KR100267837B1 - 화학요법제에 대한 감작성을 가진 억제유전자 - Google Patents

화학요법제에 대한 감작성을 가진 억제유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학적 치료제에 대한 감도와 결부된 유전인자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 인자를 확인하는 방법과 상기 인자를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학요법제에 대한 감수성과 결부된 클로닝된 유전자를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전 억제 요소
[발명의 배경]
1. 발명의 분야
본 발명은 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전 인자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 인자를 확인하는 방법과 상기 인자를 사용하는 것에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 요약
광범위한 화학요법제가 사람의 암의 치료에 사용된다. 예를 들어, 교재 CANCER(Principles ＆ Practice of Oncology, 2nd edition, (De Vita 등, Eds), J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA (1985))에서는 다음과 같은 주요 항종양제를 개시하였다 : 식물성 알칼로이드 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 VM-26 ; 항생제 악티노마이신-D, 독소루비신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신 C 및 블레오마이신 ; 항 대사 작용제 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 5-플루오로데옥시우리딘 ; 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시토신 아라비노사이드, 5-아자시티딘 및 히드록시우레아; 알킬화제시클로포스파미드, 멜팔란, 부술판(busulfan) , CCNU, MeCCNU, BCNU, 스트렙토조톡신, 클로르암부실, 비스-디아민디클로로-백금, 아제티디닐벤조퀴논 ; 그리고 기타의 약제인 다카르바진, mAMSA 및 미톡산트론.
이들 화학요법제 및 에토포시드와 암사크린과 같은 그 밖의 화학 치료제는 암의 치료에 매우 유용한 것으로 판명되었다. 불행히도, 일부 암세포들은 특정 화학 치료제에 대하여, 몇몇 경우에는 다수의 화학요법제에 대해 내성을 가지게 된다. 이러한 약제 내성이나 다중 약제 내성은, 이론적으로, 약제에 대한 내성을 부여하는 유전 인자가 존재하거나 약제에 대해 감수성을 부여하는 유전 인자가 없음으로 인해 발생한다. 전자 타입의 인자는 확인되었으며, 다중 약제 내성 유전자 mdr-l가 있다 [참조: Chen et al., 1986, Cell 47:381-389)을 포함하고 있다. 그러나, 후자 타입의 인자에 대해서는 거의 알려진 바가 없는데, 이는 부분적으로는 이러한 인자의 부재가 열성인 경향이 있기 때문이다.
상기와 같은 유전자의 발견은 암세포 및 약물 내성 암세포에 대한 진단 및 치료적 접근 방법 뿐만 아니라 유전자 치료 및 합리적인 약제의 구성에 있어서의 발전까지도 가능하게 하므로, 화학 치료제에 대한 감수성과 결부된 유전자의 확인이 요망된다. 최근, 세포 독성 약물의 감수성과 관련된 열성 유전자 요소를 포함하는 열성 유전자 요소를 단리시키기 위한 어려운 분야에서 어느 정도의 발전이 이루어졌다. 1993년 6월 8일자 등록된 로닌슨 등의 미합중국 특허 제 5,217,889 호에서는 특정 유전 억제 요소(genetic suppressor element)에 해당하는 유전자에 대해 열성 표현형을 부여하는 우성 네거티브 인자인 GSE를 얻는 보편적인 방법을 교시한다(Holzmayer 등, 1992, Acids Res. 20:711-711 참조). 구드코프 등(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3231-3235)은 토포이소머라제 Ⅱ cDNA로부터 토포이소머라제 Ⅱ와 상호 작용하는 약제에 대한 내성을 유도하는 GSE의 단리 방법을 교시하고 있다. 그러나, 여전히 화학 치료제에 대한 감수성과 결부된 미지의 유전자 또는 유전자 요소를 확인해야 할 필요성이 있으며, 이는 GSE 제조용 출발물질로서 클론된 유전자를 입수할 수 없어 더욱 어려워진다. 이러한 유전자나 유전자 요소들은 1가지 이상의 화학 치료제에 대한 감수성에 결부된 통상의 경로에 포함되는 것이 바람직하다. 상기 유전자 또는 유전자 요소는 약물 감수성 표현형의 상실을 일으키는 GSE의 직접적 선택에 의해 확인할 수 있다.
[본 발명의 간단한 설명]
본 발명은 세포에게 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제 요소(GSE)를 제공한다. 이들 GSE는, 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자로부터 유래된 무작위 단편이지만, 이러한 유전자의 특성은 매우 놀라울 수 있다.
제 1의 관점에 있어서, 본 발명은 내성이 발생될 수 있는 임의의 화학요법제에 대해 내성을 부여하는 GSE의 확인 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 전체 cDNA로부터 유래된 무작위 단편 발현 라이브러리로부터의 클론을 함유하는 세포의 화학요법제 선택과, 약제 내성 세포로부터의 라이브러리 삽입체의 후속 회수를 이용한다. 제 2의 관점에 있어서, 본 발명은 아직까지 발견되지 않은 유전자를 포함하여 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자를 확인하고, 클로닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포에게 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 GSE(또는 이러한 GSE의 일부를 구성하는 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드)를 갖는 온길이의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및 수득된 모든 포지티브 클론의 cDNA 삽입체의 누클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 제 3의 관점에서, 본 발명은 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자에 대해 최적화된 억제제 활성을 갖는 GSE를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 동일한 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자의 DNA로부터 유래된 무작위 단편 발현 라이브러리로부터의 클론을 함유하는 세포의 화학요법제 선택과, 약제 내성 세포들로부터의 라이브러리 삽입체의 후속 회수를 이용한다. 제 4의 관점에서, 본 발명은 세포에게 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드를 제공한다. 이들 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드는 본 발명에 따른 약제 내성 부여 GSE의 서열을 기초로 하여 설계된 것이다.
제 5의 관점에서, 본 발명은 특정 유전자의 발현의 부재, 또는 저발현으로 인해 1종 이상의 화학요법제에 대해 내성이 있는 종양 세포를 검정하는 방법을 제공한다. 이 검정법은 시험하려는 특정 암세포 샘플에 의한 특정 유전자 생성물의 발현 수준을 정량하는 것을 포함한다. 제 6의 관점에서, 본 발명은 유전자 동시 전달 실험에 유용한 우성 선택성 마커를 제공한다. 이들 우성 선택성 마커는 적절한 전사 제어 요소에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 약물 내성 부여 GSE이다. 제 7의 관점에서, 본 발명은 유전자 치료법 및 암에 대한 개선된 화학요법에 유용한 생체내 선택성 마커를 제공한다. 이러한 생체내 선택성 마커는 혈액 선구 세포내로 전달된 후, 동시 전달된 치료 유전자를 함유한 세포, 또는 화학요법의 경우 화학요법제 내성을 부여 GSE만을 함유한 세포에만 환자의 혈액을 재증식시키기 위해 사용된다. 제 8의 관점에서, 본 발명은 화학요법제에 대해 내성이 있는 암세포에 대해 유용한 약제 생성물의 합리적인 설계를 위한 출발점을 제공한다. 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자의 구조, 기능, 위치 또는 발현 패턴을 조사함으로써, 이러한 유전자가 발현되지 않거나 저발현되는 암 세포내의 약제 내성을 극복하는 약제 생성물을 생성시키는 방법이 개발될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 세포에게 에토포시드 내성을 부여하고, 실시예 1에 개시된 바와 같이, 단일의 유전자 무작위 단편 발현 라이브러리를 이용하여 토포이소머라제 Ⅱ DNA로부터 유래된, 12개의 GSE의 누클레오티드 서열을 도시한다. 도시된 GSE는, (A) 클론 2V[서열 확인 번호 1], (B) 클론11[서열 확인 번호 2], (C) 클론 6[서열 확인 번호 3], (D) 클론 5[서열 확인 번호 4], (E) 클론28[서열 확인 번호 5], (F) 클론2[서열 확인 번호 6], (G) 클론20[서열 확인 번호 7], (H) 클론 39[서열 확인 번호 8], (I) 클론 12S[서열 확인 번호 9], (J) 클론8[서열 확인 번호 10], (K) 클론VPS2[서열 확인 번호 11], 및 (L) 클론VM[서열 확인 번호 12]이다.
제2도는 NIH 3T3 cDNA로부터 RFEL을 구성하는 방법을 도시한다. 패널 A는 전반적인 구성 방법을 도시한다. 패널 B는 cDNA 단편의 정상화를 도시한다, 상기 패널에서, t는 분획화되지 않은 전체 cDNA를 나타내고, s와 d는 히드록시아파타이트에 의해 분리된 단일 가닥 및 2중 가닥 분획을 나타내며, 시간은 리어닐링 (reannealing)의 기간을 나타내며, 튜불린, c-mys 및 c-fos는 전체 가닥, 단일 가닥 및 2중 가닥으로 서던 하이브리드화(hybridization)에 사용된 프로브를 지시한다.
제3도는 cDNA 클로닝에 사용되는 LNCX 벡터와 어댑터의 구조를 도시한다. 어댑터의 ATG-센스 가닥[서열 확인 번호 13]과 ATG-앤티센스 가닥[서열 확인 번호 14]에 대한 누클레오티드 서열이 도시되어 있다.
제4도는 화학요법제 내성 부여 GSE가 함유된 세포주를 선택하고, 이들 세포로부터 GSE를 회수하는 전반적인 방법을 도시하였다.
제5도에는 미리 선택된 바이러스에 의해 부여된 에토포시드 내성(패널 A) 및 선택된 집단과 선택되지 않은 집단의 PCR 분석(패널 B)이 도시되어 있다.
