JPH07509602A - 新規な悪性細胞型内部核マトリックスマーカー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な悪性細胞型内部核マトリックスマーカー光里立腎１ 全ての真核細胞は（［物も動物も）、細胞質によって取り巻かれた咳ををする。

核は蛋白と複合体を形成し、クロマチンと呼ばれる細胞ＤＮＡを含んでいる。ク ロマチンはその付随蛋白とともに咳全体の主要部分を構成し、本明細書で槙マト リックス（Ｎ　Ｍ　）と呼ぶ核の内部蛍白骨格によって組織化されている。

核マトリックスはまた、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮアーゼ）Ｉによる消化と高濃度の 塩による抽出によってクロマチンの除去後残存する核構造と定義される。この骨 格核構造はさらに、“内部核マトリックス°”（ＩＮＭ）および核孔板境界複合 体によって特徴づシナられる。

種々の研究は、ＮＭが遺伝子発現の制御にとって重要な積々の杭機能に本質であ ることを示している（概論については例えば以下を参照のこと：　Ｆｅｙら、（ １９９１）Ｃｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　Ｅｕｋ、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ、　１： １２７４４３）。特に、米国特許第４８８２２６８号および４８８５２３６号に 記載されているように、一定の核マトリックス蛋白（特に内部核マトリックス蒼 白）は、細胞型を同定するためのマーカー蛋白として有用である。例えば、特定 のＩＭＮ！白の存在および豊富さは特定の細胞型の特徴であり、サンプル中に存 在する細胞または細胞断片の元の組織を同定するために用いることができる。本 発見の特に重要な応用は、転移徂織迄定におけるマーカーＩＮ〜イ蛋白の使用で ある。また、一定のＩＮＭ蛋白の発現は、悪性またはそうでなければ機能不全細 胞で変化することが知られている。また、悪性および／または機能不全細胞にお けるこれら蛍白の発現パターンの変化は、診断の目的および組織の生存度評価の ために、該蛋白および該蛍白をコードする核酸を、単独または組み合わせてマー カー蛋白として有用なものにする。米国特許第４８８２２６８号および４８８５ ２３６号（特許臼はそれぞれ１１／２１／８９　（Ｐｅｎｍａｎ）および１２１ ５／８９　（Ｆｅｙ）　）は、細胞または細胞残層から不溶性ＩＮＭ蛋白および その付随核酸を選択的に抽出し、二次元電気泳動ゲルでこの蛋白を明示すること によって特定の細胞型におけるこれら蛍白の発現パターンを識別する方法を開示 している。さらに、ＩＮＭ蛋白または蛋白フラグメントはまた、死細胞から可溶 形で遊離させることができることが最近発見された（米国特許出願第７８５８０ ４号、１９９１年１０月３１日出願）。

今日まで、ＮＭ、特にＩＮＭの特定蛋白の分子の性状は、細胞内でこれら蛋白が 僅かしか存在しないことと、一般にそれらは不溶性であることによって殆ど明ら かにされていなかった。

特定の核マトリックス蛋白およびそれらをコードする遺伝子配列を分離し、分子 レベルで性状を決定することが可能となり、これら蛋白およびその核酸のマーカ ー分子としての使用を押し進め、さらにこれら蛋白のインビボでの生物学的役割 の解明を促進することが期待される。

本発明の目的は、悪性細胞型のマーカーとして有用なＩＮＭ彊白をコードする遺 伝子配列を提供することである。別の目的は、サンプル中のこれら蛍白およびそ の核酸（ＲＮＡ転写物を含む）を同定する強力な方法を提供することである。本 発明のまた別の目的は、診断および他の組織検査工程で使用する組成物を提供す ることである。さらにまた別の目的は、癌治療において標的分子として有用な遺 伝子配列およびアミノ酸配列を提供することである。本発明のこれらおよび他の 目的および特色は、以下の説明、図面および請求の範囲から明らかとなろう。

見匪互斐丘 ２種のＩＮＭ蛋白のＤＮＡ配列データを含む分子の性状データを、これら蛋白の 単クローン性抗体を用いて発現ライブラリーから得た０本明細書ではＭＴＩおよ びＭＴ２と呼ぶこの蛋白は、悪性＆ｌ１ｖＩｉおよび細胞外液に増加レベルで存 在する。したがって、この蛋白およびそれらをコードする遺伝子配列は、細胞サ ンプルまたは体液サンプルにおいて組織の腫瘍発生を識別するマーカー分子とし て有用であると考えられる。

これら蛋白をコードする遺伝子の完全クローンまたは部分クローンを分離し、そ のＤＮＡ配列、読み枠およびこれらＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した ０ＭＴ２のＤＮＡ配列はヤンら（Ｙａｎｇら、（１９９２）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ、’、　１１虹１３０３−１３１７）およびコンプトンら（ＣｏＩｌｐ ｔｏｎら、（１９９２）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　Ｕｉ−１３９５−１ ４０８）が開示した配列（それらの文献ではＮｕＭＡと呼ばれている）と対応す る。本明細書ではＭＴＩと呼ぶこの核酸（およびコードされたアミノ酸配列）は 、以前に報告されたことはなく、当技術分野で既知の配列と殆ど配列相同性をも たない新規な配列である。さらに、ＭＴＩを発現ヘクターでサブクローニングし 、さらに大腸菌（Ｌ工吐ｕで切断可能な融合蛋白として発現させた。免疫蛍光法 で認められたように、ＭＴＩおよびＭＴ２　（ＮｕＭＡ）の両方は非有糸分裂細 胞の核全体（仁を除く）に分布し、有糸分裂中は紡錘体に局在する。

本明細書で述べる遺伝子配列は、ＭＴＩおよびＭ７２Ｎ白（ＭＴＩおよびＭＴ２ の対立遺伝子変種および変異種を含む）の各々の蛋白の１系統を提供する。この 系統の蛋白は、リコンビナント（組換え体）ＤＮＡ、ＤＮＡ自体さらにこれらの 核酸をもちそれを発現できる宿主細胞から宿主細胞での発現によって産生される 蛋白を含む。組換え体によって産生された蛋白は、標準的な方法、例えばアフィ ニティークロマトグラフィーを用いて分離し、実質的に純粋な蛋白を得ることが できる０本明細書で用いられているように、“実質的に純粋”とは、望ましくな い夾雑蛋白勧賞を実質的に含まないことを意味すると解される。

ＭＴＩと定義される蛋白の系統は、配列番号１の核酸配列（その類似体を含む） によってコードされる蛋白を含む０本明細書で用いられているように、“類似体 ”とは、対立遺伝子の変種および変異種、並びに他の天然および人工的変異種を 含むと理解される。これらの変種はこの蛋白の生物学的活性形および不活性形を 含む、特に想定されるものは、種々の好ましいコドンの使用方法を有するＤＮＡ 、配列番号１のＤＮＡの“サイレント変異”を有するＤＮＡ　（この場合遺伝子 配列の変化はコードされるアミノ酸に影響を与えない）、およびデーオフら（Ｄ ａｙｏｆｆら、　ｒ　ｌ　ｔｒ”　Ｊ　（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）　５巻、付録３．３４５−３ ６２（Ｍ、　Ｏ，ＤａｙｏｆｆＷ、Ｎａｔ’ｌ　Ｂｉｏｌｗｅｄ、　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ＋ワシントンＤ、Ｃ，、１９７９）が定義したよ うな°保存的゛°アミノ酸変化をコードするＤＮＡである。

したがって、〜ｉＴｌ系統の蛋白をコードする核酸は、厳しいハイブリダイゼー ション条件下で配列番号ｌのＤＮＡ配列とハイブリダイズする配列と定義できる 。本明細書で用いられているように、厳しいハイブリダイゼーション条件とは、 分子クローニンク：実験室マニュアル、マニア−ナイス編、コールドスプリング ハーハー研究所出版部（１９８５）で規定されているようなもので、例えば、５ ０％ホルムアミド、５Ｘデンハルト溶液、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳおよび １００μｇ／ｍ＋変性サケ精子中でハイブリダイゼーションを行い、２ＸＳＳＣ １０゜１％ＳＤＳで３７°Ｃで洗浄、さらにｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで６８ °Ｃで洗浄という条件である。

ＭＴ２と定義される系統の蛋白は、配列番号３の核酸配列（その類似体を含む） によってコードされる蛍白を含む。この類似体には対立遺伝子の変種および変異 種、並びに他の天然および人工的変異種を含む。これらの変種は生物学的活性お よび不活性蛋白形を含む。特に想定されるものは、サイレント変異を有するＤＮ Ａ、他の好ましいコドンの使用および保存的アミノ酸変化をコードするＤＮＡで ある０本発明のＭＴ２蛋白系統をコードする核酸は、厳しいハイブリダイゼーシ ョン条件下で配列番号３のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列と定義で きる。

別の特徴では、本発明は、ＭＴＩをコードする遺伝子配列とハイブリダイズする （しかし必ずしも機能的な蛋白をコードするとは限らない）核酸フラグメントじ オリゴヌクレオチド”または°オリゴマー゛）を提供する。このオリゴヌクレオ チドは〜ｆＴ１系統の蛋白に含まれる蛋白をコードする遺伝子配列をｃＤＮＡま たはゲノムＤＮＡライブラリーから分離するために、および／または、ＭＴＩ蛋 白をコードする配列と自然の状態で付随している遺伝子配列を識別するためのプ ローブ（例えばそのコード配列の上流または下流に存在する配列）を提供する。

例えば、この核酸フラグメントがＭＴＩ系統の他の蛋白を同定するプローブとし て用いられる場合、この核酸フラグメントは鋳型として配列番号ｌの配列を用い てデザインされた、゛分子クローニング：実験室マニュアル＋＋（マニアーテイ スラ編、コールドスプリングハーバ−研究所出版部、１９８５）に記載されてい る縮重配列であってもよい。したがって、オリゴヌクレオチドまたは核酸フラグ メントは配列番号１のＤＮＡ配列の全部もしくは一部を含んでいてもよく、また 配列番号ｌのＤＮＡ配列に基づいて生合成した配列であってもよい。このオリゴ ヌクレオチドは、通常の標識技術を用いて好ましくは適切に標識される。

オリゴヌクレオチドはまた、ＭＴＩ蛋白をコードするｍＲＮＡ転写物とハイブリ ダイズする配列を含む、この相補的配Ｆｉｔよ当技術分野および本明細書ではア ンチセンス配列と呼ぶ、アンチセンス配列は、配列番号ｌの配列の全部もしく番 ま一部を含んでいてもよく、また配列番号１のＤＮＡ配列を鋳型として用し）で デザインした生合成配列であってもよい。

