JPH09508006A

JPH09508006A - キネシンと化学療法薬に対する感受性との関連

Info

Publication number: JPH09508006A
Application number: JP7518581A
Authority: JP
Inventors: グドコフ，アンドレイ; ロニンソン，アイガー・ビー
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 1994-01-05
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 1997-08-19
Also published as: AU1448895A; ZA9544B; WO1995018857A1; NO962828D0; AU689840B2; CA2180426A1; EP0738321A1; NO962828L; KR100249915B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、１種以上の化学療法薬に対する耐性を細胞に与える遺伝的サプレッサー因子、かかる因子を同定および入手するための方法、ならびに、かかる因子を用いる方法を提供するものである。本発明は、また、化学療法薬に対する感受性に関連するクローン化遺伝子、特に、ＤＮＡダメージング剤に対する耐性に関係するクローン化ヒトキネシン重鎖遺伝子を提供するものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】キネシンと化学療法薬に対する感受性との関連発明の背景１．発明の分野本発明は、化学療法薬に対する感受性に関連する遺伝因子に関する。さらに詳しくは、本発明は、かかる因子の同定方法およびかかる因子のための使用に関する。本発明は、特に、哺乳動物キネシン遺伝子から誘導された遺伝的サプレッサー因子、ならびにそれに関係する治療的および診断的使用を提供するものである。２．関連技術の概要ヒトの癌治療において広範囲な種々の化学治療薬が用いられる。例えば、テキストブックであるキャンサー：プリンシプルズ・アンド・プラクティス・オブ・オンコロジー(ＣＡＮＣＥＲ：Ｐrinciples ＆Ｐractice of Ｏncology)、第２版(デ・ビータ（Ｄe Ｖita）ら編)、ジェイ・ビー・リッピンコット・カンパニー(Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃompany)、ペンシルベニア州フラデルフィア（１９８５）には、主要な抗腫瘍剤として、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビンデシンなどの植物アルカロイド；アクチノマイシン−Ｄ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣおよびブレオマイシンなどの抗生物質；メトトレキセート、５−フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シトシンアラビノシド、５−アザ−シチドンおよびヒドロキシ尿素などの代謝拮抗物質；シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ＣＣＮＵ、ＭｅＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾトシン、クロラムブシル、ビスジアミンジクロロ−白金、アゼチジニルベンゾキノンなどのアルキル化剤；ならびにダカルバジン、ｍＡＭＳＡおよびミトザントロンなどの種々雑多な薬物が開示されている。これらの薬物ならびにエトポシドおよびアムサクリンなどの他の薬物は、癌の治療において非常に有用であることが証明された。残念ながら、特定の化学療法薬に対して耐性を有するようになった腫瘍細胞があり、多くの化学療法薬に対しても耐性を有するような場合もある。かかる薬物耐性または多剤耐性は、理論的には、薬物に対する耐性を与える遺伝因子の存在、または、薬物に対する感受性を与える遺伝因子の欠如のいずれかにより生じることができる。前者のタイプの因子は、同定されており、多薬物耐性遺伝子ｍｄｒ−１が挙げられる[チェン（Ｃhen）ら、１９８６、セル（Ｃell）４７：３８１−３８９を参照]。しかしながら、後者のタイプの因子は、おそらく一部分、かかる因子の欠如が劣性形質である傾向にあるので、大部分が知られていない。化学療法薬に対する感受性に関連する遺伝子の発見により、癌細胞および薬物耐性癌に対する診断的および治療的アプローチならびに遺伝子治療および合理的薬物設計における改良を行うことができるので、該遺伝子の同定が望ましい。最近、細胞毒感受性に関係する因子を含む劣性遺伝因子を単離する困難な領域においていくつかの研究が行われた。ロニンソン（Ｒoninson）らのＵ.Ｓ.特許第５, ２１７,８８９号（１９９３年６月８日発行）には、特定の遺伝的サプレッサー因子（ＧＳＥ）が対応する遺伝子の劣性型表現型を与える優性ネガティブ因子である遺伝的サプレッサー因子（ＧＳＥ）を得るための一般化した方法が開示されている[ホルツマイヤー（Ｈolzmayer）ら、１９９２、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒes.）２０：７１１−７１７も参照]。グッドコヴ（Ｇudkov）ら、１９９３、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci., ＵＳＡ）９０：３２３１−３２３５には、トポイソメラーゼII型ｃＤＮＡからのトポイソメラーゼII型−相互作用薬に対する耐性を誘発するＧＳＥの単離が開示されている。１９９３年３月３日に出願された同時係属Ｕ.Ｓ.特許出願第０８／０３３,９８６号には、本発明者による、抗癌性ＤＮＡダメージング剤であるエトポシドに対する耐性を有する細胞のＲＮＡから単離したＧＳＥを同定するために行われた実験の新規かつ予想外の結果の発見が開示されている。この文献には、マウスのキネシン重鎖遺伝子の一部と相同であるアンチセンスＲＮＡをコードするＧＳＥがＧＳＥを発現する細胞にエトポシド耐性を与える能力を有することが開示されている。該文献に開示されている実験は、該文献に開示されている特定のキネシン重鎖遺伝子の過小発現が薬物選択ヒト腺癌細胞の培養物中の天然のエトポシド耐性に関連していたことを示している。これらの結果は、エトポシド耐性におけるキネシン遺伝子の役割が本発明者らの発見よりも前の技術では知られていなかったので、特に予想外であった。キネシンは、真核細胞中の微小管に沿って小胞または巨大分子の細胞内運動に関係する一のファミリーの運動タンパクからなる[ヴェイル(Ｖale)、１９８７、Ａnn.Ｒev.Ｃell Ｂiol.３：３４７−３７８；およびエンドウ(Ｅndow)、１９９１、Trends Biochem.Sci.１６：２２１−２２５を参照]。キネシン遺伝子の該ファミリーには、組み立てて成熟キネシンを形成するキネシン軽鎖およびキネシン重鎖をコードするものがある。多くのキネシン遺伝子が従来の技術で単離されていた。ゲイジャー（Ｇauger）およびゴールドスタイン(Ｇoldstein)、１９９３、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）２６８：１３６５７−１３６６６には、ショウジョウバエ属（Ｄrosophila）のキネシン軽鎖遺伝子のクローニングおよび配列決定が開示されている。ネイヴォン（Ｎavone）ら、１９９２、Ｊ.Ｃell.Ｂiol.１１７：１２６３−１２７５には、ヒトのキネシン重鎖遺伝子のクローニングおよび配列決定が開示されている。カト(Ｋato)、１９９１、Ｊ.Ｎeurosci.２：７０４−７１１には、マウスのキネシン重鎖遺伝子のクローニングおよび配列決定が開示されている。キル（Ｃyr）ら、１９９１、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）８８：１０１１４−１０１１８には、ラットのキネシン軽鎖遺伝子のクローニングおよび配列決定が開示されている。マクドナルド（ＭcＤonald）およびゴールドスタイン(Ｇoldstein)、１９９０、セル（Ｃell）６１：９９１−１０００には、ショウジョウバエ属のキネシン重鎖遺伝子の単離が開示されている。コジック（Ｋosik）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）２６５：３２７８−３２８３には、イカのキネシン重鎖遺伝子の単離が開示されている。本発明者らは、今まで予想されなかった遺伝子であるキネシン重鎖遺伝子が抗癌剤エトポシドに対する細胞感受性に関係すること、および、このキネシン重鎖遺伝子の機能的発現の下方調節がこの薬物に対する耐性に関連していることを示した。本明細書に記載しているさらなる実験は、化学療法薬におけるキネシン遺伝子の役割がキネシン遺伝子ファミリーのこの単一のメンバーに限定されないことを示した。これらの結果は、さらに、癌細胞における薬物耐性の予想外のメカニズムを解明するためにこれらの発明者らによって研究されたＧＳＥテクノロジーの力を強調しており、これにより、癌患者における薬物耐性を克服するための機会および手段が提供される。かかる目的に対する試薬および方法は、この明細書中に記載される。発明の簡単な説明本発明は、化学療法薬に対する感受性に関連する遺伝子から誘導されたランダムフラグメントであり、遺伝的サプレッサー因子（ＧＳＥ）を発現する細胞に化学療法薬およびＤＮＡダメージング剤に対する耐性を与えるＧＳＥを提供するものである。本発明は、詳細には、キネシン遺伝子をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから誘導されたＧＳＥを提供するものである。化学療法薬および他のＤＮＡダメージング剤を含む特定の制癌性治療モダリティー（modality）の適用によって成功裏に軽減または除去されそうな腫瘍に罹っている適当な候補癌患者を判定するのに有用な診断アッセイは、かかる癌患者によって生じた腫瘍細胞におけるキネシン遺伝子発現を基礎として本発明によって提供される。イン・ビトロでの薬物スクリーニングおよび合理的薬物設計方法もまた、本明細書の範囲内である。本発明は、耐性が起こり得る化学療法薬に対する耐性を与えるＧＳＥの同定および単離方法を提供する１９９３年３月３日に出願された同時係属Ｕ.Ｓ.特許出願第０８／０３３,０８６号に開示されている発見に一部基づいている。特に、本発明は、キネシン遺伝子から誘導されたＧＳＥであって、該ＧＳＥを発現する細胞にＤＮＡダメージング剤に対する耐性を与える能力を有するＧＳＥの同定方法を提供するものである。この方法は、キネシン特異的ｃＤＮＡから誘導されたランダムフラグメント発現ライブラリーからのクローンを収容する細胞の化学療法薬選択、および、次なる、薬物耐性細胞からのライブリー挿入物のレスキューを利用する。