제6도에는 실시예 4에 설명된 대로, 에토포시드 내성인 것으로 선택된 세포들로부터의 개개의 PCR 증폭된 단편들을 LNCX-벡터내로 리클로닝 하는 방법이 도시되어 있다.
제7도는 GSE VPA(패널 A) 및 VP9-11(패널 B)에 의해 세포에게 부여된, 350ng/㎖ 에토포시드에 대한 내성을 입증한 것이다.
제8도는 IPTG 유도성 프로모터하의 GSE 항-khcs에 의해 세포에게 부여된, 다양한 농도의 에토포시드에 대한 내성(패널 A)과 이러한 선택을 위한 구성(패널 B)을 나타낸 것이다.
제9도는 GSE 항-khcs의 누클레오티드 서열[서열 확인 번호 15]을 나타낸 것이다.
제10도는 GSE VPA의 누클레오티드 서열[서열 확인 번호 16]을 나타낸 것이다.
제11도는 GSE VP9-11의 누클레오티드 '서열[서열 확인 번호 17]을 나타낸 것이다.
제12도는 마우스 khcs cDNA의 대부분의 코딩 영역의 누클레오티드 서열[서열 확인 번호 18]을 나타낸 것이다.
제13도는 제12도에 도시된 누클레오티드 서열로부터 추론된 khcs 단백질 서열과, 사람(패널 A), 마우스(패널 B), 꼴뚜기(패널 C)로부터의 키네신 중쇄 서열, 또는 항-khcs GSE에 의해 코드화된 마우스 khcs의 일부(패널 D)와의 도트(dot) 매트릭스 정렬을 도시한 것이다.
제14도는 다양한 화학요법제의 존재하에, LNCX 벡터(X표로 표시함) 또는 항-khcs GSE를 함유한 LNCX 벡터(점으로 표시함)로 감염된 NIH 3T3 세포의 플레이팅 효율을 도시한 것이다.
제15도는 LNCX 벡터만으로 감염시킨 세포 또는 감염시키지 않은(대조) 세포에 비해, 항-khcs를 함유한 LNCX 벡터로 감염시킨 1차 마우스 배아 섬유아세포의 불멸화가 증가됨을 입증하는 것이다
제16도는 다수의 비선택되고, 에토포시드 선택된 사람 HeLa 세포에서의 사람 khcs 유전자의 발현의 cDNA-PCR 정량 분석을 도시한 것이다. 레인 a는 클론 CS(O)에 대한 결과를 도시하고, 레인 a'는 CX(200)에 대한 결과를 도시하고, 레인 b는 클론/11(o)에 대한 결과를 도시하고, 레인 b'는 클론/11(1000)에 대한 결과를 도시하고, 레인 c는 클론 6(0)에 대한 결과를 도시하고, 레인 c'는 클론 6(1000)에 대한 결과를 도시하고, 레인 d는 클론20(o)에 대한 결과를 도시하고, 레인 d'는 클론20(1000)에 대한 결과를 도시한다. 각 클론들의 명칭에 대한 소괄호속의 숫자는 성장 배지에 존재하는 에토포시드의 농도(ng/㎖)를 나타낸다. khcs 발현을 나타내는 밴드를 내부 대조군으로서의 β-2 마크로글로불린 발현에 대한 밴드를 따라 도시하였다.
[본 발명의 바람직한 구체예에 대한 상세한 설명]
본 발명은 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 특정 유전자 기능을 억제하는 수단에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 억제 효과를 가짐으로써 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제 요소(GSE)를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 GSE의 확인 방법 및 그 사용 방법도 제공한다.
제 1의 관점에 있어서, 본 발명은 내성이 발생될 수 있는 어떠한 화학 치료제에 대해서도 내성을 부여하는 GSE의 확인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따라 확인된 GSE는 1종 이상의 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자와 상동일 것이다. 본 발명의 목적상 "유전자와 상동"이라는 표현은, GSE가 앤티센스 또는 항유전자 메카니즘을 통해 작용하는지, 또는 단백질 수준에서의 간섭 메카니즘을 통해 작용하는지에 따라 2가지의 상이한 의미를 가지게 된다. 전자의 경우에, 앤티센스 또는 항유전자 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드인 GSE는, 이것이, 생리학적 조건하에, 호크슈텐 또는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 유전자 또는 이것의 mRNA 전사체와 하이브리드화하는 누클레오티드 서열을 갖는 경우에 상기 유전자와 상동이다. 후자의 경우에 있어서, 단백질 분자를 간섭하는 GSE는, 이것이, 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 상기 단백질을 코드화하는 유전자의 일부에 의해 코드화되는 아미노산 서열과 같거나 같게 될 아미노산 서열을 가지는 경우, 상기 단백질 분자를 코드화하는 유전자와 상동이다. 둘 모두의 경우에 있어서, 실질적인 문제로서, GSE가 유전자와 상동인가의 여부는 GSE가 유전자의 기능을 억제시키거나 감소시킬 수 있는지를 평가함으로써 결정된다.
본 발명의 상기 관점에 따른 방법은, 전체 cDNA 또는 게놈 DNA 무작위 단편 발현 라이브러리를 표현형에 따라 스크리닝하여 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 클론을 확인하는 단계를 포함한다. 전체 cDNA 또는 게놈 DNA의 무작위 단편의 라이브러리는 레트로바이러스 발현 벡터내에 클로닝되는 것이 바람직하다. 상기 바람직한 구체예에서는, 라이브러리를 함유하는 레트로바이러스 입자들을 사용하여 세포들을 감염시키고, 감염된 세포들을, 감염되지 않은 세포를 사멸시키는 농도의 화학요법제내에서 생존할 수 있는 능력에 대하여 시험하였다. 라이브러리 중의 삽입체들은, 바람직하게는 약 100bp 내지 약 700bp의 범위이고, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 500bp의 범위일 것이다. 가장 바람직하게는, 무작위 단편 라이브러리는 임의의 유전자의 발현 수준과는 상관없이, 클론을 제공한 세포형내에서 발현된 각각의 유전자들에 상응하는 거의 같은 수의 클론을 함유하는 정규화된 라이브러리일 것이다. 그러나, 라이브러리의 정규화는 충분하게 또는 적당하게 발현된 유전자와 상동인 GSE의 단리에는 불필요하다. 화학요법제에 내성인 세포의 클로날 집단이 단리되면, GSE를 코드화하는 라이브러리 클론이 세포로부터 회수된다. 이 단계에서, 발현 라이브러리의 삽입체가 이것의 누클레오티드 서열에 대해 시험될 수 있다. 다른 방법으로는, 회수한 라이브러리 클론은 추가의 트랜스펙션 또는 감염 및 선택 검정법에서 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 이것의 능력에 대해 추가 시험된 후, 핵산 서열이 결정될 수 있다. 물론, 누클레오티드 서열이 결정되면, GSE가 확인된다. 이 방법은 실시예 2 내지 5에 추가로 예시된다.
제 2의 관점에서, 본 발명은 아직까지 발견되지 않은 유전자를 포함하여 화학적 치료제에 대한 내성과 결부된 유전자를 확인 및 클로닝하는 방법을 제공한다. 이는 GSE나 이것의 일부를 프로브로 사용하여 완전한 길이의 cDNA나 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 이들의 유전자 기원을 확인할 수 있기 때문이다. 어떤 경우에, 화학요법제에 대한 감수성과 결부된 유전자는 아주 놀라운 것으로 판명될 것이다. 예를 들어, 에토포시드 감수성을 소거시키는 GSE는 특히 놀라운 성질을 가지고 있다. 에토포시드의 표적은 DNA를 언와인딩(unwinding) 효소인 토포이소머라제 Ⅱ이다. 토포이소머라제 Ⅱ DNA의 무작위 단편으로부터 제조되는 GSE는 에토포시드에 대한 내성을 부여한다. 따라서, 에토포시드 내성을 부여하는 대부분의 GSE는 토포이소머라제 Ⅱ를 코드화하는 DNA로부터 유래된다고 예상될 것이다. 놀랍게도, 모든 경우에 다 그러한 것은 아니다. 얻어진 3가지의 에토포시드 내성 부여 GSE 중의 2가지는 이전에 확인되지 않은 DNA 서열로부터 유래되었다. 상기 GSE 중의 3분의 1은 키네신 중쇄 유전자로부터 유래되었다. 이것이 발견되기 전에는, 키네신이 어떤 방식으로든 에토포시드 감수성에 연루되어 있다는 것을 전혀 인식하지 못하였다. 이 결과는 본 발명의 상기 관점에 따른 방법이 화학요법제에 대한 내성을 가지도록 하는 유전적 기초에 관한 매우 신규하고도 놀라운 정보를 제공할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 또한, 에토포시드에 내성을 부여하는 키네신 유래의 GSE는 세포에 영향을 미치는데, 이는 프로그램된 세포의 사멸에 키네신이 연루될 수 있음을 시사한다. 만일 이러한 경우에는, 본 발명의 상기 관점에 따른 방법은 또한 노화 및 세포 사멸의 유전적 기초에 관한 가치있는 정보를 제공한다. 이는 화학요법제에 대한 내성이나 노화와 결부된 유전자를 확인하는데 사용되는 GSE가 발생 단계에서의 상기 유전자의 역할을 결정하기 위하여 배아내의 트랜스진(transgene)으로서도 발현될 수 있기 때문에, 발생 과정에 연루된 유전자의 연구에 있어서도 중요한 의미를 가지게 되는 것이다. 본 발명의 상기 관점에 따른 방법 및 이것에 의해 확인된 유전자를 연구하는데 사용하는 방법, 그리고 이것이 세포에 미치는 영향을 실시예 6 내지 8에서 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
제 3의 관점에서, 본 발명은 화학치료제에 대한 감수성과 결부된 유전자에 대하여 최적화된 억제 활성을 가지는 GSE의 수득 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 관점에 따른 방법에 있어서, 초기 GSE는 본 발명의 제 1면에 따른 방법에 의해 수득된다, 그 후, GSE가 유래되는 유전자가 본 발명의 제 2의 관점에 따른 방법에 의해 확인되고, 클로닝된다. 그 후, 이 유전자가 임의로 단편화되고, 발현 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터내에 클로닝되어, 목적하는 유전자만으로부터 유래되는 무작위 단편 발현 라이브러리를 수득한다. 그 후, 상기 라이브러리는 포유동물 세포에 전 옮겨져서, 발현되며, 이러한 포유동물 세포는 적당한 화학요법제의 존재하에 선택된다. 실제 문제로서, 이러한 라이브러리는 전체 cDNA로부터 제조된 무작위 단편 라이브러리가 함유하는 종류 보다 목적 유전자로부터 유래된 훨씬 다양한 GSE를 함유할 것이다. 결과적으로, 극대화된 화학요법제 내성에 의해 결정되는 최적화된 GSE를 단일 유전자 무작위 단편 라이브러리 방법으로부터 수득할 가능성은 실시예 1에 더욱 상세하게 설명되어 있다.
