JP2002369685A - アポトーシス遺伝子１のヒトインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポトーシス遺伝子１のヒトインヒビターを
提供する。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって； (a)図１に示すアミノ酸１〜アミノ酸438を含有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b)(a) のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そ
して該ポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポ
リヌクレオチド；および (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチ
ドフラグメント、からなる群から選択されるメンバーを
含む、単離されたポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、アポトーシス遺伝
子１のヒトインヒビターであり、本明細書中で以降とき
どき「hIAP-1」と呼ぶ。本発明はまた、このようなポリ
ペプチドの作用を阻害することに関する。

【０００２】

【従来の技術】プログラムされた細胞死（アポトーシ
ス）は、生物が不要な細胞を排除するプロセスである。
プログラムされた細胞死は、終末の細胞分化の特定のタ
イプと考えられ得る。アポトーシスの間、生物の細胞は
集合し、そして細胞表面で活発な気泡形成を行い（bleb
bing）、アポトーシス小体を形成し、核膜およびいくつ
かの内部構造が破壊し、核DNAは酵素によって断片化さ
れ、そして最後に細胞が壊れて破片になる。

【０００３】初期のアポトーシスの研究は、タンパク質
合成をブロックする薬物はアポトーシスを阻止すると規
定し、プログラムされた細胞死は特定のタンパク質を必
要とすると示唆した。アポトーシスの原因となるタンパ
ク質をコードする遺伝子を見い出すにあたり１つの重要
な助けとなったのは、小さく透明で丸い蠕形動物である
Caenorhabditis elegansが、胚発生において活性な遺伝
子を同定するための貴重な供給源として、1980年代に出
現したことである。この微小な蠕形動物は、たった1,09
0個の細胞しか有さず、そしてそれゆえ発生生物学者ら
は、この蠕形動物が成熟するとき、各細胞の系列を追跡
することが可能であった。そして、131個の胚細胞がプ
ログラムされた細胞死を受けることを見出した。遺伝子
のうち、細胞死遺伝子（deathgene）であるced-3および
ced-4、ならびにアポトーシスから細胞を保護する「抗
細胞死」遺伝子であるced-9がC. elegans中に同定され
た。

【０００４】これらの遺伝子に対応する哺乳動物のアナ
ログの探索は、ガンの原因となるオンコジーンとして同
定された遺伝子bcl-2が、リンパ球と呼ばれる免疫細胞
を自殺から保護し、そしてニューロンをもまた保護する
ことが発見されたことにより、飛躍的な前進を得た。蠕
形動物の保護遺伝子ced-9は、bcl-2に23％相同であるこ
とが見出され、そしてbcl-2遺伝子はC.elegans中のced-
9の代わりになり得、ced-9変異体を細胞死から救った。

【０００５】さらに、ced-3とインターロイキン-β-変
換酵素（ICE）をコードする新しい哺乳動物の遺伝子と
の間に一致が見出された。この２つのタンパク質は、ア
ミノ酸レベルで28％の同一性を共有し、そしてced-3
は、ICEのプロテアーゼ活性を担う活性部位であると考
えられている５アミノ酸ストレッチにおいて、ICEタン
パク質と同一である。

【０００６】アポトーシスは種々の異なる細胞外および
細胞内刺激により誘導され得、そのうちのいくつかは未
知であり、それらは細胞型により異なり得る。しかし、
数多くのレセプターおよび各々の異なる誘導刺激に応答
する関連するシグナル伝達経路は、アポトーシス性細胞
死のプログラムを実際に「誘発」する１つ以上の限られ
た数の経路に集中し得る。アポトーシスを誘導し得る刺
激の中には、細胞外ATP、アクチノマイシン、および酸
素ラジカルがある。アクチノマイシンはRNAの合成を阻
害し、そしてアポトーシスをいくつかの哺乳動物細胞型
において誘導する。これらの細胞型は、ヒト始原子宮上
皮細胞およびHL60白血病細胞を含む（Gerschenson,L.E.
およびRotello, R.J., Cold Spring Harbor, Laborator
y Press, Cold Spring Harbor,New York, 175頁、(199
1)およびMartin, S.J.ら、Immunol.,145:1859(1990))。

【０００７】バキュロウイルスであるCydiapomonella顆
粒症ウイルス（CpGV)は、SF-21細胞（フォールアーミー
ウォーム（fall army worm）であるSpodopterafrugiper
da由来）中で、変異したバキュロウイルスAcMNPV（これ
はSF-21細胞中で、CpGV非存在下でアポトーシスを起こ
す）によるアポトーシスを阻害し得た。CpGV遺伝子は配
列決定され（Crook,N.E.ら、J.Virol., 67:2168(199
3))、そして特徴的なジンクフィンガー（zinc finger）
様モチーフを有することが見出された。この遺伝子はア
ポトーシスのインヒビター（inhibitorof apoptosis）
からiapと命名され、そしてCpGV遺伝子はCp-IAPと呼ば
れた。

【０００８】Cp-IAPポリペプチド中に見出されるジンク
フィンガー様モチーフは、ジンクフィンガー様モチーフ
の特定のクラスに属し（Freemont,P.S.ら、Cell, 64:48
3(1991)）、このモチーフは通常ポリペプチドのアミノ
末端に見出されるが、他の場所に存在し得る。例えばIA
Pポリペプチドの場合、カルボキシル末端に見出され
る。IAPモチーフはまた、このモチーフのアミノ末端部
分にさらなるCX₂Cリピート、ならびに中央の領域に余分
のアミノ酸残基（CXHX₂Cの代わりにCXHX₃C）を含む。こ
のタイプのジンクフィンガー様モチーフを含む約27の公
知のタンパク質があり、４つはバキュロウイルス中に見
出される。ジンクフィンガー様モチーフはまた、脊椎動
物ウイルスによってコードされる数個のタンパク質中に
も存在する。数個の調節タンパク質中にこのモチーフが
存在することは、このモチーフを含むタンパク質の多く
が転写調節因子であり得るという仮説を支持するが、こ
れまでのところDNA結合はこのグループの中の１つの特
定のメンバーのみについて実証されている（Tagawaら、
J.Biol. Chem., 265:20021(1990))。

【０００９】Cp-IAPに見出されるジンクフィンガー様モ
チーフはまた、アポトーシスを調節する役割を有し得る
多くの細胞ポリペプチドの中にも存在する。これらのう
ちの数個が、PML、bmi-1、c-cbl、rfp、およびmel-18の
ようなヒトプロトオンコジーンによりコードされる。

【００１０】これらのタンパク質は、正または負のいず
れかのアポトーシス制御に関わる。従って、Cp-IAPは、
アポトーシスを制御し、そしてこの特有のジンクフィン
ガー様モチーフを含む細胞タンパク質の１クラスに属し
得る。本発明のポリペプチドは、保存されたジンクフィ
ンガー様モチーフを含み、そしてこのクラスのタンパク
質のメンバーとして、推定的に同定されている。