第２の態様では、本発明は、イン・ビボでＧＳＥとして機能し、ある種の化学療法薬を含むＤＮＡダメージング剤に対するＧＳＥ耐性を発現する細胞に与えるキネシン遺伝子から誘導されるオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチドからなるＧＳＥを提供するものである。第３の態様では、本発明は、化学療法薬に対する感受性に関連するキネシン遺伝子に対する最適化サプレッサー活性を有するＧＳＥを得るための方法を提供するものである。この方法は、化学療法薬に対する感受性に関連するキネシン遺伝子のＤＮＡから誘導されるランダムフラグメント発現ライブラリーからのクローンを収容する細胞の化学療法薬選択、および、次なる、薬物耐性細胞からのライブラリー挿入物のレスキューを利用する。特に好ましくは、マウスまたはヒトのキネシン遺伝子から誘導したかかる最適化ＧＳＥが提供される。第４の態様では、本発明は、ある種の化学療法薬を含むＤＮＡダメージング剤に対する耐性を細胞に与える合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを提供するものである。これらの合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、本発明のマウスまたはヒトのキネシン遺伝子から誘導された薬物耐性を与えるＧＳＥの配列に基づいて設計される。第５の態様では、本発明は、キネシン遺伝子の発現の欠如または過小発現による、１つまたはそれ以上の治療用ＤＮＡダメージング剤に対する耐性を有し、同時に、治療用抗微小管剤に対する感受性を有する腫瘍細胞についての診断アッセイを提供するものである。この診断アッセイは、試験されるべき特定の腫瘍細胞試料における特定のキネシン遺伝子産物の発現のレベルを定量化し、次いで、このようにして得られた発現レベルを、変化する量のキネシン遺伝子ｍＲＮＡおよび／またはタンパクを発現する細胞系であってキネシン遺伝子発現のそれらのレベルに関連する化学療法薬およびＤＮＡダメージング剤に対して種々の程度の耐性を有する細胞系の標準化されたセットと比較することからなる。好ましい具体例では、かかる細胞系の標準化されたセットは、組織タイプによって、評価されるべき腫瘍細胞の組織タイプに合わせられる。第６の態様では、本発明は、特定の癌の化学療法的治療モダリティーについての候補の適正さを判定するための方法を提供するものである。１つの好ましい具体例では、本発明は、本明細書および同時係属Ｕ.Ｓ.特許出願第０８／０３３, ０８６号に開示されているキネシン重鎖遺伝子などのキネシン遺伝子が、本明細書に記載されているように細胞系の標準化されたセットと比較して、癌患者によって生じた腫瘍細胞中で過剰発現されるかまたは過小発現されるかを測定することからなる、癌患者がＤＮＡダメージング化学療法薬または放射線などの他のＤＮＡダメージング剤による治療のために適切な候補であるかを判定するための手段を提供するものである。この方法を用いる場合、ある種の化学療法薬を含むＤＮＡダメージング剤による治療に適切な候補は、腫瘍細胞がキネシン遺伝子を過剰発現する患者であろう。別の具体例では、本発明は、癌患者が抗微小管化学療法薬による治療に適切な候補であるかを判定するための手段を提供するものである。当該方法のこの態様を用いる場合、抗微小管剤治療に適切な候補は、腫瘍細胞が細胞系の標準化されたセットにおける発現レベルと比較してキネシン遺伝子を過小発現する患者であろう。本発明のこの態様の特に有用な具体例では、抗微小管抗癌剤による治療のための有効な候補癌患者は、ＤＮＡダメージング剤を用いる癌の化学治療の経過に対して抵抗力を失うか、または、抵抗力を有することを証明したであろう。第７の態様では、本発明は、化学療法薬に対して耐性を有する腫瘍細胞に対して有用である医薬品の合理的設計のための出発点を提供するものである。ＤＮＡダメージング剤に対する耐性および抗微小管化学療法薬に対する感受性に関連するキネシン遺伝子の構造、機能、局在性および発現のパターンを試験することによって、ストラテジーは、かかるキネシン遺伝子が過剰発現または過小発現される腫瘍細胞における薬物耐性を克服するであろう医薬品を創作するために研究され得る。本発明の特に好ましい具体例は、以下により詳述される好ましい具体例および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明第１Ａ図および第１Ｂ図は、ＮＩＨ３Ｔ３ｃＤＮＡからのランダムフラグメント発現ライブリー（ＲＦＥＬ）の構築のためのスキームを示す。第１Ａ図は、全構築スキームを示す。第１Ｂ図は、ｃＤＮＡフラグメントの規準化を示す。第１Ｂ図において、ｔは、全非画分化ｃＤＮＡを表し、ｓおよびｄは、ヒドロキシアパタイトによって分離された一本鎖および二本鎖フラクションを表し、時点は、再アニーリングの期間を示し、チューブリン、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓは、全ての一本鎖および二本鎖フラクションとのサザンハイブリダイゼーションで用いられたプローブを示す。第２図は、ｃＤＮＡクローニングで用いたＬＮＣＸベクターおよびアダプターの構造を示す。ヌクレオチド配列は、アダプターのＡＴＧ−センス鎖（配列番号１）およびＡＴＧ−アンチセンス鎖（配列番号２）について示される。第３図は、化学療法薬耐性を与えるＧＳＥを含有する細胞系を選択し、これらの細胞からＧＳＥをレスキューするための全スキームを示す。第４Ａ図および第４Ｂ図は、予備選択されたウイルスによって与えられたエトポシド耐性（第４Ａ図）および選択された群および選択されなかった群のＰＣＲ分析（第４Ｂ図）を示す。第４Ｃ図は、オリジナルプラスミドにおけると同一の位置および配向でＬＮＣＸベクター中に個々のＰＣＲ増幅フラグメントを再クローニングするためのスキームを示す。第５Ａ図および第５Ｂ図は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの下で、ＧＳＥ抗− ｋｈｃｓによって細胞に与えられた種々の濃度のエトポシドに対する耐性(第５Ａ図)、およびこの実験のためのスキーム（第５Ｂ図）を示す。第６図は、ＧＳＥ抗−ｋｈｃｓのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。第７図は、マウスｋｈｃｓｃＤＮＡのコード化領域のほとんどのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。第８Ａ図〜第８Ｄ図は、ヒト(第８Ａ図)、マウス(第８Ｂ図)、ショウジョウバエ（第８Ｃ図）およびＧＳＥ−Ｃ（第８Ｄ図）由来のキネシン重鎖配列を有する第７図におけるヌクレオチド配列から導き出されたｋｈｃｓタンパク配列のドットマトリックスアラインメントを示す。第９Ａ図および第９Ｂ図は、キネシン誘導性ＧＳＥの薬物選択産生のための実験プロトコール（第９Ａ図）およびランダムフラグメントＫＨＣＳｃＤＮＡライブラリーの調製のために用いたアダプターの構造（第９Ｂ図）を示す。第１０図は、無挿入物ベクターウイルスまたはヒトＫＨＣＳｃＤＮＡのランダムフラグメントライブラリーを有するＨＴ１０８０細胞におけるエトポシド耐性を示す。第１１図は、無挿入物ベクターウイルスまたは抗−ｋｈｃｓをコードするウイルスに感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞の４日間増殖に対する種々の薬物の効果を示す。薬物の不在下での細胞増殖は、比較群について５％未満異なった。薬物濃度は、ｎｇ／ｍｌで与えられる。３重に行われる並行アッセイの代表的なシリーズが示される。第１２図は、コルヒチンまたはビンブラスチンによる処置後の抗ｋｈｃｓを有する細胞（太線）および対照細胞（破線）の増殖を示す。細胞は、薬物と一緒に４日間、次いで、所定の無薬物培地中で２または４日間インキュベートした。任意の単位で表される細胞増殖は、メチレンブルー染色によって評価した。第１３図は、種々の薬物と一緒にインキュベートした抗−ｋｈｃｓＧＳＥを有する細胞（黒色の線）および対照細胞（灰色の線）の細胞増殖の速度分析を示す。細胞増殖は、第１３図について説明したと同様に測定した。細胞を平板培養し、１日後（最初の矢印で示す）、所定の薬物を所定の濃度で添加した。４日後（第２の矢印で示す）、プレートのいくつかから薬物を除去した。太線は、薬物の連続存在下での細胞増殖を示し、破線は、薬物の除去後の細胞増殖を示す。第１４図は、ＬＮＣＸベクター単独に感染した細胞または非感染（対照）細胞と比較して、抗−ｋｈｃｓＧＳＥを含有するＬＮＣＸベクターによる感染によって主要なマウス胚線維芽細胞の増加した不死化を示す。第１５図は、増殖発症におけるヒト皮膚線維芽細胞（対照）と比較して、感染後、第４継代で抗−ｋｈｃｓＧＳＥ（抗−ｋｈｃｓ）を含有するＬＮＣＸベクターによる感染によって主要なヒト皮膚線維芽細胞の増加した不死化を示す。第１６図は、種々の非選択およびエトポシド選択ヒトＨｅＬａ細胞におけるヒトｋｈｃｓ遺伝子の発現のｃＤＮＡ−ＰＣＲ定量的分析を示す。レーンａは、クローンＣＳ(０)についての結果、レーンａ'は、クローンＣＸ(２００)についての結果、レーンｂは、クローンΣ１１(０)についての結果、レーンｂ'は、クローンΣ１１(１０００)についての結果、レーンｃは、クローン６(０)についての結果、レーンｃ'は、クローン６(１０００)、レーンｄは、クローンΣ２０(０) についての結果、レーンｄ'は、クローンΣ２０(１０００)についての結果を示す。各クローン名について括弧内の数字は、増殖培地中に存在するエトポシドの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。ｋｈｃｓ発現の指摘されたバンドは、内部対照としてβ−２マクログロブリン発現についてのバンドと一緒に示される。好ましい具体例の詳細な説明本発明は、化学療法薬に対する感受性および耐性に関連する特異的遺伝子機能を抑制するための手段に関する。本発明は、遺伝的抑制効果を有し、かくして、化学療法薬を含むＤＮＡダメージング剤に対する耐性を与えるキネシン遺伝子から誘導された遺伝的サプレッサー因子（ＧＳＥ）を提供するものである。本発明は、さらに、かかるＧＳＥの同定方法およびそれらの使用方法を提供するものである。本発明の目的のために、「キネシン遺伝子」なる用語は、いずれのキネシン遺伝子も包含し、特に、哺乳動物、好ましくは、マウスまたはヒトのキネシン遺伝子を包含すると解されるであろう。キネシンは、真核細胞中の微小管に沿った小胞または巨大分子の細胞内運動に関連する多くの関連運動タンパクをコードする関連遺伝子の一ファミリーからなる（発明の背景を参照）。成熟した機能的キネシン分子は、キネシン重鎖遺伝子およびキネシン軽鎖遺伝子の産生物からなる。本発明は、キネシン軽鎖およびキネシン重鎖の両遺伝子から誘導されるＧＳＥを包含する。