JP2002519059A - ミオスタチン遺伝子の新規なプロモーター配列 - Google Patents
ミオスタチン遺伝子の新規なプロモーター配列Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子であって、ミオスタチン遺伝子のプロモーター領域またはそのフラグメントまたは、１以上のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失によって改変されたその変異型をコードし、該ポリヌクレオチド配列の該フラグメント及び変異型は該プロモーター領域と実質的に同等の機能を有する単離ＤＮＡ分子をコードする新規なプロモーター配列に関するものである。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ミオスタチン遺伝子の新規なプロモーター配列、対象とする遺伝子
のコーディング配列に機能的に連係させられた新規なプロモーター配列を含むＤ
ＮＡ構築体、及び、該プロモーターを有するベクターまたは該ベクターを含む構
築体ならびにホスト細胞に関する。
のコーディング配列に機能的に連係させられた新規なプロモーター配列を含むＤ
ＮＡ構築体、及び、該プロモーターを有するベクターまたは該ベクターを含む構
築体ならびにホスト細胞に関する。
【０００２】 （発明の背景） 遺伝子のプロモーター領域は、その遺伝子の発現を制御する部分である。ミオ
スタチン遺伝子が単離され、その配列が決定されて公開されている（Mcpherron
AC; Lawler AM and Lee SJ; Nature 387, 1 May 1997; WO94/21681）。しかしこ
の遺伝子のプロモーター領域の配列は、現在までに単離も配列決定もされておら
ず、公開されていない。
スタチン遺伝子が単離され、その配列が決定されて公開されている（Mcpherron
AC; Lawler AM and Lee SJ; Nature 387, 1 May 1997; WO94/21681）。しかしこ
の遺伝子のプロモーター領域の配列は、現在までに単離も配列決定もされておら
ず、公開されていない。
【０００３】 ミオスタチンは、成長分化因子−８（ＧＤＦ−８）としても知られ、トランス
フォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに構造的に関連して
いる（McPherron et al 1997）。ミオスタチン遺伝子は筋肉の成長を阻害する
ことが示されている。初期の研究によって、マウスにおいてミオスタチン遺伝子
を欠損させると筋重量が２倍に増加することが示されたが（McPherron et al 19
97）、これはミオスタチン遺伝子が筋重量の負の調節因子であることを示唆する
ものである。
フォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに構造的に関連して
いる（McPherron et al 1997）。ミオスタチン遺伝子は筋肉の成長を阻害する
ことが示されている。初期の研究によって、マウスにおいてミオスタチン遺伝子
を欠損させると筋重量が２倍に増加することが示されたが（McPherron et al 19
97）、これはミオスタチン遺伝子が筋重量の負の調節因子であることを示唆する
ものである。
【０００４】 本発明の発明者である３名（Kambadur, Sharma, Bass）は、「筋肉が倍増した
」ＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ種のウシにおいて、１１ｂｐの欠失を含むミオスタチ
ン遺伝子の突然変異を特定した。この突然変異はミオスタチンの作用を失わせ、
筋重量は３０％〜４０％増加する。
」ＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ種のウシにおいて、１１ｂｐの欠失を含むミオスタチ
ン遺伝子の突然変異を特定した。この突然変異はミオスタチンの作用を失わせ、
筋重量は３０％〜４０％増加する。
【０００５】 発明者等は更に、同じＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ対立遺伝子（１１塩基対の欠失
）を有するがその発現量が極めて少量である２頭のＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ種の
父系統を観察した。ノーザンブロッティングでは２本のバンドが見られ、これら
の動物ではミオスタチン遺伝子（低次形態対立遺伝子）に２箇所の突然変異があ
ることが示された。これは、ミオスタチン遺伝子の上流領域における欠損によっ
てミオスタチンの発現がなくなり、その結果筋肉の成長が増大したことを示唆す
るものである。
）を有するがその発現量が極めて少量である２頭のＢｅｌｇｉａｎＢｌｕｅ種の
父系統を観察した。ノーザンブロッティングでは２本のバンドが見られ、これら
の動物ではミオスタチン遺伝子（低次形態対立遺伝子）に２箇所の突然変異があ
ることが示された。これは、ミオスタチン遺伝子の上流領域における欠損によっ
てミオスタチンの発現がなくなり、その結果筋肉の成長が増大したことを示唆す
るものである。
【０００６】 （発明の概要） 本発明は、図１に示された配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する単離Ｄ
ＮＡ分子であって、ウシミオスタチン遺伝子のプロモーター領域またはそのフラ
グメントまたは、１以上のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失によって改変
されたその変異型をコードし、該ポリヌクレオチド配列の該フラグメント及び変
異型は該プロモーター領域と実質的に同等の機能を有する単離ＤＮＡ分子を提供
するものである。
ＮＡ分子であって、ウシミオスタチン遺伝子のプロモーター領域またはそのフラ
グメントまたは、１以上のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失によって改変
されたその変異型をコードし、該ポリヌクレオチド配列の該フラグメント及び変
異型は該プロモーター領域と実質的に同等の機能を有する単離ＤＮＡ分子を提供
するものである。
【０００７】 本発明は更なる一態様において、対象とする異種遺伝子が本発明のＤＮＡ分子
の転写制御下におかれるように該異種遺伝子に機能的に連係された本発明のＤＮ
Ａ分子を含む単離ＤＮＡ構築体を提供するものである。
の転写制御下におかれるように該異種遺伝子に機能的に連係された本発明のＤＮ
Ａ分子を含む単離ＤＮＡ構築体を提供するものである。
【０００８】 このＤＮＡ分子は天然のＤＮＡ源から単離するか、あるいはｃＤＮＡを用いる
ことが可能である。 本発明は更なる一態様において、上記に定義したような本発明のＤＮＡ分子及
び／または本発明のＤＮＡ構築体を含む組換え発現ベクター、ならびにこうした
ベクターによって形質転換されて本発明のＤＮＡ分子を誘導し、及び／または、
本発明のＤＮＡ構築体の異種遺伝子を誘導発現させることが可能なホストを提供
するものである。
ことが可能である。 本発明は更なる一態様において、上記に定義したような本発明のＤＮＡ分子及
び／または本発明のＤＮＡ構築体を含む組換え発現ベクター、ならびにこうした
ベクターによって形質転換されて本発明のＤＮＡ分子を誘導し、及び／または、
本発明のＤＮＡ構築体の異種遺伝子を誘導発現させることが可能なホストを提供
するものである。
【０００９】 本発明は更なる一態様において、本発明のＤＮＡ分子によってコードされる配
列を作製するための方法であって、ホスト細胞を培養することと、本発明のＤＮ
Ａ分子、そのフラグメントまたは変異型を含むベクターを前記ホスト細胞にトラ
ンスフェクトすることと、公知の方法によって該ＤＮＡ配列をクローン化するこ
ととを含む方法を提供するものである。
列を作製するための方法であって、ホスト細胞を培養することと、本発明のＤＮ
Ａ分子、そのフラグメントまたは変異型を含むベクターを前記ホスト細胞にトラ
ンスフェクトすることと、公知の方法によって該ＤＮＡ配列をクローン化するこ
ととを含む方法を提供するものである。
【００１０】 本発明は更なる一態様において、上記に定義したようなミオスタチン遺伝子プ
ロモーター配列を診断プローブとして用いた、ヒトなどの動物の筋細胞疾患を診
断するための方法を提供するものである。この診断方法は、ｉ）動物またはヒト
から組織または血液サンプルを得る工程と、ｉｉ）公知の方法によってＤＮＡを
単離する工程と、ｉｉｉ）場合に応じてミオスタチンＤＮＡを単離する工程と、
ｉｖ）ミオスタチン遺伝子のプロモーター配列に相補的なプローブにより前記Ｄ
ＮＡをプローブする工程と、ｖ）場合に応じてＰＣＲ法によって該ミオスタチン
のプロモーターＤＮＡの量を増幅する工程と、ｖｉ）前記プローブにより得られ
たミオスタチンのプロモーター配列のＤＮＡを、筋細胞疾患につながる任意の突
然変異について分析する工程と、ｖｉｉ）ミオスタチン遺伝子のプロモーター配
列の異常によって引き起こされる筋細胞疾患を診断する工程とを含む。
ロモーター配列を診断プローブとして用いた、ヒトなどの動物の筋細胞疾患を診
断するための方法を提供するものである。この診断方法は、ｉ）動物またはヒト
から組織または血液サンプルを得る工程と、ｉｉ）公知の方法によってＤＮＡを
単離する工程と、ｉｉｉ）場合に応じてミオスタチンＤＮＡを単離する工程と、
ｉｖ）ミオスタチン遺伝子のプロモーター配列に相補的なプローブにより前記Ｄ
ＮＡをプローブする工程と、ｖ）場合に応じてＰＣＲ法によって該ミオスタチン
のプロモーターＤＮＡの量を増幅する工程と、ｖｉ）前記プローブにより得られ
たミオスタチンのプロモーター配列のＤＮＡを、筋細胞疾患につながる任意の突
然変異について分析する工程と、ｖｉｉ）ミオスタチン遺伝子のプロモーター配
列の異常によって引き起こされる筋細胞疾患を診断する工程とを含む。
【００１１】 このプローブは、配列番号１のミオスタチンのプロモーターＤＮＡのヌクレオ
チド配列の一部または全体に対して相補的な配列を有する。 このプローブは好ましくはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンの発現レベルが低い動物の品種
を選択するための方法を提供するものである。この方法は、ｉ）動物またはヒト
から組織または血液サンプルを得る工程と、ｉｉ）公知の方法によってＲＮＡを
単離する工程と、ｉｉｉ）ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ法またはＲＮア
