ES2331441T3 - Dna que codifica dp-75 y un proceso para su uso. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE HIBRIDA CON SEQ ID NO : 6 O FRAGMENTOS DE DICHA SEQ BAJO CONDICIONES SEVERAS O A FRAGMENTOS DE DICHA NUEVA SECUENCIA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN INCLUYE ENSAYOS DIAGNOSTICOS, VECTORES DE EXPRESION, SECUENCIAS DE CONTROL, MOLECULAS ANTISENTIDO, RIBOSOMAS Y CELULAS HUESPED DESTINADAS A EXPRESAR EL POLIPEPTIDO CODIFICADO POR DICHA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. LA INVENCION ADEMAS INCLUYE REIVINDICACIONES DE DICHA SECUENCIA POLIPEPTIDICA CODIFICADA POR DICHAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO.
Description
DNA que codifica DP-75 y un
proceso para su uso.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular. Más específicamente, la presente invención se
refiere a una secuencia de DNA y a la proteína correspondiente.
Una familia de proteínas que se unen a GTP y
proteínas relacionadas ha estado implicada en la tumorigenicidad de
células hiperproliferantes. Estas proteínas incluyen ras,
dbl, ect2, lbc, ost, y TIM. Véanse,
respectivamente, Boguski and McCormick, Nature 366:
643-654 (1993), Ron et al., EMBO J.
7: 2465-2473 (1988); Miki et al.,
Nature 362: 462-465 (1993); Toksoz et
al., Oncogene 9(2): 641-628
(1994); Horii et al., EMBO J 13(20): 4776
(1994); Chan et al., Oncogene 9(4):
1057-1063 (1994). También está incluida en esta
familia la proteína Tiam-1-4786. Esta
proteína ha demostrado modular el potencial invasivo de una célula.
Véase Habets et al., Célula 77:
537-549 (1994); Habets et al., Oncogene
10(7): 1371-1376 (1995); y Gaston et
al., Nature 375: 338-340 (1995).
Tiam-1 también ha sido identificada como un miembro
del una familia de estimuladores de la disociación de GDP
(abreviadamente GDS por la expresión inglesa Guanine
Dinucleotide Stimulators) [GDP = guanine dinucleotide
phosphate]. Estas proteínas activan GTPasas similares a Rho y
similares a Rac. Véase también Hillier et al., EMBL
sequence database zb53605.rl Soares fetal lung NbHL 19W Homo
Sapiens cDNA clone 307281.
La presente invención es un nuevo polinucleótido
aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de
hibridarse con la secuencia DP-75 de la SEQ ID NO:6
o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde
dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia
siguiente: gttctagagc gagaattcag tgtccagagt ttaacatctg ttgtcagtga
ggagtgtttt tatgaaacag agagccacgg aaaatcatag tatgattcaa tccagatatg
ggttaaattc ctcattttac ttttaaactg gtggtaaagt ggaaattgca. La
invención también incluye valoraciones de diagnóstico, vectores de
expresión, secuencias de control, moléculas antisentido, ribozimas,
y células hospedantes para expresar el polipéptido codificado por
la secuencia de ácido nucleico. La presente invención también
incluye reivindicaciones dirigidas al polipéptido codificado por
las secuencias de ácidos nucleicos, en donde dicho polipéptido
exhibe al menos 20% de la actividad biológica del polipéptido
codificado por la SEQ ID NO:6.
La presente invención también se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden al menos 15 a 40 unidades
monómeras (meros) de oligonucleótidos antisentido capaces de
hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al
50% y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona:
- Un método para detectar células
hiperproliferantes en una muestra que comprende:
- (a)
- proporcionar un sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;
- (b)
- poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra bajo condiciones que permitan la formación de híbridos del polinucleótido; y
- (c)
- detectar los híbridos.
- Una composición que comprende el polipéptido
antes descrito y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
- Un proceso para producir el polipéptido antes
descrito que comprende:
- (a)
- proporcionar la célula hospedante antes descrita; y
- (b)
- cultivar dicha célula hospedante bajo condiciones que inducen la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
- Un vector antisentido que comprende (i) un
polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de
hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia formamida al 50%;
y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de
iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.
- Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1
a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho
polinucleótido es además capaz de escindir mRNA que codifica un
polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6. o que varía de la
secuencia del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6 en menos
de 20 aminoácidos.
- Un vector de ribozima que comprende:
- (i)
- una secuencia del polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y
- (ii)
- un polinucleótido que comprende a secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,
en donde dicho polinucleótido es además capaz de
escindir dicho polinucleótido de (i).
- Una composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz del polinucleótido descrito anteriormente y un
agente capaz de aumentar la absorción del polinucleótido.
- Un anticuerpo aislado que se une
específicamente al polipéptido descrito anteriormente.
- Uso de:
el vector antisentido antes descrito, el vector
de ribozima o el anticuerpo en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de tumores.
- Un método para detectar polipéptidos de
DP-75 en una muestra que comprende:
- (a)
- proporcionar el anticuerpo antes descrito;
- (b)
- poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo/antígeno; y
- (c)
- detectar los complejos.
La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo
de transferencia de mancha, en donde DP-75 se
hibridó con RNA procedente de tejido tanto canceroso como normal.
La fuente de tejido canceroso incluyó material renal, del tiroides,
de mama, de colon, y de la uretra.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo
de transferencia de mancha, en donde DP-75 se
hibridó con RNA procedente tanto de tejido canceroso como normal.
La fuente de tejido canceroso incluyó tejido de pulmón, nariz,
estómago, esófago, hígado, linfoma, útero, vejiga, recto, y
cerebro.
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular, microbiología y tecnología de DNA recombinante
que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.
Dichas técnicas están completamente explicadas en la literatura
científica. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al .,
MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989);
DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N. Glover ed. 1985);
OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC
ACID HYBRIDIZATION (B.D: Hames & S. J. Higgins eds. 1984);
TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (BD. Hames & S. J. Higgins
eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (RI. Freshney ed. 1986);
IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL. Press, 1986); B. Perbal,
A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series,
METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE
TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and M.P. Calos
eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in
Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu,
eds., respectivamente), Mayer and Walker, eds. (1987),
IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY
(Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION:
PRINCIPLES AND PRACTICE, Second Edition
(Springer-Wring, N.Y.), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL
IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M. Weir and C. C.
Blackwell eds 1986); and VACCINES (R. W. Ellis, ed., 1992,
Butterworth-Heinemann, London).
En la presente memoria se usan las abreviaturas
estándares para nucleótidos y aminoácidos.
"Homología" se refiere al grado de
similitud entre x e y. La correspondencia entre la secuencia de una
forma y otra puede ser determinada por métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, las homologías pueden determinarse por una
comparación directa de la información de secuencia del
polinucleótido. Típicamente, dos secuencias, ya sean polinucleótido
o polipéptido, son homólogas si las secuencias exhiben al menos 45%
de identidad de secuencias; más típicamente, 50% de identidad de
secuencias; más típicamente, 55% de identidad de secuencias; más
típicamente, 60% identidad de secuencias; más típicamente, 65% de
identidad de secuencias; incluso más típicamente, 70% de identidad
de secuencias. Usualmente, dos secuencias son homólogas si las
secuencias exhiben al menos 75% de identidad de secuencias; más
usualmente, 80% de identidad de secuencias; incluso más usualmente,
85% de identidad de secuencias; incluso más usualmente, 90% de
identidad de secuencias; e incluso más usualmente, 95% de identidad
de secuencias.
Alternativamente, la homología puede ser
determinada por hibridación de los polinucleótidos en condiciones
que forman dúplex estables entre regiones homólogas. Los dúplex
estables son aquellos, por ejemplo, que podrían resistir la
digestión con nucleasa(s) específica(s)
monocatenaria(s), tales como S_{1}. Dichas dúplex pueden
ser analizadas por diversos métodos, tales como determinación del
tamaño de los fragmentos digeridos.
"Hibridación" se refiere a la asociación de
dos secuencias de ácidos nucleicos una con la otra mediante enlace
por puentes de hidrógeno. Típicamente, una secuencia estará fijada
en un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Luego, las
dos secuencias se pondrán en contacto una con la otra en condiciones
que favorezcan la unión por puentes de hidrógeno. Los factores que
afectan esta unión incluyen: el tipo y volumen del disolvente; la
temperatura de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación; los
agentes que bloquean la unión no específica de la secuencia de la
fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la
concentración de las secuencias; el uso de compuestos para aumentar
la velocidad de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o
polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado
que siguen a la hibridación. Véase Sambrook, et al .,
MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989),
Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a
9.57.
9.57.
"Rigurosidad" se refiere a las condiciones
en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de
secuencias muy similares sobre secuencias que difieren. Por
ejemplo, la combinación de temperatura y concentración de sal se
debe elegir que sea de aproximadamente 12º a 20ºC por debajo de la
calculada del híbrido en estudio. La temperatura y las condiciones
de la sal pueden ser determinadas empíricamente en experimentos
preliminares en los que se hibridan muestras de DNA genómico
inmovilizadas en filtros con la secuencia de interés y lavando
luego bajo condiciones de rigurosidades diferentes. Véase Sambrook,
et al., antes citado en la página 9.50.
Las variables a considerar cuando se realice,
por ejemplo, una transferencia Southern son: (1) la complejidad del
DNA que se transfiere y (2) la homología entre la sonda y las
secuencias que se detectan. La cantidad total del (de los) los
fragmento(s) a estudiar puede variar en un orden de magnitud
de 10, desde 0,1 a 1 \mug para un producto de digestión de
plásmido o de fago hasta 10^{-9} a 10^{-8} \mug para un gen de
una sola copia en un genoma eucariótico altamente complejo. Para
los polinucleótidos de complejidad inferior, sustancialmente más
cortos, pueden ser usados hibridación, y tiempos de exposición más
cortos, una cantidad más pequeña de polinucleótidos de partida, y
menor actividad específica de las sondas. Por ejemplo, puede
detectarse un gen de levadura de una sola copia con un tiempo de
exposición de solamente 1 hora partiendo de 1 \mug de DNA de
levadura, transferencia durante dos horas e hibridación durante 4 a
8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de
mamífero de una sola copia el enfoque conservador empezaría con 10
\mug de DNA, transferencia durante una noche, e hibridación
durante una noche en presencia de sulfato de dextrano al 10% usando
una sonda de más de 10^{8} cpm/\mug, que da como resultado un
tiempo de exposición de \sim24 horas.
Varios factores pueden afectar a la temperatura
de fusión (Tm) de un híbrido DNA-DNA entre la sonda
y el fragmento de interés, y en consecuencia, las condiciones
apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos casos la
sonda no es 100% homóloga con el fragmento. Otras variables
comúnmente encontradas incluyen la longitud y el contenido total de
G+C de las secuencias hibridantes y la fuerza iónica y el contenido
de formamida del tampón de hibridación. Los efectos de todos estos
factores pueden ser representados de modo aproximado para la
sencilla ecuación siguiente:
Tm = 81 +
16,6(log10C_{i}) + 0,4(%G + C)]-0,6(% de
formamida) - 600/n-1,5(% de
desapareamiento).
Donde C_{i} es la concentración de sal (iones
monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases
(ligeramente modificada por Meinkoth y Wahl, (1984) Anal.
Biochem. 138: 267-284).
Al diseñar un experimento de hibridación pueden
ser convenientemente alterados algunos factores que afectan a los
ácidos nucleicos. La temperatura de la hibridación y los lavados y
la concentración de sal durante los lavados son los más sencillos
de ajustar. A medida que aumenta la temperatura de la hibridación
(es decir, la rigurosidad), llega a ser menos probable que ocurra
la hibridación entre cadenas que no son homólogas y como resultado
disminuye la señal de fondo. Si la sonda radiomarcada no es
completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (como sucede
frecuentemente en el caso de una familia de genes y en experimentos
de hibridación entre especies), la temperatura de hibridación debe
ser reducida, y aumentará la señal de fondo. La temperatura de los
lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado
de la señal de fondo de una manera similar. La rigurosidad de los
lavados también se aumenta con concentraciones decrecientes de
sal.
En general, las temperaturas de hibridación
convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una
sonda que es 95% a 100% homóloga al fragmento diana, 37ºC para una
sonda que es 90% a 95% homóloga, y 32ºC una sonda que es 85% a 90%
homóloga. Para homologías inferiores, el contenido de formamida debe
ser disminuido y la temperatura ajustarse consiguientemente, usando
la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento
no es conocida, el enfoque más sencillo es empezar con tanto
hibridación como condiciones de lavado que no sean rigurosas. Si se
observan bandas no específicas o una alta señal de fondo después de
la auto-radiografía, el filtro puede ser lavado con
alta rigurosidad y re-expuesto. Si el tiempo
requerido para la exposición hace que este método no sea práctico,
deben ensayarse en paralelo diversas hibridaciones y/o
rigurosidades de lavado.
Los polipéptidos y los polinucleótidos naturales
de DP-75 se refieren a las proteínas y ácidos
nucleicos respectivamente que se presentan en la naturaleza. La
secuencia de aminoácidos de los polipéptidos naturales comprenderá
una secuencia que varía ligeramente; típicamente, menos que en
10-20 aminoácidos codificadas en las SEQ ID NO: 6 o
la SEQ ID NO:1.
Un "vector" o "plásmido" es una
secuencia de ácido nucleico a la cual está unido otro segmento de
polinucleótido, de modo que lleva a cabo la replicación y/o la
expresión de segmento unido.
"PCR" se refiere a la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa como se describe en el trabajo de Saiki,
et al., Nature 324:163 (1986); y Scharf et al.,
Science (1986) 233:1076-1078; y en las
patentes de EE.UU. Nº 4.683.195; y EE.UU. 4.683.202.