本発明は、詳細には、全てのキネシン遺伝子およびそれらから誘導された、ＤＮＡダメージング剤に対する耐性または感受性を生じさせる能力を有するＧＳＥをその範囲内に含むものである。本発明の範囲内であるＤＮＡダメージング剤は、限定されるものではなく、イオン化および紫外線照射、ならびにアムサクリン、エトポシド、ドキソルビシン (アドリアマイシン)、シスプラチンおよびカンプトテシンを含むある種の化学療法薬を含む全てのＤＮＡダメージング剤である。第１の態様において、本発明は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の全細胞性ｍＲＮＡから作製された規準化されたランダムフラグメント発現ライブラリーから単離され、トポイソメラーゼII薬物エトポシド（本明細書実施例１〜４、および、１９９３年３月３日に出願された、同時係属Ｕ.Ｓ.特許出願第０８／０３３,０８６号に記載されている）に対する耐性を与えるその能力に基づいて単離されたマウスのキネシン重鎖遺伝子のｃＤＮＡから誘導されたＧＳＥを提供するものである。本発明による当該発見の前には、キネシンが如何なる場合にもエトポシド感受性に関係することは、なんら疑いがなかった。これらの結果は、一般的なＧＳＥ同定方法の、化学療法薬に対する耐性に関する遺伝的基礎についての非常に新しくかつ驚くべき情報を提供する能力を示した。さらに、エトポシドに対する耐性を与えるキネシン誘導ＧＳＥは、キネシンがプログラムされた細胞死に関連することを示す細胞効果を生じた。したがって、本発明のこの態様による方法は、老化および細胞死についての遺伝的基礎についての貴重な情報を提供するものでもある。化学療法薬耐性または老化に関連する遺伝子を同定するために用いたＧＳＥは、胚におけるトランスジーンとして発現されて、成長におけるかかる遺伝子の役割を決定することができるので、これは、成長に関係する遺伝子を研究することについての重要な関係を有する。この薬物耐性関連ＧＳＥに対応するマウスのキネシン重鎖遺伝子の構造の解明は、実施例５に記載しており、このＧＳＥの薬物耐性能の機能的分析は、実施例７に記載している。第２の態様では、本発明は、ＤＮＡダメージング剤に対する耐性を与えるキネシン遺伝子誘導ＧＳＥの同定方法を提供するものである。この方法によって同定されたＧＳＥは、キネシン遺伝子と相同であろう。本発明の目的のために、キネシン遺伝子と「相同」なる用語は、ＧＳＥがアンチセンスメカニズムを介してまたはアンチジーン（antigene）メカニズムを介して（すなわち、タンパクレベルでの妨害メカニズムを介して）作用するかによる２種類の意味を有する。前者の場合、アンチセンスまたは抗原オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであるＧＳＥは、それが、生理学的条件下、遺伝子またはそのフーグスティーン型またはワトソン−クリック型塩基対によるｍＲＮＡ転写産物にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する場合、遺伝子と相同である。後者の場合、タンパク分子を妨害するＧＳＥは、それがタンパクをコードする遺伝子の一部によってコードされると同一のものであるか、または、保存力のあるアミノ酸置換について以外は同一であるアミノ酸配列を有する場合、タンパク分子をコードする遺伝子と相同である。いずれの場合も、実際問題として、ＧＳＥが遺伝子と相同であるかは、ＧＳＥが、本明細書に記載するような、遺伝子、特に、キネシン遺伝子、好ましくは、マウスまたはヒトのキネシン遺伝子の機能を阻害するかまたは低下させる能力を有するかを評価することによって判定される。本発明のこの態様による方法は、キネシン特異的ｃＤＮＡまたはキネシン特異的ゲノムＤＮＡランダムフラグメント発現ライブラリーをスクリーニングして、ある種の化学療法薬のようなＤＮＡダメージング剤に対する耐性を与えるクローンを表現型的に同定する工程からなる。好ましくは、キネシン特異的ｃＤＮＡまたはキネシン特異的ゲノムＤＮＡのランダムフラグメントのライブラリーをレトロウイルス発現ベクター中にクローン化する。この好ましい具体例では、該ライブラリーを含有するレトロウイルス粒子を用いて、細胞に感染させ、該感染細胞を、非感染細胞を殺すＤＮＡダメージング剤のある濃度で生存する能力について試験する。好ましくは、ライブラリー中の挿入物は、約１００ｂ.ｐ.〜約７００ｂ.ｐ.、より好ましくは、約２００ｂ.ｐ.〜約５００ｂ.ｐ.の範囲であろう。ＤＮＡダメージング剤に対する耐性を有する細胞のクローナル群を単離した後、ＧＳＥをコードするライブラリークローンは、該細胞からレスキューされる。この段階で、発現ライブラリーの挿入物のヌクレオチド配列が決定される；キネシン遺伝子特異的ｃＤＮＡランダムフラグメント発現ライブラリーから誘導されるクローンにおいて、ヌクレオチド配列は、キネシン遺伝子ｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部と相同であると思われる。別法としては、レスキューされたライブラリークローンは、ヌクレオチド配列決定前に、さらなるトランスフェクションまたは感染および選択アッセイにおいて、ＤＮＡダメージング剤および化学療法薬に対する耐性を与えるその能力についてさらに試験される。もちろん、ヌクレオチド配列の決定により、ＧＳＥが同定される。この方法は、さらに、実施例６において説明する。かくして、本発明は、最適化されたサプレッサー活性を有するキネシン遺伝子誘導ＧＳＥを得るための方法を提供するものである。キネシン遺伝子特異的フラグメントから独占的に作製されたランダムフラグメント発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、実施例１におけるような全ｃＤＮＡから調製されたランダムフラグメントライブラリーと比較して、キネシン遺伝子から特異的に誘導された非常に多くの種類のＧＳＥを得ることができる。その結果、最適化されたＧＳＥ、すなわち、化学療法薬に対する最適レベルの耐性を与えるこれらのキネシン誘導ＧＳＥを得る見込みは、実施例６においてより詳細に示すように、単一遺伝子ランダムフラグメントライブラリーアプローチを用いて最大にされる。本発明のこの態様のさらなる特徴は、本発明のキネシン誘導ＧＳＥの感染性レトロウイルスエンボディメントを産生する細胞の薬物選択による非常に多くのキネシン特異的ＧＳＥの産生である。この態様では、キネシンｃＤＮＡまたはキネシンゲノムＤＮＡ特異的ランダムフラグメント発現ライブラリーに感染したエコトロピック細胞は、ＤＮＡダメージング剤、好ましくかつ最も実用的には、エトポシドなどの化学療法薬による選択に付される。これにより、各々、薬物耐性を提供するキネシン誘導ＧＳＥを含有する一群の耐性クローンが得られる。これらの細胞は、本発明のＧＳＥの感染レトロウイルスエンボディメントを産生する能力を有するので、薬物耐性を与える能力について予め選択された非常に多くのキネシン誘導ＧＳＥは、容易かつ効率的に産生することができる。第４の態様では、本発明は、化学療法薬に対する感受性に関連するキネシン遺伝子の機能を阻害する能力を有する合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明による合成ペプチドは、本発明によるＧＳＥによってコードされるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。本発明による合成オリゴヌクレオチドは、本発明によるＧＳＥのヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する。ＧＳＥが発見され、配列決定され、その配向が決定されると、（アンチセンス配向ＧＳＥについて）ＧＳＥのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドまたは（センス配向ＧＳＥについて）ＧＳＥによってコードされるアミノ酸配列を調製するのは簡単なことである。ある具体例では、かかる合成ペプチドまたはオリゴヌクレオチドは、各々、ＧＳＥによってコードされる完全な配列を有するか、または、ＧＳＥ中に存在する配列の一部だけを有する。ある他の具体例では、該ペプチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＧＳＥコード化またはＧＳＥ配列の一部だけを有する。かかる後者の具体例では、不適当な実験は、特定の遺伝子に対応する多くの独立ＧＳＥクローンが５'または３'末端（一般的には共にではない）を有するという観察によって回避される。これは、多くのＧＳＥが１つの臨界終点を有しており、これにより、簡単な歩行（walking ）実験が遺伝子機能を阻害するために必要なペプチドまたはオリゴヌクレオチドの最小サイズを決定することを示す。ペプチドについては、６〜８アミノ酸程の小さな機能性ドメインは、イムノグロブリン結合領域について同定された。かくして、ペプチドまたは該ペプチド以上の大きさを有するペプチド模擬体は、ＧＳＥとして製造することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、遺伝子機能の阻害は、生理学的条件下、それらの対応するｍＲＮＡにハイブリダイズするのに充分な長さを有するオリゴヌクレオチドによって媒介され得る。一般的には、約１２以上の塩基を有するオリゴヌクレオチドは、この説明に適するであろう。好ましくは、かかるオリゴヌクレオチドは、約１２〜約１００ヌクレオチドを有するであろう。本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチドなる用語は、ホスホチオアート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミダート、ホスホトリエステル、スルホン、シロキサアート、カーボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバマート、チオエート、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスフェート、ならびに架橋ホスホロチオアート分子間結合を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。これらの修飾結合を含有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野でよく知られている[例えば、ウールマン（Ｕhlmann）およびペイマン(Ｐeyman)、１９９０、ケミカル・リビューズ（Ｃhemical Ｒeviews）９０：５４３−５８４；シュナイダー（Ｓchneid er）およびバナー(Ｂanner)、１９９０、テトラヘドロン・レターズ（Ｔerahedr on Ｌetters）３２：３３５]。該オリゴヌクレオチドなる用語は、修飾塩基または修飾リボースもしくはデオキシリボース糖を有するオリゴヌクレオチドも含む。