマクフェロン（Ａｌｅ
ｘａｎｄｒａＣ．ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）もまた、ＧＤＦ−８の産生ならびに潜
在的用途を記述している。この出願もまたこれにより引用により組込まれる。

【０００４】ＧＤＦ−８遺伝子発現の制御が高度に望ましい。一般に、当該技術分野におい
て、真核生物系の既知の遺伝子に負もしくは正のいずれかの制御能力を与えるこ
とが可能である別個のＤＮＡセグメントの利用可能性が欠けている。ＧＤＦ−８
の調節性遺伝子配列の単離を本発明に開示する。

【０００５】（発明の要約）本発明は、ＧＤＦ−８発現の分子調節、ならびに、とりわけ、ＧＤＦ−８遺伝
子プロモーターのようなＧＤＦ遺伝子プロモーターの調節配列の単離および同定
に関する。

【０００６】一態様において、本発明は、ＧＤＦ−８の発現を促進する遺伝子調節要素の完
全なヌクレオチド配列および同定を提供する。

【０００７】別の態様において、本発明は、例えばＧＤＦ−８発現を阻害もしくは刺激する
ことによりＧＤＦ−８発現を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。

【０００８】なお別の態様において、本発明は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に有効に連結され
るＧＤＦ−８プロモーターを含有するＤＮＡ発現構築物、ならびに、筋および他
の組織（例えばＧＤＦ−８が天然に発現される組織）中でのＧＯＩの発現方法を
提供する。

【０００９】（発明の詳細な記述）本明細書で使用されるところの「ＧＤＦプロモーター」という用語は、遺伝子
の転写および／もしくは発現を調節（例えば開始、アップレギュレートもしくは
ダウンレギュレート）するＧＤＦ遺伝子（例えば、ＧＤＦ−８または別の関連す
るもしくは別の相同な成長因子）の５’端の上流に配置されたヌクレオチド配列
要素を指す。例えば、ＧＤＦプロモーターは、遺伝子転写を開始するのに必要な
配列要素、エンハンサー要素、リプレッサー要素、および遺伝子発現を調節する
他のシスに作用する制御要素を包含する可能性がある。従って、「ＧＤＦプロモ
ーター」という用語は、本明細書で「ＧＤＦ調節領域」もしくは「ＧＤＦ制御領
域」という用語と互換性に使用する。

【００１０】「単離されたＧＤＦプロモーター」は、その天然の配列の情況から取り出され
ているＧＤＦプロモーターを指す。例えば、単離されたＧＤＦプロモーターは、
その天然の供給源からクローン化されるかもしくは別の方法で取り出され、そし
て例えば発現ベクター内に異種構造遺伝子の５’端から上流に挿入されたＧＤＦ
プロモーターであることができる。「ＧＤＦプロモーター」という用語はまた、
それがＧＤＦプロモーターの１種もしくはそれ以上の機能を表す（例えば、該プ
ロモーターに操作可能に連結される遺伝子の転写を駆動する）ＧＤＦプロモータ
ーに対する十分な相同性を有するヌクレオチド配列も指す。一般に、ＧＤＦプロ
モーターは、ＧＤＦ遺伝子の５’隣接領域由来である。

【００１１】本発明のＧＤＦプロモーターは、ＧＤＦ−８遺伝子もしくは相同な遺伝子（例
えばＧＤＦ−１１）のようないずれかのＧＤＦ遺伝子由来のものを包含する。そ
れが本明細書で使用されるところの「由来の」という用語は、本発明の単離され
たＧＤＦプロモーターの供給源もしくは起源を指す。例えば、特定のＧＤＦ遺伝
子（例えばＧＤＦ−８遺伝子）「由来」であるＧＤＦプロモーターは、天然に存
在するＧＤＦ遺伝子（例えばＧＤＦ−８遺伝子）のＧＤＦプロモーターにヌクレ
オチド配列が同一もしくは高度に相同であることができる。ＧＤＦ−８遺伝子の
ようなＧＤＦ遺伝子「由来」である本発明の単離されたＧＤＦプロモーターは、
１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換により改変され
ているがしかし本質的に同一の活性もしくは機能を保持するものもまた包含する
。

【００１２】「ＧＤＦ遺伝子」という用語は、限定するものでないがしかしヒト、ニワトリ
、乳牛、ヒツジ、サカナ、ブタおよびマウスを挙げることができるＧＤＦ遺伝子
を天然に保有するいずれからかのＧＤＦ遺伝子を指す。「ＧＤＦ遺伝子」は、Ｇ
ＤＦ遺伝子を天然に保有するいずれかの魚類、甲殻類もしくは軟体動物からのＧ
ＤＦ遺伝子もまた指す。特定の一態様において、本発明は、図２に示されるヌク
レオチド配列（配列番号１）の全部または一部分（もしくは複数の部分）を含ん
で成るヒトＧＤＦ−８プロモーター、ならびに、とりわけ、プロモーター配列の
活性に必要とされる領域中のヒトプロモーター配列に相同な領域を有する他の哺
乳動物からのＧＤＦ−８プロモーターを提供する。一般に、相同性のこの範囲は
約６０％ないし９０％、もしくはより大きい。例えば、ヒト（配列番号６）、マ
ウス（配列番号７）、ブタ（配列番号８）およびニワトリ（配列番号９）のＧＤ
Ｆ−８遺伝子からのＧＤＦ−８プロモーター内の相同な領域を図８に示す。

【００１３】従って、本発明のＧＤＦプロモーターは、配列番号１、４、５、６、７、８お
よび９に示されるヌクレオチド配列に最低６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上同一なヌクレオチド配
列を有しかつ該プロモーターに操作可能に連結される遺伝子の発現を調節するプ
ロモーターを包含する。２種の核酸配列の同一性パーセントを決定するには、至
適の比較の目的上、配列を整列する（例えば、至適の整列のために、第一および
第二の核酸配列の一方もしくは双方にギャップを導入することが可能であり、ま
た、非相同な配列は比較の目的上無視することができる）。好ましい一態様にお
いて、比較の目的上整列される参照配列の長さは、該参照配列の長さの最低３０
％、好ましくは最低４０％、より好ましくは最低５０％、なおより好ましくは最
低６０％、そしてなおより好ましくは最低７０％、８０％もしくは９０％である
。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中の
ある位置が第二の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有されて
いる場合には、それらの分子はその位置で同一である（本明細書で使用されると
ころの核酸の「同一性」は、核酸の「相同性」に同等である）。２種の配列の間
の同一性パーセントは、２種の配列の至適の整列のために導入されることが必要
であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これら配列により
共有される同一の位置の数の関数である。

