JP2011172588A - Ｄｐ７５をコードするｄｎａおよびその使用のためのプロセス - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＰ７５をコードするＤＮＡおよびポリペプチドの提供。
【解決手段】特定の配列またはその相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列またはそのフラグメントを含有する、単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド。他のヒトタンパク質から精製されたＤＰ−７５ポリペプチドであって、上記単離ポリペプチドは、特定の配列、またはそれらのフラグメントと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列を含有する、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡ配列および対応するタンパク質に関する。

（発明の背景）
ＧＴＰ結合タンパク質ファミリーおよび関連タンパク質が、過増殖細胞の腫瘍原性に関連している。これらのタンパク質は、ｄｂｌ、ｅｃｔ２、ｌｂｃ、ｏｓｔ、およびＴＩＭを包含する。それぞれに、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照のこと。さらに、このファミリーには、Ｔｉａｍ−１タンパク質が包含される。このタンパク質は、細胞の侵入可能性を調節することが示されている。非特許文献６；非特許文献７、および非特許文献８を参照のこと。Ｔｉａｍ−１はまた、ＧＤＰ解離刺激物質（ＧＤＳ）のファミリーのメンバーとして同定された。これらのタンパク質は、Ｒｈｏ様およびＲａｃ様ＧＴＰａｓｅを活性化する。

Ｒｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９８８）７：２４６５−２４７３ Ｍｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６２：４６２−４６５ Ｔｏｋｓｏｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９４）９（２）：６４１−６２８ Ｈｏｒｉｉら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９９４）１３（２０）：４７７６−４７８６ Ｃｈａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９４）９（４）：１０５７−１０６３ Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ（１９９４）７７：５３７−５４９ Ｈａｂｅｔｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９５）１０（７）：１３７１−１３７６ Ｇａｓｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７５：３３８−３４０

（要旨）
本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号６のＤＰ−７５配列またはそのフラグメントにハイブリダイズする、新規核酸配列である。さらに、本発明は、診断アッセイ、発現ベクター、制御配列、アンチセンス分子、リボザイム、およびその核酸配列にコードされるポリペプチドを発現するための宿主細胞を包含する。本発明はまた、核酸配列にコードされるポリペプチド配列の請求項を包含する。

本発明はまた、ＤＰ−７５中の領域に相補的である、少なくとも１５マーから４０マーアンチセンスオリゴヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物に関する。本発明はまた、ＤＰ−７５を阻害し得る分子を使用して、ガン細胞増殖を抑制することによる、ガンを治療するための方法に関し、一例は、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドの増殖抑制量を投与することによる。

・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・項目１．他のヒトタンパク質から精製されたＤＰ−７５ポリペプチドであって、上記単離ポリペプチドは、配列番号６、配列番号１、またはそれらのフラグメントと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列を含有する、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
・項目２．上記ＤＰ−７５ポリペプチドが、ネイティブヒトＤＰ−７５である、項目１に記載のＤＰ−７５ポリペプチド。
・項目３．上記ポリペプチドが、上記ネイティブヒトＤＰ−７５の変異体、フラグメント、または融合体であり、そして上記ポリペプチドが、ＤＰ−７５の免疫学的エピトープを示す、項目１に記載のＤＰ−７５ポリペプチド。
・項目４．上記ポリペプチドが、上記ネイティブヒトＤＰ−７５の変異体、フラグメント、または融合体であり、上記ポリペプチドが、上記ネイティブヒトＤＰ−７５の少なくとも２０％の生物学的活性を示す、項目１に記載のＤＰ−７５ポリペプチド。
・項目５．上記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９８％の相同性を示す、項目４に記載のポリペプチド。
・項目６．上記アミノ酸配列が、配列番号２由来の任意の８つの連続するアミノ酸である、項目４に記載のポリペプチド。
・項目７．さらに、薬学的に受容可能なキャリアを含有する、項目４に記載のＤＰ−７５ポリペプチド。
・項目８．ＤＰ−７５ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体であって、上記ＤＰ−７５ポリペプチドは、配列番号６、配列番号１、またはそれらのフラグメントと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列を含有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する、単離抗体。
・項目９．上記抗体が、配列番号７またはそのフラグメントに少なくとも９８％の相同性を示す、ＤＰ−７５ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、項目８に記載の単離抗体。
・項目１０．配列番号６またはその相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列またはそのフラグメントを含有する、単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド。
・項目１１．１５塩基対と４０塩基対との間の長さの、配列番号６または配列番号１の配列のフラグメントを含有する、項目１０に記載の単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド。
・項目１２．上記核酸配列が、配列番号６または配列番号１に少なくとも９８％の相同性を示す、項目１０に記載の単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド。
・項目１３．上記核酸配列が、配列番号６または配列番号１に少なくとも９９％の相同性を示す、項目１０に記載の単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド。
・項目１４．以下の５’から３’の一本鎖核酸配列を含有する、項目１３に記載の単離ＤＰ−７５ポリヌクレオチド：

・項目１５．（１）制御配列、および（２）ストリンジェントな条件下で配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る、ＤＰ−７５ポリヌクレオチドを含有する単離発現ベクターであって、上記制御配列は、上記ＤＰ−７５ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、上記発現ベクターは、配列番号６または配列番号１にハイブリダイズし得ない配列を含有するベクターから精製される、単離発現ベクター。
・項目１６．以下の（ａ）および（ｂ）を含有する発現ベクターを含有する、宿主細胞：
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る、ＤＰ−７５ポリヌクレオチド；
（ｂ）上記ＤＰ−７５ポリペプチドと異種である制御配列であって、上記制御配列が、上記ＤＰ−７５ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、制御配列。
・項目１７．以下の（ａ）および（ｂ）を含有する発現ベクターを含有する、宿主細胞：
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る、ＤＰ−７５ポリヌクレオチド；
（ｂ）上記宿主細胞と異種である制御配列であって、上記制御配列が、上記ＤＰ−７５ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、制御配列。
・項目１８．上記細胞が、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、項目１６に記載の宿主細胞。
・項目１９．上記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、サル腎細胞、ヒト肝ガン細胞、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉからなる群より選択される、項目１８に記載の宿主細胞。
・項目２０．以下の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する、ＤＰ−７５ポリペプチドを産生するための方法：
（ａ）（ｉ）宿主細胞内で作動可能な制御配列、および（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントとハイブリダイズし得るＤＰ−７５ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する工程であって、上記制御配列が上記ＤＰ−７５ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている工程；および、
（ｂ）上記核酸配列の発現を誘導する条件下で、上記宿主細胞を培養する工程。
・項目２１．上記ポリヌクレオチドが、ヒトＤＰ−７５のｍＲＮＡにハイブリダイズし得る、項目１０に記載の単離ポリヌクレオチド。
・項目２２．上記ポリヌクレオチドが、１０塩基と５０塩基との間の長さである、項目２１に記載の単離ポリヌクレオチド。
・項目２３．上記ポリヌクレオチドが、１５塩基と４０塩基との間の長さである、項目２２に記載の単離ポリヌクレオチド。
・項目２４．上記ポリヌクレオチドが、２０塩基と３０塩基との間の長さである、項目２３に記載の単離ポリヌクレオチド。
・項目２５．（ｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る配列を含有するアンチセンスポリヌクレオチドであって、上記ポリヌクレオチドが、ネイティブヒトＤＰ−７５のｍＲＮＡにハイブリダイズし得る、アンチセンスポリヌクレオチド；および、（ｉｉ）上記アンチセンスポリヌクレオチドの転写を開始し得る配列を含有する、ポリヌクレオチドを含有する、アンチセンスベクター。
・項目２６．上記転写を開始するための配列が、レトロウイルス、アデノウイルス、
またはアデノ随伴ウイルス由来である、項目２５に記載のアンチセンスベクター。
・項目２７．さらに、複製起点を含有する、項目２５に記載のアンチセンスベクター。
・項目２８．さらに、ベクターのゲノムへの組み込みを促進し得るポリヌクレオチドを含有する、項目２５に記載のアンチセンスベクター。
・項目２９．ストリンジェントな条件下で、配列番号６、配列番号１、またはそれらのフラグメントにハイブリダイズし得る配列を含有する、単離ポリヌクレオチドであって、上記ポリヌクレオチドが、さらにネイティブＤＰ−７５ ｍＲＮＡを切断し得る、単離ポリヌクレオチド。
・項目３０．（ｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６、配列番号１、またはそれらのフラグメントにハイブリダイズし得る、リボザイムポリヌクレオチド配列であって、上記ポリヌクレオチドが、さらにネイティブＤＰ−７５ｍＲＮＡを切断し得る、配列；および（ｉｉ）上記リボザイムポリヌクレオチドの転写を開始し得る配列を含有する、ポリヌクレオチドを含有する、リボザイムベクター。
・項目３１．上記転写を開始するための配列が、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス由来である、項目３０に記載のリボザイムベクター。
・項目３２．ストリンジェントな条件下で、配列番号６、配列番号１、またはそれらのフラグメントとハイブリダイズし得る核酸配列を含有する有効量のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドの取り込みを促進し得る薬剤を含有する、薬学的組成物。
・項目３３．さらに、水溶性塩を含有する、項目３２に記載の薬学的組成物。
・項目３４．さらに、油脂を含有する、項目３２に記載の薬学的組成物。
・項目３５．上記油脂が、ゴマ油である、項目３４に記載の薬学的組成物。
・項目３６．さらに、合成脂肪酸エステルを含有する、項目３２に記載の薬学的組成物。
・項目３７．上記合成脂肪酸エステルが、オレイン酸エチル、およびトリグリセリドからなる群より選択される、項目３２に記載の薬学的組成物。
・項目３８．さらに、組成物の粘度を増加する物質を含有する、項目３２に記載の薬学的組成物。
・項目３９．上記物質が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランからなる群より選択される、項目３８に記載の薬学的組成物。
・項目４０．以下の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する、ＤＰ−７５（配列番号６）の発現を阻害する方法：
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得、そしてネイティブヒトＤＰ−７５ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する、アンチセンスポリヌクレオチドを提供する、工程；および、
（ｂ）上記アンチセンスポリヌクレオチドを、上記ＤＰ−７５に接触させる、工程。
・項目４１．以下の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程を包含する、サンプル中の過剰増殖細胞を検出するための方法：
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る配列を含有する、プローブポリヌクレオチドを提供する、工程；
（ｂ）ポリヌクレオチドハイブリッドの形成を可能にする条件下で、上記プローブと、上記サンプル細胞のポリヌクレオチドとを接触させる、工程；および、
（ｃ）上記ハイブリッドを検出する、工程。
・項目４２．上記プローブが、１０塩基と５０塩基との間の長さである、項目４１に記載の方法。
・項目４３．以下の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程を包含する、サンプル中のＤＰ−７５ポリペプチドを検出するための方法：
（ａ）ＤＰ−７５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する工程であって、上記ＤＰ−７５ポリペプチドが、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る配列を含有するポリヌクレオチドによってコードされる核酸配列を含有する、工程；
（ｂ）抗体／抗原複合体の形成を可能にする条件下で、上記抗体と上記サンプルとを接触させる、工程；および、
（ｃ）上記複合体を検出する、工程。
・項目４４．以下の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する、過剰増殖細胞の増殖を阻害するための方法：
（ａ）ネイティブＤＰ−７５ｍＲＮＡの発現を阻害するために、被験体にリボザイムベクターまたはアンチセンスベクターを投与する、工程；および、
（ｂ）上記リボザイムベクターまたはアンチセンスベクターと、上記過剰増殖細胞のポリヌクレオチドとを接触させる、工程。
・項目４５．以下の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する、細胞の複製を阻害する方法：
（ａ）ＤＰ−７５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する工程であって、上記ＤＰ−７５ポリペプチドが、配列番号６またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る配列を含有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する、工程；および、
（ｂ）抗体／抗原複合体の形成を可能にする条件下で、上記抗体と上記サンプルとを接触させる、工程。

図１は、ＤＰ−７５が、ガン性組織および正常組織の両方からのＲＮＡにハイブリダイズした、ドットブロットアッセイの結果を示す。ガン性組織の供給源は、腎臓、甲状腺、乳房、結腸、および尿管を含む。 図２は、ＤＰ−７５が、ガン性組織および正常組織の両方からのＲＮＡにハイブリダイズした、ドットブロットアッセイの結果を示す。ガン性組織の供給源は、肺、鼻、胃、食道、肝臓、リンパ腫、子宮、膀胱、直腸、および脳を包含する。

（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されていなければ、当該分野における分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法の従来方法を使用する。このような方法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，第一巻および第二巻（Ｄ．ＮＧｌｏｖｅｒ編、１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ）（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭＩＬＬＥＲおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻および第１５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ），Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７），ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ 第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．），ＨＡＮＤＯＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ 第１巻〜第４巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；および、ＶＡＣＣＩＮＥＳ（Ｒ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓ編、１９９２，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）を参照のこと。