第５の態様では、本発明は、遺伝子コトランスファー研究に有用な優性な選択性マーカーを提供するものである。本発明によるＧＳＥは、化学療法薬に対する耐性を与えるので、ＧＳＥを発現するベクターの存在は、ＧＳＥの不在下で細胞毒性である適切な細胞毒性薬物のある濃度でのベクタートランスフェクト細胞の増殖によって容易に選択することができる。本発明のＧＳＥは、それらの小さなサイズにより、それらが限定されたパッケージング能を有するウイルスベクター中にでさえコトランスファーされるべき遺伝子と一緒に容易に組み込まれるので、優性な選択性マーカーとして特によく適応される。第６の態様では、本発明は、キネシン遺伝子の発現の欠如または過小発現により、ある種の化学療法薬を含む１つ以上のＤＮＡダメージング剤に対する耐性を有する腫瘍細胞についての診断的アッセイを提供するものである。特に、耐性がキネシン遺伝子の過小発現に関係するＤＮＡダメージング剤のクラスとしては、限定されないが、シスプラチン、エトポシドおよびカンプトテシンが挙げられる。キネシン遺伝子の発現の欠如または過小発現が自然に生じ、かくして、化学療法薬についての医薬的に重要な基礎であるかを判断するために、ヒト腫瘍細胞を適切な化学療法薬の細胞毒性量で処理して、自発的薬物耐性突然変異体について選択することができる。次いで、これらの突然変異体を関心のある特定の遺伝子の発現のレベルについて評価することができる。発現の欠如または有意に低下した発現は、化学療法薬耐性の自然のメカニズムを示す。本明細書に記載するヒトキネシン重鎖遺伝子の過小発現がエトポシド耐性ヒト腺癌（ＨｅＬａ）細胞の培養物における化学療法薬に対する天然の耐性に関連することを説明するかかる実験の説明は、本明細書の実施例１１および１９９３年３月３日に出願された同時係属中のＵ.Ｓ.特許出願第０８／０３３,０８６号に記載されている。このアッセイの好ましい具体例では、薬物耐性のレベルおよびキネシン遺伝子発現が定量化され、お互いに相互関係が示された場合に組織特異的細胞系の標準的なセットは、アッセイされるべき各組織タイプからの腫瘍について提供される。別法として、および好ましくは、天然の治療反応性および非反応性腫瘍組織試料の回収は、キネシン遺伝子の発現レベルについて試験され得、治療結果および、おそらくその薬物耐性メカニズム、およびキネシン遺伝子発現の間の相互関係が確立された。したがって、かかる低下または欠如した発現は、関心のあるＤＮＡダメージング剤または化学療法薬に対する腫瘍細胞耐性についての診断的アッセイについての基礎であり得る。本発明のこの態様による診断的アッセイの最初の具体例は、キネシン遺伝子の配列と相同であるオリゴヌクレオチドを利用する。この具体例では、ＲＮＡは、腫瘍試料から抽出され、特定のキネシン遺伝子に対して特異的なＲＮＡは、標準的なフィルターハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅ保護アッセイまたは定量的ｃＤＮＡ−ＰＣＲによって定量化される[ノーナン（Ｎoonan ）ら、１９９０、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）８７：７１６０−７１６４]。本発明のこの態様による診断的アッセイの第２の具体例では、抗体は、キネシン重鎖またはキネシン軽鎖タンパクの一部と同一であるアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して生じる[ネイヴォン（Ｎavone）らの上記文献を参照]。次いで、これらの抗体を慣用の定量的免疫アッセイ（例えば、ＲＩＡまたは免疫組織化学的アッセイ）において用いて、試験されるべき腫瘍細胞から抽出されたタンパクの試料中に存在するか、または試験されるべき腫瘍細胞の表面または該腫瘍細胞内の位置にある関心のある遺伝子産物の量を測定する。本発明のかかる診断的アッセイについての特定の利用能は、ヒトにおける悪性疾患の緩和のための治療決定を行う際のそれらの臨床的使用である。例えば、腫瘍のかかるキネシン過小発現細胞がかかる薬物に対して耐性を有すると思われるので、本発明のキネシン重鎖遺伝子がこの組織からなる正常な細胞中で見られる発現のレベルと比較して腫瘍中で過小発現されることの決定は、かかる腫瘍に罹っている患者がＤＮＡダメージング剤を用いる治療的介入についての乏しい候補であることを示す。同様に、本発明のキネシン重鎖遺伝子を偶然にも過剰発現する腫瘍細胞は、かかる薬剤に対する感受性を有し、かくして、これらの薬剤による腫瘍細胞死滅に影響されやすいと思われる。他方、本説明は、キネシン重鎖遺伝子過小発現物が、例えば、コルチシン、コルセミド、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデシンを含む抗微小管剤の細胞致死性作用に対する感受性を有するという実験的証拠を提供する。これらの結果は、細胞が本発明のキネシン重鎖遺伝子を過小発現する腫瘍に罹っている患者がＤＮＡダメージング剤による治療に反応することを示す。かくして、本発明は、ＤＮＡダメージング剤および他の化学療法的治療モダリティーに対する個々の癌患者の腫瘍耐性または感受性の性質に基づいて、理性的でありかつ知識のある治療的介入を可能にする。ここで、治療の選択は、ＤＮＡダメージング剤に対して特異的な耐性のメカニズムに基づき、かつ、キネシン重鎖遺伝子過剰または過小発現によって媒介される治療の開始前に行われ得る。腫瘍試料中のキネシン発現レベルの検出のために、ネイヴォン（Ｎavone）ら（上記文献）に開示されている抗キネシン重鎖抗体などのキネシン特異的抗体が本発明のこの態様において特に有用である。第７の態様では、本発明は、化学療法薬に対する腫瘍細胞による耐性を中和することができる医薬品の合理的設計についての出発点を提供するものでもある。薬物感受性に関係するキネシン遺伝子の生化学的機能を理解することは、かかる遺伝子の機能を刺激または模擬し、かくして、抗癌剤に対する細胞毒性反応を増加させるための医薬的手段を示すと思われる。転写のレベルで遺伝子発現を上方調節することもできる。これは、対応するキネシン遺伝子の各々のプロモーター領域をクローニングし、特異的な生物学的刺激物質に対する反応を提供することが知られているｃｉｓ因子の存在についてプロモーター配列を分析することによって行うことができる。真核細胞中のキネシンの、すなわちキネシン重鎖およびキネシン軽鎖の両方のタンパクからなる構造のために、適切なキネシン軽鎖および重鎖の両方のタンパクの発現の同等の上方調節は、キネシン遺伝子の発現を調節することに基づいた効果的な治療的介入のために必要である。別法としては、癌細胞におけるキネシン発現は、キネシン重鎖および軽鎖の機能的な全長コピーをコードする組換え発現構築物の同時導入によって増加させることができる。これにより、かかる外因性キネシンの同等な同時発現が癌細胞における機能的なキネシン分子の増加した発現を生じるであろう。ｃＤＮＡ配列から産生されたタンパク構造は、コンピューターによる薬物設計のために用いられて、既知の抗癌剤と同様の方法でこのタンパクに影響を及ぼす新しい薬物を研究することができる。慣用の発現系で産生された精製タンパクは、抗癌活性を有する新しい化合物についてイン・ビトロ生化学的スクリーン系の臨界的成分として用いられる。したがって、本発明による化学療法薬耐性を与えるＧＳＥを発現する哺乳動物細胞は、薬物耐性を克服する能力について化合物をスクリーニングするために有用である。医薬的介入方法を用いる場合、キネシン軽鎖および重鎖は、共に、イン・ビトロで成熟キネシン分子を再構成することができる量でかかるイン・ビトロスクリーニング系中に存在すべきである。本発明の特に好ましい具体例は、以下にさらに詳細に説明したある好ましい具体例および請求の範囲から明らかにされるであろう。実施例１レトロウイルスベクターにおける正常ランダムフラグメントｃＤＮＡライブラリーの構築正常ｃＤＮＡ集合は、図１Ａおよび１Ｂに示すパタンジャリ(Ｐatanjali)らのプロトコール(プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８８巻：１９４３-1９４７頁(１９９１年))の修飾形を用いて調製した。ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡはＮＩＨ３Ｔ３細胞から抽出した。細胞成長の種々の段階において発現される異なった遺伝子に対するｍＲＮＡを採取するために、ＲＮＡの半分は急速に成長する培養物から単離し、もう半分は完全な単層集合に到達した静止期細胞から単離した。ランダム・プライムド(primed)ｃＤＮＡ集合の５'-末端の過剰発現を回避するために、煮沸によってＲＮＡを６００-１,０００ヌクレオチドの範囲の平均サイズに断片化した。ついで、これらのＲＮＡ断片を用いてランダム・プライムド二本鎖ｃＤＮＡを調製した。３種のすべての可能性のある読み枠で、かつ翻訳を開始させるための適当な前後関係でＡＴＧコドンを供しつつ、このランダム・プライムドｃＤＮＡを合成アダプターに連結した。アダプターの構造(図２参照) は、各断片がその向きから独立して開始コドンから出発するように、ｃＤＮＡの平滑末端化断片へのその連結を決定する。該アダプターには反対の鎖中に終始コドンを供されていなかった。なぜなら、クローニングベクターｐＬＮＣＸが、クローニングサイトのすぐ下流にかかるサイトを含んでいるからである(このベクターは、ミラー(Ｍiller)およびロスマン(Ｒosman)、バイオテクニックス(Ｂiot echniques)第７巻：９８０-９８６頁(１９８９年)によって記載されている)。連結した混合物は、（最初のｃＤＮＡ調製物をファージベクターにクローニングし、ついでベクター由来の配列をＰＣＲプライマーとして用いることを利用してｃＤＮＡ集合を増幅させるパタンジャリ(Ｐatanjali)らの方法に対して）ＰＣＲプライマーとしてアダプターの「センス」鎖を用いたＰＣＲで増幅させた。該ＰＣＲは、特異的配列のランダムオーバー(over-)またはアンダー(under)-増幅を最小限化し、かつ産物の収量を増加させるために、続いて合わせる１２種の別々の反応で行った。該ＰＣＲ-増幅混合物を、ゲル電気泳動によってサイズ-分画し、続く操作のために(４００−１,６００ｂｐの範囲のパタンジャリ(Ｐatanj ali)の断片サイズに対して)２００-５００ｂｐの断片を選抜した。正常化するために、パタンジャリ(Ｐtanjali)ら(前掲)によって記載され、図１Ａに示すごとく、再アニーリングには異なった時点を用いてｃＤＮＡ調製物を変性し再アニーリングさせた。各再アニーリング混合物からの一本鎖および二本鎖ＤＮＡは、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーによって分離した。各再アニーリング時点からの一本鎖ＤＮＡ画分は、アダプター由来のプライマーを用いてＰＣＲ-増幅し、種々のｍＲＮＡの相対量につきサザン・ハイブリダイゼーションによって分析した。