さらに別の特徴として、本発明は、ＭＴ２蛋白系統の蛋白をコードする遺伝子配 列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。このフラグメントには 、アンチセンス西己タリおよび、Ｍ　Ｔ　２系統の蛋白を同定し、および／また 番よイ寸随１１−コード配列を同定するためのプローブとして有用な配列力（含 まれる。

ハイブリダイズする核酸は、配列番号３の配列の全部もしくは一部を含んでいて もよく、また配列番号３のＤＮＡ配列を鋳型として用いてデザインした生合成配 列であってもよく、通常の標識技術を用いて好ましくは適切に標識される。

本明細書で同定される遺伝子配列は、組織の悪性度または他の細胞機能不全を示 唆するマーカー蛋白として識別される蛋白をコードする。したがって別の特徴で は、本発明は、本明細書に開示する蛋白を適切なアジュバントと組み合わせて用 いて、サンプル中の癌マーカー蛋白を検出するために有用な抗体を得るための組 成物を提供する。別の特徴では、本発明は、これらの蛋白をコードするｍＲＮＡ 転写物と特異的にハイブリダイズする配列をデザインするための遺伝子鋳型を提 供する。また別の特徴では、本発明は、ＭＴＩまたはＭＴ２のエピトープと特異 的に反応する結合蛋白（抗体を含む）をデザインするために、蛍白および蛍白フ ラグメントを発現させるときに使用する分離ＤＮＡ配列を提供する。本発明はま た、本明細書で開示した遺伝子配列およびそれらによってコードされるマーカー 蛋白を用いた、組織の状態の検査方法を提供する。最後に、本発明は、細胞の分 裂する能力を抑制または不可能にするために、これらマーカー蛋白またはそれら をコードする遺伝子配列を標的分子として個々に用いる、悪性疾患を治療する方 法を提供する。

区皿立酢員笠区凱 図ＩＡ−ＩＤは、以下の通り配列番号１のＭＴＩのアミノ酸配列を示す模式図で ある： 図ＩＡニブロリン残基の位置； 図ＩＢ：配列内のαヘリックスと規定される領域；図１Ｃ：ンスティン残基の位 置； 図ＬＤ；ＮＴＣＢの切断部位。

図２Ａ−２Ｂは、以下の通り配列番号３のＭ　Ｔ　２のアミノ酸配列を示す模式 図である： 図２Ａニブロリン残基の位置； 図２８：配列内のαヘリックスと規定される領域。

図３は、種々の正常および悪性組織サンプル上清中で測定された体液可溶性ＭＴ ２およびＭＴ２関連蛋白量を示す。

図４は、癌患者および正常血液供与者から分離された血清中で測定された体液可 溶性ＭＴ２およびＭＴ２関連蛋白量を示す。

主１」」り順り１哩 生物アノセーにおいて悪性細胞マーカーとして有用なＩＮＭ蛋白の性状を調べる 試みで、２種のＩＮＭ蛋白をコードする遺伝子配列（本明細書ではＭＴＩおよび ＭＴ２と呼ぶ）を同定し性状を調べた。これら蛋白をコードするＤＮＡ配列を、 分離ＩＮＭ３［白ＭＴＩおよびＭＴ２に対する単クローン性抗体を用いて発現ラ イブラリーを検索することによってクローニングした。

この蛍白は、実質的にはペンマンとフェイの方法（Ｐｅｎ■ａｎ　＆　Ｆｅｙ。

米国特許第４８８２２６８号および４８８５２３６号、この文献は参照により本 明細書に含まれる）にしたがい、悪性細胞がら分離した。クローニングしたＤＮ Ａを続いて配列を調べ、その読み枠を同定し分析した。ＭＴ２をコードする遺伝 子配列は、他の者によって開示され（Ｙａｎｇら、（１９９２）Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、皿１３０３−１３１７およびＣｏｍｐｔｏｎら、（１９９２）Ｊ、 　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、皿１３９５−１４０８）　、彼らによってＮｕＭＡ”と 呼ばれている。ＭＴＩおよびＭＴ２と当技術分野の他の配列との比較によって、 これら蛋白をコードする配列は、先に報告された配列と殆ど相同性を共有しない 配列を構成することが示された。

ＭＴＩをまた大腸菌で切断可能な融合蛋白として発現させ、哺乳類細胞から分離 した蛋白と比較した。天然由来ＭＴＩ蛋白に対する抗ＭＴＩ抗体もまた、＆［ｌ 換え体で産生させた蛋白と交差反応を示した。天然由来蛋白および組換え体産生 蛋白の両方とも、５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べたとき同じ見かけの分子量（９０ｋＤ ）と同等のｐＩ値（５，４）を存し、さらに両蛋白とも２−ニトロ−３−チオシ アノ安息香酸（ＮＴＣＢ、下記参照）による切断で同し切断パターンを示す。

ＭＴＩの免疫的局在化実験によるデータでは、ＭＴＩ蛋白は、非有糸分裂細胞の ＩＮＭ内に限局性の斑点状濾胞として、ＩＮＭの咳賃金体に不均一に分布してい る。特に、この濾胞は核のクロマチン間に存在し、内部核マトリックス蛋白とし て予想通り、クロマチン抽出後も残存する安定な結合として分布する。

さらに、ＭＴｌｉｌを胞は仁および積板からは排除されている。のみならず、有 糸分裂中にＭＴＩの分布は変化し、分裂細胞の紡錘体に星型模様として配列され る。この蛋白はクロモシームと共同して一定の部位を占めることはないが、これ はＭＴＩは有糸分裂中は構造的役割を果たしている可能性を示唆する。免疫的局 在化実験のデータは、いずれの既知ＤＮＡ結合モチーフ（例えばロイシンジノパ ー）とも構造的相同性を見出すことができないＭＴＩアミノ酸配列配列分析デー タ致する。

ＭＴ２　（ＮｕＭＡ）蛋白は組換え体で発現されていないが、一方、この蛋白の 予想分子ｆｆ１２３８ｋＤａ　（推定アミノ酸配列（配列番号３参照）から算出 ）は天然由来蛋白のそれと適合する。

Ｍ　Ｔ　２　（ＮｕＭＡ）の免疫的局在化実験は、この蛋白もまた、非有糸分裂 細胞の核質全体に存在する斑点、状濾胞を形成し、また仁から排除されているこ とを示している。有糸分裂中、この蛋白は分裂細胞の紡錘体の極に移動するよう である。その−次配列は折り畳まれた蛋白のためのコイルトコイル（ｃｏｉｌｅ ｄ−ｃｏｎ）モチーフを示唆しているようである（Ｃｏｍｐｔｏｎら、（１９９ ２）Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　皿１３９５−１４０８；　Ｙａｎｇら、（１９９２）Ｊ、　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、１ｌｉ１３０３−１３１７）。

■、使里方広 本明細書で開示される核酸は、細胞の悪性度または他の細胞異常性を識別するた めに有用なマーカー蛋白として本来区別される蛍白をコードする。特異的に、こ れら蛋白レヘルの顕著な増加が悪性細胞および癌患者の細胞外液（例えば血清） 中で検出される（ＰＣＴ公開公報−０９３１０９４３７および下記参照）０例え ば、細胞または細胞核残層を含むサンプル中のこれら蛋白またはその転写物の存 在および／または豊富さは、与えられた組織が悪性細胞または他の異常性（例え ば染色体異常）を存する細胞を含んでいるか否かを決定するために用いることが できる。このサンプルは剥離細胞サンプルまたは体液サンプル、例えば血液、血 清、血漿、尿、精液、膣分泌物、髄液、唾液、腹水、腹腔液、痰、組織ぬぐい液 、生体滲出物（例えば乳房滲出物）を含むサンプルでもよい。

さらに、ＩＮＭ蛋白は死細胞から可溶形で遊離するので、マーカー分子は対象と なる組織の生存度を調べるために用いることができる。例えば、マーカー蛋白は 、時開経過にしたがってこれらマーカー分子の体液中への遊離をモニターするこ とによって、病状または治療措置もしくは方法の有効性を調べることができる。

特に有用な体液は、血液、血清、血漿、尿、精液、膣分泌吻、１ＦＩｔｌ液、唾 液、腹水、腹腔液、痰、組織ぬぐい液、および生体滲出物（例えば乳房滲出物） である。これらのアンセーを実施する方法は、米国特許第４８８２２６８号およ び４８８５２３６号並びに米国特許出願第２１４０２２号（１９８８年６月３０ 日出１ｊＪりおよび同７８５８０４号（１９９１年１０月３１日出願）（これら 文献はすべて参照により本明細書に含まれる）に開示されている。

これらアノセーのすべては以下の一般的な操作工程の特徴を有する： １）“本物゛°のサンプルまたはリファレンスサンプル中のマーカー蛋白または その転写物の存在および／または豊富さを検出する； ２）問題のサンプル中のマーカー蛋白またはその転写物の存在および／または豊 富さを検出する； ３）問題のサンプル中のマーカー蛋白またはその転写物の量とリファレンスサン プル中の量とを比較する。

組織の生存度をモニターするためにこのアッセーを用いる場合、問題のサンプル 中のマーカー蛋白またはその転写物の存在もしくは豊富さを検出する工程は間隔 をおいて繰り返し、続いてこれらの値を比較する。検出濃度の変化は組織の状態 における変化を反映している。治療の有効性を調べるためにこのアッセーを用い る場合は、モニタ一工程は、治療薬剤または治療法を施した後で実施する（例え ば化学治療剤の投与後または放射線照射治療後）。

特定のＩＮＭマーカー分子が標的細胞型に存在し、他には存在しないという意味 で、選択マーカー蛋白または転写物は全体的に固有のものである必要はない、む しろ、マーカー分子は、サンプル中のそのためにアンセーをデザインした予め選 んだ細胞型を識別するために十分高いノイズ比の信号を有することが要求される 。例えば、ＭＴＩおよびＭＴ２蛋白は、たとえその蛋白またはその密接な類似体 が非悪性細胞型に普通に存在しているとしても、悪性細胞におけるそれらの発現 のレベル上昇のゆえに、細胞サンプル中の悪性性の存在を示す蛍白としてを用で ある。

−Ｃ的な蛋白および核酸分析の考察についての簡単な説明を以下に述べる。特定 のアンセー条件の詳細は上記のアノセーの参考文献（これらは参照により本明細 書に含まれる）および当技術分野で周知の公表されたプロトコル（これらは容易 に入手できる）で見出すことができる。

Ａ、■亘ヱヱ立二 本明細書で開示するように、分子レベルでのＭＴＩおよびＭＴ２蛋白の性状決定 によって、該蛋白を構造的および生化学的に性状を調べることが可能になった。