ーゼ保護アッセイを用いてミオスタチン遺伝子の転写レベル（ｍＲＮＡ）を決定
する工程とを含む。
チド配列の一部または全体に対して相補的な配列を有する。 このプローブは好ましくはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンの発現レベルが低い動物の品種
を選択するための方法を提供するものである。この方法は、ｉ）動物またはヒト
から組織または血液サンプルを得る工程と、ｉｉ）公知の方法によってＲＮＡを
単離する工程と、ｉｉｉ）ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ法またはＲＮア
ーゼ保護アッセイを用いてミオスタチン遺伝子の転写レベル（ｍＲＮＡ）を決定
する工程とを含む。
【００１２】 好ましくは、動物は、雌牛、雄牛、ヒツジ、ブタ、ヒトまたは他の哺乳動物、
家禽、魚類、または経済的に重要な他の任意の家畜品種である。 本発明は更なる一態様において、対象とする異種遺伝子を筋細胞において特異
的に発現させるための方法を提供するものである。この方法は、ｉ）前記異種遺
伝子のコーディング配列を単離する工程と、ｉｉ）前記コーディング配列がミオ
スタチンのプロモーターの転写制御下におかれるように前記異種遺伝子のコーデ
ィング配列をミオスタチンのプロモーター配列に連結する工程と、ｉｉｉ）連結
された構築体を適当な発現ベクターに挿入する工程と、ｉｖ）該発現ベクターを
ホスト筋細胞に導入する工程と、ｖ）場合に応じて、産物を回収することにより
該異種遺伝子の発現量を測定する工程とを含む。
家禽、魚類、または経済的に重要な他の任意の家畜品種である。 本発明は更なる一態様において、対象とする異種遺伝子を筋細胞において特異
的に発現させるための方法を提供するものである。この方法は、ｉ）前記異種遺
伝子のコーディング配列を単離する工程と、ｉｉ）前記コーディング配列がミオ
スタチンのプロモーターの転写制御下におかれるように前記異種遺伝子のコーデ
ィング配列をミオスタチンのプロモーター配列に連結する工程と、ｉｉｉ）連結
された構築体を適当な発現ベクターに挿入する工程と、ｉｖ）該発現ベクターを
ホスト筋細胞に導入する工程と、ｖ）場合に応じて、産物を回収することにより
該異種遺伝子の発現量を測定する工程とを含む。
【００１３】 この方法は、培養筋細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏで行うかヒトなどの動物の体内
でｉｎ ｖｉｖｏで行うことが可能である。 本発明は更なる一態様において、異種ポリペプチドまたはペプチドを生産する
ための方法であって、（ａ）上記に定義したＤＮＡ構築体を含むベクターにて形
質転換もしくはトランスフェクトしたホスト細胞を培養して、該異種遺伝子によ
りコードされる異種ポリペプチドまたはペプチドを発現させる工程と、場合に応
じて、（ｂ）発現されたポリペプチドまたはペプチドを回収する工程とを含む方
法を提供するものである。
でｉｎ ｖｉｖｏで行うことが可能である。 本発明は更なる一態様において、異種ポリペプチドまたはペプチドを生産する
ための方法であって、（ａ）上記に定義したＤＮＡ構築体を含むベクターにて形
質転換もしくはトランスフェクトしたホスト細胞を培養して、該異種遺伝子によ
りコードされる異種ポリペプチドまたはペプチドを発現させる工程と、場合に応
じて、（ｂ）発現されたポリペプチドまたはペプチドを回収する工程とを含む方
法を提供するものである。
【００１４】 本発明は更なる一態様において、筋細胞中で異種ポリペプチドまたはペプチド
を発現する非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、本発明のＤＮＡ構築体をトラン
スフェクトした非ヒト哺乳動物を提供するものである。
を発現する非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、本発明のＤＮＡ構築体をトラン
スフェクトした非ヒト哺乳動物を提供するものである。
【００１５】 対象とする異種遺伝子は、ａ）筋形成調節遺伝子、ｂ）ミオスタチン及びミオ
スタチン受容体、ｃ）癌遺伝子、ｄ）筋細胞の増殖または分化を調節する遺伝子
、ｅ）筋ジストロフィー遺伝子、及びｆ）筋肉において発現される任意の遺伝子
からなる群から選択することが可能である。
スタチン受容体、ｃ）癌遺伝子、ｄ）筋細胞の増殖または分化を調節する遺伝子
、ｅ）筋ジストロフィー遺伝子、及びｆ）筋肉において発現される任意の遺伝子
からなる群から選択することが可能である。
【００１６】 この発現ベクターは、真核細胞由来のベクター、レトロウイルスベクター、ま
たは遺伝子治療に使用される任意のベクターからなる群から選択することが可能
である。
たは遺伝子治療に使用される任意のベクターからなる群から選択することが可能
である。
【００１７】 ホスト筋細胞は、筋芽細胞または形質転換させられた筋芽細胞の任意の初代培
養、衛星細胞またはミオスタチンプロモーターが活性である任意の細胞培養から
なる群から選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系から選択することが可能である。
またホスト筋細胞はｉｎ ｖｉｖｏとして動物の体内の骨格筋細胞を用いること
も可能である。
養、衛星細胞またはミオスタチンプロモーターが活性である任意の細胞培養から
なる群から選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系から選択することが可能である。
またホスト筋細胞はｉｎ ｖｉｖｏとして動物の体内の骨格筋細胞を用いること
も可能である。
【００１８】 ホスト動物は、雌牛、雄牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラット、マウス、魚類、ま
たはヒトからなる群から選択することが可能である。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンまたはミオスタチンのアンチセ
ンス、またはリボザイムまたは任意の外来遺伝子をホストの筋細胞／筋芽細胞内
で発現させるための方法であって、対象とするコーディング配列がミオスタチン
のプロモーターの制御下におかれるように該コーディング配列に連結されたミオ
スタチンプロモーターを有する構築体を調製する工程と、該構築体を通常のクロ
ーニング手法によって遺伝子治療ベクターにクローン化する工程と、該遺伝子治
療ベクターを所望の細胞系または生きた動物またはヒトの組織にトランスフェク
トさせる工程とを含む方法を提供するものである。
たはヒトからなる群から選択することが可能である。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンまたはミオスタチンのアンチセ
ンス、またはリボザイムまたは任意の外来遺伝子をホストの筋細胞／筋芽細胞内
で発現させるための方法であって、対象とするコーディング配列がミオスタチン
のプロモーターの制御下におかれるように該コーディング配列に連結されたミオ
スタチンプロモーターを有する構築体を調製する工程と、該構築体を通常のクロ
ーニング手法によって遺伝子治療ベクターにクローン化する工程と、該遺伝子治
療ベクターを所望の細胞系または生きた動物またはヒトの組織にトランスフェク
トさせる工程とを含む方法を提供するものである。
【００１９】 好ましくはホスト筋細胞は、骨格筋細胞、体節、筋芽細胞、または筋管から選
択される。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンの優性のネガティブ型または他
の任意の遺伝子の優性のネガティブ型をホスト筋細胞内で発現させるための方法
であって、ミオスタチンプロモーターの転写制御下にある所望の突然変異型また
は野生型遺伝子に連結されたミオスタチンのプロモーターを、通常のクローニン
グ法によって遺伝子治療ベクターにクローン化する工程と、該ベクターを所望の
細胞系または生きた動物またはヒトの組織にトランスフェクトさせる工程とを含
む方法を提供するものである。
択される。 本発明は更なる一態様において、ミオスタチンの優性のネガティブ型または他
の任意の遺伝子の優性のネガティブ型をホスト筋細胞内で発現させるための方法
であって、ミオスタチンプロモーターの転写制御下にある所望の突然変異型また
は野生型遺伝子に連結されたミオスタチンのプロモーターを、通常のクローニン
グ法によって遺伝子治療ベクターにクローン化する工程と、該ベクターを所望の
細胞系または生きた動物またはヒトの組織にトランスフェクトさせる工程とを含
む方法を提供するものである。
【００２０】 好ましくは、骨格筋細胞、体節、筋芽細胞、または筋管から選択される。 この方法は、培養中のホスト筋細胞内内でｉｎ ｖｉｔｒｏにて、またはホス
ト動物の体内でｉｎ ｖｉｖｏにて行うことが可能である。ホスト動物は、雌牛
、雄牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラット、マウス、ヒト、家禽、または魚類からな
る群から選択することが可能である。
ト動物の体内でｉｎ ｖｉｖｏにて行うことが可能である。ホスト動物は、雌牛
、雄牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラット、マウス、ヒト、家禽、または魚類からな
る群から選択することが可能である。
【００２１】 本発明は広義において、この出願の明細書中に参照もしくは示される、個々の
部品、要素、及び特徴もしくはそれらの集合、またはこれらの部品、要素もしく
は特徴の内の２以上の任意またはすべての組み合わせから構成され、本発明が関
連する技術分野において複数の公知の均等物を有する特定の完全な構成に言及す
る場合、これらの公知の均等物は恰も個別に記載されたものとして解釈されるも
のである。
部品、要素、及び特徴もしくはそれらの集合、またはこれらの部品、要素もしく
は特徴の内の２以上の任意またはすべての組み合わせから構成され、本発明が関
連する技術分野において複数の公知の均等物を有する特定の完全な構成に言及す
る場合、これらの公知の均等物は恰も個別に記載されたものとして解釈されるも
のである。
【００２２】 本発明は上記の記載ならびに下記にその例が与えられる構成を包含するもので
ある。 （用語の定義） 「単離された」なる語は、その核酸が本来存在する細胞または生体内の夾雑配
列から実質的に分離または精製することを意味し、標準的な精製方法によって精