제 4의 관점에서, 본 발명은 화학 치료제에 대한 감수성과 관련된 유전자의 기능을 억제시킬 수 있는 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드를 제공한다. 본 발명에 따른 합성 펩티드는 본 발명에 따른 GSE에 의해 코드화된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에 따른 합성 누클레오티드는 본 발명에 따른 GSE의 누클레오티드 서열에 상응하는 누클레오티드 서열을 갖는다. GSE가 발견되어, 서열화되고, 이것의 배향이 결정되면, GSE의 누클레오티드 서열에 상응하는 올리고누클레오티드(앤티센스 배향된 GSE의 경우) 또는 GSE에 의해 코드화된 아미노산 서열(센스 배향된 GSE의 경우)을 제조하는 것이 용이해진다. 어떤 구체예에 있어서, 상기의 합성 펩티드 또는 올리고누클레오티드는 GSE에 의해 코드화된 완전한 서열을 가질 수 있거나, GSE내에 존재하는 서열의 일부만을 각각 가질 수 있다. 어떤 다른 구체예에 있어서는, 펩티드나 올리고누클레오티드가 GSE 코드화된 서열 또는 GSE 서열의 일부만을 가질 수 있다. 상기 후자의 구체예에서는, 특정 유전자에 상응하는 다수의 독립적 GSE 클론들이 동일한 5' 또는 3' 말단을 가지지만, 일반적으로는 둘 모두를 갖지는 않을 것이라는 결과에 의해 과도한 실험이 방지된다. 이는 다수의 GSE들이 1개의 중요한 종말점을 가지며, 이로부터 간단한 실험으로 유전자의 기능을 억제하는데 필요한 펩티드나 올리고누클레오티드의 최소 크기가 정해질 것임을 제시한다. 펩티드에 대해서는 6 내지 8개의 아미노산 정도로 작은 기능 도메인이 면역 글로불린 결합 영역으로 확인되었다. 그러므로, 상기한 바 이상의 크기를 가지는 펩티드 또는 펩티드 유사체가 GSE로서 제조될 수 있다. 앤티센스 올리고누클레오티드의 경우, 생리학적 조건에서 이들의 상응하는 mRNA에 하이브리드화하기에 충분한 길이를 가지는 올리고누클레오티드에 의해 유전자 기능의 억제가 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기의 용도에는 염기를 약 12개 이상 가지는 올리고누클레오티드가 적합할 것이다. 상기 올리고누클레오티드는 약 12개 내지 약 100개의 누클레오티드를 가지는 것이 바람직할 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 올리고누클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스폰산염, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포트리에스테르, 술폰, 실록산, 탄산염, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 브리지된(bridged) 포스포르아미데이트, 브리지된 포스폰산 메틸렌, 및 브리지된 포스포로티오에이트 인터누클레오티드 결합과 같이 누클레아제 내성 인터누클레오티드 결합을 갖는 변형된 누클레오티드를 의미한다. 상기의 변형된 결합을 함유하는 올리고누클레오티드의 합성 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다 [참조: Uhlmann and Peyman, 1990, Chem. Rev. 90:543-584 (1990) ; Schneider Banner 1990, Tetrahedron Lett. 31:335]. 또한, 올리고누클레오티드란 변형된 염기나 변형된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당을 갖는 올리고누클레오티드를 의미한다.
제 5의 관점에서, 본 발명은 특정 유전자의 발현의 부재, 또는 발현 부진 때문에 1가지 이상의 화학 치료제에 대한 내성을 가지는 종양 세포의 진단 검정 방법을 제공한다. 본 발명의 제 1 및 제 2의 관점에 따른 방법을 이용하여 상기의 유전자를 확인 및 클로닝할 수 있다. 상기 유전자의 발현의 부재 또는 발현 부진이 자연발생적인 것인지 여부와 화학요법제에 대한 내성에 대해 의학적으로 중요한 기초를 결정하기 위하여, 사람의 종양 세포는 세포 독성량의 적당한 화학요법제로 처리되어 자발적인 약제 내성 돌연변이체를 선택할 수 있다. 그 다음으로 상기의 변이체들은, 목적으로 하는 특정 유전자의 발현 수준에 대하여 측정을 할 수 있다. 발현의 부재 또는 발현의 현저한 감소는 화학요법제에 대한 내성의 자연적 메카니즘을 시사한다. 따라서, 상기 발현의 부재나 발현의 감소는 화학요법제나 목적 약제에 대하여 내성을 가지는 종양 세포에 대한 진단 검정 방법의 기초가 될 수 있다. 본 발명의 상기 관점에 따른 진단 검정 방법의 제 1 구체예에서는 발현을 측정할 유전자의 서열과 상동인 올리고누클레오티드(들)를 이용한다. 상기 구체예에서는 RNA가 종양 샘플로부터 추출되고, 목적 유전자에 특이적인 RNA가 표준 필터 하이브리드화 방법, RNase 보호적 검정법 및 정량적 cDNA-PCR 방법으로 정량된다 (참조: Noonan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7160-7164). 본 발명의 상기 관점에 따른 진단 검정의 제 2 구체예에 있어서는, 목적 유전자에 의해 코드화되는 단백질의 부분과 동일한 아미노산 서열을 가진 합성 펩티드에 대한 항체들이 유도된다. 그 후, 항체들이 통상의 정량적 면역 검정법(에컨대, RIA 또는 면역 조직화학적 검정법)에 사용되어, 시험할 종양 세포로부터 추출한 단백질 시료내에 존재하거나 시험할 종양 세포들의 표면 또는 내부에 존재하는 목적 유전자 생성물들의 양의 결정된다.
제 6의 관점에서, 본 발명은 유전자 동시 전달(co-transfer) 연구에 유용한 우성 선택성 마커들을 제공한다. 본 발명에 따른 GSE가 화학요법제에 대한 내성을 부여하기 때문에, GSE를 발현시키는 벡터의 존재는 GSE의 부재시에 세포독성을 가지게 되는 적당한 세포독성 약제의 농도에서 상기 벡터로 트랜스펙션된 세포의 성장에 의해서 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 GSE는 크기가 작아서 제한된 패키징 용량을 갖는 바이러스 벡터내로 동시 전달되는 유전자에 합체된 상태로 쉽게 일체화될 수 있으므로, 우성 선택성 마커로서 특히 적합하다.
제 7의 관점에서, 본 발명은 유전자 치료법 및 화학적 치료법의 유효성을 모두 증강시키는데 유용한 생체내 선택성 마커를 제공한다. 유전자 치료법에 있어서는, 본 발명에 따른 GSE는 벡터로, 발현시에 유전적 질환을 완화시키는 치료 유전자와 함께, 환자로부터의 인간 CD34+혈액 선구 세포내로 동시 전달될 수 있다. 세포들은 적당한 화학적 치료제에 대한 내성에 대해 생체외에서 선택되어 GSE의 성공적 전달을 보장할 수 있고, 암시적으로, 치료 유전자의 성공적 전달도 보장할 수 있다. 그 후, GSE와 치료 유전자를 함유한 선구 세포는 환자의 순환계에 복귀될 수 있다. 최종적으로, GSE와 치료 유전자를 함유한 세포들은, 정상 혈액 세포에 대하여 독성을 가지는 농도의 적당한 화학요법제(GSE가 내성을 부여하게 될)를 투여하여 생체내에서 선택될 수 있다. 이러한 방법으로 GSE와 치료 유전자를 가진 세포들이 환자의 혈액내에서 다시 증식할 것이다.