ヌクレオチドおよびアミノ酸に対する標準的な方法が、本明細書で使用されている。本明細書に記載されている全刊行物、特許、および特許出願は、参考として援用されている。

（定義）
「相同性」は、ｘおよびｙ間の類似性の程度をいう。１つの型とその他の型との配列間の対応は、当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、それらは、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較によって決定され得る。代表的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかの２つの配列は、その配列が、少なくとも４５％の配列同一性、より代表的には５０％配列同一性、より代表的には５５％配列同一性、より代表的には６０％配列同一性、さらに代表的には６５％配列同一性、よりさらに代表的には７０％配列同一を示すときに、相同である。一般的には、２つの配列は、その配列が、少なくとも７５％配列同一性、より一般的には８０％配列同一性、よりさらに一般的には８５％配列同一性、よりさらに一般的的には９０％配列同一性、そしてよりさらに一般的には９５％配列同一を示すときに、相同である。

あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、決定され得る。安定な二本鎖は、例えば、Ｓ_１のような一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化に耐え得るものである。このような二本鎖は、消化されたフラグメントのサイズ決定のような、種々の方法によって分析され得る。

「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸配列のもう１つの配列への、水素結合による会合をいう。代表的には、１つの配列が固体支持体に固定され、もう一方が溶液中に解離されている。次に、その２つの配列は、水素結合に好ましい条件下で、もう一方に接触される。この結合に影響する因子は、溶媒の型および容積、反応温度、ハイブリダイゼーション時間、撹拌、液相配列の固体支持体への非特異的結合をブロックする試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）、配列の濃度、配列会合速度を増大する化合物の使用（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）、およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシーを包含する。ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＮＵＡ第２版（１９８９）、第二巻、９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。

「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましい、ハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、温度および塩濃度の組み合わせは、研究下のハイブリッドの計算されたＴ_ｍは、約１２℃から２０℃以下であるように選択されるべきである。温度および塩条件は、しばしば、フィルターに固定されたゲノムＤＮＡサンプルが、異なるストリンジェントな条件下で、目的配列にハイブリダイズされ、次いで洗浄される予備実験で、実験的に決定され得る。上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。

例えば、サザンブロットが実施されるときに考慮される変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑性、および（２）プローブおよび検出されるべき配列間の相同性である。研究されるべきフラグメントの総量は、プラスミドまたはファージ消化に対しては０．１μｇ〜１μｇ、１０〜９μｇ、高度に複雑な真核ゲノム中の１コピー遺伝子に対しては１０〜８μｇに、１０段階に変化され得る。複雑性の低いポリヌクレオチドついては、実質的に短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の開始ポリヌクレトチドおよびプローブの低特異活性が使用され得る。例えば、１コピー酵母遺伝子は、１μｇ酵母ＤＮＡで開始して、２時間のブロッティング、１０^８ｃｐｍ／μｇプローブとの４〜８時間のハイブリダイゼーションでの、１時間のみの曝露時間で検出され得る。１コピー哺乳動物遺伝子に対しては、従来のアプローチでは、１０μｇのＤＮＡで開始され、一晩のブロット、１０^８ｃｐｍ／μｇを超えるプローブを使用して、１０％硫酸デキストラン存在下での一晩のハイブリダイゼーションによって、約２４時間の曝露時間をもたらした。

数種の因子が、プローブと目的フラグメント間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、従って、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の適切な条件に、影響し得る。多くの場合に、プローブは、フラグメントに必ずしも１００％相同ではない。その他の一般的な会合変数は、ハイブリダイズする配列の長さおよび総Ｇ＋Ｃ含有量、イオン強度、およびハイブリダゼーション緩衝液のホルムアミド含有量を包含する。これらの全ての因子の影響は、下記の１つの方程式によって最適化され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃ_ｉ）＋０．４［％Ｇ＋Ｃ）］−０．６（ホルムアミド％）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここで、Ｃｉは、塩濃度（一価イオン）であり、ｎは、塩基対中のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４からわずかに改変された）。

ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響するいくつかの因子は、都合よく変化され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度、および洗浄中の塩濃度は、調整するのに最も容易である。ハイブリダイゼーション温度の上昇に伴って（すなわち、ストリンジェンシー）、非相同性である鎖間にハイブリダイゼーションが生じる可能性はほとんどなく、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識プローブが、固定されたフラグメントと完全に相同でないときは（それは、しばしば、遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験の場合であるように）、ハイブリダイゼーション温度は減少されなければならず、バックグラウンドは増加する。洗浄温度は、ハイブリダイズするバンドの強度、および同様の様式でバックグラウンドの程度に影響する。洗浄のストリンジェンシーもまた、塩濃度の減少に伴って増大する。

一般的に、５０％ホルムアミド存在下での良好なハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントと９５％〜１００％相同であるプローブに対しては４２℃であり、９０％〜９５％の相同性に対しては３７℃であり、そして８５％〜９０％の相同性に対しては３２℃である。より低い相同性については、ホルムアミド含有量は低くされるべきであり、従って、温度は上記方程式を用いて調整される。プローブおよび標的フラグメント間の相同性が未知であるときは、最も簡単なアプローチは、ハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄の条件で開始することである。非特異バンドまたは高バックグラウンドがオートラジオグラフィー後に観察されるときには、フィルターは、高ストリンジェンシーにて洗浄され、再曝露され得る。曝露に必要とされる時間がこのアプローチを非実用的にさせるときは、数回のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが、並行してテストされるべきである。

ネイティブＤＰ−７５ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、天然に生じるタンパク質および核酸をいう。ネイティブポリペプチドのアミノ酸配列は、代表的には、配列番号６または配列番号１にコードされた１０〜２０アミノ酸より少ないわずかに変化した配列を有する。

「ベクター」または「プラスミド」は、接続されるセグメントの複製および／または発現をもたらすように、その他のポリヌクレオチドセグメントが接続される核酸配列である。

「ＰＣＲ」は、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３（１９８６）；および、Ｓｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−１０７８；および米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されているような、ポリメラーゼ連鎖反応の技術である。

「制御配列」とは、連結されるコードの発現を促進するポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の特性は、宿主生物（真核生物）に依存して異なり、一般にこのような制御配列は、例えば、プロモーターおよび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、例えば、転写および翻訳に関連する反応のような、最低でも、その存在が発現を促進する、全成分を包含することが意図される。制御配列はまた、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を包含し得る。

「作動可能に連結された」は、記載された成分が、それらの意図される様式で機能し得る関係にある並列連結をいう。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適した条件下で、コード配列の発現が達成される。

本明細書中の用語「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、任意の長さのヌクレオチドポリマー、好ましくはデオキシリボヌクレオチドをいい、本明細書では、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」と互換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみをさす。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびにアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。それは、公知の型の修飾、例えば、当該分野で公知の標識の存在、メチル化、末端「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドアナログの１つ以上の置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、特定の型の非電荷連結（例えば、リン酸メチル、リン酸エステル、ホスフォアミデート、カルバメートなど）または電荷連結（例えば、ホスフォロチオネート、ホスフォロジチオエートなど）との置換、ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレーター（例えば、金属、放射活性核種、ホウ素、酸化部分など）、アルキレーター（例えば、αアンマー核酸など））の導入を包含する。

「ゲノム」は、スプライスｍＲＮＡと反対の染色体ＤＮＡ中に認められる配列に対応するＤＮＡ分子の収集物またはライブラリーを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列を意味する。

本明細書で使用されているように、ｘが、同じ様式でｙに天然で会合しないとき、すなわち、ｘが、天然でｙと会合しないか、または天然に見出されるのと同じ様式でｙに会合しないときに、ｘは、ｙに関して「異種」である。

本明細書中の用語「タンパク質」または「ポリペプチチド」は、アミノ酸ポリマーをいい、特定の長さの産物のことではない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびポリタンパク質、ならびにそれらのフラグメントが、この定義内に包含される。この用語はまた、タンパク質の翻訳後の修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）をいわないか、または除外する。この定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を有するタンパク質、置換連結を有するタンパク質、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない両方の当該分野で公知の修飾が包含される。

示された核酸配列「由来」の、または「コードされる（ｃｏｄｅｄ ｂｙ）」、または「コードされる（ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ）」ポリペプチドまたはタンパク質または核酸は、配列中にコードされるポリペプチドの配列と同じアミノ酸配列、または少なくとも３〜５つの保存アミノ酸からなる部分、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも１１〜１５アミノ酸からなる部分、またはこの配列中にコードされるポリペプチドによって免疫学的に同定され得る部分を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、示された核酸配列から発現されるポリペプチドを包含する。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、およびその他のこのような用語は、例えば、組換えベクターまたなその他の導入ＤＮＡの受容体として使用され得るかまたはされてきた、微生物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞をさし、形質転換されたもとの細胞の子孫を包含する。１つの親細胞の子孫は、天然、偶発的、または意図的な変異によって、形態学的またはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ成分において、もとの親と完全に同じである必要はないことが、理解される。

「細胞株」は、インビボでの連続的増殖または延長増殖、および分裂し得る細胞集団をいう。しばしば、細胞株は、１つの前駆細胞由来のクローン集団である。さらに当該分野では、自発的変化または誘導変化が、このようなクローン集団の貯蔵または移送中に核型において生じ得ることが公知である。従って、示される細胞系由来の細胞は、母細胞または培養物と厳密に同じでなくてもよく、細胞株によって、このような変異体を包含する。用語「細胞株」はまた、不死化細胞を包含する。

本明細書中の用語「微生物」は、細菌およびカビのような、真核および原核微生物を包含し、後者は、酵母および糸状菌を包含する。

本明細書で使用される場合、「形質転換」は、挿入に使用される方法（例えば、直接取り込み、粒子媒介、形質導入、ｆ−交配、またはエレクトロポレーション）にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入をいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主ゲノムへ組み込まれ得る。粒子媒介形質導入の例は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，１４９，６５５号に示されていて、これらは全体が本明細書に参考として援用されている。

「精製された」および「単離された」は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するときは、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子を実質的に含まない状態で存在することを意味する。本明細書中の用語「精製された」は、存在する同じ型の生物学的高分子（しかし、水、緩衝液、およびその他の低分子、特に１０００未満の分子量を有する分子は、存在し得る）の、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％が存在することを意味する。

ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドの「増殖抑制量」は、例えば、ガンの治療、改善、または予防するための治療剤の量をいう。その量は、検出可能な治療効果または予防効果を示すのに十分である。その効果は、例えば、ガン性細胞のような異常細胞増殖の減退；ガン性細胞の死；またはガン抗原またはマーカーの存在の減少を包含し得る。治療効果はまた、患者の生理学的症状または徴候の減少を包含し得る。被験体に対する厳密な有効量は、被験体の大きさおよび健康、心臓脈管状態の特性および程度、ならびに、治療剤または投与のために選択された治療剤の組み合わせに依存する。従って、実際の有効量を予め特定することは有用ではない。しかし、特定状況に対する有効量は、日常的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。

用語「薬学的に受容可能な」は、不適切な毒性をともなわずに哺乳動物に投与され得る化合物または組成物をいう。薬学的に受容可能な塩の例は、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸などのような鉱酸；および、酢酸、プロピオン酸、マロン酸、安息香酸などの有機酸を包含する。

（一般的な方法）
ＤＰ−７５は、ある種のガンによって同定されたその他の配列にいくらかの相同性配列を有する、新規なＤＮＡおよびアミノ酸配列である。例えば、本発明のＤＰ−７５核酸配列は、Ｔｉａｍ−１として同定された核酸配列（Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ７７：５３７−７４９（１９９４）、およびＨａｂｅｔｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１３７１−１３７６（１９９５）を参照のこと）（両方は、本明細書に参考として援用されている）と部分的に相同である。Ｔｉａｍ−１の全長または切断型の過剰発現は、マウスにおけるリンパ腫細胞の転移可能性を増大する。Ｔｉａｍ−１は、Ｒｈｏ様およびＲａｃ様ＧＴＰａｓｅを活性化するタンパク質である、ＧＤＰ解離刺激物質（ＧＤＳ）ファミリーのメンバーである。ＧＤＳならびにＲｈｏおよびＲａｃ様ＧＴＰａｓｅは、ガン発生性能力を有する。

ＤＰ−７５の細胞侵入を誘導する能力についてアッセイするための、Ｈａｂｅｔｓら、Ｃｅｌｌ７７：５３７−７４９（１９９４）に概説されている方法は、以下の通りである。例えば、細胞はＤＰ−７５によって形質転換され得、そしてそのクローンは、実験動物、すなわちヌードマウスに投与され得る。Ｈａｂｅｔｓらの５３７頁および５３８頁を参照のこと。