製された核酸、組換え技術によって調製した核酸、及び化学的に合成されたもの
を含む。
ある。 （用語の定義） 「単離された」なる語は、その核酸が本来存在する細胞または生体内の夾雑配
列から実質的に分離または精製することを意味し、標準的な精製方法によって精
製された核酸、組換え技術によって調製した核酸、及び化学的に合成されたもの
を含む。
【００２３】 ここで用いる「変異型」なる語は、図１に示された核酸配列と実質的に同じ核
酸配列を有するＤＮＡ分子を指すものである。変異型は、１以上の核酸の挿入、
置換、欠失などの改変によって前記ＤＮＡ分子を改変することによって得られる
。こうした改変は当該ＤＮＡ分子の機能を損ねることのない中立突然変異を含む
。
酸配列を有するＤＮＡ分子を指すものである。変異型は、１以上の核酸の挿入、
置換、欠失などの改変によって前記ＤＮＡ分子を改変することによって得られる
。こうした改変は当該ＤＮＡ分子の機能を損ねることのない中立突然変異を含む
。
【００２４】 「実質的配列同一性」なる語は、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムにおい
てデフォルトの間隔ウェイトを用いた場合のように、２つのＤＮＡ配列が最適に
並べられた場合に、少なくとも配列の６０％が共通しており、好ましくは少なく
とも配列の８０％が共通しており、より好ましくは配列の少なくとも９０％が共
通しており、最も好ましくは配列の少なくとも９５％以上が共通していることを
意味するものである。
てデフォルトの間隔ウェイトを用いた場合のように、２つのＤＮＡ配列が最適に
並べられた場合に、少なくとも配列の６０％が共通しており、好ましくは少なく
とも配列の８０％が共通しており、より好ましくは配列の少なくとも９０％が共
通しており、最も好ましくは配列の少なくとも９５％以上が共通していることを
意味するものである。
【００２５】 「ＤＮＡ構築体」なる語は、本発明の核酸分子を有する構築体または特定の位
置におけるそのフラグメント、中立突然変異、もしくはホモログを意味するもの
であり、これによって異種のコーディング配列が本発明のプロモーター配列の制
御下におかれるかプロモーター配列に機能的に連係されてホスト細胞内で発現す
ることが可能である。
置におけるそのフラグメント、中立突然変異、もしくはホモログを意味するもの
であり、これによって異種のコーディング配列が本発明のプロモーター配列の制
御下におかれるかプロモーター配列に機能的に連係されてホスト細胞内で発現す
ることが可能である。
【００２６】 「中立突然変異」なる語は、突然変異、すなわち、欠失、置換、逆位、挿入な
どによるヌクレオチドまたはポリペプチド配列における変化が、コードされたプ
ロモーター配列の機能に影響を及ぼさないような突然変異を意味するものである
。
どによるヌクレオチドまたはポリペプチド配列における変化が、コードされたプ
ロモーター配列の機能に影響を及ぼさないような突然変異を意味するものである
。
【００２７】 本発明に基づく核酸分子のフラグメントは、完全長よりも短い核酸の一部分で
あり、下記に定義されるストリンジェントな条件下において本発明の核酸分子（
またはこれに相補的な配列）と特異的にハイブリダイズすることが可能な最小の
長さを少なくとも有するもののことである。本発明に基づくフラグメントは本発
明の核酸またはポリペプチドの生物学的活性の内の少なくとも１つを有する。
あり、下記に定義されるストリンジェントな条件下において本発明の核酸分子（
またはこれに相補的な配列）と特異的にハイブリダイズすることが可能な最小の
長さを少なくとも有するもののことである。本発明に基づくフラグメントは本発
明の核酸またはポリペプチドの生物学的活性の内の少なくとも１つを有する。
【００２８】 核酸のプローブまたはプライマーは配列番号１または２の配列などの本発明に
基づいた核酸に基づいて調製することが可能である。「プローブ」は、当該技術
分野においてよく知られた検出可能な標識またはリポーター分子に結合させられ
た単離された核酸を含むものである。一般的な標識としては、放射性同位元素、
リガンド、化学発光性物質、及び酵素が含まれる。
基づいた核酸に基づいて調製することが可能である。「プローブ」は、当該技術
分野においてよく知られた検出可能な標識またはリポーター分子に結合させられ
た単離された核酸を含むものである。一般的な標識としては、放射性同位元素、
リガンド、化学発光性物質、及び酵素が含まれる。
【００２９】 「プライマー」は、短い核酸であって、好ましくはヌクレオチド１５個分以上
の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーは核酸のハイブリ
ダイゼーションによって相補的なＤＮＡ鎖にアニールされることによりプライマ
ーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、この後、ポリメラーゼ、好ま
しくはＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長される。核酸配列
を増幅するためには、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）や当該技術分野においてよく知られた他の核酸増幅法において、プライ
マーのペアを用いる。ＰＣＲ用のプライマーのペアをコンピュータプログラムを
使用することによって本発明に基づいた核酸の配列から導出することが可能であ
り、こうした目的のためのコンピュータプログラムの例としてＰｒｉｍｅｒ（Ve
rsion0.5 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, M
A ）がある。
の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーは核酸のハイブリ
ダイゼーションによって相補的なＤＮＡ鎖にアニールされることによりプライマ
ーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、この後、ポリメラーゼ、好ま
しくはＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長される。核酸配列
を増幅するためには、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）や当該技術分野においてよく知られた他の核酸増幅法において、プライ
マーのペアを用いる。ＰＣＲ用のプライマーのペアをコンピュータプログラムを
使用することによって本発明に基づいた核酸の配列から導出することが可能であ
り、こうした目的のためのコンピュータプログラムの例としてＰｒｉｍｅｒ（Ve
rsion0.5 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, M
A ）がある。
【００３０】 プローブ及びプライマーの調製及び使用法については例として、「モレキュラ
ークローニング」（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, 2nd ed, vol.1-3. ed Sambrook et al. Cold Spring Harbour Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbour, NY, 1989 ）に記載されている。プローブやプライマ
ーは溶液中に遊離して存在するか、または標準的な手段によって共有結合または
共有結合以外の結合によって固体支持体に結合させることが可能である。
ークローニング」（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, 2nd ed, vol.1-3. ed Sambrook et al. Cold Spring Harbour Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbour, NY, 1989 ）に記載されている。プローブやプライマ
ーは溶液中に遊離して存在するか、または標準的な手段によって共有結合または
共有結合以外の結合によって固体支持体に結合させることが可能である。
【００３１】 「機能的に連係した」なる語は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に
関連している場合に第２の核酸に第１の核酸が連係していると云う。例えば、本
発明のプロモーター配列は、該プロモーターが異種遺伝子のコーディング配列の
転写や発現に影響する場合に該コーディング配列に機能的に連係している。
関連している場合に第２の核酸に第１の核酸が連係していると云う。例えば、本
発明のプロモーター配列は、該プロモーターが異種遺伝子のコーディング配列の
転写や発現に影響する場合に該コーディング配列に機能的に連係している。
【００３２】 「組換え」核酸とは、天然に存在しない配列を有するかまたは２つの本来別個
の配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有する核酸
のことである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって行われることも多
いが、より一般的には単離した核酸のセグメントを遺伝子操作などによって人工
的に操作することによって行われる。
の配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有する核酸
のことである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって行われることも多
いが、より一般的には単離した核酸のセグメントを遺伝子操作などによって人工
的に操作することによって行われる。
【００３３】 核酸操作の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．などに一般的に
記載されている。 「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８
９）の９．５２〜９．５５及び９．５６〜９．５８に述べられるハイブリダイズ
法に基づいた、標的核酸に対する（特定の核酸配列に対する）核酸プローブのハ
イブリダイゼーションに関して機能的に定義される。
記載されている。 「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８
９）の９．５２〜９．５５及び９．５６〜９．５８に述べられるハイブリダイズ