화학적 치료를 강화시키기 위해, 본 발명에 따른 GSE는 단독으로 또는 다른 유전자와 함께 발현 벡터에 의해 암 환자로부터 취한 CD34+혈액 선구 세포내들로 전달될 수 있다. 그 후, 적당한 화학요법제를 사용하여 GSE를 갖는 선구 세포들의 시험관내 선택이 수행된다. 그 후, 선택된 세포가 환자의 순환계에 복귀되고, 혈액의 재증식이 시작되도록 한다. 적당한 시간이 경과된 후에, 상기 세포들에서의 GSE의 발현 때문에 면역계에 대한 독성 부작용이 억제되기 때문에, 보통 농도보다 훨씬 농도가 높은 적당한 화학요법제(GSE가 내성을 부여하게 되는)를 사용하여 적극적 화학적 치료가 수행될 수 있다.
이러한 치료학적 관계에서, GSE의 발현이 유익할 때에만, 즉, 생체내 선택 또는 화학치료 도중에만 선구 세포내에서(그 다음에는 혈액 세포내에서) GSE를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 유도성 프로모터를 사용하여 GSE를 발현시킬 수 있다. 그 후, 적당한 유도제가 시험관내 선택 전 및 선택 도중에 세포에 첨가되고, 생체내 선택 또는 화학치료 전 및 도중에 다시 첨가된다. 유도제가 인체내에 정상적으로 존재하지 않는 한, GSE는 다른 어느 시기에도 발현되지 않을 것이다.
제 8의 관점에서, 본 발명은 화학요법제에 대한 암세포의 내성에 반작용을 할 수 있는 제약 생성물을 합리적으로 설계할 수 있는 출발점을 제공한다. GSE가 유래된 유전자에 의해 코드화되는 단백질 서열은 cDNA 서열로부터 추론해낼 수 있고, 대응 단백질의 기능은 공지의 유전자와의 상동성을 조사하거나 단백질 서열내에서 공지의 기능적 모티브를 조사하여 결정될 수 있다. 상기의 검정 방법에서 단백질의 기능이 나타나지 않는다면, 유전자를 억제하는 GSE의 표현형 효과를 통해서 추론할 수도 있다. 이러한 효과들은 GSE 발현과 결부된 다양한 성장 관련의 형태적, 생화학적 또는 항원성 변화를 분석함으로써 세포 수준에서 검증될 수 있다. 생물체 수준에서의 GSE 효과는 대응 GSE를 트랜스진으로서 유전자 이식 동물(예컨대, 마우스)내에 도입시키고, GSE 발현과 결부된 발생 과정 중의 비정상적인 현상을 분석함으로써 또한 연구될 수 있다. 유전자의 기능은 GSE 보다도 세포나 유전자이식 동물내의 강력한 프로모터로부터의 대응 유전자의 전체 길이 cDNA를 발현시키고, 유전자의 과잉 발현과 결부된 변화를 조사함으로써 또한 연구될 수 있다.
cDNA 서열의 길이 전체 또는 일부는 편리한 진핵 또는 원핵 발현 시스템내에서 단백질 합성을 유도시키는데 또한 사용될 수 있고, 제조된 단백질은 다클론성 또는 단클론성 항체를 수득하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 항체는 단백질 정위를 조사하는데 사용되고, 단백질 기능의 특정 억제제로서 사용될 뿐만 아니라, 진단 목적으로 사용될 수 있다. GSE 항-khcs 서열의 상보적 서열의 일부 또는 사람 KHCS 단백질의 대응 영역에 의해 코드화된 합성 펩티드에 대한 항체들이 특히 유용하며, 상기 항체들은 VPA나 VP9-11 GSE(제 9-11도 참고)의 일부에 의해 코드화된 아미노산 서열에 대한 것과 같다.
약제의 감수성과 관련된 유전자의 생화학적 기능을 이해하는 것은, 상기 유전자의 기능을 자극하거나 모사하여 항암제에 대한 세포독성 반응을 증가시키는 제약학적 수단을 제시하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 유전자가 어떤 화합물을 제조하는 효소를 코드화하면, 상기 화합물은 화학 합성되고, 세포독성 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 약제학적 방법이 단백질의 기능으로부터 명백하지 않다면, 유전자의 발현이 전사 수준에서 상향 조정될 수 있다. 이 작업은 대응 유전자의 프로모터 영역을 클로닝하고, 특정 생물학적 자극제에 반응하는 것으로 공지된 cis 요소의 존재에 대하여 프로모터 서열을 분석함으로써 수행될 수 있다.
GSE 방법을 통해 확인된 약제 감수성 유전자의 발현을 증가시키는 가장 신속한 방법은, 상기 유전자에 대한 전체 길이 cDNA를 레트로바이러스 벡터내로 삽입시키는 것이다. 재조합 레트로바이러스 형태의 상기 벡터는 생체내에서 종양 세포에 전달되고, 삽입시에 해당 화학요법제의 효과에 대하여 상기 세포들을 감작화시킬 것이다. 래트 뇌종양내로 약물 감수성 유전자를 선택 전달시킨 후, 적절한 약제로 치료하는 유사한 방법이 쿨버(Culver)등에 의해 보고되었다 (1992, Science 256:1550-1552). 종양 세포에 대한 선택적인 전달은 분열하는 세포에 대한 레트로바이러스 매개성 형질도입의 선택성을 기초로 하여 달성될 수 있다. 다른 방법으로는, 선택성은, 약제 감수성 유전자의 발현을, 조직 특이적 또는 종양 특이적 프로모터, 예컨대 배아성 암 항원 유전자 프로모터로부터 유도시킴으로써 달성될 수 있다.
cDNA 서열로부터 결정된 단백질 구조는 또한 컴퓨터 보조된 약제 디자인에 사용되어, 공지의 항암제와 같은 방식으로 상기 단백질에 영향을 미치는 신규한 약제를 개발할 수 있다. 또한, 편리한 발현 시스템에서 제조된 정제된 단백질은 항암 활성을 가진 신규 화합물을 위한 시험관내 생화학적 스크린 시스템의 중요한 성분으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학요법제 내성 부여 GSE를 발현하는 포유동물 세포는 화합물을 약제 내성을 극복하는 능력에 대해 스크리닝하기에 유용하다.
이하의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로서, 조금이라도 본 발명을 제한하고자 하는 의도가 아니다.
[실시예 1]
[사람 토포이소머라제 Ⅱ에 대한 GSE의 개발]
토포이소머라제 Ⅱ는 에토포시드, 독소루비신 및 암사크린을 포함하는 다수의 항암제의 표적으로서 작용하는 DNA 언와이딩 효소이다. 이 효소는 통상 이중 가닥의 DNA를 절단한 후, 가닥을 통과하고 절단부(break)를 남긴다. 항암제는 효소에 의해 함께 고정된 이중 가닥 절단부를 갖는 복합체에 효소를 트랩핑시켜서, 복제중인 세포내에 치명적 손상을 일으킨다. 토포이소머라제 Ⅱ와 상호작용하는 항암제에 대해 내성인 몇몇 세포주는 상기 효소의 발현을 감소시켰다.
GSE의 무작위 단편 선택에는 발현 라이브러리가 매우 많은 수의 수용체 세포내에 전달될 필요가 있다. 그러므로, 토포이소머라제 Ⅱ에 대한 GSE를 함유하는 무작위 단편 라이브러리를 제조 위해, 효율적인 레트로바이러스 벡터 시스템을 선택하였다. 토포이소머라제 Ⅱ에 대한 전체 코딩 서열에 걸쳐있는 오버랩핑 cDNA 클론을 혼합하고, Mn++이온의 존재하에 DNase I 에 의해 250 내지 350bp 단편으로 무작위 단편화하고, 단편 말단을 T4 DNA 폴리머라제와 DNA 폴리머라제 I 의 클레노우(Klenow) 단편으로 채웠다. 해독 개시 및 종료 코돈을 제공하는 합성 어댑터로 연결시킨 후, 단편 혼합물을 어댑터 유래의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 혼합물의 neo 유전자가 함유된 LNCX 레트로바이러스 벡터로 클로닝 하였다(Miller 및 Rosman, 1989, Biotechnigues 7:980-986 참조).
20,000개의 독립적 클론들을 함유하고 있는 무작위 단편 라이브러리를 얻고, 이것을 이용하여 NIH 3T3 세포들로부터 유래된 앰포트로픽(amphotropic) 및 에코트로픽(ecotropic) 바이러스 패키징 세포주들을 트랜스 펙팅시켜서, 바이러스의 핑퐁 복제 매개성 증폭을 수행하였다(예를 들어, Bodine 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3738-3742). 이 결과로서, 토포이소머라제 Ⅱ 유전자 서열로부터 유도된 대표적인 삽입체 혼합물을 함유한 재조합 레트로바이러스의 세트인, 무작위 단편 발현 라이브러리(RFEL)가 생성되었다.
RFEL내의 서열 존재의 균일성을 다음과 같이 모니터하였다. NIH 3T3 세포들을 바이러스 함유 상층액으로 감염시킨 다음, 24시간 후에, [32P] α-dNTP의 존재하에 삽입된 프로바이러스 삽입체 서열을 PCR 증폭시켰다. PCR 증폭된 혼합물의 분액을 겔 전기영동시켜서, 뚜렷한 밴드의 부재를 확인하였다. 또 다른 분액을 수 개의 자주 절단하는 제한 효소로 분해된 토포이소머라이제 Ⅱ cDNA의 서던블롯을 위한 프로브로서 사용하였다. 제 1의 시험에서의 뚜렷한 밴드의 부재와 제 2의 시험에서의 모든 단편들에 대한 균일한 하이브리드화에 의해 입증된 대표적 서열 혼합물을 수득하였다.