"Secuencia de control" se refiere a
secuencias de polinucleótidos que facilitan la expresión de
secuencias codificadoras a las que están unidas. La naturaleza de
dichas de control secuencias difiere dependiendo de organismo
hospedante; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de
control incluyen, por ejemplo, promotores y secuencias terminadoras
de la transcripción. La expresión "secuencias de control" está
destinada a incluir, como mínimo, todos los componentes cuya
presencia es facilitar la expresión, tal como, por ejemplo, las
reacciones implicadas en la transcripción y la traducción. La
secuencia de control también puede incluir componentes adicionales
cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias delanteras
(líderes) y secuencias de compañeros de fusión.
"Unido operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en donde los componentes así descritos se encuentran
en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida.
Una secuencia de control está "unida operativamente" a una
secuencia codificadora de modo que se consigue la expresión de la
secuencia codificadora en condiciones compatibles con las
secuencias de control.
Las expresiones "polinucleótido" o
"secuencia de ácido nucleico" tal como se usan en la presente
memoria se refiere a un polímero de nucleótidos de cualquier
longitud, preferiblemente desoxirribonucleótidos; y se usan
intercambiablemente en la presente memoria con las expresiones
"oligonucleótido" y "oligómero". Las expresiones se
refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto,
esta expresión incluye DNA monocatenario y bicatenario, así como
polinucleótidos antisentido. También incluye tipos conocidos de
modificaciones, por ejemplo, la presencia de marcadores que son
conocidos en la técnica, tales como metilación, "huecos" de
extremos, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se
presentan en la naturaleza con un análogo, modificaciones
internucleótidos tales como, por ejemplo, reemplazamiento con
ciertos tipos de enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de
metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) o enlaces
cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.),
introducción de restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas
(incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal,
poli-L-lisina, etc.), intercaladores
(por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo,
metales, especies radioactivas, boro, restos oxidantes, etc.),
agentes alquilantes (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anómeros
etc.).
Por "genómica" se quiere significar una
colección o genoteca de moléculas de DNA que corresponden a la
secuencia encontrada en el DNA cromosómico en oposición a mRNA
empalmado. Por "cDNA" se quiere significar una secuencia de
DNA que se hibrida a una cadena de mRNA complementario.
Tal como se usa en la presente memoria, x es
"heterólogo" con respecto a y si x no está asociado
naturalmente con y de manera idéntica; es decir, x no está asociado
con y en la naturaleza o x no está asociado con y del mismo modo
que se encuentra en la naturaleza.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "proteína" o "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica
del producto; por tanto, los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos,
proteínas, y poliproteínas, así como los fragmentos de estos, están
incluidos dentro de esta definición. Este término tampoco se
refiere a, o excluye, las modificaciones
pos-expresión de la proteína, por ejemplo,
glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Están
incluidos dentro de esta definición, por ejemplo, las proteínas que
contiene uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por
ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), proteínas con enlaces
sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica,
tanto como las que se presentan en la naturaleza como las que no se
presentan.
Una secuencia de polipéptido o proteína o
aminoácido secuencia "derivada de" o "codificada por" una
secuencia de ácido nucleico designada se refiere a un polipéptido
que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un
polipéptido codificado en la secuencia, o una de sus porciones, en
donde la porción consiste en al menos 3-5
aminoácidos consecutivos, y más preferiblemente al menos
8-10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al
menos 11-15 aminoácidos, o que es inmunológicamente
identificable con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta
terminología también incluye un polipéptido expresado por una
secuencia diseñada de ácido nucleico.
"Células hospedantes recombinantes",
"células hospedantes""células""cultivos de células"
y otros dichos términos, por ejemplo, microorganismos, células de
insectos, y células de mamífero, que pueden ser, o haber sido,
usadas como recipientes para un vector recombinante u otro DNA de
transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha
sido transformada. Ha de entenderse que la progenie de una célula
parental puede no ser necesariamente idéntica en morfología o en
complemento de DNA genómico o total a la célula parental original,
debido a una mutación natural, accidental o deliberada.
"Línea celular" se refiere a una población
de células capaces de crecimiento prolongado o continuo y división
in vitro. Frecuentemente, las líneas celulares son
poblaciones clonales derivadas de una sola célula progenitora. Se
sabe además en la técnica que pueden ocurrir cambios espontáneos o
inducidos en el cariotipo durante la conservación o transferencia
de dichas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas
de la línea celular referida pueden no ser precisamente idénticas a
las células ancestrales o cultivos, y se hace referencia a la línea
celular para incluir dichas variantes. La expresión "líneas
celulares" también incluye células inmortalizadas.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "microorganismo" incluye especies microbianas
procariotas y eucariotas, tales como bacterias y hongos, incluyendo
estos últimos levaduras y hongos filamentosos.
"Transformación", como se usa en la
presente memoria, se refiere a la inserción of un polinucleótido
exógeno en una célula hospedante, independientemente del método
usado para la inserción, por ejemplo, la absorción directa, mediada
por partículas, transducción, factor de apareamiento o
electroporación. El polinucleótido exógeno puede ser mantenido como
un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente,
puede ser integrado en el genoma del hospedante. Ejemplos de
transducción mediada por partículas se muestran en las patentes de
EE.UU 4.945.050 y 5.149.655.
"Purificado" y "aislado" significan,
cuando se ha ce referencia a un polipéptido o secuencia de
nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia
sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El
término "purificado" como se usa en la presente memoria
preferiblemente significa al menos 75% en peso, más preferiblemente
al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en
peso, y más preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas
biológicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presentes
agua, tampones, y otras pequeñas moléculas, especialmente moléculas
que tienen un peso molecular menor que 1000).
"Cantidad supresora del crecimiento" de
oligonucleótido antisentido de DP-75, por ejemplo,
se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar,
mejorar o impedir el cáncer. La cantidad es suficiente para exhibir
efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede incluir,
por ejemplo, reducción en el crecimiento de células anormales,
tales como células cancerosas; muerte de células cancerosas; o
reducción en presencia de antígenos o marcadores de cáncer. Los
efectos terapéuticos también incluyen la reducción de
manifestaciones o síntomas en pacientes. La cantidad eficaz precisa
para un sujeto dependerá de tamaño del sujeto y su salud, la
naturaleza y extensión de su estado cardiovascular, y los
tratamientos terapéuticos o combinaciones de tratamientos
terapéuticos seleccionados para la administración. Por tanto, no es
útil especificar de antemano una cantidad exacta. Sin embargo, la
cantidad eficaz para una situación dada puede ser determinada por
experimentación habitual y está dentro del buen juicio del médico
clínico.
La expresión "farmacéuticamente aceptable"
se refiere a compuestos y composiciones que pueden ser administradas
a mamíferos sin una toxicidad indebida. Las sales farmacéuticamente
aceptables ilustrativas incluyen sales con ácidos minerales, tales
como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares,
y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos,
malonatos, benzoatos y similares.
DP-75 es una nueva secuencia de
DNA y aminoácidos que tiene homología de secuencia con otras
secuencias que han sido identificadas en ciertos cánceres. Por
ejemplo, la presente secuencia de ácido nucleico
DP-75 es parcialmente homóloga a una secuencia de
ácido nucleico identificada como Tiam-1, véase
Habets et al., Cell 77:537-749
(1994), y Habets et al., Oncogene
10:1371-1375 (1995). La sobreexpresión de las formas
de longitud complete o truncada de Tiam-1 aumenta
el potencial metastásico de las células de linfoma en ratones.
Tiam-1 es un miembro de la familia de los
estimuladores de la disociación de GDP que son proteínas que activan
GTPasas similares a Rho y similares a Rac. Las GDS
así como Rho y Rac tienen potencial oncógeno.
Para valorar la capacidad de
DP-75 para inducir la invasividad celular, puede
seguirse el método de Habets et al., Cell
77:537-749 (1994). Por ejemplo, las células pueden
ser transformadas con DP-75 y los clones pueden ser
administrados a animales experimentales, es decir, ratones atímicos.
Véase las páginas 537 y 538 del trabajo de Habets et al.
Se considera que la secuencia de DNA de
DP-75, o su complemento, serán útiles en ensayos de
diagnóstico, vectores de expresión, secuencias de control,
moléculas antisentido, ribozimas, y células hospedantes para
expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácido
nucleico. La secuencia de aminoácidos de DP-75 puede
ser usada en una valoración para escrutar inhibidores
(preferiblemente moléculas pequeñas) de la capacidad de
DP-75 para facilitar el intercambio
GDP-GTP. Véase Michiels et al.,
Nature, 375:338-3411(1995) para una
valoración apropiada. Por ejemplo, esta valoración podría implicar
el uso de la proteína DP-75 que podría ser incubada
con Rho o Rac junto con la cual se cargó con GDP tritiado.
DP-75 debe liberar GDP a menos que un compuesto
inhiba dicha liberación. Esta inhibición podría ser medida de la
misma manera que en el trabajo de Michiels et al.
Se ha encontrado que DP-75 es expresada
en el corazón normal, el cerebro, y en la musculatura del esqueleto,
como se muestra más adelante. El tamaño del mensaje (RNA) fue
mayoritariamente 3 Kb para tejido del cerebro, y pareció que era 6
Kb en el tejido del corazón y de la musculatura del esqueleto. Una
mirada más completa a los tejidos de las diferentes regiones del
cerebro muestra que el polo occipital, el lóbulo frontal, el lóbulo
temporal y el putamen contenían un mensaje de 3 Kb, pero que el
cerebelo contenía un mensaje de 7,7 Kb. Por consiguiente, parece
que puede haber versiones diferencialmente empalmadas de
DP-75 en diversos tejidos del cuerpo.
DP-75 tiene algo de homología
con Tiam-1, una proteína implicada como modulador de
la invasividad de las células tumorales. Tiam-1 es
un estimulador de la disociación de los GDP (GDS). Es una proteína
citosólica que afecta a la invasividad de las células T de linfomas
y comparte dominios (homólogo Dbl y homóloga Pleckstrin) con
proteínas que modulan la actividad de las proteínas similares a
Rho y similares a Rac. Dichas proteínas Dichas
proteínas similares a Rho y similares a Rac han estado
implicadas en las vías de transducción de señales que regulan las
estructuras del citoesqueleto (esqueleto celular). Además, las GDS
modulan la actividad de pequeñas moléculas de GTPasa que son
importantes en la señalización celular, la regulación, la secreción,
el tamaño, la forma, la adhesión, la motilidad y el crecimiento,
entre otras actividades.
Una molécula que es un paradigma para estas
pequeñas GTPasas es Ras, que ha sido estudiada extensivamente
y tipifica una superfamilia de proteínas relacionadas, tales como
las subfamilias rac, rho y rab. Véase Boguski y
McCormick, (1993), Nature, 366:643-654. Véase
también Fanti et al., Annu. Rev. Biochem. (1993)
62:453-481 para información sobre señalización por
el receptor de las tirosina-quinasas, tal como
p21ras.
El ras activado se ha encontrado en el
20% de los cánceres, y el 100% de los cánceres pancreáticos.
Ras está unido normalmente a GTP como molécula inactiva, sin
embargo, puede ser activada cuando el GTP es escindido para forma
GDP. Estos factores de intercambio contienen típicamente los
dominios homólogos Dbl y de Pleckstrin que son útiles en escindir
el GTP a GDP. Se cree que DP 75 puede ser importante en todas
aquellas zonas en las que estas moléculas reguladoras hayan
mostrado utilidad.
Como se ha indicado antes, estas GDS están
implicadas en diversos cánceres y se cree que DP-75
puede ser útil para diagnosticar células cancerosas. Se pueden usar
muchas técnicas para diagnosticar tanto muestras de tejidos como
personas que poseen tejido tumoral que contiene
DP-75. Por ejemplo, la transcripción inversa y la
amplificación por PCR del RNA de una muestra de tumor para
identificar las presencia de secuencias de mRNA de
DP-75 (véase Sambrook, et al., MOLECULAR
CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), capítulo 14
o Gaugler et al., J. Exp. Med. (1994)
179:921-930). También pueden utilizarse técnicas
inmunohisquímicas o ensayos ELISA para identificar tumores que
expresan DP-75. Por ejemplo, la proteína
DP-75 puede ser expresada recombinantemente y luego
pueden prepararse anticuerpos monoclonales de acuerdo con métodos
que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos mostrados
en la patente europea 174.204, y en el trabajo de Kohler y Milstein,
Nature (1975) 256:495-497, Fong et
al., J. Immnun. Meth. (1984) 70:83-90, y
las patentes GB 2.086.937, 2.113.715, EP 57.107, 62.409, EP
118.893, EP 124.301 y EP 131.878 son adecuados para la
presente invención. Los anticuerpos monoclonales
anti-DP-75 pueden usarse luego en
ensayos estándares citados anteriormente o en otros ensayos que
son conocidos por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
usar terapéuticamente. Los anticuerpos monoclonales
anti-DP-75 pueden ser administrados
por medios conocidos en la técnica. Preferiblemente, los anticuerpos
se administran por vía parenteral o subcutánea, más
preferiblemente, se administran por vía intravenosa. Los anticuerpos
monoclonales pueden ser administrados en combinación con otros
agentes diseñados para promover la actividad de los anticuerpos o
para tratar el estado subyacente que implica las células que
expresan DP-75.
Adicionalmente, pueden realizarse ensayos con
DNA ramificados para detectar DNA de DP-75 como se
muestra en la patente de EE.UU. 5.124.246 y 4.868.105. Las
moléculas de sonda para ácidos nucleicos de DP-75
para ensayar el DNA ramificado tienen preferiblemente una longitud
de 10 a 50 bases, más preferiblemente, un longitud entre 15 y 40
bases, más preferiblemente, una longitud entre 20 y 30 bases.