【００１４】２種の配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴ
リズムを使用して達成することが可能である。好ましい一態様において、２種の
ヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマト
リックスならびに４０、５０、６０、７０もしくは８０のギャップ重み(gap wei
ght)および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重み(length weight)を使用し
て、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を使用して決定する。別の態様において、２種
のヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表(weigh
t residue table)、１２のギャップ長ペナルティ(gap length penalty)および４
のギャップペナルティ(gap penalty)を使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージ
ョン２．０）に組込まれたマイヤース（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）とミラー（Ｗ．Ｍｉ
ｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））を使
用して決定する。

【００１５】従って、本発明のＧＤＦプロモーターは、本明細書に提供される特定のＧＤＦ
プロモーター配列（例えばヒトＧＤＦ−８プロモーターに対応する配列番号１）
とＧＤＦ遺伝子の転写開始部位の５’の領域を比較すること、および活性のプロ
モーター配列に対応する相同な領域を探すことにより同定することが可能である
。本発明により提供される特定のＧＤＦ−８プロモーター配列はまた、標準的Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーションプロトコルを使用して（例えば高ストリンジェンシ
ーの条件下で）他の種からの相同な配列についてスクリーニングするのにも使用
することが可能である。

【００１６】本発明のＧＤＦプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの適正な結合および活性
化を確実にし、転写が開始することができる場所に影響し、そして転写のレベル
に影響を及ぼすＤＮＡ配列要素を含有する。加えて、刺激もしくは特定の化学種
に応答する遺伝子発現の調節（誘導および抑制）で機能性である特定の調節配列
もまた、該プロモーター配列内に包含することができる。

【００１７】ＤＮＡの「コーディング配列」、「コーディング領域」もしくは特定のタンパ
ク質「をコードする配列」は、適切な調節要素の制御下に配置される場合にイン
ビトロもしくはインビボでポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列であ
る。コーディング配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳終
止コドンにより決定される。コーディング配列は、限定されるものでないが、真
核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物、動物、鳥類、な
ど）供給源からのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ挙げることがで
きる。転写終止配列は通常、コーディング配列に対して３’に配置することがで
きる。

【００１８】本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、容易に定
量可能もしくは観察可能であるタンパク質をコードする遺伝子を指す。遺伝子の
調節は通常転写のレベルで起こるため、転写調節およびプロモーター活性は、し
ばしば、遺伝子産物の定量によりアッセイする。例えば、プロモーターの調節お
よび活性は、しばしば、容易にアッセイ可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ
Ｚ遺伝子の異種プロモーターへの融合（カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）とコ
ーエン（Ｃｏｈｅｎ）（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：１７９−２
０７）により定量的に研究されている。クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびルシフェラーゼの
構造遺伝子は、プロモーターもしくは他の調節配列の活性を検出するのに普遍的
に使用される他の遺伝子である。

【００１９】それが本明細書で使用されるところの「組織特異的発現」という用語は、細胞
型のあいだでの遺伝子発現の限定されたもしくは特徴的なパターンを指す。言い
換えれば、ある遺伝子の発現はある生物体のある種の組織で観察されるがしかし
他の組織で観察されない。例えば、ある遺伝子の「筋特異的」発現は、その遺伝
子が筋かつおそらく限定された他の組織で発現されるが、しかし全部の組織で（
例えば全体的に）発現されるわけでないことを示す。

【００２０】「ベクター」は、結合されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセ
グメントを結合することができるプラスミド、ファージ、もしくはコスミドのよ
うなレプリコンである。「発現ベクター」は、本発明のプロモーター領域を包含
する、所望の遺伝子の発現に必要な遺伝子要素を含有するいずれかのＤＮＡベク
ター（例えばプラスミドベクター）を意味する。これらの要素は該遺伝子に「操
作可能に連結」され、これは、それらが、遺伝子の転写に対する機能的影響をそ
れらが有することを可能にするベクター内のある位置に配置されることを意味す
る。調節要素は、それらがその発現を指図するよう機能する限りはコーディング
配列と連続的である必要はない。従って、例えば、介入する翻訳されないがそれ
でもなお転写される配列が、プロモーターとコーディング配列との間に存在する
可能性があり、そして、プロモーターはなおコーディング配列に「操作可能に連
結される」もしくは「操作可能な連結にある」とみなすことができる。

【００２１】細胞は、外因性ＤＮＡ（例えばトランスジーン(transgene)）が細胞膜の内側
に導入されている場合は、こうした外因性ＤＮＡにより「形質転換」されている
。外因性ＤＮＡは、該細胞のゲノムを含んで成る染色体ＤＮＡに組込まれていて
もよいか、もしくは組込まれていなくてもよい。とは言え、真核生物細胞に関し
ては、安定に形質転換された細胞は、その中で、外因性ＤＮＡが染色体の複製に
より娘細胞により遺伝されるような、それが染色体に組込まれたようになってい
るものである。

【００２２】「宿主細胞」は、外因性核酸分子により形質転換されているかもしくは形質転
換が可能である細胞である。

【００２３】「トランスジーン」は、細胞に導入されている核酸を指す。典型的には、トラ
ンスジーンは導入後に細胞のゲノムに組込まれる。トランスジーンは、細胞中で
発現されない、または低レベルでもしくは欠損形態で細胞中で発現されるタンパ
ク質をコードする可能性がある。

【００２４】「トランスジェニック動物」は、その細胞中に最低１種のトランスジーンをも
つ動物である。例えば、トランスジェニック動物は、動物の生殖細胞に導入され
ている別の種のある遺伝子に対応するトランスジーンをその細胞中に含有するこ
とが可能であり、その結果、導入された遺伝子が全部の体細胞および生殖細胞に
存在する。