法に基づいた、標的核酸に対する（特定の核酸配列に対する）核酸プローブのハ
イブリダイゼーションに関して機能的に定義される。
【００３４】 特定の増幅プライマーのペアを用いた（ＰＣＲなどによる）標的核酸配列の増
幅に関し、ストリンジェントな条件とは、対応する野生型の配列（またはその相
補的配列）を有するプライマーが結合する標的核酸配列に対してのみそのプライ
マーのペアがハイブリダイズすることが可能な条件のことである。
幅に関し、ストリンジェントな条件とは、対応する野生型の配列（またはその相
補的配列）を有するプライマーが結合する標的核酸配列に対してのみそのプライ
マーのペアがハイブリダイズすることが可能な条件のことである。
【００３５】 当業者によれば直ちに認識されるように、核酸のハイブリダイゼーションは、
塩基組成、相補鎖の長さ、ハイブリダイズする核酸同士のヌクレオチド塩基のミ
スマッチの数の他にも、塩濃度、温度、有機溶媒などの条件によって影響される
。
塩基組成、相補鎖の長さ、ハイブリダイズする核酸同士のヌクレオチド塩基のミ
スマッチの数の他にも、塩濃度、温度、有機溶媒などの条件によって影響される
。
【００３６】 （発明の詳細な説明） 上記に定義したように、本発明はその第１の態様において、ミオスタチン遺伝
子の新規なプロモーター配列、及び筋細胞疾患の診断テストとしてのその使用、
及び、特に、ミオスタチンの発現が低レベルであるウシ／ヒツジの品種の選択の
ための遺伝子マーカーを提供するものである。この新規なプロモーター配列は外
来遺伝子や優性であるミオスタチンのネガティブ型を筋肉において発現させるう
えでも有用である。
子の新規なプロモーター配列、及び筋細胞疾患の診断テストとしてのその使用、
及び、特に、ミオスタチンの発現が低レベルであるウシ／ヒツジの品種の選択の
ための遺伝子マーカーを提供するものである。この新規なプロモーター配列は外
来遺伝子や優性であるミオスタチンのネガティブ型を筋肉において発現させるう
えでも有用である。
【００３７】 本発明の新規なプロモーター配列は、図１の配列番号１ に示されるポリヌク
レオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子、または、実質的に同等な転写活性を有す
る該ＤＮＡ分子のフラグメントもしくは変異型を含む。
レオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子、または、実質的に同等な転写活性を有す
る該ＤＮＡ分子のフラグメントもしくは変異型を含む。
【００３８】 ゲノムＤＮＡライブラリからミオスタチンプロモーターを単離する方法に関し
ては、「モレキュラークローニング」（Sambrook et al, "Molecular cloning,"
Second Edition, Cold Spring Harbour Press (1987) ）に一般的に述べられて
いる。
ては、「モレキュラークローニング」（Sambrook et al, "Molecular cloning,"
Second Edition, Cold Spring Harbour Press (1987) ）に一般的に述べられて
いる。
【００３９】 最初の工程では、ホスト細胞へのクローン化の後、特定のミオスタチンＤＮＡ
プローブを用い、ＰＣＲ法によって増幅する。 好ましくは、ミオスタチンプロモーターをコードしたＤＮＡ配列をクローン化
するホスト細胞はＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓなどのバチルス属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍやＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓなどの腸内細菌科といった他の原核
生物を使用することも可能である。
プローブを用い、ＰＣＲ法によって増幅する。 好ましくは、ミオスタチンプロモーターをコードしたＤＮＡ配列をクローン化
するホスト細胞はＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓなどのバチルス属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍやＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓなどの腸内細菌科といった他の原核
生物を使用することも可能である。
【００４０】 一般に、ホスト細胞が原核生物である場合、そのホスト細胞に対して適合性を
有する生物種に由来した複製及び制御配列を有するクローニングベクターが用い
られる。このベクターは更に、形質転換した細胞において表現型選択を可能とす
るマーカー遺伝子を有する。例として、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換には、通常、ｐ
ＢＲ３２２が用いられてきた。ｐＢＲ３２２はある種のＥ．ｃｏｌｉに由来する
プラスミドであり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を有
し、形質転換した細胞を容易に特定する手段を与えるものである。
有する生物種に由来した複製及び制御配列を有するクローニングベクターが用い
られる。このベクターは更に、形質転換した細胞において表現型選択を可能とす
るマーカー遺伝子を有する。例として、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換には、通常、ｐ
ＢＲ３２２が用いられてきた。ｐＢＲ３２２はある種のＥ．ｃｏｌｉに由来する
プラスミドであり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を有
し、形質転換した細胞を容易に特定する手段を与えるものである。
【００４１】 原核生物以外に酵母などの真核生物を使用することも可能であり、例としてＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや哺乳類や昆虫などの多細胞
生物に由来する培養細胞をホストとして使用することが可能である。有用な哺乳
動物の培養細胞の例として、ＨｅＬａ細胞やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、筋芽細胞、筋細胞、繊維芽細胞、及び衛星細胞がある。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや哺乳類や昆虫などの多細胞
生物に由来する培養細胞をホストとして使用することが可能である。有用な哺乳
動物の培養細胞の例として、ＨｅＬａ細胞やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、筋芽細胞、筋細胞、繊維芽細胞、及び衛星細胞がある。
【００４２】 哺乳動物細胞における使用に適当なクローニングベクターとしては、ＳＶ４０
や他の適当なウイルスベクターが含まれる。 本発明のＤＮＡ分子は、適当な天然のＤＮＡ源（筋肉、血液）から単離される
ＤＮＡ分子に挿入したり、従来の方法に基づいてイントロンを含まないｃＤＮＡ
として作製することが可能であるが、ｃＤＮＡが好ましい。
や他の適当なウイルスベクターが含まれる。 本発明のＤＮＡ分子は、適当な天然のＤＮＡ源（筋肉、血液）から単離される
ＤＮＡ分子に挿入したり、従来の方法に基づいてイントロンを含まないｃＤＮＡ
として作製することが可能であるが、ｃＤＮＡが好ましい。
【００４３】 本発明は更に、１以上のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失によって天然
の配列と異なったＤＮＡ分子の変異型もその範囲に含むものである。これらの変
異型は適当なシンセサイザを使用したＤＮＡの選択的合成によって作製するか、
部位特異的すなわちカセット突然変異誘発などにより天然ＤＮＡを改変するか、
あるいは当該技術分野において知られる他の任意の方法によって作製することが
可能である。こうした変異型は図１の配列番号１のＤＮＡ配列に対して６０〜９
５％の相同性を有し、これとほぼ同等の機能を有する。
の配列と異なったＤＮＡ分子の変異型もその範囲に含むものである。これらの変
異型は適当なシンセサイザを使用したＤＮＡの選択的合成によって作製するか、
部位特異的すなわちカセット突然変異誘発などにより天然ＤＮＡを改変するか、
あるいは当該技術分野において知られる他の任意の方法によって作製することが
可能である。こうした変異型は図１の配列番号１のＤＮＡ配列に対して６０〜９
５％の相同性を有し、これとほぼ同等の機能を有する。
【００４４】 ＤＮＡフラグメント、プローブ、及びプライマーの作製もやはり当業者の能力
の範囲内のものである。 本発明のＤＮＡ分子は、任意の適当な源から単離された天然のウシミオスタチ
ンから構成するか、あるいは作製される活性フラグメントのサイズによって許容
される合成オリゴヌクレオチドとして形成することが可能である。例として、Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ（Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. Vol 1
03: 3185-3191 (1981) ）によるトリエステル法を用いることが可能である。
の範囲内のものである。 本発明のＤＮＡ分子は、任意の適当な源から単離された天然のウシミオスタチ
ンから構成するか、あるいは作製される活性フラグメントのサイズによって許容
される合成オリゴヌクレオチドとして形成することが可能である。例として、Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ（Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. Vol 1
03: 3185-3191 (1981) ）によるトリエステル法を用いることが可能である。
【００４５】 一旦得られたＤＮＡ分子には、選択された制御配列とともに適当なクローニン
グベクターに挿入するための適当な処理が行われる。この目的でＤＮＡは必要に
応じて、切断、調整及び再結合される。
グベクターに挿入するための適当な処理が行われる。この目的でＤＮＡは必要に
応じて、切断、調整及び再結合される。
【００４６】 切断は、適当な緩衝液中で制限酵素にて処理することで行われる。市販の多数