La ribozimas pueden ser diseñadas para actuar
sobre la secuencia de DP-75 secuencia identificada
en la SEQ ID NO:6 o sus fragmentos. Por ejemplo,
Kashani-Cabet y Scanlon revisaron el estado de la
técnica en Cancer Gene Therapy, (1995)
2:213-223. Los autores analizan la bioquímica de las
ribozimas con forma de cabeza de martillo y de horquilla y estudian
su papel o función en la terapia génica, VIH y cáncer.
Una ribozima puede ser diseñada para actuar
sobre la secuencia de DP-75 cortándola en sitios
particulares. Por ejemplo, la Fig. 1 del texto de
Kashani-Cabet muestra la estructura de una ribozima
de forma cabeza de martillo y las instrucciones para diseñar estas
ribozimas contra cualquier gen. Por consiguiente, de acuerdo con la
Fig. 1 del texto de Kashani-Cabet, muestra que tiene
tres hélices, y una estructura de bucle de tallo, así como
la zona de unión. Los autores citados describen además métodos para
la administración intracelular de una ribozima de interés, usando
técnicas tales como suministro de ribozima "desnuda",
liposomas, y modificaciones químicas para la ribozima.
Kashani-Cabet también analizan
ribozimas en forma de horquilla que tiene cuatro regiones
helicoidales y dos estructuras de bucle. Los autores establecen que
hay secuencias de nucleótidos esenciales en algunas de estas
estructuras. Adicionalmente, la expresión de ribozimas celulares
puede ser útil para proporcionar las ribozimas a su sustrato, sin
su degradación.
Para obtener la expresión celular, el gen de la
ribozima se clonó en un vector disponible y se transfectó en las
células elegidas. Pueden elegirse diferentes vectores basándose en
la célula diana que se ha de infectar. Por ejemplo, las células
respiratorias pueden ser dianizadas por un vector constituido por un
virus adeno o adeno asociado (AAV). En estos vectores pueden
insertarse promotores adecuados para asegurar la expresión
regulable. (Véase Kashani-Cabet en la página
216).
Se pueden desarrollar moléculas antisentido
basándose en la secuencia de DP-75 mostrada en la
SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6. Véase, por ejemplo, las patentes de
EE.UU. Nº 5.491.133 y 5.271.941
Las secuencias de RNA antisentido se han
descrito como inhibidores biológicos, que se presentan en la
naturaleza, de la expresión de genes tanto en procariotas (Mizuno,
T., Chou, M-Y, e Inouye, M. (1984), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81, (1966-1970)) como
eucariotas (Heywood, S. M. Nucleic Acids Res., 14,
6771-6772 (1986) y estas secuencias funcionan
presumiblemente hibridándose con las secuencias de mRNA
complementario, dando como resultados que la hibridación detiene la
traducción (Paterson, B. M., Roberts, B. E., y Kuff E. L., (1977)
Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 74,
4370-4374.
Los oligodesoxinucleótidos antisentido son
secuencias cortas de nucleótidos formuladas para ser complementarias
de un gen o RNA mensajero específico. A través de la unión de estos
oligómeros a una secuencia de DNA o mRNA diana pueden ser
selectivamente bloqueadas la transcripción o la traducción del gen y
puede ser detenido el proceso morboso generado por dicho gen. La
localización citoplásmica del mRNA proporciona una diana que se
considera fácilmente accesible a los oligodesoxinucleótidos
antisentido que entran en la célula; por tanto mucho del trabajo de
campo se ha enfocado al RNA como diana.
Usualmente, el uso de oligodesoxinucleótidos
antisentido proporciona una herramienta útil para explorar la
regulación de la expresión de genes in vitro y en cultivo de
tejidos (Rothenberg, M. et al, (1989) J. Natl. Cancer
Inst., 81:1539-1544).
La terapia con oligonucleótidos antisentidos es
la administración de oligonucleótidos que se unen un polinucleótido
localizado dentro de las células. Estos oligonucleótidos son
generalmente exógenos, pero pueden ser expresados endógenamente. El
término "antisentido" se refiere al hecho de que dichos
oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares,
por ejemplo, DP-75. Véase, por ejemplo, Jack Cohen,
OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene
Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis
1:1-5 (1988).
Los oligonucleótidos antisentido de la presente
invención incluyen derivados tales como
S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o
S-oligos, véase, Jack Cohen, supra) que
exhiben una acción inhibidora mejorada del crecimiento de células
cancerosas. Estos oligonucleótidos antisentido pueden ser RNA o DNA
que son complementarios al genoma de DP-75 y se
hibridan establemente con el mismo o el mRNA correspondiente. El uso
de de un oligonucleótido complementario a esta región permite la
hibridación selectiva con el mRNA de DP-75 y no con
otros mRNA.
Preferiblemente, los oligonucleótidos
antisentido de DP-75 son un fragmento de 15 a 40
meros de la molécula de DNA antisentido que se hibrida con el
mRNA de DP-75. Alternativamente, el oligonucleótido
antisentido de DP-75 es un oligonucleótido de 20 a
30 meros que es complementario con una región de
DP-75. Se describen en la presente memoria
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de al
menos uno de los oligonucleótidos antisentido de
DP-75, descritos en la presente memoria, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede
utilizarse un solo oligonucleótido antisentido de
DP-75. Además pueden utilizarse dos oligonucleótidos
antisentido de DP-75 que sean complementarios a las
regiones adyacentes de DP-75.
La administración de dos oligonucleótidos
antisentido de DP-75 que sean complementarios a las
regiones adyacentes del genoma de DP-75 o un mRNA
correspondiente puede permitir una inhibición más eficaz de la
transcripción genómica de DP 75 o la traducción del mRNA, dando
como resultado una inhibición más eficaz del crecimiento de las
células cancerosas. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido
de DP-75 se administra conjuntamente con una agente
que mejora la absorción por las células de la molécula antisentido.
Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido de
DP-75 puede ser combinado con un compuesto catiónico
lipófilo que puede estar en la forma de liposomas.
El uso de liposomas para introducir nucleótidos
en células se enseña, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº
4.897.355 y 4.394.448. Véanse también las patentes de EE.UU.
4.235.871, 4.231.877, 4.224.179, 4.753.788, 4.673.567, 4.247.411,
4.814.270 para métodos generales de preparar liposomas que
comprenden materiales biológicos. Alternativamente, el
oligonucleótido antisentido de DP-75 puede ser
combinado con un vehículo lipófilo, tal como uno cualquiera de
cierto número de esteroles que incluyen colesterol, colato y ácido
desoxicólico. Un esterol preferido es el colesterol. Además, el
oligonucleótido antisentido de DP-75 puede estar
conjugado con un péptido que es ingerido por las células. Ejemplos
de péptidos útiles incluyen hormonas peptídicas, antígenos o
anticuerpos, y toxinas peptídicas. Eligiendo un péptido que sea
absorbido selectivamente por las células neoplásticas puede
efectuarse una administración específica del agente antisentido.
El oligonucleótido antisentido de
DP-75 puede ser unido covalentemente vía el grupo
5'H por formación de un derivado de aminoalquilo activado. El
péptido de elección puede ser unido covalentemente luego al
oligonucleótido antisentido de DP-75 activado vía
un reactivo hetero-bifuncional de amino y
sulfhidrilo. Este último se une a un residuo de cisteína presente
en el péptido. Por exposición de las células al oligonucleótido
antisentido de DP-75 unido al péptido, el agente
antisentido de peptidilo es sometido a endocitosis y el
oligonucleótido antisentido de DP-75 se une al mRNA
de DP-75 diana inhibiendo la traducción. Véase la
publicación de solicitud de patente PCT PCT/US89/02363.1
Los oligonucleótidos antisentido de
DP-75 y las composiciones farmacéuticas de la
presente invención pueden ser administrados por cualquier medio
para conseguir el fin pretendido. Por ejemplo, la administración de
los compuestos antisentido u otros compuestos de la presente
invención puede ser por las vías parenteral, subcutánea,
intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o transdérmica.
La dosis administrada será dependiente de la
edad, salud, y peso del paciente receptor, la clase de tratamiento
concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento, y la
naturaleza del efecto deseado. Las composiciones dentro del alcance
de esta invención incluyen todas las composiciones en donde el
oligonucleótido antisentido de DP-75 está contenido
en una cantidad de que es eficaz para conseguir la inhibición de la
proliferación y/o estimular la diferenciación de las células
cancerosas objetos.
Aunque varían las necesidades individuales, la
determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de
cada componente está dentro de la experiencia de la técnica.
Típicamente, el oligonucleótido antisentido de
DP-75 puede ser administrado a mamíferos, por
ejemplo, seres humanos, a una dosis de 0,005 a 1 mg/kg de peso
corporal/día, o una cantidad equivalente de una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, del mamífero que se somete a
tratamiento.
Además de administrar los oligonucleótidos
antisentido de DP-75 en forma de material en bruto
en solución, los oligonucleótidos antisentido de
DP-75 pueden ser administrados como parte de una
preparación farmacéutica que con-
tiene vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el pro-
cesamiento del oligonucleótido antisentido de DP-75 en las preparaciones que pueden ser usados farmacéuticamente.
tiene vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el pro-
cesamiento del oligonucleótido antisentido de DP-75 en las preparaciones que pueden ser usados farmacéuticamente.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen soluciones acuosas de los oligonucleótidos
antisentido de DP-75 en una forma soluble en agua,
por ejemplo, sales solubles en agua. Además pueden administrarse
suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones
oleosas inyectables apropiadas. Los disolventes o vehículos
lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de
sésamo, o ésteres de aceites grasos sintéticos, por ejemplo, oleato
de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas
pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la
suspensión e incluyen, por ejemplo,
carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol, y/o
dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener
estabilizadores.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente
invención pueden prepararse de acuerdo con cualquiera de los
métodos que son bien conocidos por los expertos ordinarios en la
técnica. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido se
preparan por síntesis en fase sólida. Véase, el trabajo de
Goodchild, J., Bioconjugate Chemistry,
1:165-157 (1990), para una revisión de la síntesis
química de oligonucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos
antisentido pueden ser obtenidos en cierto número de compañías que
están especializadas en la síntesis usual de oligonucleótidos.
Una limitación que utiliza oligonucleótidos como
agentes terapéuticos es la rápida degradación del oligonucleótido
en la sangre y dentro de las células por la acción de las nucleasas.
Dichas enzimas hidrolizan los enlaces fosfodiéster que unen los
nucleótidos dentro de una cadena de DNA o RNA, escindiendo por tanto
la molécula en fragmentos más pequeños. En el pasado se ha
conseguido algún progreso en el desarrollo de análogos de
oligonucleótidos que son resistentes a la degradación por
nucleasas, pero el uso de dichos derivados para bloquear la
expresión de genes específicamente dianizados ha tenido un éxito
limitado. Véanse, por ejemplo, Ts'o et al., Patente de
EE.UU. Nº 4.469.863 expedida el 4 de septiembre de 1984; Miller
et al., Patente de EE.UU. Nº 4.507.433 expedida el 26 de
Marzo de 1985;y Miller et al., Patente de EE.UU. Nº 4.511.713
expedida el 16 de abril de 1985.
El trabajo descrito en cada una de las tres
patentes antes mencionada implica el uso de oligonucleótidos en los
cuales ha sido modificada la totalidad de los grupos fosfatos a la
forma de fosfonatos de metilo. La Patente de EE.UU. Nº 5.491.133
muestra que los oligonucleótidos modificados en sólo el enlace
3'-más internucleotídico están marcadamente
protegidos de la degradación dentro de la sangre y de las células.
Además, dichos derivados tienen propiedades de hibridación normal y
forman sustratos con los mRNA que son reconocidos y escindidos por
la RNasaH, impidiendo con ello la expresión del gen dianizado. La
consecución de esta inhibición de la expresión de genes
seleccionados por oligonucleótidos que son resistentes a la
degradación, y, por tanto, más eficaces cuando se usan
terapéuticamente, es otro objetivo de esta invención.
Puede ser útil administrar las moléculas de
ácidos nucleicos antes descritas, es decir, las moléculas de
ribozima o antisentido, en un método de terapia de genes. Por
consiguiente, serán útiles los vectores y técnicas descritos
anteriormente. Los siguientes sistemas de expresión describen
elementos vectores, promotores y reguladores que son útiles
aplicaciones de terapia de genes para la administración de los
polinucleótidos anteriores.
Los vectores y sistemas de expresión útiles para
la presente invención incluyen sistemas virales y no virales.
Ejemplos de sistemas de administración virales incluyen retrovirus,
adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus
sindbis y virus herpes. En un aspecto de la presente invención, el
vector viral es capaz de integrar la secuencia anterior de ácido
nucleico en el genoma de la célula hospedante para una expresión a
largo plazo.
Ejemplos de vectores que pueden integrarse de
esta manera son retrovirus y AAV. Un retrovirus preferido es el
virus de la leucemia murina. Sin embargo, puede ser preferido evitar
la integración en el genoma de la célula hospedante. Los vectores
no virales incluyen DNA desnudo y DNA formulado con lípidos
catiónicos o liposomas.
Los vectores retrovirales se producen
manipulando genéticamente retrovirus. Los vectores retrovirales son
eficaces para la integración en el genoma de la célula hospedante,
como sea explicado antes. Sin embargo, ellos son los únicos que
infectan a las células en división. Los vectores retrovirales
contienen RNA y una vez entra en la célula, es sometido a
transcripción inversa en DNA e integrado establemente en el genoma
de la célula hospedante.
El genoma del retrovirus de tipo silvestre
contiene tres genes: los genes gag, pol, and env, que
están flanqueados por grandes secuencias repetitivas terminales
(abreviadamente en lo sucesivo secuencias LTR por la expresión
inglesa long terminal repeat). El gen gag codifica las
proteínas de la nucleocápsida, el gen pol codifica las
enzimas virales incluyendo la transcriptasa inversa y la integrasa,
el gen env codifica las glicoproteínas virales de la
envolvente. Las secuencias LTR 5' y 3' sirven para promover la
transcripción y la poliadenilación de los viriones de RNA.