ＤＰ−７５ＤＮＡ配列またはその相補体が、診断アッセイ、発現ベクター、制御配列、アンチセンス分子、リボザイム、および、核酸配列によってコードされるポリヌクレオチドを発現するための宿主に、有用である。ＤＰ−７５アミノ酸配列は、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換を促進するＤＰ−７５の能力に対するインヒビター（好ましくは、小分子）をスクリーニングするためのアッセイに、使用され得る。適切なアッセイについては、Ｍｉｃｈｉｅｌｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５：３３８−３４０（１９９５）を参照のこと。Ｍｉｃｈｉｅｌｓらは、その全体が本明細書に参考として援用されている。例えば、このアッセイは、トリチウム化ＧＤＰと共に、ＲｈｏまたはＲａｃとインキュベートされ得る、ＤＰ−７５タンパク質の使用を包含し得た。ＤＰ−７５は、化合物がその放出を阻害しなければ、ＧＤＰを放出するはずである。この阻害は、Ｍｉｃｈｉｅｌらと同じ様式によって測定され得た。

ＤＰ−７５は、下記に示されているように、正常心臓、脳、および骨格筋で発現されることが見出された。メッセージサイズは、脳組織についてはほぼ３Ｋｂであり、心臓および骨格筋組織では６ Ｋｂであるようであった。脳の異なる領域からの組織でのより完全な形態については、脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、および被殻は、３Ｋｂメッセージを有するが、小脳は７．７ Ｋｂメッセージを有することを示した。従って、身体の種々の組織において、ＤＰ−７５の異なるスプライシングバージョンが存在し得るようである。

ＤＰ−７５は、腫瘍細胞の侵入モジュレーターとして示されるタンパク質である、Ｔｉａｍ−１にいくらかの相同性を有する。Ｔｉａｍ−１は、ＧＤＰ解離刺激物質（ＧＤＳ）である。これは、Ｔリンパ腫細胞の侵入に影響するサイトゾルタンパク質であり、ｒｈｏ様およびｒａｃ様タンパク質の活性を調節するタンパク質と、ドメイン（Ｄｂｌ−相同およびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎ相同）を共有する。このようなｒｈｏ様およびｒａｃ様タンパク質は、細胞骨格構造を調節するシグナル形質導入経路において示されている。さらに、ＧＤＳは、その他の活性の中の、細胞シグナル伝達、調節、分泌、大きさ、形状、付着、運動性、および増殖において重要である、小ＧＴＰａｓｅ分子の活性を調節する。

これらの小ＧＴＰａｓｅに対する範例である分子はｒａｓであり、これは広く研究されており、ｒａｃ、ｒｈｏ、およびｒａｂサブファミリーのような、関連タンパク質のスーパーファミリーを代表する。その全体が本明細書に参考として援用されている、ＢｏｇｕｓｋｉおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６６：６４３−６５４を参照のこと。さらに、ｐ２１ｒａｓのような、レセプターチロシンキナーゼによるシグナル伝達に対する情報については、Ｆａｎｔｌら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）６２：４５３−４８１を参照のこと。

活性化ｒａｓは、ガンの約２０％、および膵臓ガンの１００％に見出されている。ｒａｓは通常、不活性分子としてＧＴＰに結合されるが、しかし、ＧＴＰがＧＤＰを形成するために切断されるときに、活性化され得る。これらの変換因子は通常、ＧＴＰをＧＤＰに切断するのに有用である、ＤｂｌおよびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎ相同ドメインを含有する。ＤＰ−７５は、これらの調節分子が有用性を示したこれらの全ての領域で、重要であり得ると考えられる。

上記のように、これらのＧＤＳは種々のガンで示され、ＤＰ−７５が、ガン細胞の診断に有用であると考えられる。多くの方法が、組織サンプルまたはヒトが、ＤＰ−７５含有腫瘍組織を有するかどうかを診断するために使用され得る。例えば、ＤＰ−７５ｍＲＮＡ配列の存在を同定するための、腫瘍サンプルのＲＮＡ逆転写およびＰＣＲ増幅である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ；ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版（１９８９），第１４章、またはＧａｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：９２１−９３０を参照のこと）。さらに、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡアッセイが、ＤＰ−７５発現腫瘍を同定するために使用され得る。例えば、ＤＰ−７５タンパク質は、組換え発現され得、次に、モノクローナル抗体が、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。例えば、ＥＰ１７４，２０４、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７、Ｆｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．（１９８４）７０：８３−９０、ＧＢ ２，０８６，９３７、２，１１３，７１５、ＥＰ ５７，１０７、６２，４０９、ＥＰ １１８，８９３、ＥＰ １２４，３０１、およびＥＰ１３１，８７８に示されている方法が、本発明に適している。次に、抗ＤＰ−７５モノクローナル抗体が、上記記載の標準的なアッセイ、またはそうでなければ当該分野で公知のその他のアッセイにおいて使用され得る。

モノクローナル抗体はまた、治療的に使用され得る。抗ＤＰ−７５は、当該分野で公知の手段によって投与され得る。好ましくは、抗体は、非経口的または皮下的に投与され、より好ましくは、それらは静脈内に投与される。モノクローナル抗体は、その抗体の活性を促進するように、またはＤＰ−７５発現細胞に関連する背後状態を治療するように設計されたその他の薬剤と組み合わせて投与され得る。

さらに、米国特許第５，１２４，２４６号および同第４，８６８，１０５号（その全体が本明細書に参考として援用されている）に示されるような、ＤＰ−７５ ＤＮＡについてアッセイするための分枝ＤＮＡテストが実施され得る。分枝ＤＮＡテストのためのＤＰ−７５核酸プローブ分子は、好ましくは１０〜５０塩基長、より好ましくは１５と４０塩基長との間、さらに好ましくは２０と３０塩基長との間である。

リボザイムは、配列番号６に示されているＤＰ−７５配列またはそのフラグメントに作用するように、設計され得る。例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−ＣａｂｅｔおよびＳｃａｎｌｏｎは、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９５）２：２１３−２２３（その全体が本明細書に参考として援用されている）に、先行技術を概説する。著者らは、ハンマーヘッドおよびヘヤピンリボザイムの生化学を考察し、遺伝子治療（ＨＩＶおよびガン）におけるそれらの役割を考察している。

リボザイムは、ＤＰ−７５配列に作用して、それを特定位置で切断するように設計され得る。例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｃａｂｅｔの図１は、任意の遺伝子に対してこれらのリボザイムを設計するための、ハンマーヘッドリボザイムの構造および方向を示す。Ｋａｓｈａｎｉ−Ｃａｂｅｔに従って、図１は、３ヘリックスおよび１ステムループ構造、ならびに結合領域を示す。著者らはさらに、裸のリボザイム送達、リポソーム、およびリボザイムに対する化学修飾のような技術を用いる、目的リボザイムの細胞内送達方法を開示する。

Ｋａｓｈａｎｉ−Ｃａｂｅｔはまた、４ヘリックス領域および２ループ構造を有するヘアピンリボザイムを考察する。著者らは、これらの構造のいくつかに必須ヌクレオチド配列が存在することを示す。さらに、細胞リボザイム発現は、分解をともなわずに、それらの基質にリボザイムを提供するのに有用であり得る。

細胞発現を得るために、リボザイム遺伝子は種々のベクターへクローニングされ、選択された細胞へ形質転換される。異なるベクターが、感染されるべき標的細胞に基づいて選択される。例えば、呼吸器細胞は、アデノまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって標的され得る。適切なプロモーターが、調節発現を確実にするために、これらのベクターへ挿入され得る（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｃａｂｅｔ、２１６頁を参照のこと）。

アンチセンス分子は、配列番号１または配列番号６に示されているＤＰ−７５配列に基づいて開発され得る。例えば、その全体が本明細書に参考として援用されている、米国特許第５，４９１，１１３号および同第５，２７１，９４１号を参照のこと。

アンチセンスＲＮＡ配列は、原核生物（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．，Ｃｈｏｕ，Ｍ−Ｙ，およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，（１９６６−１９７０）、および真核生物（Ｈｅｙｗｏｏｄ，Ｓ．Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，６７７１−６７７２（１９８６）の両方での遺伝子発現に対する、天然に存在する生物学的インヒビターとして記載され、これらの配列はおそらく、相補的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることによって機能し、翻訳のハイブリダイゼーション妨害をもたらす（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｅ．およびＫｕｆｆ，Ｅ．Ｌ．，（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，４３７０−４３７４）。

アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、特定遺伝子またはＲＮＡメッセージに相補的であるように処方された、短い合成ヌクレオチドである。これらのオリゴマーの標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列への結合を介して、遺伝子の転写または翻訳が選択的に阻害され、その遺伝子によって生じた疾患プロセスが中断され得る。ｍＲＮＡの細胞質配置は、細胞へ侵入するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに容易に組み立てられると考えられる標的を提供する。従って、この分野の多くの研究が、標的としてＲＮＡに注目してきている。

現在、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、インビトロおよび組織培養で、遺伝子発現調節を探求するために有用な手段を提供する（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１：１５３９−１５４４）。

アンチセンス治療は、細胞に配置される標的ポリヌクレオチドに結合する、オリグヌクレオチドの投与である。これらのオリゴヌクレオチドは通常外因性であるが、それらは内因的に発現され得る。用語「アンチセンス」とは、このようなオリゴヌクレオチドが、それらの細胞標的、例えば、ＤＰ−７５に相補的である事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。

本発明のＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ガン細胞増殖阻害作用を示す、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスフォロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、ＪａｃｋＣｏｈｅｎ，前出を参照のこと）のような誘導体を包含する。本発明のＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＰ−７５ゲノムまたは対応ｍＲＮＡに相補的であり、そして安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＤＰ−７５ｍＲＮＡへの選択ハイブリダイゼーションを可能にし、その他のｍＲＮＡへはハイブリダイズしない。

好ましくは、本発明のＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＰ−７５ ｍＲＮＡにハイブリダイズする、アンチセンスＤＮＡ分子の１５マー〜４０マーのフラグメントである。あるいは、好ましいＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＰ−７５中の領域に相補的である、２０マー〜３０マーオリゴヌクレオチドである。本発明の少なくとも１つのＤＰ−７５オリゴヌクレオチドの有効な量を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有する薬学的組成物が、本発明に包含される。１つの実施態様において、１つのＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される。もう１つの実施態様において、ＤＰ−７５ゲノムの隣接領域に相補的である２つのＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される。

ＤＰ−７５ゲノムの隣接領域または対応ｍＲＮＡに相補的な、２つのＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ＤＰ−７５ゲノム転写またはｍＲＮＡ翻訳のより有効な阻害を可能にし、ガン細胞増殖のより有効な阻害をもたらす。好ましくは、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によるアンチセンス分子の取り込みを促進する薬剤と、同時投与される。例えば、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソーム形態で有り得る、親油性カチオン化合物と組み合わされ得る。

ヌクレオチドを細胞へ導入するためのリポソームの使用は、例えば、その全体が本明細書に参考として援用されている、米国特許第号４，８９７，３５５および第号４，３９４，４４８に教示されている。さらに、生物学的物質を含有するリポソームを調製する一般的な方法については、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，２３１，８７７号、同第４，２２４，１７９号、同第４，７５３，７８８号、同第４，６７３，５６７号、同第４，２４７，４１１号、同第４，８１４，２７０号を参照のこと。あるいは、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コレステロール、胆汁酸、およびデオキシ胆汁酸を含有する、多数のステロールの任意の１つのような、親油性キャリアと組み合わせられ得る。好ましいステロールは、コレステロールである。さらに、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞によって摂取されるペプチドと複合体化され得る。有用なペプチドの例は、ペプチドホルモン、抗原または抗体、およびペプチドトキシンを包含する。悪性細胞によって選択的に取り込まれるペプチドを選択することによって、アンチセンス薬剤の特異的な送達が有効となり得る。

ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性化アミノアルキル誘導体の形成によって、５’Ｈ基を介して共有結合し得る。次に、選択ペプチドは、アミノおよびスルフィジル反応性ヘテロ官能性試薬を介して、活性化ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドへ共有結合され得る。後者は、ペプチドに存在するシステイン残基に結合される。ペプチドに結合されるＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチチドへの曝露に際して、ペプチジルアンチセンス試薬が細胞内に取り込まれ、そしてＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＤＰ−７５ｍＲＮＡへ結合して、翻訳を阻害する。ＰＣＴ公開ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２３６３．１を参照のこと。

本発明のＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的組成物は、意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、本発明のアンチセンス化合物またはその他の化合物は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮経路により投与され得る。

投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、同時処置の種類、処置頻度、所望の効果に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドが、増殖および／または被験体ガン細胞の分化の刺激の阻害の達成に有効である量で含有される、全ての組成物を包含する。

個々の必要性は変化するが、各成分の有効量の最適範囲の投与量の決定は、当該分野の範囲内である。代表的には、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトへ、０．００５〜１ ｍｇ／ｋｇ／日の投与量、または等量の薬学的に受容可能なそれらの塩を、一日に治療されるべき哺乳動物の体重について投与され得る。

溶液状の新鮮な化学物質として、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することに加えて、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に使用され得る調製物へのＤＰ−７５アンチセンスのプロセシングを促進する賦形剤および補助剤を含有する、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的調製物の一部として、投与され得る。