の制限酵素の内の任意のものを製造者の指示に基づいて使用することが可能であ
る。切断後、核酸をエタノールによる沈殿などにより回収する。
の制限酵素の内の任意のものを製造者の指示に基づいて使用することが可能であ
る。切断後、核酸をエタノールによる沈殿などにより回収する。
【００４７】 切断したＤＮＡの調整は、従来の方法によって行うことが可能である。例とし
て、平滑末端が必要な場合、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩにて処理し（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）、フェノール及びクロロフォルムにて抽出し、エタノールにて沈殿させ
る。
て、平滑末端が必要な場合、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩにて処理し（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）、フェノール及びクロロフォルムにて抽出し、エタノールにて沈殿させ
る。
【００４８】 再結合は、適正なマッチング及び適当なリガーゼ（例 Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）
による処理のために適宜調整された、ほぼ等モル量の所望の成分を与えることに
よって行われる。
による処理のために適宜調整された、ほぼ等モル量の所望の成分を与えることに
よって行われる。
【００４９】 本発明はその更なる一態様において、対象とする異種遺伝子に機能的に連係さ
せられた、本発明のＤＮＡ分子であるウシミオスタチンプロモーターを含むＤＮ
Ａ構築体として構成される。この異種遺伝子は、ウシミオスタチンプロモーター
の転写制御下におかれる。
せられた、本発明のＤＮＡ分子であるウシミオスタチンプロモーターを含むＤＮ
Ａ構築体として構成される。この異種遺伝子は、ウシミオスタチンプロモーター
の転写制御下におかれる。
【００５０】 構築体は、筋原性調節因子、ミオスタチン及びミオスタチン受容体、ガン遺伝
子、筋肉の増殖及び分化を調節する遺伝子、筋ジストロフィー遺伝子、及び筋肉
において発現される他の任意の遺伝子を含む群から選択される異種遺伝子に機能
的に連係したウシミオスタチンプロモーターを含む。
子、筋肉の増殖及び分化を調節する遺伝子、筋ジストロフィー遺伝子、及び筋肉
において発現される他の任意の遺伝子を含む群から選択される異種遺伝子に機能
的に連係したウシミオスタチンプロモーターを含む。
【００５１】 ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて筋細胞内で発現することが望まし
い外来遺伝子すなわち異種遺伝子に結合されたミオスタチンプロモーターを有す
る構築体を構築するうえで、上記に述べたものに類似の方法を用いることが可能
である。
い外来遺伝子すなわち異種遺伝子に結合されたミオスタチンプロモーターを有す
る構築体を構築するうえで、上記に述べたものに類似の方法を用いることが可能
である。
【００５２】 本発明のＤＮＡ構築体を発現させるうえで好適に使用される複製可能なトラン
スファーベクターを使用して、繊維芽細胞やＨｅＬａ細胞などの培養筋細胞、培
養筋芽細胞、または筋管細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させて異種タンパク
質を生産することが可能である。
スファーベクターを使用して、繊維芽細胞やＨｅＬａ細胞などの培養筋細胞、培
養筋芽細胞、または筋管細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させて異種タンパク
質を生産することが可能である。
【００５３】 使用されるホスト細胞に基づいて複製可能なトランスファーベクターを選択す
ることが可能である。有用なベクターは通常次の特徴点を有する。 （ａ）自己複製能力。 （ｂ）標的部位、すなわち任意の特定の制限エンドヌクレアーゼによる切断部
位を１箇所有すること。
ることが可能である。有用なベクターは通常次の特徴点を有する。 （ａ）自己複製能力。 （ｂ）標的部位、すなわち任意の特定の制限エンドヌクレアーゼによる切断部
位を１箇所有すること。
【００５４】 （ｃ）望ましくは抗生物質に対する耐性などの、容易に選択可能なマーカー遺
伝子を有すること。 これらの特徴を有するベクターの代表的な２つのタイプは、プラスミド及び細
菌ウイルス（バクテリオファージまたは単にファージ）である。
伝子を有すること。 これらの特徴を有するベクターの代表的な２つのタイプは、プラスミド及び細
菌ウイルス（バクテリオファージまたは単にファージ）である。
【００５５】 使用可能な好適な真核細胞の発現ベクターの例としてはｐｃＤＮＡ１．１があ
り、その発現産物を単離、測定することが可能である。 遺伝子治療における公知の技術を用いて本発明の構築体をｉｎ ｖｉｖｏ発現
させることが可能である。例として、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕ
Ｌｖ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳｖ）、マウス乳腺癌ウイルス
（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）にミオスタチンプロモータ
ーを挿入することが可能である。多くの他のレトロウイルスベクターにおいて複
数の遺伝子を挿入することが可能である。ウイルスベクターにミオスタチンプロ
モーターを挿入することにより、このベクターを筋特異的な遺伝子を発現させる
ために使用することが可能である。
り、その発現産物を単離、測定することが可能である。 遺伝子治療における公知の技術を用いて本発明の構築体をｉｎ ｖｉｖｏ発現
させることが可能である。例として、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕ
Ｌｖ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳｖ）、マウス乳腺癌ウイルス
（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）にミオスタチンプロモータ
ーを挿入することが可能である。多くの他のレトロウイルスベクターにおいて複
数の遺伝子を挿入することが可能である。ウイルスベクターにミオスタチンプロ
モーターを挿入することにより、このベクターを筋特異的な遺伝子を発現させる
ために使用することが可能である。
【００５６】 ベクターの構築において、簡便かつ迅速なアッセイによって外来ＤＮＡを有す
るベクターを改変のないベクターから区別できることが有利である。こうしたア
ッセイにおいて有用なリポーターシステムとして、測定可能な色の変化、抗生物
質耐性などを与えるリポーター遺伝子及び他の検出可能な標識がある。好ましい
ベクターの１つではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子リポーター遺伝子が用いられて
いる。この遺伝子は、Ｘ−ｇａｌプレート上で青色の表現型を呈するクローンに
て検出される。これは選択を容易とするものである。一実施形態においては、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を多面体をコードする遺伝子にて置き換えることが可
能である。この遺伝子は、Ｘ−ｇａｌにて染色した場合に白色の表現型を呈する
クローンによって検出される。この青色−白色に基づいた選択を、組換えベクタ
ーを検出するための有用なマーカーとして利用することが可能である。
るベクターを改変のないベクターから区別できることが有利である。こうしたア
ッセイにおいて有用なリポーターシステムとして、測定可能な色の変化、抗生物
質耐性などを与えるリポーター遺伝子及び他の検出可能な標識がある。好ましい
ベクターの１つではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子リポーター遺伝子が用いられて
いる。この遺伝子は、Ｘ−ｇａｌプレート上で青色の表現型を呈するクローンに
て検出される。これは選択を容易とするものである。一実施形態においては、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を多面体をコードする遺伝子にて置き換えることが可
能である。この遺伝子は、Ｘ−ｇａｌにて染色した場合に白色の表現型を呈する
クローンによって検出される。この青色−白色に基づいた選択を、組換えベクタ
ーを検出するための有用なマーカーとして利用することが可能である。
【００５７】 一旦選択されたこのベクターは、凍結融解抽出後に精製を行うなどの通常の手
法によってカルチャーから単離することが可能である。 本発明は更なる別の一態様において、ミオスタチンの発現レベルの低い動物を
選択するための方法であって、ミオスタチンのプロモーター配列を遺伝子マーカ
ーとして基本的に使用する方法を提供するものである。これは、ミオスタチンの
プロモーター配列に沿って設計されたプライマーにより、血液から単離されたゲ
ノムＤＮＡを用いてミオスタチンのプロモーターをＰＣＲ増幅し、突然変異につ
いてこのゲノムＤＮＡをスキャニングすることによって実現される。
法によってカルチャーから単離することが可能である。 本発明は更なる別の一態様において、ミオスタチンの発現レベルの低い動物を
選択するための方法であって、ミオスタチンのプロモーター配列を遺伝子マーカ
ーとして基本的に使用する方法を提供するものである。これは、ミオスタチンの
プロモーター配列に沿って設計されたプライマーにより、血液から単離されたゲ
ノムＤＮＡを用いてミオスタチンのプロモーターをＰＣＲ増幅し、突然変異につ
いてこのゲノムＤＮＡをスキャニングすることによって実現される。
【００５８】 本発明を説明するための非限定的実施例を以下に述べる。 上記の説明はあくまで例示的なものであり、材料及び技術における当業者には
周知の変形は発明の範囲に含まれるものである。 実施例１ １． ミオスタチン遺伝子のクローン化 ウシミオスタチン遺伝子の５’側上流の調節配列をＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ（１９８９）の方法によってウシラムダゲノムライブラリ（ストラタジーン
社）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離した。このライブラリを、逆ＰＣＲによ
