KR100255582B1 - 포유동물 세포에서의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자 및 유전 요소 - Google Patents

포유동물 세포에서의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자 및 유전 요소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환된 세포상에 악성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형을 부여하는 유전 억제 요소, 상기 억제 요소를 확인 및 수득하는 방법, 상기 유전 억제 요소에 상응하는 유전자를 단리 및 확인시키는 방법, 및 상기 유전 억제 요소를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 GSE에 상응하는 유전자에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
포유동물 세포에서의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자 및 유전 요소
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 발명은 포유동물 세포에서의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자 및 유전 억제 요소에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 이러한 유전자 및 유전 억제 요소를 확인하는 방법 뿐만 아니라 상기 유전자 및 유전 억제 요소의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물 세포의 형질전환된 표현형과 관련된 유전자로부터 유도된 유전 억제 요소, 및 이것의 치료 및 진단적 용도를 상세히 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자를 제공한다.
[관련 기술의 요약]
암은 미국에서 사망의 주된 원인 중의 하나이다. 임상적으로, 수술, 방사선 치료 및 화학요법제 치료를 포함하여 광범한 의학적 방법이 암을 치료하는데 현재 사용되고 있다[참조: the textbook CANCER ; Principles ＆ Practice of Oncology, 2nd Edition, De Vita et al., J. B. Lippincottcott Company, Philadlphia, PA, 1985]. 그러나, 이들 방법은, 악성 형질전환 및 종양 성장의 정밀한 세포 기저의 명확한 이해의 근본적인 결여로 인해 계속 제한을 받는 것으로 인식되어 있다.
악성종양성 형질전환 및 종양 성장의 기저의 이러한 이해의 기초적 내용은 지난 10년에 걸쳐 밝혀져 왔다. 정상 세포의 성장은, 프로토-온코진(Proto-oncogene)과 종양 억제 유전자로서 각각 공지된 성장 촉진 유전자와 성장 억제 유전자의 균형에 의해 조절되는 것으로 현재 이해되어 있다. 프로토-온코진은 비조절성 세포 성장을 자극시키는 이들의 능력을 증가시키는 조절 및 구조 변이에 의해 온코진으로 전환된다. 따라서, 이들 변이는 우성(예를 들어, 변이체 RAS 유전자) 또는 공동 우성(온코진, 예를 들어 NMYC 또는 HER2/NEU의 증폭의 경우)인 것으로 나타난다[참조: Varinus, 1989, “A historical overview of oncogenes”, Oncogenes and the molecular origene of cancer, Weinberg, ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. pp.3-44].
우성 및 공동 우성 유전자는 유전자 전달 또는 증폭되거나 과발현된 DNA 서열의 선택적 단리를 기초로 하는 다수의 기법을 사용하여 효과적으로 확인되고 연구될 수 있다[참조 : Kinzler et al., 1987, Science 236: 70­73; Schwab et al., 1989, Oncogene 4: 139-144; Nakatani et al., Jpn. J. Cancer Res. 81: 707-710]. 발현 선택 방법은 이용하여 다수의 세포성 온코진을 콜로닝하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 온코진의 우성 특성으로 인해, 시험관내, 즉, 세포 배양액에서, 및 생체내, 즉, 형질전환된 동물에서 이들의 기능 분석이 용이하였다. 현재까지 약 50개의 세포성 온코진이 확인되었다[참조: Hunter, 1991, Cell 64: 249-270].
그러나, 비정상적 세포 성장을 유도하기 보다는 억제하는데 관여하는 암 관련 유전자가 더 많은 것으로 여겨진다. 온코진 억제 유전자 또는 종양억제 유전자로서 알려진 이 종류의 유전자는, 바인베르크(Weinberg)의 문헌[1991, Science 254: 1138-1146]에 “유전 요소로서, 이것이 없거나 비활성화 되면 세포가 종양 성장 억제의 한 표현형 또는 또 다른 표현형을 나타내게 하는 요소”를 포함하는 것으로 규정되어 있다. 종양 억제 유전자의 기능 또는 발현을 상실시키는 종양 억제 유전자내의 변화는, 이들 변화가 동일한 유전자의 정상 대립유전자의 존재하에 표현형에 영향을 미치지 않기 때문에 열성이다. 종양 억제 인자와 관련된 변이의 열성 특성은, 이러한 유전자를 유전자 전달 기법에 의해 분석하거나 확인하는 것을 매우 어렵게 하며, 온코진의 연구가 종양 억제 유전자의 연구 보다 훨씬 앞서있는 이유를 설명해준다.
정상 세포에 있어서, 종양 억제 유전자는, 성장 억제 신호를 인식하여 이를 핵에 전달하는 것으로부터, 신호에 대한 세포 반응을 최종 결정하는 2차 반응 유전자를 유도(또는 억제)하는 것까지, 다양한 수준에서 참여할 수 있다. 실제로, 공지된 종양 억제 유전자는 조절 경로의 다양한 단계들과 관련되어 왔다. 따라서, DCC와 ErbA 유전자는 2개의 상이한 종류의 수용체를 코드화한다[참조 : Fearon et al., 1990, Science, 247: 49-56; Sap et al., 1986, Nature 324: 635-640; Weinberg et al., 1986, Nature 324: 641-646]. 유전자 NF-1은 ras 상호작용 단백질과 유사한 폴리펩티드로서, 신호화 경로의 일원인 폴리펩티드를 코드화한다[참조: Xu et al., 1990, Cell 62: 599-608; Ballester et al., 1990, Cell 62: 851-859; Weinberg et al., 1990, Nature 347: 291-294; Barbacid, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56: 779-827]. p53, RB 및 WT 유전자는 핵 조절 단백질을 코드화한다[참조: Field et al., 1991, Science 249: 1046-1049; Raycroft et al., 1990, Science 249: 1049-1051; Kem et al., 1991, Oncogene 6: 131-136; O′Rourke et al., 1990, Oncogene 5: 1829-1832; Kern et al., 1991, Science 252: 1708-1711; Lee et al., 1987, Nature 329: 642-645; Friend et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9059-9063; Call et al., 1990, Cell 60: 509-520; Gessler et al., 1990, Nature 343: 774-778].
종양 억제 유전자를 클로닝하기 위해 종래에 2가지 방법이 사용되었다. 첫 번째 방법은 특정 유형의 종양에서 관찰되는 불규칙한 유전자 결실 또는 재배열과 관련된 영역을 단리하는 것을 기초로 한다. 이 방법에는 극도로 많은 연관 분석이 필요하고, 추정 억제 유전자의 기능에 관한 임의의 직접적인 정보를 제공하지 못한다[참조: Friend et al., 1991, Science 251: 1366-1370; Viskochil et al., 1990, Cell 62: 187-192; Vogelstein et al., 1988, N, Engl. J. Med. 319: 525-532]. 실제로, 특정 종양들에서의 이형접합성의 상실의 다수의 결과중에서[참조: Solomon et al., 1991, Science 254: 1153-1160; LaForgia et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5036-5040; Trent et al., 1989, Cancer Res. 49: 420-423], 영향을 받은 유전자의 기능이 이해되어 있는 예는 소수에 지나지 않는다. 이러한 드문 경우중의 2가지 경우에, 유전자 기능은 또 다른 방법, 즉, 우성 네거티브 변이체 단백질의 분석을 사용하여 확인되었다[참조: Herskowitz, 1987, Nature 329: 219-222].
상세하게는, 종양 억제 유전자 erbA 및 p53은 변이체 단백질을 코드화하는 변형된 형태로서 최초로 발견되었다[참조: Sap et al., 1986, ibid,; Milner et al., 1991, Molec. Cell. Biol. 11: 12-19]. 이들 변형된 유전자는, 이들이 단독으로 또는 다른 온코진과 조합된 형태로 트랜스펙션되는 경우에 세포 형질전환을 유도하기 때문에, 온코진으로서 초기에 분류되었다 [p53의 경우에는 ras, erbA의 경우에는 erbB; 참조 - Eliyahu et al., 1984, Nature 312: 646-649; Parada et al., 1984, Nature 312: 649-651; Graf ＆ Beug, 1983, Cell 34: 7-9; Damm et al., 1989, Nature 339: 593-597]. 그러나, 그후, 이들 “온코진”둘 모두가 상응하는 야생형 유전자의 정상적 기능을 간섭함으로써 작용하는 것으로 인식되었다. 따라서, 온코진 변이체 p53 단백질은 야생형 단백질과 함께 기능적으로 비활성인 복합체를 형성하며; 이러한 복합체는 p53 단백질의 정상적 네거티브 조절 기능을 제공할 수 없게 된다[참조: Herskowitz, 1986, ibid.; Milner et al., 1991, ibid.; Montenarch ＆ Quaiser, 1989, Oncogene 4: 379-382; Finlay et al., 1988, Molec. Cell. Biol. 8: 531-539]. 닭의 적아세포증 바이러스에서 발견되는 온코진 erbA는, 적혈구계 분화의 유도에 관여하는 전사 조절 단백질인 갑상선 호르몬 수용체에 대한 닭 유전자의 변이체이다[참조: Damm et al., 1989, ibid.; Damm et al., 1987, EMBO J. 6: 375-382]. 변이체 earA 단백질은 DNA내에 이것의 특이적 결합 부위를 형성시킴으로써 야생형 수용체의 기능을 블록킹한다[참조: Sap et al., 1989, Nature 340: 242-244].