【００１１】アポトーシスは、細胞発生、抗ウイルス応
答、組織分化、発生、組織ホメオスタシス、アルツハイ
マー病、関節リウマチ、敗血性ショック、パーキンソン
病において重要な役割を果たすことが示されおり、脳卒
中、外傷、および変性性疾患の間に、細胞が死ぬメカニ
ズムであり得る。不適切なアポトーシス、すなわち、細
胞が死ぬべきときに死に損ねるとき、腫瘍、腫瘍形成、
およびウイルス感染を招き得る。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの局面に
よれば、新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に
活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポ
リペプチドはヒト起源である。

【００１３】本発明の別の局面によれば、本発明のポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、
それには、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにその
アナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治
療に有用なそのフラグメントおよび誘導体が含まれる。

【００１４】本発明のなおさらなる局面によれば、組換
え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための
プロセスが提供される。組換え技術には、核酸配列を含
む組換え原核生物および／または真核生物宿主細胞を、
該タンパク質の発現および該タンパク質のその後の回収
を促進する条件下で、培養することが包含される。

【００１５】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、治療目的のために、例
えば、腫瘍形成を阻止するため、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、関節リウマチ、敗血性ショックを処置す
るため、ならびに脳卒中、外傷、および変性性疾患の間
の細胞死を阻止するために利用するためのプロセスが提
供される。

【００１６】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするために十分
な長さの核酸分子を含む核酸プローブもまた提供され
る。

【００１７】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。

【００１８】本発明のなお別の局面によれば、このよう
なポリペプチドに結合し、そしてそれを阻害する化合物
が提供される。それらの化合物は、例えば、抗ウイルス
防御機構として、細胞発生、組織分化、組織ホメオスタ
シス、および正常発生を可能にするために用いられ得
る。

【００１９】本発明のさらに別の局面によれば、開示さ
れたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、研究目的
に使用するためのプロセスが提供される。

【００２０】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明の単離されたポリ
ヌクレオチドは、 (a)配列番号２に示すアミノ酸１〜アミノ酸438を含有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b)(a) のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そ
してこのポリヌクレオチドと少なくとも70％同一である
ポリヌクレオチド；および (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチ
ドフラグメント、からなる群から選択されるメンバーを
含む。

【００２２】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドがDNAである。

【００２３】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドがRNAである。

【００２４】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドがゲノムDNAである。

【００２５】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドは、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸438を含む
ポリペプチドをコードする。

【００２６】別の実施形態では、本発明の単離されたポ
リヌクレオチドは、 (a)ATCC受託番号第 号に含まれるDNAにより発現され
るアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； (b)ATCC受託番号第 号に含まれるDNAにより発現され
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； (c)(a)のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そし
てこのポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポ
リヌクレオチド；および (d)(a)、(b)、または(c)のポリヌクレオチドのポリヌク
レオチドフラグメント、からなる群から選択されるメン
バーを含む。

【００２７】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド１からヌ
クレオチド1435までを含む。

【００２８】好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオ
チドは、配列番号１に示す配列のヌクレオチド10からヌ
クレオチド1323までを含む。

【００２９】さらに本発明は、上記DNAを含有するベク
ターに関する。

【００３０】さらに本発明は、上記ベクターで遺伝子操
作された宿主細胞に関する。

【００３１】さらに本発明は、ポリペプチドを産生する
ためのプロセスであって、上記宿主細胞から上記DNAに
よってコードされるポリペプチドを発現させる工程を包
含する、プロセスに関する。

【００３２】さらに本発明は、上記ポリペプチドを発現
し得る細胞を産生するためのプロセスであって、細胞を
上記ベクターで遺伝子操作する工程を包含する、プロセ
スに関する。

【００３３】さらに本発明は、ポリペプチドであって、
(i)配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導
体；ならびに(ii)ATCC受託番号第 号のcDNAによりコ
ードされるポリペプチド、ならびにこのポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体からなる群から
選択される、ポリペプチドに関する。

【００３４】好ましい実施形態では、上記ポリペプチド
は、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸438を含む。

【００３５】さらに本発明は、上記ポリペプチドの活性
化を阻害する化合物に関する。

【００３６】さらに本発明は、hIAPを必要とする患者の
処置方法であって、治療有効量の請求項１４に記載のポ
リペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法に関
する。

【００３７】好ましい実施形態では、上記治療有効量の
上記ポリペプチドが、このポリペプチドをコードするDN
Aを上記患者に提供し、そしてインビボでこのポリペプ
チドを発現させることによって投与される。

【００３８】さらに本発明は、hIAPの阻害を必要とする
患者の処置方法であって、治療有効量の上記化合物をこ
の患者に投与する工程を包含する、方法に関する。

【００３９】さらに本発明は、上記ポリペプチドの過少
発現に関連する疾患またはこの疾病に対する感受性を診
断するためのプロセスであって：このポリペプチドをコ
ードする核酸配列中の変異を決定する工程を包含する、
プロセスに関する。

【００４０】さらに本発明は、宿主由来のサンプル中の
上記ポリペプチドの存在について分析する工程を包含す
る、診断プロセスに関する。

【００４１】さらに本発明は、上記ポリペプチドに対す
るアンタゴニストとして効果的である化合物を同定する
ためのプロセスであって：hIAP-1をコードする核酸配列
で細胞をトランスフェクトする工程；スクリーニングさ
れるべき化合物と、この細胞を接触させる工程；および
この細胞がアポトーシスを受けるかどうかを決定する工
程、を包含する、プロセスに関する。

【００４２】

【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、図
１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリ
ペプチドまたは1995年５月11日にATCC受託番号第
号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌ
クレオチド）が提供される。

【００４３】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、ヒトjurket細胞株およびヒト骨巨細胞腫
ストローマ細胞から得られ得る。これは、アポトーシス
遺伝子ファミリーのインヒビターに構造的に関連する。
これは、438アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含有する。このタンパク
質は、Op-IAPに対して最も高い程度の相同性を示し、44
％の同一性および64％の類似性を全アミノ酸のストレッ
チにわたって有する。前述のように、この型の遺伝子に
見出される保存されたモチーフは、本発明の遺伝子に保
存されている。

【００４４】本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態
またはDNA（このDNAはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNA
を包含する）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一
本鎖であり得、そして一本鎖の場合、コード鎖または非
コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチ
ドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示
すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と
同一であり得るか、またはそのコード配列が、遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）
のDNAまたは寄託されたcDNAと同じ成熟ポリペプチドを
コードする異なるコード配列であり得る。