【００２５】本発明のＧＤＦプロモーターの大きさは変動する可能性がある。一般に、プロ
モーター配列は、転写開始の部位に対し５’の向きで（もしくは上流に）およそ
５００塩基ないし３０００塩基の配列にわたるか、もしくはそれ内に配置される
。しかしながら、プロモーターは、転写開始の部位に対して５’におよそ４００
０ｂｐもしくはそれ以上からの配列を包含する可能性がある。異種構造遺伝子の
情況で使用される場合、転写開始部位に関するＧＤＦプロモーターの至適の位置
は変動する可能性がある。一般に、同一の利益は、ＧＤＦプロモーターが転写開
始部位から上流に約３００ヌクレオチドもしくはそれ以上までのどこかに配置さ
れる場合に得られるであろう。しかしながら、好ましい一態様においては、ＧＤ
Ｆプロモーターは転写開始部位の１５０ヌクレオチド内に配置される。

【００２６】大多数のプロモーターは一方向のみで転写の開始を制御する。従って、本発明
のＧＤＦプロモーターの制御下にあるためには、構造遺伝子は、一般に、ＧＤＦ
プロモーターの下流（３’の向きで）かつプロモーターに関して正しい向きで配
置されなければならない。１個もしくは数個の遺伝子が単一のＧＤＦプロモータ
ーの制御下にあることができるか、または、逆に１個もしくはそれ以上のＧＤＦ
プロモーターが単一の構造遺伝子を制御することができる。

【００２７】一態様において、ＧＤＦプロモーターは、ＧＤＦプロモーター内でＤＮＡ配列
に結合するＲＮＡポリメラーゼの能力を変えることにより、プロモーターに有効
に連結される遺伝子の発現を調節する。例えば、調節タンパク質は、転写を高め
るもしくは予防するために、ＲＮＡポリメラーゼ結合の位置でもしくはその近く
でＤＮＡ配列に結合することが可能である。あるいは、調節タンパク質（例えば
、インデューサーもしくはリプレッサー分子）は、ＲＮＡポリメラーゼそれ自身
と直接もしくは間接的に相互作用して、ＧＤＦプロモーターのＤＮＡ配列に対す
る認識および結合のその特異性を変えることが可能である。いずれの場合も、Ｇ
ＤＦプロモーター内の特定の配列（１種もしくは複数）が調節の機構に関与して
いる。

【００２８】「組換えＤＮＡ分子」という用語は、本明細書で、遺伝子工学の技術により、
例えば制限酵素のインビトロの使用もしくはＤＮＡリガーゼを使用する連結によ
り、異種ＤＮＡ配列がそれらの天然の供給源から人工的に切断もしくは一緒に連
結されているＤＮＡ分子を識別するのに使用する。

【００２９】本発明のＧＤＦプロモーターは、それらの天然の供給源（例えば、ヒト、マウ
ス、ニワトリ、ブタ、乳牛、サカナもしくはヒツジのゲノム）から同定かつクロ
ーン化することが可能である。ＤＮＡフラグメントのクローニングの方法は、そ
の天然の供給源からの該ＤＮＡフラグメントの取り出し(excision)および単離、
組換えベクターへの該ＤＮＡフラグメントの挿入、ならびに微生物もしくは細胞
（該微生物もしくは細胞の増殖の間に該ベクターおよび挿入されたＤＮＡフラグ
メントが複製される）への該ベクターの取り込みを必要とする。「クローン化さ
れたＤＮＡフラグメント」もしくは「クローン化されたＤＮＡ分子」という用語
は、クローニングの過程により産生されるＤＮＡフラグメントもしくは分子、な
らびに該ＤＮＡフラグメントもしくはそれから複製された分子のコピー（もしく
はクローン）を指す。既知かつ当業者により普遍的に使用されるクローニング、
ＤＮＡの単離、ＤＮＡの増幅および精製、（例えばＤＮＡリガーゼ、ポリメラー
ゼもしくは制限エンドヌクレアーゼを必要とする）酵素反応の標準的技術ならび
に多様な分離技術を、本発明で使用することが可能である。多数のこれらの標準
的技術は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー；ウ（Ｗｕ）（編）（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ６８；ウ（Ｗｕ）ら（編）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
００および１０１；グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）とモルデイヴ（Ｍｏｌｄａ
ｖｅ）（編）（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；ミラー（編）（１
９７２）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ニューヨーク州コールドスプリン
グハーバー；オールド（Ｏｌｄ）とプリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）（１９８
１）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、カリ
フォルニア大学出版局（Ｕｎｉｖ．ｏｆＣａｌ．Ｐｒｅｓｓ）、バークレー；
シュリーフ（Ｓｃｈｌｉｅｆ）とヴェンジンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）（１９８２）
ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｏｈｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ；グロヴァー（Ｇｌｏｖｅｒ）（編）１９８５（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、
第ＩおよびＩＩ巻、ＩＲＬプレス（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、英国オックスフォー
ド）；セロウ（Ｓｅｌｌｏｗ）とホレンダー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）（１９７
９）ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ、第Ｉ巻、プレナムプレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、
ニューヨークに記述され；それらはそっくりそのまま引用により本明細書に組込
まれる。使用される場合の略語は、当該分野で標準的と思われかつ本明細書に引
用されるもののような専門雑誌で普遍的に使用されるものである。

【００３０】遺伝子の発現は、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのタンパク質への
その後の翻訳の双方を必要とする。遺伝子の調節は通常転写のレベルで起こるた
め、本発明のＧＤＦプロモーターの転写調節および活性は遺伝子産物の定量によ
りアッセイすることが可能である。例えば、プロモーターの調節および活性は、
容易にアッセイ可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ遺伝子配列の異種プロ
モーターへの融合（カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ
）（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：１７９−２０７）により定量的
に研究することが可能である。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を、プロモーターの活性を検出するのに使用することが可能
である。こうした遺伝子は「レポーター」遺伝子と称され、これらは、所定のプ
ロモーター（通常は異種プロモーター）と組み合わせられる場合に、プロモータ
ー活性についての容易なアッセイを提供する。