따라서, 천연 우성 네거티브 변이체는 상응하는 종양 억제 유전자의 확인을 가능하게 할 뿐만 아니라, 이들의 기능 분석을 위한 기구의 역할을 한다. 그러나, 열성 유전자의 확인을 위한 이러한 천연 도구는 드문 것으로 여겨지며, 이는 신규한 종양 억제 유전자를 발견하기 위한 이 방법의 유용성을 제한한다.
종양성 형질전환에 관여하는 신규한 열성 유전자의 발견 및 분석은, 이러한 유전자로부터 유도되며, 이들 유전자의 기능을 선택적으로 억제할 수 있는 유전 억제 요소(GSE)를 사용함으로써 현저하게 가속될 수 있다. GSE는 특정 GSE가 상응하는 유전자에 대한 열성형 표현형을 부여하는 우성 네거티브 인자이다. 최근에, 열성 유전자를 단리시키는 어려운 영역에서의 약간의 발전이 GSE 기술을 이용하여 이루어졌다. 미국 특허 제5,217,889호(1993년 6월 8일에 허여됨)에는 GSE를 수득하는 일반화된 방법이 기재되어 있다[참조: Holzmayer et al., 1992, Nucleic Acid Res. 20: 711-717]. 구드코프(Gudkov) 등의 문헌[1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3231-9235]에는 토포이소머라제(topoisomerase) II 상호작용 약제에 대한 내성을 유도하는 토포이소머라제 II cDNA로부터 GSE를 단리하는 방법이 교시되어 있다. 공동 계류중인 1993년 3월 3일에 출원된 미국 특허 출원 제08/033,986호 및 1994년 1월 5일에 출원된 미국 특허 출원 제08/177,571호에는, 항암 DAN 상해제인 에토포시드에 대해 내성인 세포의 RNA로부터 단리된 GSE가 키네신 중쇄 유전자의 일부와 상동인 안티센스 RNA를 코드화하는 GSE를 포함한다는 신규하고 의외의 결과에 대한 본 발명자들에 의한 발견이 기재되어 있다. 또한, 공동 계류중인 미국 특허 출원 제 08/033,986호에는 종래에 공지되지 않은 유전자로부터의 2개의 다른 GSE로서, 발현되면 포유동물 세포에 에토포시드 내성을 부여하는 GSE가 기재되어 있다. 공동 계류증인 1994년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/199,900호에는, 종래에 공지되지 않은 유전자로부터의 GSE로서, 발현되면 포유동물 세포에 시스플라틴 내성을 부여하는 GSE가 기재되어 있다.
이들 결과에 의해, 암세포에서의 약제 내성을 포함하여 의외의 메카니즘을 포함하는 열성 유전자 매개성 생물학적 현상을 설명하기 위해 본 발명자들에 의해 개발된 GSE 기술의 힘이 추가로 강조되며, 이는 암 환자에서의 암 약제 내성을 극복하기 위한 기회 및 수단을 제공한다. 본 발명의 기술은, GSE를 발현시키는 사전 비형질전환된 세포에 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 단리시키고 확인하기 위해, 및 형질전환된 표현형과 관련된 유전자를 단리시키고 확인하기 위해 적용되고 있다.
[발명의 요약]
본 발명은, 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형과 관련된 유전자로부터 유도된 불규칙 단편인 유전 억제 요소(GSE)로서, 이러한 GSE를 발현시키는 세포에 형질전환된 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를 제공한다. 본 발명은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있고, 공동 계류중인, 1993년 3월 3일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/033,086호, 1994년 1월 5일에 출원된 제 08/177,157호, 및 1994년 2월 22일에 출원된 제 08/199,900호에 기재된 발견에 부분적으로 기초한 것으로서, GSE를 발현시키는 세포에 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 GSE를 확인하고 단리시키는 방법을 제공한다.
제1의 일면에서, 본 발명은 GSE를 발현하는 세포에 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 정상 세포, 바람직하게는 마우스 또는 사람 섬유아세포로부터 유도되는 전체 cDNA로부터 유도된 불규칙 단편 발현 라이브러리로부터의 클론을 함유하는 세포를 선택한 후, 불멸화된 세포, 형태학적으로 형질전환된 세포 또는 프랭클리(frankly) 종양유발성인 세포로부터 라이브러리 삽입물을 수득하는 것을 이용한다. 제2의 일면에 있어서, 본 발명은 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형과 관련된 유전자를 확인하고 클로닝하는 방법을 제공하며, 또한 유전자 자체를 제공한다. 이 방법은 세포에 형질전환된 표현형을 제공하는 GSE(또는, 대안적으로, 이러한 GSE의 일부를 구성하는 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드)를 사용하여 온길이 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 수득되는 임의의 포지티브 클론의 cDNA 삽입물의 누클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 대안적으로, “앵커링된 PCR”기법(하기 실시예 3 참조)이 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE에 상응하는 cDNA를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 이러한 일면에서 구체화 되는 것은, 형질전환된 표현형과 관련된 유전자를 코드화하는 게놈 DNA를, 예를 들어 게놈 DNA를 라이브러리로부터 단리하는 것이다. 제3의 일면에서, 본 발명은, 특정 유전자의 발현의 부재 또는 저발현으로 인해 형질전환된 표현형을 발현시키는 형질전환된 세포, 특히 사람 종양 세포를 특징화시키기 위한 진단 방법을 제공한다. 이 진단 방법은, 시험하려는 특정 종양 세포 샘플에 의한 특정 유전자 생성물의 발현의 수준을, 정상의 비형질전환된 세포에서의 발현의 수준과 비교하여, 바람직하게는 정량적으로 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 일면의 한 특징은, 저발현 또는 발현의 부재가 악성종양성 포유동물, 가장 바람직하게는 악성종양성 사람 세포에서의 형질 전환된 표현형과 관련되어 있는 단백질에 대해 특이적인 항체의 개발이다. 이러한 항체는 생검 또는 기타 조직 샘플에서 종양 세포를 검출하기 위한 진단제로서 유용하며, 이러한 세포에서의 형질전환된 표현형의 성질 및 발현의 정도를 특징화하는데 유용하다. 제4의 일면에서, 본 발명은 시험관내약제 스크리닝 및 종양 세포에 대해 유용한, 즉, 항암제인 약제 생성물의 이론적 설계에 대한 출발점을 제공한다. 형질전환된 표현형과 관련된 유전자의 구조, 기능, 편재화 및 발현 패턴을 연구함으로써, 선택적으로 이러한 세포를 치사시키거나 성장을 억제시키는 약제 조성물을 생성시키기 위한 방법이 개발될 수 있으며, 여기서, 이러한 유전자는 발현되지 않거나 저발현된다. 또한, 본 발명에 의해, 본 발명의 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 발현시키고, 이것에 의해 형질전환되는 포유동물 세포의 배양액이 제공된다. 이러한 세포는 악성종양성 포유동물 세포 형질전환에 대한 생리학적 및 생화학적 기초를 결정하는 데에 유용한다. 이러한 세포는 선택적으로 이러한 세포를 치사시키거나 성장을 억제시키기 위한 약제 및 화학요법제의 개발에 또한 유용하기 때문에, 궁극적으로, 종양 질환을 더욱 효과적으로 치료하기 위한 개선된 화학요법적 프로토콜을 수립하는데 유용한다.
본 발명의 특정한 바람직한 구체예는, 특정한 바람직한 구체예의 하기의 상세한 설명과 특허청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 cDNA 클로닝에 사용되는 어댑터의 구조를 도시한 도면이다. 어댑터의 ATG-센스(서열번호 1) 및 ATG-앤티센스(서열번호: 2) 가닥에 대한 누클레오티드 서열이 도시되어 있다.
제2도는 cDNA 클로닝에 사용되는 pLNCX 벡터의 구조를 도시한 도면이다.
제3(a)도 및 제3(b)도는 마우스 NIH 3T3 세포 cDNA로부터의 불규칙 단편 발현 라이브러리(RFEL)를 함유하는 MEF 세포에서 불멸화 GSE를 선택하기 위한 개략도이다.
제3(a)도는 분기점(crisis)에서 살아남은 세포에 대한 선택의 1 라운드를 통한 이러한 GSE의 선택을 도시한다.
제3(b)도는 제3(a)도에 도시된 개략도에 따라 생성된 불멸화된 MEF의 집단으로부터 불멸화 GSE를 재선택하고, 부화시키기 위한 개략도이다.