【００４５】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチド、
または寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る
が、これらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード
配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらな
るコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および
必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配
列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコ
ード配列の5’および/または3’非コード配列）。

【００４６】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。

【００４７】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託され
たクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリ
ヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然
に存在しない改変体であり得る。

【００４８】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたク
ローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリ
ヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１
（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたクロー
ンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体、またはアナログをコードする。このような
ヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、およ
び付加または挿入改変体を含む。

【００４９】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列、ま
たは寄託されたクローンのコード配列の天然に存在する
対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分
野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌ
クレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌ
クレオチド配列の別の形態であり、これはコードされる
ポリペプチドの機能を実質的に変化させない。

【００５０】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるい
は、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、CO
S-7細胞）が使用される場合は、血球凝集素（HA）タグ
であり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タン
パク質に由来するエピトープと一致する（Wilson,I.
ら、Cell, 37:767(1984)）。

【００５１】本発明はさらに、配列間に少なくとも70
％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは
少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上
記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチド
にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語
「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーショ
ンが、配列間に少なくとも95％および好ましくは少なく
とも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意
味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、図１（配列番号１）のcDNAまたは寄託されたcDNAに
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチド
をコードする。

【００５２】あるいは、このポリヌクレオチドは、少な
くとも20塩基、好ましくは30塩基、そしてより好ましく
は少なくとも50塩基を有し得る。これらは、本発明のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書
上記のように、それに対する同一性を有し、そして活性
を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。この
ようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチド
の回収のために、配列番号１のポリヌクレオチド、また
はその誘導体のプローブとして、あるいは診断プローブ
またはPCRプライマーとして使用され得る。

【００５３】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、および少なくとも
30塩基、そして好ましくは少なくとも50塩基を有するそ
のフラグメントに対して、少なくとも70％の同一性、好
ましくは少なくとも90％、そしてより好ましくは少なく
とも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびに
このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドに関する。

【００５４】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
用語の下に維持される。これらの寄託物は、単に当業者
に対して便宜上提供されるのみであり、そして米国特許
法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけ
ではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、
ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そ
して本明細書中の任意の配列の記載とのいかなる矛盾も
抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売する
ためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実
施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。

【００５５】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するか、または寄託されたcDNAに
よりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナ
ログ、および誘導体に関する。

【００５６】用語「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドま
たは寄託されたcDNAにコードされるポリペプチドをいう
場合は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学
的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により活
性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタン
パク質を包含する。

【００５７】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。

【００５８】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチドのフラ
グメント、誘導体、またはアナログは、(i)１つ以上の
アミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸
残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されたもの
であり、そしてこのような置換アミノ酸残基がその遺伝
コードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれ
ないし、またはそうではないかもしれないもの、あるい
は(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するも
の、あるいは(iii)成熟ポリペプチドがポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）のような別の化合物に融合されているもの、あ
るいは(iv)成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列
の精製のために使用する成熟ポリペプチドに、さらなる
アミノ酸が融合されているものであり得る。このような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中
の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。

【００５９】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。

【００６０】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号
２のポリペプチドと少なくとも70％の類似性（好ましく
は70％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号２の
ポリペプチドおよび一般的に少なくとも30アミノ酸そし
てより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むポリペプ
チドのこのような部分を有するこのようなポリペプチド
の部分と90％の類似性（より好ましくは90％の同一
性）、そしてさらにより好ましくは配列番号２のポリペ
プチドと95％の類似性（さらにより好ましくは95％の同
一性）を有するポリペプチドを含む。

【００６１】当該分野に公知であるように、２つのポリ
ペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配
列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列およびその保
存アミノ酸置換を比較することにより決定される。

【００６２】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。

【００６３】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単
離されている。このようなポリヌクレオチドはベクター
の一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そ
してそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境
の一部ではない点で、なお単離され得る。

【００６４】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するDNAセグメントを意味する；これは、コード
領域に先行する領域および後に続く領域「リーダーおよ
びトレイラー」ならびに個々のコードセグメント（エク
ソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。

【００６５】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。

【００６６】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入、または形質転
換、またはトランスフェクト）される。ベクターは、例
えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態
であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活
性化するか、形質転換体を選択するか、またはhIAP-1遺
伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地に
おいて培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHな
ど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用さ
れた条件であり、そして当業者には明らかである。

【００６７】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれかに含まれ得
る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体D
NA配列、および合成DNA配列を含む。このようなベクタ
ーは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファ
ージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラス
ミドとファージDNAとの組み合わせ由来のベクター；ウ
イルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主
において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任
意のベクターも使用され得る。

【００６８】適切なDNA配列は、種々の手順によりベク
ターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公
知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿
入される。このような手順および他の手順は、当業者の
範囲内であると考えられる。

【００６９】発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現
制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNA
の合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な
例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロ
モーター、E.coli.lacまたはtrp、λファージP_Lプロモ
ーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウ
イルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている
他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のた
めのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含
有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な
配列を含有し得る。

【００７０】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは、E.coliにおける
テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供
する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。

【００７１】本明細書中上記の適切なDNA配列ならびに
適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベク
ターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を
発現させるために用いられ得る。

【００７２】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli、Streptomyc
es、 Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵
母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaS2およびSpodopte
ra Sf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒
色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の
選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると
考えられる。

【００７３】より詳細には、本発明はまた、上記で広範
に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含す
る。この構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベク
ターまたはウイルスベクター）を含み、このベクターの
中に本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されてい
る。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさ
らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、
プロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクターお
よびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販
されている。以下のベクターが例として提供される。細
菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phag
escript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH
16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-
3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核性：pWL
NEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、p
BPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラ
スミドまたはベクターが、それらが宿主において複製可
能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。

【００７４】プロモーター領域は、CAT（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マー
カーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺
伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK2
32-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモー
ターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびtrp
を含む。真核プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミ
ジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイル
ス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを含む。
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当
業者のレベルの範囲内である。

【００７５】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞
（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞
は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の
宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションにより達成され得る
(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,BasicMethods inMolec
ular Biology,(1986))。

【００７６】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。

【００７７】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構
築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質
を産生するために用いられ得る。原核宿主および真核宿
主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現
ベクターは、Sambrookら、MolecularCloning: A Labora
tory Manual、第２版、Cold Spring Harbor,N.Y.,(198
9)（この開示は、本明細書中に参考として援用されてい
る）に記載されている。

【００７８】本発明のポリペプチドをコードするDNAの
高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配
列を挿入することにより増大される。エンハンサーは、
DNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bp
であり、これはプロモーターに作用してその転写を増大
させる。例として、複製起点の後期側bp100〜270のSV40
エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモータ
ーエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハ
ンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられ
る。