非経口投与に対する適切な処方物は、ＤＰ−７５アンチセンスオリゴヌクレオチドの水可溶性形態、例えば水可溶性塩の水溶液を包含する。さらに、適切な油性注入懸濁液として、活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または賦形剤は、油脂（例えばゴマ油）、合成脂肪酸エステル（例えばエチルオレイン酸またはトリグリセリド）を含有する。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストラン）を含有し得る。必要に応じて、懸濁液はさらに安定剤を含有し得る。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野の当業者に周知である任意の方法に従って調製され得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相合成法によって調製され得る。オリゴヌクレオチドの化学合成法の概説については、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１：１６５−１６７（１９９０）を参照のこと。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド注文合成を専門にする多数の会社から得られ得る。

治療剤としてのオリゴヌクレオチドの使用の限界の１つは、血液および細胞内でのヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの迅速な分解である。このような酵素は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖内のヌクレオチドを結合しているホスフォジエステル結合を加水分解し、そのことによって、分子を小フラグメントに切断する。以前には、ヌクレアーゼ分解に耐性であるオリゴヌクレオチドの開発にいくつかの前進があったが、このような誘導体の特異標的遺伝子の発現を阻害するための使用は、限界に直面した。例えば、１９８４年９月４日に発行されたＴｓ’ｏらの米国特許第４，４６９，８６３号；１９８５年３月２６日に発行されたＭｉｌｌｅｒらの米国特許第４，５０７，４３３号；１９８５年４月１６日に発行されたＭｉｌｌｅｒらの米国特許第号４，５１１，７１３を参考のこと。これらはその全体が本明細書に参考として援用されている。

前記の３つの先行特許の各々に記載されている研究は、全リン酸基が、メチルホスフェネートの形態に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用を包含する。米国特許第５，４９１，１３３号は、ほとんどの３’−ヌクレオチド連結のみで修飾されたオリゴヌクレオチドが、血液内および細胞内での分解から明かに防御されることを示す。さらに、このような誘導体は、通常のハイブリダイゼーション特性を有し、ＲＮａｓｅＨによって認識および切断されるｍＲＮＡによって基質を形成し、そのことによって、標的遺伝子の発現を阻む。分解に対して耐性であり、従って治療に使用されたときにより有効であるオリゴヌクレオチドによる、選択された遺伝子の発現阻害の達成は、本発明のもう１つの目的である。

上記記載の核酸分子、すなわちリボザイムまたはアンチセンス分子を、遺伝子治療法において投与することは有用であり得る。従って、下記のベクターおよび方法は有用である。以下の発現系は、上記ポリヌクレオチドの送達のために、遺伝子治療適用に有用である、ベクター、プロモーター、および調節エレメントを記載する。

本発明に有用なベクターおよび発現系は、ウイルスおよび非ウイルス系を包含する。ウイルス送達系の例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、シンドビスおよびヘルペスウイルスを包含する。本発明の１つの局面では、ウイルスベクターは、長期発現のために、上記核酸配列を宿主細胞ゲノムへ組み込み得る。

この様式で組み込み得るベクターの例は、レトロウイルスおよびＡＡＶである。１つの好ましいレトロウイルスは、マウス白血病ウイルスである。しかし、宿主細胞ゲノムへの組み込みを避けることが好ましい。非ウイルスベクターは、カチオン脂質またはリポソームと処方された、裸のＤＮＡおよびＤＮＡを包含する。

レトロウイルスベクターは、レトロウイルスを遺伝子操作することによって、産生される。レトロウイルスベクターは、上記に説明されているように、宿主細胞ゲノムへの組み込みに有効である。しかし、それらは、分裂細胞にのみ感染する。レトロウイルスベクターはＲＮＡを有し、一旦細胞へ侵入すると、ＲＮＡはＤＮＡへ逆転写され、宿主細胞へ安定に組み込まれる。

野生型レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子を有する：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子であり、長末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接される。ｇａｇ遺伝子は、ヌクレオキャプシドタンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素およびインテグラーゼを含むウイルス酵素をコードし、ｅｖｎ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。５’ＬＴＲの隣接配列は、ゲノムの逆転写（ＲＮＡプライマー結合部位）、およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なカプセル化（Ｐｉ部位）に必要な配列である。Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ，Ｃ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ（編），１５５−１７３（１９８３）；Ｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：１５３−１５９；Ｃｏｎｅ，ＲＤおよびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），（１９８４）８１：６３４９−６３５３を参照のこと。

さらに、ＡＡＶは、それらが高力価で複製し、効率よく組み込み、ヒトに対して病原性でなく、安定であり、精製が容易であり、そして非分裂細胞に感染するｎｏｄｅ有利である。ＡＡＶベクターは、核酸を適切なプロモーター／エンハンサーの制御下で、ＡＡＶ複製に対してｃｉｓに要求される配列のみであるＡＡＶＬＴＲの間に挿入することによって構築される。このＤＮＡ構築物は、ＲｅｐおよびＣＡＰ（複製に必要とされるＡＡＶコード領域）を発現するその他のプラスミドの存在下で、適切なヒト細胞系へトランスフェクトされる。翻訳後の適切な時期に、細胞は、アデノウイルスまたは単純へルペスウイルスのような、ヘルパーウイルスによって感染される。感染後、ベクター粒子は、細胞から回収される。ＡＡＶ粒子は、標準的なプロトコルによって、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス夾雑物から精製される。

アデノウイルスは、広範な種々の細胞を感染し、非分裂細胞を感染し、高力価を産生し、生物学は十分に理解され、そして長い挿入断片を受容できるので有利である。アデノウイルス遺伝子発現は、遺伝子のカスケードによって制御される。例えば、遺伝子発現段階は、「極初期」、「初期」、ＤＮＡ合成、および後期または構造遺伝子である。これらの遺伝子は、順番に発現される。最初に発現されるマスター遺伝子は、Ｅ１Ａである。１つの好ましい実施態様は、Ｅ１Ａ遺伝子の目的核酸配列での置換、および、一般に入手可能である２９３細胞のような、構成的にＥ１Ａを産生する細胞の、このベクターでのトランスフェクションを包含する。ベクターは、ビリオン産生に必要な全遺伝子を含有し、細胞系は、欠損Ｅ１Ａタンパク質を提供する。

使用され得る非ウイルス系の１つは、Ｔ７／Ｔ７系である。ここで、細菌ウイルスＴ７ポリメラーゼによって認識される短いプロモーター配列は、目的の核酸配列の上流のベクター上に配置される。次に、ベクターは、細胞へ挿入され得、欠損Ｔ７ポリメラーゼが付加され得て、遺伝子転写を得る。あるいは、以下の配列を有するベクターが、作製され得る：Ｔ７プロモーター配列、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子、Ｔ７プロモーター配列の別のコピー、および上記記載の核酸配列。この実施態様では、ベクターは細胞へ形質転換され、開始のために、単にＴ７ポリメラーゼの少量を必要とする。その後、ベクターは、それ自身のポリメラーゼの産生を指示する。

さらに、本明細書に開示されている核酸配列から、例えば、インヒビターについてのテスト、またはモノクローナル抗体の調製のためのアッセイにおいて使用される、ＤＰ−７５タンパク質を産生するのに有用である。ＤＰ−７５は、ネイティブまたは修飾ＤＰ−７５核酸配列によって形質転換された、原核生物微生物または真核生物細胞によって産生され得る。本発明に有用なＤＰ−７５核酸配列は、ネイティブＤＰ−７５のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。

好ましくは、ＤＰ−７５核酸またはタンパク質配列は、下記に記載されている部分配列と相同である。好ましくは、上記配列は、配列番号６またはそのフラグメントと９５％より大きい相同性、より好ましくは９８％より大きい相同性、さらに好ましくは９９％より大きい相同性である。実質的な相同性は、その配列が同じか、またはタンパク質の活性に悪く影響しない、１つ以上の変化（欠損、付加、置換）によって異なることを意味する。タンパク質配列が、上記と同じ割合で相同であることが好ましい。

ＤＰ−７５配列の正確な化学構造は、多数のファクターに依存する。イオン化アミノまたはカルボキシル基が分子中に存在すると、特定のタンパク質は、酸性または塩基性塩、または天然型で得られ得る。適切な環境条件下に存在するときにその活性をとどめる、このような調製物の全ては、本明細書のタンパク質の定義内に包含される。さらに、タンパク質の一次アミノ酸配列は、糖部分（グリコシル化）または、脂質、リン酸、アセチル基などのような、その他の補充分子を用いる誘導体化によって、増加され得る。このような増加のある局面は、産生細胞の翻訳後のプロセシングシステムを通して完了される；その他のこのような修飾は、インビトロにおいて導入され得る。あらゆる事象において、このような修飾が、そのタンパク質の活性を崩壊しない限り、本明細書のタンパク質の定義内に包含される。このような修飾が、種々のアッセイにおいて、タンパク質の活性を促進または減退することによって、量的または質的に活性に影響し得ることが予測される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または誘導体化によって修飾され得、タンパク質は切断されて、活性をとどめるフラグメントを得る。活性を崩壊しないこのような改変は、本明細書のＤＰ−７５の定義から、そのタンパク質配列を排除しない。

最終的に、翻訳中に配列に組み込まれるアミノ酸の欠損、付加、または変化による、一次構造それ自体に対する修飾は、タンパク質の活性を崩壊することなくなされ得る。例えば、部位特異的変異誘発は、ポリペプチド構造変化に影響する、ＤＮＡ構造での特定の変化を可能にする。その全体が本明細書に参考として援用されている、Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＵＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ 第２版（１９８９）、第２巻、１５章を参照のこと。

ＤＰ−７５タンパク質のアミノ酸配列は、４つの一般的なカテゴリーに分割され得る：配列番号６、配列番号１に記載されている配列によってコードされる、変異体、フラグメント、融合体、およびタンパク質、またはそのフラグメント、およびその他の生物に認められるその他の相同体。ネイティブＤＰ−７５タンパク質は、天然に存在するものである。ネイティブポリペプチドのアミノ酸配列は、代表的には、配列番号６または配列番号１由来の１０〜２０アミノ酸より少ないわずかな変化を有する配列を有する。

ネイティブＤＰ−７５タンパク質をコードする配列は、ＤＰ−７５タンパク質のその他のクラスをコードするように、容易に変化され得る。例えば、変異体は、保存アミノ酸置換を作製することによって、構築され得る。以下は保存置換の例である：Ｇｌｙ←→Ａｌａ、Ｖａｌ←→Ｌｅｕ、Ａｓｐ←→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ←→Ａｒｇ、Ａｓｎ←→Ｇｌｎ、およびＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒ。ムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）と呼ばれる変異体のサブセットは、中性アミノ酸、一般的にはセリンと置換される、非ジスルフィド結合にかかわるシステインを有する、ポリペプチドのグループである。変異体は、ネイティブＤＰ−７５タンパク質より広い温度範囲で安定である。変異体はまた、ネイティブＤＰ−７５タンパク質に比較して、アミノ酸欠損または挿入を有する。変異体のコード配列は、ネイティブＤＰ−７５ポリペプチドコード配列のインビトロ変異誘発によって、構築され得る。

