JPH05505529A - 新規な薬物および試薬の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な薬物および試薬の同定 発明の分野 本発明は、療法、診断および研究用の新規な組成物の同定、調製および使用、な らびにそれらの使用法に関するものである。より詳細には、本発明は新規なアン チセンス組成物、すなわちハイブリダイゼーションにより核酸と相互作用してそ れらの機能に影響を及ぼし、これによりそれらの生物学的活性を変化させる組成 物に関するものである。療法、診断および研究用の新規な組成物ならびに診断、 処置および実験のための方法をもたらすこれらのアンチセンス組成物の同定法が 提供される。

発明の背景 大部分の疾病状態を含めて踊乳動物の身体状態は大部分が蛋白質により影響され ることは周知である。これらの蛋白質は直接に、またはそれらの酵素機能を介し て作用することにより、動物およびヒトにおける多くの疾病に主として関与する 。古典的な療法は一般にこれらの蛋白質との相互作用に注目し、それらが疾病を 引き起こし、または疾病を増強する機能を緩和する努力を行ってきた。しかし最 近では、それらの蛋白質の合成を指示する分子、すなわち細胞内ＲＮＡとの相互 作用によりそれらの蛋白質の実際の産生を調整する試みがなされている。蛋白質 の産生を阻害することにより最大の効果および最小の副作用において療法結果に 効果を得ることが期待された。これらの療法の一般的な目的は、望ましくない蛋 白質の形成をもたらす遺伝子発現を妨害その他の形で変調させることである。

ある程度受は入れられている特異的遺伝子発現抑制のための１方法は、特異的な ターケットメｙセンシャーＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド同族体による“ アンチセンス“法である。多数の研究者かこのような試みを報告している。関連 の総説には下記のものか含まれる°スタインおよびコーエン（Ｃ，Ａ、Ｓｔｅ＆ 　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｖｏｌ、２．ｐ、５０２−５０４　（１９８８）； マーカスーセクラ（Ｃ，−Ｊ、Ｍａ　ｒｃｕｓ−３ｅｋｕｒａ）、　Ａｎａ　１ ．Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ、１７２．２８９−２９５　（１９８８）；シン（ Ｇｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、５．ｐ、５３９−５４９　（ １９８８）：ファン・デル・クロル、モルおよびストライチェ（Ａ、　Ｒ，Ｋｒ ｏ　ｌ。

ｏｌ、６．ｐ、９５８−９７３　（１９８８）およびルーズミッチェル（Ｄ、　 Ｓ。

Ｌｏｏｓｅ−Ｍｉ　ｔｃｈｅｌ　ｌ）、ＴＩＦ’Ｓ、ｖａｔ、９．　ｐ、４５− ４７　（Ｌ９８８）。以上はそれぞれ一般的アンチセンス理論に関する背景およ び先行技術を提示する。

アンチセンス療法における従来の試みにより、特異的ｍＲＮＡにハイブリダイゼ ーシヨンによって特異的に結合すべく設計されたｍ−それと特異的にハイブリダ イズしうるーーオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体が提供され た。これらの同族体は多数の機構のうちのいずれかにより、選ばれたｍＲＮＡの 活性を抑制するー−そのｍＲＮＡによりコードされる蛋白質が産生される翻訳反 応を阻害する−−ことを意図したものである。これらの阻害されるｍＲＮＡによ りコードされる特異的蛋白質の形成の抑制が、療法上の利益をもたらすと期待さ れている。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの療法活性を高めるために、多数の化学的修飾 がそれらに導入された。それらの修飾はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞 透過性を高めるべく、ヌクレアーゼそのほか体内でそれらオリゴヌクレオチド同 族体の構造または活性を低下させ、または阻害する酵素からそれらを安定化すべ く、かつそれらの薬物動力学的特性を改良すべく設計される。しかし現在では、 −膜化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド療法または診断の方式は見出され ていない。従来の活動は、効果的な活性を起こさせるのに十分な量のアンチセン スオリゴヌクレオチドを適宜な細胞に付与し得なかりたことにより制限されてぃ た。現在入手しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、効果的な療法、 研究試薬または診断に用いるためには実際問題として十分なものでなかった。従 って、効果的な療法および診断に使用しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ クレオチド同族体か長年の要望であった。