그 후, RFEL을 사용하여 HeLa 세포를 감염시키고, 감염체를 G418로 선택하였다. 그 후, 각각 약 50 내지 70개의 세포들을 가지는 G418 내성 세포들의 콜로니들을 200㎍/㎖ 농도의 에토포시드에 노출시켰다. G418 내성 콜로니 10,000개 중의 대략 50개가, 삽입체가 없는 레트로바이러스를 대조표준으로서 사용하였을 때의 10-4미만의 빈도수와 비교하여 에토포시드에 대해 내성이었다. 세포주들을 에토포시드 내성 콜로니로부터 단리하였다. RFEL을 생산하는 앰포트로픽 및 에코트로픽 패키징 세포주들을 또한 에토포시드 내성에 대해 선택하였다. 에토포시드 내성 패키징 세포주로부터의 바이러스를 사용하여 HeLa 세포를 감염시킨 후, G418로부터 선택하였다. G418 내성 감염체를 다음의 3가지의 토포이소머라제 Ⅱ 상호작용성 항암제로 공격하였다 : 에토포시드, 테니포시드 및 암사크린. 높은 비율의 감염 세포들이 3가지 모든 약제에 대하여 내성을 가졌으며, 이는, 마우스 패키징 세포주를 에토포시드로 선택하면 사람과 마우스 세포 모두에서 활성인 GSE가 생성됨을 입증한다. 또한, 상기의 감염체들을 사용하여 세포주를 확인하였다. RFEL 유래의 삽입체들을 PCR에 의해 에토포시드 내성 세포주로부터 회수하여, LNCX 벡터내로 리클로닝하였다. 그 후, 새로 유도된 클론들을 HeLa 세포내로 트랜스펙션시에 에토포시드에 대한 내성을 부여하는 능력에 대하여 개별 시험을 하여, 대응 삽입체의 GSE 활성을 확인하였다.
26개의 상이한 단리된 클론을 서열 분석한 결과, 이들 중 16개가 앤티센스 방향으로 삽입되고, 10개가 센스 방향으로 삽입된 것으로 밝혀졌다. 표 I 에서 보는 바와 같이, 확인된 12개의 GSE 중에서 7개가 센스였고, 5개가 앤티센스였다. 확인된 GSE들의 서열을 제 1도에 도시하였다. 확인된 GSE들 중의 센스 배향된 삽입체들은, 어댑터에 의해 제공된 ATG 코돈으로부터 개시하거나, 해독 개시를 위해 적당한 관계에서 삽입체의 5' 말단 근처에 위치한 토포이소머라제 Ⅱ의 오픈 리딩 프레임과 연결된 내부 ATG 코돈으로부터 개시하는, 37 내지 99개의 아미노산 길이의 토포-Ⅱ 유래의 펩티드를 코드화한다. 확인된 앤티센스 GSE 중의 4개는 해독 시작 부분을 포함하고 있는 cDNA의 3' 말단으로부터 유래하고, 1개는 cDNA의 5'-말단으로부터 유래한다. 센스 배향된 GSE 중의 5개는 DNA에 공유결합하는 활성 부위 티로신-804과 토포이소머라제 Ⅱ의 이합체화와 관련된 루신 지퍼(zipper) 영역을 포함하는 단백질의 중심 부분으로부터 유래되었다. 1개의 GSE 펩티드는 N-말단 근처의 영역으로부터 유래하고, 또 다른 GSE 펩티드는 단백질의 C 말단 근처의 영역으로부터 유래하며; 상기 단편 중 어느 것도 공지의 기능적 부위와는 무관하다.
상기 결과는, 에토포시드 내성을 부여하는 다중 메카니즘에 따라 작용하는 GSE가 토포이소머라제 Ⅱ를 코드화하는 DNA의 무작위 단편 라이브러리로부터 제조될 수 있음을 입증한다. 또한, 상기 결과에서는 1종의 포유동물로부터 생성된 GSE가 또 다른 포유동물종에서 활성일 수 있는 것으로 나타났다.
a: 토포이소머라제의 cDNA 서열내의 위치; 잔기는 차이-플루그펠더(Tsai-Pflugfelder) 등의 문헌[1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7177-7181]에 기재된 대로 넘버링됨.
b: 토포이소머라제의 아미노산 서열내에서 센스 배향된 GSE에 의해 코드화된 펩티드의 위치; 해독은 정확한 오픈 리딩 프레임내의 제 1의 ATG 코돈으로부터 개시되는 것으로 추정됨.
[실시예 2]
[레트로바이러스 벡터내에서의 정규화된 무작위 단편 cDNA 라이브러리의 발생]
제2도에 도시된 바와 같이, 정규화된 cDNA 집단을 파탄잘리(Patanjali) 등의 프로토콜(1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1943-1947)의 변형법을 이용하여 제조하였다. 폴리(A)+RNA를 NIH 3T3 세포로부터 추출하였다. 세포 성장의 다양한 단계에서 발현된 다양한 유전자에 대한 mRNA를 얻기 위해, RNA의 1/2을 급속 성장중인 배양물로부터 단리하고, 나머지 1/2을 완전한 단층 컨플루언시(confluency)에 도달한 정지 세포들로부터 단리하였다. 무작위 프라이밍된 cDNA 집단에서의 5'-말단 서열의 과잉존재를 방지하기 위해, RNA를 비등시켜서, 평균 600 내지 1,000개의 누클레오티드 크기가 되도록 단편화시켰다. 그 후, 상기 RNA 단편을 이용하여 무작위 프라이밍된 이중 가닥 cDNA를 제조하였다. 그 후, 이러한 무작위 프라이밍된 cDNA를 합성 어댑터에 연결시켜서, ATG 코돈을, 3개의 가능한 리딩 프레임 및 적절한 해독 개시를 위한 적절한 위치내에 제공하였다. 어댑터의 구조(제 3도)로 인해, cDNA의 평활말단화된 단편에 대한 이것의 연결이, 각각의 단편이 개시 코돈으로부터 출발하게 되는 방식으로 배향과는 무관하게 결정되었다. 어댑터에는 맞은편 가닥에 있는 종료 코돈이 제공되지 않는데, 이는 클로닝 벡터 PLNCX가 클로닝 부위의 바로 다운스트림에 종료 코돈을 함유하기 때문이다. 상기 벡터는 밀러(Miller)와 로스만(Rosman)의 문헌[1989, Biotechnigue 7:980-986]에 기재되어 있다. 연결된 혼합물을, 초기 cDNA 제조물을 파지 벡터내로 클로닝한 다음, 벡터 유래의 서열을 PCR 프라이머로 사용하여 cDNA 집단을 증폭시키는 파탄잘리 등의 방법과 대조적으로, 어댑터의 "센스" 가닥을 PCR 프라이머로서 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR을 후속 조합되는 12개의 별도의 반응물로 수행하여, 특정 서열의 무작위 과증폭 또는 저증폭을 최소화시키고, 생성물의 수율을 증가시켰다. PCR 증폭된 혼합물을 겔-전기영동에 의해 크기 분별하고, 차후의 조작을 위해, 파탄잘리의 400 내지 1600bp 크기와 대조적으로, 200 내지 500bp 단편을 선택하였다.
정규화의 경우, cDNA 제조물을, 리어닐링을 위해, 파탄잘리 등(상기 참조)이 개시하고, 제 2도에 도시된 바와 같이 상이한 시점을 이용하여 변성시키고, 리어닐링시켰다. 각각의 리어닐링된 혼합물로부터의 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 분리하였다. 리어닐링의 각각의 시점으로부터의 단일 가닥 DNA 분획을 어댑터 유래의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시키고, 상이한 mRNA 서열들의 상대적인 풍부함을 서던 하이브리드화에 의해 분석하였다. 각각 중발현된 유전자 및 저발현된 유전자에 대응되는, 유사한 비율의 튜불린, c-myc 및 c-fos DNA 서열을 함유한 분획(제 2도)을 이용하여 라이브러리를 제조하였다.
정규화된 cDNA 제조물을, 레트로바이러스의 긴 말단 반복체(LTR)내에 함유된 프로모터로부터 전사되는, neo(G418 내성) 유전자를 가지며, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 강력한 프로모터로부터 삽입된 서열을 발현시키는 MoMLV 기초 레트로바이러스 벡터 PLNCX의 Clal 부위내로 클로닝하였다(제 3도 참조). 5부분으로 나눈 연결 혼합물을 사용하여, 5회 후속 E. coli의 대규모 형질전환을 수행하였다. 형질전환된 박테리아를 총 500개 아가 플레이트(직경 150㎜)상에 플레이팅하고, 플라스미드 집단(총 18㎎)을 아가를 세척한 콜로니로부터 단리하였다. 총 약 5×107개 클론을 얻었고, 임의로 취한 50개의 피켓 콜로니로부터의 삽입물의 PCR 증폭에 의해 평가하여 이들 중의 60%를 넘는 콜로니가 정규화된 cDNA의 삽입체를 함유하였다. 상기 결과에 의해, 레트로바이러스 플라스미드 발현 벡터내에서 3×107개의 많은 재조합 클론의 정규화된 cDNA 라이브러리가 생성될 가능성이 입증되었다.