フラグメントは、変異またはネイティブＤＰ−７５タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端アミノ酸の欠損である。切断されるアミノ酸数は、ポリペプチドフラグメントが所望の配列相同性、免疫学的または生物学的活性を示す限り、重要ではない。免疫学的に重要なポリペプチドフラグメントは、例えば、ネイティブＤＰ−７５タンパク質と共有する少なくとも１つのエピトープを有する。このようなＤＰ−７５タンパク質は、長さ５〜１５アミノ酸のみの長さであり得る。フラグメントのアミノ酸配列の例は、以下のアミノ酸数を包含する：配列番号７のアミノ酸番号１〜８（ａａ１〜ａａ８）；配列番号７のａａ２〜ａａ９；配列番号７のａａ３〜ａａ１０；配列番号７のａａ４〜ａａ１１；配列番号７のａａ５〜ａａ１２；配列番号７のａａ６〜ａａ１３；配列番号７のａａ７〜ａａ１４；配列番号７のａａ８〜ａａ１５；配列番号７のａａ９〜ａａ１６；配列番号７のａａ１０〜ａａ１７；配列番号７のａａ１１〜ａａ１８；配列番号７のａａ１２〜ａａ１９；配列番号７のａａ１３〜ａａ２０；配列番号７のａａ１４〜ａａ２１；配列番号７のａａ１５〜ａａ２２；配列番号７のａａ１６〜ａａ２３；配列番号７のａａ１７〜ａａ２４；配列番号７のａａ１８〜ａａ２５；配列番号７のａａ１９〜ａａ２６；配列番号７のａａ２０〜ａａ２７；配列番号７のａａ２１〜ａａ２８；配列番号７のａａ２２〜ａａ２９；配列番号７のａａ２３〜ａａ３０；配列番号７のａａ２４〜ａａ３１；配列番号７のａａ２５〜ａａ３２；配列番号７のａａ２６〜ａａ３３；配列番号７のａａ２７〜ａａ３４；配列番号７のａａ２８〜ａａ３５；配列番号７のａａ２９〜ａａ３６；配列番号７のａａ３０〜ａａ３７；配列番号７のａａ３１〜ａａ３８；配列番号７のａａ３２〜ａａ３９；配列番号７のａａ３３〜ａａ４０；配列番号７のａａ３４〜ａａ４１；配列番号７のａａ３５〜ａａ４２；配列番号７のａａ３６〜ａａ４３；配列番号７のａａ３７〜ａａ４４；配列番号７のａａ３８〜ａａ４５；配列番号７のａａ３９〜ａａ４６；配列番号７のａａ４０〜ａａ４７；配列番号７のａａ４１〜ａａ４８；配列番号７のａａ４２〜ａａ４９；配列番号７のａａ４３〜ａａ５０；配列番号７のａａ４４〜ａａ５１；配列番号７のａａ４５〜ａａ５２；配列番号７のａａ４６〜ａａ５３；配列番号７のａａ４７〜ａａ５４；配列番号７のａａ４８〜ａａ５５；配列番号７のａａ４９〜ａａ５６；配列番号７のａａ５０〜ａａ５７；配列番号７のａａ５１〜ａａ５８；配列番号７のａａ５２〜ａａ５９；配列番号７のａａ５３〜ａａ６０；配列番号７のａａ５４〜ａａ６１；配列番号７のａａ５５〜ａａ６２；配列番号７のａａ５６〜ａａ６３；配列番号７のａａ５７〜ａａ６４；配列番号７のａａ５８〜ａａ６５；配列番号７のａａ５９〜ａａ６６；配列番号７のａａ６０〜ａａ６７；配列番号７のａａ６１〜ａａ６８；配列番号７のａａ６２〜ａａ６９；配列番号７のａａ６３〜ａａ７０；配列番号７のａａ６４〜ａａ７１；配列番号７のａａ６５〜ａａ７２；配列番号７のａａ６６〜ａａ７３；配列番号７のａａ６７〜ａａ７４；配列番号７のａａ６８〜ａａ７５；配列番号７のａａ６９〜ａａ７６；配列番号７のａａ７０〜ａａ７７；配列番号７のａａ７１〜ａａ７８；配列番号７のａａ７２〜ａａ７９；配列番号７のａａ７３〜ａａ８０；配列番号７のａａ７４〜ａａ８１；配列番号７のａａ７５〜ａａ８２；配列番号７のａａ７６〜ａａ８３；配列番号７のａａ７７〜ａａ８４；配列番号７のａａ７８〜ａａ８７；配列番号７のａａ７９〜ａａ８６；配列番号７のａａ８０〜ａａ８７；配列番号７のａａ８１〜ａａ８８；配列番号７のａａ８２〜ａａ８９；配列番号７のａａ８３〜ａａ９０；配列番号７のａａ８４〜ａａ９１；配列番号７のａａ８５〜ａａ９２；配列番号７のａａ８６〜ａａ９３；配列番号７のａａ８７〜ａａ９４；配列番号７のａａ８８〜ａａ９５；配列番号７のａａ８９〜ａａ９６；配列番号７のａａ９０〜ａａ９７；配列番号７のａａ９１〜ａａ９８；配列番号７のａａ９２〜ａａ９９；配列番号７のａａ９３〜ａａ１００；配列番号７のａａ９４〜ａａ１０１；配列番号７のａａ９５〜ａａ１０２；配列番号７のａａ９６〜ａａ１０３；配列番号７のａａ９７〜ａａ１０４；配列番号７のａａ９８〜ａａ１０５；配列番号７のａａ９９〜ａａ１０６；配列番号７のａａ１００〜ａａ１０７；配列番号７のａａ１０１〜ａａ１０８；配列番号７のａａ１０２〜ａａ１０９；配列番号７のａａ１０３〜ａａ１１０；配列番号７のａａ１０４〜ａａ１１１；配列番号７のａａ１０５〜ａａ１１２；配列番号７のａａ１０６〜ａａ１１３；配列番号７のａａ１０７〜ａａ１１４；配列番号７のａａ１０８〜ａａ１１５；配列番号７のａａ１０９〜ａａ１１６；配列番号７のａａ１１０〜ａａ１１７；配列番号７のａａ１１１〜ａａ１１８；配列番号７のａａ１１２〜ａａ１１９；配列番号７のａａ１１３〜ａａ１２０；配列番号７のａａ１１４〜ａａ１２１；配列番号７のａａ１１５〜ａａ１２２；配列番号７のａａ１１６〜ａａ１２３；配列番号７のａａ１１７〜ａａ１２４；配列番号７のａａ１１８〜ａａ１２５；配列番号７のａａ１１９〜ａａ１２６；配列番号７のａａ１２０〜ａａ１２７；配列番号７のａａ１２１〜ａａ１２８；配列番号７のａａ１２２〜ａａ１２９；配列番号７のａａ１２３〜ａａ１３０；配列番号７のａａ１２４〜ａａ１３１；配列番号７のａａ１２５〜ａａ１３２；配列番号７のａａ１２６〜ａａ１３３；配列番号７のａａ１２７〜ａａ１３４；配列番号７のａａ１２８〜ａａ１３５；配列番号７のａａ１２９〜ａａ１３６；配列番号７のａａ１３０〜ａａ１３７；配列番号７のａａ１３１〜ａａ１３８；配列番号７のａａ１３２〜ａａ１３９；配列番号７のａａ１３３〜ａａ１４０；配列番号７のａａ１３４〜ａａ１４１；配列番号７のａａ１３５〜ａａ１４２；配列番号７のａａ１３６〜ａａ１４３；配列番号７のａａ１３７〜ａａ１４４；配列番号７のａａ１３８〜ａａ１４５；配列番号７のａａ１３９〜ａａ１４６；配列番号７のａａ１４０〜ａａ１４７；配列番号７のａａ１４１〜ａａ１４８；配列番号７のａａ１４２〜ａａ１４９；配列番号７のａａ１４３〜ａａ１５０；配列番号７のａａ１４４〜ａａ１５１；配列番号７のａａ１４５〜ａａ１５２；配列番号７のａａ１４６〜ａａ１５３；配列番号７のａａ１４７〜ａａ１５４；配列番号７のａａ１４８〜ａａ１５５；配列番号７のａａ１４９〜ａａ１５６；配列番号７のａａ１５０〜ａａ１５７；配列番号７のａａ１５１〜ａａ１５８；配列番号７のａａ１５２〜ａａ１５９；配列番号７のａａ１５３〜ａａ１６０；配列番号７のａａ１５４〜ａａ１６１；配列番号７のａａ１５５〜ａａ１６２；配列番号７のａａ１５６〜ａａ１６３；配列番号７のａａ１５７〜ａａ１６４；配列番号７のａａ１５８〜ａａ１６５；配列番号７のａａ１５９〜ａａ１６６；配列番号７のａａ１６０〜ａａ１６７；配列番号７のａａ１６１〜ａａ１６８；配列番号７のａａ１６２〜ａａ１６９；配列番号７のａａ１６３〜ａａ１７０；配列番号７のａａ１６４〜ａａ１７１；配列番号７のａａ１６５〜ａａ１７２；配列番号７のａａ１６６〜ａａ１７３；配列番号７のａａ１６７〜ａａ１７４；配列番号７のａａ１６８〜ａａ１７５；配列番号７のａａ１６９〜ａａ１７６；配列番号７のａａ１７０〜ａａ１７７；配列番号７のａａ１７１〜ａａ１７８；配列番号７のａａ１７２〜ａａ１７９；配列番号７のａａ１７３〜ａａ１８０；配列番号７のａａ１７４〜ａａ１８１；配列番号７のａａ１７５〜ａａ１８２；配列番号７のａａ１７６〜ａａ１８３；配列番号７のａａ１７７〜ａａ１８４；配列番号７のａａ１７８〜ａａ１８５；配列番号７のａａ１７９〜ａａ１８６；配列番号７のａａ１８０〜ａａ１８７；配列番号７のａａ１８１〜ａａ１８８；配列番号７のａａ１８２〜ａａ１８９；配列番号７のａａ１８３〜ａａ１９０；配列番号７のａａ１８４〜ａａ１９１；配列番号７のａａ１８５〜ａａ１９２；配列番号７のａａ１８６〜ａａ１９３；配列番号７のａａ１８７〜ａａ１９４；配列番号７のａａ１８８〜ａａ１９５；配列番号７のａａ１８９〜ａａ１９６；配列番号７のａａ１９０〜ａａ１９７；配列番号７のａａ１９１〜ａａ１９８；配列番号７のａａ１９２〜ａａ１９９；配列番号７のａａ１９３〜ａａ２００；配列番号７のａａ１９４〜ａａ２０１；配列番号７のａａ１９５〜ａａ２０２；配列番号７のａａ１９６〜ａａ２０３；配列番号７のａａ１９７〜ａａ２０４；配列番号７のａａ１９８〜ａａ２０５；配列番号７のａａ１９９〜ａａ２０６；配列番号７のａａ２００〜ａａ２０７；配列番号７のａａ２０１〜ａａ２０８；配列番号７のａａ２０２〜ａａ２０９；配列番号７のａａ２０３〜ａａ２１０；配列番号７のａａ２０４〜ａａ２１１；配列番号７のａａ２０５〜ａａ２１２；配列番号７のａａ２０６〜ａａ２１３；配列番号７のａａ２０７〜ａａ２１４；配列番号７のａａ２０８〜ａａ２１５；配列番号７のａａ２０９〜ａａ２１６；配列番号７のａａ２１０〜ａａ２１７；配列番号７のａａ２１１〜ａａ２１８；配列番号７のａａ２１２〜ａａ２１９；配列番号７のａａ２１３〜ａａ２２０；配列番号７のａａ２１４〜ａａ２２１；配列番号７のａａ２１５〜ａａ２２２；配列番号７のａａ２１６〜ａａ２２３；配列番号７のａａ２１７〜ａａ２２４；配列番号７のａａ２１８〜ａａ２２５；配列番号７のａａ２１９〜ａａ２２６；配列番号７のａａ２２０〜ａａ２２７；配列番号７のａａ２２１〜ａａ２２８；配列番号７のａａ２２２〜ａａ２２９；配列番号７のａａ２２３〜ａａ２３０；配列番号７のａａ２２４〜ａａ２３１；配列番号７のａａ２２５〜ａａ２３２；配列番号７のａａ２２６〜ａａ２３３；配列番号７のａａ２２７〜ａａ２３４；配列番号７のａａ２２８〜ａａ２３５；配列番号７のａａ２２９〜ａａ２３６；配列番号７のａａ２３０〜ａａ２３７；配列番号７のａａ２３１〜ａａ２３８；配列番号７のａａ２２２〜ａａ２３９；配列番号７のａａ２３３〜ａａ２４０；配列番号７のａａ２３４〜ａａ４１；配列番号７のａａ２３５〜ａａ２４２；配列番号７のａａ２３６〜ａａ２４３；配列番号７のａａ２３７〜ａａ２４４；配列番号７のａａ２３８〜ａａ２４５；配列番号７のａａ２３９〜ａａ２４６；配列番号７のａａ２４０〜ａａ２４７；配列番号７のａａ２４１〜ａａ２４８；配列番号７のａａ２４２〜ａａ２４９；配列番号７のａａ２４３〜ａａ２５０；配列番号７のａａ２４４〜ａａ２５１；配列番号７のａａ２４５〜ａａ２５２；配列番号７のａａ２４６〜ａａ２５３；配列番号７のａａ２４７〜ａａ２５４；配列番号７のａａ２４８〜ａａ２５５；配列番号７のａａ２４９〜ａａ２５６；配列番号７のａａ２５０〜ａａ２５７；配列番号７のａａ２５１〜ａａ２５８；配列番号７のａａ２５２〜ａａ２５９；配列番号７のａａ２５３〜ａａ２６０；配列番号７のａａ２５４〜ａａ２６１；配列番号７のａａ２５５〜ａａ２６２；配列番号７のａａ２５６〜ａａ２６３；配列番号７のａａ２５７〜ａａ２６４；配列番号７のａａ２５８〜ａａ２６５；配列番号７のａａ２５９〜ａａ２６６；配列番号７のａａ２６０〜ａａ２６７；配列番号７のａａ２６１〜ａａ２６８；配列番号７のａａ２６２〜ａａ２６９；配列番号７のａａ２６３〜ａａ２７０；配列番号７のａａ２６４〜ａａ２７１；配列番号７のａａ２６５〜ａａ２７２；配列番号７のａａ２６６〜ａａ２７３；配列番号７のａａ２６７〜ａａ２７４；配列番号７のａａ２６８〜ａａ２７５；配列番号７のａａ２６９〜ａａ２７６；配列番号７のａａ２７０〜ａａ２７７；配列番号７のａａ２７１〜ａａ２７８；配列番号７のａａ２７２〜ａａ２７９；配列番号７のａａ２７３〜ａａ２８０；配列番号７のａａ２７４〜ａａ２８１；配列番号７のａａ２７５〜ａａ２８２；配列番号７のａａ２７６〜ａａ２８３；配列番号７のａａ２７７〜ａａ２８４；配列番号７のａａ２７８〜ａａ２８４；配列番号７のａａ２７９〜ａａ２８６；配列番号７のａａ２８０〜ａａ２８７；配列番号７のａａ２８１〜ａａ２８８；配列番