この長年の要望は、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法および診断の分野にお ける従来の研究によっては満たされなかった。他の人々は直ちに妥当な利用度で 療法または診断に効果を示す材料を提供し得なかったのである。特に、感染性因 子（ｉｎ４ｅｃｔ　１ｏｕｓ　ａｇｅｎｔ）を効果的に処置しうるオリゴヌクレ オチドを同定するための一般化された方法がなかった。これらのヌクレオチドを 同定するための既知の従来法はすべて、ハイブリダイゼーションを目的とする部 分の核酸に関して予め核酸配列を知ることが要求された。従って感染性因子に対 する有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定し、この同定法が予め核酸配 列を知る必要のないものであることが強く要望される。

発明の目的 本発明の目的は、疾病状態のアンチセンス療法に有用なオリゴヌクレオチドの同 定法を提供することである。

他の目的は、動物の身体機能の状態を判定するのに有用なオリゴヌクレオチドを 同定することである。

さらに他の目的は、たとえば特定のＲＮＡ分子の遺伝子発現を遮断するための研 究用試薬として有用なオリゴヌクレオチドを同定することである。

本発明のさらに他の目的は、動物の身体機能に有意の影響を及ぼすポリペプチド の発現を制御する核酸の座を同定することである。

他の目的は、それに対するハイブリダイゼーションを目的とする核酸の配列を予 め知る必要なしに上記オリゴヌクレオチドを同定および提供することである。

他の目的は本明細書を検討することにより当業者に明らかになるであろう。

発明の要約 アンチセンスオリゴヌクレオチドは有効な療法薬として現在研究されているが、 特定のｍＲＮＡの発現を抑制する最も可能性の高いヌクレオチドを選択する方法 は明らかでない。さらに、多くの場合疾病の経過を変化させるアンチセンス抑制 の目標となる遺伝子を判定することすら困難である。本発明方法はこれらの困難 を克服するものである。

本発明によれば感染性因子のＭｉ酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド の同定法か提供され、この方法は実質的にランダムに配列したオリゴヌクレオチ ドを含む複数のベクターを調製し、これらのベクターを細胞に取込ませることを 含む。これらの細胞を感染性因子で感染させ、細胞が増殖する条件を与える。次 いで、感染に対して耐性である細胞を同定する。好ましくは、感染に対して耐性 である細胞につき、含まれるオリゴヌクレオチドの核酸配列を決定する。

好ましい形態によれば、面相合成その他により約１０−約１００核酸サブユニツ トからなる実質的にランダムに配列したオリゴヌクレオチドを調製する。あるい は好ましくは病原性生物からのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをベクターの調製に 用いることかできる。好ましくはこれらのＤＮＡをフラグメント化し、約５０か ら数千の範囲の多数のサブユニットを含むＤＮＡのプラグメント部分を得る。約 １００−約１０００が好都合であり、好ましい。用いる細胞は、好ましくは感染 性因子によって容易に感染しうるように選ばれる。

他の形態によれば、感染性因子に耐性である細胞に由来するものであ４ことが確 認されている挿入オリゴヌクレオチドの核酸配列を少な（ともその構成部分とし て含む試薬を調製する。これらの試薬から療法、診断および研究用の組成物なら びにキットが調製され、それらを用いる療法、診断および研究のための方法が本 発明に包含されると解される。

図面の簡単な説明 第１図はベクターＩｔｓ　ＲＧ−１の模式的構造を表す。

発明の詳細な記述 本発明は、感染性その他の因子の遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌク レオチド配列の同定法を提供する。ランダム合成により形成された、感染性因子 から感染性因子のＤＮＡもしくはＣＤＮＡをＤＮＡａｓｅで処理することにより まｔ：は粉砕により誘導された、あるいは感染性因子に感染した細胞のｍＲＮＡ から誘導されたオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞内へ形質転換 する。次いで細胞をその感染性その他の因子に感染させる。次いで、感染性因子 の発現を抑制し、従ってその感染性因子の作用を抑止するのに有用であるオリゴ ヌクレオチドを、感染性因子による感染の影響を示さない細胞の選択により選択 する。たとえば細胞が死滅しない、増大した速度で細胞が増殖する、または感染 の変調を示唆する他の挙動を示すなどである。これらの細胞か同定されると、軽 減効果をもつオリゴヌクレオチドの配列を同定する。同定は、ベクターを回収し 、挿入核酸物質を含む頭載を配列決定することにより達成される。

細胞、発現ベクター、およびオリゴヌクレオチド配列選択法は、感染性その他の 因子の種類により決定される。たとえばヘルペスウィルスに対するアンチセンス オリゴヌクレオチドを同定したい場合、選ばれる細胞の種類はそのヘルペスウィ ルスに感染しうるちのであり、発現ベクターは選ばれた細胞ど適合性であるもの である。