各々、高-、中-、および低-発現の遺伝子に対応する(図１Ａおよび１Ｂ参照)、同様な比率のチューブリン、ｃ-ｍｙｃおよびｃ-ｆｏｓｃＤＮＡ配列を含む画分をライブラリーの調製に用いた。正常化ｃＤＮＡ調製物は、レトロウイルス長末端反復(ＬＴＲ)中に含まれるプロモーターから転写されるｎｅｏ(Ｇ４１８耐性)遺伝子を運搬し、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)の強力なプロモーターからインサート配列を発現する、ＭｏＭＬＶをベースとするレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸのＣlaＩサイトにクローン化した(図２参照)。５部に分割した連結混合物を、イー・コリ(Ｅ.coli)の５つの続く大スケール形質転換に用いた。形質転換した細菌を、合計５００枚の寒天平板(直径１５０ｍｍ)に平板して、洗い流した寒天のコロニーからプラスミド集合(合計１８ｍｇ)を単離した。合計約５×１０⁷クローンが得られ、５０個の任意に採取したコロニーからのインサートのＰＣＲ増幅によって概算すると、これらの６０％を超えるものが正常化ｃＤＮＡのインサートを運搬していた。これらの結果は、レトロウイルス・プラスミド発現ベクターにおいて３×１０⁷組換えクローン程度の正常化ｃＤＮＡライブラリーを作製する容易性を示している。実施例２レトロウイルスランダム断片ライブラリーのウイルス-パッケージング細胞系統およびＮＩＨ３Ｔ３細胞への形質導入レトロウイルスのビリオン蛋白質を発現するウイルス-パッケージング細胞(ＮＩＨ３Ｔ３の誘導体)(かかる細胞系統の例はマルコビッツ(Ｍarkowitz)ら、バイロロジー(Ｖirology)第１６７巻：４００-４０６頁(１９８８年)によって記載されている)へのトランスフェクションによって、実施例１に従って調製したプラスミドライブラリーをレトロウイルス粒子の混合物に移入した。各々、エコトロピックおよび両種性ウイルス-パッケージング細胞系統であるＧＰ＋Ｅ８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２を１：１に比にて混合し、標準的なリン酸カルシウム共沈条件下にてこの混合物１０⁷細胞をプラスミドライブラリーでトランスフェクトした。このトランスフェクションによって、パッケージングならびにエコトロピックおよび両種性のウイルスの分泌を生じ、これらはパッケージング細胞集合を介して急速に拡範する。なぜなら、エコトロピックウイルスは両種性パッケージング細胞に感染できるかその逆であるからである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の感染後に得たＧ４１８-耐性コロニー数によって測定したウイルスの収量は、一過性トランスフェクションのステージの間(１−３日)の培地１ｍＬ当たりで１０⁵感染単位に達し、ついで減少(４-８日)し、ついで大部分のパッケージング細胞に安定して組み込まれるようになったプロウイルスゲノムの発現によって急激に増加した。トランスフェクション９-１２日後のウイルスの収量は、培地上清１ｍＬ当たり＞１０⁴に達した。このステージで、該ライブラリーは種々の断片のかなり一様な発現を示したが、後のステージでは個々のウイルス-産生クローンが集合中で優勢となり始め、ｃＤＮＡ-由来インサートの一様でない発現を導いた。レトロウイルス集合における均一な配列の発現は、ウイルス-含有上清で感染した細胞からＤＮＡを迅速に抽出し、つづいてインサートをＰＣＲ増幅することによってモニターした。該インサートは、最初にエチジウム-ブロマイド染色アガロースゲルにおける連続した縞模様の産生によって、ついでトポイソメラーゼII 、ｃ-ｍｙｃおよびチューブリンを含む種々のプローブとのサザン・ハイブリダイゼーションによって分析した。各遺伝子が複数の断片の縞模様によって表される限り、該ライブラリーの発現性は満足いくべきものと考えた。もう１つの実験において、発現性を欠失することなくランダム-断片正常化ｃＤＮＡライブラリーをＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入するために、感染の一過性ステージ(１-３日目)に産生されるウイルスか、または感染１０−１２日後に採取した高力価ウイルスかでＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染した。後者の場合においては、ウイルス懸濁液１００ｍlには１０⁸感染単位を超えるウイルスが含まれる。「一過性」ウイルスの場合においては、ウイルス-産生細胞からの培地５００ｍl( 感染の５つの円形、各々１００ｍlの培地)を用いることによって少なくとも１０⁷ 組換えレトロウイルスでＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させた。これらの結果は、大きく複雑なランダム断片ライブラリーをレトロウイルス形に転換し、その複雑性を欠失することなく非-パッケージング細胞系統にそれをデリバリーする容易性を示している。実施例３化学療法剤エトポシドに対する耐性を付与するＧＳＥの単離エトポシド耐性を付与するＧＳＥの選抜の全体スキームを図３に示す。この選抜は、ＧＳＥの発現によって生じる耐性発現型の細胞はかかるＧＳＥを運搬するウイルス粒子を産生するであろうという予想で、ウイルス-産生パッケージング細胞上で直接行った。両種性およびエコトロピック・パッケージング細胞の混合物を、実施例１に従って調製したＬＮＣＸベクター中のｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトし、そのウイルスを集合を通して９日間拡範させた。Ｇ４１８耐性の小部分の集合の分析により、事実上１００％の細胞がｎｅｏ-含有プロウイルスを運搬していることが示された。ついで、この細胞を３５０ｎｇ/ｍＬエトポシドに１５日間暴し、ついで無薬剤でさらに２週間増殖させた。エトポシド選抜した後の該実験で得られたコロニー数と対照(非感染細胞または無インサートＬＮＣＸウイルスで感染した細胞)で得られたものとの間に差は全く認められなかった。ついで、生存細胞の培地上清に存在するウイルスを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染し、つづいて実質的に同一のプロトコールを用いてエトポシド選抜した。エトポシドで選抜したパッキング細胞によって産生されたライブラリー- 由来ウイルスで感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞が、無インサート-ＬＮＣＸウイルスで感染した対照細胞に比してエトポシド-耐性細胞数でより大きな増加を示すことは、前もって選抜したウイルス集合中に生物学的に活性なＧＳＥが存在することを示している(図４Ａ参照)。エトポシド-選抜ＮＩＨ３Ｔ３細胞で得られたプロウイルス・インサートはＰＣＲによって分析した。この分析(図４Ｂ参照)によって、感染細胞の非選抜集合に比して特異的なフラグメントの豊富さが示された。図４Ｃに示すごとく、個々のＰＣＲ-増幅断片を元のプラスミドと同一の位置および向きでＬＮＣＸベクターに再クローン化した。エトポシド選抜後に増やした合計４２種のプロウイルス・インサートを、かく再クローン化し、レトロウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入した後のエトポシド耐性の上昇を付与する能力について、バッチまたは個別のいずれかで試験した。これらの非-同一クローンがエトポシド耐性を誘導することが判明したことは、それらが生物学的に活性なＧＳＥを含んでいることを示している。これらのＧＳＥを抗-ｋｈｃｓ、ＶＡＰおよびＶＰ９-１１と命名した。抗-ｋｈｃｓと命名したクローンによって誘導されたエトポシド耐性を図５Ａに示す。バイム(Ｂaim)ら(プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８８巻：５０７２-５０７６頁(１９９１年))によって記載されているごとく、エトポシド耐性を誘導する１種の抗-ｋｈｃｓＧＳＥの能力を、イソプロピル β-Ｄ- チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)-誘導性プロモーター/アクチベーター系を用いることによってさらに示した。この系の成分には、複数反復の細菌ｌａｃオペレーターとシスで連結したエンハンサー依存性プロモーター、およびｌａｃレプレッサーおよび哺乳動物転写アクチベーター由来の人工調節蛋白質であるＬＡＰ 265を発現する遺伝子が含まれる。この抗-ｋｈｃｓＧＳＥを、プラスミドｐＸ６.ＣＬＮにクローン化した。このプラスミドには、ｌａｃオペレーターの２１繰り返し配列を補充した無エンハンサーＳＶ４０初期遺伝子プロモーターからのインサートを発現するベイム(Ｂaim)ら、前掲によって用いられた誘導性プロモーター(ティー・シェンク博士(Ｄr.Ｔ.Ｓhenk)寄贈)が含まれる。選抜マーカーを含まない得られたプラスミドを、ｎｅｏ遺伝子を運搬するＬＮＣＸプラスミドと共にＮＩＨ３Ｔ３に同時トランスフェクトした。Ｇ４１８-選抜トランスフェクト細胞の大量集合を、無インサートベクターでトランスフェクトした対照細胞と共に、５ｍＭＩＰＴＧ存在下または不存在下にて、徐々に上昇する濃度のエトポシドに暴した。同時トランスフェクト・プロトコールはＧ４１８-耐性細胞の画分でのみのＧＳＥの組み込みを通常誘導したが、抗-ｋｈｃｓでトランスフェクトしたものはエトポシド耐性の明らかな上昇を生じ、これはＩＰＴＧ依存性であった(図５Ｂ)。実施例４化学療法剤エトポシドに対する耐性を付与するＧＳＥの配列分析実施例３記載のごとくクローン化したＧＳＥ抗-ｋｈｃｓは、標準的なジデオキシ配列決定法によって配列決定し、予想配列を図６に示す。「センス」および「アンチセンス」鎖のヌクレオチド配列、ならびにこれらの各鎖によってコードされる予想ペプチドのアミノ酸配列を、相同性検索用のBLASTネットワークプログラムを用いて、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(Ｎational Ｃenter for Ｂiotechnology Ｉnformation)データベースに存在する核酸および蛋白質配列に対する相同性につき分析した。抗-ｋｈｃｓＧＳＥの「アンチセンス」鎖に対応する配列は、真核生物細胞の微小管に沿ったオルガネラまたは高分子の細胞内移動に関与する微小管運動蛋白質ファミリーの一員であるキネシンの重鎖をコードする幾つかの遺伝子と非常に高い相同性を示した。最も相同性の高いものは、ネーボン(Ｎavone)ら(ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(Ｊ.Ｃell.Ｂiol.)