【００３１】本発明のＧＤＦプロモーターおよびＧＤＦプロモーター要素（すなわちそれら
の調節機能に関与するＧＤＦ−８プロモーター内の選択された配列）は、単一も
しくは複数のユニットの形態で、多数の多様な組み合わせおよび構成中で、順向
きもしくは逆向きで、などで使用することができる。複数のユニットの態様の情
況、ならびに／もしくは正および負双方の制御要素を組込む態様において、こう
したユニットが隣接する先頭から先頭もしくは先頭から末尾の構造で配置される
という要件は存在しない。なぜなら、こうした複数のユニットの改良された調節
能力は、事実上、相互に関してこうした複数の配列の位置に独立して与えられる
からである。さらに、各ユニットが同一の正もしくは負の要素を含んで成るとい
う要件は存在しない。こうした配列は、所望の調節効果を与えるように、転写開
始部位の上流およびそれに十分に接近して、イントロン中に、もしくは目的の遺
伝子の下流に配置することが可能である。加えて、本発明のＧＤＦプロモーター
およびＧＤＦプロモーター要素は、目的のいかなる遺伝子の発現の所望の増強も
しくは抑制も達成するために、他の遺伝子のプロモーターおよび調節要素との多
数の多様な組み合わせで使用することが可能である。

【００３２】従って、本発明の一態様において、ＧＤＦプロモーターを使用して、単に構造
遺伝子を得そして該遺伝子の転写開始部位の上流に１個もしくはそれ以上のコピ
ーのＧＤＦプロモーターを挿入することにより異種構造遺伝子の転写を調節する
。加えて、当該技術分野で既知であるとおり、異種構造遺伝子の転写開始部位の
上流およびそれに接近してＴＡＴＡボックス配列を包含することが一般に望まし
い。こうした配列は、本発明の新規制御配列と同一の様式で合成しかつ挿入する
ことができる。あるいは、異種構造遺伝子を天然に伴うＴＡＴＡ配列を使用する
ことが可能である。一般に、ＴＡＴＡ配列は、転写開始の上流約２０ヌクレオチ
ドと３０ヌクレオチドとの間に配置される。

【００３３】選択されたヌクレオチド配列を選択された点でより大きな配列内に正確に挿入
するための多数の方法が当該技術分野で既知である。一方法においては、所望の
制御配列もしくは配列の組み合わせを合成し、そして制限部位のリンカーフラグ
メントを制御配列の末端に付加する。これは、上流領域内の適合する制限部位へ
の制御配列の容易な挿入を見込む。あるいは、合成された制御配列を選択された
領域に直接連結することが可能である。加えて、好都合な制限大きさが所望の挿
入部位で見出されない場合には、部位特異的突然変異誘発を使用して、制御配列
を挿入することができる制限部位を形成することが可能である。

【００３４】本発明のＧＤＦプロモーターは、付加的な同種もしくは異種の制御もしくは促
進配列を伴うもしくは伴わないいかなる異種遺伝子の情況でも有益に使用するこ
とが可能である。特定の一態様において、本発明は、ＧＤＦ−８遺伝子プロモー
ター、および場合によってはＧＤＦ−８の発現を誘導することが既知である因子
に応答してＧＤＦ−８発現の誘導で機能する他の調節配列を提供する。

【００３５】本発明のＧＤＦプロモーター要素の活性を測定するのにいずれかの適するレポ
ーター遺伝子を使用することが可能である。例えば、下述される実施例において
は、ＧＤＦ−８プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を使用した。Ｇ
ＤＦ−８プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物は、２種の細胞系（図
１Ａ−１Ｂ）、ＲＤ（ヒト胚横紋筋肉腫）およびＡ６７３（ヒト横紋筋肉腫）で
活性であった。最大活性は０．６５ｋｂの５’隣接フラグメントで観察された（
ＳＶ４０−ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌの５
〜８％）。ＨｅｐＧ２（ヒト肝芽腫）、ＨＴ２９（ヒト結腸腺癌）、ＰＡ−１（
ヒト卵巣奇形癌）およびＭＣＰ−７（ヒト乳房腺癌）では有意のルシフェラーゼ
活性が検出されなかった。トランスフェクションアッセイの結果は、１）リプレ
ッサー要素（１個もしくは複数）が、ヒトＧＤＦ−８遺伝子の上流８．５ｋｂと
０．６５ｋｂとの間に存在する、２）０．６５ｋｂのフラグメントは最小のプロ
モーターを含有する、および３）最小のプロモーターは組織特異的であり、かつ
、筋細胞系のみで活性であるようであることを示唆している。

【００３６】なお別の態様において、本発明は、ＧＤＦ−８プロモーターのようなＧＤＦプ
ロモーター（もしくはその一部分）に結合しそしてＧＤＦ遺伝子（例えばＧＤＦ
−８）もしくは異種遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニング方法を提供
する。本明細書で使用されるところの「調節する」という用語は、ＧＤＦ発現の
阻害および刺激の双方を包含する。さらに、「阻害」という用語は、ＧＤＦ発現
の完全および部分的双方の阻害を包含することを意図している。多様な態様にお
いて、ＧＤＦ発現は、野生型レベルのＧＤＦ−８発現より最低１．２倍、１．５
倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍もしくは５倍より低いレベルに阻害
される。さらなる態様において、ＧＤＦ発現は最低１０％、２０％、３０％、４
０％、５０％、７５％もしくは１００％阻害される。

【００３７】ＧＤＦの転写および／もしくは発現を調節するそれらの能力について化合物を
試験するため、対照のレポーターのものに比較して、本発明のＧＤＦプロモータ
ーに有効に連結されるレポーター遺伝子（例えばＳＶ４０−β−ガラクトシダー
ゼレポーター遺伝子）の転写および／もしくは発現を増大もしくは刺激する、ま
たは転写および／もしくは発現を減少もしくは抑制するその能力について、化合
物を試験することが可能である。試験化合物の効果はレポーター遺伝子の活性の
変化により測定する。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子
に有効に連結されるＧＤＦ−８プロモーターを含有する安定な細胞系を、発現を
検出するための当該技術分野で既知のいずれかの公知のスクリーニング方法（例
えば、ルシフェラーゼアッセイ、ＣＡＴアッセイもしくは緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）アッセイ）で使用することが可能である。しかしながら、本発明はこれ
らの示唆されたスクリーニング方法に制限されない。