本発明によれば、核酸の配列に適用される″ランダム′という語は幾つかの関連 する意味をもつ。たとえば固相合成により形成された真にランダムなオリゴヌク レオチドを包含する。しかしこのプロトコールですら、実際には完全におよび統 計的にランダムである必要はない。たとえば本発明のある形態によれば、一定の 基準のオリゴヌクレオチドの濃縮（ｅｎｒ　ｉ　ｃｈｍｅｎ　ｔ）が望ましいで あろう。

本発明の概念における″ランダム“という語の他の意味は、生物、特に感染性因 子からのゲノムＤＮＡの使用に関するものである。これらのゲノムＤＮＡを生物 から常法により採取し、次いで粉砕またはＤＮＡａｓｅ攻撃処理して、多数のＤ ＮＡフラグメントを形成する。母体ＤＮＡが一定の配列をもつという点で真にラ ンダムではないが、その配列は一般に未知であり、そのフラグメント形成は一般 に無制御である。

本発明に適用される″ランダム″という語の他の意味は、相補的ＤＮＡすなわち ｃＤＮＡに関するものである。相補的ＤＮＡは、生物、特に病原性生物のすへて または若干のＲＮＡにつき調製しうる。次いでこのｃＤＮＡをベクターに挿入し 、他の点ては上記に述へたと同様に使用しうる。

本発明により意図されるラノダムオリゴヌクレオチドの使用か以上の形態すべて を包含することは理解されるであろう。オリゴヌクレオチドのフラグメントまた は部分は、一般に本発明の実施に際して有効な大きさのものである。一般に、合 成により形成されたランダム配列については約２０−１００塩基か用いられ、ゲ ノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについては約１００から数千の塩基ユニットが用いら れる。

発現ベクターおよびオリゴヌクレオチドの操作ならびに細胞の形質転換は、環ハ ーバ−・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−，１９８２、 に見られるものに従って実施される。

本発明方法に用いるのに適した発現ベクターには、市販のプラスミドベクター、 たとえばｐＭＡＭＭ−ＮＥＯ（クローンチク）その他の発現ベクターが含まれる 。

プラスミド発現ベクターがそのベクターの構成および回収を可能にする遺伝子を 少なくとも１種類、たとえば抗生物質耐性遺伝子、たとえばアンピシリン耐性遺 伝子を含むことが好ましい。プラスミド発現ベクターが、ランダムまたは準ラン ダム配列を発現するための誘導性プロモーターおよび転写開始頭載、ならびにそ れらのランダム配列を安定化するポリアデニル化シグナルを含むことも好ましい 。

これは、より効果的な発現のためにイントロンを含んでもよく、含まなくてもよ い。

好ましいプラスミド発現ベクターは第１図に模式的に示したｌ５ｒＳ　ＲＧ−１ である。このベクターは、培養に際して安定に形質転換された細胞のＧ４１８選 択のためのネオマイシン遺伝子、および細菌性増幅のためのアンピシリン遺伝子 を含む。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸｂａ　１部位において切断してスタッファ− （ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを放出させることにより、挿入配列を適性方向 に（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）クローン化することができる。ＨｉｎｄＩｒ ■部位はＲ８Ｖプロモーターのす＜３′側にあり、Ｘｂａ　１部位はウシ成長ホ ルモン（ＢＧＨ）ポリ　（Ａ）部位のす＜５′側にある。

本発明方法に用いられるオリゴヌクレオチドは数種類の供給源から得られる。

ランダム配列は、ＤＮＡ合成装置により各位置においてＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔの等モル 混合物を用いて一定長さのＤＮＡを形成することによって調製しうる。相補的連 鎖はＤＮＡプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて調製しうる。ランダム 配列のＤＮＡ末端を制限酵素開裂により残されたオーバー１１ングに相補的なも のとなすことにより、ランダム混合物を発現ベクター内へクローン化することが できる。準ランダムオリゴヌクレオチドを得るためには、感染性因子のＤＮＡを 剪断またはＤＮＡａｓｅ処理することによって短片に切断しうる。たとえばヘル ペスＤＮＡを剪断またはＤＮＡａｓｅ処理して小サイズとなし、そして発現ベク ター内へ″ショットガンクローン化′することができる。発現した配列のうちあ るものはヘルペス遺伝子に対してアンチセンスであろう。あるいは感染細胞から 単離されたｍＲＮＡよりｃＤＮＡライブラリーを形成する。次いでｃＤＮＡを発 現ベクター内へ、ＲＮＡがアンチセンス配向で産生されるように方向付けてクロ ーン化する。この方法によって、有効な感染にとって重要な新規遺伝子が同定さ れるであろう。