したがって、これらの遺伝子配列とそれらがコードするアミノ酸配列の開示に続 き、アノセー条件を強化するために用いることができる、好ましい結合エピトー プを同定することができる。例えば、結合蛋白は、特定の細胞型によって産生さ れるマーカー蛋白、または特定の悪性機能としてのマーカー蛋白に対する親和性 を強化するようにデザインできる。同様に、結合蛋白は、死細胞から遊離される 蛋白フラグメントに優先的に結合するようにデザインできる。

さらに、正常および異常組織で産生される蛋白間の構造および／または配列変動 を解明し、利用することができる。遺伝子配列は、当技術分野で既知の標準的な 岨換え体ＤＮＡ操作を用いて所望するように、例えば切り詰め、変異を起こさせ るなどして操作し、抗体産生に有用な所望の特徴をもつ蛋白を得ることができる 。

当業者には理解されるところであるが、問題のマーカー蛋白を特異的に識別し定 量するいずれの方法も利用できる。サンプル中の問題の蛋白を検出する目下の好 ましい手段は、マーカー蛋白と特異的に反応することができる結合蛋白を手段と するものである。ｍｍ抗体、また特にその結合部分を有利に用いることができる 。抗体は本来単クローン性抗体でも多クローン性でもよく、また生合成的に製造 してもよい、マーカー蛍白複合量、例えば結合蛋白に結合するマーカー蛋白量は 、続いて当技術分野でよく知られている標準的な蛋白検出方法を用いて決定され る。

Ａ、１．免ゑｊ二＝に 異なる種々の免疫アンモー形が目下のところ存在するが、それらのいずれもＩＮ ＭＷ白およびその蛋白フラグメントを検出し定量するために利用することができ る。例えば、剥離細胞サンプルについては、細胞および周囲の液体を採集し、［ ＮＭＷ白はペンマンとフエイの方法（米国特許第４８８２２６８号および４８８ ５２３６号）によって選択的に分離する。続いてこれらの蛋白を好ましくは二次 元ゲル電気泳動によって分離し、マーカー蛋白の存在を標享的ウェスタンプロッ ト方法によって検出する。

検出されるべきマーカー蛋白および／または蛋白フラグメントが主に溶液中に存 在する血清および他の液体ア、セーでは、目下のところ最も鋭敏な免疫アッセ一 様式はサンドイツチ法である。典型的には±５％の正確さをもつこの方法では、 ＰＣＴ公開公報−０９３１０９４３７号に開示されているように、一般に問題の 被分析物と結合することができる２つの抗体が用いられる：例えば１つは固形支 持体に固定され、他は／８液中に遊離しているかなんろかの容易に検出できる化 学化合物で標識されている。

第二の抗体のために用いることができる化学標識の例には、放射性同位元素、蛍 光化合物与よび酵素、または、反応物もしくは酵素基質に接触させたとき着色生 成物もしくは電気化学的に活性な生成物を生しる他の分子が含まれる。マーカー 蛋白またはその蛋白フラグメントを含むサンプルをこの系に投入するとき、マー カー蛋白は固定抗体および標識抗体の両方に結合する。

結果は、支持体表面上の°サンドイッチ”免疫複合体である。

この複合体蛋白は、非結合サンプル成分および過剰の標識抗体を洗い流し、支持 体表面の蛍白と複合体を形成した標識抗体の量を測定することによって検出され る。サンドイッチ免疫ア・ンセーは、優れた検出限界をもつ標識を用いるならば 、極めて特異的でかつ非常に鋭敏である。免疫学的アンセーのデザイン、理論お よびプロトコルの詳細な総論は、「免疫学の実際Ｊ　（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　［ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　’ｄ、　Ｒ，Ｂｕｔｔ　ｋｌＡ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋ ｋｅｒ、ニューヨーク、１９８４）を含む当技術分野の多数の成書に見出すこと ができる。

一般二こ、免疫アノセーのデザインの考察は抗体（例えば単クローン性抗体また は多クローン性抗体）の調製を含むが、この抗体は、特異的に結合した抗原−抗 体複合吻を非特異的相互反応から信顛性をもって区別できる、それら抗原に対し て十分に高い結合特異性を有する。本明細書で用いられるように、“抗体“とは 、マーカー蛋白に対して適切な結合親和性および特異性を有する他の結合蛋白を 含むと考えられる。抗体の結合特異性が高ければ高いほど、検出できる抗原濃度 は低くなる。目下のところ、好ましい結合特異性は、該結合蛍白がマーカー蛋白 に対して約１０’Ｍ−’よりも大きい、好ましくは約１０’Ｍ−’よりも大きい 結合親和性を存するようなものである。

抗体結合ドメインはまた、生合成的に製造でき、結合ドメインのアミノ酸配列を 操作して好ましいエピトープで結合０和性を強化することができる。ＭＴＩおよ びＭ　Ｔ　２の遺伝子配列の同定は、好ましい結合蛋白のデザインと構築に有利 に用いることができる０例えば、好ましいエピトープをコードするＤＮＡはＭｉ 換え体によって発現させ、選択的にこのエピトープと結合する抗体を選択するた めに用いることができる。続いて、その特異的咳マトリックス蛋白もしくは蛋白 フラグメントに該抗体を特異的に結合させるに十分な条件下で選択抗体をサンプ ルと接触させ、形成された複合体の量をその後検出する。特異的な抗体について の方法論は周知であり、文献に記載されている。

その調製についてのより詳細な記載は、例えば「免疫学の実際」［（Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　Ｌ　Ｒ，Ｂｕｔｔ　ｋＸＡ、Ｍａｒｃｅｌ 　Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９８４　）で見出すことができる。

標識の選択はまた所望の検出限界に依存する。酵素アンセー（ＥＬＩＳＡ）は典 型的には、酵素標識複合体と酵素基質との相互作用によって形成された着色生成 物を検出させる。別の標識には、放射性または蛍光標識が含まれる。今日までに 知られている最も鋭敏な標識は化学発光標識であるが、この場合、反応物との相 互作用は光の発生をもたらす、有用な標識には化学発光分子（例えばアクリジウ ムエステル）または化学発光酵素（この場合反応物は酵素基質である）が含まれ る。例えば、アクリジウムエステルが過酸化アルカリ溶液と反応するとき、強い 閃光が放出され、他の標識で得られる検出限界よりも１００から１００００倍ま で検出限界を増加させる。さらに、この反応は迅速である。化学発光および免疫 アソセーの詳細な説明はウイークスらの底置で見出されるｊＷｅｅｋｓら、（１ ９８３）　ｒ酵素学的手法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）　ユ３６６−３８７］、液体アノセーの他の考察には、マイクロタイター（穴 ）ウェルまたはカラム免疫アノセーの使用が含まれる。カラムアンセーは、迅速 に反応するｉｌｒ！ａ、例えば化学発光標識を用いる場合は特に有利である。標 識複合体はポストカラム検出器に溶出できるが、これには、また反応物または酵 素基質が含まれ、続いて形成される生成物を直ちに検出することが可能である。

Ａ、２．症生製造 本明細書で開示する蛋白は、周知で当技術分野で記載されている標準的な免疫学 的方法を用いて抗体を産生さセるために使用することができる　１例えば、「免 疫学の実際Ｊ　（Ｗ、　Ｒ，Ｂｕｔｔ編、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　、　二 ｓ−ヨーク、１９８４　）を参照１．簡単に記せば、例えば宿主細胞で組換え体 ＤＮＡを発現させることによって製造した分離ＩＮＭ蛋白を、異種宿主で抗体を 産生させるために用いる。好ましい抗体は、該蛋白上のエピトープと特異的に結 合する抗体（エピトープに対して好ましくは１０’Ｍ−’より大きい結合親和性 、最も好ましくは１０’Ｍ−’より大きい結合親和性を有する）である。例えば 、ヒ）ＩＮＭｉ白（例えば、ＭＴＩまたは〜ＩＴ２）に対する抗体を所望する場 合は、適切な抗体を生しる宿主は、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモットまたは抗 体産生にを用な他の哺乳類である。該蛋白は、宿主において抗体産生を強化する ことができる適切なアジュバントと合体させ、例えば腹腔内投与によって宿主に 注射することができる。宿主の免疫反応を刺激するために適切ないずれのアジュ バントも便宜のために用いることができる。目下のところ好ましいアジュバント は、フロイントの完全アジュバント（殺菌し乾燥させた微生物細胞を含む乳濁液 ［例えばカルビオヶム社（サンディエゴ）またはギブコ社（グランドアイランド 、ニューヨーク）１である。抗原の複数回注射が望まれる場合は、後の注射は不 完全アジュバント（例えば細胞非含有乳濁液）と混合した抗原を含む。

多クローン性抗体は、抗体産生宿主から問題の蛋白に対する抗体を含む血清を抽 出することによって分離することができる。

単クローン性抗体は、所望の抗体を産生じている宿主細胞を分離し、免疫学分野 で既知の［４的方法を用いてミエローマ細胞とこれらの細胞を融合させ、さらに 特異的にＩＮＭ蛋白と反応し所望の結合親和性を有するハイプリント細胞（ハイ ブリドーマ）をスクリーニングすることによって製造することができる。

以下に提供するのは、目下のところ好ましい単クローン性抗体産生プロトコルの 実施例である。他のプロトコルもまた意図される。したがって、本発明の癌マー カー蛋白組成物に対して特定の抗体製造方法が、本発明の特徴として意図される わけでない。また下記に述べるものは、サンプル中のマーカー蒼白を検出および ／または定量するために有用なサンドインチ免疫アノセ〒およびドントブロノト アンセーの実施例である。マーカー蛋白（特にＭＴＩ、ＭＴ２およびその類似体 でその蛋白フラグメントおよび自然に発生する変種を含む）を検出する他の手段 も意図される。これらの他の方法は周知で、当技術分野で記載されている。

只、　プロ　コル：Ｂａ１ｂ／ｃＸＪマウス（ジャクソンラボラトリー、バーバ ーバー、メーン）に、ヒト子宮頚癌細胞株（ＣａＳｋｉ）から精製した精製ＩＮ Ｍ蛋白（例えばＭＴＩ）を１６週間の間２週間毎に腹腔内に注射する。マウスに 殺処分の４日前に１度だけ追加免疫を注射し、膵臓を摘出する。最初の注射では フロイントの完全アジュバント（ギブコ、グランドアイランド）を用い、２度目 の注射ではフロイントの不完全アジュバントを用い、その後の注射は食塩水で実 施する。膵臓細胞（またはリンパ節細胞）を続いて文献の方法［Ｋｏｈｌｅｒ　 ＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　匡４９５（この文献は参照 により本明細書に含まれる）１を用い、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ベー リンガーマンハイム、ドイツ）でマウスミエローマ細胞株と融合させる。

その後、核マトリックス蛋白と反応する抗体を産生じているハイブリドーマをク ローニングし、腹水として増殖させる。免疫学分野で既知の標準的な方法を用い て、当該免疫原が由来した細胞株に対する核反応性と組織免疫化学によってハイ ブリドーマをスクリーニングする。スクリーニングプロトコル、腹水製造および 免疫アノセーもまた、ＰＣＴ公開公報１９３１０９４３７号に記載されている。

別Ｍ−とに二 Ａ、サンドイッチ免疫アノセー（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）抗原結合用、交差反応分析用 、およびモニターアンセー用のドーズ・レスポンス曲線を作製するために標準的 免疫アンセーを実施することができる。データはＮＭ抗原の標準的調製物をもち いて作製し、体液分析時に参考標準物として用いる。これらの実施例ではＥＬＩ ＳＡも放射性免疫アノセーも実施した。

１、免疫アノセー（ウェルアンセー） マイクロタイタープレート（イムロンＴＩ、グイナテンク、ンヤンティリー、バ ージニア）を５から１５Ｍｇ／ｍｌ　（ＰＢＳ中、ｐ　Ｈ７，４）の精製抗体で １時間または一晩被覆し、その後３００μｌのＰＢＳで３度洗浄する。続いてプ レートをＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清で１時間室温でブロックし、さらに３０ ０μｌのＰＢＳで３度洗浄する。プロトコルの１例を下記に示す。

ここではウェルにつき１００μｍのサンプルをピペットでとり、室温で１時間保 温して分析する。ウェルを３００μｌのＰＢＳで３度洗浄した。１．２５から１ ０Ｍｇ　／　ｍ　ｌのビオチン化抗体１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時 間保温し、３００μｌのＰＢＳで３度洗浄した。１：１０００倍希釈のストレプ トアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合物（パインディングサイト社、 バーミンガム、イギリス）１００μｌを各ウェルに加え、１時間保温し、続いて ＰＢＳで洗浄した。その後、１００μｌのペルオキシダーゼ基質（クエン酸塩、 燐酸塩、ＯＰＤ　ＨｚＯｚ）を各ウェルに加え、２０分保温する。

５０μｍの１Ｍ硫酸をウェルに加えて反応を停止させる。光学濃度をプレートリ ーダーで４９０ｎｍで読み取る。

未知サンプルと比較するために、リフエレンス濃度の抗原を調製して標準希釈曲 線を調製することによって抗原濃度を決定する。

２、　ＴＲＭＡ　・　ア　セー （ａ）ストレプトアビジンのヨード化 ２μｌの０．０５Ｍ燐酸塩液（ｐＨ７，４）中の１０Ｍｇのストレプトアビジン （シグマ社、シンシナチ）を微量遠心管中の１０μＩの０．２５Ｍ燐酸塩液（ｐ Ｈ７，４）に加え、１０μｌの１ｍＣ１の”’　Ｉ　（ＮＥＮ−ＤＩＩＦＯＮＴ 、ウィルミントン、プラウエア）を加える。直ちに５０ｍ１の蒸留水中の１００ ｍｇクロラミン−Ｔ三水和物（シグマ社）１０μｌを加え、混合し２５秒間反応 させる。続いて４０ｍｇのシステアミン（２−メルカプトエチルアミン、シグマ 社）５０μｌ、および０．０５Ｍの燐酸塩液（ｐＨ７，４）５０ｍｌ中の５ｍｇ ＫＩを２０秒間混合して反応を停止させる。ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中の１％Ｂ ＳＡ０．５ｍｌを加え、材料を予めＢＳＡＰＢＳ緩衝液で平衡化した１０ｍ１の セファデックスＧ−１００カラム（ファルマシア、スエーデン）で分画した。０ ．５ｍ１Ｘ３０の分画を採集し、各分画のｌｏμｌを１ｍｌにＢＳＡ／ＰＢＳで 希釈する。

希釈した分画の１００μｌを＋ｉｓＩ用ＬＫＢガンマカウンターで計測する。比 活性を計算し、通常８５から１００μＣ４／μｇの間になった。蛋白ピークの中 央の分画をその後サンドインチ免疫アンセーに用いる。

（ｂ）サンドインチ放射性免疫アンモ−マイクロタイター分離式ウェル（イムロ ンＩＩリムーバウェルストリップ、ダイナチック、シャンテイリー、バージニア ）をＥＬ［ＳＡアノセーのように１ｉｌｌし、さらに）゛ロングする。

サンプル（標準物または血清）を日常的に以下のように測定する。ウェル中で１ ００μｌを室温で１時間保温し、プレート洗浄器を用いて３００μｌのＰＢＳで ３度洗浄し、続いてビオチン化抗体（１０％ヤギ血清中の２−１０Ｍｇ／ｍ　＋ 　）で１時間室温で保温し、再び洗浄する。結合ビオチン化抗体を＋２Ｓ■−ス トレプトアビジンで検出する。１００μｌの２０００００から３０００００ｃｐ ｍ　（７７％計測効率）を各ウェルに加え、１時間室温で保温し、再び洗浄する 。結合分画をＬＫＢガンマカウンターで放射能活性を計測して検出する。４度を リファレンス調製物について得たカウントと比較してめることができる。

Ｂ、ＮＭのドツトプロット検出 Ｎ〜１蛋白と抗体の反応性は、Ｉ準的方法と装置（例えばＳｃｈ　１ｅｉｃｈｅ ｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いてドツトプロット検出アツセーで調べることが できる。ニトロセルロース膜をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、　５０ｍＭ　ＴＲｌ ５．１５０ｆｆｉＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，６）に浸し、一連のウェルに対して種 々の蛋白濃度のＮＭ＃Ａ製物で処理し、室温で１時間保温する（例えば、１０Ｍ ｇ　／　ｍ　ｌ、１μｇ　／　ｍ　Ｉおよび１００　ｎ　ｇ／ｍ　ｌのＴ−４７ ＤＮＭ上清）、続いてブロックしたウェルを２００μｍのＴＢＳで２度洗浄し、 その後ＴＢＳ中１００μｍの１０％正常ヤギ血清で１時間室温でブロックする。

続いてブロックしたウェルを２００μｍのＴＢＳで２度再び洗浄し、核活性抗体 を含む被験培養上清１００μｌをそれぞれのウェルに加え、室温で１時間保温す る。その後ウェルを２００μｍのＴＢＳで２度洗浄し、アルカリホスファターゼ 結合ヤギ抗マウスＩｇＧの段階希釈１００μ］　（バイオラッド社、’Ｊ　、チ モンド、カリフォルニア）（例えば１　：　１０００．１：５０００、または１ 　：　１００００）をそれぞれのウェルに加え、さらに１時間保温する。続いて ウェルを２００μｍのＴＢＳで２度洗浄し、さらにレバミゾール（ヘクター社、 Ｃｏｒｐｕｓ　Ｃｈｒｉｓｔｉ、テキサス）を含むトリス緩衝液中の酵素基質（ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、　Ｋｉｒｋｇａａｒｄ＆　Ｐｅｒｒｙ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ、メリーランド、例えば１００μ＋）を加える。一般に１５分の保温で 十分である。反応は蒸留水で洗浄して停止させ、精製物を噴出することができる 。

Ｂ、挟醤立捉 これらの癌マーカー蛋白をコードする転写物の量を検出することによって、組織 の状態を決定することもまた可能である。

これまでのところ、ｍＲＮＡを検出する好ましい手段は、標識オリゴヌクレオチ ド（例えば問題の転写物と特異的にハイブリダイズできる核酸フラグメント）を 用いるノザンプロット分析手段である。これまでのところ好ましいオリゴヌクレ オチド配列は、マーカー配列転写物の少なくとも一部分と相補的な配列をコード する配列である。これらの相補的な配列は、“アンチセンス”配列として当技術 分野では既知である。このオリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドまたは オリゴデオキシリボヌクレオチドであろう。さらに、オリゴヌクレオチドは天然 オリゴマーであり、生物学的に重要なヌクレオチド（すなわちＡ（アデニン）、 ｄＡ（デオキシアデニン）、Ｇ（グアニン）、ｄＧ（デオキシグアニン）、Ｃ（ シトシン）、ｄＣ（デオキシアデニン）、Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル））、ま たは例えばヌクレオチド間のホスホジエステル結合内のホスフェート酸素をメチ ル基または硫黄原子に置き換えた修飾オリゴヌクレオチド種で構成される（例え ば下記の１．Ｃ章を参照）、さらに、このヌクレオチド自体および／またはその リポース部分も修飾されていてもよい。

この配列は、当技術分野でよく記載されている既知の化学的オリゴヌクレオチド 合成方法のいずれかを用いて化学的に合成できる。例えば、オリゴヌクレオチド は有利には、市販のいずれかの自動核酸合成装置を用いて調製することができる 。また別に、オリゴヌクレオチドは標準的な組換え体ＤＮＡ技術、例えば非コー ド鎖の転写を誘発することによって製造することができる。例えば、マーカー蛋 白をコードするＤＮＡ配列は、組換え体ＤＮＡ系で逆にすることができる。例え ば、非コード鎖が転写されるように、適切なプロモーターの下流に逆方向に挿入 できる。

有用なハイブリッド形成オリゴヌクレオチド配列は、ＭＴＩまたはＭＴ２−次転 写物と特異的にハイブリダイズすることができるいずれの配列も含む。したがっ て、当業者には理解されるように、包含される有用な配列は配列番号１（ＭＴＩ ）または配列番号３　（ＭＴ２）（ＭＴＩおよびＭＴ２は蛋白コード領域と一敗 する）で提供されるＤＮ−Ａ配列だけでなく、当該コード配列からさらに上流も しくは下流にある転写配列（例えば５゛および３°非翻訳領域に含まれるか、ま たは該領域にまで延びる配列）と相補的な配列の両方を含む。代表的なアンチセ ンス配列は配列番号５および６に記載されている。配列番号５は、ＭＴＩＩ白コ ード配列の最初の１００ヌクレオチドだけでなく、開始コドンの上流にある５３ ヌクレオチド配列と相補的な配列を表している。開始コドンと相補的なヌクレオ チドは、配列番号５の２９８−３００位にある。同様に、配列番号６は、ＭＴ２ 蛋白コード配列の最初のｌＯＯヌクレオチド（配列番号３および６と比較のこと ）だけでなく、開始コドンの上流にある４８ヌクレオチドと相補的な配列を示す 、開始コドンと相補的なヌクレオチドは配列番号６の２９８−３００位にある。