[실시예 3]
[바이러스 패키징 세포주 및 NIH 3T3 세포내로의 레트로바이러스 무작위 단편 라이브러리의 형질도입]
실시예 2에 따라 제조된 플라스미드 라이브러리를, 레트로바이러스 비리온 단백질을 발현시키는 바이러스-패키징 세포(NIH 3T3의 유도체)내로 트랜스펙션시킴으로써, 레트로바이러스 입자의 혼합물로 전환시켰다. 상기 세포주의 실예들은 마르코비츠(Markowitz) 등이 개시하였다(1988, Virology 167:400-406). 에코트로픽 및 앰포트로픽 바이러스 패키징 세포주 GP+E86 및 GP+envAm12를 각각 1:1 비율로 혼합하고, 상기 혼합물의 107개 세포를 표준 인산 칼슘 공동 침전 조건하에 플라스미드 라이브러리로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션은 패키징 세포 집단을 통해 급속하게 확산하는 에코트로픽 및 앰포트로픽 바이러스 입자의 패키징 및 분비를 야기시키는데, 이는 에코트로픽 바이러스가 앰포트로픽 패키징 세포를 감염시킬 수 있거나 그 반대일 수 있기 때문이다. NIH 3T3 세포의 감염 후에 얻어진 G418-내성 콜로니의 수로 측정된 바이러스의 수율은 전이성 트랜스펙션 단계 동안(1 내지 3일)에는 배지 1㎖ 당 105개 감염 단위에 도달한 후, 감소(4 내지 8일)하였으며, 그 후, 대부분의 패키징 세포내에 안정하게 통합된 프로바이러스 게놈의 발현 때문에 급속하게 증가하였다. 트랜스펙션 후 9 내지 12일째의 바이러스의 수율은 배지 상층액 1㎖당 106개를 초과했다. 이 단계에서, 라이브러리는 상이한 단편들의 아주 균일한 외양을 나타내지만, 나중 단계에서는 개별적인 바이러스 생성 클론들이 집단내에서 현저하게 많아지기 시작하여 cDNA 유래 삽입체의 불균일한 외양을 초래하였다. 레트로바이러스 집단내의 서열 외형상의 균일성을 바이러스 함유 상층액으로 감염시킨 세포들로부터 DNA를 급속 추출함으로써 모니터한 후, 삽입체를 PCR 증폭시켰다. 삽입체를 처음에는 브롬화 에디튬으로 염색된 아가로스겔에서 연속적으로 스미어(smear)를 생성시킴으로써 먼저 분석한 후, 토포이소머라제 Ⅱ, c-myc 및 튜불린을 포함하는 상이한 프로브들로 서던 하이브리드화시킴으로써 분석하였다. 각각의 유전자가 다중 단편들의 스미어에 의해 나타나는 한, 상기 라이브러리의 표현형은 만족스러운 것으로 간주되었다.
다른 실험에서, 무작위 단편화된 정규화된 cDNA 라이브러리를 표현형의 상실없이 NIH 3T3 세포내로 형질도입하기 위해, NIH 3T3 세포를 전이단계의 트랜스펙션(1 내지 3일)에서 생성시킨 바이러스, 또는 트랜스펙션한지 10 내지 12일째에 수집된 고역가 바이러스로 감염시켰다. 후자의 경우, 100㎖의 바이러스 현탁액에는 108개 이상의 감염성 단위가 함유되어 있었다. "일과성(transient)" 바이러스의 경우에 있어서, NIH 3T3 세포를, 바이러스 생성 세포들로부터의 500㎖ 배지를 사용하여, 최소한 107개의 재조합 레트로바이러스로 감염시켰다 (5회 감염, 각각 100㎖ 배지). 상기 결과에 의해, 대규모의 복잡한 무작위 단편 라이브러리를 레트로바이러스 형태로 전환시키고, 이를 복잡성의 상실없이 비패키징 세포주에 전달할 가능성이 입증된다.
[실시예 4]
[화학요법제 에토포시드에 대한 내성을 부여하는 GSE의 단리]
에토포시드 내성을 부여하는 GSE의 선택을 위한 전반적인 방법을 제 4도에 도시하였다. 상기 선택은, GSE 발현에 의해 내성 표현형이 유발되는 세포가 이러한 GSE를 함유하는 바이러스 입자를 생성시킬 것을 기대하면서, 바이러스 생성 패키징 세포에서 직접 수행하였다. 앰포트로픽 및 에코트로픽 패키징 세포들의 혼합물을 실시예 2에 따라 제조된 LNCX 벡터내의 cDNA 라이브러리로 트랜스펙션시키고, 바이러스들이 9일간 집단에 확산되도록 하였다. G418 내성에 대해 집단의 일부의 분석한 결과, 실제로 100%의 세포들이 neo-함유 프로바이러스를 함유하는 것으로 나타났다. 그 후, 세포들을 350ng/㎖ 에토포시드에 15일간 노출시킨 다음, 2주간 약제 없이 성장시켰다. 에토포시드 선택 후 실험군 및 대조군(미감염된 세포, 또는 삽입체 없는 LNCX 바이러스로 감염된 세포)에서 얻어진 콜로니들의 갯수에는 차이가 없었다. 그 후, 생존 세포들의 배지 상층액에 존재하는 바이러스를 이용하여 NIH 3T3 세포들을 감염시킨 다음, 본질적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 에토포시드 선택을 수행하였다. 에토포시드를 사용하여 선택한 패키징 세포에 의해 생성된 라이브러리 유래의 바이러스로 감염시킨 NIH 3T3 세포는, 삽입체가 없는 LNCX 바이러스로 감염시킨 대조 세포들에 비해 에토포시드 내성 세포들의 수가 크게 증가하였으며, 이는 사전선택된 집단에서의 생물학적 활성 GSE의 존재를 나타낸다 (제5a도 참조).
에토포시드 선택된 NIH 3T3 세포에 함유된 프로바이러스 삽입체를 PCR에 의해 분석하였다. 상기 분석(제 5b도 참조)은 감염된 세포의 선택되지 않은 집단에 비해 특정 단편이 풍부함을 나타내었다. 개별적 PCR 증폭된 단편들을 LNCX 벡터내에, 제 6도에 도시된 바와 같이, 원래의 플라스미드에서와 동일한 위치 및 배향으로 리클로닝하였다. 에토포시드 선택 후에 풍부화된 총 42개의 프로바이러스 삽입체를 이렇게 리클로닝시키고, NIH 3T3 세포내로의 레트로바이러스를 형질도입 후 증가된 에토포시드 내성을 부여할 수 있는 능력에 대해 배치(batch)로 또는 개별적으로 시험하였다. 3개의 미확인 클론은 에토포시드 내성을 유발하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들이 생물학적 활성 GSE를 함유함을 나타낸다. 상기 클론들에 의해 유도된 에토포시드 내성을 제 7도 및 제 8도에 나타내었다. 상기 GSE는 항-khcs, VPA 및 VP9-11로 명명하였다.
에토포시드 내성을 유도하는 상기 GSE 중의 하나(항-khcs)의 능력을 바임(Baim) 등의 문헌[1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076]에 기재된 바와 같이, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)-유도성 프로모터/액티베이터 시스템을 이용하여 추가로 확인하였다. 상기 시스템의 성분으로는, 박테리아 lac 오퍼레이터의 다중 반복체와 시스 결합된 인핸서 의존성 프로모터, 및 lac 리프레서로부터 유도된 합성 조절 단백질이고 포유동물 전사 활성제인 LAP265를 발현시키는 유전자가 있다. 항-khcs GSE를, lac 오퍼레이터 서열의 21개 반복체가 보충된 인핸서가 없는 SV40 초기 유전자 프로모터로부터 삽입체를 발현시키는, 바임 등(상기 참조)에 의해 사용된 유도성 프로모터(티. 쉔크(T. Shenk) 박사 제공)를 함유하는 플라스미드 px6.CLN내로 클로닝시켰다. 선택성 마커를 가지지 않는 생성된 플라스미드를, neo 유전자를 함유하는 LNCX 플라스미드와 함께 NIH 3T3 세포내로 동시 트랜스펙션시켰다. 삽입체가 없는 벡터로 트랜스펙션된 대조 세포들과 함께 G418 선택된 트랜스펙턴트의 집단을 5mM IPTG의 존재 또는 부재하에, 농도가 증가하는 에토포시드에 노출시켰다. 동시 트랜스펙션 프로토콜에 의해 보통 G-418 내성 세포의 분획에서만 GSE가 삽입되지만, 항-khcs로 트랜스펙션되면 IPTG에 의존성인 에토포시드 내성이 명백히 증가하였다(제 8도 참조).
[실시예 5]
[화학요법제 에토포시드에 대한 내성을 부여하는 GSE의 서열 분석]
실시예 4에 개시된 바와 같이 클로닝된 GSE 항-khcs, VPA 및 VP9-11을 표준 디데옥시 서열화 방법으로 서열화시키고, 추론된 서열을 제 9 내지 11도에 도시하였다. "센스" 및 "앤티센스" 가닥 및 상기 가닥에 의해 코드화된 펩티드의 아미노산 서열을 상동성 조사용 BLAST 네트워크 프로그램을 사용하여, 국립 생물공학 중앙 정보 데이터 베이스에 소장된 핵산 및 단백질 서열과의 상동성을 분석하였다. GSE VPA 및 VP9-11와 현저한 상동성을 나타내는 서열은 검출되지 않았다. 대조적으로, 항-khcs GSE의 "앤티센스" 가닥에 상응하는 서열은, 진핵세포의 마이크로튜불을 따라 기관소체나 거대분자의 세포내 이동에 관여하는 마이크로튜불 모터 단백질의 한 부류인 키네신의 중쇄를 코드화하는 몇몇 유전자와의 강력한 상동성을 나타냈다. 이러한 단백질 부류는 엔다우(Endow)에 의해 검토되었다(1991, Trends Biochem. Sci. 16:221-225). 나본(Navone) 등(1992, J. Cell Biol. 117:1263-1275)이 개시한 대로, 최대 상동성은 사람의 키네신 중쇄(KHC) 유전자에서 발견되었다. 그러므로, 항-khcs는 마우스 khc 유전자의 앤티센스 RNA를 코드화하는데, 여기서 본 발명자들은 khc를 감수성(약제에 대한)이나 노화와 관련된 khc로 일컫는다. 본 발명자들은 키네신 경쇄를 가진 khcs 단백질의 어소시에이트(associate)에 의해 형성된 키네신 분자를 키네신-S라고 명명하여, 포유동물 세포에 존재하는 다른 키네신과 구별하기로 한다. 이들 결과는, GSE에 대한 화학요법제 선택에 의해 신규한 유전자 요소가 발견될 수 있고, 또한 지금까지 예측하지 못한 약제 감수성에 있어서의 유전자의 역할을 밝힐 수 있게 됨을 입증한다.