第１１７巻：１２６３−１２７５頁( １９９２年))によって記載されたごとき、ヒトキネシン重鎖(ｋｈｃ)遺伝子とで見出された。したがって、抗-ｋｈｃｓは、本発明者らが(薬剤に対する)感受性または老化に関連するｋｈｃとしてｋｈｃｓと命名したマウスｋｈｃ遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードしている。本発明者らは、哺乳細胞に存在する他のキネシン類とそれを区別するために、キネシン軽鎖とＫＨＣＳ蛋白質との集合によって形成されるキネシン分子をキネシン-Ｓという。これらの結果は、ＧＳＥについての化学療法薬剤選抜によって、新規な遺伝的エレメントの発見に導くことができ、今まで予想できなかった薬剤感受性における遺伝子の役割も明らかにすることができることを示している。実施例５抗-ｋｈｃｓＧＳＥ遺伝子が由来する遺伝子のクローニングおよび分析実施例３で単離した抗-ｋｈｃｓＧＳＥをプローブとして用いて、ラムダｇｔ１０ベクター中の２つのＤＮＡライブラリーの各々から４００,０００クローンをスクリーニングした。これらのライブラリーは、ロー(Ｌau)およびネーサンズ (Ｎathans)(エンボ・ジャーナル(ＥＭＢＯ.Ｊ.)第４巻：３１４５-３１５１頁( １９８５年)およびプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８４巻:１１８２-１１８６頁)によって記載されている異なる期またはＧ₀→Ｇ₁期のいずれかのマウスBALB/c 3T3細胞のＲＮＡ(エル・ロー博士(Ｄr.Ｌ.Ｌau)寄贈) から常法によって調製した。最初のライブラリーのスクリーニングではハイブリダイズしたクローンは全く得られなかったが、２番目のライブラリーからの２種の異なったクローンが抗-ｋｈｃｓ配列を含んでいることが判明した。これらのクローンを精製して配列決定した。配列分析により、本発明者らが、７９６コドンに相当する大方のマウスｋｈｃｓｃＤＮＡを単離したことが示された(全長ヒトＫＨＣｃＤＮＡは９６３アミノ酸をコードする)。この配列を図７に示す:アミノ末端から８４アミノ酸をコードするさらなる２５２ヌクレオチドは、オーハラ (Ｏhara)ら(プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８６巻：５７６３-５６７７頁(１９８９年))によって記載されている「アンカード(anchore d)ＰＣＲ」技術を用いて単離した５'-特異的ｃＤＮＡから決定した。さらなる欠損３'末端配列は、この技術を用いて現在単離している。ヒト(ネーボン(Ｎavone )ら、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(Ｊ.Ｃell.Ｂiol.)第１１７巻 :１２６３- １２７５頁参照)、マウス(カトー(Ｋato)、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(Ｊ.Ｎeurosci)第２巻：７０４-７１１頁(１９９１年)参照)およびドロソフィラ(Ｄrosophila)(マクドナルド(ＭcＤonald)およびゴールドシュタイン(Ｇold stein)、セル(Ｃell)第６１巻：９９１-１０００頁(１９９０年))から以前にクローン化されているＫＨＣ蛋白質とｋｈｃｓ蛋白質の配列決定部分とのドット- マトリックス・アライメント(dot-matrix alignment)を図８Ａ〜８Ｃに;対照としてＧＳＥ-Ｃに対する相同性を図８Ｄに示す。抗-ｋｈｃｓＧＳＥに対応する部分を［］内に示す。ｋｈｃｓ遺伝子がヒト遺伝子に対して最も高い相同性(９７％アミノ酸相同性)を有するということは、ヒトＫＨＣ(ＫＨＣＳ)遺伝子がマウスｋｈｃｓに機能的に同等であることを示している。また、該アライメントは、抗-ｋｈｃｓＧＳＥが種々のキネシンの間で最も高く変異している領域(これらの配列のまわりを［］によって図に示す)に対応することも示している。実施例６ランダム断片ＫＨＣＳｃＤＮＡレトロウイルスライブラリーの作製およびＫＨＣＳ-由来ＧＳＥの単離前記の実施例５に記載するごとく、ネズミｋｈｃｓ遺伝子はネーボン(Ｎavone )ら(ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(Ｊ.Ｃell.Biol.)第１１７巻：１２６３−１２７５頁(１９９２年))によって記載されているヒトＫＨＣ(またはＫＨＣＳ)遺伝子に対して高い相同性を有する。これらの遺伝子の機能同等性は、エトポシド耐性につき選抜したヒト細胞においてＫＨＣＳｍＲＮＡレベルが低下するという知見(実施例８参照)によっても示唆された。ヒトＫＨＣＳ遺伝子がマウスｋｈｃｓの機能同等性を発現するということを決定的に確認するために、ヒトＫＨＣＳｃＤＮＡのいずれのランダム断片もエトポシド-耐性ＧＳＥとして機能し得るか否かを決定した。完全ヒトＫＨＣＳｃＤＮＡ(２．９ｋｂ長：カリフォルニア大学サンフランシスコ分校のアール・ベール博士(Ｄr.Ｒ.Ｖale)寄贈)のランダムＤＮアーゼ-Ｉ生成断片のライブラリーは、以下の修飾を有する図９Ａに説明したプロトコールを用いて、トポイソメラーゼII ｃＤＮＡについて前記したごとく(出典明示して本明細書の一部とみなす、同時継続米国特許出願番号０８/０３３,０８６号の実施例１参照)、実質的に生成した。特には、１個の代わりに２個の合成アダプターをＤＮアーゼＩ-生成cＤＮＡ断片との連結に用いた。３つのＡＴＧコドンを含む一方のアダプターは、ＨindIIIクローニングサイトを運搬している(図９Ｂ)。もう一方のアダプターは３つ全ての読み枠に終始コドンを有し、ＣlaＩクローニングサイトを運搬している(図９Ｂ)。両アダプターの等モル混合物と連結した後に、各々、第一のアダプターおよび第二のアダプターのセンスおよびアンチセンス鎖を用いたＰＣＲによってｃＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をＣlaIおよびＨindIIIで消化し、ｐＬＮＣＸプラスミドの対応するサイトにクローニングした。クローニング戦略のこの修飾により、レトロウイルスベクターにクローニングした後に、ｃＤＮＡインサートの末端で逆反復の形成が回避された。２０,０００個の独立したインサート-運搬クローンのプラスミド・ライブラリーを得、リン酸カルシウム共沈技術を用いてエコトロピック・パッケージング細胞にトランスフェクトした。一過性のトランスフェクト細胞により放出されたウイルスを用いて、ＨＴ1080/ｐＪＥＴ-２ＴＧＨ細胞、クローン２、ネズミエコトロピック受容体を発現するプラスミド(アルブリットン(Ａlbritton)ら、セル(Ｃ ell)第５７巻：６５９-６６６頁(１９８９年))でトランスフェクトし、エコトロピック・レトロウイルスでの感染に感受性なヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞系統 (クリーブランド・クリニック基金(Ｃleveland Ｃlinic Ｆoundation)のジイ・アール・スターク(Ｄr.Ｇ.Ｒ.Stark)博士寄贈)の誘導体を感染させた。感染およびＧ４１８選抜後に、これらの細胞(さらに、ＨＴ１０８０/ＥＲという)を、１００ｍｍプレート当たり１０⁵細胞にて平板し、種々のエトポシド濃度(２００- ５００ｎｇ/ｍＬ)で１２日間培養した。該薬剤を除去した後に、細胞を無薬剤の培地中でさらに７日間増殖させた。この時点で、幾つかのプレートを固定しクリスタルバイオレットで染色して、生存コロニー数を測定した(図１０)。図１０に示すごとく、２５０ｎｇ/ｍＬエトポシドの薬剤濃度において、ＧＳＥ- 含有細胞を含むプレートにおける約１００倍のさらなるコロニーに比して、対照のプレートにおいては数個のコロニーしかなかった。平行した実験において、パッケージング細胞のウイルス-産生混合物を同様なエトポシド選抜に付した。試験したすべての薬剤濃度において、対照細胞集合におけるよりも、ＧＳＥ-運搬細胞におけるエトポシド処理での方がより多くのコロニーが生存していた。これらの結果は、ＫＨＣＳｃＤＮＡのランダム断片のレトロウイルスライブラリーがヒト細胞に薬剤耐性を誘導する数多くのＧＳＥを含むことを示し、ヒトＫＨＣＳが薬剤耐性と関連していることが確認された。これらのＧＳＥの幾つかは、ネズミｋｈｃｓ遺伝子からのオリジナルの単一ＧＳＥである薬剤耐性の選抜マーカーとしてより大きな潜在性があるようである。かかるエトポシド-耐性細胞から単離したウイルスは、キネシン-由来の多重性薬剤耐性を付与するＧＳＥの集合を発現し、この多重性はそれ自体が本発明の一態様であって、本明細書に開示したごとき化学療法剤を含むＤＮＡ損傷剤に対する耐性を付与するのに有用である。実施例７複数コピーの抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬する細胞集合の作製エコトロピックおよび両種性パッケージング細胞の１：１混合物を、標準的なリン酸カルシウム共沈法を用いて、抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬するレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸでトランスフェクトした。２週間後に、Ｇ４１８-耐性ＮＩＨ３Ｔ３コロニーの形成によって測定したところ、ウイルス力価は「ピンポン」感染(ボディン(Ｂodine)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Natl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８７巻：３７３８-３７４２頁(１９９０年)参照)の結果として１ｍＬ当たり＞１０⁴感染単位に達していた。このウイルスを含有する上清を用いて、１２時間間隔で１０回ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させた。対照細胞は、同一の方法によって得た無インサートベクターウイルスで平行して感染させた。Ｇ４１８選抜により、１００％のＮＩＨ３Ｔ３細胞が該ウイルスで感染されるようになったことが示された。感染細胞からのＤＮＡを、ウイルス-特異的プローブを用いたサザンブロット・ハイブリダイゼーションによって分析した。この分析により、感染細胞は、複数コピーの組み込まれたプロウイルスを含むことが示された。新たに得た複数-感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖速度および平板効率の低下によって特徴付けした。しかしながら、数継代後にそれらの増殖指標が対照細胞から区別できなくなったことは、増殖の遅い細胞が集合から排除されたことを示している。このステージで細胞を冷凍し以下に記載する実験に用いた。実施例８複数コピーの抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬するＮＩＨ３Ｔ３細胞の薬剤耐性パターン実施例７に記載した感染細胞集合を、増殖阻害アッセイによって、数種の抗ガン剤に対する耐性につき分析した。