제4도는 MEF 불멸화 GSE를 포함하는 PCR 단편의 폴리아크릴아미드겔 전기영동 분석을 도시한다.
제5도는 Tr6-GSE(서열번호 3)의 누클레오티드 서열이다.
제6(a)도 및 제6(b)도는 Tr6-GSE(서열번호 3)가 스위치 3T3 세포와 MEF 세포 둘 모두에게 형태학적으로 형질전환된 표현형을 부여할 수 있고(제6(a)도), 또한, 자발적 불멸화가 외래 도입된 p53 유전자의 발현에 의해 억제되는 MEF 세포를 불멸화시킬 수 있음(제6(b)도)을 입증하는 실험의 결과를 도시한다.
제7도는 형태학적 형질전환을 부여하는 GSE를 선택하기 위한 개략도이다.
제8(a)도 및 제8(b)도는 수득된 형질전환 GSE를 함유하는 레트로바이러스를 사용하여 새로운 NIH 3T3 세포를 재감염시키는 실험의 결과를 도시한다.
제8(a)도는 5％ FCS가 보충된 배지에서의 G418 내성(감염 효율의 측정치로서) 및 형태학적 형질전환에 대한, 병소 24, 25 및 26를 함유하는 바이러스로 감염된 세포의 선택의 결과를 도시하며,
제8(b)도는 형택학적으로 형질전환된 병소의 게놈 DNA로부터의 레트로바이러스 삽입물의 PCR 분석의 결과를 도시한다.
제9도는 SAHH-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 6)을 도시한다.
제10도는 SAHH-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 6; 상부 서열)과 사람 S-아데노실호모시스테인 하이드롤라아제 mRNA 서열(서열번호 8; 하부 서열)을 비교한 도면이다.
제11도는 SAHH-GSE에 의해 코드화되는 펩티드의 아미노산 서열(서열번호 7; 상부 서열)과 사람 S-아데노실호모시스테인 하드롤라아제 단백질 아미노산 서열(서열번호 9; 하부 서열)을 비교한 도면이다.
제12도는 Tr19-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 4)을 도시한다.
제13(a)도 내지 제13(c)도는, SAHH-GSE는 MEF 세포에 불멸화 및 형태학적 형질전환 둘 모두를 부여할 수 있고(제13(a)도), Tr19-GSE는 MEF 세포를 불멸화시킬 수 있고(제13(b)도), SAHH-GSE 및 항-khcs GSE 둘 모두는 MEF 세포를 불멸화시킬 수 있지만, SAHH-GSE만이 MEF 세포를 형태학적으로 형질전환시킬 수 있음(제13(c)도)을 입증하는 실험의 결과를 도시한다.
제14도는 종양유발성 GSE를 선택하기 위한 개략도이다.
제15도는 종양유발성 GSE를 포함하는 PCR 단편의 폴리아크릴아미드겔 전기영동 분석의 결과를 도시한다.
제16도는 Tr22-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 5)를 도시한다.
제17도는 1bb1-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 10)을 도시한다.
제18도는 1bb1-GSE의 누클레오티드 서열(서열번호 10; 상부 서열)과 P120 사람 인 항원 유전자 서열(서열번호 12; 하부 서열)을 비교한 도면이다.
제19도는 1bb1-GSE에 의해 코드화된 펩티드 아미노산 서열(서열번호 11; 상부 서열)과 P120 사람 인 항원 단백질 아미노산 서열(서열번호 13; 하부 서열)을 비교한 도면이다.
제20도는 1bb1-GSE(서열번호 10)을 함유하는 레트로바이러스에 의한 스위스 3T3 세포의 감염을 사용하는 병소 생성 검정의 결과를 도시한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형과 관련된 특정 유전자 기능을 확인하기 위한 수단에 관한 것이다. 본 발명은 유전 억제 요소(GSE)를 제공하며, 이러한 GSE가 발현되면 비형질전환된 섬유아세포에 형질전환된 표현형을 부여한다. 또한, 본 발명은 이러한 GSE를 확인 하기 위한 방법 뿐만 아니라 이들을 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 있어서, “악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형” 및 “형질전환된 표현형”이란 용어는, 포유동물 세포의 세포성 형질전환과 관련된 표현형 특징, 즉, 세포 배양액에서의 장기간 성장, 반고체 배지에서의 성장, 또는 면역부전 또는 동계 동물에서의 종양유발성 성장에 의해 검출되는, 불멸성, 형태학적 또는 성장 형질전환, 및 발암성 중의 어느 하나를 포함하고자 하지만, 이들에 제한되지 않는다.
제1의 일면에 있어서, 본 발명은 비형질전환된 세포에 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 확인된 GSE는 악성종양성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형과 관련된 유전자와 상동일 것이다. 본원에 있어서, “유전자와 상동인”이라는 용어는, GSE가, 앤티센스 또는 앤티진(antigene) 메카니즘을 통해 작용하는지 또는 단백질 수준에서의 간섭의 메카니즘을 통해 작용하는지에 따라 2가지 상이한 의미를 갖는다. 전자의 경우, 앤티센스 또는 앤티진 올리로누클레오티드 또는 폴리누클레오티드인 GSE는, 이것이 생리학적 조건하에 후그스틴(Hoogsteen) 또는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍형성에 의해 유전자 또는 이것의 mRNA 전사체와 하이브리드화하는 누클레오티드 서열을 갖는 경우, 유전자와 상동이다. 후자의 경우, 단백질 분자를 간섭하는 GSE는, 이것이 단백질을 코드화하는 유전자의 일부에 의해 코드화되는 서열과 동일하거나, 보존적 아미노산 치환이 없는 경우에 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우, 이 단백질을 코드화하는 유전자와 상동이다. 두 경우 모두에 있어서, 실질적으로, GSE가 유전자와 상동인 지의 여부는 GSE가 유전자의 기능을 억제시키거나 감소시킬 수 있는 지를 평가함으로써 결정된다.
본 발명의 이 일면에 따른 방법은 비형질전환된 수용체 세포에 형질전환된 표현형을 부여하는 클론을 확인하기 위해 전체 cDNA 또는 게놈DNA 불규칙 단편 발현 라이브러리를 표현형 스크리닝하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 전체 cDNA 또는 게놈 DNA의 불규칙 단편의 라이브러리는 레트로바이러스 발현 벡터내로 클로닝된다. 이 바람직한 구체예에 있어서, 라이브러리를 함유하는 레트로바이러스 입자는 세포를 감염시키는데 사용되며, 감염된 세포는, 예를 들어, 시험관내 배양액에서의 “분기점”을 넘어서 성장하거나, 형태학적으로 형질전환되는 것으로 인식되는 방식으로 성장하거나, 연질 아가 또는 아가로스와 같은 반고체 배지, 또는 메틸셀룰로오스중에서 성장하는 능력을 나타내거나, 동물에서의 생체내 프랭클리 종양유발성 성장에 의해 형질전환된 표현형을 나타내는 이들의 능력이 시험된다. 바람직하게는, 라이브러리내의 삽입물의 크기는 약 100bp 내지 약 700bp, 더욱 바람직하게는 약 200bp 내지 약 500bp 일 것이다. 가장 바람직하게는, 불규칙 단편 라이브러리는 임의의 유전자의 발현 수준과 무관하게 라이브러리가 만들어지는 세포 유형에서 발현되는 각각의 유전자에 상응하는 거의 동수의 클론을 함유하는 정규화된 라이브러리일 것이다. 그러나, 라이브러리의 정규화는 풍부하게 또는 적절하게 발현된 유전자에 상동인 GSE를 단리시키는 데에는 불필요하다. 형질전환된 표현형을 나타내는 세포의 클론성 집단이 단리되면, GSE를 코드화하는 라이브러리 클론이 세포로부터 수득된다. 이 단계에서, 발현 라이브러리의 삽입물이 이것의 누클레오티드 서열에 대해 시험될 수 있다. 대안적으로 및 바람직하게는, 수득된 라이브러리 클론은, 누클레오티드 서열 결정 전에, 추가의 트랜스펙션 또는 감염 및 선택성 검정서 형질전환된 표현형을 부여하는 이것의 능력에 대해 추가 시험될 수 있다. 물론, 누클레오티드 서열이 결정되면 GSE가 확인된다. 이 방법은 실시예 1 및 2에 추가로 예시된다.
제2의 일면에 있어서, 본 발명은 포유동물 세포에서의 종양성 성장의 조절과 관련된 유전자를 확인하고 클로닝하는 방법 뿐만 아니라 이 방법에 의해 유도되는 유전자를 제공한다. 이것은, GSE 또는 이것의 일부를 프로브로서 사용하여, 온길이 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 이들의 유전자 기원을 확인할 수 있기 때문이다. 대안적으로, “앵커링된 PCR”의 기법(실시예 3 참조)이 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE에 상응하는 cDNA를 단리시키는데 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서의 종양성 형질전환의 조절과 관련된 유전자가, 본 발명에 의해 제공된 GSE 또는 이러한 GSE에 상응하는 유전자를 사용하여 사람을 포함한 임의의 포유동물종으로부터의 이러한 종양성 성장 관련된 GSE에 상응하는 유전자를 단리시킬 수 있을 정도로 충분히 진화적으로 보존되는 것으로 인식된 것이다.