【００７９】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.ce
revisiaeのTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転
写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有す
る。このようなプロモーターは、特に、解糖酵素（例え
ば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、
酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコ
ードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳
開始配列および翻訳終止配列と適切な相で組立てられ
る。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、
発現された組換え産物の安定化または簡略化された精
製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質
をコードし得る。

【００８０】細菌での使用に有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、所望の
タンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始
シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望な
らば宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有す
る。形質転換のために適切な原核宿主は、E.coli、Baci
llussubtilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseu
domonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属
内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象とし
て用いられ得る。

【００８１】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含
む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌
の複製起点を含有し得る。このような市販のベクター
は、例えば、pKK223-3(PharmaciaFine Chemicals, Upps
ala, Sweden)およびGEM1(Promega Biotec, Madison, W
I, USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切
なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合
わされる。

【００８２】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。

【００８３】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。

【００８４】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は、当業者に周
知である。

【００８５】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Gluzman, Cell, 23: 175 (1981)によ
り記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適
合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C12
7、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺
乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター
およびエンハンサー、を含有し、そして任意の必要なリ
ボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド
ナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結
配列、および５’フランキング非転写配列もまた含有す
る。SV40スプライスに由来するDNA配列、およびポリア
デニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供
するために使用され得る。

【００８６】このポリペプチドは、以下を包含する方法
により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され
得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオ
ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折り
たたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を
完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程のために
用いられ得る。

【００８７】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞によ
る）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニ
ンアミノ酸残基を含み得る。

【００８８】以下に記載されるhIAP-1ポリペプチドおよ
び阻害性化合物は、本発明に従い、このようなポリペプ
チドをインビボで発現することによって利用され得るポ
リペプチドであり、これは「遺伝子療法」と呼ばれる。

【００８９】従って、例えば、患者からの細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRN
A)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作され
た細胞はポリペプチドで処置される患者に提供される。
このような方法は当該分野で周知であり、本明細書中の
教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明のポリ
ペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラス
ミドベクターの使用により操作され得る。

【００９０】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞は本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレト
ロウイルスプラスミドベクターで形質導入され、その結
果パッケージング細胞は、目的の遺伝子を含む感染性ウ
イルス粒子を産生する。これらの産生細胞は、インビボ
で細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチド
の発現のために患者に投与され得る。このような方法に
よる本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方
法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明
らかであるはずである。

【００９１】本明細書中の上記のレトロウイルスプラス
ミドベクターが誘導され得るレトロウイルスは、モロニ
ーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイ
ルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイ
ルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイ
ルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、脊髄増
殖肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含す
るが、これらに限定されない。１つの実施態様におい
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマ
ウス白血病ウイルスより誘導される。

【００９２】ベクターは、１またはそれ以上のプロモー
ターを含有する。使用され得る適切なプロモーターは、
レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMiller
ら、Biotechniques、第７巻、９号、980-990（1989）に
記載されるヒトサイトメガロウイルス(CMV）プロモータ
ー、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒスト
ン、polIII、およびβ−アクチンプロモーターを包含す
るが、これらに限定しない真核細胞プロモーターのよう
な細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定され
ない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデ
ノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロ
モーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包
含するが、これらに限定されない。適切なプロモーター
の選択は、本明細書中に含まれる技術より当業者にとっ
て明らかである。

【００９３】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに
限定されない：アデノウイルス主要後期プロモーターの
ようなアデノウイルスプロモーター；または、サイトメ
ガロウイルス（CMV）プロモーターのような異種プロモ
ーター；RSウイルス(respiratory syncytial virus)（R
SV）プロモーター；MMTプロモーターのような誘導性プ
ロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロ
モーター；ヒトグロブリンプロモーター；ヘルペス単純
チミジンキナーゼプロモーターのようなウイルス性チミ
ジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明
細書中の上記の修飾したレトロウイルスLTRを包含す
る）；β-アクチンプロモーター；およびヒト増殖ホル
モンプロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチド
をコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであ
り得る。

【００９４】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株を形質導入するために使用され、プ
ロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、
ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、
GP+E-86、GP+envAm12、および本明細書中で全体で参考
として援用されるMiller、HumanGene Therapy, 第１
巻、5-14頁（1990）に記載されるDAN細胞株を包含する
が、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公
知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し
得る。このような手段は、エレクトロポレーション、リ
ポソームの使用、およびCaPO₄沈澱を包含するが、これ
らに限定されない。１つの他の方法においては、レトロ
ウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプセ
ル化され得るか、または脂質と結合し、次いで宿主に投
与され得る。

【００９５】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を包含する感染
性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、この
ようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまた
はインビボのいずれかにおいて真核細胞を形質導入する
ために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリ
ペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発
現する。形質導入され得る真核細胞は、胚幹細胞、胚癌
細胞、および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細
胞、ケラチノサイト、内皮細胞、ならびに気管支の上皮
細胞を包含するが、これらに限定されない。

【００９６】一旦hIAP-1ポリペプチドが細胞内で遺伝子
療法により発現されると、ニューロンの異常なアポトー
シスに起因する神経変性の疾患、例えばアルツハイマー
病およびパーキンソン病を処置するために利用され得
る。

【００９７】hIAP-1はまた、頭部傷害および脳卒中のよ
うな外傷の際、細胞が死ぬのを防ぐために利用され得
る。

【００９８】本発明のhIAP-1タンパク質はまた、関節リ
ウマチを導く異常なアポトーシスを防ぐために利用され
得る。

【００９９】hIAP-1ポリぺプチドはまた、異常なアポト
ーシスから生じる腫瘍形成を防ぐために利用され得る。

【０１００】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合
成、およびDNAベクターの作製に関連するインビトロの
目的に利用する方法が提供される。例えば、遺伝子およ
び遺伝子産物は、ヒトの疾患のための診断的および治療
的処置を発見するための研究道具として、そしてヒトの
アポトーシスのプロセスに光明を投じるために利用され
得る。

【０１０１】全長hIAP-1遺伝子のフラグメントは、cDNA
ライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブ
として、全長hIAP-1遺伝子を単離するため、およびhIAP
-1遺伝子に対して高い配列類似性または類似の生物学的
活性を有する他の遺伝子を単離するために用いられ得
る。プローブは少なくとも20塩基長、好ましくは少なく
とも30塩基長、そして最も好ましくは少なくとも50塩基
長である。プローブはまた、全長の転写物に対応するcD
NAクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領
域、エキソンおよびイントロンを含む完全なhIAP-1遺伝
子を含むゲノムクローンを同定するために用いられ得
る。スクリーニングの一例には、hIAP-1遺伝子のコード
領域を、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための
既知のDNA配列を用いることによって単離することが含
まれる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する
標識されたオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどの
メンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する
ために、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリ
ーをスクリーニングするために用いられる。