Adyacentes a la secuencias 5' LTR están las secuencias necesarias
para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del
cebador (o iniciador) de RNA) y para la encapsulación eficaz del
RNA viral en partículas (el sitio Pi). Véase Mulligan, R.C., en:
Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye
(Ed). 155-173 (1983); Mann, R. et al .,
Cell, (1983) 33:153-159; Cone, RD and R. C.
Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), (1984)
81:6349-6353.
También, son ventajosos los AAV porque se
replican con un alto valor del título, se integran eficazmente, no
son patógenos para los seres humanos, son estables, fáciles de
purificar, e infectan a células que no se dividen. Un vector de AAV
se construye insertando la secuencia de ácido nucleico, bajo el
control de un promotor/potenciador adecuado, entre las LTR del AAV,
que son las únicas secuencias requeridas en cis para la replicación
del AAV. Esta construcción de DNA se transfecta en una línea
celular humana adecuada en presencia de otro plásmido que expresa
Rep y CAP, las regiones codificadoras del AAV necesarias para
la replicación. En un tiempo de post-transfección
adecuado, las células se infectan con un virus coadyuvante, tal como
Adenovirus o Virus Herpes Simplex. Después de la infección, las
partículas del vector se cosechan de estas células. Las partículas
de AAV se purifican a partir de Adenovirus o Virus Herpes
contaminantes por protocolo estándares.
El Adenovirus es ventajoso porque infecta una
amplia variedad de células, infecta células que no se dividen,
produce un título elevado, su biología está bien entendida, y puede
aceptar grandes inserciones. La expresión de los genes de
adenovirus es controlada por una cascada de genes. Por ejemplo, el
orden de expresión de los genes es "temprano inmediato",
"temprano", síntesis de DNA, y genes tardíos o estructurales.
Estos genes se expresan en secuencia. El gen maestro que primero se
expresa es E1A. Una realización preferida implicaría reemplazar el
gen E1A con la secuencia de ácido nucleico de interés y transfectar
este vector en células que constitutivamente producen EIA, tal como
las células 293 que son públicamente asequibles. El vector contiene
todos los genes necesarios para la producción de viriones y la línea
celular proporciona la proteína E1A que falta.
Un sistema no viral que puede usarse es el
sistema T7/T7. Aquí una pequeña secuencia promotora reconocida por
la polimerasa del virus bacteriano T7 se coloca en un vector situado
hacia el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico de interés.
El vector puede insertarse luego en las células y la polimerasa de
T7 puede ser añadida para obtener la transcripción de genes.
Alternativamente, puede obtenerse un vector que contiene las
siguientes secuencias, la secuencia promotora de T7, el gen de la
polimerasa de T7, otra copia de la secuencia promotora de T7, y las
secuencias de ácidos nucleicos anteriores. En esta realización el
vector se transforma en las células y requiere simplemente para la
iniciación una pequeña cantidad de polimerasa de T7. A continuación,
el vector dirige la fabricación de su propia polimerasa.
Adicionalmente será útil producir la proteína
DP-75 a partir de la secuencia de ácido nucleico
presentemente descrita para ser usada en la valoración en un ensayo
para inhibidores o, por ejemplo, para la preparación de anticuerpos
monoclonales. DP-75 puede ser producido por un
microorganismo procariota o una célula eucariota que ha sido
transformada con una secuencia de ácido nucleico de
DP-75 natural o modificada. La secuencia de ácido
nucleico de DP-75 útil en la presente invención
codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es
sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la
DP-75 natural.
Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
o proteína DP-75 será homóloga a las secuencias
parciales enumeradas más adelante. Preferiblemente, la secuencia
anterior tendrá una homología mayor que 95% con la SEQ ID NO:6 o
uno de sus fragmentos, más preferiblemente tendrá una homología
mayor que 98%, más preferiblemente mayor que 99%. Identidad
sustancial significa que las secuencias son idénticas o difieren en
una o más alteraciones (deleción, adiciones, sustituciones) que no
afectan adversamente a la actividad de la proteína. Es preferible
que las secuencias de proteínas sean homólogas en los mismos
porcentajes antes indicados.
La estructura química precisa de la secuencia de
DP-75 depende de cierto número de factores. Como
están presentes grupos carboxilos y amino ionizables en la
molécula, puede obtenerse una proteína particular en forma de sal
ácida o básica o en forma neutra. Dichas preparaciones que retienen
su actividad cuando se colocan en condiciones ambientales
aceptables están incluidas en la definición de proteínas en la
presente memoria. Además, la secuencia primaria de aminoácidos de
la proteína puede ser aumentada por derivatización usando restos de
azúcar (glicosilación) o por otras moléculas suplementarias tales
como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Ciertos aspectos
de dicho aumento se consiguen por sistemas de tratamiento
posteriores a la traducción de los hospedantes productores; otras
de dichas modificaciones pueden ser introducidas in vitro. En
cualquier caso, dichas modificaciones están incluidas en la
definición de proteína en la presente memoria siempre que no se
destruya la actividad de la proteína. Se espera que dichas
modificaciones puedan afectar cualitativa o cuantitativamente y a la
actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad de la
proteína en los diversos ensayos. Además, los residuos de
aminoácidos individuales de la cadena pueden ser modificados por
oxidación, reducción o derivatización, y la proteína puede ser
escindida para obtener fragmentos que retienen actividad. Dichas
alteraciones que no destruyen la actividad no aparta la secuencia
de la proteína de la definición de DP-75 en la
presente memoria.
Finalmente, las modificaciones de la estructura
primaria propiamente dicha por deleción, adición o alteración de
los aminoácidos incorporados en la secuencia durante la traducción,
pueden hacerse sin destruir la actividad de la proteína. Por
ejemplo, la mutagénesis específica de sitio puede facilitar cambios
específicos en la estructura del DNA para efectuar un cambio en la
estructura del polipéptido. Véase Mark et al., Patente de
EE.UU. Nº 4.959.314, y Sambrook, et al., MOLECULAR
CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), Volumen 2,
capítulo 15.
La secuencia de aminoácidos de las proteínas
DP-75 puede ser dividida en cuatro categorías
generales: mutantes, fragmentos, fusiones, y la proteína codificada
por la secuencia listada en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:1, o sus
fragmentos y otros homólogos encontrados en otros organismos. Las
proteínas DP-75 naturales son las que se presentan
en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos
naturales comprenderá una secuencia que varía ligeramente;
típicamente, en menos de 10-20 aminoácidos de la SEQ
ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1.
Una secuencia que codifica una proteína
DP-75 natural puede ser modificada fácilmente para
codificar otras clases de proteínas DP-75. Por
ejemplo, pueden construirse mutantes hacienda sustituciones
conservadoras de aminoácidos. Los siguientes son ejemplos de
sustituciones conservadoras: Gly <-> Ala; Val <-> Lau;
Asp <-> Glu; Lys <-> Arg; Asn <-> Gin; y Phe
<-> Trp <-> Tyr. Un subconjunto de mutantes, llamado
muteínas, es un grupo de polipéptidos con cisteínas que participan
con enlaces no disulfuro sustituidas con un aminoácido neutro,
generalmente, con serinas. Estos mutantes pueden ser estables en un
amplio intervalo de temperaturas mayor que el de las proteínas
DP-75 naturales. La secuencia codificadora de los
mutantes puede contener también deleciones o inserciones de
aminoácidos comparadas con las proteínas DP-75
naturales. La secuencia codificadora de los mutantes puede ser
construida por mutagénesis in vitro de las secuencias
codificadoras de polipéptidos de DP-75.
Los fragmentos son deleciones de aminoácidos
amino y/o carboxi terminales de proteínas DP-75
mutantes o naturales. El número de aminoácidos que están truncados
no es crítico siempre y cuando el fragmento polipeptídico exhiba la
homología de secuencias deseada, y la actividad inmunológica o
biológica. Los de fragmentos de polipéptidos de significación
inmunológica comprenden; por ejemplo, al menos un epítopo compartido
por una proteína DP-75. Tales proteínas
DP-75 pueden tener solamente una longitud de
5-15 aminoácidos. Ejemplos de secuencias de
aminoácidos de fragmentos incluyen los aminoácidos números
1-8 (aa1 hasta aa8) de SEQ ID NO:7; aa2 hasta aa9 de
SEQ ID NO:7; aa3 hasta aa10 de SEQ ID NO:7; aa4 hasta aa11 de SEQ
ID NO:7; aa5 hasta aa12 de SEQ 1D NO:7; aa6 hasta aa13 de SEQ ID
NO:7; aa7 hasta aa14 de SEQ ID NO:7; aa8 hasta aa15 de SEQ ID NO:7;
aa9 hasta aa16 de SEQ ID NO:7; aa10 hasta aa17 de SEQ ID NO:7; aa11
hasta aa18 de SEQ ID NO:7; aa12 hasta aa19 de SEQ ID NO:7; aa13
hasta aa20 de SEQ ID NO:7; aa14 hasta aa21 de SEQ ID NO:7; aa15
hasta aa22 de SEQ ID NO:7; aa16 hasta aa23 de SEQ ID NO:7; aa17
hasta aa24 de SEQ ID NO:7; aa18 hasta aa25 de SEQ ID NO:7; aa19
hasta aa26 de SEQ ID NO:7; aa20 hasta aa27 de SEQ ID NO:7; aa21
hasta aa28 de SEQ ID NO:7; aa22 hasta aa29 de SEQ ID NO:7; aa23
hasta as30 de SEQ ID NO:7; aa24 hasta aa31 de SEQ ID NO:7; aa25
hasta aa32 de SEQ ID NO:7; aa26 hasta aa33 de SEQ ID NO:7; aa27
hasta aa34 de SEQ ID NO:7; aa28 hasta aa35 de SEQ ID NO:7; aa29
hasta aa36 de SEQ ID NO:7; aa30 hasta aa37 de SEQ ID NO:7; aa31
hasta aa38 de SEQ ID NO:7; aa32 hasta aa39 de SEQ ID NO:7; aa33
hasta aa40 de SEQ ID NO:7; aa34 hasta aa41 de SEQ ID NO:7; aa35
hasta aa42 de SEQ ID NO:7; aa36 hasta aa43 de SEQ ID NO:7; aa37
hasta aa44 de SEQ ID NO:7; aa38 hasta aa45 de SEQ ID NO:7; aa39
hasta aa46 de SEQ ID NO:7; aa40 hasta aa47 de SEQ ID NO:7; aa41
hasta aa48 de SEQ ID NO:7; aa42 hasta aa49 de SEQ ID NO:7; aa43
hasta aa50 de SEQ ID NO:7; aa44 hasta aa51 de SEQ ID NO:7; aa45
hasta aa52 de SEQ ID NO:7; aa46 hasta aa53 de SEQ ID NO:7; aa47
hasta aa54 de SEQ ID NO:7; aa48 hasta aa55 de SEQ ID NQ:7; aa49
hasta aa56 de SEQ ID NO:7; aa50 hasta aa57 de SEQ ID NO:7; aa51