[실시예 6]
[항-khcs GSE 유전자가 유래된 유전자의 클로닝 및 분석]
실시예 4에서 단리된 항-khcs GSE를 프로브로 사용하여, λgt10 벡터내에 있는 2개의 cDNA 라이브러리로부터 400,000개의 클론을 스크리닝하였다. 상기 라이브러리를, 라우(Lau)와 나단(Nathan)이 개시한 대로(1985, EMBO J. 4:3145-3151, 및 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1182-1186, Lau 박사 제공), 비동시발생하거나 G0→G1 전이 단계에 있는 마우스 BALB/c 3T3 세포의 RNA로부터 통상의 방법에 의해 제조하였다. 제 1 라이브러리를 스크리닝하면 하이브리드화 클론이 생성되지 않았고, 제 2 라이브러리로부터의 2개의 상이한 클론은 항-khcs 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상기 클론들을 정제하고, 서열화하였다. 서열 분석 결과, 본 발명자들은 796 코돈에 상응하는 대량의 마우스 khcs cDNA를 단리시킨 것으로 나타났다 (온길이의 사람 KHC cDNA는 963개 아미노산을 코드화함). 상기 서열을 제 12도에 도시하였다. 결실된 5' 및 3' 말단 서열은 오하라(Ohara) 등의 문헌[1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5763-5677]에 기재된 바와 같이 "앵커 PCR" 기법을 사용하여 현재 단리되고 있는 중이다.
khcs 단백질의 서열화된 부분을, 사람(Navone 등, 1992, J. Cell, Biol, 117:1263-1275), 마우스(Kato, 1991, J. Neurosci. 2:704-711) 및 꼴뚜기(Kosik 등, 1990, J. Biol, Chem, 265:3278-3283)로부터의 사전 클로닝된 KHC 단백질과 도트-매트릭스 정렬시킨 것을 제 13도에 도시하였다. 항-khcs GSE에 상응하는 부분을 제 9도에 도시하였다. khcs 유전자는 사람 유전자와 최대 상동성을 가지는데(아미노산 97% 동일), 이는 사람 KHC(KHCS) 유전자가 마우스 khcs와 기능적으로 동등함을 제시한다. 또한, 상기 정렬은 항-khcs GSE가 상이한 키네신 사이에서 최대로 다양화된 영역에 상응함을 나타낸다. 이 결과는, 항-khcs GSE가 키네신-S에 대해 특이적인 억제 효과를 갖는 안티센스 배향된 GSE 단편이지만, 다른 마우스 키네신에 대해서는 이러한 효과를 갖지 않음을 제시한다. 이는 키네신 부류의 그밖의 일원을 억제하면 세포 성장에 대해 유해한 효과를 주게 되어, khcs 유전자내의 가장 특이적인 서열을 선택적으로 단리할 수 있는 가능성을 제시한다.
[실시예 7]
[에토포시드에 대한 내성에 의해 부여되는 약제 교차내성의 평가]
항-khcs GSE가 내성을 부여하는 약제의 범위를 측정하기 위해, 본 발명자들은 항-khcs 삽입체를 가진 LNCX 바이러스를 생성시키는 에코트로픽 패키지 세포의 안정한 집단을 개발하였다. 상기 바이러스를 사용하여 NIH 3T3 세포를 감염시켰다. 감염시킨지, 2일째에 세포들을, 표준 플레이팅 효율 검정법을 이용하여, LNCX 벡터 바이러스로 감염된 대조 세포들에 대한, 몇가지 상이한 약제에 대한 내성에 대해 분석하였다. 제 14도에는 상기 검정법에 의해 상이한 약제를 사용하여 수행된 3개 실험 세트 중 1개를 도시하였다. 항-khcs 바이러스로 감염시킨 세포들은 대조 LNCX 바이러스로 감염시킨 대조 NIH 3T3 세포들에 비해, 에토포시드 및 아드리아마이신에 대한 이들의 내성의 명백한 증가를 나타냈다. 콜히친, 시스플라틴, 캄프토테친, 또는 악티노마이신 D로는 내성의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 선택되지 않은 바이러스로 감염된 전체 집단을 분석하는 상기 검정법은 개별 선택된 클론들을 고도로 발현시키는 분석에 비해 비교적 덜 민감하므로, 후자 결과는 예비적인 것이다. 전체적으로, 상기 결과는 하나의 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 GSE를 선택하며, 또 다른 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 GSE를 수득할 수 있게 됨을 입증한다.
[실시예 8]
[에토포시드에 대한 내성을 부여하는 GSE의 세포 효과의 평가]
항-khcs GSE를 함유하는 바이러스를, 마우스 배아의 1차 섬유아세포(MEF)의 수명을 증가시키는 능력에 대해 시험하였다. MEF를 표준 트립신 처리 방법에 의해서 10일된 마우스 배아로부터 준비하고, 노화 세포들을 크라이시스(crisis) 전 상이한 계대에서 동결시켰다. 크라이시스 2주 전의 노화 MEF에, 삽입체가 없거나 항-khcs를 지닌 LNCX 벡터를 함유하는 재조합 레트로바이러스로 감염시켰다. 제 15도는 크라이시스 후 2주째의 MEF 세포콜로니를 나타낸다. 감염되지 않은 MEF 세포나 대조 LNCX 바이러스로 감염시킨 세포에 비해, 항-khcs로 감염시킨 세포들은 크라이시스를 넘긴 세포들의 비율이 크게 증가했음을 나타낸다. 항-khcs 바이러스로 감염된 크라이시스 후의 세포들은 종양 형질전환의 현미경 가시적 특징을 나타내지 않았다. 이들 결과는 항-khcs가 정상적 노화 섬유아세포의 불멸화를 촉진시킴을 나타낸다. 상기 결과는, 키네신-S의 정상 기능이 특정 세포 독성제에 노출된 후 또는 세포의 노화 중에 일어나는 프로그램된 세포 사멸의 유도와 관련될 수 있음을 제시한다. 또한, 상기 결과는, 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 GSE를 단리하면 세포 유전자와 세포 성장의 조절에 관여하는 프로세스에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 9]
[약제 내성의 천연 메카니즘에 있어서의 감소된 khcs 유전자 발현의 역할 측정]
감소된 khcs 유전자 발현이 약제 내성의 임의의 천연 메카니즘의과 관련이 있는 가를 시험하기 위해, cDNA-PCR에 의해 khcs mRNA 수준을 측정하는 검정법을 개발하였다. 상기 검정법은 mdr-1 유전자 발현을 측정하기 위한 누난(Noonan) 등의 정량 검정법(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7160-7164)의 변형법이다. 올리고누클레오티드 프라이머는 서열 AGTGGCTGGAAAACGAGCTA [서열 확인 번호 19] 및 CTTGATCCCTTCTGGTTGAT [서열 확인 번호 20]을 가졌다. 상기 프라이머를 사용하여 항-khcs GSE에 상응하는 마우스 khcs cDNA의 327bp 세그먼트를 증폭시켰다. 상기 프라이머는 마우스 cDNA 주형을 효율적으로 증폭시키지만, 게놈 DNA는 증폭시키지 않는데, 이는 이들이 게놈 DNA내의 1개 이상의 인트론을 스패닝(spanning)함을 나타낸다. 상기 프라이머를 이용하여, 본 발명자들은, khcs mRNA가 신장, 간 또는 비장에서 보다 마우스 근육 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 결정하였다.
또 다른 실험에서, 사람 KHCS cDNA의 상동 세그먼트를 증폭시키는 1쌍의 프라이머를, 나본 등의 방법(참조: 1992, J. Cell. Biol. 117:1263-1275)에 개시된 사람 KHC 서열을 기초로 하여 선택하였다. 상기 프라이머의 서열은 AGTGGCTTGAAAATGAGCTC [서열 확인 번호 21] 및 CTTGATCCCTTCTGGTAGATG [서열 확인 번호 22]이며, 이들은 327bp cDNA 단편을 증폭시킨다. 상기 프라이머들을 사용하여, 독립적으로 단리된 몇 개의 사람 HeLa 세포 집단에서의 KHCS 유전자 발현의 변화에 대해 시험하되, 각각의 집단은 자발적으로 획득된 에토포시드 내성에 대하여 선택되고, β2-마크로글로불린 cDNA 서열은 내부 대조군으로서 증폭시켰다. 제 16도는 다음의 집단들에 대한 cDNA-PCR 검정법의 결과를 나타내었다 : CX(0), LNCX 벡터 바이러스로 감염되고, G418로 선택된 HeLa 집단 ; CX(200), 200ng/㎖ 에토포시드에 대한 내성에 대해 선택된 동일한 세포 ;11(0), 6(0) 및21(0), 실시예 1의 기재된 대로 토포이소머라제 αcDNA에서 유래된 상이한 GSE를 함유하는 재조합 레트로바이러스로 HeLa 세포를 감염시키고, G418로 선택한 후에 수득된 집단 :11(1000), 6(1000) 및21(1000), 1㎍/㎖ 에토포시드에 대한 내성에 대해 선택된 집단. 제 16도에 도시된 대로, khcs 유전자에 대해 특이적인 PCR 생성물의 수율은 대조 세포에서 보다 각각의 에토포시드 선택된 집단에서 현저히 낮았다. 이 결과는, khcs 유전자 발현의 감소가 약제 내성에 대한 공통적인 천연 메카니즘임을 나타낸다.