몇몇 경우에 있어서, 형질전환된 표현형과 관련된 유전자는 매우 놀라운 것으로 입증될 것이다. 예를 들어, 비형질전환된 세포에 형질전환된 표현형을 부여할 수 있는 것으로 밝혀진 GSE로, 사람 P120인 항원 유전자의 마우스 상동체로부터 유도된 GSE 및 S-아데노실 호모시스테인 하이드롤라아제의 마우스 상동체로부터 유도된 GSE, 뿐만 아니라 종래에 확인되지 않은 유전자로부터의 3개의 GSE가 있다. 또한, 마우스 키네신 유전자로부터 유도되고, 에노포시드 내성과 관련된 GSE는, 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 및 정상 사람 섬유아세포에 세포 배양액 성장 불멸화를 부여할 수 있는 것으로 이미 밝혀졌으며, 이는 공동 계류중인 1994년 1월 5일자에 출원된 미국 특허 출원 제 08/177,154호와 1993년 3월 3일에 출원된 제 08/033,086호에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 이 일면에 따른 방법은 노화에 대한 유전자 기초에 관한 가치있는 정보를 또한 제공한다. 본 발명의 이 일면에 따른 방법, 이 방법에 의해 확인된 유전자 연구를 위한 이것의 용도, 및 이들의 세포성 효과는 실시예 3에 추가로 예시된다.
제3의 일면에 있어서, 본 발명은 특정 유전자의 발현의 부재 또는 저발현으로 인해 형질전환된 표현형을 나타내는 형질전환된 세포, 특히 사람 종양 세포를 특징화하기 위한 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 제1 및 제2의 일면에 따른 방법을 이용함으로써, 이러한 유전자가 확인되고 클로닝된다. 이러한 유전자의 발현의 부재 또는 저발현이 자연적인 것이며, 이로써 종양 성장 및 암에 대한 의학적으로 중요한 기초를 제공하는 지를 결정하기 위해, 사람 종양 세포가 관심있는 특정 유전자에 대한 이들의 발현 수준에 대해 평가된다. 따라서, 종양을 유도하는 정상 조직에서의 발현에 비해 발현의 부재 또는 현저히 감소된 발현은, 특정 종양의 세포 및 조직 유형, 발병률, 침입성, 전이력, 및 그 밖의 관련 특성을 포함하여 특정 암의 자연적 내력과 상호관련될 것이다. 따라서, 이러한 감소된 발현 또는 발현의 부재는 조직 샘플내의 종양유발성 세포의 존재 및 양에 대한 진단 방법을 위한 기초가 될 수 있다. 유전자의 과발현의 결과로서의 악성종양성 형질전환 및 종양 성장은 본 발명에 의해 제공된 유사한 진단 방법을 이용하여 또한 검출될 수 있다. 본 발명의 이 일면에 따른 진단 벙법의 제1의 구체예는 발현을 측정하려는 유전자의 서열과 상동인 올리고누클레오티드(들)을 사용한다. 이 구체예에 있어서, RNA는 조직 또는 종양 샘플로부터 추출되며, 관심있는 유전자에 특이적인 RNA는 RNase 보호 검정인 표준 필터 하이브리드화 과정 또는 정량적 cDNA-PCR[참조, Noonan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164]에 의해 정량화된다. 본 발명의 이 일면에 따른 진단 방법의 제2의 구체예에 있어서, 항체는 관심있는 유전자에 의해 코드화되는 단백질의 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드에 대해 유도된다. 따라서, 이들 항체는 시험하려는 종양 세포로부터 추출된 단백질의 샘플중에 존재하거나, 시험하려는 종양 세포의 표면 또는 종양 세포내의 위치에 존재하는 관심있는 유전자 생성물의 양을 결정하기 위해 통상의 정량적 면역 검정(예를 들어, RIA 또는 면역조직화학적 검정)에 사용된다. 제3의 구체예에 있어서, 암세포의 종양성 형질전환과 관련된 유전자의 특성인 효소 활성은 상기 단백질을 코드화하는 유전자가 암세포중에서 과발현되거나 저발현되는 지를 측정하는데 이용될 수 있다.
제4의 일면에 있어서, 본 발명은 생체내에서의 종양 세포에 의한 종양유발성 및 종양 성장을 중화시킬 수 있는 약제 생성물의 시험관내 약물스크리닝 및 합리적 설계를 위한 출발점을 제공한다. 이 점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 발현시키며, 이것에 의해 불멸화되고/되거나 형질전환되는 포유동물 세포의 배양액을 제공한다. 본 발명의 이 일면에는 거의 모든 조직 또는 세포 유형을 대표하는 세포 배양액이 포함된다. 이러한 세포는, 포유동물 세포의 악성종양성 형질전환에 대한 생리학적 및 생화학적 기초를 결정하는데 유용할 뿐만 아니라 선택적으로 이러한 형질전환된 세포를 치사시키거나 성장을 억제시키기 위한 약제 및 화학요법제를 스크리닝하는데 유용하다. 이러한 제제의 확인으로 인해 종양성 질환을 더욱 효과적으로 치료하기 위한 개선된 화학요법적 프로토콜이 개발될 것이다.
GSE가 유도되는 유전자에 의해 코드화된 단백질 서열은 cDAN 서열로부터 추론될 수 있으며, 상응하는 단백질의 기능은 공지된 유전자와의 상동성을 조사하거나 단백질 서열에서의 공지된 작용의 원인을 조사함으로써 결정될 수 있다. 이들 검정에 의해 단백질 기능이 밝혀지지 않는 경우에, 이것은 유전자를 억제하는 GSE의 표현형 효과를 통해 추론될 수 있다. 이러한 효과는 GSE 발현과 관련된 다양한 성장 관련된 변화, 형태학적 변화, 생화학적 변화 또는 항원성 변화를 분석함으로써, 세포 수준에서 조사될 수 있다. 생물체 수준에서의 GSE 효과는 형질전환된 동물(예를 들어, 마우스)에 트랜스유전자로서의 상응하는 GSE를 도입시키고, GSE 발현과 관련된 발육 비정상성을 분석함으로써 또한 실험될 수 있다. 유전자 기능은 세포 또는 형질전환된 동물로부터의 GSE가 아닌 상응하는 유전자의 온길이 cDNA를 발현시키고, 유전자의 과발현과 관련된 변화를 조사함으로써 또한 실험될 수 있다.
온길이 또는 부분 cDNA 서열은 편리한 원핵세포 또는 진핵세포 발현 시스템에서 직접 단백질 합성을 또한 유도시키기 위해 사용될 수 있으며, 생성된 단백질은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 얻기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 이들 항체는 단백질 편재화를 조사하기 위해 사용되고, 단백질 기능의 특이적 억제제로서 사용될 뿐만 아니라 진단을 위해 사용될 수 있다. 특히, GSE인 Tr6, Tr19 및 Tr22의 서열, 또는 p120 핵내 항원 유전자 또는 SAHH 유전자의 상응하는 영역에 의해 코드화된 합성 펩티드에 대해 유도된 항체가 특히 유용할 것이다(실시예 2 및 3, 제5도, 9 내지 11도 및 15 내지 18도 참조).
포유동물 세포의 악성종양성 형질전환에 관여하는 유전자의 생물학적 기능을 이해하면, 이러한 유전자의 기능을 자극하거나 모방함으로써 항암제에 대한 세포독성 반응을 증가시키는 수단이 제시될 것으로 또한 여겨진다. 예를 들어, 유전자가 특정 화합물을 생성시키는 효소를 코드화하는 경우, 이러한 화합물은 화학 합성될 수 있고, 세포독성 약제와 조합된 형태로 투여될 수 있다. 약제학적 방법이 단백질 기능으로부터 명백하지 않은 경우, 유전자 발현을 전사 수준에서 상향조절할 수 있다. 이것은 상응하는 유전자의 프로모터 영역을 클로닝하고, 특이적 생물학적 자극체에 반응을 제공하는 것으로 공지된 cis 요소 존재에 대해 프로모터 서열을 분석함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 종양 질환을 일으키는 돌연변이 또는 그 밖의 생물학적 손상을 통해 손실된 이러한 유전자의 종양 억제 기능을 회복시키기 위해, 종양 억제 유전자의 기능을 복구하는데 유용한다.