hasta aa58 de SEQ ID NO:7; aa52 hasta aa59 de SEQ ID NO:7; aa53
hasta aa60 de SEQ ID NO:7; aa54 hasta aa61 de SEQ ID NO:7; aa55
hasta aa62 de SEQ ID NO:7; aa56 hasta aa63 de SEQ ID NO:7; aa57
hasta aa64 de SEQ ID NO:7; aa58 hasta aa65 de SEQ ID NO:7; aa59
hasta aa66 de SEQ ID NO:7; aa60 hasta aa67 de SEQ ID NO:7; aa61
hasta aa68 de SEQ ID NO:7; aa62 hasta aa69 de SEQ ID NO:7; aa63
hasta aa74 de SEQ ID NO:7; aa64 hasta aa71 de SEQ ID NO:7; aa65
hasta aa72 de SEQ ID NO:7; aa66 hasta aa73 de SEQ ID NO:7; aa67
hasta aa74 de SEQ ID NO:7; aa68 hasta aa75 de SEQ ID NO:7; aa69
hasta aa76 de SEQ ID NO:7; aa70 hasta aa77 de SEQ ID NO:7; aa71
hasta aa78 de SEQ ID NO:7; aa72 hasta aa79 de SEQ ID NO:7; aa73
hasta aa80 de SEQ ID NO:7; aa74 hasta aa81 de SEQ ID NO:7; aa75
hasta aa82 de SEQ ID NO:7; aa76 hasta aa83 de SEQ ID NO:7;. aa77
hasta aa84 de SEQ ID NO:7; aa78 hasta aa85 de SEQ ID NO:7; aa79
hasta aa86 de SEQ ID NO:7; aa80 hasta aa87 de SEQ ID NO:7; aa81
hasta aa88 de SEQ ID NO:7; aa82 hasta aa89 de SEQ ID NO:7; aa83
hasta aa90 de SEQ ID NO:7; aa84 hasta aa91 de SEQ ID NO:7; aa85
hasta aa92 de SEQ ID NO:7; aa86 hasta aa93 de SEQ ID NO:7; aa87
hasta aa94 de SEQ ID NO:7; aa88 hasta aa95 de SEQ ID NO:7; aa89
hasta aa96 de SEQ ID NO:7; aa90 hasta aa97 de SEQ ID NO:7; aa91
hasta aa98 de SEQ ID NO:7; aa92 hasta aa99 de SEQ ID NO:7; aa93
hasta aa100 de SEQ ID NO:7; aa94 hasta aa101 de SEQ ID NO:7; aa95
hasta aa102 de SEQ ID NO:7; aa96 hasta aa103 de SEQ ID NO:7; aa97
hasta aa104 de SEQ ID NO:7; aa98 hasta aa105 de SEQ ID NO:7; aa99
hasta aa106 de SEQ ID NO:7; aa100 hasta aa107 de SEQ ID NO:7 aa101
hasta aa108 de SEQ ID NO:7 aa102 hasta aa109 de SEQ ID NO:7; aa103
hasta aa110 de SEQ ID NO:7; aa104 hasta aa111 de SEQ ID NO:7; aa1 05
hasta aa112 de SEQ ID NO:7; aa106 hasta aa113 de SEQ ID NO:7; aa107
hasta aa114 de SEQ ID NO:7; aa108 hasta aa115 de SEQ ID NO:7; aa109
hasta aa116 de SEQ ID NO:7; aa110 hasta aa117 de SEQ ID NO:7; aa111
hasta aa118 de SEQ ID NO:7; aa112 hasta aa119 de SEQ ID NO:7; aa113
hasta aa120 de SEQ ID NO:7; aa114 hasta aa121 de SEQ ID NO:7; aa115
hasta aa122 de SEQ ID NO:7; aa116 hasta aa123 de SEQ ID NO:7; aa117
hasta aa124 de SEQ ID NO:7; aa118 hasta aa125 de SEQ ID NO:7; aa119
hasta aa126 de SEQ ID NO:7; aa120 hasta aa127 de SEQ ID NO:7; aa121
hasta aa128 de SEQ ID NO:7; aa122 hasta aa129 de SEQ ID NO:7; aa123
hasta aa130 de SEQ ID NO:7; aa124 hasta aa131 de SEQ ID NO:7; aa125
hasta aa132 de SEQ ID NO:7; aa126 hasta aa133 de SEQ ID NO:7; aa127
hasta aa134 de SEQ ID NO:7; aa128 hasta aa135 de SEQ ID NO:7; aa129
hasta aa136 de SEQ ID NO:7; aa130 hasta aa137 de SEQ ID NO:7; aa131
hasta aa138 de SEQ ID NO:7; aa132 hasta aa139 de SEQ ID NO:7; aa133
hasta aa140 de SEQ ID NO:7; aa134 hasta aa141 de SEQ ID NO:7; aa135
hasta aa142 de SEQ ID NO:7; aa136 hasta aa143 de SEQ ID NO:7; aa137
hasta aa144 de SEQ ID NO:7; aa138 hasta aa145 de SEQ ID NO:7; aa139
hasta aa146 de SEQ ID NO:7; aa140 hasta aa147 de SEQ ID NO:7; aa141
hasta aa148 de SEQ ID NO:7; aa142 hasta aa149 de SEQ ID NO:7; aa143
hasta aa150 de SEQ ID NO:7; aa144 hasta aa151 de SEQ ID NO:7; aa145
hasta aa152 de SEQ ID NO:7; aa146 hasta aa153 de SEQ ID NO:7; aa147
hasta aa154 de SEQ ID NO:7; aa148 hasta aa155 de SEQ ID NO:7; aa149
hasta aa156 de SEQ ID NO:7; aa150 hasta aa157 de SEQ ID NO:7; aa151
hasta aa158 de SEQ ID NO:7; aa152 hasta aa159 de SEQ ID NO:7; aa153
hasta aa160 de SEQ ID NO:7; aa154 hasta aa161 de SEQ ID NO:7; aa155
hasta aa162 de SEQ ID NO:7; aa156 hasta aa163 de SEQ ID NO:7; aa157
hasta aa164 de SEQ ID NO:7; aa158 hasta aa165 de SEQ ID NO:7; aa159
hasta aa166 de SEQ ID NO:7; aa160 hasta aa167 de SEQ ID NO:7; aa161
hasta aa168 de SEQ ID NO:7; aa162 hasta aa169 de SEQ ID NO:7; aa163
hasta aa170 de SEQ ID NO:7; aa164 hasta aa171 de SEQ ID NO:7; aa165
hasta aa172 de SEQ ID NO:7; aa166 hasta aa173 de SEQ ID NO:7; aa167
hasta aa174 de SEQ ID NO:7; aa168 hasta aa175 de SEQ ID NO:7; aa169
hasta aa176 de SEQ ID NO:7; aa170 hasta aa177 de SEQ ID NO:7; aa171
hasta aa178 de SEQ ID NO:7; aa172 hasta aa179 de SEQ ID NO:7; aa173
hasta aa180 de SEQ ID NO:7; aa174 hasta aa181 de SEQ ID NO:7; aa175
hasta aa182 de SEQ ID NO:7; aa176 hasta aa183 de SEQ ID NO:7; aa177
hasta aa184 de SEQ ID NO:7; aa178 hasta aa185 de SEQ ID NO:7; aa179
hasta aa186 de SEQ ID NO:7; aa180 hasta aa187 de SEQ ID NO:7; aa181
hasta aa188 de SEQ ID NO:7; aa182 hasta aa189 de SEQ ID NO:7; aa183
hasta aa190 de SEQ ID NO:7; aa184 hasta aa191 de SEQ ID NO:7; aa185
hasta aa192 de SEQ ID NO:7; aa186 hasta aa193 de SEQ ID NO:7; aa187
hasta aa194 de SEQ ID NO:7; aa188 hasta aa195 de SEQ ID NO:7; aa189
hasta aa196 de SEQ ID NO:7; aa190 hasta aa197 de SEQ ID NO:7; aa191
hasta aa198 de SEQ ID NO:7; aa192 hasta aa199 de SEQ ID NO:7; aa193
hasta aa200 de SEQ ID NO:7; aa194 hasta aa201 de SEQ ID NO:7; aa195
hasta aa202 de SEQ ID NO:7; aa196 hasta aa203 de SEQ ID NO:7; aa197
hasta aa204 de SEQ ID NO:7; aa198 hasta aa205 de SEQ ID NO:7; aa199
hasta aa206 de SEQ ID NO:7; aa200 hasta aa207 de SEQ ID NO:7; aa201
hasta aa208 de SEQ ID NO:7; aa202 hasta aa209 de SEQ ID NO:7; aa203
hasta aa210 de SEQ ID NO:7; aa204 hasta aa211 de SEQ ID NO:7; aa205
hasta aa212 de SEQ ID NO:7; aa206 hasta aa213 de SEQ ID NO:7; aa207
hasta aa214 de SEQ ID NO:7; aa208 hasta aa215 de SEQ ID NO:7; aa209
hasta aa216 de SEQ ID NO:7; aa210 hasta aa217 de SEQ ID NO:7; aa211
hasta aa218 de SEQ ID NO:7; aa212 hasta aa219 de SEQ ID NO:7; aa213
hasta aa220 de SEQ ID NO:7; aa214 hasta aa221 de SEQ ID NO:7; aa215
hasta aa222 de SEQ ID NO:7; aa216 hasta aa223 de SEQ ID NO:7; aa217
hasta aa224 de SEQ ID NO:7; aa218 hasta aa225 de SEQ ID NO:7; aa219
hasta aa226 de SEQ ID NO:7; aa220 hasta aa227 de SEQ ID NO:7; aa221
hasta aa228 de SEQ ID NO:7; aa222 hasta aa229 de SEQ ID NO:7; aa223
hasta aa230 de SEQ ID NO:7; aa224 hasta aa231 de SEQ ID NO:7; aa225
hasta aa232 de SEQ ID NO:7; y aa226 hasta aa233; de SEQ ID NO:7
aa227 hasta aa234 de SEQ ID NO:7; aa228 hasta aa235 de SEQ ID NO:7;
aa229 hasta aa236 de SEQ ID NO:7; aa230 hasta aa237 de SEQ ID NO:7;
aa231 hasta aa238 de SEQ ID NO:7; aa222 hasta aa239 de SEQ ID NO:7;
aa233 hasta aa240 de SEQ ID NO:7; aa234 hasta aa241 de SEQ ID NO:7;
aa235 hasta aa242 de SEQ ID NO:7; aa236 hasta aa243 de SEQ ID NO:7;
aa237 hasta aa244 de SEQ ID NO:7; aa238 hasta aa245 de SEQ ID NO:7;
aa239 hasta aa246 de SEQ ID NO:7; aa240 hasta aa247 de SEQ ID NO:7;
aa241 hasta aa248 de SEQ ID NO:7; aa242 hasta aa249 de SEQ ID NO:7;
aa243 hasta aa250 de SEQ ID NO:7; aa244 hasta aa251 de SEQ ID NO:7;
aa245 hasta aa252 de SEQ ID NO:7; aa246 hasta aa253 de SEQ ID NO:7;
aa247 hasta aa254 de SEQ ID NO:7; aa248 hasta aa255 de SEQ ID NO:7;
aa249 hasta aa256 de SEQ ID NO:7; aa250 hasta aa257 de SEQ ID NO:7;
aa251 hasta aa258 de SEQ ID NO:7; aa252 hasta aa259 de SEQ ID NO:7;
aa253 hasta aa260 de SEQ ID NO:7; aa254 hasta aa261 de SEQ ID NO:7;
aa255 hasta aa262 de SEQ ID NO:7; aa256 hasta aa263 de SEQ ID NO:7;
aa257 hasta aa264 de SEQ ID NO:7; aa258 hasta aa265 de SEQ ID NO:7;
aa259 hasta aa266 de SEQ ID NO:7; aa260 hasta aa267 de SEQ ID NO:7;
aa261 hasta aa268 de SEQ ID NO:7; aa262 hasta aa269 de SEQ ID NO:7;
aa263 hasta aa270 de SEQ ID NO:7; aa264 hasta aa271 de SEQ ID NO:7;
aa265 hasta aa272 de SEQ ID NO:7; aa266 hasta aa273 de SEQ ID NO:7;
aa267 hasta aa274 de SEQ ID NO:7; aa268 hasta aa275 de SEQ ID NO:7;
aa269 hasta aa276 de SEQ ID NO:7; aa270 hasta aa277 de SEQ ID NO:7;
aa271 hasta aa278 de SEQ ID NO:7; aa272 hasta aa279 de SEQ ID NO:7;
aa273 hasta aa280 de SEQ ID NO:7; aa274 hasta aa781 de SEQ ID NO:7;
aa275 hasta aa282 de SEQ ID NO:7; aa276 hasta aa283 de SEQ ID NO:7;
aa277 hasta aa284 de SEQ ID NO:7; aa278 hasta aa284 de SEQ ID NO:7;
aa279 hasta aa286 de SEQ ID NO:7; aa280 hasta aa287 de SEQ ID NO:7;
aa281 hasta aa288 de SEQ ID NO:7; aa282 hasta aa289 de SEQ ID NO:7;
aa283 hasta aa290 de SEQ ID NO:7; aa284 hasta aa291 de SEQ ID NO:7;
aa285 hasta aa292 de SEQ ID NO:7; aa286 hasta aa293 de SEQ ID NO:7;
aa287 hasta aa294 de SEQ ID NO:7; aa288 hasta aa295 de SEQ ID NO:7;
aa289 hasta aa296 de SEQ ID NO:7; aa290 hasta aa297 de SEQ ID NO:7;
aa291 hasta aa298 de SEQ ID NO:7; aa292 hasta aa299 de SEQ ID NO:7;
aa293 hasta aa300 de SEQ ID NO:7; aa294 hasta aa201 de SEQ ID NO:7;
aa295 hasta aa302 de SEQ ID NO:7; aa296 hasta aa303 de SEQ ID NO:7;
aa297 hasta aa304 de SEQ ID NO:7; aa298 hasta aa305 de SEQ ID NO:7;
aa299 hasta aa306 de SEQ ID NO:7; aa300 hasta aa307 de SEQ ID NO:7
aa301 hasta aa308 de SEQ ID NO:7; aa302 hasta aa309 de SEQ ID NO:7;
aa303 hasta aa310 de SEQ ID NO:7; aa304 hasta aa311 de SEQ ID NO:7;
aa305 hasta aa312 de SEQ ID N0:7; aa306 hasta aa313 de SEQ ID NO:7;
aa307 hasta aa314 de SEQ ID NO:7; aa308 hasta aa315 de SEQ ID NO:7;
aa309 hasta aa316 de SEQ ID NO:7; aa310 hasta aa317 de SEQ ID NO:7;
aa311 hasta aa118 de SEQ ID NO:7; aa312 hasta aa319 de SEQ ID NO:7;
aa313 hasta aa320 de SEQ ID NO:7; aa314 hasta aa321 de SEQ ID NO:7;
aa315 hasta aa322 de SEQ ID NO:7; aa316 hasta aa323 de SEQ ID NO:7;
aa317 hasta aa324 de SEQ ID NO:7; aa318 hasta aa325 de SEQ ID NO:7;
aa319 hasta aa326 de SEQ ID NO:7; aa320 hasta aa327 de SEQ ID NO:7;
aa321 hasta aa328 de SEQ ID NO:7; aa322 hasta aa329 de SEQ ID NO:7;
aa323 hasta aa330 de SEQ ID NO:7; aa324 hasta aa331 de SEQ ID NO:7;
aa325 hasta aa332 de SEQ ID NO:7; aa326 hasta aa333 de SEQ ID NO:7;
aa327 hasta aa334 de SEQ ID NO:7; aa328 hasta aa335 de SEQ ID NO:7;
aa329 hasta aa336 de SEQ ID NO:7; aa330 hasta aa337 de SEQ ID NO:7;
aa331 hasta aa338 de SEQ ID NO:7; aa332 hasta aa339 de SEQ ID NO:7;
aa333 hasta aa340 de SEQ ID NO:7; aa334 hasta aa341 de SEQ ID NO:7;
aa335 gasta aa342 de SEQ ID NO:7; aa336 hasta aa343 de SEQ ID NO:7;
aa337 hasta aa344 de SEQ ID NO:7; aa338 hasta aa345 de SEQ ID NO:7;
aa339 hasta aa346 de SEQ ID NO:7; aa340 hasta aa347 de SEQ ID NO:7;
aa341 hasta aa348 de SEQ ID NO:7; aa342 hasta aa349 de SEQ ID NO:7;
aa343 hasta aa350 de SEQ ID NO:7; aa344 hasta aa351 de SEQ ID NO:7;
aa345 hasta aa352 de SEQ ID NO:7; aa346 hasta aa353 de SEQ ID NO:7;
aa347 hasta aa354 de SEQ ID NO:7; aa348 hasta aa355 de SEQ ID NO:7
aa349 hasta aa356 de SEQ ID NO:7; aa350 hasta aa357 de SEQ ID NO:7;
aa351 hasta aa358 de SEQ ID NO:7; aa352 hasta aa359 de SEQ ID NO:7;
aa353 hasta aa360 de SEQ ID NO:7; aa354 hasta aa361 de SEQ ID NO:7;
aa355 hasta aa362 de SEQ ID NO:7; aa356 hasta aa363 de SEQ ID NO:7;
aa3 S7 hasta aa364 de SEQ ID NO:7; aa358 hasta aa365 de SEQ ID