このアッセイでは、ウェル当たり１０⁴細胞を１２-ウェルプレートに平板し、徐々に上昇してゆく濃度の種々の薬剤に４日暴した。相対細胞数はメチレンブルー染色アッセイによって測定した(ペリー(Ｐ erry)ら、ミューテーション・リサーチ(Ｍutation Ｒes.)第２７６巻:１８９-１９７頁(１９９２年))。非選抜外来性細胞集合で行った場合のこのアッセイの相対的な無反応性にもかかわらず、抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬するウイルスでの感染はエトポシドおよびアムサクリンの細胞増殖抑制効果に対する耐性の顕著な上昇を誘導し、アドリアマイシン、カンプトセシンおよびシスプラチンに対するより低い程度の上昇を誘導した(図１１)。すべてのこれらの薬剤は、異なる機作によってではあるが、ＤＮＡ損傷を誘導することが知られている。同一のアッセイ条件下にて、コルヒチンまたはアクチノマイシンＤでは耐性の上昇が全く認められなかった(図１１)。抗-ｋｈｃｓにより付与される薬剤耐性の性質をさらに特徴付けするために、前記した短期増殖阻害アッセイにつづいて、種々の薬剤の細胞増殖抑制および細胞毒性効果の両方を測定する長期増殖阻害アッセイを行った。これらのアッセイは、薬剤存在下にて細胞を４日間インキュベートし、つづいて薬剤不存在下にて２または６日間インキュベートして、薬剤-誘導阻害からの回復にしばしば関連するプログラム細胞死させることによって行った(クン(Ｋung)ら、キャンサー・リサーチ(Ｃancer Ｒes.)第５０巻：７３０７-７３１７頁(１９９０年）)。これらのアッセイにより、ＧＳＥ-運搬細胞は、エトポシドおよびアドリアマイシンには耐性であるが、シスプラチン、カンプトセシンまたはアクチノマイシンＤには耐性でないことが示された。さらに、該ＧＳＥ-運搬細胞は、コルヒチンおよびビンブラスチンに過敏感であることが判明し、該過敏感はアッセイの期間が長くなるにつれてより明白になっていく。かくして、図１２に示す実験において、抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬するＮＩＨ３Ｔ３細胞および無ＧＳＥの対照細胞を培養皿当たり２×１０⁴の密度で平板し、種々の濃度のコルヒチンまたはビンブラスチンのいずれかの中で５日間増殖させた。ついで、該細胞を固定して染色し、生存細胞数を測定し、無薬剤における細胞増殖の％として示した。これらの結果は、これらの細胞における抗-ｋｈｃｓＧＳＥの発現がコルヒチンおよびビンブラスチンの両方に対する過敏感を伴うことを明らかに示している。短期および長期薬剤アッセイで得られた結果の間の矛盾をさらに調べるために、２５０ｎｇ/ｍＬエトポシド、２０ｎｇ/ｍＬカンプトセシンおよび４０ｎｇ/ ｍＬコルヒチンで処理する間または処理した後の細胞増殖の動力学の分析を行った。(図１３に示す)これらの実験においては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を対応する薬剤で５日間処理し、ついで薬剤存在下または不存在下のいずれかでさらに６日間インキュベートした。選択した薬剤濃度は増殖阻害を起こしたが、薬剤が連続して存在する細胞死はほとんど検出されなかった。薬剤に暴して１１日後のエトポシド-またはカンプトセシン-処理対照細胞集合の合計細胞数は薬剤に暴して５日後のものよりも少し低かったが、コルヒチン-処理対照細胞集合においては遅い細胞増殖性がまだ検出された。薬剤を５日後に除去する実験においては、３種類すべての薬剤について細胞増殖性が最初に活性化された。薬剤不存在下で増殖させたおよそ２日後に、エトポシドまたはカンプトセシンで処理した細胞数は減少したが、しかしながら、広範な細胞によるものであり、よって薬剤不存在下でインキュベートした細胞集合の最終細胞数は、コルヒチンまたはカンプトセシン存在下で連続して維持した細胞におけるものと事実上同一であった。それに対して、コルヒチンで前処理した細胞は薬剤から除去した後に限定された細胞死しか起こさず、薬剤から除去されて２日後の細胞増殖性に比較的少ない鈍化を生じ、コルヒチン中で連続して維持したものに対して薬剤から除去した集合中の合計細胞数で顕著に上昇した(図１３)。抗-kｈｃｓＧＳＥの発現はこれらの薬剤によって誘導される増殖阻害および回復-関連細胞死に対して種々の効果を有する。エトポシドで処理した細胞において、抗-kｈｃｓは薬剤の増殖阻害効果を連続して暴して５または１１日後に比較的小さな程度で同等に低下させた。くわえて、抗-ｋｈｃｓＧＳＥは、エトポシド阻害から放出された集合における細胞死量を低下させた。結果として、このＧＥＳによって付与されるエトポシド耐性にける上昇は、連続して暴す条件下よりも薬剤から放出された後によりさらに顕著であった(図１３)。カンプトセシンで処理した細胞においては、該ＧＳＥは薬剤の増殖-阻害効果のわずかな低下を生じ、これは暴して５日後により顕著であったが、連続して暴して１１日後には無視できるレベルまで低下した。暴して５日後の増殖性における低下は、薬剤から除去された後の細胞死におけるわずかな低下を伴い、その結果、ＧＳＥはカンプトセシン耐性における顕著な長期の差を全く生じなかった。コルヒチンで処理した集合においては、抗-ｋｈｃｓＧＳＥが該薬剤の増殖阻害効果に対して細胞をより感受性とし：この効果は長期的に暴するに従って上昇し、５日後に該薬剤から放出したか、またはコルヒチン中に連続して維持した集合において同等に明らかであった(図１３)。前記実験の結果は、種々のＤＮＡ損傷剤の細胞増殖性抑制効果を阻害することによって該抗-ｋｈｃｓＧＳＥが作用することを示していた。くわえて、このＧＳＥは、ある種のＤＮＡ損傷剤(エトポシド)で処理した細胞において薬剤から放出された後には起こるが、ある種のもの(カンプトセシン)で処理したものでは起こらないプログラム細胞死の程度を低下させるようである。抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬する細胞がコルヒチンの細胞増殖性抑制効果に対して過敏感になる知見は、潜在的に重要な治療的意義を有する。キネシンのＧＳＥ-媒介阻害を有する細胞において認められた抗-微小管剤コルヒチンに対する過敏感性は、該微小管に沿って種々の構造体を移動し、互いに対する微小管の滑動、ならびに微小管の集合および分解に関与しているかもしれないキネシンの実質的な機能に関連する機械的作用のようである。抗-微小管剤に対する細胞の感受性に対する抗-ｋｈｃｓＧＳＥの顕著な効果は、このＧＳＥが細胞における一般的なキネシン機能に影響し、キネシンの特定の薬剤-応答性-特異的イソ型に限られないことも示している。本発明者らはＫＨＣＳ遺伝子のダウン-レギュレーションがヒト腫瘍細胞における薬剤耐性の自然機構を表していることを示したため(実施例１１参照)、コルヒチンに対する過敏感性はヒトガンにおけるこの型の耐性を克服するアプローチを提供する。実施例９抗-キネシンＧＳＥの細胞効果の評価第一代マウス胚繊維芽細胞(ＭＥＦ)の寿命延命能につき、抗-ｋｈｃｓＧＳＥを運搬するウイルスを試験した。ＭＥＦは、標準的なトリプシン処理法によって１０日齢マウス胚から調製し、老齢細胞は危機(crisis)の前に種々の継代にて冷凍した。危機の２週間前に、老齢ＭＥＦをインサートを有しない、または抗-ｋｈｃｓを有するＬＮＣＸベクターを運搬する組換えレトロウイルスで感染した。図１４は、危機２週間後のＭＥＦ細胞コロニーを示している。非感染ＭＥＦまたは対照ＬＮＣＸウイルスで感染した細胞に比して、抗-ｋｈｃｓで感染した細胞は危機を生存する細胞の集合における大きな上昇を示した。抗-ｋｈｃｓウイルスで感染した危機後細胞は、新生生物トランスフォーメーションの顕微鏡的に見える特徴を全く示さなかった。これらの結果は、抗-ｋｈｃｓが正常な老齢繊維芽細胞の不死化を促進することを示している。これらの結果は、キネシン-Ｓの正常な機能がある種の細胞毒性剤に暴した後または細胞老化の過程で起こるプログラム細胞死の誘導と関連し得ることを示している。また、これらの結果は、化学療法剤に対する耐性を付与するＧＳＥの単離によって、細胞増殖調節に関与する細胞遺伝子およびプロセスへの洞察を提供できる。実施例１０マウス抗-ｋｈｃｓＧＳＥのヒト老齢繊維芽細胞に対する生物学的効果第一代マウス胚繊維芽細胞の不死化を促進する実施例４に記載した抗-khcs ＧＳＥの能力(実施例９で示した)は、キネシン-Ｓが正常なマウス繊維芽細胞の不死化を阻害することによって腫瘍サプレッサーとして作用し得ることを示唆した。この遺伝子がヒト細胞においても同一の役割を演じ得るか否かを確認するために、第一代ヒト繊維芽細胞の寿命に影響する抗-ｋｈｃｓＧＳＥの能力を調べた。ヒト皮膚由来の第一代ヒト繊維芽細胞は、ナショナル・インスティチュート・オブ・エイジング(Ｎational Ｉnstitute of Ａging)のエイジング・セル・レポジトリー(Ａging Ｃell Ｒepository)から得た。培養における通常のヒト皮膚繊維芽細胞増殖の補充に通常用いるアミノ酸およびビタミン濃度の２倍を補充した２０％子ウシ血清を入れたＤＭＥＭ中で細胞を増殖した。第五継代の細胞を、( 実施例３に前記したごとく作製した)対照ｐＬＮＣＸウイルスまたはマウス抗-kh cs ＧＳＥを運搬するウイルスで感染させた。４継代後に、該対照細胞は危機を起こしたが、ＧＳＥ-運搬細胞は増殖し続け(図１５)、少なくともさらに５継代現在まで生存している。これらの結果は、本発明の抗-ｋｈｃｓＧＳＥが第一代ヒト繊維芽細胞の寿命も延命することができることを示しており、ＫＨＣＳがヒト細胞における潜在的な腫瘍サプレッサーであることを示している。実施例１１薬剤耐性の自然に起こる機作におけるｋｈｃｓ遺伝子発現の低下の役割の評価ｋｈｃｓ遺伝子発現の低下が薬剤耐性のいずれかの自然に起こる機作と関連するのか否かを試験するために、ｃＤＮＡ-ＰＣＲによってｋｈｃｓｍＲＮＡレベルを測定するアッセイを開発した。このアッセイは、ｍｄｒ−１遺伝子発現を測定するためにノーナン(Ｎoonan)らによって記載された(プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８７巻：７１６０−７１６４頁(１９９０年))定量アッセイの修飾形である。該オリゴヌクレオチド・プライマーは配列：ＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＣＴＡ(配列番号：５)およびＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ(配列番号：６)を有する。これらのプライマーを用いて、抗-ｋｈｃｓＧＳＥに対応する３２７ｂｐセグメントのマウスｋｈｃｓｃＤＮＡを増幅した。