【０１０２】本発明はまた、診断薬（diagnostic)とし
てのhIAP-1遺伝子の使用にも関する。hIAP-1の変異体の
検出は、hIAP-1の発現不良から生じる疾患またはその疾
患に対する感受性の診断を可能にする。

【０１０３】ヒトhIAP-1遺伝子に変異を有する個体は、
種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のた
めの核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組
織生検、および剖検物質）より得られ得る。ゲノムDNA
は、検出のために直接使用され得るか、または分析前に
PCRを用いることにより酵素的に増幅され得る（Saiki
ら、Nature、324:163-166(1986)）。RNAあるいはcDNAも
また、同じ目的のために使用され得る。一例として、hI
AP-1をコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、hIA
P-1の変異を同定および分析するのに使用され得る。例
えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較にお
ける増幅された産物のサイズの変化により検出され得
る。点変異は、放射性標識されたhIAP-1RNAまたは、あ
るいは、放射性標識されたhIAP-1 アンチセンスDNA配列
に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせることにより
同定され得る。完全に対合した配列は、RNaseA消化また
は融解温度の差により、ミスマッチした二重らせんと区
別され得る。

【０１０４】参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の違いは、直接DNA配列決定法により明らかにされ
得る。さらに、クローン化されたDNAセグメントは、特
定のDNAセグメントを検出するためのプローブとして利
用され得る。この方法の感度は、PCRと組み合わされた
ときに、非常に増強される。例えば、配列決定プライマ
ーは、二本鎖PCR産物または修飾されたPCRによって産生
された一本鎖鋳型分子とともに用いられる。配列決定
は、放射性標識されたヌクレオチドと共に従来の方法に
より、または蛍光タグ（tag）を用いた自動配列決定手
順により行われる。

【０１０５】DNA配列の相違に基づいた遺伝子試験は、
変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグ
メントの電気泳動的移動度における変化の検出により達
成され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高分離能
ゲル電気泳動により視覚化され得る。異なる配列のDNA
フラグメントは、変性ホルムアミドグラジエントゲル上
で区別され得る。このゲル中で、異なるDNAフラグメン
トの移動度は、それらの特異的な融解温度または部分的
融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中に、遅滞される
（例えば、Myersら、Science、230:1242(1985)を参照の
こと）。

【０１０６】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、RNase保護およびS1保護
または化学的切断法（例えば、Cottonら、PNAS、USA、8
5:4397-4401 (1985)））により示され得る。

【０１０７】従って、特定のDNA配列の検出は、例え
ば、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切
断、直接的なDNA配列決定または制限酵素の使用（例え
ば、制限フラグメント長多型(RFLP)）、およびゲノムDN
Aのサザンブロッティングのような方法により達成され
得る。

【０１０８】より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列
決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析により検
出され得る。

【０１０９】本発明はまた、種々の組織におけるhIAP-1
タンパク質のレベルの変化を検出するための診断アッセ
イに関する。なぜなら、正常なコントロール組織サンプ
ルと比較したこのタンパク質の過剰発現は、異常に高い
アポトーシスに関連する状態の存在を検出し得るからで
ある。宿主に由来するサンプル中のhIAP-1タンパク質の
レベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者
には周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的
結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、および好まし
くはELISAアッセイを含む。ELISAアッセイは、最初にhI
AP-1抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗
体を調製することを包含する。さらに、レポーター抗体
がモノクローナル抗体に対して調製される。このレポー
ター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、
蛍光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ酵素を結合させる。サンプルは、ここで宿主
から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合
する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上
でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意
の遊離のタンパク質結合部位は、BSAのような非特異的
タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆わ
れる。次に、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でイ
ンキュベートされる。この間に、モノクローナル抗体
は、ポリスチレンディッシュに結合された任意のhIAP-1
タンパク質と結合する。全ての非結合モノクローナル抗
体は、緩衝液を用いて洗い出される。西洋ワサビペルオ
キシダーゼと結合したレポーター抗体はここで、ディッ
シュ中に置かれ、hIAP-1と結合した任意のモノクローナ
ル抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる。次い
で、非結合レポーター抗体は、洗い出される。次いで、
ペルオキシダーゼ基質が、ディッシュに加えられ、そし
て所定の時間内の発色量は、標準曲線と比較した場合、
患者サンプルの所定の容量中に存在するhIAP-1タンパク
質の量の測定値である。

【０１１０】競合アッセイが、使用され得る。ここで、
hIAP-1に特異的な抗体は、固体支持体に付着し、そして
標識hIAP-1および宿主由来のサンプルは、固体支持体上
を通過され、そして固体支持体に結合して検出された標
識の量は、サンプル中のhIAP-1の量と相関し得る。

【０１１１】本発明は、hIAP-1によるアポトーシスの阻
害をブロックする化合物を同定するために化合物をスク
リーニングする方法を提供する。例えば、SF-21細胞は
アポトーシスを生じる既知の遺伝子、例えば、vAcAnhま
たはvP35Z由来のアニヒレーター（annihilator）変異DN
Aによってトランスフェクトされる。試験される化合物
およびhIAPは、次いで、細胞内または細胞外のいずれか
で細胞と接触される。次いで調査が、コトランスフェク
ションの３〜４日後に、これらの細胞について光学顕微
鏡下で行われ、そしてアポトーシス細胞の通常の特徴が
検査され、そして化合物のhIAPの作用を阻止する能力が
分析される。

【０１１２】ヒトIAP-1は、細胞内で産生され機能す
る。従って、任意の阻害化合物は細胞内で機能しなけれ
ばならない。これらの化合物は、細胞内で産生される抗
体を含む。例えば、hIAP-1を阻害するとして同定される
抗体は、当該分野で公知の手順、例えば、適切な細胞
を、hIAP-1の機能を阻止する一本鎖抗体をコードするDN
Aで形質転換することによって、一本鎖抗体として細胞
内で産生され得る。

【０１１３】別の例は、アンチセンス技術を用いて調製
されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術
は、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNA
を介した遺伝子発現を制御するために用いられ、これら
の方法は両方とも、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに
結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5’コ
ード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNA
オリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNA
オリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（三重らせん-Leeら、Nuc
l.Acids Res., 6:3073 (1979); Cooneyら、Science, 24
1:456 (1988);およびDervanら、Science,251: 1360 (19
91)を参照のこと）、それにより、hIAP-1の転写および
産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチド
はインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子
のhIAP-1ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチ
センス-Okano、J.Neurochem.,56:560 (1991); Oligodeo
xynucleotides as Antisense Inhibitors ofGene Expre
ssion, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)）。上記の
オリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それに
よって、アンチセンスRNAまたはDNAが、hIAP-1の産生を
阻害するためにインビボで発現され得る。