NO:7; aa359 hasta aa366 de SEQ ID NO:7; aa360 hasta aa367 de SEQ ID
NO:7; aa361 hasta aa368 de SEQ ID NO:7; aa362 hasta aa369 de SEQ ID
NO:7; aa363 hasta aa370 de SEQ ID NO:7; aa364 hasta aa371 de SEQ ID
NO:7; aa365 hasta aa372 de SEQ ID NO:7; aa366 hasta aa373 de SEQ ID
NO:7; aa367 hasta aa374 de SEQ ID NO:7; aa368 hasta aa375 de SEQ 1D
NO:7; aa369 hasta aa376 de SEQ ID NO:7; aa370 hasta aa377 de SEQ ID
NO:7; aa371 hasta aa378 de SEQ ID NO:7; aa372 hasta aa379 de SEQ ID
NO:7; aa373 hasta aa380 de SEQ ID NO:7; aa374 hasta aa381 de SEQ ID
NO:7; aa375 hasta aa382 de SEQ ID NO:7; aa376 hasta aa383 de SEQ ID
NO:7; aa377 hasta aa384 de SEQ ID NO:7; aa378 hasta aa385 de SEQ ID
NO:7; aa379 hasta aa386 de SEQ ID NO:7; aa380 hasta aa387 de SEQ ID
NO:7; aa381 hasta aa388 de SEQ ID NO:7; aa382 hasta aa389 de SEQ ID
NO:7; aa383 hasta aa390 de SEQ ID NO:7; aa384 hasta aa391 de SEQ ID
NO:7; aa385 hasta aa392 de SEQ ID NO:7; aa386 hasta aa393 de SEQ ID
NO:7; aa387 hasta aa394 de SEQ ID NO:7; aa388 hasta aa395 de SEQ ID
NO:7; aa389 hasta aa396 de SEQ ID NO:7; aa390 hasta aa397 de SEQ ID
NQ:7; aa391 hasta aa398 de SEQ ID NO:7; aa392 hasta aa399 de SEQ ID
NQ:7; aa393 hasta aa400 de SEQ ID NO:7; aa394 hasta aa401 de SEQ ID
NO:7; aa395 hasta aa402 de SEQ ID NO:7; aa396 hasta aa403 de SEQ ID
NO:7; aa397 hasta aa404 de SEQ ID NO:7; aa398 hasta aa405 de SEQ ID
NO:7; aa399 hasta aa406 de SEQ ID NO:7; aa400 hasta aa407 de SEQ ID
NO:7; aa401 hasta aa408 de SEQ ID NO:7; aa402 hasta aa409 de SEQ ID
NO:7; aa403 hasta aa410 de SEQ ID NO:7; aa404 hasta aa411 de SEQ ID
NO:7; aa405 hasta aa412 de SEQ ID NO:7; aa406 hasta aa413 de SEQ ID
NO:7; aa407 hasta aa414 de SEQ ID NO:7; aa408 hasta aa415 de SEQ ID
NO:7; aa409 hasta aa416 de SEQ ID NO:7; aa414 hasta aa417 de SEQ ID
NO:7; aa411 hasta aa418 de SEQ ID NO:7; aa412 hasta aa419 de SEQ ID
NO:7; aa413 hasta aa420 de SEQ ID NO:7; aa414 hasta aa421 de SEQ ID
NO:7; aa415 hasta aa422 de SEQ ID NO:7; aa416 hasta aa423 de SEQ ID
NO:7; aa417 hasta aa424 de SEQ ID NO:7; aa418 hasta aa425 de SEQ ID
NO:7; aa419 hasta aa426 de SEQ ID NO:7; aa420 hasta aa427 de SEQ ID
NO:7; aa421 hasta aa428 de SEQ ID NO:7; aa422 hasta aa429 de SEQ ID
NO:7; aa423 hasta aa430 de SEQ ID NO:7; aa424 hasta aa431 de SEQ ID
NO:7; aa425 hasta aa432 de SEQ ID NO:7; aa426 hasta aa433 de SEQ ID
NO:7; aa427 hasta aa434 de SEQ ID NO:7; aa428 hasta aa435 de SEQ ID
NO:7; aa429 hasta aa436 de SEQ ID NO:7; aa430 hasta aa437 de SEQ ID
NO:7; aa431 hasta aa438 de SEQ ID.NO:7; aa432 hasta aa439 de SEQ ID
NO:7; aa433 hasta aa440 de SEQ ID NO:7; aa434 hasta aa441 de SEQ ID
NO:7; aa435 hasta aa442 de SEQ ID NO:7; aa436 hasta aa443 de SEQ ID
NO:7; aa437 hasta aa444 de SEQ ID NO:7; aa438 hasta aa445 de SEQ ID
NO:7; aa439 hasta aa446 de SEQ ID NO:7; aa440 hasta aa447 de SEQ ID
NO:7; aa441 hasta aa448 de SEQ ID NO:7; aa442 hasta aa449 de SEQ ID
NO:7; aa443 hasta aa450 de SEQ ID NQ:7; aa444 hasta aa451 de SEQ ID
NO:7; aa445 hasta aa452 de SEQ ID NO:7; aa446 hasta aa453 de SEQ ID
NO:7; aa447 hasta aa454 de SEQ ID NO:7; aa448 hasta aa455 de SEQ ID
NO:7; aa449 hasta aa456 de SEQ ID NO:7; aa450 hasta aa457 de SEQ ID
NO:7; aa451 hasta aa458 de SEQ ID NO:7; aa452 hasta aa459 de SEQ ID
NO:7; aa453 hasta aa460 de SEQ ID NO:7; aa454 hasta aa461 de SEQ ID
NO:7; aa455 hasta aa462 de SEQ ID NO:7; aa456 hasta aa463 de SEQ ID
NO:7; aa457 hasta aa464 de SEQ ID NO:7; aa458 hasta aa465 de SEQ ID
NO:7; aa459 hasta aa466 de SEQ ID NO:7; aa460 hasta aa467 de SEQ ID
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NO:7; aa463 hasta aa470 de SEQ ID NO:7; aa464 hasta aa471 de SEQ ID
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NO:7; aa619 hasta aa626 de SEQ ID NO:7. La secuencia codificadora
de los fragmentos puede ser construida fácilmente escindiendo los
nucleótidos no deseados de las secuencias que codifican la proteína
DP-75 mutante o natural.
Las fusiones son proteínas DP-75
fragmentarias, mutantes o naturales con aminoácidos adicionales en
uno o en ambos de sus extremos. La secuencia de aminoácidos
adicionales no es necesariamente homóloga con la secuencia
encontrada en los polipéptidos naturales del receptor hipotalámico.
Los residuos de aminoácidos adicionales pueden facilitar, por
ejemplo, la expresión, detección o actividad del polipéptido. La
secuencia de aminoácidos adicionales también puede usarse como
enlazador para construir multímeros de proteínas
DP-75. Todos los polipéptidos de fusión exhiben la
homología de secuencia y la actividad inmunológica o biológica
deseada.
Como se ha mencionado previamente, la
DP-75 recombinante puede ser producida por
microorganismos procariotas o células eucariotas. Los sistemas
celulares preferidos incluyen células de E. coli, mamíferos,
baculovirus, y levaduras. Preferiblemente, DP-75 se
produce transformando un microorganismo procariota con DNA para
producir una proteína que posea actividad de DP-75
natural. Las bacterias son microorganismos procariotas que pueden
producir DP-75 y E. coli es especialmente
preferida. La DP-75 recombinante sintética también
puede ser preparada en eucariotas, tales como células de levadura o
humanas. Véase Sambrook, et al ., MOLECULAR CLONING; A
LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), Volumen 3, para la
expresión bacteriana, véase el capítulo 17, para la expresión en
mamíferos, véase el capítulo 16 los cuales se incorporan en la
presente memoria como referencia.
El DNA de DP-75 puede ser
incorporado en un vector de expresión bacteriano que contiene todas
las secuencias de control necesarias para expresar polipéptidos de
DP-75. Las secuencias de control son conocidas en la
técnica e incluyen: un sitio de unión a ribosoma, un promotor
regulado (es decir, trp, trp-lac,
\lambdap_{1}, y T7); opcionalmente una secuencia de
operador, un codón de iniciación (ATG) y un codón de parada; un
potenciador, etc. También es preferible incluir un origen de
replicación para facilitar la replicación del plásmido dentro de
las bacterias.
Los vectores apropiados y los plásmidos están
disponibles públicamente y pueden ser empleados para contener DNA
de DP-75. Pueden ser ligados, en un enlace
operativo, a las secuencias de control anteriores y ser insertados
en el vector usando enzimas y técnicas de ligación corrientemente
disponibles. Adicionalmente, la secuencia de DNA de
DP-75 puede insertarse en dirección 3' de una
secuencia que proporciona la secreción en el espacio periplásmico,
tal como la secuencia phoA.
Se conocen en la técnica una variedad de
hospedantes bacterianos para la expresión y están disponibles en
The American Type Culture Collection (ATCC). Los hospedantes
bacterianos adecuados para expresar DP-75 incluyen,
sin limitación: Campylobacter, Bacillus, Escherichia,
Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus y
Streptococcus. Un microorganismo transformado típico útil en
la presente invención es E. coli K-12,
la cepa MM294 (depositada en The American Type Culture Collection
el 4 de agosto de 1983, por Cetus Corporación bajo las
disposiciones del Tratado de Budapest y con el número de acceso Nº
39.405).
Los métodos de introducir DNA de
DP-75 en hospedantes bacterianos son conocidos en la
técnica, y típicamente incluyen tratar las bacterias con CaCl_{2}
u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El DNA
desnudo o plasmídico también puede introducirse en las células
bacterianas por electroporación o infección viral. Los métodos de
transformación usualmente varían con la especie bacteriana que ha de
ser transformada. Véase por ejemplo, (Masson et al., (1989)
FEMS Microbial. Lett. 60:273; Palva et al., (1982)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; Publicaciones de EP
036259 y 063953; PCT WO 84/04541, Bacillus), (Miller et
al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et
al., (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter),
(Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci.,
69:2110; Dower et al., (1988) Nucleic Acids Res.
16:6127; Kushner (1978) ``An improved method for transformation
of Escherichia coli with ColE1-derived
plasmids in Genetic Engineering: Proceedings of the International
Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S.
Nicosia); Mandel et al., (1970) J. Mol. Biol. 53:159;
Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia),
(Chassy et al., (1987) FEMS Microbial. Lett, 44:173
Lactobacillus); (Fiedler et al., (1988) Anal.
Biochem. 170:38, Pseudomonas); (Augustin et al.,
(1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus),
(Barany et al., (1980) Bacteriol. 144:698; Harlander
(1987) "Transformation of Streptococcus lactic by
electroporation" en Streptococcal Genetics (ed. J.
Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al., (1981) Infec.
Immun. 32:1295; Powell et al., (1988) Appl. Environ.
Microbial. 54:655; Somkuti et al., (1987) Proc. 4th
Eyr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus).
Procesos ilustrativos del crecimiento, cosecha,
rotura o extracción del polipéptido de DP-75 de las
células se describen sustancialmente en las Patentes de EE.UU. Nº.
4.604.377, 4.738.927, 4.656.132, 4.569.790, 4.748.234, 4.530.787,
4.572.298, 5.248.769 y 5.162.507.
DP-75 puede ser expresado en una
variedad de otros sistemas de expresión; por ejemplo,
preferiblemente sistemas de expresión en mamíferos o baculovirus,
así como sistemas de expresión en levaduras.
Los sistemas de expresión en mamíferos son
conocidos en la técnica. Un promotor de mamíferos es cualquier
secuencia de DNA capaz de fijar o unir RNA polimerasa de mamífero e
iniciar la transcripción en dirección 3' de una secuencia
codificadora (por ejemplo, un gen estructural) en mRNA. Un promotor
tendrá una región iniciadora de la transcripción, que está
usualmente colocada próxima al extremo 5' de la secuencia
codificadora, y una caja TATA, usualmente localizada
25-30 pares de bases (pb) hacia el extremo 5' del
sitio de iniciación de la transcripción. Se cree que la caja TATA
dirige la RNA polimerasa II a comenzar la síntesis de RNA en el
sitio correcto. Un promotor de mamíferos también contendrá un
elemento promotor en dirección 5', usualmente localizado 100 a 200
pb hacia el extremo 5' de la caja TATA. Un elemento promotor en
dirección 5' determina la velocidad a la que se inicia la
transcripción y puede actuar en cualquier orientación, Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd
ed. 1989).