손실되면 유전자를 더 이상 기능적으로 발현시키기지 않는 세포의 악성 종양성 형질전환을 초래하는, GSE 방법을 통해 확인된 유전자의 발현을 증가시키는 가장 간단한 방법은 이러한 유전자에 대한 온길이 cDNA를 유전자 치료용 발현 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에 삽입시키는 것일 것이다. 재조합 레트로바이러스 형태의 이러한 벡터는 생체내에서 종양 세포에 전달될 것이며, 일체화되면, 이러한 세포의 종양 성장을 감소시키거나 제거하는 작용을 할 것이다. 종양 세포에 대한 선택적 전달은 분열하는 세포에 대한 레트로바이러스 매개성 형질도입의 선택성을 기초로하여 달성될 수 있다. 대안적으로, 선택성은 조직 특이적 프로모터 또는 종양 특이적 프로모터, 예를 들어 암배사성 항원 유전자의 프로모터로부터 유전자의 발현을 유도시킴으로써 달성될 수 있다.
cDNA 서열로부터 추론된 단백질 구조는 또한 공지된 항암제와 동일한 방식으로 이 단백질에 영향을 미치는 신규한 약제를 개발하기 위해, 컴퓨터 보조된 약제 설계에 또한 사용될 수 있다. 편리한 발현 시스템에서 생성된 정제된 단백질은 항암 활성을 간는 신규한 화합물에 대한 시험관내 생화학적 스크린 시스템의 중요한 성분으로서 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE를 발현시키는 포유동물 세포는 상응하는 유전자의 하향 조절과 관련된 종양 성장을 선택적으로 제거하거나 억제시키는 능력에 대해 화합물을 스크리닝하는데 유용하다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 추가로 예시할 뿐이며, 제한하는 것이 아니다.
[실시예 1]
[레트로바이러스 벡터에서의 정규화된 불규칙 단편 cDNA 라이브러리의 생성 및 바이러스 패키징 세포주로의 도입]
정규화된 cDNA 집단을 본원에 참고문헌으로 인용된 1993년 3월 9일에 출원된 공동 계류중인 미국 특허 제 08/033,086호에 기술된 바와 같이 제조하였다. 요약하며, 폴리(A)＋RNA를, 세포 형질전환 검정에 유용한 것으로 공지된 불멸화된 마우스 세포주인 마우스 NIH 3T3 세포(기탁번호 CRL 1658, American Type Culture Collection, Rockville, MD)의 지수 성장하고, 정적인 컨플루언트 단일층 배양액(참조: Shih et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5714-5718)으로부터 동량으로 추출된 전체 RNA로부터 정제하였다. 불규칙적으로 프라이밍된 cDNA 진단에서의 5′-말단 서열의 과발현을 방지하기 위해, RNA를 5분간 비등시킴으로써 600 내지 1000개의 누클레오티드의 평균 크기로 단편화시켰다. 그 후, 이들 RNA 단편을 불규칙적으로 프라이밍된 이중 가닥 cDNA를 제조하는데 사용하였다. 그 후, 이 불규칙적으로 프라이밍된 cDNA를 모든 세 개의 가능한 리딩 프레임 및 번역 개시를 위한 적합한 환경에 ATG를 제공하는 합성 어댑터에 연결시켰다(제1도 참조). 어댑터의 구조에 의해, 각각의 단편이 이것의 배향과 무관하게 개시 코돈으로부터 출발하게 하도록 cDNA의 평활 단부를 갖는 단편에 대한 이것의 연결이 결정되었다. 특이적 서열의 불규칙적 과증폭 또는 저증폭을 최소화시키고, 생성물의 수율을 증가시키기 위해, 연결된 혼합물을, 후속 조합되는 12개의 개별 반응에서 PCR 프라이머로서 어댑터의 “센스”가닥을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 후, PCR 증폭된 혼합물을 6％ 폴리아크릴아미드겔중에서 전기영동에 의해 크기 분별하고, 크기가 약 200 내지 500 염기쌍(bp)인 단편을 추가 조작을 위해 선택하였다.
정규화를 위해, cDNA 제제를 변성시키고, 리어닐링을 위한 0, 24, 48, 72, 96 및 120시간점을 사용하여 리어닐링시켰다. 그 후, 각각의 리어닐링된 혼합물로부터의 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA를 수산화인회석 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 리어닐링의 각각의 시점으로부터의 이들 DNA 단편을 어댑터 유도된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키고, 사람 세포에서 상이한 수준으로 발현되는 유전자에 상응하는 프로브와의 슬롯(slot) 블롯(blot) 하이브리드화에 의해 분석하였다. α-튜불린 및 c-myc 프로브를 고발현된 유전자를 나타내기 위해 사용하였고, 아데노신 아미노기이탈효소 및 토포이소머라제 II(후자 cDNA의 5’및 3’말단에 대해 별개의 프로브를 사용함) 프로브를 즉시 발현된 유전자를 나타내기 위해 사용하였으며, c-fos 프로브를 저발현된 유전자를 나타내기 위해 사용하였다. 고발현된 유전자, 중발현된 유전자 및 저발현된 유전자를 유사한 비율로 함유하는 분획을 라이브러리 제조를 위해 사용하였다.
정규화된 cDNA 제제를 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR)에 함유된 프로모터의 전사 제어하에 발현되는 neo(G418 내성) 유전자를 함유하고, 세포확대바이러스(CMV) 유도된 프로모터로부터 cDNA 삽입물 서열을 발현시키는, MoMLV를 기초로 한 레트로바이러스 벡터 pLNCX의 Clal 위치에 클로닝시켰다[참조: 제2도 및 문헌(Mllle and Rosman, 1989. Biotechniques 7: 980-986)]. pLNCX는 클로닝 부위의 20bp 다운스트림에 있는 모든 세 개의 리딩 프레임중에 번역 종료 코돈을 함유한다. GSE 선택을 위한 대표적 크기의 라이브러리를 생성시키기 위해, 이 연결 혼합물을 5개 부분으로 나누고, 일렉트로포레이션을 위한 통상의 기법과 표준 조건[참조: Sambrook et al., 1992, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]을 사용하여 5회의 개별적 일렉트로포레이션 실험에서 대장균을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환된 박테리아를 총 500개의 아가 플레이트(직경 150mm)에 플레이팅하고, 생성된 플라스미트(총 18mg)를 아가가 세척된 콜로니로부터 단리시켰다. 총 약 5×107개 콜로니가 수득되었으며, 이들 콜로니 중 60％가 넘는 콜로니는, 50개의 무작위 선택된 콜로니의 PCR 증폭에 의해 평가하여 정규화된 cDNA의 삽입물을 함유하였다.
플라스미드 DNA를 하기 실시예 2에 설명되는 바와 같이 적합한 세포의 형질전환된 표현형을 부여할 수 있는 GSE의 생체내 선택을 위해 사용하였다. 상기 설명된 바와 같이 제조된 플라스미드 라이브러리를, 플레이트당 1.5×106개 세포의 밀도로 트랜스펙션 전날에 시딩한(seeded) 에코트로픽(ecotropic) 및 암포트로픽(amphotropic) 패키징 세포(NIH 3T3 세포로부터 유도됨; 참조: Markowitz et al., 1988, Virolygy 167: 400-406)의 1:1 혼합물을 함유하는 20개의 P150 배양 플레이트에 트랜스펙션시킴으로써 레트로바이러스 입자의 혼합물로 전환시켰다. 불규칙 단편 레트로바이러스 라이브러리(RERL) 플라스미드 DNA 15㎍을 P150 플레이트 당 트랜스펙션시켰다. 레트로바이러스 함유 세포 배양액의 상층액을 트랜스펙션시킨 후 3일에 걸쳐 12시간 마다 수거하고, 0.22㎛의 막을 통한 여과에 의해 정제하였다.
[실시예 2]
[마우스 섬유아세포내로의 레트로바이러스 불규칙 단편 라이브러리의 도입]
실시예(1)에 따라 제조되는 정제된 레트로바이러스 함유 상층액을, 포유동물 세포에서 형질전환된 표현형의 3가지 상이한 일면을 검출하기 위해 선택된 각각의 3가지 검정에 사용한다. 형질전환성 GSE를 선택하는 경우 확인가능하고 선택가능한 형질전환 관련된 변화를 겪을 수 있는 적당한 지시제 세포가 사용되어야 한다. 종양성 형질전환과 관련된 표현형 특성을 유도하는 GSE에 대한 3가지 상이한 선택 프로토콜을 사용하였다. 먼저, 노화 세포를 불멸화시킬수 있는 GSE를 선택하기 위해, 마우스 배아 섬유아세포를 지시제 세포 시스템으로서 사용하였다. 나머지 2가지 선택 프로토콜은 종양성 형질전환의 상이한 단계에 특이적인 GSE를 선택하기 위해, 형질전환 관련된 특성이 서로 다른 3가지 상이한 유형의 불멸화된 마우스 섬유아세포를 이용하였다. 이들 세포주 중의 2개는 NIH 3T3 세포의 서브배리언트(subvariant)이고, 세포의 제3 유형은 자발적 형질전환된 MEF 세포로부터 새롭게 형성된 스위스 3T3 세포의 몇몇 집단을 포함한다. 이들 후자 세포는 다양한 GSE의 효과에 대해 상이하게 감수성인 다수의 표현형 변형체를 함유할 것으로 기대되며, 이로써 검출될 수 있는 GSE의 다양한 유형의 수가 증가한다. 각각의 3가지 유형의 불멸화 세포의 몇몇 특징을 표 1에 기재하였다.