って単離した５００ｂｐのゲノムＤＮＡ（−１７００〜−１２００）によってス
クリーニングした。全ゲノムのクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロー
ニングし、配列を決定した。
周知の変形は発明の範囲に含まれるものである。 実施例１ １． ミオスタチン遺伝子のクローン化 ウシミオスタチン遺伝子の５’側上流の調節配列をＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ（１９８９）の方法によってウシラムダゲノムライブラリ（ストラタジーン
社）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離した。このライブラリを、逆ＰＣＲによ
って単離した５００ｂｐのゲノムＤＮＡ（−１７００〜−１２００）によってス
クリーニングした。全ゲノムのクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロー
ニングし、配列を決定した。
【００５９】 このＰＩ−ＰＣＲ法はＫ．Ｍ．Ｐａｎｇ及びＤ．Ａ．Ｋｎｅｃｈｔ（１９９７
）によって述べられた方法に改良を加えたものである。ＰＣＲにおいてテンプレ
ートとして使用するために一連のＳａｕ３Ａ１消化物を調製した。ウシのゲノム
ＤＮＡの１０μｇ量を、Ｓａｕ３Ａ１（ニューイングランドバイオラブズ社）（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，米国）により２，０．５，０．１２
５，０．０３１，０．００８，０．００４，０．００２Ｕ／μｇＤＮＡで１時間
３７℃で消化した。反応は６５℃にて２０分加熱して停止させた。各反応混合物
を２μｇづつ１％アガロースゲル上で分離して切断の度合いを確認した。消化の
程度に基づき、１つの部分消化物を更なる操作のために選択した（０．００８Ｕ
のＳａｕ３Ａ１／μｇＤＮＡ）。このＤＮＡをエタノール沈殿させて、１×リガ
ーゼバッファーに５ｎｇ／μｌの最終濃度となるように再懸濁した。Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，米国）を４Ｕ／μｌの濃
度となるように加えて２２℃にて一晩かけてライゲーションさせた。６５℃にて
２０分加熱してライゲーションを停止させ、フェノール次いでクロロフォルムに
て抽出し、エタノール沈殿させ、５０ｎｇ／μｌの濃度となるように滅菌水に再
懸濁した。ウシミオスタチンの５’側が翻訳されたＤＮＡ配列から外側に向かう
２つのプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣ
及び５’−ＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＡ）を使用してＰＩ
−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２５０ｎｇの再連結させたＤＮＡ、及び０．２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ（ギブコＢＲＬ社）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国）を含む５０μ
ｌの反応物中にて行った。製造業者により提供された１×「Ｂ」バッファに加え
た０．８μＭの各プライマーと２μｌのＥｌｏｎｇａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉ
ｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国）を加えた。９４℃にて３０秒間、５５℃にて２
分間、６８℃にて６分間で、３５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％
アガロースゲル上で分離して２ｋｂのバンドを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ
Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社
）（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）によって精製して、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（インビトロゲン社）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）によってクローン
化した。この２ｋｂのインサートを順方向及び逆方向のＭ１３プライマー５’−
ＧＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧ及び５’−ＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ
ＴＣＴＣＴＴＧを用いて配列決定した。
）によって述べられた方法に改良を加えたものである。ＰＣＲにおいてテンプレ
ートとして使用するために一連のＳａｕ３Ａ１消化物を調製した。ウシのゲノム
ＤＮＡの１０μｇ量を、Ｓａｕ３Ａ１（ニューイングランドバイオラブズ社）（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，米国）により２，０．５，０．１２
５，０．０３１，０．００８，０．００４，０．００２Ｕ／μｇＤＮＡで１時間
３７℃で消化した。反応は６５℃にて２０分加熱して停止させた。各反応混合物
を２μｇづつ１％アガロースゲル上で分離して切断の度合いを確認した。消化の
程度に基づき、１つの部分消化物を更なる操作のために選択した（０．００８Ｕ
のＳａｕ３Ａ１／μｇＤＮＡ）。このＤＮＡをエタノール沈殿させて、１×リガ
ーゼバッファーに５ｎｇ／μｌの最終濃度となるように再懸濁した。Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，米国）を４Ｕ／μｌの濃
度となるように加えて２２℃にて一晩かけてライゲーションさせた。６５℃にて
２０分加熱してライゲーションを停止させ、フェノール次いでクロロフォルムに
て抽出し、エタノール沈殿させ、５０ｎｇ／μｌの濃度となるように滅菌水に再
懸濁した。ウシミオスタチンの５’側が翻訳されたＤＮＡ配列から外側に向かう
２つのプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣ
及び５’−ＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＡ）を使用してＰＩ
−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２５０ｎｇの再連結させたＤＮＡ、及び０．２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ（ギブコＢＲＬ社）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国）を含む５０μ
ｌの反応物中にて行った。製造業者により提供された１×「Ｂ」バッファに加え
た０．８μＭの各プライマーと２μｌのＥｌｏｎｇａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉ
ｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国）を加えた。９４℃にて３０秒間、５５℃にて２
分間、６８℃にて６分間で、３５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％
アガロースゲル上で分離して２ｋｂのバンドを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ
Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社
）（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）によって精製して、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（インビトロゲン社）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）によってクローン
化した。この２ｋｂのインサートを順方向及び逆方向のＭ１３プライマー５’−
ＧＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧ及び５’−ＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ
ＴＣＴＣＴＴＧを用いて配列決定した。
【００６０】 ２． ＣＡＴリポーターベクターの構築 ３．３ｋｂのミオスタチンの上流ゲノムＤＮＡをウシのゲノムＤＮＡをテンプ
レートとして用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにおいて使用したプライマーは、
ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡ（順方向
）、及び、ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＫＡＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣＴ（
逆方向）である。ＰＣＲ条件は、９４℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃
で６０秒間である（３５サイクル）。このように増幅した３．３ｋｂのＤＮＡを
通常のクローニング法によってＫｐｎＩフラグメントとしてｐＣＡＴ３プロモー
ターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。この構築体をｐＭＳ２６と
呼ぶものとする。
レートとして用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにおいて使用したプライマーは、
ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡ（順方向
）、及び、ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＫＡＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣＴ（