【０１１４】別の例は、hIAP-1の変異形態、すなわち変
異タンパク質を含み、これはhIAP-1基質を認識するが、
アポトーシスを阻止しないように障害性の機能を有す
る。

【０１１５】別の例は、細胞膜を通過し得、そしてhIAP
-1に結合し、そしてその生物学的活性を阻止する小分子
である。小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分
子を含むが、それらに限定されない。

【０１１６】これらの化合物は、hIAP-1の作用を阻害
し、そして腫瘍を阻止するために利用され得る。なぜな
ら、細胞が適切な時期にアポトーシスを受け損ねると、
腫瘍形成が生ずるからである。

【０１１７】hIAP-1の作用はまた、細胞発達の進行のた
めにこれらの化合物によって阻害され得、アポトーシス
がウイルス感染細胞を死滅させ、そして組織の分化およ
び発達を刺激することを可能にする。これらの化合物は
また、組織ホメオスタシスを維持するために使用され得
る。

【０１１８】これらの化合物は、適切な薬学的キャリア
と組み合わせて使用され得る。このような組成物は治療
有効量の化合物、および薬学的に許容可能なキャリアま
たは賦形剤を包含する。このようなキャリアは、生理食
塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール、およびそれらの組合せを含むが、
これらに限定されない。その処方物は投与の様式に適合
すべきである。

【０１１９】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的
パックまたはキットを提供する。このような容器に関し
て、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売
を統制する政府機関により規定された形式で製品表示さ
れ得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売における機関による認可を表す。さら
に、この化合物は、他の治療化合物と併用して用いられ
得る。

【０１２０】これらの薬学的組成物は、経口、局所、静
脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路
によるような便利な様式で投与され得る。薬学的組成物
は、特定の徴候の処置および／または予防に効果的な量
で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10
μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それら
は１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与され
る。最も多くの場合、投薬量は、１日あたり約10μg/kg
体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが
考慮される。

【０１２１】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際
の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピン
グは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを相関さ
せることにおける重要な第１段階である。

【０１２２】簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプ
ライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより
染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコ
ンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソ
ンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化しない
プライマーを迅速に選択するために使用される。次い
で、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体
細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。
プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドの
みが増幅フラグメントを生じる。

【０１２３】体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、
特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手
順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに
本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントの
パネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプー
ルを用いて部分的位置決定(sublocalization)が達成さ
れ得る。染色体にマップするために同様に使用され得る
他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリ
ダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted)
染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cD
NAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによる前選択を含む。

【０１２４】cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１
工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得
る。この技術は、50または60塩基という短いcDNAを用い
て使用され得る。この技術の総説としては、Vermaら,Hu
man Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Per
gamon Press, New York(1988)を参照のこと。

【０１２５】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置は遺伝子地図の
データと相関され得る。このようなデータは、例えば、
V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man に見出さ
れる(Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library
からオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染
色体領域にマップされる遺伝子と疾患との間の関係が、
連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により
同定される。

【０１２６】次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA
配列またはゲノム配列における差異を決定する必要があ
る。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察され
るが、いかなる正常な個体にも観察されない場合、この
変異は疾患の原因因子でありそうである。

【０１２７】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜
在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベ
ースのマッピング解像度、および20kbあたり１遺伝子と
仮定する。）このポリペプチド、それらのフラグメント
もしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、または
それらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生さ
せるための免疫原として使用され得る。これらの抗体
は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナ
ル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗
体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、また
はFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で
公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生のために使用され得る。

【０１２８】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
ることができる。この動物は、好ましくは非ヒトであ
る。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプ
チド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドの
フラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポ
リペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用さ
れ得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用
され得る。

【０１２９】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(K
ohlerおよびMilstein, 1975, Nature, 256: 495-497)、
トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbo
rら,1983, Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノ
クローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技
術(Coleら, 1985,Monoclonal Antibodies and Cancer T
herapy, Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。

【０１３０】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適応させ
得る。また、トランスジェニック動物が、本発明の免疫
原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使
用され得る。

【０１３１】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部または
量は、他に明記しない限り重量基準である。

【０１３２】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い所定の方法および／または用語が記載
される。

【０１３３】「プラスミド」は、先行する小文字のｐお
よび／またはそれに続く大文字および／または数字によ
り命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販さ
れているか、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラ
スミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そ
して当業者には明らかである。

【０１３４】DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列での
み作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断する
ことをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素
は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因
子、および他の必要条件は当業者に公知のように使用さ
れた。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離
する目的のためには、代表的には５〜50μgのDNAが20〜
250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特
定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製
造者により特定される。37℃での約１時間のインキュベ
ーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリア
クリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメン
トを単離する。

【０１３５】切断フラグメントのサイズ分離は、Goedde
l,D.ら,Nucleic Acids Res.,８: 4057 (1980)により記
載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われ
る。

【０１３６】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化され
ていないフラグメントに連結する。

【０１３７】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていな
ければ、連結は公知の緩衝液および条件で、およそ等モ
ル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10
単位のT4DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成さ
れ得る。

【０１３８】他に記載しない限り、形質転換はGraham,
F.およびVander Eb, A., Virology,52:456-457 (1973)
の方法に記載のように実施された。

【０１３９】

【実施例】（実施例１） （hIAP-1の細菌発現および精製）hIAP-1をコードするDN
A配列（ATCC受託番号第 号）を、プロセシングされ
たhIAP-1遺伝子（−シグナルペプチド配列）の５’およ
び３’末端配列に対応し、そしてhIAP-1遺伝子の３’の
ベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて最初に増幅する。hIAP-1に対応するさらな
るヌクレオチドを、５’および３’配列それぞれに添加
する。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’
GATCGGATCCATGAGTACTGAAGAAGCCAG ３’（配列番号３）
を有し、 BamHI制限酵素部位およびそれに続くプロセシ
ングされたタンパク質の推定の末端アミノ酸から開始す
るhIAP-1コード配列の20ヌクレオチドを含む。３’配列
５’GACTGGATCCTCTTTAAGAGAGAAATGTACG ３’（配列番号
４）は、BamHI部位に相補的な配列を有する。制限酵素
部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen、Inc. 、Chat
sworth、 CA）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、
抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG
調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソー
ム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位を
コードする。次いで、pQE-9をBamHIで消化し、そして脱
リン酸化する。増幅された配列をpQE-9に連結し、そし
てヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフ
レームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E.co
li M15/rep4株 (Qiagen,Inc)をSambrook, J.ら、Molecu
lar Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Labor
atory Press, (1989)に記載の手順により形質転換す
る。M15/rep4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてカ
ナマイシン耐性（Kan^r）をもまた付与するプラスミドpR
EP4の複数のコピーを含有する。形質転換体をLBプレー
ト上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン
／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDN
Aを単離して、そして制限酵素分析により確認する。所
望の構築物を含有するクローンを、Amp（100μg/ml）お
よびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における
液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を用いて
1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、
600の光学密度（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで
増殖させる。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオ
ガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にす
る。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することによっ
てP/Oの解放（clearing）を誘導し、遺伝子発現の増加
を導く。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、
細胞を遠心分離により収集する。この細胞ペレットをカ
オトロピック薬剤6MグアニジンHCl中で可溶化する。明
澄化の後、6-Hisタグ（Hochuli,Eら、J.Chromatography
411:177-184(1984))を含有するタンパク質による緊密な
結合を可能にする条件下でのニッケル-キレート(Nickel
-Chelate)カラムにおけるクロマトグラフィーによっ
て、この溶液から可溶化hIAP-1タンパク質を精製する。
hIAP-1(50％純粋）を6MグアニジンHCl(pH5.0)中でカラ
ムから溶出し、そして再生のために３MグアニジンHCl、
100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元
型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整した。
この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タン
パク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。