【００３８】本発明のＧＤＦプロモーターに結合する転写因子は、ゲル移動度シフトアッセ
イを使用してもまた特徴づけることが可能であり、また、これらの転写因子は、
発現ライブラリーのスクリーニングでこれらの特異的配列をプローブとして使用
してクローン化することが可能である。あるいは、ＧＤＦプロモーター配列に結
合することにより稼働するＧＤＦ遺伝子に特異的な阻害物質を同定するための高
スループットスクリーニングアッセイで、複数のコピーの以下の転写因子結合配
列すなわちＣＡＡＡＴＧ、ＣＡＧＡＣＡもしくはＧＡＣＡＧＣ、および最小のプ
ロモーター（開始ＡＴＧの０．２ｋｂ上流）、またはこれらの配列の組み合わせ
および最小のプロモーターを含有する第二世代のレポーター構築物を使用するこ
とが可能である。これらの転写因子を同定した後、それらもまた他の阻害物質を
同定するための標的として使用することができる。例えば、これら転写因子は、
２ハイブリッドアッセイもしくは３ハイブリッドアッセイの「餌タンパク質」と
して（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；ゼルフォス（Ｚｅｒｖｏｓ）
ら（１９９３）Ｃｅｌｌ７２：２２３−２３２；マデュラ（Ｍａｄｕｒａ）ら
（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；バー
テル（Ｂａｒｔｅｌ）ら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４：９２
０−９２４；岩淵（Ｉｗａｂｕｃｈｉ）ら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：
１６９３−１６９６；およびブレント（Ｂｒｅｎｔ）ＷＯ９４／１０３００を参
照されたい）、または転写因子に結合するもしくはそれらと相互作用する他のタ
ンパク質を同定するための発現ライブラリーのスクリーニングでのタンパク質プ
ローブとして使用することが可能である。こうした転写因子結合タンパク質は、
モジュレーター、例えばＧＤＦ−８発現の阻害物質として作用することもまたあ
りそうである。

【００３９】一態様において、本発明は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に有効に連結されかつ組
織特異的様式で発現される可能性のあるＧＤＦ−８プロモーターもしくはその一
部分を提供する。ＧＤＦ−８プロモーター活性は筋組織に特異的である。従って
、ＧＤＦ−８プロモーターは、その発現が筋組織中で望ましいいかなるＧＯＩも
発現するのに使用することができる。こうした遺伝子の例は、限定されるもので
ないが、ＧＤＦ−８それ自身、ジストロフィン、成長因子、腫瘍もしくは病原体
の抗原をコードする遺伝子を挙げることができる。ウイルス、腫瘍、病原体もし
くは細菌の抗原、とりわけＡＩＤＳエンベロープタンパク質ｇｐ１２０を包含す
るワクチン接種で有用なタンパク質を発現する遺伝子もまた包含される。しかし
ながらこれは一覧を限定することを意図されない。目的のタンパク質を発現する
いかなる遺伝子も本発明の方法で使用することができる。

【００４０】筋組織で特異的に目的のタンパク質を発現することは、身体での筋のかさの量
、およびその中で筋が外来遺伝子を発現することが可能である容易さのため、遺
伝子治療の領域で高度に好ましい。従って、本発明のＧＤＦ−８プロモーターは
、筋組織中での目的の遺伝子の発現を指図する遺伝子治療ベクターで使用するこ
とが可能である。本発明のＧＤＦ−８プロモーターを包含する遺伝子治療ベクタ
ーは、例えば、静脈内注入、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照
されたい）、定位注入（例えばチェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７を参照されたい
）もしくは直接筋肉内注入（例えば米国特許第５，５８０，８５９号および第５
，５８９，４６６号に記述されるような）により被験者に送達することが可能で
ある。本発明のＧＤＦ−８プロモーターを含有する遺伝子治療ベクターは、癌、
筋ジストロフィー、脊髄傷害、外傷性傷害、うっ血性閉塞性肺疾患、ＡＩＤＳも
しくは悪液質のような筋に関連した障害の治療；あるいは肥満および関連障害、
例えば糖尿病；または脂肪細胞の異常増殖に関連した障害の治療に使用すること
が可能である。

【００４１】本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは限定するとし
て解釈されるべきでない。本明細書を通じて引用される全部の参考文献、特許お
よび公開特許明細書の内容は、引用により本明細書に組込まれる。

【００４２】実施例実施例１：ヒトゲノムライブラリーのスクリーニング７４５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩヒトＧＤＦ−８ｃＤＮＡプロー
ブ（例えば米国特許出願第０８／５２５，５９６号に記述される）を使用して、
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヒトゲノムライブラリー（ＨＴ１０８
０）をスクリーニングした。ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン
ワイリーアンドサンズインク（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．）、９９６に記述される方法を使用して、３個のゲノムクローンを単離し
た。ヒトＧＤＦ−８の５’隣接領域を含有する８．５キロ塩基（ｋｂ）のフラグ
メントをルシフェラーゼレポーター構築物ｐＧＬ−３−ｂａｓｉｃ（プロメガ（
Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローニングした。この８．５キロ塩基のフラグメ
ントを制限消化もしくはＰＣＲにより短縮して６種の付加的クローン、すなわち
５．３ｋｂ、３．６ｋｂ、０．６５ｋｂ、０．３ｋｂ、０．２ｋｂおよび０．１
ｋｂを生じさせた。開始ＡＴＧのおよそ１ｋｂ上流は配列決定されている。ＣＣ
ＡＡＴおよびＴＡＴＡＡボックスの位置に基づく近似の転写開始部位は、ＡＴＧ
の約１００塩基上流である。従って、０．１ｋｂを含有するルシフェラーゼクロ
ーンは、５’非翻訳領域のみを含有する。

【００４３】実施例２：トランスフェクションアッセイ製造元のプロトコルに従い、ＦｕＧＥＮＥ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））を使用して、一過性トランスフェクシ
ョンアッセイを実施した。６種の異なるヒト細胞系、ＲＤ、Ａ６７３、ＨｅｐＧ
２、ＨＴ２９、ＰＡ−１およびＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴ
ィル）をこのトランスフェクションアッセイで使用した。トランスフェクション
の前日に、１０％ＦＢＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭ中の１．５×１０⁵個の細胞を
３５ｍｍの組織培養皿に植え付けた。細胞が５０〜７０％コンフルエントになる
まで、細胞を一夜インキュベーションした。各トランスフェクションについて、
１．０μｇのルシフェラーゼレポータープラスミド、０．１μｇのβ−ガラクト
シダーゼレポータープラスミドｐＳＶ−β−ｇａｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ
））および５μｇのＦｕＧＥＮＥを使用した。プロモーターのないルシフェラー
ゼベクター（ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））およびＳ
Ｖ４０−ルシフェラーゼベクター（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ）（プロメガ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ））を対照として使用した。トランスフェクション２４時間後に、
製造元のプロトコルに従い、二重灯（ＤｕａｌＬｉｇｈｔ）化学発光レポータ
ー遺伝子アッセイキット（トロピックスインク（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．））
を使用して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシ
フェラーゼレポーター構築物の相対活性を、β−ガラクトシダーゼ活性に対して
正規化した。