逆方向）である。ＰＣＲ条件は、９４℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃
で６０秒間である（３５サイクル）。このように増幅した３．３ｋｂのＤＮＡを
通常のクローニング法によってＫｐｎＩフラグメントとしてｐＣＡＴ３プロモー
ターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。この構築体をｐＭＳ２６と
呼ぶものとする。
【００６１】 ３． トランスフェクション及びＣＡＴ ＥＬＩＳＡ ４μｇのＣＭＶ−ＣＡＴ（ポジティブコントロール）、ｐＣＡＴプロモーター
（ネガティブコントロール）、及びｐＭＳ２６ベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロ
シュダイアグノスティック社）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造
者のプロトコルに基いて使用し、活発に増殖しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞のカル
チャーにトランスフェクトした。この後、細胞を洗い、細胞抽出物中のＣＡＴタ
ンパク質の量を製造者のプロトコルに基いてＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。
（ネガティブコントロール）、及びｐＭＳ２６ベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロ
シュダイアグノスティック社）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造
者のプロトコルに基いて使用し、活発に増殖しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞のカル
チャーにトランスフェクトした。この後、細胞を洗い、細胞抽出物中のＣＡＴタ
ンパク質の量を製造者のプロトコルに基いてＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。
【００６２】 結果 ３．３ｋｂの上流配列にはミオスタチンのエンハンサー配列が含まれる。 筋原細胞中のミオスタチンの発現を促進するエンハンサー配列を特定するため
、３．３ｋｂの上流ゲノムＤＮＡ（ｐＭＳ２６）を有するリポーターＣＡＴ構築
体を作製し、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞細胞系にトランスフェクトした。このアッセイ
ではｐＣＡＴプロモーターベクター及びＣＭＶ ＣＡＴ構築体をそれぞれネガテ
ィブ及びポジティブコントロールとして使用した。トランスフェクトしたＣ２Ｃ
１２筋芽細胞の細胞破砕液をＥＬＩＳＡによってＣＡＴタンパク質についてアッ
セイすることにより、ミオスタチンプロモーター構築体（ｐＭＳ２６）をトラン
スフェクトした細胞ではＣＡＴ含量が２５０ピコグラム／ｍｌであることが示さ
れた（図２）。これに対し、ネガティブコントロールとしてのベクター（ｐＣＡ
Ｔプロモーターベクター）をトランスフェクトした細胞では、ＣＡＴタンパク質
の含量は５ピコグラム／ｍｌであった（図２）。
、３．３ｋｂの上流ゲノムＤＮＡ（ｐＭＳ２６）を有するリポーターＣＡＴ構築
体を作製し、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞細胞系にトランスフェクトした。このアッセイ
ではｐＣＡＴプロモーターベクター及びＣＭＶ ＣＡＴ構築体をそれぞれネガテ
ィブ及びポジティブコントロールとして使用した。トランスフェクトしたＣ２Ｃ
１２筋芽細胞の細胞破砕液をＥＬＩＳＡによってＣＡＴタンパク質についてアッ
セイすることにより、ミオスタチンプロモーター構築体（ｐＭＳ２６）をトラン
スフェクトした細胞ではＣＡＴ含量が２５０ピコグラム／ｍｌであることが示さ
れた（図２）。これに対し、ネガティブコントロールとしてのベクター（ｐＣＡ
Ｔプロモーターベクター）をトランスフェクトした細胞では、ＣＡＴタンパク質
の含量は５ピコグラム／ｍｌであった（図２）。
【００６３】 考察 転写の調節は、発生及び分化における組織特異的遺伝子の発現パターンを決定
するうえで重要である。胎児の筋発生の初期においては、ＭＲＦ（ＭｙｏＤ、ミ
オゲニン、Ｍｙｆ−５、及びＭＲＦ−５）、Ｐａｘ−３、などの複数の転写因子
が、筋特異的遺伝子の転写を能動的に調節することによって筋発生の前駆細胞（
筋芽細胞）の決定、分裂、及び分化を制御する（Rudnicki and Jaenisch, 1995
）。筋肉の成長を負に調節する遺伝子であるミオスタチンは、体節において胎児
の筋発生の初期に発現し、成人の体軸筋及び軸傍筋においては継続して発現する
（Kambadur et al., 1997 ）。更に、ミオスタチン遺伝子の発現については、異
なる体軸筋及び軸傍筋において異なる調節が行われていることも示されている（
Kambadur et al., 1997 ）。今回、発明者等はミオスタチン遺伝子の上流配列を
単離し、この上流ゲノムＤＮＡにおいて複数の筋特異的ＤＮＡ結合配列を特定し
た。更に発明者等は、３．３ｋｂの上流ＤＮＡが筋発生の前駆細胞系におけるＣ
ＡＴ遺伝子の発現を引き起こすことを示した。この単離された上流配列は、「Ｃ
ＡＴ」ボックス及び「ＴＡＴＡ」ボックス配列などの、一般的な真核生物の基礎
プロモーター（Cohen et al 1986, Wingender 1988）と共通の配列を有する。Ｃ
ＡＴボックス（ＣＡＡＡＴＧ）の共通配列は−２０６ｂｐを中心として存在し、
２つのＴＡＴＡボックスの共通配列はそれぞれ−１３９ｂｐ及び−１６３ｂｐを
中心として存在する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写
において前開始複合体を形成する段階の初期において、よく調べられた基礎的な
転写因子であるＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）に結合する。更に発
明者等はミオスタチンの上流配列に複数の「Ｅ」ボックスを発見した（Lassar e
t al 1989 ）。Ｅボックスはｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ ｌｏｏｐ ｈｅｌｉｘ（
ｂＨＬＨ）転写因子、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ−５、ＭＲＦ−４及びミオゲニンのよう
な筋発生の調節因子に結合することが示された。これらのｂＨＬＨ転写因子はｂ
ＨＬＨＤＮＡ結合ドメインを介して複数の筋特異的遺伝子のプロモーターに結合
し、これらの遺伝子の転写活性化を制御することが示された（Rudnicki and Jae
nisch, 1995 ）。発明者等は更に、ミオスタチンプロモーターの−５８４ｂｐに
別の筋特異的転写アクティベーターＭＥＦ−２（ＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴ）を見
出したが、これは、ミオスタチン遺伝子の調節は複数の独立した筋特異的転写因
子によって行われることを示すものである（G ossett et al 1989）。
するうえで重要である。胎児の筋発生の初期においては、ＭＲＦ（ＭｙｏＤ、ミ
オゲニン、Ｍｙｆ−５、及びＭＲＦ−５）、Ｐａｘ−３、などの複数の転写因子
が、筋特異的遺伝子の転写を能動的に調節することによって筋発生の前駆細胞（
筋芽細胞）の決定、分裂、及び分化を制御する（Rudnicki and Jaenisch, 1995
）。筋肉の成長を負に調節する遺伝子であるミオスタチンは、体節において胎児
の筋発生の初期に発現し、成人の体軸筋及び軸傍筋においては継続して発現する
（Kambadur et al., 1997 ）。更に、ミオスタチン遺伝子の発現については、異
なる体軸筋及び軸傍筋において異なる調節が行われていることも示されている（
Kambadur et al., 1997 ）。今回、発明者等はミオスタチン遺伝子の上流配列を
単離し、この上流ゲノムＤＮＡにおいて複数の筋特異的ＤＮＡ結合配列を特定し
た。更に発明者等は、３．３ｋｂの上流ＤＮＡが筋発生の前駆細胞系におけるＣ
ＡＴ遺伝子の発現を引き起こすことを示した。この単離された上流配列は、「Ｃ
ＡＴ」ボックス及び「ＴＡＴＡ」ボックス配列などの、一般的な真核生物の基礎
プロモーター（Cohen et al 1986, Wingender 1988）と共通の配列を有する。Ｃ
ＡＴボックス（ＣＡＡＡＴＧ）の共通配列は−２０６ｂｐを中心として存在し、
２つのＴＡＴＡボックスの共通配列はそれぞれ−１３９ｂｐ及び−１６３ｂｐを
中心として存在する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写
において前開始複合体を形成する段階の初期において、よく調べられた基礎的な
転写因子であるＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）に結合する。更に発
明者等はミオスタチンの上流配列に複数の「Ｅ」ボックスを発見した（Lassar e
t al 1989 ）。Ｅボックスはｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ ｌｏｏｐ ｈｅｌｉｘ（
ｂＨＬＨ）転写因子、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ−５、ＭＲＦ−４及びミオゲニンのよう
な筋発生の調節因子に結合することが示された。これらのｂＨＬＨ転写因子はｂ
ＨＬＨＤＮＡ結合ドメインを介して複数の筋特異的遺伝子のプロモーターに結合
し、これらの遺伝子の転写活性化を制御することが示された（Rudnicki and Jae
nisch, 1995 ）。発明者等は更に、ミオスタチンプロモーターの−５８４ｂｐに
別の筋特異的転写アクティベーターＭＥＦ−２（ＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴ）を見
出したが、これは、ミオスタチン遺伝子の調節は複数の独立した筋特異的転写因
子によって行われることを示すものである（G ossett et al 1989）。
【００６４】 結論 ・ミオスタチンの上流調節配列の１０．０ｋｂを含むゲノムのクローンが初め