【０１４０】（実施例２） （バキュロウイルス発現系を用いるhIAP-1のクローニン
グおよび発現）全長のhIAP-1タンパク質をコードするDN
A配列（ATCC受託番号第 号）を、遺伝子の５’およ
び３’末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて増幅する： ５’プライマーは、配列

【０１４１】

【化１】 を有し、そしてBglII制限酵素部位（太字）、続いて、h
IAP-1遺伝子（翻訳の開始コドン「ATG」は下線が付いて
いる）のすぐ後ろにある真核細胞中での翻訳の開始のた
めの効果的なシグナルに類似する25ヌクレオチド（Koza
k,M., J. Mol.Biol., 196:947-950(1987)）を含む。

【０１４２】３’プライマーは、配列

【０１４３】

【化２】 を有し、そして制限エンドヌクレアーゼBglIIの切断部
位およびhIAP-1遺伝子の３’非翻訳配列に相補的な19ヌ
クレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Gene
clean」BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.）を用いて、１％
アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントを
エンドヌクレアーゼBglIIで消化し、次いで再び１％ア
ガロースゲルにおいて精製する。このフラグメントをF2
と称する。

【０１４４】ベクターpRG1（pVL941ベクターの改変体、
下記）をバキュロウイルス発現系を用いるhIAP-1タンパ
ク質の発現のために用いる（総説について、Summers,M.
D.およびSmith, G.E. 1987, A manual of methods for
baculovirus vectors and insectcell culture procedu
res, Texas Agricultural Experimental Station Bulle
tin No.1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Aut
ographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の
強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エン
ドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイ
ルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリア
デニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択
するために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を
ポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポ
リヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに続ける。
ポリヘドリン配列を、同時トランスフェクト野生型ウイ
ルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列
に両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベク
ターが、pRG1の代わりに用いられ得る（例えば、pAc37
3、pVL941、およびpAcIM1（Luckow,V.A.およびSummers,
M.D.、Virology, 170:31-39))。

【０１４５】プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、そ
して当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファター
ゼを用いて脱リン酸化する。次いで、DNAを市販のキッ
ト（「Geneclean」BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.）を用
いて、１％アガロースゲルから単離する。このベクター
DNAをV2と称する。

【０１４６】フラグメントF2および脱リン酸化プラスミ
ドV2を、T4DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E.
coli HB101細胞を形質転換し、そしてPCRを用いて、hIA
P-1遺伝子を正しい向きに有するプラスミド（pBachIAP-
1）を含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの
配列を、DNA配列決定により確認する。

【０１４７】５μgのプラスミドpBachIAP-1を、リポフ
ェクション法（Felgnerら Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 84:7413-7417 (1987)）を用いて、1.0μgの市販の線
状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TMbaculoviru
s DNA」, Pharmingen, San Diego, CA.）とともに同時
トランスフェクトする。

【０１４８】1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５
μgのプラスミドpBachIAP-1を、50μlの無血清グレース
培地（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）を
含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合す
る。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレ
ース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間イン
キュベートする。次いで、そのトランスフェクション混
合物を、血清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織
培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCCCRL 171
1）に滴下する。プレートを振とうさせ、新たに加えら
れた溶液を混合する。次いでプレートを、27℃で５時間
インキュベートする。５時間後、トランスフェクション
溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を
補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。プレート
をインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を
続ける。

【０１４９】４日後、上清を回収し、そしてSummersお
よびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセ
イを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容
易な単離を可能にする、「BlueGal」（Life Technologi
es Inc., Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用
いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li
feTechnologies Inc.、Gaithersburgにより配布される
昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者
ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。

【０１５０】ウイルスの系列希釈物を細胞に加えた４日
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒
天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチュ
ーブに再懸濁する。寒天を、簡単な遠心分離により除去
し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を用い
て、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させ
る。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、
次いで４℃で保存する。

【０１５１】Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグ
レース培地中で増殖させる。細胞を、感染多重度（MO
I）２で組換えバキュロウイルスV-hIAP-1に感染させ
る。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンお
よびシステインを除いたSF900II培地（Life Technologi
es Inc., Gaithersburg, MD）に置き換える。42時間
後、５μCiの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシス
テイン（Amersham）を添加する。細胞を、さらに16時間
インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集
し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオー
トラジオグラフィーにより可視化する。

【０１５２】（実施例３） （COS細胞における組換えhIAP-1の発現）発現プラスミ
ドhIAP-1 HAは、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invit
rogen）に由来する：１）SV40複製起点、２）アンピシ
リン耐性遺伝子、３）E.coli複製起点、４）ポリリンカ
ー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が
続くCMVプロモーター。hIAP-1前駆体全体およびその
３’末端にインフレームで融合されたHAタグをコードす
るDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域に
クローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現は、
CMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記
載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質
由来のエピトープに対応する（I.Wilson、H. Niman、R.
Heighten、A Cherenson、M. Connolly、およびR. Lern
er、1984, Cell 37,767(1984)）。標的タンパク質へのH
Aタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体での組換
えタンパク質の容易な検出を可能にする。