[표 1]
a=종양을 갖는 마우스의 수/시험된 마우스의 수
N.T. = 시험되지 않음
A. 마우스 배아 섬유아세포를 불멸화시킬 수 있는 GSE의 선택
노화 세포를 불멸화시키는 능력에 대한 GSE 선택을, 제3(a)도 및 제3(b)도에 도시된 프로토콜을 사용하여, 실시예 1의 RFRL을 포함하는 레트로바이러스 입자로 감염된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 배양액상에서 수행하였다. 1차 MEF 배양액을 통상의 트립신화 과정을 사용하여 11일된 스위스 웹스터(Webster) 마우스 배아로부터 제조하였다. 10％(v/v) 우태아 혈청이 보충된 둘베코스 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 성장시킨 세포를, 3 내지 4일 마다 각각의 계대접종에서 P150 배양 플레이트 당 플레이팅된 2.5×106개의 세포를 스플릿시켰다. 약 5×106개의 세포를, 2차 계대접종 후, 배양액이 노화 및 “분기점”을 거칠 때까지, 저온 보호용 용액에서 -70℃로 동결시킴으로써 보존하였다. 레트로바이러스 감염 실험을 위해, 분기점까지 4회 계대접종 전에 동결된 세포를 동결된 세포를 해동시키고 1×106개 세포/플레이트의 밀도로 10 P150 플레이트상에서 배양하면서 성장시켰다. 해동된 세포를 3일에 걸쳐 12시간 간격으로 RFRL 유도된 레트로바이러스로 감염시키고, MEF를 각각의 수거된 상층액으로 반복 감염시켰다. 각각의 P150 플레이트를 RFRL 유도된 레트로바이러스로 감염시키는 것에서 출발하여 독립적으로 처리하였다. 감염의 효율은 동수의 감염 세포를 G418의 존재 및 부재하에 5일간 플레이팅시킴으로써 평가하였고, 이 기간에서, 상대적 세포 생존성을 MTT 검정을 사용하여 측정하였다[참조: Pauwels et al., 1988, J. Virol. Meth. 20: 309-321]. 이러한 검정으로 수득한 전형적인 감염 효율은 MEF의 약 70％가 RFRL 유도된 레트로바이러스로 감염되었음을 나타내었다.
세포 배양액이 노화 및 분기점을 극복한 후, 각각의 플레이트로부터의 생존 세포를 에코트로픽 패키징 세포와 융합시켜서, 공동 계류중인 1994년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/199,900호에 공지된 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 바이러스를 얻어낸다. 수득한 바이러스 집단의 복잡성을, 클로닝 어댑터의 센스 가닥에 상응하는 올리고누클레오티드를 PCR 프라이머로서 사용하여(제4도에 도시되어 있음), 프로바이러스 삽입물의 PCR 증폭에 의해 평가하였다. RFRL 유도된 레트로바이러스 감염된 MEF 세포로부터의 PCR 생성물은 길이가 200 내지 500bp인 단편의 연속 도말(smear)을 초기에 형성하였다. 세포가 분기점을 거침에 따라, cDNA 삽입물의 복잡성이 감소하고, 개별 밴드가 가시화되었다(제2도).
바이러스를 비교적 낮은 역가(∼104/ml)로 함유하는, 분기점 후의 세포로부터의 수득된 바이러스 제제를 사용하여 분기점 전의 MEF 세포의 새로운 집단을 감염시킨 후, 분기점을 거치게 하였다. 이들 2차 감염된 세포의 효율을 분기점 전 및 후에 G418 선택에 의해 평가하였고; 몇몇 2차 선택실험에 있어서, 감염된 세포의 비율은 분기점 후에 증가하였으며, 이는 GSE 함유 세포에 대한 부화를 나타낸다. 이 제2 라운드 선택에서 살아남은 불멸화된 세포로부터의 세포 DNA 상에서 수행된 PCR 분석은 추정 불멸화를 부여하는 GSE를 함유하는, 몇몇 cDNA 삽입물의 선택을 나타내었다.
이들 삽입물을 pLNCX 레트로바이러스 벡터내에 각각 서브클로닝시키고, 제3(b)도에 도시된 바와 같이 MEF 세포를 불멸화시키는 능력에 대해 시험하였다. 분기점까지 2회 계대접종 전의 MEF를 GSE 함유 바이러스에 의해 감염시킨 후, 저밀도로 플레이팅시킨 후(예를 들어, 3×104개 세포/100m 배양 플레이트), 플레이팅시킨지 2주후에 고정시켜서 염색하였다. 생존 콜로니의 수는 감염된 집단에서의 불멸화된 세포의 비율을 나타낸다.
B.형태학적으로 마우스 섬유아세포를 형질전환시킬 수 있는 GSE 세포의 분리
불멸화된 MEF의 형태학적 형질전환을 유도할 수 있는 GSE를 단리시키기 위해, 서브섹션 A에 설명된 불멸화된 MEF 세포를 사용하였다. 세포를 10 P100 플레이트에 2.5×106개 세포/플레이트의 밀도로 플레이팅시키고, DMEM/10％ FCS 중에서 3주간 유지시켰다. 형태학적으로 형질전환된 세포의 2 내지 20개 병소가 각각의 플레이트에서 나타났다. 2개의 병소를 단리하고, 배양액에서 성장시킴으로써 증식시켰다. 그 후, 이 증식된 병소로부터의 세포를 패키징 세포와 융합시키고, 하이브리드 세포를 G418로 선택하고, 상기에 설명된 바와 같이 레트로바이러스 집단을 수득하는데 사용하였다. 증식된 병소로부터 이렇게 단리된 바이러스를 사용하여 새로운 스위스 3T3 세포를 감염시키고, 감염된 세포를 DMEM/5％ FCS중에 유지시켰다.
불멸화된 MEF 세포의 원래 플에이트 중의 하나로부터 단리시킨, 이들 2개의 병소 각각으로부터 수득된 바이러스는 2회의 별도의 실험에서 스위스 3T3 세포의 형태학적 형질전환을 유도하였다. 형질전환된 스위스 3T3세포의 4개의 독립적 병소로부터 단리시킨 게놈 DNA상에서 수행된, 형질전환성 바이러스에 존재하는 cDNA 삽입물(Tr6-GSE로 일컬어짐)의 PCR 분석결과, 단일의 삽입물 밴드가 나타났다. 이 밴드로부터의 DNA를 pLNCD벡터내로 리클로닝시키고, 누클레오티드 서열을 통상의 기법(참조: Sambrook et al., ibid)을 사용하여 결정하였다. 이 클론은 285bp 삽입물(제5도에 도시되어 있음)을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 이것은 바이오테크놀로지 인포메이션 데이터베이스에 대한 내셔널 센터(National Center)에 존재하는 공지된 핵산 및 단백질 서열과 현저한 상동성을 나타내지 않았다. 리클로닝된 Tr6-GSE 함유 레트로바이러스는 NIH 3T3 세포 및 MEF의 형태학적 형질전환을 유도시키는데 효과적이었다(제6(a)도에) 도시되어 있음). 이 바이러스로 노화 MEF 세포를 감염시키면, 바탕과 비교하여, 불멸화 세포의 수를 현저히 증가시키지 않았다.
그러나, Tr6은 상이한 검정에 의해 MEF 불멸화에 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이 검정에서, 노화으로부터 2회 계대접종된 MEF 세포를, LNCX 또는 Tr6-GSE 함유하는 레트로바이러스 구성물, 또는 53 레트로바이러스와 Tr6-GSE 함유 레트로바이러스의 배합물로 감염시켰다. LNCX 벡터 레트로바이러스로 감염된 MEF 세포는 낮은 바탕의 자발적 불멸화된 세포를 생성시켰다(제6(b)도). 대조적으로, 모든 세포가 감염되는 조건하에 p53 종양 억제 유전자의 온길이 cDNA를 함유하는 재조합 레트로바이러스로 감염된 MEF 세포는 불멸화된 콜로니를 유도하지 못했다. 그러나, 동일한 세포를 동일한 조건하에 Tr6 및 p53을 함유하는 레트로바이러스로 감염시키는 경우, 불멸화된 콜로니가 형성되었다(제6(b)도).