これらのプライマーがマウスｃＤＮＡ鋳型を効率的に増幅するがゲノムＤＮＡは増幅しないことは、それらがゲノムＤＮＡ中の少なくとも１個のイントロンにまたがることを示している。これらのプライマーを用いて、本発明者らは、ｋｈｃｓｍＲＮＡがマウスの腎臓、肝臓または脾臓よりも筋肉組織において高レベルで発現していることを確認した。もう１つの実験において、ネーボン(Ｎavone)ら(ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(Ｊ.Ｃell.Ｂiol.)第１１７巻：１２６３-１２７５頁(１９９２年))によって公開されている報告されたヒトＫＨＣ配列に基づいて、ヒトＫＨＣＳｃＤＮＡの相同性セグメントを増幅する一対のプライマーを選抜した。これらのプライマーの配列は：ＡＧＴＧＧＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣ(配列番号：７)およびＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＡＴＧ(配列番号：８)であり、それらは、３２７ｂｐのｃＤＮＡ断片を増幅する。これらのプライマーを用いて、同時に獲得されたエトポシド耐性について各々選抜した幾種類かの独立して単離されたヒトＨｅＬａ細胞の集合におけるＫＨＣＳ遺伝子発現の変化につき試験した；β₂-ミクログロブリンｃＤＮＡ配列を内部対照として増幅した。図１６は、以下の集合におけるｃＤＮＡ-ＰＣＲアッセイの結果を示している：ＣＸ(０ )、ＬＮＣＶベクターウイルスで感染しＧ４１８で選抜したＨｅＬａ集合；ＣＸ( ２００)、２００ｎｇ/ｍlエトポシドに対する耐性について選抜した同細胞；Σ １１(Ｏ)、６(Ｏ)、およびΣ２１(Ｏ)、(出典明示して本明細書の一部とみなす) 同時継続米国特許出願番号０８/０３３,０８６号の実施例１に記載のごとく、トポイソメラーゼα ｃＤＮＡ由来の種々のＧＳＥを運搬する組換えレトロウイルスでＨｅＬａ細胞を感染し、Ｇ４１８で選抜した後に得た集合；Σ１１(１０００) 、６(１０００)およびΣ２１(１０００)、１μｇ/ｍlエポトシドに対する耐性について選抜した同集合。図１６に示すごとく、ｋｈｃｓ遺伝子に特異的なＰＣＲ産物の収量は、対照細胞におけるよりも各エトポシド-選抜集合における方が顕著に低かった。この結果は、ｋｈｃｓ遺伝子発現の低下は薬剤耐性についての普通の自然機構であることを示している。実施例１２診断アッセイ前記実施例に示した結果は、エトポシドのごときある種の化学療法剤に対する耐性レベルと関連するよく特徴付けられたキネシン重鎖遺伝子発現レベルを有するイン・ビトロ(in vitro)の正常化セットの細胞系統に関連する、ガン患者の腫瘍細胞におけるキネシン遺伝子の発現レベルを測定する診断アッセイの有用性を示唆している。かかる正常化セットの細胞系統の１種は実施例１１に記載したＨｅＬａ細胞系統よりなる。別法として、例えば、慢性骨髄性白血病を患った患者を評価するためのヒトＫ５６２細胞、または急性前骨髄球性白血病を患者のためのヒトＨＬ６０細胞を用いて評価すべき各細胞型の薬剤選抜耐性によって、種々の、細胞系統の組織-特異的正常セット細胞系統を開発した。キネシン用のアッセイによって、ある種の抗ガン治療様式を有するヒトガン患者の治療の適性が評価されるであろう。キネシンを低レベルで発現する(under-e xpress)腫瘍細胞を有する患者は、放射線照射ならびに化学療法剤エトポシド、カンプトセシン、シスプラシンおよびアドリアマイシンを包含するＤＮＡ損傷剤での治療に対しては難治性であり得る。しかしながら、かかる患者は、コルヒチン、コルセミド、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンデシンのごとき抗 -微小管剤での処理に特に応答性であり得る。反対に、キネシンを過剰発現する腫瘍細胞を有する患者は、例えば、ＤＮＡ損傷剤での治療に対して応答性であり得、抗-微小管剤での治療に対して難治性であり得る。これらのアッセイにより、治療様式が試行され失敗した後よりむしろ、その事実の前にかかる治療を判断する基礎が初めて提供される。また、該アッセイは、ＤＮＡ損傷剤および抗-微小管剤の両方に交差耐性となることが期待される薬剤耐性の他の機作からキネシン遺伝子媒介薬剤耐性を区別することによって、以前にＤＮＡ損傷剤、特にある種の抗ガン剤での治療に対して難治性であって、抗-微小管剤を用いるさらなる化学療法から恩恵を受けるであろう患者を特定する基礎も提供する。前記の開示が本発明のある特定の具体例のみを強調しているものであって、それらと同等なすべての修飾形または別法も、添付した請求の範囲に記載されている本発明の趣旨および範囲の中にあることは理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 Ａ // Ｇ０１Ｎ 33/574 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）キネシン遺伝子をコードするｃＤＮＡの１組のランダムフラグメントを生じさせ；（ｂ）該ＤＮＡフラグメントを発現ベクターにトランスファーさせて、ライブラリーを得（ここで、該発現ベクターは、生細胞中でＤＮＡフラグメントを発現させる能力を有する）；（ｃ）工程（ｂ）のランダムフラグメントライブラリーを生細胞中に導入することによって、生細胞を遺伝学的に修飾し；（ｄ）ＤＮＡダメージング剤の存在下、細胞を選択することによって、キネシン誘導遺伝的サプレッサー因子を含有する遺伝学的に修飾された生細胞を単離または富化させ；（ｅ）遺伝学的に修飾された細胞から遺伝的サプレッサー因子を得ることからなることを特徴とする、１種以上のＤＮＡダメージング剤に対する耐性を細胞に与えるキネシン遺伝子から誘導される遺伝的サプレッサー因子の同定方法。２．請求項１記載の方法によって同定された遺伝的サプレッサー因子。３．ヒトまたはマウスｋｈｃs遺伝子の一部と相同であるヌクレオチド配列を有する請求項２記載の遺伝的サプレッサー因子。４．請求項２記載のＧＳ日を発現する哺乳動物細胞。５．請求項３記載のＧＳＥを発現する哺動物細胞。６．遺伝的サプレッサー因子がセンス配向される請求項１記載の方法。７．遺伝的サプレッサー因子がアンチセンス配向される請求項１記載の方法。８．請求項６記載の方法により産生されたＧＳＥによってコードされるアミノ酸配列の約６アミノ酸から全部までに対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。９．請求項７によって産生されるＧＳＥによってコードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列の約１２ヌクレオチドから全部までのヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチド。１０．（ａ）動物由来の腫瘍または悪性細胞から、メッセンジャーＲＮＡからなる細胞性ＲＮＡを単離し；（ｂ）動物における腫瘍または悪性細胞中でキネシンｍＲＮＡの発現のレベルを測定し；（ｃ）腫瘍または悪性細胞中のキネシンｍＲＮＡの発現のレベルが、キネシン遺伝子が動物における腫瘍または悪性細胞中で過剰発現または過小発現されることを示すかを判定することからなることを特徴とする診断アッセイ。１１．（ａ）動物由来の腫瘍または悪性細胞から、細胞性タンパクを単離し；（ｂ）動物における腫瘍または悪性細胞中でキネシンタンパクの量を測定し；（ｃ）腫瘍または悪性細胞におけるキネシンタンパクの量が、キネシン遺伝子が動物における腫瘍または悪性細胞中で過剰発現または過小発現されることを示すかを判定することからなることを特徴とする診断アッセイ。１２．請求項１０または１１記載のアッセイを用いて判断した場合に腫瘍または悪性細胞がキネシン遺伝子を過剰発現する場合、動物にＤＮＡダメージング剤である抗癌剤を投与することからなることを特徴とする、動物の身体中に悪性腫瘍または悪性細胞を有する動物の治療方法。１３．請求項１０または１１記載のアッセイを用いて判断した場合に腫瘍または悪性細胞がキネシン遺伝子を過剰発現する場合、動物に抗微小管剤である抗癌剤を投与することからなることを特徴とする、動物の身体中に悪性腫瘍または悪性細胞を有する動物の治療方法。１４．請求項１０または１１記載のアッセイを用いて判断した場合に腫瘍または悪性細胞がキネシン遺伝子を過剰発現する場合、予めＤＮＡダメージング剤である抗癌剤での治療が不成功に終わった動物に抗微小管剤である抗癌剤を投与することからなることを特徴とする、動物の身体中に悪性腫瘍また悪性細胞を有する動物の治療方法。１５．（ａ）キネシン遺伝子をコードするｃＤＮＡの１組のランダムフラグメントを生じさせ；（ｂ）該ＤＮＡフラグメントをレトロウイルス発現ベクターにトランスファーさせて、レトロウイルスランダムフラグメント発現ライブリーを得（ここで、該レトロウイルス発現ベクターは、生細胞中でＤＮＡフラグメントを発現させる能力を有する）；（ｃ）工程（ｂ）のレトロウイルスランダムフラグメント発現ライブラリーを培養物の生細胞中に導入することによって、生細胞の培養物を遺伝学的に修飾し（ここで、培養物の生細胞は、ライブラリーからなるレトロウイルス発現ベクターの各々を増殖させる能力を有する）；（ｄ）ＤＮＡダメージング剤の存在下、細胞を選択することによって、キネシン誘導遺伝的サプレッサー因子を含有する遺伝学的に修飾された生細胞を単離または富化させ；（ｅ）工程（ｄ）の薬物耐性の遺伝学的に修飾された細胞により、レトロウイルスランダムフラグメント発現ライブラリーのキネシン誘導遺伝的サプレッサー因子を増殖させて、種々のキネシン誘導遺伝的サプレッサー因子からなる増幅されたランダムフラグメント発現ライブラリーを形成することからなることを特徴とする、１種以上のＤＮＡダメージング剤に対する耐性を細胞に与えるキネシン遺伝子から誘導される種々の遺伝的サプレッサー因子の同定方法。１６．請求項１５記載の方法によって最初に同定された遺伝的サプレッサー因子。１７．ヒトまたはマウスｋｈｃｓ遺伝子の一部と相同であるヌクレオチド配列を有する請求項１６記載の遺伝的サプレッサー因子。１８．請求項１６記載のＧＳＥを発現する哺乳動物細胞。１９．請求項１７記載のＧＳＥを発現する哺乳動物細胞。２０．遺伝的サプレッサー因子がセンス配向される請求項１５記載の方法。２１．遺伝的サプレッサー因子がアンチセンス配向される請求項１５記載の方法。２２．請求項２１記載の方法により産生されたＧＳＥによってコードされるアミノ酸配列の約６アミノ酸から全部までに対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。２３．請求項２２記載の方法により産生されたＧＳＥによってコードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列の約１２ヌクレオチドから全部までのヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチド。