【発明の詳細な説明】
結合組織増殖因子−２
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で、「ＣＴＧ
Ｆ−２」と呼ばれる結合組織増殖因子−２である。本発明はまた、そのようなポ
リペプチドの作用を阻害することにも関する。
ＣＴＧＦポリペプチドは、構造上および機能上、増殖因子ファミリーに関連し
、この増殖因子には、ＩＧＦ(インスリン様増殖因子)、ＰＤＧＦ(血小板由来増
殖因子)、およびＦＧＦ(繊維芽細胞増殖因子)が含まれる。この出現する(emergi
ng)ファミリーの分泌タンパク質は、一群のシステインに富むタンパク質である
。この群の増殖因子は、正常増殖、分化、胚の軟骨性骨格の形態形成、および細
胞増殖に重要である。これらの増殖因子に関して発見されている幾つかの機能の
中には、創治癒、組織修復、移植片固定、および骨質量の増加を刺激することが
ある。
増殖因子の広範囲にわたるスーパーファミリーには、とりわけ、ＴＧＦ(トラ
ンスフォーミング増殖因子)、骨形態形成因子、およびアクチビンが含まれる。
最も周知の増殖因子であるＴＧＦは、様々な細胞に対して多数の異なった効果
を発揮する。例えば、ＴＧＦ−βは、他の細胞の分化を誘発する(Ｓeyedine,Ｓ.
Ｍ.ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８２：２２６７−２２７１（１９８７）)中胚葉起源
の幾つかの細胞の分化を阻害することができ(Ｆlorini,Ｊ.Ｒ.ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃh em.
、２６１：１６５９−１６５１３（１９８６）)、また様々な種類の上皮細胞
の増殖を強力に阻害することができる(Ｔucker,Ｒ.Ｆ.、Ｓcience、２２６：７
０５−７０５（１９８４）)。この最後の活性は、ＴＧＦ−βに関する１つの重
要な生理的役割が、多くの種類の細胞の増殖状態の抑制を維持することであろう
という推測をもたらしている。従って、ＴＧＦ−βに応答する能力を失った細胞
は、恐らく、増殖の制御不能を示して、腫瘍形成性となるであろう。
従って、アミノ酸配列の相同性から、本発明のポリペプチドは、様々な異なっ
た組織に対して多くの効果を有する、増殖因子の、この広範囲にわたるファミリ
ーの一員である。
本発明の一態様により、ＣＴＧＦ−２である新規成熟ポリペプチド、さらには
また、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプ
チドは、ヒト起源である。
本発明の別の態様により、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術によ
り製造する方法を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的、例えば、結合およ
び支持組織の修復を高めるために、組織移植片の付着、固定および安定化を促進
するために、また創治癒を高めるために利用する方法を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提
供する。
本発明のまた別の態様により、例えば、ＣＴＧＦ依存性の腫瘍増殖の処置にお
いて、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために使用することができる、
そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビターを提供する。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら
かであろう。
以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含
される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
第１図は、ＣＴＧＦ−２のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。
第２図は、ＣＴＧＦ−２(上段)とＣyr６１(下段)との間のアミノ酸比較であり
、アミノ酸配列の相同性を説明する。
第３図は、ＣＴＧＦ−２(上段)とマウスＣＴＧＦ(下段)との間のアミノ酸比較
であり、アミノ酸配列の相同性を説明する。
第４図は、ＣＴＧＦ−２のノーザンブロット分析の結果を示す。
本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド
、またはＡＴＣＣ寄託番号第７５８０４号として寄託されたクローンのcＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌク
レオチド)を提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト胎児の肺から得られたcＤＮＡライブラリ
ー中で発見された。それは、構造的上、ＩＧＦおよびＰＤＧＦファミリーに関連
する。それは、約３７５個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする開放読み枠
(オープンリーディングフレーム)を含み、このうち、最初の約２４個のアミノ酸
残基は推定されるリーダー配列であることから、推定される成熟タンパク質は２
０１個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、マウスＣＴＧＦに対し、４
９％の同一性および６７％の類似性をもって、またＣyr６１に対し、８９％の同
一性および９３％の類似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。Ｃyr６１は
、血清により刺激されたマウス繊維芽細胞中で最初に同定された、増殖因子誘導
可能な即時型初期遺伝子である。それは、システインに富む分泌タンパク質の出
現するファミリーの一員をコードし、これには、結合組織増殖因子が含まれる(
Ｏ'ＢrienおよびＬau,Ｌ.Ｆ.、Ｃell Ｇrowth Ｄiffer.、３：６４５−５４（１
９９２）)。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、こ
のＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮ
Ａは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非
コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配
列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じで
あってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮ
Ａまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコー
ド配列であってもよい。
第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成
熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリー
ダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コード配
列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、およ
び成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／
または３'といったような非コード配列。
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリ
ペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的
コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、ア
ナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。
ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体
またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。
従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託され
たクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ
、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコ
ードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに
付加および挿入変異体が含まれる。
先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に
存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在する
アレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレ
ル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し
得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチド
の機能を実質的には変えない。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする
マーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細胞宿主の場合には、そ
のマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するため
の、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であって
よく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合
には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは
、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(
Ｗilson,Ｉ.ら、Cell、３７：７６７（１９８４）)。
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性
がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくと
も９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう
ことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
するポリヌクレオチドは、第１図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有する
ポリペプチドをコードする。
本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への
便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求
されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾す
る際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売す
るには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与され
ない。
本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＴＧＦ−２ポリペプチド、さら
にはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関
する。
第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語
は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有する
ポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断す
ることにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロ
プロテインが含まれる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。
第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で
置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードさ
れるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）
１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成
熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリ
エチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）
リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、
またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチド
に融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナロ
グは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される
のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。
「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存
在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きて
いる動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され
ていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同
じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌク
レオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは
組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク
ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術
による製造にも関する。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本
発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス
フォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラ
スミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プ
ロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＣＴＧＦ−２遺
伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができ
る。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先
に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用
することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発
現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。その
ようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４
０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラス
ミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニ
ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡ
が含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であっ
て、生存可能である限り、使用することができる。
適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般
には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ
れる。
発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能
に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、
以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacま
たはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終
結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダク
ターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイ
クリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細
胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能な
マーカー遺伝子を含むのが好ましい。
上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制
御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、
その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。
適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es
、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞
；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢow
esメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明
細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含ん
でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向
で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター
を含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、
該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当
なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている
。以下のベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−
９(Ｑ
iagen)、pＢＳ、pＲＧ１、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ
１７４、pＢluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、p
ＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；pＴrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、p
ＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡ
Ｔ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ
、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、
それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができ
る。
プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝
子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およ
びＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには
、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後
期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−
Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ
ベルの範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿
主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞
であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物
の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行う
ことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in
Ｍolecular Ｂiology（１９８６）)。
宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる
遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発
明
のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もま
た使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニン
グおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory
Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により
記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エン
ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ
モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡ
のシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側
にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが含まれる。
通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ
ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリ
ン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転
写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ
ョックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構
造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の
細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共
に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所
望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与え
るＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構
造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモー
ターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。その
ベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカー
および複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原
核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びに
Ｐseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な
種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは
、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素
を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の
複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ
２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧ
ＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ
３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合
わせる。
適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度
までの増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフ
トまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により
破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理
、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊
でき、そのような方法は、当業者に周知である。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用
することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５
（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、お
よび適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベク
ターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの
必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク
セプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでな
るであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリア
デニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。
ＣＴＧＦ−２ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマ
トグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製する
ことができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体
配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフ
ィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物
であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ
とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチ
ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
本発明のＣＴＧＦ−２ポリペプチドは、結合および支持組織の修復を高めるた
めに使用することができる。例えば、ＣＴＧＦ−２は、損傷、アクネ、老化、Ｕ
Ｖダメージまたは熱傷といったような、皮膚障害を処置するために使用すること
ができる。ＣＴＧＦ−２はまた、例えば、しわが寄った皮膚を処置することによ
り、皮膚の化粧上の外観を改良するために使用することもできる。
ＣＴＧＦ−２はまた、組織移植片、例えば、再構築手術の間に挿入されたプロ
テーゼおよび他の移植片の付着、固定および安定化を促進するために使用するこ
ともできる。本発明のＣＴＧＦ−２ポリペプチドは、上皮および結合組織の増殖
、並びに総タンパク質およびコラーゲンの合成を促進することにより、外創傷の
治癒に使用することができる。ＣＴＧＦ−２は、結合組織、骨およびセメント質
の増殖を促進することにより、またタンパク質およびコラーゲン合成を刺激する
こ
とにより起こる再生をもって、損傷した、または減損した骨の領域に適用するこ
とができ、これは特に、歯周病に有用である。
本発明のポリペプチドはまた、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定す
るのにも有用である。例えば、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチド
プローブを合成することにより、ＣＴＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離する。
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒ
トのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用し
て、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する
。
該ポリペプチドはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポ
リペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもでき
る。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該
ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の
使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。
同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおけ
る発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知ら
れているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボに
おいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレト
ロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。その
ような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他
の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作する
ための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒク
ルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することがで
きるアデノウイルスであってもよい。
本発明のポリペプチドは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することがで
きる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容
され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定され
るものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリ
セロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投
与方法に適合すべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１
つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ
のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を
規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに
、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができる。
該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経
路といったような、便利な方法で投与することができる。ＣＴＧＦ−２は、具体
的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、Ｃ
ＴＧＦ−２は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、ＣＴＧＦ−２は、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであ
ろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日
約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色
体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで
きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配
列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を
マークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ
ピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階で
ある。
簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp)
を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡのコ
ンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン(s
pan)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする
。
次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、そ
れらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰
属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい
ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成
することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他
のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソー
ティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特
異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
セレクションが含まれる。
cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ
ーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ
る。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することが
できる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳ
Ｔが得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、
２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、
恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には
、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐerga
mon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。
ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的
位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv
ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を
結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する
。
次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノ
ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全
てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ
の変異は疾患の原因となるものであるらしい。
現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する
染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺
伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析およ
び２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの
アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対す
る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト
化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成
物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメン
トの製造に使用することができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ
ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ
トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして
得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ
リペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプ
チドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような
抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する
ことができる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗
体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo
hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオ
ーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm
unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥ
Ｂ
Ｖ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃ
ancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。
単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号)
は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合
し得る。
本発明は、ＣＴＧＦ−２ポリペプチドに対する受容体の同定方法を提供する。
該受容体をコードする遺伝子は、発現クローニングにより同定することができる
。簡単に言えば、ポリアデニル化ＲＮＡをＣＴＧＦ−２に応答する細胞から調製
して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプールに分けて、ＣＯＳ
細胞またはＣＴＧＦ−２に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使
用する。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標識
化ＣＴＧＦ−２にさらす。ＣＴＧＦ−２は、ヨウ素化または部位特異的プロテイ
ンキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標識化することが
できる。固定およびインキュベーションに続いて、そのスライドをオートラジオ
グラフ分析にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブ
プーリングおよび再スクリーニング方法を利用して、再びトランスフェクトし、
最終的には、推定される受容体をコードする単一クローンを得る。受容体を同定
するための他の方法として、標識化リガンドを細胞膜と光親和性により結合させ
るか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することができる。橋かけ(cro
ss-linked)物質をＰＡＧＥにより分けて、Ｘ線フィルムにさらす。ＣＴＧＦ−２
−受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分けて、タンパ
ク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ
酸配列を使用して、一組のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、cＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングして、推定される受容体をコードする遺伝子が同定さ
れるであろう。
本発明はまた、ＣＴＧＦ−２の、その受容体との相互作用を高める、またはブ
ロックする薬物を同定するために、薬物をスクリーニングする方法も提供する。
アゴニストは、ＣＴＧＦ−２の天然の生物学的機能を増大させる化合物であり、
またアンタゴニストは、これらの機能を阻害する。例として、ＣＴＧＦ−２受容
体を発現する哺乳動物の細胞または膜調製物が、薬物の存在下に標識化ＣＴＧＦ
−２とインキュベートされるであろう。次いで、この相互作用を高める、または
ブロックする、その薬物の能力を測定することができるであろう。あるいはまた
、ＣＴＧＦ−２と、その受容体との相互作用に続いて、既知の第二メッセンジャ
ーシステムの応答が、薬物の存在下、または不存在下に比較測定されるであろう
。そのような第二メッセンジャーシステムには、これらに限定されるものではな
いが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシ
チド加水分解が含まれる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト／インヒビター分子、
およびＣＴＧＦ−２の機能を減少させる、または排除する際の、それらの使用に
も関する。
アンタゴニストの例は、ＣＴＧＦ−２ポリペプチドに結合する抗体、または幾
つかの場合には、オリゴヌクレオチドである。あるいはまた、アンタゴニストに
は、生物学的機能を失っており、またそのことによって、受容体部位が占有され
ることから、ＣＴＧＦ−２の作用を防ぐ、密接に関連したタンパク質が含まれる
。
アンチセンス技術を利用して、インビボにおけるＣＴＧＦ−２の循環レベルを
減少させることができる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成または
アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、
この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく
。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５
’コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴ
ヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子
領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes
.、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そ
のことによって、転写およびＣＴＧＦ−２の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮ
Ａ分
子のＣＴＧＦ−２への翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeuroch
em.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnh
ibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込み、アンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＣＴＧＦ−２の産生を阻害する
ことができる。
インヒビターの例は、ＣＴＧＦ−２受容体に結合する小さな分子であり、従っ
て、正常な生物学的活性が阻害される。小さな分子の例には、これらに限定され
るものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。
該アンタゴニスト／インヒビターを使用して、結合組織の過剰増殖による瘢痕
の形成を防ぎ、またＣＴＧＦ−２依存性の腫瘍増殖を防ぐことができる。該アン
タゴニスト／インヒビターは、例えば、上記のような薬学上許容され得る担体と
共に、組成物中で使用することができる。
本発明はまた、ＣＴＧＦ−２に特異的な、強力なアンタゴニスト／インヒビタ
ーを同定するためのアッセイにも関する。そのようなアッセイの例は、競合阻害
アッセイの場合、ＣＴＧＦ−２およびアンタゴニスト／インヒビター候補物を、
適当な条件下に膜結合型ＣＴＧＦ−２受容体または組換えＣＴＧＦ−２と結合さ
せる。ＣＴＧＦ−２は、放射能等により標識化することができるので、該受容体
に結合したＣＴＧＦ−２分子の数から、アンタゴニスト／インヒビター候補物の
有効性を測定することができる。
本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのよ
うな実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこ
とわらない限り、重量単位である。
以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および
／または用語を記載する。
「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および
／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限
定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手
可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触
媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており
、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう
に使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築
のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中
、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に
適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間
のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えるこ
とができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して
、所望のフラグメントを単離する。
切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒe
s.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリルアミド
ゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような
合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存
在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドに
ライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな
いフラグメントにライゲートするであろう。
「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ
ル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわ
らない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほ
ぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に
、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa
n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ
れているようにして行った。
実施例１ バキュロウイルス発現システムにおけるＣＴＧＦ−２のクローニングおよび発現
完全な長さのＣＴＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７
５８０４号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを利用して増幅した。その５'プライマーは、配列：
を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞における翻
訳の開始に有効なシグナルに似ている１８ヌクレオチドを含む(Ｊ.Ｍol.Ｂiol．
１９８７、１９６、９４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)。翻訳開始コドン「ＡＴＧ」
に下線を引く。
その３'プライマーは、配列：
を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Ａsp ７８１の切断部位、およびＣＴＧＦ
−２遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な２０ヌクレオチドを含む。増幅さ
れた配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla
、Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメ
ントをエンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよびＡsp７８１で消化した後、１％ アガ
ロースゲル上で単離することにより精製した。このフラグメントをＦ２と名付け
る。
ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロ
ウイルス発現システムを用いてのＣＴＧＦ−２タンパク質の発現に使用した(復
習には、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manual of method
s for baculovirus vectors and insect cell culture procedures、Ｔexas Ａg
ricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発
現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニア核多角体病ウイル
ス群(ＡcＭＮＰＶ)の強多角体(strong polyhedrin)プロモーター、続いて、制限
エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよびＡsp７８１の認識部位を含む。シミアンウ
イルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。
組換えウイルスを容易に選択するには、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を、多角体(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロ
モーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野
生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列
を多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、p
Ａc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１といったようなpＲＧ１の代わりに
使用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirol
ogy、１７０：３１−３９)。
プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp７８１で消化した後、当業界で既知
の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮ
Ａを１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。
フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラスミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼ
でライゲートさせた。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォームして
、ＣＴＧＦ−２遺伝子を有するプラスミド(pＢacＣＴＧＦ−２)を含む細菌を、
酵素 ＢamＨＩおよびＡsp７８１を用いて同定した。クローン化されたフラグメ
ントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
リポフェクション法を利用して、プラスミド pＢacＣＴＧＦ−２ ５μgを市販
の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧoldTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐhar
mingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフェクトした(Ｆelgne
rら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７
）)。
ＢaculoＧoldTMウイルス ＤＮＡ １μgおよびプラスミド pＢacＣＴＧＦ−２
５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithe
rsburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合し
た。その後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加
え、混合して、室温で１５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクシ
ョン混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播
種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加した。そのプレートを
前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合した。次いで、そのプレートを２
７℃で
５時間インキュベートした。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレー
トから除去して、１０％ ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた
。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。
４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上記)により記載されたように
して、プラークアッセイを行った。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechno
logies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用したが、このことに
より、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラ
ークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、お
よびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイ
ルス学、９−１０頁にも見い出すことができる)。
４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加え、青色に染色されたプラークをエ
ッペンドルフピペットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させた。その寒
天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、
３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞に使用した。４日後、これらの培養皿の上
清を収集した後、４℃で保存した。
Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させた。
その細胞を、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＣＴＧＦ−２
に感染させた。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを
含まないＳＦ９００ II 培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替
えた。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの35Ｓ システイ
ン５μＣi(Ａmersham)を加えた。その細胞をさらに１６時間インキュベートした
後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびオートラジオグラフィーにより視覚化した。
実施例２
ＣＯＳ細胞における組換えＣＴＧＦ−２の発現
プラスミド、ＣＴＧＦ−２ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アン
ピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４
０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベク
ター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)から得られる。完全なＣＴＧＦ−２前駆体
およびその３'末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮＡフラグメ
ントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化したことから、組換えタ
ンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のよ
うなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する
(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、およ
びＲ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我々の標的タンパ
ク質へ加えることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体
で容易に検出することが可能となる。
プラスミド構築方法を以下に記載する：
ＣＴＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５８０４号を、２つのプ
ライマーを用いての、完全な長さのクローンでのＰＣＲにより構築した：
５'プライマー
は、ＢamＨＩ部位、続いて、開始コドンに関連する−３の位置から始まる、１８
ヌクレオチドのＣＴＧＦ−２コード配列を含む；
３'配列
は、Ｘba Ｉ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およびＣＴ
ＧＦ−２コード配列の最後の１９ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を
含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＢamＨＩ部位、ＣＴＧＦ−２コード配列、続いて
、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳末端終止コドン、およびＸ
baＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター、
pc
ＤＮＡＩ／Ａmpを、ＢamＨＩおよびＸbaＩ制限酵素で消化して、ライゲートさせ
た。そのライゲーション混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓ
ystems、１１０９９ Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌa Ｊolla、ＣＡ ９２０
３７から入手可能である)にトランスフォームし、そのトランスフォームされた
培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択した。プラ
スミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在
に関して制限分析により試験した。組換えＣＴＧＦ−２の発現には、ＤＥＡＥ−
ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトした
(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８９）)。ＣＴＧＦ
−２ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。(
Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring
Ｌaboratory Ｐress、（１９８８）)。トランスフェクションから２日後、細胞
を35Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界
面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤ
Ｓ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))で溶菌し
た。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養
培地は両方とも、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降した。沈降したタン
パク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
実施例３
ヒト組織におけるＣＴＧＦ−２の発現パターン
ノーザンブロット分析を行って、ヒト組織におけるＣＴＧＦ−２の発現レベル
を調べた。全体の細胞ＲＮＡ試料をＲＮＡzolTMＢ システム(Ｂiotecx Ｌaborat
ories,Ｉnc．６０２３ Ｓouth Ｌoop Ｅast、Ｈouston、ＴＸ ７７０３３)で単
離した。指定された各々のヒト組織から単離された総ＲＮＡ約１０μgを１％ ア
ガロースゲルで分離して、ナイロンフィルター上にブロットした(Ｓambrook、Ｆ
ritsch、およびＭaniatis、Ｍolecular Ｃloning、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐre
ss、（１９８９）)。Ｓtratagene Ｐrime−Ｉｔキットにより、標識化反応をＤ
ＮＡフラグメント５０ngで行った。標識化ＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラム(５
Ｐrime−３ Ｐrime,Ｉnc．５６０３ Ａrapahoe Ｒoad、Ｂoulder、ＣＯ ８０３
０３)で精製した。次いで、０.５Ｍ ＮaＰＯ4(pＨ ７.４)および７％ ＳＤＳ中
、フィルターを、１,０００,０００cpm／mlの、完全な長さの放射能標識化ＣＴ
ＧＦ−２遺伝子と、６５℃で一晩ハイブリダイズした。０.５×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳを用いて、室温で２回および６０℃で２回洗浄した後、そのフィルター
を増感紙に−７０℃で一晩さらした。ＣＴＧＦ−２のメッセージＲＮＡは、心臓
に豊富である(第３図)。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後
記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる
。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/475 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＤＳ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/02 ＡＤＵ
//(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）