有用なオリゴマーは、配列番号５および６の配列の一部分またはすべてを基本に して作製することができる。しかしながら、当業者には理解されるところである が、該転写物の他の領域とハイブリダイズする他の有用な配列も、配列番号１お よび３、および／または別の非翻訳配列（例えばコンプトンら（Ｃｏｍｐｔｏｎ ら）およびヤンら（Ｙａｎｇら）のＭ　Ｔ２（Ｎ　ｕ　Ｍ　Ａ　）について開示 されたようなもの）に存在する配列に基づいて容易に作製される。

いずれの長さのオリゴヌクレオチドもｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズさせるた めに用いることができるけれども、８−１５ヌクレオチドより短い配列は、標的 ｍＲＮＡとハイブリダイズするとき特異性が低いかもしれない。したがって、典 型的には８−１００ヌクレオチド以内のオリゴヌクレオチド、好ましくは１５− ５０の範囲内のヌクレオチドが、標準的なＲＮＡハイブリダイゼーシジンアノセ ーで最も有用であろうと考えられる。

ＩＮＭ転写物とハイブリダイズさせるために選択されるオリゴヌクレオチド（化 学的に合成されるか、組換え体ＤＮＡで合成されるかに拘わらず）は、続いて標 準的技術を用いて単離、精製され、さらに標準的標識プロトコルを用いて好まし くは（例えば３５Ｓまたは３２Ｐで）標識される。

問題のマーカー転写物を含むサンプルを続いて電気泳動ゲルで流し、分散させた 核酸をニトロセルロースフィルターに移し、１ｍオリゴヌクレオチドを適切なハ イプリダイゼーンヨン条件下で該フィルターと接触させる。ハイブリダイゼーシ ラン条件は、「＼　ローニング：マニュ　ルＪ　［（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、マニア−ナイスら ｌに記載されているように、例えば、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、２× デンハルトン容７Ｆ！Ｌ、０．１％ＳＤＳ、４２°Ｃである。当技術分野で既知 の他の有用な方法は、溶液ハイブリダイゼーシヨン並びにドツトおよびスロット ＲＮＡハイブリダイゼーションを含む。続いて、サンプルに存在するマーカー転 写物の量を、当技術分野で既知の標準的方法を用いてハイブリダイズしたフラグ メントの放射能活性を測定することによって定量する。

同様なプロトコルにしたがって、またＭＴＩおよびＭＴ２蛋白系の種類をコード する（例えば以下の実施例で述べるように）他の配列を同定するために、オリゴ ヌクレオチドを用いることができる。この方法論は、本明細書で開示する蛋白コ ード配列に関連する遺伝子配列を同定するために、例えば該蛋白コード配列の上 流または下流に存在する非コード配列で、これら遺伝子の発現に機能的な役割を 果たす可能性があるものを同定するためにもまた用いることができる。新規なマ ーカ一種を同定する場合には、縮重配列および／または好ましいコドンバイアス をもつ配列を、鋳型として配列番号１または３の配列を用し）、さらに縮重を取 り扱う当技術分野で開示されている一般的ガイドラインを使用巳て作製すること ができる。　１例えば「分子クローニング：実験室マニュアルコ（マニアーナイ スラ）　ヲ参照のこと　。

本明細書で開示する蛋白は有糸分裂中の紡錘体装置に付随し、悪性細胞で量が増 加する。したがって、特定の理論に拘束されなければ、これらの蛋白は細胞分裂 において重要な役割、おそらくは構造に関する役割を果たしているであろうと仮 定できよう、したがって、これらの蛋白およびその転写物は癌の化学療法のため の標的分子として好ましい候補であろう。

Ｃ，１ヱヱ土＋７囚血凰 想定される特に有用な癌治療法は、マーカー転写物の部分または全てと相補的な オリゴヌクレオチドであるが、これは、該転写物に特異的にハイブリダイズする ことができ、ｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズするとき、ｌｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの 翻訳を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、正常および 異常細胞の遺伝子発現を抑制するために広く用いられてきた［例えば、アンチセ ンス理論関係の総論としてはスティンらの文献（Ｓｔｅｉｎら、（１９８８）Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８：２６５９−２６６８）　、および既存のプロトコ ールを参照のこと１．したがって、ＭＴＩおよびＭＴ２に対するアンチセンスヌ クレオチドを化学療法の一部分として、単独または他の治療と組み合わせて用い ることができる。

上記の１．　８節で述べたように、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキ シヌクレオチド配列の両方とも、ｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズし、本明細書 で開示するマーカー蛋白のｍＲＮＡ１訳を抑制するために用いることができるで あろう。

しかしながら、一般にオリゴリボヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドより リボヌクレアーゼによる酵素攻撃に感受性が高い。したがって、オリゴデオキシ リポヌクレオチドが、各患者のｍＲＮＡ翻訳を抑制するインビボ治療の使用には 好ましい。

また上記１．Ｂ節で述べたように、治療的に有用な本明細書発明のアンチセンス オリゴヌクレオチドは、当技術分野でよく記載されている既知の化学的オリゴヌ クレオチド合成のいずれによっても合成できる。また別に、天然のｍＲＮＡ配列 の一部分またはすべてと相補的な配列は、標準的な組換え体ＤＮＡ技術を用いて 作製することができる。例えば、この蛋白コード配列をコードするＤＮＡは、該 配列を発現することができるプロモーターの下流に逆方向に、この非コード鎖が 転写されるように挿入することができる。

この蛋白コード配列の完全なヌクレオチド配列は、その付加５゛および３゛非非 翻訳列と同様、ＭＴＩおよびＭＴ２の両方について既知であり（例えば配列番号 １および２、並びにコンプトンらの文献を参照のこと）、さらにまた本開示を用 いて決定することができるので、これら蛋白のｍＲＮＡ転写物のいずれの部分と もハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者 に既知の慣用的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて調製することができる。

ＭＴＩおよびＭＴ２のｍＲＮＡ転写物のいずれかの部分と相補的で、かつハイブ リダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、本明細書で開示するように転 写物の翻訳抑制に概ね有効である。例えば、米国特許第５０９８８９０号（１９ ９２年３月２４日発効、この文献は参照により本明細書に含まれる）に開示され るように、その翻訳開始コドン部位、またはその近くのｍＲＮＡと相補的なオリ ゴヌクレオチドを用いるのが翻訳抑制に有利である。さらに、翻訳開始部位から ３°方向にあまりにも離れた配列は、リポソームの潜在的“リードスルー”［メ ンセージの翻訳を可能にするためにアンチセンス／センス二重体（デューブレン クス）を解きほぐすためにリポソームが必要とする現象１のために、ｍＲＮＡ転 写物とのハイブリダイゼーションの効果が低い。

ＭＴＩδよびＭＴ２転写物に対する代表的なアンチセンス配列は、配列番号５（ ＭＴＩ）および配列番号６　（ＭＴ２）で示される。このアンチセンス配列は、 ＭＴＩまたはＭＴ２マーカー蛋白のいずれかのＮ−末端をコードする配列の他に 、開始コドンの直ぐ上流の５゛非非翻訳列にも相補的である（これらの配列の詳 細な説明については上記の１．　Ｂ節を参照のこと）。

当業者には理解されるところであるが、ＭＴＩおよび／またはＭＴ２転写物の他 の領域と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１およ び３に示された配列を鋳型として用いて容易に作製できる。

上記の１．Ｂ節で述べたように、いずれの長さのオリゴヌクレオチドもｍＲＮＡ 転写物とハイブリダイズさせるために利用できる。しかしながら、非常に短い配 列（例えば８−１５ヌクレオチド未満）の結合は特異性が低いかもしれない。そ の上、インビボでの使用では、そのような短い配列は酵素による分解に特に鋭敏 であろう、さらに、オリゴヌクレオチドを細胞に直接与える場合は、非常に長い 配列は、標的細胞による取り込みが減少するので抑制効果は低いであろう。した がって、オリゴヌクレオチドを直接標的細胞に与える場合は、８−５０ヌクレオ チド、好ましくは１５−３０ヌクレオチドの範囲内の長さを有するオリゴヌクレ オチドが最も有利であると想定される。

アンチセンス配列を標的細胞に与える別の手段は、遺伝子治療技術の一部として 、例えば、標的細胞内で好ましくは構成的にアンチセンス配列の発現が可能なプ ロモーターを伴うＤＮＡ配列（好ましくはベクターの一部分）として存在する。

最近、工−ラーら（Ｏｅｌｌｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９２）、　社４３ ７−５３９；この文献は参照により本明細書に含まれる）は、完全な長さのＡＣ Ｃンンターゼ転写転写子ンチセンス配列をコードする構成的に発現が可能なりＮ Ａ配列を用いてＡＣＣシンターゼのインビボ抑制を報告した。したがって、アン チセンス配列が標的細胞に間接的に提供される場合、例えば細胞内で発現される 発現可能な遺伝子配列部分として提供される場合は、蛋白コード配列の実質的に 全てに相補的な配列を含むより長いオリゴヌクレオチド配列を用いるのが有利で あろう。

最後に、上記の１．Ｂ！ｆｆでもまた述べたように、想定される治療的に有用な オリゴヌクレオチドには、天然に存在するヌクレオチドで構成される天然のオリ ゴマーだけなく、例えば安定性や脂質可溶性を改善し、それによって細胞の取り 込みを強化した修飾ヌクレオチドを含むオリゴマーもまた含まれる０例えば、脂 實可溶性強化および／または核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）耐性の強化は、ヌク レオチド内のホスホジエステル結合内のホスフェート酸素をメチル基または硫黄 原子で置換することによってもたらされることが知られている。ホスホロチオエ ート（ホスフェート酸素が硫黄原子で置換されている“Ｓ−オリゴヌクレオチド °“）は、ヌクレアーゼ切断に対して安定で、脂質に可ン容性で、特にオリゴヌ クレオチドの直接投与のために好ましい、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、上記の１ ．Ｂ節で述べた既知の自動化合成装置で化学的に合成できる。

ｍＲＮＡ翻訳抑制に通したオリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載され、さ らに当技術分野でよく特性が調べられた標準的な方法を用いた標準的なインビト ロアノセーで容易に評価される。プロトコルの実施例は下記で述べるが、他のプ ロトコルも想定されを利に用いられるであろう。

アンチセンスの候補配列は、標準的な化学的技術を用いて本明細書で提供するよ うに調製される０例えば、配列番号５の２８５−３１５位に示す配列を有するＭ ＴＩアンチセンス配列は、アプライドバイオシステム社の自動ＤＮＡ合成装置を 用いて調製され、オリゴヌクレオチドは製造元の指示にしたがって精製できる。

続いて、オリゴヌクレオチドを適切な悪性細胞株（例えばＭＥ〜１８０）の培養 に標準的な培養条件下で提供し、増触細胞に取り込ませる。

好ましくは、ある範囲の投与量を用いて、ハイブリダイゼーション特異性と同様 抑制のための効果的濃度を決定する０例えば、ｏ−ｔｏｏμｇオリゴヌクレオチ ド／ｍｌの投与範囲を調べることができる。さらに、オリゴヌクレオチドはただ １回のＤＮＡ惑染（トランスフェクション）で細胞に与えることができるが、ま た連続的なトランスフェクションの部分として与えることもできる。