【０１５３】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：hIAP-1をコードするDNA配列（ATCC受託番号第
号）を、以下の２つのプライマーを用いてPCRにより構
築する：５’プライマー５’ GCAGATCTGCAATGAGTACTGAA
GAAGCC ３’（配列番号７）は、BglII部位とそれに続い
て開始コドンから始まるhIAP-1コード配列の21ヌクレオ
チドを含む；３’配列５’GCAGATCTTCAAGCGTAGTCTGGGAC
GTCGTATGGGTAAGAGAGAAATGTACGAACAGT ３’（配列番号
８）は、BglII部位、翻訳停止コドン、HAタグおよびhIA
P-1コード配列の最後の21ヌクレオチド（停止コドンは
含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物
は、BglII部位、hIAP-1コード配列、続いてインフレー
ムで融合されたHAタグ、HAタグに隣接する翻訳終止停止
コドン、およびBglII部位を含む。PCRで増幅されたDNA
フラグメントをBglIIにより消化し、そしてBamHI制限酵
素で消化したベクターpcDNA1/Ampを連結する。連結混合
物を、E.coli XL-1-Blue株（Stratagene Cloning Syste
ms,La Jolla, CA）に形質転換し、形質転換された培養
物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単
離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分
析により試験する。組換えhIAP-1の発現のために、COS
細胞を、DEAE-DEXTRAN法（J.Sambrook、E. Fritsch、T.
Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
ColdSpring Laboratory Press, (1989)）により発現ベ
クターでトランスフェクトする。hIAP-1 HAタンパク質
の発現を、放射標識および免疫沈降法（E.Harlow, D. L
ane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor LaboratoryPress, (1988)）により検出する。細
胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システイン
で８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細
胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mMNaCl、１％ NP-40、
0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.
5))(Wilson, I.ら、同上37:767 (1984)）で溶解する。
細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクロ
ーナル抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を
15％SDS-PAGEゲルで分析する。

【０１５４】（実施例６） （遺伝子治療を介するhIAP-1の発現）線維芽細胞を皮膚
バイオプシーにより被験体から得る。得られる組織を組
織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小片
を、各フラスコに約10片ずつ、組織培養フラスコの湿っ
た表面上に置く。このフラスコを逆さにし、堅く密封し
て室温で一晩放置する。室温で24時間後、このフラスコ
を逆さにし、そして組織の小片をフラスコの底に固定し
たままで、新鮮な培地（例えば、10％FBS、ペニシリン
およびストレプトマイシン含有Ham’sF12培地）を添加
する。次いで、これを37℃で約１週間インキュベートす
る。このとき、新鮮な培地を添加し、そして続いて、
２、３日毎に培地を交換する。さらなる２週間の培養
後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシ
ン処理し、そしてより大きなフラスコへスケールアップ
する。

【０１５５】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
の側面に配置されるpMV-7(Kirschmeier,P.T.ら、DNA,7:
219-25(1988))を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、そし
て続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。線状化ベク
ターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズ
を用いて精製する。

【０１５６】本発明のポリペプチドをコードするcDNA
を、それぞれ５’および３’末端配列に対応するPCRプ
ライマーを用いて増幅する。５’プライマーはEcoRI部
位を含有し、そして３’プライマーはHindIII部位を含
有する。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状化骨格
とEcoRIおよびHidIIIフラグメントとを、T4DNAリガーゼ
の存在下に共に加える。得られる混合物を２つのフラグ
メントの連結に適切な条件下で維持する。この連結混合
物を用いて細菌HB101を形質転換し、次いで、これを、
ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有すること
を確認する目的のために、カナマイシン含有アガー上に
播種する。

【０１５７】両種性pA317またはGP+am12パッケージング
細胞を、10％ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプ
トマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で
コンフルエントな密度まで組織培養で増殖させる。次い
で、遺伝子を含有するMSVベクターを培地に添加し、そ
してパッケージング細胞をベクターで形質導入する。こ
のパッケージング細胞は、ここより、遺伝子を含有する
感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッケー
ジング細胞をプロデューサー細胞と呼ぶ）。

【０１５８】形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮
な培地を添加し、そして続いて、この培地をコンフルエ
ントなプロデューサー細胞の10cmプレートから回収す
る。感染性ウイルス粒子を含有する消費された培地を、
ミリポアフィルターを通して濾過して分離した（detach
ed）プロデューサー細胞を取り除き、次いでこの培地
を、線維芽細胞を感染させるために使用する。培地を線
維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから取り除
き、そしてプロデューサー細胞由来培地に素早く置き換
える。この培地を除去し、そして新鮮な培地に置き換え
る。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維
芽細胞が感染し、そして選択の必要はない。ウイルス力
価が非常に低い場合、neoまたはhisのような選択マーカ
ーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要があ
る。

【０１５９】次いで、単独でまたはサイトデックス(cyt
odex)３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに
増殖した後のいずれかで、操作された線維芽細胞を宿主
に注入する。この線維芽細胞は、ここで、タンパク質産
物を産生する。

【０１６０】本発明の多数の改変および種々の変化は上
記の教示を考慮すると可能であり、従って、添付の請求
の範囲内にあり、本発明は、特に記載した以外の別の方
法でも実施され得る。

【０１６１】

【表１】

【図面の簡単な説明】

以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして
請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することは意
図されない。

【図１Ａ】図１は、本発明のポリペプチドのcDNA配列、
および対応する推定アミノ酸配列を例示する。ヌクレオ
チドおよびアミノ酸の標準的な略語が用いられている。
配列決定を、373自動DNAシーケンサー（AppliedBiosyst
ems, Inc.）を用いて実施した。

【図１Ｂ】図１は、本発明のポリペプチドのcDNA配列、
および対応する推定アミノ酸配列を例示する。ヌクレオ
チドおよびアミノ酸の標準的な略語が用いられている。
配列決定を、373自動DNAシーケンサー（AppliedBiosyst
ems, Inc.）を用いて実施した。

【図２Ａ】図２は、hIAP-1の、Cp-IAP（アポトーシスの
Cydia pomonella顆粒症ウイルスインヒビター）およびO
p-IAP（アポトーシスのOrgyiapseudotsugata核多角体病
ウイルスインヒビター）とのアミノ酸配列アラインメン
トである。

【図２Ｂ】図２は、hIAP-1の、Cp-IAP（アポトーシスの
Cydia pomonella顆粒症ウイルスインヒビター）およびO
p-IAP（アポトーシスのOrgyiapseudotsugata核多角体病
ウイルスインヒビター）とのアミノ酸配列アラインメン
トである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ウェイ ウ ヒ アメリカ合衆国 メリーランド 21045, コロンビア， フリーストーン コート 6225 (72)発明者 ピーター エル． ハドソン アメリカ合衆国 メリーランド 20874, ジャーマンタウン， ハイストリーム ドライブ 19041 (72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン アメリカ合衆国 メリーランド 20882, レイトンズビル， ローリング ヒル レーン 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 HA17

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって； (a)図１に示すアミノ酸１〜アミノ酸438を含有するポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b)(a) のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そ
   して該ポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポ
   リヌクレオチド；および (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチ
   ドフラグメント、からなる群から選択されるメンバーを
   含む、単離されたポリヌクレオチド。