Claims (29)

  1. 진핵세포에 선택성 표현형을 부여하는 유전 억제 요소(GSE)를 확인하는 방법으로서, (a) 진핵세포의 전체 mRNA로부터 무작위 단편화된 cDNA를 합성하여, 700염기쌍 미만의 크기를 갖는 DNA 단편을 수득하는 단계;
    (b) 선택성 표현형을 나타낼 수 있는 살아있는 진핵세포에서 DNA단편을 발현시키는 발현벡터에 DNA 단편을 전달하여, 각각의 DNA 단편이 단백질 해독 개시 코돈에 작동적으로 결합된 라이브러리를 수득하는 단계;
    (c) 유전 억제 요소 라이브러리를 세포에 도입하여, 살아있는 세포를 유전적으로 변형시키는 단계;
    (d) 선택성 표현형을 발현하는 세포를 선택함으로써, 선택성 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를 함유하는, 유전적으로 변형된 살아있는 진핵세포를 단리시키거나 풍부하게 하는 단계 ; 및
    (e) 유전적으로 변형된 세포로부터 유전 억제 요소를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  2. GSE VPC(서열 확인 번호: 15), VPA(서열 확인 번호: 16) 및 VP9-11(서열 확인 번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 유전 억제 요소.
  3. 제1항에 있어서, 유전 억제 요소가 펩티드를 코드화하는 센스 배향된 유전 억제 요소임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유전 억제 요소가 앤티센스 RNA를 코드화하는 앤티센스 배향된 유전 억제 요소임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 따른 GSE에 의해 코드화된 앤티센스 RNA의 누클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고누클레오티드.
  6. GSE에 의한 유전자 억제시에 억제된 유전자를 갖는 진핵세포에 선택성 표현형을 부여하는 유전자에 상응하는 GSE를 확인하는 방법으로서,
    (a) 진핵세포로부터 전체 mRNA 집단을 수득하는 단계 ;
    (b) 전체 mRNA로부터 무작위 단편화된 cDNA를 합성하여, 700염기쌍 미만의 크기를 갖는 무작위 cDNA 단편을 수득하는 단계 ;
    (c) 무작위 cDNA 단편을 합성 어댑터에 연결하여, 증폭가능한 무작위 cDNA 단편을 제조하는 단계 ;
    (d) 무작위 cDNA 단편을 증폭시키는 단계 ;
    (e) 증폭된 무작위 cDNA 단편의 혼합물을 적당한 발현벡터내로 클로닝하여, 각각의 무작위 cDNA 단편이 단백질 해독 개시 코돈에 작동적으로 결합되어 있는 무작위 단편 발현 라이브러리를 제조하는 단계 ;
    (f) 무작위 단편 발현 라이브러리를 적당한 표적 진핵세포에 전달하는 단계 ;
    (g) 선택성 표현형을 발현시키는 세포를 확인하고, 단리시키거나 풍부하게 함으로써, 선택성 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를 함유하는, 유전적으로 변형된 살아있는 세포를 단리시키거나 풍부하게 하는 단계 ; 및
    (h) 선택성 표현형을 가지는 표적세포로부터 GSE를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  7. GSE에 의한 유전자 억제시에 억제된 유전자를 갖는 진핵세포에 선택성 표현형을 부여하는 유전자에 상응하는 GSE를 확인하는 방법으로서,
    (a) 진핵세포로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계 ;
    (b) 게놈 DNA를 무작위 단편화하여, 700염기쌍 미만의 크기를 가지는 무작위 게놈 DNA 단편을 제조하는 단계 ;
    (c) 무작위 게놈 DNA 단편을 합성 어댑터에 연결하여, 증폭가능한 무작위 게놈 DNA 단편을 제조하는 단계 ;
    (d) 무작위 게놈 DNA 단편을 증폭시키는 단계 ;
    (e) 증폭된 무작위 게놈 DNA 단편의 혼합물을 적당한 발현벡터내로 클로닝하여, 각각의 무작위 게놈 DNA 단편이 단백질 해독 개시 코돈에 작동적으로 결합된 무작위 단편 발현 라이브러리를 제조하는 단계 ;
    (f) 무작위 단편 발현 라이브러리를 적당한 표적 진핵세포내로 전달하는 단계 ;
    (g) 선택성 표현형을 발현시키는 세포를 확인하고, 단리시키거나 풍부하게 함으로써, 선택성 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를 함유하는, 유전적으로 변형된 살아있는 세포를 단리시키거나 풍부하게 하는 단계 ; 및
    (h) 선택성 표현형을 갖는 표적세포로부터 GSE를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  8. GSE VPA(서열 확인 번호: 16) 또는 VP9-11(서열 확인 번호: 17)에 의해 코드화된 펩티드의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  9. 제2항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포로서, 도3에 도시된 레트로바이러스 벡터 pLNCX를 포함하며, GSE가 레트로바이러스 벡터 pLNCX의 Clal 부위내로 클로닝되어 있는 세포.
  10. 진핵세포에 1종 이상의 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제 요소를 확인하는 방법으로서,
    (a) 700염기쌍 미만의 크기를 갖는, 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자의 무작위 DNA단편을 수득하는 단계 ;
    (b) 화학요법제의 억제효과에 민감한 살아있는 진핵세포에서 DNA단편을 발현시킬 수 있는 발현벡터에 DNA 단편을 전달하여, 각각의 무작위 DNA 단편이 단백질 해독 개시 코돈에 작동적으로 결합된 라이브러리를 수득하는 단계 ;
    (c) 유전 억제 요소 라이브러리를 세포내로 도입시킴으로써, 살아있는 진핵세포를 유전적으로 변형시키는 단계 ;
    (d) 세포를 화학요법제의 존재하에 선택함으로써, 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제 요소를 함유하는, 유전적으로 변형된 살아있는 세포를 단리시키거나 풍부하게 하는 단계 ; 및
    (e) 유전적으로 변형된 진핵세포로부터 유전 억제 요소를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 클로닝된 유전자가 하기 GSE와 상동인 누클레오티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법:
  12. 제10항에 있어서, 클로닝된 유전자가 하기 GSE와 상동인 누클레오티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법:
  13. 제10항에 있어서, 클로닝된 유전자가 하기 GSE와 상동인 누클레오티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법:
  14. GSE 2V(서열 확인 번호: 1),11(서열 확인 번호: 2), 6(서열 확인 번호: 3), 5(서열 확인 번호: 4),28(서열 확인 번호: 5),2(서열 확인 번호: 6),20(서열 확인 번호: 7), 39(서열 확인 번호: 8), 12S(서열 확인 번호: 9),8(서열 확인 번호: 10),VPS2(서열 확인 번호: 1) 및VM(서열 확인 번호: 12)로 구성된 군으로부터 선택된 GSE.
  15. 제14항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포로서, 도3에 도시된 레트로바이러스 벡터 pLNCX를 포함하며, GSE가 레트로바이러스 벡터 pLNCX의 Clal 부위내에 클로닝되어 있는 세포.
  16. 제14항에 따른 GSE의 누클레오티드 서열을 갖는 합성올리고누클레오티드.
  17. 제1항에 있어서, 선택성 표현형이 화학요법제에 대한 내성임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 발현벡터가 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 라이브러리가 정규화된 라이브러리임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제6항에 있어서, 선택성 표현형이 화학요법제에 대한 내성임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제6항에 있어서, 발현벡터가 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제6항에 있어서, 라이브러리가 정규화된 라이브러리임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제7항에 있어서, 선택성 표현형이 화학요법제에 대한 내성임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제7항에 있어서, 발현벡터는 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제14항에 따른 GSE의 약 12개 내지 전체 누클레오티드 서열을 갖는 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드로 cDNA라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하여, 화학요법제에 대한 감수성과 관련된 유전자를 단리하는 방법.
  26. 제14항의 GSE의 누클레오티드 서열에 상응하는 클로닝된 유전자.
  27. 제14항에 따른 GSE의 서열과 상동인 누클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 세포내 유전자 발현을, 약제에 대해 내성을 갖지 않는 세포에서의 유전자 발현과 비교하는 단계를 포함하여, 화학요법제 내성에 대해 진단하는 방법으로서, 저발현이 화학요법제 내성을 나타내는 방법.
  28. 제14항에 따른 GSE와 상동인 완전한 유전자를 암세포에서 발현시키는 단계를 포함하여, 사람을 제외한 포유동물의 암세포에서 약제 내성을 극복하는 방법.
  29. 제2항에 따른 GSE와 상동인 완전한 유전자를 암세포에서 발현시키는 단계를 포함하여, 사람을 제외한 포유동물의 암세포에서 약제 내성을 극복하는 방법.
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