号７のａａ２８２〜ａａ２８９；配列番号７のａａ２８３〜ａａ２９０；配列番号７のａａ２８４〜ａａ２９１；配列番号７のａａ２８５〜ａａ２９２；配列番号７のａａ２８６〜ａａ２９３；配列番号７のａａ２８７〜ａａ２９４；配列番号７のａａ２８８〜ａａ２９５；配列番号７のａａ２８９〜ａａ２９６；配列番号７のａａ２９０〜ａａ２９７；配列番号７のａａ２９１〜ａａ２９８；配列番号７のａａ２９２〜ａａ２９９；配列番号７のａａ２９３〜ａａ３００；配列番号７のａａ２９４〜ａａ１０１；配列番号７のａａ２９５〜ａａ１０２；配列番号７のａａ２９６〜ａａ１０３；配列番号７のａａ２９７〜ａａ１０４；配列番号７のａａ２９８〜ａａ１０５；配列番号７のａａ２９９〜ａａ１０６；配列番号７のａａ３００〜ａａ３０７；配列番号７のａａ３０１〜ａａ３０８；配列番号７のａａ３０２〜ａａ３０９；配列番号７のａａ３０３〜ａａ３１０；配列番号７のａａ３０４〜ａａ３１１；配列番号７のａａ３０５〜ａａ３１２；配列番号７のａａ３０６〜ａａ３１３；配列番号７のａａ３０７〜ａａ３１４；配列番号７のａａ３０８〜ａａ３１５；配列番号７のａａ３０９〜ａａ３１６；配列番号７のａａ３１０〜ａａ３１７；配列番号７のａａ３１１〜ａａ３１８；配列番号７のａａ３１２〜ａａ３１９；配列番号７のａａ３１３〜ａａ３２０；配列番号７のａａ３１４〜ａａ３２１；配列番号７のａａ３１５〜ａａ３２２；配列番号７のａａ３１６〜ａａ３２３；配列番号７のａａ３１７〜ａａ３２４；配列番号７のａａ３１８〜ａａ３２５；配列番号７のａａ３１９〜ａａ３２６；配列番号７のａａ３２０〜ａａ３２７；配列番号７のａａ３２１〜ａａ３２８；配列番号７のａａ３２２〜ａａ３２９；配列番号７のａａ３２３〜ａａ３３０；配列番号７のａａ３２４〜ａａ３３１；配列番号７のａａ３２５〜ａａ３３２；配列番号７のａａ３２６〜ａａ３３３；配列番号７のａａ３２７〜ａａ３３４；配列番号７のａａ３２８〜ａａ３３５；配列番号７のａａ３２９〜ａａ３３６；配列番号７のａａ３３０〜ａａ３３７；配列番号７のａａ３３１〜ａａ３３８；配列番号７のａａ３３２〜ａａ３３９；配列番号７のａａ３３３〜ａａ３４０；配列番号７のａａ３３４〜ａａ３４１；配列番号７のａａ３３５〜ａａ３４２；配列番号７のａａ３３６〜ａａ３４３；配列番号７のａａ３３７〜ａａ３４４；配列番号７のａａ３３８〜ａａ３４５；配列番号７のａａ３３９〜ａａ３４６；配列番号７のａａ３４０〜ａａ３４７；配列番号７のａａ３４１〜ａａ３４８；配列番号７のａａ３４２〜ａａ３４９；配列番号７のａａ３４３〜ａａ３５０；配列番号７のａａ３４４〜ａａ３５１；配列番号７のａａ３４５〜ａａ３５２；配列番号７のａａ３４６〜ａａ３５３；配列番号７のａａ３４７〜ａａ３５４；配列番号７のａａ３４８〜ａａ３５５；配列番号７のａａ３４９〜ａａ３５６；配列番号７のａａ３５０〜ａａ３５７；配列番号７のａａ３５１〜ａａ３５８；配列番号７のａａ３５２〜ａａ３５９；配列番号７のａａ３５３〜ａａ３６０；配列番号７のａａ３５４〜ａａ３６１；配列番号７のａａ３５５〜ａａ３６２；配列番号７のａａ３５６〜ａａ３６３；配列番号７のａａ３５７〜ａａ３６４；配列番号７のａａ３５８〜ａａ３６５；配列番号７のａａ３５９〜ａａ３６６；配列番号７のａａ３６０〜ａａ３６７；配列番号７のａａ３６１〜ａａ３６８；配列番号７のａａ３６２〜ａａ３６９；配列番号７のａａ３６３〜ａａ３７０；配列番号７のａａ３６４〜ａａ３７１；配列番号７のａａ３６５〜ａａ３７２；配列番号７のａａ３６６〜ａａ３７３；配列番号７のａａ３６７〜ａａ３７４；配列番号７のａａ３６８〜ａａ３７５；配列番号７のａａ３６９〜ａａ３７６；配列番号７のａａ３７０〜ａａ３７７；配列番号７のａａ３７１〜ａａ３７８；配列番号７のａａ３７２〜ａａ３７９；配列番号７のａａ３７３〜ａａ３８０；配列番号７のａａ３７４〜ａａ３８１；配列番号７のａａ３７５〜ａａ３８２；配列番号７のａａ３７６〜ａａ３８３；配列番号７のａａ３７７〜ａａ３８４；配列番号７のａａ３７８〜ａａ３８５；配列番号７のａａ３７９〜ａａ３８６；配列番号７のａａ３８０〜ａａ３８７；配列番号７のａａ３８１〜ａａ３８８；配列番号７のａａ３８２〜ａａ３８９；配列番号７のａａ３８３〜ａａ３９０；配列番号７のａａ３８４〜ａａ３９１；配列番号７のａａ３８５〜ａａ３９２；配列番号７のａａ３８６〜ａａ３９３；配列番号７のａａ３８７〜ａａ３９４；配列番号７のａａ３８８〜ａａ３９５；配列番号７のａａ３８９〜ａａ３９６；配列番号７のａａ３９０〜ａａ３９７；配列番号７のａａ３９１〜ａａ３９８；配列番号７のａａ３９２〜ａａ３９９；配列番号７のａａ３９３〜ａａ４００；配列番号７のａａ３９４〜ａａ４０１；配列番号７のａａ３９５〜ａａ４０２；配列番号７のａａ３９６〜ａａ４０３；配列番号７のａａ３９７〜ａａ４０４；配列番号７のａａ３９８〜ａａ４０５；配列番号７のａａ３９９〜ａａ４０６；配列番号７のａａ４００〜ａａ４０７；配列番号７のａａ４０１〜ａａ４０８；配列番号７のａａ４０２〜ａａ４０９；配列番号７のａａ４０３〜ａａ４１０；配列番号７のａａ４０４〜ａａ４１１；配列番号７のａａ４０５〜ａａ４１２；配列番号７のａａ４０６〜ａａ４１３；配列番号７のａａ４０７〜ａａ４１４；配列番号７のａａ４０８〜ａａ４１５；配列番号７のａａ４０９〜ａａ４１６；配列番号７のａａ４１０〜ａａ４１７；配列番号７のａａ４１１〜ａａ４１８；配列番号７のａａ４１２〜ａａ４１９；配列番号７のａａ４１３〜ａａ４２０；配列番号７のａａ４１４〜ａａ４２１；配列番号７のａａ４１５〜ａａ４２２；配列番号７のａａ４１６〜ａａ４２３；配列番号７のａａ４１７〜ａａ４２４；配列番号７のａａ４１８〜ａａ４２５；配列番号７のａａ４１９〜ａａ４２６；配列番号７のａａ４２０〜ａａ４２７；配列番号７のａａ４２１〜ａａ４２８；配列番号７のａａ４２２〜ａａ４２９；配列番号７のａａ４２３〜ａａ４３０；配列番号７のａａ４２４〜ａａ４３１；配列番号７のａａ４２５〜ａａ４３２；配列番号７のａａ４２６〜ａａ４３３；配列番号７のａａ４２７〜ａａ４３４；配列番号７のａａ４２８〜ａａ４３５；配列番号７のａａ４２９〜ａａ４３６；配列番号７のａａ４３０〜ａａ４３７；配列番号７のａａ４３１〜ａａ４３８；配列番号７のａａ４３２〜ａａ４３９；配列番号７のａａ４３３〜ａａ４４０；配列番号７のａａ４３４〜ａａ４４１；配列番号７のａａ４３５〜ａａ４４２；配列番号７のａａ４３６〜ａａ４４３；配列番号７のａａ４３７〜ａａ４４４；配列番号７のａａ４３８〜ａａ４４５；配列番号７のａａ４３９〜ａａ４４６；配列番号７のａａ４４０〜ａａ４４７；配列番号７のａａ４４１〜ａａ４４８；配列番号７のａａ４４２〜ａａ４４９；配列番号７のａａ４４３〜ａａ４５０；配列番号７のａａ４４４〜ａａ４５１；配列番号７のａａ４４５〜ａａ４５２；配列番号７のａａ４４６〜ａａ４５３；配列番号７のａａ４４７〜ａａ４５４；配列番号７のａａ４４８〜ａａ４５５；配列番号７のａａ４４９〜ａａ４５６；配列番号７のａａ４５０〜ａａ４５７；配列番号７のａａ４５１〜ａａ４５８；配列番号７のａａ４５２〜ａａ４５９；配列番号７のａａ４５３〜ａａ４６０；配列番号７のａａ４５４〜ａａ４６１；配列番号７のａａ４５５〜ａａ４６２；配列番号７のａａ４５６〜ａａ４６３；配列番号７のａａ４５７〜ａａ４６４；配列番号７のａａ４５８〜ａａ４６５；配列番号７のａａ４５９〜ａａ４６６；配列番号７のａａ４６０〜ａａ４６７；配列番号７のａａ４６１〜ａａ４６８；配列番号７のａａ４６２〜ａａ４６９；配列番号７のａａ４６３〜ａａ４７０；配列番号７のａａ４６４〜ａａ４７１；配列番号７のａａ４６５〜ａａ４７２；配列番号７のａａ４６６〜ａａ４７３；配列番号７のａａ４６７〜ａａ４７４；配列番号７のａａ４６８〜ａａ４７５；配列番号７のａａ４６９〜ａａ４７６；配列番号７のａａ４７０〜ａａ４７７；配列番号７のａａ４７１〜ａａ４７８；配列番号７のａａ４７２〜ａａ４７９；配列番号７のａａ４７３〜ａａ４８０；配列番号７のａａ４７４〜ａａ４８１；配列番号７のａａ４７５〜ａａ４８２；配列番号７のａａ４７６〜ａａ４８３；配列番号７のａａ４７７〜ａａ４８４；配列番号７のａａ４７８〜ａａ４８５；配列番号７のａａ４７９〜ａａ４８６；配列番号７のａａ４８０〜ａａ４８７；配列番号７のａａ４８１〜ａａ４８８；配列番号７のａａ４８２〜ａａ４８９；配列番号７のａａ４８３〜ａａ４９０；配列番号７のａａ４８４〜ａａ４９１；配列番号７のａａ４８５〜ａａ４９２；配列番号７のａａ４８６〜ａａ４９３；配列番号７のａａ４８７〜ａａ４９４；配列番号７のａａ４８８〜ａａ４９５；配列番号７のａａ４８９〜ａａ４９６；配列番号７のａａ４９０〜ａａ４９７；配列番号７のａａ４９１〜ａａ４９８；配列番号７のａａ４９２〜ａａ４９９；配列番号７のａａ４９３〜ａａ５００；配列番号７のａａ４９４〜ａａ５０１；配列番号７のａａ４９５〜ａａ５０２；配列番号７のａａ４９６〜ａａ５０３；配列番号７のａａ４９７〜ａａ５０４；配列番号７のａａ４９８〜ａａ５０５；配列番号７のａａ４９９〜ａａ５０６；配列番号７のａａ５００〜ａａ５０７；配列番号７のａａ５０１〜ａａ５０８；配列番号７のａａ５０２〜ａａ５０９；配列番号７のａａ５０３〜ａａ５１０；配列番号７のａａ５０４〜ａａ５１１；配列番号７のａａ５０５〜ａａ５１２；配列番号７のａａ５０６〜ａａ５１３；配列番号７のａａ５０７〜ａａ５１４；配列番号７のａａ５０８〜ａａ５１５；配列番号７のａａ５０９〜ａａ５１６；配列番号７のａａ５１０〜ａａ５１７；配列番号７のａａ５１１〜ａａ５１８；配列番号７のａａ５１２〜ａａ５１９；配列番号７のａａ５１３〜ａａ５２０；配列番号７のａａ５１４〜ａａ５２１；配列番号７のａａ５１５〜ａａ５２２；配列番号７のａａ５１６〜ａａ５２３；配列番号７のａａ５１７〜ａａ５２４；配列番号７のａａ５１８〜ａａ５２５；配列番号７のａａ５１９〜ａａ５２６；配列番号７のａａ５２０〜ａａ５２７；配列番号７のａａ５２１〜ａａ５２８；配列番号７のａａ５２２〜ａａ５２９；配列番号７のａａ５２３〜ａａ５３０；配列番号７のａａ５２４〜ａａ５３１；配列番号７のａａ５２５〜ａａ５３２；配列番号７のａａ５２６〜ａａ５３３；配列番号７のａａ５２７〜ａａ５３４；配列番号７のａａ５２８〜ａａ５３５；配列番号７のａａ５２９〜ａａ５３６；配列番号７のａａ５３０〜ａａ５３７；配列番号７のａａ５３１〜ａａ５３８；配列番号７のａａ５３２〜ａａ５３９；配列番号７のａａ５３３〜ａａ５４０；配列番号７のａａ５３４〜ａａ５４１；配列番号７のａａ５３５〜ａａ５４２；配列番号７のａａ５３６〜ａａ５４３；配列番号７のａａ５３７〜ａａ５４４；配列番号７のａａ５３８〜ａａ５４５；配列番号７のａａ５３９〜ａａ５４６；配列番号７のａａ５４０〜ａａ５４７；配列番号７のａａ５４１〜ａａ５４８；配列番号７のａａ５４２〜ａａ５４９；配列番号７のａａ５４３〜ａａ５５０；配列番号７のａａ５４４〜ａａ５５１；配列番号７のａａ５４５〜ａａ５５２；配列番号７のａａ５４６〜ａａ５５３；配列番号７のａａ５４７〜ａａ５５４；配列番号７のａａ５４８〜ａａ５５５；配列番号７のａａ５４９〜ａａ５５６；配列番号７のａａ５５０〜ａａ５５７；配列番号７のａａ５５１〜ａａ５５８；配列番号７のａａ５５２〜ａａ５５９；配列番号７のａａ５５３〜ａａ５６０；配列番号７のａａ５５４〜ａａ５６１；配列番号７のａａ５５５〜ａａ５６２；配列番号７のａａ５５６〜ａａ５６３；配列番号７のａａ５５７〜ａａ５６４；配列番号７のａａ５５８〜ａａ５６５；配列番号７のａａ５５９〜ａａ５６６；配列番号７のａａ５６０〜ａａ５６７；配列番号７のａａ５６１〜ａａ５６８；配列番号７のａａ５６２〜ａａ５６９；配列番号７のａａ５６３〜ａａ５７０；配列番号７のａａ５６４〜ａａ５７１；配列番号７のａａ５６５〜ａａ５７２；配列番号７のａａ５６６〜