GSE를 NIH 3T3 세포의 형태학적 형질전환을 유도하는 능력에 대해 또한 선택하였다(제7도에 도시되어 있음). 이들 실험에서, RFRL 플라스미드 DNA를 에코트로픽 및 암포트로픽 바이러스 패키징 세포의 1:1 혼합물내로 트랜스펙션시켰다. 레트로바이러스 입자 함유 조직 배양 배지 상층액을, 감염시킨지 24, 48 및 72시간째에 수거하고, NIH 3T3 세포의 반복 감염을 위해 사용하였다. 감염에 사용된 바이러스의 전체량은 107보다 큰 감염 단위로 평가되었다. 수용체 NIH 3T3 세포를, 10개의 P150 플레이트에 1×106개 세포/플레이트의 밀도로 플레이팅시키고, DMEM/10％ FCS 중에서 인규베이션시켰다. 4개의 플레이트를, 패키징 세포를 벡터 플라스미드 pLNCX로 일시적 트랜스펙션시킴으로써 생성시킨, GSE 삽입물을 함유하지 않는 대조 바이러스로 감염시켜서, 이들 세포에서의 자발적(즉, GSE 매개성이 아님) 형질전환율을 평가하였다.
최종 감염시킨 다음날, 감염된 NIH 3T3 세포의 일부를 상기 기술된 바와 같이 동결시키고, 또 다른 일부를 10 P150 배양 플레이트에 2 세포/플레이트의 밀도로 스플릿시키고, DMEM/5％ FCS 중에서 2주간 배양시켰다. 감염의 효율을 G418 선택에 의해 평가하였으며; 전형적으로, 세포의 50％ 이상이 감염된 것으로 나타났다. 명백히 형질전환된 세포의 유사한 수는 실험 및 대조 플레이트 둘 모두에서 관찰되었다(2.5-7.51×106개 병소/세포에 해당하는 5-15 병소/플레이트). 각각의 병소를 취하고, 상기 기술된 바와 같이 증식시키고, 바이러스를, 에코트로픽 패키징 세포와의 융합에 의해 각각의 병소로부터 수득하였다. 새로운 NIH 3T3 세포를 수득한 레트로바이러스로 감염시켰으며, 수득한 바이러스 집단 2/50으로 감염된 세포는, 5％ 혈청에서 훨씬 높은 밀도에 도달하는 것을 포함하여, 변화된 성장 특성을 나타내는 세포 집단을 생성시키는 것으로 나타났다(제8(a)도 및 제8(b)도에 도시되어 있음). 이들 집단으로부터 게놈 DNA를 PCR 분석한 결과, 이렇게 변화된 세포 성장 특성을 유도하는 각각의 2개의 바이러스 집단이 단일의 cDNA 삽입물을 함유하는 것으로 나타났다.
이러한 방식으로 단리된 형질전환성 레트로바이러스에 함유된 2개의 cDNA 삽입물을 시퀀싱하여, NCBI 데이터 베이스에 존재하는 공지된 핵산 및 단백질 서열과의 상동성에 대해 분석하였다. 이 분석에 의해, 형질전환성 바이러스 중의 하나가, 센스 배향으로 클로닝된, 효소 S-아데노실 호모시스테인 히드롤라아제(SAHH)를 코드화하는 cDNA의 코딩 영역의 개시부에 상응하는 285pb 단편을 함유하는 것으로 나타났다(제9 내지 11도에 도시되어 있음). SAHH는, 메티오닌, 시스테인 및 S-아데노실메티오닌 합성을 포함하여 다수의 생화학적 경로에 관여하는 것으로 공지되어 있으며, 여기서, S-아데노실메티오닌은 메틸화 반응에서의 메틸기의 주요 공급원이다. 비정상적 SAHH 발현은, 세포성 DNA 메틸화 패턴의 일반적 변화를 야기할 수 있으며, 다양한 세포 특성을 변화시키는 것으로 공지되어 있다[참조: Wolos et al., 1993, J. Immunol. 150: 3264-3273; Liu et al., 1992, Antivir. Res. 19: 247-265; Duerre et al., 1992, Biochim. Biolog. Cellulaire 70: 703-711]. 이 실험으로부터의 SAHH 유도된 cDNA 삽입물을 본래 프로바이러스에서와 동일한 배향(즉, 센스 배향)으로 pLNCX 벡터내로 리클로닝시키고, 하기 기술되는 바와 같이 추가 시험을 위해 사용하였다.
제2의 형질전환성 바이러스 제제로부터의 삽입물은, 어댑터에 의해 서로 연결되어 있는 2개의 상이한 결합된 cDNA 단편을 함유하는 것으로 나타났다. 이들 단편 중의 하나는 구조 단백질인 필라민을 코드화하는 cDNA로부터 유도되었다. Tr19-GSE로 일컬어지는 나머지 단편의 서열(제12도에 도시되어 있음)은 NCBI 데이터베이스에 있는 공지된 유전자와 현저한 상동성을 나타내지 않았다. 이들 2개의 단편을 추가 시험을 위해 pLNCX 레트로바이러스 벡터내로 각각 리클로닝시켰다.
각각의 리클로닝된 cDNA 단편을 에코트로픽 페키징 세로내로 트랜스펙션시킴으로써 시험하였으며, 생성된 바이러스를 사용하여 NIH 3T3 세포를 감염시키고(각각의 cDNA 삽입물에 대한 형태학적 형질전환 능력에 대해 시험하기 위해) 및 MEF 세포로 감염시켰다(불멸화 및 형태학적 형질전환 능력을 모두 시험하기 위해). NIH 3T3 세포 실험은 매우 가변적인 결과를 나타내었다. 다른 한편으로는, MEF 세포 실험은 더욱 효과적이고, 재현가능하였으며, 이러한 실험의 결과를 제13(a)도 내지 13(c)도에 나타내었다. SAHH cDNA 서열(SAHH-GSE)을 함유하는 바이러스로 감염시키면, MEF 세포의 불멸화 및 형태학적 형질전환 둘 모두가 초래되었다. 필라민 cDNA 단편을 함유하는 바이러스로 감염시키면 MEF 세포에 대한 효과가 없었지만, Tr19-GSE 함유 바이러스는, SAHH-GSE보다 낮은 효율이지만, MEF 세포의 불멸화를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 결과로 인해, 본원에 기재된 방법에 의해 2개의 형질전환성 GSE가 단리되었으며, 이들 중의 하나는 종래에 공지되지 않았고(Tr19), 나머지 하나는 공지되었지만 현재까지 종양성 형질전환에 관련되지 않았던 유전자로부터 유도되었음이 확인되었다.
C.누드 마우스에서의 종양유발성 성장을 가능하게 하는 GSE의 선택
하기 실험을, 면역력이 없는 누드(nu/nu) 마우스에서의 NIH 3T3 세포의 종양유발성 성장을 가능하게 할 수 있는 GSE를 단리시키기 위해 수행하였다. 이들 실험을 위한 개략도를 제14도에 나타내었다. 이 선택을 위해, 상기 기술된 바와 같이 제조된 RFRL 감염된 NIH 3T3 세포를, 누드 마우스(Balb/c 균주)의 옆구리에 5×105개 세포/마우스로 피하 접종시켰다. pLNCX 벡터 유도된 바이러스로 감염시킨 NIH 3T3 세포를 대조표준으로서 사용하였다. 마우스를 접종 후 6주간 종양 형성에 대해 매주 조사하였다. 이들 실험의 결과를 표 2에 요약하였다.
[표 2]
LNCX 유도된 레트로바이러스 보다 RFRL 유도된 레트로바이러스로 감염된 NIH 3T3 세포 중의 종양유발성 변종의 고빈도를 나타내는 이들 결과는, RFRL 유도된 레트로바이러스의 집단 중의 종양유발성 GSE의 존재를 나타낸다. 종양의 직경이 5mm에 이르면, 각각의 종양을 외식시키고, 배양액중에서 안정시켰다. 이들 종양 유도된 배양물 중 3개로부터의 게놈 DNA를 사용하여 수행한 PCR 분석 결과, 상이한 cDNA 삽입물을 함유하는 몇몇 프로바이러스의 존재가 나타났다. 그 후, 바이러스를, 상기 기술된 바와 같이 종양 세포를 에코트로픽 패키징 세포와 융합시키고, 새로운 NIH 3T3 세포를 감염시키고, 종양유발성에 대해 누드 마우스에서 선택함으로써, 이들 종양 세포로부터 수득하였다. 2마리의 마우스를 각각의 형질도입된 세포집단 당 사용하고, 이들 마우스내에 생성된 종양으로부터의 프로바이러스 삽입물을 PCR 분석에 의해 특징화하였다(제15도에 도시되어 있음). 시험된 3개의 집단 중 2개에서, 단일의 삽입물이, 각각 주사된 마우스 둘 모두의 2차 종양에서 부화되는 것으로 발견되었다. 제3의 본래 NIH 3T3 세포 집단으로부터 유도된 바이러스로 감염된 세포가 주입된 마우스의 2차 종양에서, 상이한 삽입물이 검출되었다.