アンチセンス効果は、トランスフェクション後の時間の経過にしたがって細胞増 殖における変化を、標準的な細胞計測方法および／またはマーカー蛋白の発現減 少を、例えば上記のＩ。

Ａで述べたように免疫蛍光によって分析してめることができる。また別に、細胞 の取り込み能およびチミジン利用能は、細胞分裂の分析のもう一つのＩ！車的手 段で、ここでも例えば３Ｈチミジンを用いて実施することができる。効果的なア ンチセンス抑制は、細胞分裂を十分に抑制して、チミジンの取り込みを減少させ 、細胞増殖を抑制し、および／または検出可能なレベルのマーカー蛋白を減少さ せるはずである。

有用な濃度範囲は、新生物の性質と程度、用いられる特定のオリゴヌクレオチド 、オリゴヌクレオチドに対する新生物の相対的感受性および他の因子にしたがっ て変動すると想定される。

与えられた細胞の型にとって有用な範囲とオリゴヌクレオチドは、標準的な投与 範囲実験を本明細書で述べるように実施して決定することができる。投与範囲実 験はまた、正常および悪性細胞に対する毒性レベルを調べるために実施できる。

１０Ｓ細胞につき約１から１００μｇ／ｍｌの１度を用いるのが有利である。

インビボの使用では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬担体（例えば適 切な液体賦形剤）および場合によって補助添加剤と組み合わせてもよい。液体賦 形剤は慣用的で市販物を入手できる。それらの例は、莫留水、生理的食塩水、ぶ どう糖水溶液などである。インビボの癌治療のためには、アンチセンス配列は好 ましくは直接悪性細胞に、例えば新生物部位に注射によって与えられる。また別 に、アンチセンス配列が標的の悪性細胞に当該配列を誘導する手段を伴うことを 条件として、オリゴヌクレオチドを全身投与することができる。

慣用的な担体とともに投与する外、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の 特殊なオリゴヌクレオチド送達技術によって投与することができる。例えば、オ リゴヌクレオチドは、文献に記載されているようにリボゾームで被包することが できる［Ｍａｎｉａｔｉｓら、；　Ｍａｎｎｉｎｏら、（１９８８）　Ｂ　ｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　鉦６８２；Ｆｅ１ｇｎｅｒら、（１９８９）ＢｅＬｈ ｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、　Ｆｏｃｕｓ、　ｎ：２１１．再構築ウィルス外 Ｗｉ（エンベロープ）もまた用いられ、ＲＮＡおよびＤＮＡを細胞に送達させる ことができた　［例えば、Ａｒａｄら、（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　Ｂｉ ｏｐｈｙ、　Ａｃｔａ、、　匠８８−９４参照］。

インビボでの治療的使用では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療的に有 効な量、例えば悪性細胞での標的蛋白発現を抑制するために十分な量で与えられ る。投与される実際の投薬量は、治療の性質が予防的か治療的か、患者の年齢、 体重、健康度および性別、投与ルート、悪性疾患の大きさと性質の他、他の因子 を考慮することができる。毎日の投薬量は、１日当たり約０．０１からＩ　Ｏ０ ０ｍｇの範囲が可能である。それより多いまたは少ないオリゴヌクレオチド量も 所望に応じて投与できる。医療分野、特に化学療法分野の業者には理解されるよ うに、インビボ投与のための適切な投与範囲は、臨床室にとってはルーチンな検 査であろう。予備的なガイドラインとして、上記のように、標的分子のインビト ロ抑制に有効な濃度をまずめることができる。

１１、Ｂ］Ｌ血且■ 別の実施例では、癌マーカー蛋白自体を標的分子として用いることができる０例 えば、本質的に不可逆的にマーカー蛋白と結合するようにデザインされた結合蒼 白を、例えば細胞に対して特異的で、かつ細胞によって吸収されることが分かっ ているリガンドで結合させることによって、悪性細胞に与えることができる。特 定の細胞および細胞型に分子を的中させる手段は、化学療法分野ではよく記載さ れている。

結合蛋白は１．Ａの節で述べたように得られ、テストすることができる。例えば 、抗体の結合部分を有利に用いることができる。特にを用なものは、標的蛋白に 対して高い親和性、例えば約１０”Ｍ−’より大きい親和性で識別される結合蛋 白である。

また別に結合蛋白をコードするＤＮＡを、当技術分野でよく記載されている遺伝 子治療プロトコルに用いる操作の後、細胞内で発現されるべき発現可能な遺伝子 の一部分として標的細胞に与えることができる（例えば米国特許第４４９７７９ ６号および“遺伝子移転”（Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ、　Ｖｉｊａｙ　Ｒ， Ｂａｉｃｈｗａｌｍ、（１９８６）　）を参照）。ＩＮＭ蛋白複合体はそれによ って細胞分裂を障害し抑制することができると期待される。

アンチセンスヌクレオチドについて上記で述べたように、インビトロの使用のた めには、適切な結合蛍白は、適切な医薬担体（例えば生理的食塩水または医療分 野でよく特性が知られた他の担体）と組み合わせることができる。医薬組成物は 悪性細胞に直接、例えば直接注射することによって与えることができるが、また 該結合蛋白が標的細胞に該蛋白を的中させる手段を伴うことを条件として全身的 に投与することもできる。最後に適切な投与範囲および細胞毒性レベルは、標準 的な投与量範囲実験を用いて調べることができる。治療的に有効な濃度は、０． １−１０００ｍｇ／日の範囲であろう、上記で述べたように、実際の投薬量は、 例えば悪性疾患の性質、患者の年齢、体重および健康度の外、他の因子によって も変動するであろう。

１１．１施± 以下の実施例は、さらに異常細胞型に対するマーカーとしてのＭＴＩおよびＭＴ ２の使用を説明し、さらに、ＭＴＩおよびＭＴ２蛋白をコードする遺伝子配列の 分離の仕方および性状決定の方法を、範囲を限定することなく、そのクローニン グと性状決定の最良のＬ！ｉ様を合わせて説明する０例えば、大腸菌でのＩＮＭ ｉ白発現を本明細書で開示する。しカルながら、他の原核細胞および真核細胞発 現系もまた、ここで開示する蛋白の組換え体発現のために想定される。包含され る他の有用な宿主には、酵母菌属、昆虫／バキュロウィルス発現系、哺乳類細胞 （例えば異種ミエローマ細胞および性状がよ（調べられているチャイニーズハム スター卵巣細胞株）が含まれる。

笠ヱ土 下記に示すように、ＭＴ１発現レベルは、乳房、結腸、膀胱、卵巣、前立腺およ び子宮頚部の悪性細胞型を含む多数の異なる悪性細胞型において顕著に強化され る。下記に示したものは標準的な免疫アノセー（精度±５％）の結果であるが、 正常および悪性ヒト組織抽出物（これはＰＣＴ公開公報に記載されたように８Ｍ ウレア、２％β−メルカプトエタノール、２％ノニデノトＰ−４０（洗剤）で調 製された）について、本明細書およびＰＣＴ公開公報Ｗ０９３１０３４９７号に 記載されたように実施した。

３０２．４７抗体は、Ｃａ５ｋｉ　［子宮頚癌培養細胞株（Ａｖｅｒｉｃａｎ　 Ｔｙｐｅ　（ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ，ロックビル、 メリーランド）由来Ｎ　Ｍ１ｉ！製物に対して作製された。ＭＴＩ　：　２−８ はクローニングＭＴＩ蛋白に対して作製された。両抗体とも標準結合ア、セーを 用いて明ａかにされたように、配列番号ｌにょってコードされた蛋白上のエピト ープと結合する。下記に提示した結果から分かるように、ＭＴＩは悪性膀胱組織 で顕著に上昇する。ブロンド実験はまた、ＭＴＩレヘレベ他の悪性組織で上昇す ることを示している。

表Ｉ まず天然由来ＭＴＩ蛋白を、本質的に米国特許第４８８２２６８号および４８８ ５２３６号に８Ｃ！！されたベンマンおよびフエイの方法にしたがって、ヒト子 宮頚癌から分離した。ヒト子宮頚癌細胞株Ｃａ５ｋｉおよびＭ　Ｅ　１８０　［ ＡＴＣＣ（ｏ　ｙクビル、メリーランド）から入手１由来細胞を細胞が接触し合 うまで増殖させ、トリプンン処理によってフラスコから取り出した。懸濁細胞を 燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、細胞骨格緩衝液（Ｃ３Ｋ：１００ｍＭ ＮａＣ１，３００ｍＭ蔗垢、１０ｍＭＰＩＰＥＳ、３ｍＭＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＥ ＧＴＡ、０．５％トリトン−Ｘ１００．１．２ｍＭＰＭＳＦ）で４°Ｃ１分抽出 し、続いて冷Ｒ５Ｂ　（細網細胞懸濁緩衝液）７２倍洗剤緩衝液（１００ｍＭＮ ａＣ１，３ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｚ、１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４）、１％ヒ トイーン４０．０．５％デオキシコレート、１．２ｍＭＰＭＳＦ）で抽出した。

また別に、細胞をＲＢ　Ｓ／２倍洗剤緩衝液で２度抽出した。２種の抽出プロト コルによって、極めて類似の調製物が得られた。抽出細胞を３０分室温で消化緩 衝液［５０ｍＭＮ　ａ　Ｃ！、３００ｍＭ蔗垢、００ｍ％トリトン−Ｘ１００． １０ｍＭＰ　Ｉ　Ｐ　ＥＳ　Ｃｐ　Ｈ６，８）　、３ｍＭＭｇＣ１ｇ、１　ｍ　 Ｍ　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ、１．２ｍＭＰＭＳＦ　（１００μｇのＲＮアーゼおよびＤ ＮＮアーゼを含む）ｌで消化した。２Ｍの硫酸アンモニウムを０．２５Ｍの最終 濃度になるように加え、消化核からクロマチンを抽出した。抽出核マトリックス ー中間フィラメント（ＮＭ−［Ｆ）溝成物を続いて３７００Ｘｇで１５分沈降さ せた。