【００４４】実施例３：ＧＤＦ−８プロモーター突然変異体ＰＣＲを使用してＧＤＦ−８プロモーターの付加的短縮を行い、開始ＡＴＧコ
ドンの上流０．６５ｋｂ、０．４４ｋｂ、０．３１ｋｂ、０．２９ｋｂ、０．２
５ｋｂ、０．２１ｋｂおよび０．１ｋｂの配列を含有するＤＮＡフラグメントを
生じさせた（図２および３Ａを参照されたい）。その後、これらのＤＮＡフラグ
メントを、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメ
ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にサブクローニングした。これらの構築物（０．６５ｋ
ｂないし０．１ｋｂ）をＲＤ細胞にトランスフェクションし、そしてルシフェラ
ーゼアッセイを使用してこれらの構築物の発現を測定した（図３Ａおよび３Ｂを
参照されたい）。０．３１ｋｂから０．２９ｋｂまでの領域の欠失はルシフェラ
ーゼ活性を約４０％低下させ；０．３１ｋｂから０．２５ｋｂまではルシフェラ
ーゼ活性を約６０％低下させ；そして０．３１ｋｂから０．２１ｋｂまではルシ
フェラーゼ活性を約９０％低下させた。０．３１ｋｂから０．２９ｋｂまで、お
よび０．２９ｋｂないし０．２５ｋｂの領域の検査は、それぞれ配列ＣＡＡＡＴ
Ｇ（潜在的Ｅボックス）およびＣＡＧＡＣＡ（潜在的Ｓｍａｄ３および４結合
配列）を示した。０．２５ｋｂないし０．２１ｋｂの領域の検査はいかなる既知
の転写結合部位も示さなかったが、欠失の結果はシス要素の可能性を示唆してい
る。

【００４５】欠失構築物からのルシフェラーゼ活性の低下が、ＧＤＦ−８発現におけるＣＡ
ＡＡＴＧ、ＣＡＧＡＣＡおよびＧＡＣＡＧＣ配列の調節の役割によったのか、も
しくは、プロモーター領域の物理的短縮によったのかどちらかを決定するため、
クイックチェンジ［ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的突然変異誘発キ
ット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用する集団部位特異的突
然変異誘発(clustered site-directed mutagenesis)を実施した。以下の突然変
異体（ＣＡＡＡＴＧ→ＡＧＡＴＣＴ；ＣＡＧＡＣＡ→ＡＧＡＴＣＴ；およびＧＡ
ＣＡＧＣ→ＡＧＡＴＣＴ）を創製した。加えて、複数の集団突然変異を含有する
ＧＤＦ−８プロモーターレポーター構築物もまた生じさせた。突然変異されたプ
ロモーター構築物をＲＤ細胞にトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ
活性についてアッセイした（図４Ａおよび４Ｂを参照されたい）。ＣＡＡＡＴＧ
領域の突然変異はルシフェラーゼ活性のおよそ２５％の低下をもたらし；ＣＡＧ
ＡＣＡ領域の突然変異はルシフェラーゼ活性の増大をもたらし；そしてＧＡＣＡ
ＧＣ領域の突然変異はルシフェラーゼ活性のおよそ４０％の低下をもたらした。

【００４６】これらの結果は、該プロモーター領域の物理的な短縮がルシフェラーゼ発現に
対する影響を有することのみならず、しかしより重要なことには配列ＣＡＡＡＴ
Ｇ、ＣＡＧＡＣＡおよびＧＡＣＡＧＣが発現で調節の役割を演じていることを示
唆している。２種の配列ＣＡＡＡＴＧおよびＧＡＣＡＧＣは、二重突然変異体で
のルシフェラーゼ活性の６０％の低下により立証されるように相乗的にもまた作
用するようである。これらの結果は、ＧＤＦ−８プロモーター中には複数の調節
領域（例えば転写因子結合領域）が存在することもまた示唆している。従って、
ＧＤＦ−８プロモーター−ルシフェラーゼ遺伝子レポーター構築物は高スループ
ットスクリーニング（ＨＴＳ）で使用することが可能である。なぜなら、ＧＤＦ
−８発現の阻害物質は異なる調節部位で作用する阻害物質を生じることができる
からである。

【００４７】実施例４：ＧＤＦ−８発現の調節化合物のスクリーニングでの使用に適する発
現構築物の発生配列ＣＡＡＡＴＧ、ＣＡＧＡＣＡおよびＧＡＣＡＧＣの突然変異は、ＧＤＦ−
８プロモーター構築物ｐＧＬ３−０．６５の発現を阻害するか（ＣＡＡＡＴＧお
よびＧＡＣＡＧＣについて）もしくは高めるか（ＣＡＧＡＣＡについて）のいず
れかをもたらす。これは、これらの配列がＧＤＦ−８発現の調節に関与している
ことを示しており、そして、これらの配列が転写因子により認識されていること
を示唆している。これを立証するため、最小のプロモーター配列（領域−１ない
し−２０７を含有するｐＧＬ３−０．２１、図２）および最小のプロモーター配
列の上流の上の調節配列の１個もしくはそれ以上のコピーを含有するルシフェラ
ーゼ発現プラスミドを構築した。図５Ａは、配列ＣＡＡＡＴＧおよびＧＡＣＡＧ
Ｃ、ならびにコンカテマーの発生で使用されたそれらの隣接配列（複数のコピー
の上で同定された配列）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチド配列を示す。ＣＡ
ＡＡＴＧ配列を含有するルシフェラーゼレポーター構築物の発現は、該構築物内
に含有されたこの配列のコピー数に依存した一方、ルシフェラーゼレポーター構
築物の発現は、ＧＡＣＡＧＣ配列のコピー数に関係なく対照の１００％のままで
ある（図５Ｂ）。これらのトランスフェクションの結果は、これらの発現プラス
ミドをスクリーニングのプロトコルで使用して、上の調節配列と相互作用する特
異的な転写因子を調節する化合物を同定することが可能であることを示している
。