オリゴヌクレオチドを含む発現ベクターが構成されると、これらの発現ベクター をその感染性因子に感染されやすい細胞内へ挿入する。細胞は既にその感染性因 子に感染していてもよく、または発現ベクターの挿入後にその感染性因子に感染 させてもよい。発現ベクターは標準法、たとえばリン酸カルシウムトランスフエ クソラノまたはエレクトロボレーシランにより細胞内へ挿入される。

次いで細胞を培養し、感染性因子のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるオリゴ ヌクレオチドを選択する。選択法は細胞の種類および感染性因子の作用に依存す る。たとえばネオマイシン耐性細胞を１０ｃｍの組織培養皿中でコンフルエンシ ーに達するまで増殖させる。コンフルエンシーに達した時点で集団全体を低Ｍｏ ＩにおいてＨ５Ｖ−１に感染させる。二次感染の頻度を低下させるために、感染 ののち培地を頻繁に交換する。感染に際して生存した細胞をコンフルエンシーに 達するまで増殖させ、次いで同様にして２回目のｇ染を行う。すべての細胞が感 染に際して生存するまで、または個々の耐性コロニーか選択されるまで、この処 理を反復する。

目的とするオリゴヌクレオチドを含む細胞が選択されると、活性をもつオリゴヌ クレオチドの配列を決定する。オリゴヌクレオチド配列の同定は数種の方法によ り行うことができる。オリゴヌクレオチドを発現ベクターから取出し、配列決定 する。あるいは適宜なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により細胞内で オリゴヌクレオチド配列を増幅させ、増幅された配列につき配列決定してもよい 。

実施例 実施例１　ベクターの構成 以下の方法は、培養された哺乳動物細胞のＨ５Ｖ感染を特異的に抑制する配列を スクリーンするためのランダムおよび準ランダムアンチセンスメツセージを形成 する方式を示す。これは３種類の異なる手段で実施することができる。１）ラン ダム混合物の長さの合成オリゴマー、２）準ランダム−ゲノムＤＮＡの剪断によ り調製、および３）Ｈ３Ｖ感染細胞からｃＤＮＡライブラリーを形成。いずれの 場合も用いたベクターはｌ５ＩＳ　ＲＧ−１である。このベクターは培養におい て安定に形質転換された細胞を０４１８選択するためのネオマイシン遺伝子、お よび細菌性増幅のためのアンピシリン遺伝子を含む。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸ ｂａ　１部位において切断してスタッファ−７ラグメントを放出させることによ り、挿入配列を適性方向にクローン化することができる。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位 はＲ３Ｖプロモーターのすぐ３′側にあり、Ｘｂａ　Ｉ部位はウシ成長ホルモン （ＢＧＨ）ポリ（Ａ）部位のすぐ５′側にある（第１図参照）。

■　ランダム配列　各オリゴマーの５′末端がＨｉｎｄ　Ｉ１１部位、ｄ　（Ｃ ＡＡＧＣＴＴＧ）　、からなるようにオリゴヌクレオチドのランダム集団を調製 する。これに約２５ｎｔのランダム配列、次いでテイル配列ｄ　（ＴＣＴＡＧＡ ＧＡＡＡＡＡ）か続き、Ｘｂａ　Ｉ部位およびポリＡテイルが形成される。次い で、３′末端配列に相補的なプライマー、５’　ｄ　（ＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧ Ａ）３’、を、形成されたランダムオリゴマーそれぞれに対する相補鎖を合成す るためのプライマーとして用いて、２本鎖分子を形成する。次いでオリゴマー集 団をＨｉｎｄ　Ｉ［［およびＸｂａ　ｌにより消化して、ベクターと適合性であ る粘着末端を得る。

Ｉｌ、　ランダムゲノムフラグメント　前ｇ己て調製されたＨｉｎｄ　ｉｆおよ びＸｂａ　Ｉ末端を備えたベクターをクレノー断片で充填して、平滑末端を形成 する。次いでリガー七で処理して、分子を再環化する。これによりＸｂａ　１部 位は再生されるか、Ｈｉｎｄ　Ｉ■ｒ部位は除かれる。次いでこのベクターをＸ ｂａ　Ｉで切断し、両端をホスファターゼ処理して、再環化を防止する。次いで ゲノムＤＮＡ全体を種々の濃度のＤＮＡ５ｅ　ｔで切断し、調製用アガロースゲ ル上で目的サイズの生成物を単離することにより、挿入配列を形成する。次いで 剪断されたフラグメントの両端をＴ７　ＤＮＡポリメラーゼおよびＸｂａ　Ｉリ ンカ−１ｄ　（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣ）　、で修復し、平滑末端をリゲートした のち、結合した挿入配列をＸｂａ　Ｉで切断し、挿入配列を直接にベクター内へ クローン化する。