ａａ５７３；配列番号７のａａ５６７〜ａａ５７４；配列番号７のａａ５６８〜ａａ５７５；配列番号７のａａ５６９〜ａａ５７６；配列番号７のａａ５７０〜ａａ５７７；配列番号７のａａ５７１〜ａａ５７８；配列番号７のａａ５７２〜ａａ５７９；配列番号７のａａ５７３〜ａａ５８０；配列番号７のａａ５７４〜ａａ５８１；配列番号７のａａ５７５〜ａａ５８２；配列番号７のａａ５７６〜ａａ５８３；配列番号７のａａ５７７〜ａａ５８４；配列番号７のａａ５７８〜ａａ５８５；配列番号７のａａ５７９〜ａａ５８６；配列番号７のａａ５８０〜ａａ５８７；配列番号７のａａ５８１〜ａａ５８８；配列番号７のａａ５８２〜ａａ５８９；配列番号７のａａ５８３〜ａａ５９０；配列番号７のａａ５８４〜ａａ５９１；配列番号７のａａ５８５〜ａａ５９２；配列番号７のａａ５８６〜ａａ５９３；配列番号７のａａ５８７〜ａａ５９４；配列番号７のａａ５８８〜ａａ５９５；配列番号７のａａ５８９〜ａａ５９６；配列番号７のａａ５９０〜ａａ５９７；配列番号７のａａ５９１〜ａａ５９８；配列番号７のａａ５９２〜ａａ５９９；配列番号７のａａ５９３〜ａａ６００；配列番号７のａａ５９４〜ａａ６０１；配列番号７のａａ５９５〜ａａ６０２；配列番号７のａａ５９６〜ａａ６０３；配列番号７のａａ５９７〜ａａ６０４；配列番号７のａａ５９８〜ａａ６０５；配列番号７のａａ５９９〜ａａ６０６；配列番号７のａａ６００〜ａａ６０７；配列番号７のａａ６０１〜ａａ６０８；配列番号７のａａ６０２〜ａａ６０９；配列番号７のａａ６０３〜ａａ６１０；配列番号７のａａ６０４〜ａａ６１１；配列番号７のａａ６０５〜ａａ６１２；配列番号７のａａ６０６〜ａａ６１３；配列番号７のａａ６０７〜ａａ６１４；配列番号７のａａ６０８〜ａａ６１５；配列番号７のａａ６０９〜ａａ６１６；配列番号７のａａ６１０〜ａａ６１７；配列番号７のａａ６１１〜ａａ６１８；配列番号７のａａ６１２〜ａａ６１９；配列番号７のａａ６１３〜ａａ６２０；配列番号７のａａ６１４〜ａａ６２１；配列番号７のａａ６１５〜ａａ６２２；配列番号７のａａ６１６〜ａａ６２３；配列番号７のａａ６１７〜ａａ６２４；配列番号７のａａ６１８〜ａａ６２５；配列番号７のａａ６１９〜ａａ６２６。フラグメントのコード配列は、変異体またはネイティブＤＰ−７５タンパク質コード配列から、所望でないヌクレオチドを切断することによって、容易に構築され得る。

融合体は、一方または両方の末端にさらなるアミノ酸を有する、フラグメント、変異体、またはネイティブＤＰ−７５タンパク質である。さらなるアミノ酸配列は、ネイティブ視床下部レセプターポリペプチドに認められる配列に、必ずしも相同である必要はない。そのさらなるアミノ酸残基は、例えば、ペプチドの発現、欠損、または活性を促進し得る。さらなるアミノ酸配列はまた、ＤＰ−７５タンパク質のマルチマーを構築するためのリンカーとして使用され得る。全ての融合ポリペプチドは、所望の配列相同性、免疫学的または生物学的活性を示す。

以前に記載されたように、組換えＤＰ−７５は、原核微生物または真核生物細胞によって産生され得る。好ましい細胞系は、Ｅ．ｃｏｌｉ、哺乳動物、バキュロウイルス、および酵母細胞を包含する。好ましくは、ＤＰ−７５は、ネイティブＤＰ−７５活性を有するタンパク質を産生するように、ＤＮＡで原核微生物を形質転換することによって、産生され得る。細菌は、ＤＰ−７５を産生し得る原核微生物であり、Ｅ．ｃｏｌｉが特に好ましい。合成組換えＤＰ−７５はまた、酵母またはヒト細胞のような、真核生物で産生され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版（１９８９），第３巻、細菌発現については１７章、哺乳動物細胞での発現については１６章を参照のこと。これらの両方は本明細書に参考として援用されている。

ＤＰ−７５ＤＮＡは、ＤＰ−７５ポリペプチドを発現するために必要な全ての制御配列を有する、細菌発現ベクターへ取り込まれ得る。制御配列は当該分野で公知であり、リボソーム結合部位、調節プロモーター（すなわち、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃ、λｐ_Ｌ、およびＴ７）；必要に応じてオペレーター配列、開始（ＡＴＧ）および終止コドン；エンハンサーなどを包含する。さらに、細菌内でのプラスミドの複製を促進するための複製起点を含むことが好ましい。

適切なベクターおよびプラスミドは、一般的に入手可能であり、ＤＰ−７５ ＤＮＡを有するように使用され得る。それは、上記制御配列に作動可能に連結され、一般的に入手可能な連結酵素および方法を用いて、ベクターへ挿入され得る。さらに、ＤＰ−７５ＤＮＡ配列は、ｐｈｏＡ配列のような、細胞周辺空間への分泌を提供する配列の下流に、挿入され得る。

発現のための種々の細菌宿主が当該分野で公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。ＤＰ−７５を発現するために適した細菌宿主は、限定されないが、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを包含する。本発明に有用な代表的な形質転換微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２、株 ＭＭ２９４である（１９８３年８月４日にブタペスト条約下にＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、アメリンタイプカルチャーコレクションに寄託番号３９，４０５で寄託されている）。

細菌宿主へのＤＰ−７５ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、代表的には、ＣａＣｌ_２または二価カチオンおよびＤＭＳＯのような、その他の試薬による細菌の処理を包含する。裸のまたはプラスミドＤＮＡもまた、エレクトロポレーションまたはウイルス感染によって、細菌細胞へ導入され得る。通常、形質転換方法は、形質転換されるべき細菌種によって変化する。例えば、（Ｍａｓｓｏｎら、（１９８８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ Ｐｕｂｌ．０３６２５９および０６３ ９５３；ＰＣＴ ＷＯ ８４／０４５４１，Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）“Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒら、（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら、（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎｙら、（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，“ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら、（１９８１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）を参照のこと。

細胞からのＤＰ−７５ポリペプチドの増殖、回収、分解、または抽出の方法の例は、実質的に米国特許第４，６０４，３７７号、同第４，７３８，９２７号、同第４，６５６，１３２号、同第４，５６９，７９０号、同第４，７４８，２３４号、同第４，５３０，７８７号、同第４，５７２，２９８号、同第５，２４８，７６９号、および同第５，１６２，５０７号に記載され、その全体が本明細書に参考として援用されている。

ＤＰ−７５は、種々のその他の発現系で発現され得る。例えば、好ましくは哺乳動物またはバキュロウイルス発現系、ならびに酵母系である。

哺乳動物発現系は、当該分野で公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に配置される転写開始領域、および通常は、転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に配置されるＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でのＲＮＡ合成を開始する、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを指示すると考えられる。哺乳動物プロモーターはまた、通常ＴＡＴＡボックスの１００から２００ｂｐ上流内に配置される上流プロモーターエレメントを含有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれの方向でも作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９））。

上記プロモーターエレメントと組み合わされた、エンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大する。エンハンサーは、通常のＲＮＡ開始部位で開始する合成によって、同種または異種プロモーターに連結されたときに１０００倍まで転写を刺激し得る、調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、通常の方向または裏返し方向に、転写開始部位の上流または下流、あるいは、プロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離に配置されるときにもまた活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７（１９８９）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版（１９８９））。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それら通常広い宿主範囲を有するので、特に有用である。その例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、およびラウス肉腫ウイルス由来（Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）、およびヒトサイトメガロウイルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２２１）の長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーターを包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、ホルモンまたは金属イオンのような誘導物質の存在下でのみ活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。

タンパク質分子は、哺乳動物細胞で細胞内発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子に直接連結され得る。この場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、いつでもＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。必要であれば、Ｎ末端メチオニンは、インビトロでの臭化シアンとのインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において融合タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含有する、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地中に分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分節リーダーは、哺乳動物細胞での外来タンパク質分泌を提供する、リーダー配列の例である。

一般的に、哺乳動物細胞で認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’末端に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと一緒に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）“Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドへ翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを包含する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

いくつかの遺伝子は、イントロンが存在するときに、より効率よく発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライスドナーおよびアクセプター部位とも呼ばれる）を欠くベクターから、効率よく発現されている（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、スプライスドナーおよびアクセプター部位を含有するコード配列内に介在する非コード配列である。それらは、一次転写物のポリアデニル化後のスプライシングによって除去される（Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら、（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）“ＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇ，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編））。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終止配列を含む上記の成分は、一緒に発現構築物へ取り込まれる。エンハンサー、機能性スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、必要であれば発現構築物に含まれ得る。複製のためにトランス作用因子を必要とする、動物ウイルス由来の哺乳動物複製系を包含する。例えば、ＳＶ４０のような、パポーバウイルス（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）またはポリオーマウイルスの複製系を有するプラスミドは、適当なウイルスＴ抗原の存在下で、非常に多いコピー数に複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例は、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のものを包含する。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のための哺乳動物細胞における維持、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主での維持を可能にする。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例は、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）を包含する。

使用される形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接のマイクロインジェクションを包含する。

発現用宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該分野出公知であり、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、およびその他多数の細胞
株を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な、多数の不死化細胞株を包含する。

ＤＰ−７５核酸配列はまた、適切な昆虫発現ベクターへ挿入され得、そしてこれはベクター内の制御エレメントに作動可能に連結される。ベクター構築物は、当該分野で公知の技術を用いる。

一般的に、発現系の成分は、トランスファーベクター、通常は細菌プラスミド（これは、バキュロウイルスゲノムのフラグメントおよび発現されるべき異種遺伝子の挿入に便利な制限部位の両方を含む）；トランスファーベクター内にバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、異種遺伝子のバキュロウイルスゲノムへの相同的組換えを可能にする）；および適切な昆虫宿主細胞および増殖培地；を包含する。