La presencia de un elemento potenciador
(potenciador), combinado con los elementos promotores descritos
antes, aumentará usualmente los niveles de expresión. Un
potenciador es una secuencia de DNA reguladora que estimula la
transcripción hasta 1000 veces cuando esta unidad a promotores
homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis el sitio de
iniciación del RNA normal. Los potenciadores también son activos
cuando están colocados hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3'
desde el sitio de iniciación de la transcripción, en
orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000
nucleótidos desde el promotor, Maniatis et al.,
Science 236:1237 (1989); Alberts et al., Molecular
Biology of the Cell, 2nd ed (1989). Los elementos potenciadores
derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que
usualmente tienen una gama más amplia de hospedantes. Ejemplos
incluyen el potenciador del gen temprano de SV40, Dijkema et
al ., (1985) EMBO J. 4:761, y los
potenciadores/promotores derivados de la repetición terminal larga
(LTR) del virus de sarcoma de Rous, Gorman et al., (1902)
Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777, y de citomegalovirus humanos,
Boshart et al., (1985) Cell, 41:5221. Adicionalmente,
algunos potenciadores son regulables y solamente llegan a ser
activos en presencia de un inductor, tal como una hormona o ion
metálico, Sassorte-Corsi et al., (1986)
Trends Genet. 2:215; Maniatis et al., (1987)
Science, 236:1237.
Una molécula de proteína puede ser expresada
intracelularmente en células de mamíferos. Una secuencia promotora
puede ser enlazada directamente a una molécula de DNA, en cuyo caso
el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante
será siempre una metionina, que esta codificado por el codón de
iniciación ATG. Si se desea, la metionina
N-terminal puede ser escindida desde la proteína por
incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Alternativamente, las proteínas extrañas también
pueden ser secretadas desde la célula en el medio de crecimiento
creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de
fusión constituida por una secuencia líder que proporciona la
secreción de la proteína extraña en células de mamíferos.
Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el
fragmento delantera o líder y el gen extraño que pueden ser
escindidos bien sea in vivo o bien sea in vitro. El
fragmento de la secuencia líder usualmente codifica un péptido de
señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la
secreción de la proteína desde la célula. El líder tripartito de
adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que proporciona la
secreción de una proteína extraña en células de mamíferos.
Usualmente, las secuencias de transcripción,
terminación y poliadenilación reconocidas por células de mamíferos
son regiones reguladoras situadas en 3' respecto al codón de parada
de la traducción y por tanto, junto con los elementos del promotor,
flanquean la secuencia codificadora. El extremo 3' del mRNA maduro
se forma y por escisión posterior a la traducción y
poliadenilación, Birnstiel et al., (1985) Cell,
41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end
processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing"
(ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends
Biochem. Sci. 14:105. Estas secuencias dirigen la transcripción
de un mRNA que puede ser traducido en el polipéptido codificado por
el DNA. Ejemplos de señales de terminador de la
transcripción/
poliadenilación incluyen las derivadas de SV40, Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
poliadenilación incluyen las derivadas de SV40, Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Algunos genes pueden ser expresados más
eficazmente cuando están presentes intrones. Sin embargo, diversos
cDNA, se han expresado eficazmente, a partir de vectores que carecen
de señales de empalme (también denominadas sitios donadores y
aceptores de empalme), véase, por ejemplo, Gething and Sambrook
(1981) Nature 293:620. Los intrones son secuencias
intercaladas no codificadoras dentro de una secuencia codificadora
que contienen sitios donadores y aceptores de empalme. Se eliminan
en el empalme después de la poliadenilación de los transcritos
primarios, Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green
(1986) Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett et al.,
(1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Kramer and Maniatis
(1988) "RNA splicing", In Transcription and
splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover).
Usualmente, los componentes antes descritos, que
comprenden un promotor, una señal de poliadenilación, y una
secuencia de terminación de la transcripción se colocan juntos en
construcciones para expresión. Los potenciadores, los intrones con
sitios funcionales aceptores y donadores de empalme, y las
secuencias líderes también puedan estar incluidos en una
construcción de expresión, si se desea. Los sistemas de replicación
en mamíferos incluyen los derivados de virus animales, que
requieren para replicarse factores de acción trans. Por ejemplo, los
plásmidos que contienen el sistema de replicación de papovavirus,
tales como SV44, Gluzman (1981) Cell, 23:175, o
poliomavirus, se replican en un número de copias extremadamente alto
en presencia del antígeno viral T apropiado. Ejemplos adicionales
de replicones de mamíferos incluyen los derivados de papilomavirus
de bovino y el virus de Epstein-Barr.
Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación,
permitiendo por tanto ser mantenido, por ejemplo, en células de
mamífero para la expresión y en un hospedante procariota para
clonación y amplificación. Ejemplos de dichos vectores lanzaderas de
mamíferos-bacterias incluyen pMT2, Kaufman et
al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946, y pHEBO,
Shimizu et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074.
El método de transformación usado depende del
hospedante que se ha de transformar. Los métodos para la
introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos
son conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por
dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada
por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación,
encapsulación de (de los) polinucleótido(s) en liposomas, y
micro-inyección directa del DNA en los núcleos.
Las líneas de células de mamíferos disponibles
como hospedantes para expresión son conocidas en la técnica e
incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en The
American Type Culture Collection (ATCC), que incluyen, pero sin
limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa,
células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono
(COS), células de carcinoma humano hepatocelular (por ejemplo, Hep
G2), y cierto número de otras líneas celulares.
La secuencia de ácido nucleico
DP-75 también puede ser insertada en un vector de
expresión de insectos adecuado, y se une operativamente a los
elementos de control dentro del vector. La construcción del vector
emplea métodos que son conocidos en la técnica.
Generalmente, los componentes del sistema de
expresión incluyen un vector de transferencia, usualmente un
plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de
baculovirus, como un sitio de restricción conveniente para la
inserción del gen o genes heterólogo(s) que han de
expresarse; un baculovirus de tipo natural con una secuencia
homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de
transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen
heterólogo en el genoma del baculovirus); y células de insectos
como hospedantes apropiadas y medio de crecimiento.
Después de insertar la secuencia de DNA de
DP-75 en el vector de transferencia, el vector y el
genoma viral de tipo natural se transfectan en una célula
hospedante de insecto en donde se dejan recombinar el vector y el
genoma viral. El virus recombinante empaquetado se expresa y se
identifican y purifican las placas recombinantes. Los materiales y
métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de
insectos están comercialmente disponibles en forma de kit, entre
otras compañías, en Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac").
Estas técnicas generalmente son conocidas por expertos en la
técnica y están completamente descritas en el trabajo de Summers
and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº.
1555 (1987) (en lo sucesivo citado como "Summers and
Smith").
Antes de insertar la secuencia de DNA que
codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes
antes descritos, que comprenden un promotor, una secuencia líder (si
se desea), una secuencia codificadora de interés, y una secuencia
de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente en una
construcción intermedia (vector de transferencia).
Usualmente, el vector de transferencia más
comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373.
También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los
expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que
altera el codón de iniciación de polihedrina de ATG a ATT, y que
introduce un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases hacia el
extremo 3' desde ATT; véase Luckow and Summers, Virology
(1989) 17:31. El plásmido usualmente contiene también la señal de
poliadenilación de polihedrina (Miller et al., (1988)
Ann. Rev. Microbiol, 42:177) y un gen procariota de
resistencia a ampicilina (amp) y el origen de replicación
para la selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus
contienen usualmente un promotor de baculovirus. Un promotor tendrá
una región de iniciación de la transcripción que está colocada
usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta
región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio
de unión de RNA-polimerasa y un sitio de iniciación
de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus
también puede tener un segundo dominio denominado un potenciador,
que, si está presente, está usualmente distante del gen
estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.
Los genes estructurales, abundantemente
transcritos en momentos tardíos en un ciclo de infección viral,
proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos
incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína
viral polihedrina, Friesen et al., (1986) "The
Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: The
Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); nº de
publicación de la EPO 127839 y 155476; y el gen que codifica la
proteína p10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol.
69:765.
El DNA que codifica secuencias señal adecuadas
puede ser derivado de genes para proteínas secretadas de insectos o
baculovirus, tales como el gen de polihedrina de baculovirus
(Carbonell et al., (1988) Gene, 73:409).
Alternativamente, puesto que las señales para las modificaciones
posteriores a la traducción en células de mamíferos (tales como la
escisión del péptido señal, escisión proteolítica, y fosforilación)
parecen ser reconocidas por células de insectos, y las señales
requeridas para la secreción y acumulación nuclear también parecen
ser conservadas entre las células de invertebrados, las secuencias
líder de origen no insectos, también pueden usarse para
proporcionar secreción en insectos, tales como las derivadas de
genes que codifican \alpha-interferón humano,
Maeda et al., (1985), Nature 315:592; el péptido
liberador de gastrina humana, Lebacq-Verheyden
et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129;
IL-2 humano, Smith et al., (1985) Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de
ratón, (Miyajima et al ., (1987) Gene 58:273; y
glucocerebrosidasa humana, Martin et al., (1988) DNA
7:99.
Después de la inserción de la secuencia de DNA
y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de
la proteína, un célula de insecto hospedante se
co-transforma con el DNA heterólogo del vector de
transferencia y el DNA genómico del baculovirus de tipo natural
-usualmente por co-transfección. Los métodos para
introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus
baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers and
Smith; Ju et al., (1987); Smith et al., Mol.
Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow and Summers (1989)).
Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen, tal como el gen de
polihedrina, por recombinación doble cruzada homóloga; la inserción
también puede ser en una enzima de restricción manipulada
ingenierilmente en el gen de baculovirus deseado. Miller et
al., (1989), Bioassays 4:91.
El vector de expresión de baculovirus
recientemente formado se empaqueta subsiguientemente en un
baculovirus recombinante infeccioso. Los métodos para identificar
virus recombinantes se describen en "Current Protocols in
Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al., eds) en 16.8
(Supp. 10, 1990); Summers and Smith; Miller et al.,
(1989).
Los vectores de expresión recombinantes de
baculovirus recientemente formados se han desarrollado para la
infección en diversas células de insectos. Por ejemplo, los
baculovirus recombinantes se han desarrollado para, entre otras:
Aedes aegypti, Autographs californica, Bombyx mori, Drosophila
melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni
(PCT Nº de Pub. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J.
Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et
al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase
generalmente, Fraser, et al., (1989) In Vitro
Cell. Dev. Biol. 25:225).
Los sistemas de expresión en levadura también
son conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Dichos
sistemas pueden ser usados aunque son menos preferidos en la
presente invención. Para una revisión general de la expression en
levadura, véase Barr et al., (eds.), Yeast Genetic
Engineering, Butterworths, London (1989).
La proteína DP-75 puede ser
purificada después de la expresión en un sistema de célula
hospedante mediante una secuencia de etapas de recuperación y
purificación. Por ejemplo, la DP-75 expresada en
forma de una proteína soluble en E. coli puede ser liberada
rompiendo las células bacterianas en un microfluidizador y ser
recuperadas por precipitación en sulfato amónico al 30%. La
proteína DP-75 puede ser redisuelta luego en un
tampón y purificada por una variedad de etapas incluyendo, por
ejemplo, cromatografía de cambio iónico, cromatografía de exclusión
por tamaño molecular, cromatografía con hidroxiapatito,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de quelación
de metales, HPLC de fase inversa, cromatografía de afinidad, y
precipitaciones adicionales con sulfato de amonio. Estos métodos
son muy conocidos por los expertos en la técnica.
La proteína DP-75 puede ser
usada en una valoración de inhibidores y para preparar anticuerpos
dirigidos contra DP-75. La proteína
DP-75 también puede ser útil como un factor que
favorece el crecimiento de células cancerosas en cultivos. La
proteína DP-75 puede ser combinada con el vehículo
farmacéuticamente aceptable antes citado para uso con la molécula
antisentido de DP-75.
La presente invención se ilustrará a
continuación con referencia a los siguientes ejemplos que exponen
realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, debe
advertirse que estas realizaciones son ilustrativas y de ningún
modo han de entenderse como restrictivas de la invención.
La secuencia parcial de ácido nucleico para
DP-75 se expone a continuación como la SEQ ID NO:1
en forma de una molécula monocatenaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló DP-75 de cDNA
hipotalámico construyendo sondas de ácido nucleico como sigue. Los
primeros 19 nucleótidos (AAGGCCTTTG TTGGGTGCC) proceden del oligo
DO-3 degenerado (AAGGCCTTTGYTGGNYNCC) y el
complemento de los últimos 22 nucleótidos (CCCCGGGGATCAACATTGGGTT)
procede de oligo DO-14 degenerado
(CCCCGGGGATVADVADDGGRTT). La secuencia AGGCCT de
DO-3 comprende un sitio de restricción StuI y la
secuencia CCCGGG de DO-14 comprende un pequeño
sitio de restricción SmaI. La reacción en cadena de la polimerasa
PCR se llevó a cabo en cDNA hipotalámico y se clonaron y
secuenciaron los productos resultantes.
Una colección de tejidos humanos se escrutó en
cuanto a la presencia de DP-75. Kits de
transferencias Northern se adquirieron a Clontech Laboratories
Inc., 4030 Fabian Way, Palo Alto, CA. Una mancha de transferencia
contenía aproximadamente 2 microgramos de RNA de poli A^{+} por
pista de ocho tejidos humanos diferentes. El RNA se hizo correr en
un gel de agarosa al 1,2% con formaldehído desnaturalizante, se
transfirió a una membrana de nilón modificada en carga por
transferencia Northern, y se fijó por irradiación con UV. Las pistas
1-8 contenían RNA de corazón, cerebro, placenta,
pulmón, hígado, musculatura del esqueleto, riñón y páncreas. Están
indicadas las bandas del marcador del tamaño del RNA. Una segunda
mancha de transferencia contenía 2 microgramo de RNA de poli
A^{+} por pista de ocho diferentes secciones del cerebro. La
transferencia se realizó como antes. Las secciones de cerebro
fueron cerebelo humano, córtex cerebral, médula, cordón espinal,
polo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen. Se
encontró que la DP-75 se expresaba en corazón
normal, cerebro y musculatura del esqueleto. El tamaño del mensaje
(RNA) fue mayoritariamente 3 Kb por cerebro, y pareció ser 6 Kb en
corazón y musculatura del esqueleto. Una mirada más completa a las
regiones del cerebro mostró que el córtex cerebral, el polo
occipital, el lóbulo frontal, el lóbulo temporal y el putamen
contenían un mensaje de 3 Kb, pero que el cerebelo contenía un
mensaje de 7,7 Kb. Por consiguiente, parece que puede haber
versiones diferencialmente empalmadas de DP-75 en
diversas regiones del cuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una valoración por transferencia de puntos,
la DP-75 se hibridó a RNA de tejido tanto normal
como canceroso. La fuente de tejido canceroso incluyó renal, de
tiroides, mama, colon, uretra, pulmón, nariz, estómago, esófago,
hígado, linfoma, útero, vejiga, recto y cerebro.