１１１、ｃＤＮＡフラグメント　Ｈ３Ｖに感染させた細胞からｍＲＮＡを単離す る。これらの配列をＲＧ−１ベクター内へ適性方向にクローン化するために、ポ リＡ＋ｍＲＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩＩプライマー／アダプターｄ　（ＣＣＡＡＧＣ ＴＴＧＧ　（Ｔ）＋ｓ）でプライムする。プライマーのアニーリングののち、本 質的にグプラーおよびホフマン（Ｇｕｂ　ｌ　ｅ　ｒ、Ｈｏ　ｆ　ｆｍａｎ）に よる概説（ｆｉｇ、２）に従ってｃＤＮＡを形成する。

形質転換／選択　上記構造体の効果が確定されると、それらのプラスミドをチェ ノおよびオカヤマの方法によりＣＶ−１またはＨｅＬａ細胞内へ集団としてトラ ンスフェクトする。適切な形質転換体はＧ４１８に対する耐性に基づいて選択さ れる。次いて安定に形質転換された細胞の集団をＨ３Ｖに感染させる。生存コロ ニーはＨ３Ｖ感染を特異的にブロックすへく相互作用するｍＲＮＡを発現してい ると思われる。次いでこの作用に関与するプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ　ＩＩ ■およびＸｂａ　Ｉプライマーを用いるＰＣＲにより形質転換細胞から単離する ことができる。

要約書 感染性因子の核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドの同定法が開示さ れる。好ましい形態によれば、動物の身体状態にとって重要であるが、または疾 病状態に関与するＲＮＡとアンチセンス相互作用しうるオリゴヌクレオチドが同 定される。これらのオリゴヌクレオチドを用いる療法、診断および研究法ならび に組成物が提供される。一般に感染性因子の核酸の配列を予め知る必要はない。

手続補正書 平成５年　７月　を日−

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．感染性因子の核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを同定するた めの、下記を含む方法： （ａ）実質的にランダムに配列したオリゴヌクレオチドを含む複数のベクターを 調製し； （ｂ）これらのベクターを細胞に取込ませ；（ｃ）これらの細胞を感染性因子で 感染させ；そして（ｄ）これらの細胞が増殖する条件を与える。
2. ２．さらに （ｅ）感染に対して耐性である細胞を同定し；そして（ｆ）耐性細胞に含まれる オリゴヌクレオチドの核酸配列を決定することを含む、請求の範囲第１項に記載 の方法。
3. ３．ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドが約１０−約１００核酸サブユニッ トからなり、固相合成法により調製される、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する、請求の 範囲第１項に記載の方法。
5. ５．ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドが約１００−約１０，０００塩基ユ ニットからなる、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドがｃＤＮＡに由来する、請求の範囲 第１項に記載の方法。
7. ７．ベクターに含まれるオリゴヌクレオチドが約１００−約１０，０００塩基ユ ニットからなる、請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．該感染性因子に感染しうる細胞が選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法 。
9. ９．感染性因子がヘルペスウイルスであり、細胞が上皮細胞である、請求の範囲 第１項に記載の方法。
10. １０．請求の範囲第１項に記載の耐性細胞における挿入オリゴヌクレオチドの核 酸配列を実質的に含有するオリゴヌクレオチドを含む組成物。
11. １１．薬剤学的に受容しうるキャリヤー中における、請求の範囲第１０項に記載 の組成物。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の組成物を含む、動物の身体状態を判定するた めのキット。
13. １３．請求の範囲第１項に記載の方法により同定されたオリゴヌクレオチド。
14. １４．請求の範囲第２項に記載の方法により決定された配列を含むオリゴヌクレ オチド。
15. １５．請求の範囲第１３項に記載のオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物。
16. １６．請求の範囲第１４項に記載のオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物。
17. １７．感染性因子により引き起こされた疾病の処置法において、その疾病を伴う 疑いのある動物に請求の範囲第１項に記載の方法により同定されたオリゴヌクレ オチドを投与することを含む方法。
18. １８．感染性因子により引き起こされた疾病の処置法において、その疾病を伴う 疑いのある動物に請求の範囲第２項に記載の方法により決定された配列を含むオ リゴヌクレオチドを投与することを含む方法。