ＤＰ−７５ＤＮＡ配列のトランスファーベクターへの挿入後に、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムが、ベクターとウイルスゲノムとが組換えられ得る昆虫宿主細胞へトランスフェクトされる。パッケージされた組換えウイルスが発現され、組換えプラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料および方法は、キット形態で商業的に、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（“ＭａｘＢａｃ”キット）から入手可能である。これらの方法は、一般的に当業者に公知であり、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７）に十分に記載されている（以後、“ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ”）。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列のバキュロウイルスゲノムへの挿入前に、プロモーター、リーダー（必要であれば）、目的のコード配列、および転写終止配列を含む上記の成分は、通常は中間構築物（トランスファーベクター）へアセンブリされる。

現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶへ導入するために最も一般的に使用されるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。当該分野で公知であるその他多数のベクターもまた、設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５を包含する（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへ変え、ＡＴＴの３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する：ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）。プラスミドは、通常、ポリヘドロンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、およびＥ．ｃｏｌｉでの選択および増殖のための、原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含有する。

通常、バキュロウイルストランスファーベクターは、バキュロウイルスプロモーターを含む。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルストランスファーベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二ドメインを有し得、存在するならば、通常構造遺伝子の末端の遠位である。発現は、調節的または構成的のいずれかであり得る。

構造遺伝子は、ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写され、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例は、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）“Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開１２７８３９および１５５ ４７６；および、ｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）を包含する。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のような、分泌される昆虫またはバキュロウイルスタンパク質の遺伝子由来であり得る（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）に対するシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようであり、その分泌および核蓄積に必要とされるシグナルもまた、無脊椎動物および脊椎動物間で保存されるようであるので、非昆虫起源のリーダー、例えば、ヒトα−インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９）をコードする遺伝子由来のものが、昆虫における分泌を提供するために使用され得る。

ＤＮＡ配列および／またはタンパク質の発現産物前駆体をコードする遺伝子の挿入後に、昆虫細胞宿主は、トランスファーベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡとともに、通常は同時トランスフェクションによって、同時形質転換される。異種ＤＮＡのバキュロウイルスの所望の部位へ導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｊｕら、（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中へなされ得る。挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子へ操作された制限酵素部位へなされ得る（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１）。

新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次に、感染性組換えバキュロウイルスへパッケージされる。組換えウイルスを同定する方法は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増刊１０，１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）に記載されている。

組換えバキュロウイルス発現ベクターは、数種の昆虫細胞への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉについて開発された（ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および、全般的には、Ｆｒａｓｅｒら、（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。

酵母発現系もまた、当業者に公知である。本発明にはあまり好ましくないが、このような系が使用され得る。酵母発現系についての概説は、Ｂａｒｒら（編）、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８９）を参照のこと。

ＤＰ−７５タンパク質は、一連の回収および精製工程によって、宿主細胞系で発現された後に精製され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで可溶性タンパク質として発現されるＤＰ−７５は、マクロフルーダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で細菌細胞を破壊することによって放出され、３０％硫酸アンモニウム沈降によって回収され得る。次に、ＤＰ−７５タンパク質は緩衝液に再溶解され、種々の工程（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、金属カレーションクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、およびさらなる硫酸アンモニウム沈降を含む）によって精製され得る。これらの方法は、当業者に周知である。

ＤＰ−７５タンパク質は、インヒビターについてのアッセイ、およびＤＰ−７５に対する抗体の調製において、使用され得る。ＤＰ−７５タンパク質はまた、培養においてガン細胞増殖を促進する因子として有用であり得る。ＤＰ−７５タンパク質は、ＤＰ−７５アンチセンス分子との使用のために、上記記載の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得る。

本発明は、ここで特に有利な実施態様を記載した以下の実施例を参考として例示される。しかし、これらの実施態様は例示であり、いかなる方法においても本発明を限定するように構成されていないこと留意すべきである。

（実施例１：配列番号１（Ｐ−７５）の単離）
ＤＰ−７５に対する部分核酸配列が、一本鎖分子として、配列番号１として下記に記載されている。

（配列番号１）

ＤＰ−７５を、以下のように核酸プローブを構築することによって、視床下部ｃＤＮＡから単離した。最初の１９ヌクレオチド（ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣ）は、縮重オリゴＤＯ−３（ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＹＴＧＧＮＹＮＣＣ）からで、最後の相補２２ヌクレオチド（ＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＴＴ）は、縮重オリゴＤＯ−１４（ＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＶＡＤＶＡＤＤＧＧＲＴＴ）からである。ＤＯ−３の配列ＡＧＧＣＣＴは、ＳｔｕＩ制限部位を含有し、配列ＤＯ−１４の配列ＣＣＣＧＧＧは、ＳｍａＩ制限部位を含有する。ＰＣＲを、視床下部ｃＤＮＡで実施し、得られた産物をクローニングし、そして配列決定した。

ヒト組織のライブラリーを、ＤＰ−７５の存在についてスクリーニングした。商業的に入手可能なノーザンブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから購入した。１つのブロットは、８つの異なるヒト組織からの各レーンあたり約２マイクログラムのポリＡ^＋ＲＮＡを含有した。ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲル上で展開し、ノーザンブロッティングによって、荷電改変ナイロン膜へ移し、ＵＶ照射によって固定した。レーン１〜８は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓からのＲＮＡを含有した。ＲＮＡサイズマーカーバンドを示した。第二のブロットは、８つの個別脳切片からの各レーンあたり２マイクログラムのポリＡ^＋ＲＮＡを含有した。ブロットは、上記のように調製した。脳切片は、ヒト小脳、脳皮質、髄、脊髄、後頭極、前頭葉、側頭葉、および被殻であった。ＤＰ−７５は、正常心臓、脳、および骨格筋で、発現が見出された。メッセージサイズは、脳についてはほぼ３Ｋｂであり、心臓および骨格筋では６Ｋｂであった。脳領域のより完全な観察は、脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、および被殻が、３Ｋｂメッセージを有するが、小脳は、７．７ Ｋｂメッセージを有することを示した。従って、身体の種々の領域に、ＤＰ−７５の異なるスプライシングバージョンが存在し得る。

（実施例２：配列番号１のガンを診断するための利用）
ドットブロットアッセイにおいて、ＤＰ−７５を、ガンおよび正常の両組織からのＲＮＡとハイブリダイズさせた。ガン組織の供給源は、腎臓、甲状腺、乳房、結腸、尿管、肺、鼻、胃、食道、肝臓、リンパ腫、子宮、膀胱、直腸、および脳を包含する。

ブロットは、ＢｉｏＣｈａｉｎＩｎｓｔｉｔｕｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．から購入した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから購入したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）ハイブリダイゼーション緩衝液を、１０^６ ｃｐｍ／ｍｌのＤＰ−７５（配列番号１）での、６８℃にて２時間ブロッティングに使用した。

４つの甲状腺サンプルのうち４つで、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルはガンにおいて正常サンプルより高かった。図１を参照のこと。

４つの結腸サンプルのうち２つで、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルはガンにおいて正常サンプルより高かった。図１を参照のこと。

２つの尿管サンプルのうち１つで、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルはガンにおいて正常サンプルより高かった。図１を参照のこと。

４つの乳房サンプルのうち１つで、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルはガンにおいて正常サンプルより高くなった。図１を参照のこと。

４つの腎サンプルのうち１つで、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルはガンにおいて正常サンプルより高かった。図１を参照のこと。

試験されたその他の全組織型で、配列番号１（ＤＰ−７５）ｍＲＮＡレベルは、ガンサンプルより正常サンプルにおいて、同じかまたはより高かった。

（実施例３：配列番号６の単離）
配列番号６を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．から購入した、ファージベクターを使用する前頭皮質ライブラリーから単離した。そのライブラリーを、約１×１０^６ｃｐｍ／ｍｌの最終放射性カウントで、ランダムプライム標識によって生成した配列番号１でプローブした。プローブを、Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡから購入したＲｅｄｉＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡ標識キットを用い、製造者の指示に従って標識した。

ファージライブラリーを増殖し、次いで製造者の指示に従って、プレートあたり３．０−５．０×１０^５プラークで、２０のプレートにプレートした。プラークを、ニトロセルロース膜に移した。各膜を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから購入したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）ハイブリダイゼーション溶液中、６５℃にて２時間、配列番号１プローブとともにインキュベートした。フィルターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って洗浄した。フィルムを膜に曝露し、所望のＤＰ−７５ポリヌクレオチドを含有する、推定ポジティブプラークを同定した。

プレートおよびハイブリダイゼーションの第二回工程を実施して、単一のポジティブプラークを同定した。第一回工程からのポジティブプラークを増殖し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供された指示に従って寒天培地へプレートした。プラークをフィルターへ移した。そのフィルターを配列番号１プローブとともにインキュベートした。プローブおよびハイブリダイゼーション条件は、上記と同じであった。ポジティブプラークを同定して、増殖させた。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供された指示に従って、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドを、ファージベクターからレスキューした。プラスミドからのＥｃｏＲＩ挿入断片を配列決定した。ポリヌクレオチド配列を、配列番号６に示す。

その他のＤＰ−７５ポリペプチドコード配列は、ライブラリーを生成するためのプライマー伸長およびＰＣＲ技術を用いて単離され得る。これらの技術は、配列番号１または配列番号６、またはそれらの変異体、融合体、またはフラグメントを含有するプライマーを使用し得る。

一旦ライブラリーが生成されると、その他のＤＰ−７５ポリヌクレオチドが、配列番号１または配列番号６由来の配列、またはそれらの変異体、融合体、またはフラグメントを含有するプライマーを使用して、ライブラリーから同定され得る。

ＤＰ−７５ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体が、経口、局所、または非経口的な手段（皮下および筋肉内注入、持続放出貯蔵物の移植、静脈内注入、経鼻腔投与などを含む）によって投与され得る。腫瘍治療のために使用されるときは、例えば、腫瘍塊を除去する手術の間に、ＤＰ−７５ポリヌクレチドまたは抗体を、例えば、直接的に部位へ適用するのが有利であり得る。従って、ＤＰ−７５ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物として投与され得る。このような組成物は、水溶液、エマルジョン、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。適切な賦形剤は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および、エタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）、植物油などの溶液を包含する。さらに、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどのような適切な防腐剤、安定剤、抗酸化剤、抗菌剤、および緩衝剤が含まれ得る。処方物に有用なクリームまたは軟膏ベースは、ラノリン、Ｓｉｌｖａｄｅｎｅ（Ｒ）（Ｍａｒｉｏｎ）、Ａｑｕａｐｈｏｒ（Ｒ）（ＤｕｋｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などを含む。その他の局所処方物は、エアロゾル、包帯（ｂａｎｄａｇｅｓ）、およびその他の創傷用包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を包含する。あるいは、ＤＰ−７５ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、適切なポリマーマトリックスまたは膜へ取り込まれるかまたはカプセル化され得、従って、局所的に治療されるべき部位の近くへの移植に適した、徐放送達デバイスを提供する。その他のデバイスは、内在カテーテルおよびＡｌｚｅｔ（Ｒ）ミニポンプのようなデバイスを包含する。眼科用調製物は、Ｓｏｒｂｉ−ｃａｒｅ（Ｒ）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）、Ｎｅｏｄｅｃａｄｒｏｎ（Ｒ）（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ）、Ｌａｃｒｉｌｕｂｅ（Ｒ）などのような、市販のビヒクルを使用して処方され得るか、または、米国特許第５，１２４，１５５号（本明細書に参考として援用されている）に記載されているような局所調製物を使用し得る。さらに、ＤＰ−７５ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、固体形態、特に凍結乾燥粉末で提供され得る。凍結乾燥処方物は、代表的には、安定剤および増量剤（例えば、ヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトールなど）を含有する。薬学的に受容可能な賦形剤の全般的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．）において利用可能である。

任意の特定の疾患を治療するために要求される、ＤＰ−７５ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体量は、もちろん、疾患の特性および重篤度、被験体の年齢および症状、および当業者によって容易に決定されるその他の因子に依存して、変化する。適切な投与量は、実施例に下記された方法に従い、当業者によって決定され得る。

本発明は、特定の実施態様を参考として記載してきた。しかし、本出願は、添付の請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく、当業者によってなされ得る改変および置換を包含することを、意図する。

（寄託情報）
以下の材料が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された：
名称 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＮＶαＦ’ＤＰ７５
寄託日 １９９６年４月２５日
受託番号 ９８０３０。

上記材料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、表示の寄託番号のもとに寄託された。この寄託物は、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下に維持される。寄託物は、本特許の発行後３０年間、または本特許の存続期間のいずれか長い期間の間維持される。本特許の発行に際して、寄託物は、ＡＴＣＣから制限なく一般に入手可能である。

これらの寄託物は、ただ当業者の利便のために提供され、寄託物が米国特許法第１１２条のもとに要求されることの承認ではない。寄託物質内に包含されるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用され、本明細書の配列の記述とのいかなる対立事象をも調整する。認可は、寄託材料を生産、使用、または販売するために要求され得、このような認可は、これによって認められない。
（配列表）

Claims (1)

1. 本明細書に記載される発明。