【００４８】本実施例ならびに上の実施例１、２および３に記述されるアプローチは、ヒト
ＧＤＦ−８プロモーター、および限定されるものでないがマウス、ブタもしくは
ニワトリのＧＤＦ−８プロモーターを挙げることができる他のＧＤＦ−８プロモ
ーター中のいずれかの他の未知の調節配列を同定するのにもまた使用することが
できる。加えて、本実施例ならびに上の実施例１、２および３に記述される多様
な発現構築物は、インビボでのプロモーターおよび／もしくは調節活性を立証す
るためのトランスジェニック動物を生じさせるのにも使用することが可能である
。

【００４９】実施例５：ＧＤＦ−８発現の調節化合物のスクリーニングでの使用に適する細
胞系の発生ＲＤ細胞をｐＧＬ３−０．６５プラスミドでトランスフェクションし、そして
Ｇ４１８圧選択下で安定な細胞クローンについて選択することにより、ｐＧＬ３
−０．６５プラスミド配列を含有する安定な細胞系を生じさせた。２種のこうし
た安定な細胞クローンの発現プロフィルを図６に示す。ＴＧＦ−βもしくはＴＮ
Ｆαでのこれらの細胞クローンの処理は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現
をダウンレギュレートし、外因性ＧＤＦ−８プロモーターが調節される可能性が
あること、ならびに、これらの細胞クローンがＧＤＦ−８発現調節化合物のスク
リーニングおよび同定で有用であることを立証する。ＧＤＦ−８発現調節化合物
、例えばこれらの配列に結合する（転写因子のような）調節タンパク質に特異的
に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび同定での使用のための、ＣＡＡＡ
ＴＧおよびＧＡＣＡＧＣコンカテマーのレポータープラスミド（実施例４に記述
される）を含有する安定な細胞系もまた生じさせることが可能である。

【００５０】実施例６：ＧＤＦ−８プロモーター中の調節配列は多様な種の間で保存されて
いる白色レグホンのニワトリゲノムライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ））をスクリーニングすることにより単離されたニワトリＧＤＦ−８ゲ
ノムクローンを配列決定すること、および、ジョンズ＝ホプキンス大学のリー（
Ｓｅ−ｊｉｎＬｅｅ）博士により恵与されたマウスＧＤＦ−８ゲノムクローン
（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８７：
８３−９０を参照されたい）をスクリーニングすることにより、ニワトリおよび
マウスのＧＤＦ−８からの付加的なプロモーター配列を得た。ブタＧＤＦ−８遺
伝子のヌクレオチド配列は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＪ１３
３５８０およびＡＦ０９３７９８から得ることが可能である。

【００５１】ヒト、マウス、ニワトリおよびブタのＧＤＦ−８プロモーター配列（ＴＡＴＡ
Ａボックスの１６０ヌクレオチド上流）の比較は、図８に示され、そして、４種
の間での高レベルの配列の相同性を示す（表１を参照されたい）。とりわけ、調
節配列ＣＡＡＡＴＧおよびＧＡＣＡＧＣが全４種でこの領域内に存在する。これ
らの種のプロモーター領域中の高度の配列の同一性、およびこの領域におけるこ
れらの調節配列の保存は、ヒトプロモーターに結合する同一の転写因子がブタ、
マウスおよびニワトリの調節配列もまた認識する可能性があることを示している
。従って、ヒトプロモーター中の調節配列を同定するのに使用することが可能で
ある同一の戦略は、マウス、ブタおよびニワトリのＧＤＦ−８のプロモーター領
域中の調節配列を同定するのにもまた使用することが可能である。

【００５２】実施例１、２、３および４にヒトＧＤＦ−８遺伝子について記述された方法を
使用して、マウス、ブタおよびニワトリのＧＤＦ−８遺伝子のプロモーターおよ
び調節要素の活性を測定かつ分析することが可能である。例えば、マウス、ブタ
およびニワトリ起源の細胞および細胞系を、マウス、ブタおよびニワトリのＧＤ
Ｆ−８のそれぞれプロモーターおよび調節要素のインビボ分析で使用することが
可能である。ＧＤＦ−８プロモーター領域は多様な種の間で高度に保存されてい
るため、インビボアッセイでのプロモーターおよび調節要素の活性の分析で同種
からの細胞および細胞系を使用することに加えて、異種の細胞および細胞系もま
た使用することができる。加えて、ＧＤＦ−８プロモーター、プロモーターの部
分、調節要素および／もしくはそれらの組み合わせを含有するレポーターベクタ
ーを使用してのトランスジェニック動物の発生により、限定されるものでないが
しかしヒト、マウス、ブタおよびニワトリを挙げることができるいかなる種のＧ
ＤＦ−８のプロモーターおよび調節要素の活性も分析することが可能である。

【００５３】

【表１】

【００５４】同等物当業者は、本明細書に記述された本発明の特定の態様に対する多くの同等物を
認識するであろうか、もしくは、わずかに慣例の実験を使用して確かめることが
可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含することを意図し
ている。

【００５５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａおよび１Ｂ】発明にかかる、６種の異なる細胞系におけるヒトＧＤＦ−８プロモーター−ル
シフェラーゼレポーター構築物のトランスフェクションアッセイの結果を示す。

【図２】発明にかかる、ヒトＧＤＦ−８プロモーター要素に対応するヌクレオチド配列
（配列番号１）を示す。開始コドンＡＴＧは太字で下線をつけられている。囲ま
れた配列は３個の突然変異された領域である。数字はＡＴＧの上流の核酸位置を
表す。

【図３Ａ】発明にかかる、多様なヒトＧＤＦ−８プロモーター−レポーター構築物の略図
である。

【図３Ｂ】発明にかかる、ＲＤ（ヒト胚横紋筋肉腫）細胞中でのこれらの構築物のルシフ
ェラーゼ活性を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性は対照（ＡＴＧ部位の上
流の０．６５ｋｂの配列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ
３−０．６５）のパーセントとして表す。該レポータープラスミドの相対的ルシ
フェラーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化している。