得られたペレットを続いて分散緩衝液（８Ｍウレア、２０ｍＭＭＥＳ　（ｐＨ６ ，６）、１ｍＭＥｃＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、０．１ｍＭＭｇＣ１ｚ、１％２−メ ルカプトエタノール）に再懸濁し、ベレットを超音波処理し、さらに、２０００ 容のアッセンブリー緩衝液（０，１５ＭＫＣｌ、２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７ ，１）、５ｍＭＭｇＣＬ、２ｍＭＤＴＴ、０．１２５ｍＭＥＧＴＡ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を３回交換して一晩透析した。透析物を続いて１０１０００００ｘ時 間遠心し、８Ｍ蛋白を上清から回収した。また別にＮＭＩＦ構成物を直接Ｅ４０ ０＄１衝液（０，４ＭＮａＣ１，０，０２Ｍ）リスｐＨ７゜５．０．１ｍＭのＭ ｇＣ１ｚ、０．５％２−メルカプトエタノール、１．２ｍＭＰＭＳＦ）で４°Ｃ ３０分、フオンクリスらの記Ｒ［ｖｏｎ　Ｋｒｔｅｓら、（１９９１）　Ｃｅ１ ｌ、　６４：１２３−１３５］　のように抽出した。続いてベックマン７０．Ｉ Ｔｉローターで４０００Ｏｒｐｍ、９０分遠心した後、中間体フィラメントに冨 むベレットを除去した。残存上清は、殆どサイトケラチン夾雑物を含まずＭＴＩ 蛋白に冨む。

ＭＴＩ特異抗体は標準的方法で作製した。特に、Ｂａ１ｂ／ｃＸＪマウス（ジャ クマンラボラトリー、バーハーバ−、メーン）に精製ＣａｓｋｉＮＭ蛋白を２週 間毎に１６週間腹腔内に６射した。マウスには殺処分と肺臓摘出の４日前にただ １回追加免疫を注射した。フロイントの完全アジュバントは最初の注射で用い、 二回目の６射では不完全フロインドアジュバントを、その後の注射は食塩水で実 施した。肺臓細胞はＳＰ２１０−Ａｇ１４マウスミ工ローマ株（ＡＴＣＣ，ロッ クビル、メリーランド）とともに、当技術分野で周知の標準的融合方法を用いて 融合させた。核マトリックス蛋白と反応する抗体を産生じているバイブリド−７ をクローニングし、腹水として増殖させた。抗原特異性を免疫蛍光分光計および ウェスタンブロノトアンセーで調べた。３０２．４７抗体を用いて下記のように 発現ライブラリーをスクリーニングしＭＴＩ遺伝子を分離した。

ＭＴＩのｃ　ＤＮＡクローンをラムダＺＡＰ発現ライブラリー（ストラタジーン 社、ラホイヤ、カリフォルニア）から得た。

ライブラリースクリーニングは、ＭＴＩ特異抗体３０２．４７を用い製造元の指 示にしたがって実施した。簡単に記せば、２．４５ｋｂの挿入物を含むただ１個 の陽性クローンを同定し、Ｅｃ。

Ｒ１およびＸｈｏｌクローニング部位で開環したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔヘクタ ー（ストラテジーン、ラホイヤ、カリフォルニア）でサブクローニングした。得 られたプラスミド（ｐＭＴｌ）の配列を直接調べ、さらにサブクローニングして ＭＴＩ融合蛋白を製造した（下記参照）。

ｃ　ＤＮＡ配列は当技術分野で記載されている標準的なジデオキシ法を用いて得 られた。二重鎖配列決定は、製造元（ストラタジーン、ラホイヤ、カリフォルニ ア）の指示にしたがって、適切なブライ−マーを用いてプライミングしたｐ　Ｍ 　Ｔ　１ペタターを使って実施した。内部配列は合成プライマー（同定した配列 に基づいて作ｌりを使って得た。

ＭＴＩの完全なヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列は配列番号１に示す。

ｃＤＮＡクローンはポリアデニル化シグナル（仮定的開始コドン）、連続した開 放読み取り枠およびヒト遺伝子に合致するコドン利用を存している。ＭＴＩの予 想アミノ酸配列は、ＰＩが５．４７の７０．５ｋＤの蛋白をコードする６３９個 のアミノ酸から成っている。−次構造は、チョウーファスマンアルゴリズム（Ｃ ｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、　（１９７８）　Ａｄｖ、　ＥｎｚｙＩｌｌｏｌ。

Ｒｅ１ａｔ、　Ａｒｅａｓ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、４７：１４５−１４８）から 予想されたように、７２％アルファへワックスから成り、その５６％は延長へワ ックスである。

ＭＴＩの一次構造（図１に提示）は２７個のプロリン残基を含み、これは一般に 分子全体に２個ずつまたは３個ずつとなって出現する。配列内のプロリン分布は 図ＩＡに示すが、ここでダイヤはプロリン残基を表している。プロリンペアーお よびプロリントリブレンドは積み重ねたダイヤで示されている。Ｎ−末端では４ ０個のアミノ酸のストレッチは８個のプロリンの集塊（残基４２−８１）を含み 、これは３個またはそれより少ないアミノ酸で分断されながら対になって出現す る。同様なプロリンに冨む領域がＭＴＩのＣ−末端（残基５５１−５６３）に出 現し、ここでは１３個のアミノ酸のストレンチ内に６個のプロリンが出現する。

プロリンに冨む両領域は、エミ二一ら（Ｅｍｉｎｉら、（１９８５）　Ｊ、ν１ ｒｏ１．．５５：８３６−８３９）の技術で決定したプロハビリティー計算によ ればおそらく蛍白表面に存在する。この高プロリン宙度はまた、ＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動でめたように異常な見かけの分子量を説明できるであろ う。

上記で述べたように、アミノ酸配列から想定したＭＴＩの予想分子量は７０．１ ｋＤである。しかしながら、下記に述べるように、天然由来および＆１ＩｌＩ！ ！え体蛋白はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで９０ｋＤ蛋白として移動する。別 の選択肢として、この分子量の変動は、原核細胞および真核細胞の両方で達成で きる翻訳後修飾の結果とも考えられる。

２つのプロリン富裕末端の間で、ＭＴＬは延長アルファへリノクス構造の領域に 一致する配列を有するが、これは図ＩＢの斜線構造で示す。延長へリノクスは、 通常１対のプロリン残基を含む短いヘリックス−歪曲アミノ酸ストレンチによっ て４が所で遮られている。これらの理論上の計算に基づ＜ＭＴＩ構造に関する予 備的仮説は、この分子は、球状のプロリン富裕ドメインがいずれかの末端に境界 を作っている伸長杆状体から成るということである。

利用可能な配列データベースの全ての分析によって、ＭＴＩは、いずれの既知蛋 白とも顕著な相同性をもたない新規な配列を有することが示された。さらに、こ の配列は、いずれの既知の識別可能なりＮＡ結合モチーフ（例えばロイシンジッ パ−モチーフ）も持たないように思われる。

クローン化ＭＴＩＤＮＡを使って、ＭＥ細胞由来の全ＲＮＡおよびポリＡ含有Ｒ ＮＡのノーザンプロット分析を、１５μｇのＲＮＡで標準的な方法を用いて実施 した。プロットを実施し、”Ｐｉ識ｐＭＴＬＤＮＡでハイブリダイズさせた後、 ただ１本のｍＲＮＡのバンドがポリＡ含存分画で検出された。このバンドはオー トラジオダラムの４８時間露出では全ＲＮＡ分画においては検出されなかったが 、これはＭＴメンセージは少量のＲＮＡ種であることを示している。ノーザンブ ロノト分析は、ＭＴ１蛋白は単一のｍＲＮＡから翻訳されることを示唆している 。

ノーザンブロント分析はまた、ＭＴＩ　ＲＮＡは、配列番号１に示す蛋白コード 配列の５“測的５００ｂｐを含むことを示している。この上流の配列は１つまた はそれ以上の非翻訳配列を示しているかもしれないし、および／または付加的な 蛋白コード配列をコードしているかもしれない。

ＭＴＩの融合蛋白は、上記のｐ　Ｍ　Ｔ　１構築物からの挿入物を用いて、配列 番号１およびｐＭＡＬ発現系にューイングランドハイオラブ社、ビハリー、マサ チューセノツ）で得られた。

この系では、問題の遺伝子（ＭＴ　１　）はｐＭａｌ−ｃベクターにニーイング ランドバイオ９フ社、ビバリー、マサチューセノツ〕でクローニングし、ベクタ ーを大腸菌にトランスフェクトし発現させて、問題の蛋白とマルトース結合蛋白 の両方を含む融合蛋白を生成した。マルトース結合蛋白は、マルトースの存在化 で融合蛋白を選択的に精製することを可能にし、さらに、その後でＸａ因子によ る蛋白分解切断で切断し、完全な組換え体ＭＴＩ蛋白を得ることができる。ここ では、マルトース結合蛋白の５゛末端に開始ＡＵＣコドンが直接連続するように 、ＭＴｌｃＤＮＡをｐＭＡＬ−ｃベクターでクローニングした。Ｘａ因子で蛍白 分解による切断後、生成ＭＴＬ融合蛋白は、−切の付加的アミノ酸をもたない、 ＭＴｌｃＤＮＡでコードされた完全なアミノ酸配列を保持している。ｐＭＡＬ系 の実験は細部に到るまで全て製造元の指示にしたがって実施された。

は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで約９０ｋＤの見かけの分子量と一敗する電気泳動移動度 をもつ。さらに、両蛋白のｐ＋は等しく　（５，４）、アミノ酸配列から算定さ れる予想ｐ■と一敗する。レトとマルチ二ン一の方法（Ｌｅｔｏ　＆　Ｍａｒｃ ｈｅｓｉ　（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｑｉ４６０３−４０ ４９）にしたがって、システィン残基を２−二トロー５−チオンアノ安息香酸（ ＮＴＣＢ）で切断した両蛋白のペプチドマツピングでは、ウェスタンプロット分 析で同しＭＴＩ交差反応性を共有する同等なペプチドフラグメントが得られた。

その上、生成したペプチドフラグメントの数と大きさは提唱されたＭＴｌアミノ 酸配列から予想されたものと一敗している。

又工Ｉ ＭＴＩと同様に、Ｍ　Ｔ　２発現レベルは、血清分析および組織培養上清分析の 両方によって決定されたように、種々の悪性細胞型で顕著に増強される。下記に 述べるアンセーでは、使用抗体は２種の異なる子宮頚癌細胞株（門Ｅ−１８０お よびＣａ５ｋｉ、　ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド）のＮＭｌｉ製物に対 して作製された。

１００シリーズの抗体はＭＥ−１８０に対して作製されたもので、３００シリー ズの抗体はＣａ５ｋｉ　−ＮＭ免疫原に対して作製されたものである。下記の抗 体のうち、１０７．７および３０７．３３がＭＴ２Ｔ２蛋白異的に結合し、さら に３０２−１８．３０２−２２および３０２−２９がＭ　Ｔ　２と密接に関連し 、それと−緒に分離される蛋白と交差反応することが分かった。