이들 추정 종양유발성 GSE 둘 모두를 누클레오티드 시퀀싱에 의해 특징화하고, 서열을 NIBI 데이터베이스에 존재하는 공지된 핵산 및 단백질 서열과 비교하였다. Rr22-GSE로 일컬어지는 cDNA 삽입물 중의 하나는, 데이터베이스에 있는 서열 중의 어느 하나와 현저한 상동성을 공유하지 않는 것으로 밝혀졌기 때문에, 신규한 유전자의 단편을 나타낸다(이 서열은 제16도에 도시되어 있음). 1bb1-GSE로 일컬어지는 나머지 cDNA 삽입물은, 증식하는 세포의 사람 P120 인 항원의 마우스 상동체의 내부 영역으로부터의 87개 아미노산을 코드화하는 센스 배향된 GSE이다. 이 GSE의 누클레오티드 서열을 제17도에 도시하였고, P120 서열과 GSE 서열 사이의 핵산 및 아미노산 서열 비교를 제18 및 19도에 각각 나타내었다.
1bb1 단편을 pLNCX 벡터내로 리클로닝시키고, 에코트로픽 패키징 세포내로 트랜스펙션시키고, 생성되는 바이러스를 사용하여 스위스 3T3 세포를 감염시켰다. 1bb1 함유 바이러스로 감염시키면, 이들 세포내에 형태학적으로 형질전환된 병소가 생성되었다(제20도). 이들 결과는 P120의 온길이 cDNA가 NIH 3T3 세포내에서 우성 온코진으로서 작용할 수 있다는 최근 발표와 일치한다[참조: Perlaky et al., 1992, Cancer Res. 52: 428-436]. 본원에 기술된 결과는, 1bb1 GSE를 포함하는 P120 cDNA이 일부가 P120단백질의 약 10％를 나타내는 작용성 온코진 도메인을 코드화함을 나타낸다. 이 결과는, 온코진 단백질의 소량이 온코진 작용성임을 최초로 입증한다.
[실시예 3]
[각각의 형질전환성 GSE가 유도되는 유전자의 클로닝 및 분석]
상기 실시예 2에 기술된 결과는, 종양 세포에서의 세포성 형질전환에 관련된 3개의 새로 확인된 유전자의 단리를 설명한다. 이들 3개의 GSE에 상응하는 각각의 유전자를 하기와 같이 단리한다. 각각의 GSE을 혼성화 프로브로서 사용하여, 정상 세포로부터 제조된 마우스 또는 사람 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 적당한 엄격조건하의 이종간 DNA 하이브리드화는, 임의의 포유동물종으로부터의 GSE에 상응하는 유전자를, GSE에 상동인 핵산 프로브 또는 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 단리된 이러한 GSE에 상응하는 유전자를 사용하여 단리시킬 수 있는 것으로 기대된다. 가능하게 할 수 있을 것으로 고려된다. 그 후, 각각의 GSE에 대해 이 방식으로 단리한 최장 cDNA 클론의 누클레오티드 서열을 결정하고, 서열을, 각각의 가닥으로부터 추정 유전자 생성물을 코드화하는 최장 오픈 리딩 프레임(ORF)를 확인하기 위해 분석한다. 그 후, 상기 기술된 서열 상동성 분석을 최장 ORF의 서열상에서 수행하여, 관련 단백질이 종래에 확인되었는지를 결정한다. 그 후, 필요에 따라, 아미노 말단으로부터 아미노산을 코드화하는 임의의 추가 누클레오티드를, 오하라(Ohara) 등의 문헌[1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5763-5677]에 기술된 바와 같이, “앵커링된 PCR” 기법을 사용하여 단리시킨 5’특이적 cDNA로부터 결정한다. 추가의 누락된 3’말단 서열을 이 기법을 사용하여 또한 단리한다. 라이브러리 스크리닝 없이 GSE 서열로부터 직접 출발하여 온길이 cDNA를 단리시키기 위해 “앵커링된 PCR” 기법을, 또한 사용할 수 있다.
상기 설명은 본 발명의 특정 구체예를 강조하며, 이것에 대한 모든 변형 또는 대안적 균등물이 첨부된 특허청구의 범위에 기재된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위내에 속한다는 것을 이해해야 한다.

Claims (17)

  1. 포유동물 세포에서의 형질전환된 표현형의 형성 또는 유지와 관련된 유전 억제 요소(GSE)를 단리시키는 방법으로서,(a) 세포의 전체 mRNA로부터 제조된 불규칙하게 단편화된 cDNA를 합성하여, 세포의 mRNA 집단을 대표하는 다수의 DNA 단편을 생성시키는 단계;(b) 다수의 DNA 단편을 발현 벡터에 이동시켜서 mRNA 집단을 대표하는 유전 억제 요소 라이브러리를 생성시키는 단계로서, 각각의 DNA 단편이 번역 개시 및 종결 코돈에 작동적으로 연결되어 있고, 발현 벡터가 형질전환된 표현형을 발현시킬 수 있는 생존 세포에서 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 단계;(c) 생존 세포를 세포에 유전 억제 요소 라이브러리를 도입시킴으로써 유전적으로 변형시키는 단계;(d) 세포에 형질전환된 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를 함유하는 유전적으로 변형된 생존 세포를, 형질전환된 세포가 확인될 수 있는 조건하에 세포를 선택함으로써 단리시키거나 부화시키는 단계; 및 (e) 형질전환된 표현형을 부여하는 유전 억제 요소를, 살아남은 유전적으로 변형된 세포로부터 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항의 방법에 의해 확인되는 유전 억제 요소로서, GSE가 GSE Tr6(서열번호 3), SAHH(서열번호 6), Tr19(서열번호 4), Tr22(서열번호 5) 및 1bb1(서열번호 10)로 구성된 군으로부터 선택되는 유전 억제 요소.
  3. 제2항에 따른 GSE에 의해 코드화된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  4. 제2항의 GSE 또는 이것의 상보체의 누클레오티드 서열에 상응하는 클로닝된 유전자.
  5. 제4항에 있어서, GSE가 GSE Tr6(서열번호 3), Tr19(서열번호 4) 및 Tr22(서열번호 5)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 클로닝된 유전자.
  6. 제2항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포로서, 제2도에 도시된 레트로바이러스 벡터 pLNCX를 포함하며, GSE가 레트로바이러스 벡터 pLNCX의 Clal 부위내에 클로닝되어 있는 포유동물 세포.
  7. 사람을 제외한 동물내의 악성 종양을 특징화하기 위한 방법으로서,(a) 동물의 암세포로부터 전령 RNA를 포함하는 세포성 RNA를 단리시키는 단계;(b) 동물의 암세포내에서 제4항의 유전자에 상응하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 측정된 mRNA의 발현 수준에 의해, 유전자가 동물의 암세포내에서 과발현되는지 저발현되는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 사람을 제외한 동물내의 악성 종양을 특징화하기 위한 방법으로,(a) 동물의 암세포로부터 세포성 단백질을 단리시키는 단계;(b) 동물의 암세포내에서 제4항의 유전자에 상응하는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계(b)에서 측정된 단백질의 양에 의해, 유전자가 동물의 암세포내에서 과발현되는지 저발현되는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 사람을 제외한 동물내의 악성 종양을 특징화하기 위한 방법으로서, (a) 동물의 암세포내에서 제4항의 유전자에 상응하는 단백질의 특성인 효소 활성의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에서 측정된 효소 활성의 양에 의해, 유전자가 동물의 암세포내에서 과발현되는지 저발현되는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 측정된 유전자의 발현 수준을 정량하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 유전자가 SAHH(서열번호 6), 1bb1(서열번호 10), Tr6(서열번호 3), Tr19(서열번호 4) 및 Tr22(서열번호 5)로 구성된 군으로부터 선택된 GSE의 누클레오티드 서열 또는 이것의 상보체와 상동임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 유전 억제 요소 라이브러리가 정규화된 라이브러리임을 특징으로 하는 방법.
  13. 세포에 형질전환된 표현형을 부여하는 GSE로서, SAHH(서열번호 6), 1bb1(서열번호 10), Tr6(서열번호 3), Tr19(서열번호 4) 및 Tr22(서열번호 5)로 구성된 군으로부터 선택되는 GSE.
  14. 제8항에 있어서, 측정된 유전자의 발현 수준을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 측정된 유전자의 발현 수준을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제8항에 있어서, 유전자가 SAHH(서열번호 6), 1bb1(서열번호 10), Tr6(서열번호 3), Tr19(서열번호 4) 및 Tr22(서열번호 5)로 구성된 군으로부터 선택된 GSE의 누클레오티드 서열 또는 그것의 상보체와 상동임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제9항에 있어서, 유전자가 SAHH(서열번호 6), 1bb1(서열번호 10), Tr6(서열번호 3), Tr19(서열번호 4) 및 Tr22(서열번호 5)로 구성된 군으로부터 선택된 GSE의 누클레오티드 서열 또는 그것의 상보체와 상동임을 특징으로 하는 방법.
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