て単離された。 ・ミオスタチン遺伝子のエンハンサー配列が特徴付けされた。 ・筋特異的エンハンサー配列に特異的に見られる複数のＥボックス及び１箇所
のＭＥＦ−３結合部位はミオスタチンのエンハンサー配列においても見られる。
て単離された。 ・ミオスタチン遺伝子のエンハンサー配列が特徴付けされた。 ・筋特異的エンハンサー配列に特異的に見られる複数のＥボックス及び１箇所
のＭＥＦ−３結合部位はミオスタチンのエンハンサー配列においても見られる。
【００６５】 本開示は発明を上記の実施例のみに限定することを企図するものではなく、当
業者であれば直ちに想到されるところの多くの変形例が、特許請求の範囲によっ
て定義されるところの発明の範囲から逸脱することなく可能である点は認識され
るであろう。
業者であれば直ちに想到されるところの多くの変形例が、特許請求の範囲によっ
て定義されるところの発明の範囲から逸脱することなく可能である点は認識され
るであろう。
【００６６】 参考文献 [1] Wingender E. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 1879-1902. [2] Cohen R.B. et al (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 821-832.
【００６７】 [3] Lassar B.A. et al (1989) Cell 58, 823-831. [4] Gossett L .A. et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 5022-5033.
【００６８】 [5] Pang K.M. and Knecht D.A. (1977) Biotechnologies 22: 1046-1048 [6] Rudnicki M.A. and Jaenisch R. (1995). BioEssays. 17 3 203-209
【００６９】 [7] Kambadur R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci 87 9168-9172 [8] Kambadur R et al (1997) Genome Research 7: 910-915
【００７０】 ここに列記した文献のすべてはそれらの全容を本明細書中に援用するものである
。
。
【図１】ウシの筋肉から単離されたミオスタチン遺伝子のプロモーター配列
（配列番号１）。
（配列番号１）。
【図２】図１のプロモーター配列のプロモーター活性を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 カンバドゥール、ラヴィ ニュージーランド国 2001 ハミルトン アドミラル クレセント 41 (72)発明者 シャルマ、ムリドゥラ ニュージーランド国 2001 ハミルトン アドミラル クレセント 41 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA21 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA12 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44
Claims (24)
- 【請求項１】 配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子
であって、ミオスタチン遺伝子のプロモーター領域またはそのフラグメントまた
は、１以上のヌクレオチドの挿入、置換、または欠失によって改変されたその変
異型をコードし、該ポリヌクレオチド配列の該フラグメント及び変異型は該プロ
モーター領域と実質的に同等の機能を有する単離ＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 ミオスタチン遺伝子のプロモーター領域をコードした単離Ｄ
ＮＡ分子であって、 ａ）配列番号１のＤＮＡ分子に対して少なくとも６０％の相同性を有するＤＮ
Ａ分子と、 ｂ）ａ）のＤＮＡ分子に対して標準的な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分
子とからなる群から選択されるＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 ａ）配列番号１のＤＮＡ分子に対して少なくとも７０〜９５
％の相同性を有するＤＮＡ分子と、 ｂ）ａ）のＤＮＡ分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡ分子とからなる群から選択される請求項２に記載の単離ＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 少なくとも機能的に連係させられた異種遺伝子を発現させる
うえで充分な配列番号１のポリヌクレオチド配列の部分、または実質的にこれと
同等の機能を有する変異型を含む単離プロモーター配列。 - 【請求項５】 前記プロモーターは組織特異的である請求項４に記載の単離
プロモーター配列。 - 【請求項６】 前記プロモーターは筋細胞に特異的に発現を引き起こす請求
項５に記載の単離プロモーター配列。 - 【請求項７】 ウシミオスタチンのプロモーターまたはそのフラグメントま
たは変異型である請求項４乃至６のいずれか１項に記載の単離プロモーター配列
。 - 【請求項８】 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を有する
組換えクローニングベクター。 - 【請求項９】 請求項８に記載の組換えクローニングベクターにて形質転換
させられるか、もしくはトランスフェクトしたホスト細胞。 - 【請求項１０】配列番号１のポリヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連
続したヌクレオチドか、あるいはこれに相補的なものを含む単離プローブ。 - 【請求項１１】対象とする遺伝子のコーディング配列に機能的に連係させら
れた請求項４乃至７のいずれか１項に記載のプロモーター配列を有する組換えＤ
ＮＡ構築体。 - 【請求項１２】前記対象とする遺伝子は、筋形成調節因子、ミオスタチン及
びミオスタチン受容体、癌遺伝子、筋細胞の増殖及び分化を調節する遺伝子、筋
ジストロフィー遺伝子、ならびに筋肉において発現する他の任意の遺伝子からな
る群から選択される請求項１１に記載の組換えＤＮＡ構築体。 - 【請求項１３】請求項１１または１２に記載のＤＮＡ構築体を含むベクター
。 - 【請求項１４】請求項１３に記載のベクターにて形質転換させられるか、ト
ランスフェクトしたホスト細胞。 - 【請求項１５】請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子をクロー
ン化するための方法であって、 ａ）前記単離ＤＮＡ分子を複製可能な適当なクローニングベクターに挿入する
工程と、 ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記ベクターによりホスト細胞を形質転換するかもし
くはトランスフェクトする工程と、 ｃ）前記ホスト細胞を培養する工程と、 ｄ）クローン化されたＤＮＡ分子を単離する工程とを含む方法。 - 【請求項１６】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項４に記載の単離プロモーター配列。 - 【請求項１８】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項８に記載の組換えクローニングベクター。 - 【請求項１９】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項９に記載のホスト細胞。 - 【請求項２０】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１０に記載の単離プローブ。 - 【請求項２１】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１１に記載のＤＮＡ構築体。 - 【請求項２２】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１３に記載のベクター。 - 【請求項２３】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１４に記載のホスト細胞。 - 【請求項２４】付属の図面に基いて本明細書に実質的に記載されるか例示さ
れた請求項１５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NZ33090298 | 1998-07-07 | ||
| NZ330902 | 1998-07-07 | ||
| PCT/NZ1999/000107 WO2000001810A1 (en) | 1998-07-07 | 1999-07-07 | Novel promoter sequences of myostatin gene |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| AU (1) | AU760608B2 (ja) |
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| EP1072680A1 (en) * | 1999-07-30 | 2001-01-31 | Pfizer Products Inc. | Myostatin regulatory region, nucleotide sequence determination and methods for its use |
| AU2001261650A1 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-26 | Geron Corporation | Ovine tissue for xenotransplantation |
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| CN103421786B (zh) * | 2013-04-24 | 2015-04-22 | 华中农业大学 | 鼠肌肉分化时期特异性表达基因启动子的克隆与应用 |
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