Los kits de transferencia fueron adquiridos a
BioChain Institute, Inc., San Leandro, California, USA. El tampón
de hibridación ExpressHyb^{TM} adquirido a Clontech, Palo Alto,
California, USA, se usó para la transferencia a 68ºC con
DP-75 (SEQ ID NO: 1) a 1x10^{6} cpm/ml durante 2
horas.
En una de cuatro muestras de tiroides, los
niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más
elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la
Figura 1.
En dos de cuatro muestras de colon, los niveles
de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más
elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la
Figura 1.
En una de dos muestras de uretra, los niveles de
mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados
en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura
1.
En una de cuatro muestras de mama, los niveles
de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más
elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la
Figura 1.
En una de cuatro muestras renales, los niveles
de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más
elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la
Figura 1.
En todos los otros tipos de tejidos analizados,
los niveles de mRNA (DP-75) SEQ ID NO:1 fueron
iguales o superiores en las muestras de tejidos normales que en las
muestras de tejidos cancerosos.
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID NO:6 se aisló de una colección del
córtex frontal utilizando un vector fago, y se adquirió a
Stratagene, La Jolla, California, USA. La colección se sondó con la
SEQ ID NO:1, que se generó por un marcador cebado al azar con un
recuento radioactivo final de aproximadamente 1x10^{6} cpm/ml. La
sonda se marcó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con
un kit de marcaje de DNA RediPrime^{TM} adquirido a Amersham,
Arlington Heights, Illinois, USA.
La colección de fagos se propagó y luego se
cultivó en placas sobre veinte placas de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con 3,0-5,0 x 10^{5}
calvas/placa. Las calvas se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. Cada membrana se incubó con la sonda de la SEQ ID
NO:1 durante 2 horas a 65ºC en solución de hibridación
ExpressHyb^{TM} adquirida a Clontech, Palo Alto, California, USA.
Los filtros se lavaron de acuerdo con las instrucciones de
Clontech. La película se expuso a las membranas para identificar las
supuestas placas positivas que contenían el polinucleótido
DP-75 deseado.
Se realizó una segunda ronda de cultivos en
placas e hibridación para identificar una sola calva positiva. Las
calvas positivas de la primera ronda se propagaron y cultivaron en
placas de medio de agar-agar de acuerdo con las
instrucciones proporcionadas Stratagene. Las calvas se transfirieron
a filtros. Estos filtros se incubaron con la sonda de la SEQ ID
NO:1. La sonda y las condiciones de hibridación fueron las mismas
que se han descrito antes. Se identificaron y propagaron las calvas
positivas.
De acuerdo con las instrucciones proporcionadas
por Stratagene, se rescató un plásmido BlueScript del vector fago.
Se secuenció la inserción EcoRl del plásmido. La secuencia del
polinucleótido se muestra en la SEQ ID NO:6.
Pueden aislarse otras secuencias que codifican
el polipéptido DP-75 usando una extensión de cebador
y técnicas de PCR para generar genotecas. Estas técnicas emplean
cebadores que comprenden la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6 o sus
mutantes, fusiones o fragmentos.
Una vez que se han generado las genotecas, puede
ser identificados otros polinucleótidos de DP-75 a
partir de la genoteca usando sondas que comprenden una secuencia de
la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6 o sus mutantes, fusiones o
fragmentos.
Los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos
de DP-75 pueden ser administrados oralmente,
tópicamente o por medios parenterales, incluyendo inyección
subcutánea e inyección intramuscular, implantación de formulaciones
de liberación prolongada, inyección intravenosa, administración
intranasal y similares. Cuando se usan para tratar tumores puede
ser ventajosa aplicar los polinucleótidos o anticuerpos
DP-75, por ejemplo, directamente al sitio, por
ejemplo, durante la cirugía para eliminar la masa del tumor. Por
consiguiente, los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos
DP-75 pueden ser administrados en forma de una
composición farmacéutica que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden ser
soluciones acuosas, emulsiones, cremas, ungüentos, suspensiones,
geles, suspensiones de liposomas y similares.
Los excipientes adecuados incluyen agua,
solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y
soluciones de etanol, glucosa, sacarosa, dextrano, manosa, manitol,
sorbitol, polietilenglicol (PEG), fosfato, acetato, gelatina,
colágeno, Carbopol®, aceites vegetable y similares. Se pueden
incluir adicionalmente conservantes adecuados, estabilizantes,
antioxidantes, antimicrobianos y soluciones tampón, por ejemplo,
BHA, BHT, ácido cítrico, ácido ascórbico, tetraciclina y similares.
Las bases para cremas o pomadas útiles en la formulación incluyen
lanolina, Silvadenc® (Marion), Aquaphor® (Duke Laboratories) y
similares. Otras formulaciones tópicas incluyen aerosoles, vendas
medicadas, y otros apósitos de vendajes. Alternativamente, las
formulaciones pueden incorporar o encapsular los polipéptidos,
polinucleótidos o anticuerpos de DP-75 en una matriz
o membrana de un polímero adecuado, proporcionando de este modo un
dispositivo de liberación prolongada adecuado para la implantación
cerca del sitio que ha de ser tratado localmente. Otros dispositivos
incluyen catéteres y dispositivos de implantación permanente, tales
como la minibomba Alzet®. La preparaciones oftálmicas pueden ser
formuladas usando vehículos comercialmente disponibles, tales como
Sortai-care® (Allergan), Neodecadron® (Merck, Sharp
& Dohme), Lacrilube®, y similares o pueden emplear preparaciones
tópicas, tales como las descritas en la patente de EE.UU. Nº
5.124.155.
Además se puede proporcionar un polipéptido,
polinucleótido o anticuerpo de DP-75 en forma
sólida, especialmente en forma de un polvo liofilizado. La
formulaciones liofilizadas contiene típicamente agentes
estabilizantes y de voluminosidad, por ejemplo seroalbúmina humana,
sacarosa, manitol, y similares. Un descripción a fondo de los
excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en
Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.).
La cantidad de polipéptido, polinucleótido o
anticuerpo de DP-75 requerida para tratar cualquier
trastorno particular variará naturalmente con la naturaleza y
gravedad del trastorno, la edad y estado del sujeto, y otros
factores fácilmente determinados por los expertos ordinarios en la
técnica. La dosis apropiada puede ser determinada por un experto
ordinario en la técnica siguiendo los métodos expuestos en los
ejemplos.
La presente invención se ha descrito con
referencia a realizaciones específicas. Sin embargo, esta solicitud
está destinada a cubrir los cambios y sustituciones que puedan ser
realizados por los expertos ordinarios en la técnica sin apartarse
del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.
El siguiente material se depositó en The
American Type Culture Collection:
| Nombre | Fecha del depósito | N^{o} de entrada |
| Escherichia coli INV\alpha F' DP 75 | 25 de abril 1996 | 98030 |
Los materiales anteriores han sido depositados
en The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
bajo el número de entrada indicado. Este depósito se mantendrá de
acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional de los Depósitos de Microorganismos
para los fines del procedimiento de Patentes. Los depósitos serán
mantenidos durante un periodo de 30 años después de la concesión de
la patente, o durante la vida legal de la patente, el plazo que sea
mayor. Tras la concesión de la patente, los depósitos serán
asequibles al público en ATCC sin restricción.
Estos depósitos se proporcionan simplemente por
conveniencia para conocimiento de los expertos en la técnica, y no
son el reconocimiento de que se requiere un depósito de acuerdo con
la norma 35 U.S.C. \NAK112. Las secuencias de polinucleótidos
contenidas dentro de los materiales depositados, así como las
secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por
ellos, sirven como control en el caso de conflicto con la
descripción escrita de las secuencias en la presente memoria. Para
fabricar, usar o vender los materiales depositados debe solicitarse
una licencia, pero la presente memoria no concede dicha
licencia.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: CHIRON CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo DNA y procedimiento para su uso
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Chiron Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 8097
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94662-8097
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- APODERADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Chung, Ling-Fong
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTO: 36.482
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1203.001
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (510) 601-2704
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 15101 655-3542
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 355 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGCCTTTG TTGGGTGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGCCTTTG YTGGNYNCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCGGGGAT CAACATTGGG TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCGGGGAT VADVADDGGR TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2869 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 626 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (L)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7
Claims (37)
1. Un polinucleótido aislado que comprende a
secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6
o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde
dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia
de ácido nucleico:
2. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, que comprende un fragmento de la secuencia de SEQ
ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 de una longitud entre 15 y 40 pares de
bases.
3. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al
menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.
4. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al
menos 99% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.
5. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 4, que comprende la secuencia monocatenaria 5' a 3'
de ácido nucleico:
6. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido tiene: (a) una
longitud de entre 10 y 50 bases; (b) una longitud de entre 15 y 40
bases; o (c) una longitud de entre 20 y 30 bases.
7. Un vector de expresión aislado que comprende:
(1) una secuencia de control y (2) un polinucleótido de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; en donde dicha
secuencia de control está unida operativamente a dicho
polinucleótido.
8. Una célula hospedante que comprende un vector
de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, en donde:
- (a)
- la secuencia de control es heteróloga para dicho polinucleótido y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido; o
- (b)
- la secuencia de control es heteróloga para dicha célula hospedante y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido.
9. La célula hospedante de la reivindicación 8,
en donde dicha célula es una bacteria, una célula de levadura, una
célula de mamífero o una célula de insecto.
10. La célula hospedante de la reivindicación 9,
en donde la célula se selecciona de ovario de hámster chino,
células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido, células de
riñón de mono, células de carcinoma hepatocelular,
Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas,
Staphylococcus, Streptococcus, Aedes egypt, Autographa californica,
Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y
Trichoplusia ni.
11. Un método para detectar células
hiperproliferantes en una muestra, que comprende:
- (a)
- proporcionar una sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;
- (b)
- poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra en condiciones que permitan la formación de híbridos de polinucleótidos; y
- (c)
- detectar los híbridos.
12. El método de la reivindicación 11, en donde
la sonda tiene una longitud de entre 10 y 50 bases.
13. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido
que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse
con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de
formamida al 50%, en donde dicho polipéptido exhibe al menos 20% de
la actividad biológica del polipéptido codificado por la SEQ ID NO:
6.
14. El polipéptido de la reivindicación 13, en
donde dicho polipéptido está codificado por el polinucleótido de la
SEQ ID NO: 6 o varía de secuencia del polipéptido codificado por la
SEQ ID NO: 6 en menos de 20 aminoácidos.
15. El polipéptido de la reivindicación 13 o 14
o uno de sus fragmentos o fusión, en donde dicho polipéptido exhibe
un epítopo inmunológico del polipéptido codificado por el
polinucleótido de la SEQ ID NO: 6.
16. El polipéptido de la reivindicación 13, en
donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido exhibe al
menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 7.
17. El polipéptido de la reivindicación 13, en
donde la secuencia de aminoácidos es ocho aminoácidos contigua de
la SEQ ID NO: 7.
18. Una composición que comprende el polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
19. Un anticuerpo aislado que específicamente se
une a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17.
20. El anticuerpo aislado de la reivindicación
19, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un epítopo
de un polipéptido que exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID
NO: 7.
21. Un proceso para producir un polipéptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que
comprende:
- (a)
- proporcionar una célula hospedante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10; y
- (b)
- cultivar dicha célula hospedante en condiciones que induzcan la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
22. Un vector antisentido que comprende. (i) un
polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de
hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al
50%; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de
iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.
23. El vector antisentido de la reivindicación
22, que comprende además un origen de la replicación.
24. El vector antisentido de la reivindicación
22, que comprende además un polinucleótido capaz de facilitar la
integración del vector en un genoma.
25. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 1 a
32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido
es además capaz de escindir el mRNA que codifica un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 14.
26. Un de vector ribozima que comprende:
- (i)
- una secuencia de polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y
- (ii)
- un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,
en donde dicho polinucleótido es además capaz de
escindir dicho polinucleótido de (i).
27. El vector antisentido de la reivindicación
22 o el vector de ribozima de la reivindicación 26, en donde dichas
secuencias para iniciar la transcripción se derivan de un
retrovirus, un adenovirus, o un virus
adeno-asociado.
28. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz de un polinucleótido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente capaz de
potenciar la absorción del polinucleótido.
29. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, que comprende además una sal soluble en agua.
30. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, que comprende además un ácido grado.
31. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, en donde dicho ácido graso es aceite de
sésamo.
32. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, que comprende además un éster de ácido graso
sintético.
33. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, en donde dicho éster de ácido graso se selecciona
del grupo que consiste en oleato de etilo y triglicéridos.
34. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, que comprende además una sustancia para aumentar
la viscosidad de la composición.
35. La composición farmacéutica de la
reivindicación 34, en donde dicha sustancia se selecciona de
carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol, y
dextrano.
36. Uso de:
- (a)
- un vector antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 o 27;
- (b)
- un vector de ribozima de acuerdo con la reivindicación 26 o 27; o
- (c)
- un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20; en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.
37. Un método para detectar polipéptidos en una
muestra in vitro, que comprende:
- (a)
- proporcionar un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20;
- (b)
- poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación complejos anticuerpo/antígeno; y
- (c)
- detectar los complejos.
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