【図４Ａ】発明にかかる、多様な突然変異されたヒトＧＤＦ−８プロモーター−ルシフェ
ラーゼレポーター構築物の図解である。

【図４Ｂ】発明にかかる、ＲＤ細胞中でのこれらの構築物のルシフェラーゼ活性を示すグ
ラフである。ルシフェラーゼ活性は対照（ＡＴＧ部位の上流の０．６５ｋｂの配
列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−０．６５）のパー
セントとして表す。該レポータープラスミドの相対的ルシフェラーゼ活性は、β
−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化している。

【図５Ａ】発明にかかる、ＣＡＡＡＴＧおよびＧＡＣＡＧＣ配列のコンカテマーを含有す
るヒトＧＤＦ−８プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物の構築で使用
された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を示す。ボックス１の配列は配列番
号２に対応する。ボックス３の配列は配列番号３に対応する。

【図５Ｂ】発明にかかる、ＲＤ細胞中でのこれらの構築物のルシフェラーゼ活性を示すグ
ラフである。ルシフェラーゼ活性は対照（ＡＴＧ部位の上流の０．６５ｋｂの配
列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−０．６５）のパー
セントとして表す。レポーター構築物ｐＧＬ−０．２１はコンカテマーのレポー
ター構築物の親プラスミドである。該レポータープラスミドの相対的ルシフェラ
ーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。

【図６】発明にかかる、図５Ｂの記述で言及されたｐＧＬ３−０．６５ルシフェラーゼ
レポーター配列を含有する多様な安定なＲＤクローンのルシフェラーゼ活性、な
らびにルシフェラーゼレポーターの発現に対するＴＧＦ−βおよびＴＮＦαの影
響を示すグラフである。

【図７Ａ】発明にかかる、マウスＧＤＦ−８プロモーター領域のヌクレオチド配列（配列
番号４）を示す。

【図７Ｂ】発明にかかる、ニワトリＧＤＦ−８プロモーター領域のヌクレオチド配列（配
列番号５）を示す。

【図８】発明にかかる、ＴＡＴＡＡボックス（下線をつけられる）の上流のヒト、マウ
ス、ブタおよびニワトリのＧＤＦ−８プロモーター要素のヌクレオチド配列（そ
れぞれ配列番号６、７、８および９）の整列を示す。ＣＡＡＡＴＧ、ＣＡＧＡＣ
ＡおよびＧＡＣＡＧＣ配列が囲まれている。影をつけられた領域は配列の相同な
領域を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 CA06 DA03 EA04 FA02 GA11 HA17 4B065 AA93X AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 BA44 MA01 NA14 ZA222 ZA392 ZA702 ZA892 ZA942 ZB212 ZB262 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図２に示されるヌクレオチド配列（配列番号２）、もしくは
相同なヌクレオチド配列を含んで成る単離されたＧＤＦ遺伝子プロモーターであ
って、該プロモーターに有効に連結されている遺伝子の筋特異的発現を調節する
プロモーター。
【請求項２】ＧＤＦ−８遺伝子由来の請求項１記載の単離されたＧＤＦ遺
伝子プロモーター。
【請求項３】ＧＤＦ−８遺伝子がヒトＧＤＦ−８遺伝子である、請求項２
記載の単離されたＧＤＦ遺伝子プロモーター。
【請求項４】配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載
の単離されたＧＤＦ遺伝子プロモーター。
【請求項５】配列番号４、５、６、７、８および９より成る群から選択さ
れるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の単離されたＧＤＦ遺伝子プ
ロモーター。
【請求項６】該プロモーターに有効に連結されている遺伝子の筋特異的発
現を調節する、配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその一部分を含んで成る
、単離されたＧＤＦ−８遺伝子プロモーター。
【請求項７】該プロモーターに有効に連結されている遺伝子の筋特異的発
現を調節する、配列番号４、５、６、７、８および９より成る群から選択される
ヌクレオチド配列もしくは前記ヌクレオチド配列の一部分を含んで成る、単離さ
れたＧＤＦ−８遺伝子。
【請求項８】図２に示されるヌクレオチド配列（配列番号２）、もしくは
相同なヌクレオチド配列を含んで成るＧＤＦ−８遺伝子プロモーターの１個もし
くはそれ以上のコピーに有効に連結されている目的の遺伝子を含んで成るベクタ
ーであって、該プロモーターが該遺伝子の筋特異的発現を調節するベクター。
【請求項９】目的の遺伝子がＧＤＦ−８である、請求項８記載のベクター
。
【請求項１０】目的の遺伝子がＧＤＦ−８に関係しない遺伝子である、請
求項８記載のベクター。
【請求項１１】遺伝子にＧＤＦ−８プロモーターを操作可能に連結するこ
と、該プロモーターを化合物と接触させること、および該遺伝子の発現を測定す
ることを含んで成る、ＧＤＦ発現を調節する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】化合物とプロモーターを接触させた後の遺伝子の発現を、
該化合物とプロモーターの接触を伴わない遺伝子の発現と比較して、該化合物が
該遺伝子の発現を遂げたどうかを決定する段階をさらに含んで成る、請求項１１
記載の方法。
【請求項１３】遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１２記載の方法
。
【請求項１４】プロモーターがヒトＧＤＦ−８プロモーターである、請求
項１２記載の方法。
【請求項１５】プロモーターが、図２に示されるヌクレオチド配列（配列
番号１）の全部もしくは一部分を含んで成る、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】プロモーターが、マウスＧＤＦ−８プロモーター、ニワト
リＧＤＦ−８プロモーターおよびブタＧＤＦ−８プロモーターより成る群から選
択されるＧＤＦ−８プロモーターである、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】化合物がＧＤＦ発現を阻害する、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】化合物がＧＤＦ発現をアップレギュレートする、請求項１
２記載の方法。
【請求項１９】遺伝子の筋特異的発現を得る方法であって、筋細胞を請求
項１記載の単離されたＧＤＦプロモーターでトランスフェクションすることを含
んで成る方法。
【請求項２０】ＧＤＦプロモーターが１個の遺伝子に操作可能に連結され
る、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】ＧＤＦプロモーターが微小注入法を介して細胞中に導入さ
れる、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】ＧＤＦプロモーターが、トランスジェニック動物の注入を
介してインビボで細胞中に導入される、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】ＧＤＦプロモーターが、ヒトでインビボで細胞中に導入さ
れる、請求項１９記載の方法。