２種の抗体組み合わせのドーズ・レスポンス評価の結果は以下の表ＩＩに示すが 、ＭＥ−１８０細胞培養上清が抗原として用いられている。各アノセーは、組織 培養上清における抗原の用量依存検出を示し、このアッセーが、死細胞から遊離 される可溶性内部核マトリックス蛋白を定量できることを明らかにし未希釈　０ ．２７４　０．０１８ １：２　０．１２７　０．００６ １　：４　ｏ、０６７　０．００６ １：８　０．０３５　０．００９ １：１６　０．０２１　０．００７ 上清なし　ｏ、ｏｏ。

上ａａ度　平均ＯＤ　５Ｄ ３ｃｔ　ｏ、９０６　０．００９ ３：２　０．４５６　０．０１１ ３：４　０．２１６　０．００７ ３：８　０．０９９　０．００５ ３：１６　０．０５２　０．００２ ３：３２　０．０３１　０．００５ 次に、内部核マトリックス蛋白定量実験を種々の壊死腫瘍組織の上清で調べた。

ここでは、血清を枯渇させて腫瘍と正常組織を培養液中で殺した。特に、細胞株 は標準的な培養技術で組織培養フラスコで互いに接触するまで増殖させた。続い て培養液を血清非含有培養液と交換し、さらに細胞を５％ＣＯ２の３７°Ｃ保温 器に７から１４日間入れた。保温終了時に培養液を採集し、１４０００Ｘｇで遠 心して細胞残層を取り除いた。上清１１々の構成のサンドイノチアンセーで調べ た。

結果を図３に示すが、ここでは、ＭＥ−１８０抗原を標準として用い、全ての値 は単位／ｇである。図３から分かるように、ＭＴ２抗原は壊死組織の各々から遊 離され、腫瘍組織での死細胞の増加は、癌組織対正常組織として定量したとき、 より高いＭＴ２平均抗原値として反映される。

図４は、癌患者と正常血液供与者からの血清サンプルを用いて実施した類似の実 験結果を示す。ここでは組織は以下のように調製される。供与者から組織を取り 出し、摘出後１０分から４時間以内に液体窒素中でフラッシュ凍結を行い、必要 なときまで一７０°Ｃで保存する。使用の準備ができたら、組織が溶けるとき、 Ｉｉ流フード内で無菌的に組織を０．１から０．３ｃｍ角に細切れにし、ファン ギゾンとゲンタマイシンを含む血清非含有培養液ををするフラスコに入れた。一 般に、２−４ｇの組織をＴ１５０フラスコ中の１００ｍ１の培養液に用いる。組 織を含むフラスコを続いて４−７日間５％ＣＯ□で３７°Ｃで保温する。保温後 、培養液をフラスコから採集し、ｌ　４０００Ｘｇで２０分遠心する。図３につ いては、ＭＥ−１８，０細胞抗原がｍｓである。結果は単位／ｍｌで示す、上清 抗原を血清で希釈し、続いて溶液中で蛋白を定量するコントロール実験では、血 清は殆どまたは全くアノセーに影響を与えない０図４に示した結果から分かるよ うに（図３で示した結果と同じように）、癌患者の血清サンプルは、正常血液の 血清サンプルで検出されたものと比べて、癌患者の血清サンプルで検出される計 量可能なより高しベルのＭＴ２抗原によって示唆されるように、より高い細胞死 の速度を反映している。

クローニング ＭＴＩと同し一般的な方法にしたがって、選択的にＭＴ２に冨む組成物をＭＥ− １８０細胞（子宮頚癌細胞、ＡＴＣＣ、ロックピノ呟メリーランド）から得、Ｍ Ｔ２特異的抗体を調製した。

１０７．７抗体を用いて、ＭＴＩのようにラムダＺＡＰ発現ライブラリーをスク リーニングすることによってＭＴ２の部分的ｃ　ＤＮＡクローンを得た。回収し た部分的クローンを続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌヘクター（ｐ　Ｍ　Ｔ　 ２　）でサブクローニングし、標準的技術を用いてＭＴ２ｃＤＮＡの配列を調べ た。

配列番号３の残基１３６６から２８６５に対応する、配列を調べたＤＮＡを続い て、読みとり枠およびコードされるアミノ酸配列を決定するために分析した。完 全なコード配列はその後決定したが、配列番号３に示す（Ｃｏｍｐｔｏｎら、（ １９９２）Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１ｉ１３９５−１４０８）、　Ｍ　Ｔ　２のヌクレオチド配列および予想アミノ 酸配列は配列番号３に記載する。

ＭＴ２の一次構造は模式的に図２に示す。この蛋白は、プロリン対によって分断 される少なくとも６個の螺旋領域を含むように思われる（図４ＡおよびＢ参照） 、この−次構造は、蛋白が溶液中でコイルトコイル構造を形成することを可能に する。

図３に関しては、プロリンはダイヤで、ヘリックスは斜線入り枠で示される。さ らに、ＭＴ２のＣおよびＮ末端の両方は球状ドメインのように折れ曲がるようで ある（Ｃｏｎ＋ｐ　ｔｏｎら、（１９９２）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１釘 １３９５−１４０８）。

本発明は、その神髄または本質的な特徴から外れること無く他の特異的な形態で 具体化できる。ここに示した実施例は、したがって全ての局面において解説的な ものであり、制限的なものではなく、発明の範囲は、前述の記載によるよりむし ろ添付の請求の範囲によって示され、請求の範囲と同等の意味および範囲内に入 る変更は本発明に包含される。

配列リスト （１）一般情報： （ｉ　ｉ　ｉ）配列の総数二６ （２）配列番号１の情報 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の型：ｃＤＮＡ （Ｆ）組織型：子宮頚部１１瘍 （２）配列番号２の情報・ （Ｘｌ）分子の型：蛋白 （ｘ１〕配列の記載　配列番号２ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　人１ａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　（、ｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｂ　Ｇｌｕ　Ｇ１■ Ｖｉｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　にｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＳｅｒＧユｕ工ユｅ ＡｉＪＧｌｙＣ１ｕＬｙｓＬｙｓ５ｅｒ人１ａＧａｓＴｒｐ人ｒｇ丁ｈｒＶａ、 １Ｃ１ｕＧｌｙ　人１ａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｔｇ　Ｌｙｓ　 人ｌａ　Ｖａｎ　ＡＬＰ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　人ユａ　Ａｓｐ　ＡｌａＬｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｙｓ　ｕａ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｌｌ！ｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｘ１ｅ　ＧｌｕＡＩ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　にｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ 　Ｉｌｅτｈｒ　ＡｌａＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａ ｘｎ　ｌ１ｅｔ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＬｅｕΔｓｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖ ａ１Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ｄａ　Ａｌａ　Ｇｈ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 ｕａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＴｙｒＨｉｓ　Ｇ１１ｌ　Ｌ ｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ムｊｐ　人ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌ ｙｓ　人ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　人５■ Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉ（ｅｔ　Ｓｅｒ　ＶａｌＳｅｒＡａｐ　Ｌｅｕ　Ａ ｉａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｊｐ　ｊｕｐ　Ｌｅｕムｓ ｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ工１ｅＡｌムＬｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｕ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｎＨｌｓ　Ｉｌｅτｈｉ　Ｌｅｕ　Ａｉａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ 　ＬｙｓＶａｌ　Ａｒｇ　人５ｐ　Ａｈａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　人ｓｎ　Ｇｌｕ　 ＭｅＣムｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　丁ｈ：　ＡｌａＬｙｓ　Ａｌ ａ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒムｓｐ　ｍｎ　Ｇｌｕ　Ｆｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　 Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＡｌａＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧｌｒＩＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　に１ｕＴｙｒ　Ｃ′／ｓ　：ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　ｈ ｓｐ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ｕａ　Ｌｙｓ　Ｆｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓ ｎＧｉｎ　ＬｅｕＬｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅ＝＾ｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｇ′−ｎＡｓｐτ：ｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ（２）配列番号３の情報 ： （１１）分子の型：　ＤＮＡ （Ｂ）へしＭＡの一次構造４ （ｘｉ）配りリＯ記載　配シＩＪ番号３（２）配列番号４０情報： （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の型：蛋白 （ｘｉ）配列の記ｉ！：配列番号４ Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ｂｎＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅ ａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＡＪＰ　Ａｌａ　ＧＬＩ　ｒｌｅ　Ａｌ ａ　Ｍｅｔ　？ｌｅｔ　Ｇ釦Ｇ−Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　ｈｘｇ　Ｌｅｕ　人 ユａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ムｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　人１ａ　Ｓ ｅｒ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌ７Ｓ　Ａｉｎ　Ｃ１ｕ　Ｓｅｔ　Ｌｅｕ２７５　２ｇ０　２ ８５ Ｔｈｒ　Ｍｅｃ　人＝ｇ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｇｉｎ　Ｃ）ｒｓ　にｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｉ　τｈ■ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　Ｃ；ＬＩ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　工１ｅ 　人５Ｉｌｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　■Pｎ Ｃ１ｌ）ｌ　Ａ５Ｐ　Ｌｅｕ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　人ｒｇ　Ｇｌ ｕ　Ｐｈｅ　ムｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇ撃■■ ３２５　３コ０　３コ５ Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅ：　［；ｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　［ｌｉ ｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ｊｕｐ　Ａ唐■ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　ＡＪＰ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕτｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌ ７Ｓ　ＣＬＩ　にｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｎ：　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａ ｉｎ　Ａｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　ＬａｕＧ工ｎ　ムユλ人ｒｇ　ｖａｌ　Ｃ１ｕ 　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　にｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｕ　ム１１４］５　４４０　４４５ Ｓｅ＝　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　にＬｏ　Ｓｅｒ　 Ｓｉｒ　ＩＩｓ　Ｓｉｒ　ｈｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｈ＋Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｉ ｎ　Ｖ＆１Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｘｎ　ＡｌａＧｉｎ　Ａｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｌｙｓ　人ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ムユ息　ムｓｐ　人 ユａ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　人ｒｇ　Ｃｙｓ　ｌ１ｅＡｌ ａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｘ＋　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｈ ｌｓ　Ｇ３ｓ　Ａｌａ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　にｍｕ　ＶａP ７７０　７７５　７１！０ Ｔｈｒ　にｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡＳｐ　［；ｉｎ　［；ｌ ｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　にｌｙ　Ｌ■■ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　工ｉｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎτｈｒ　Ｖｉｌ　ＬｙｓＣ１＋ｌＩ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　人１ａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　）Ｈｌｓ　人１ａ　Ｓｓｒ　fｌｙ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｕａ　Ａｌａ　Ｃ１ｙ　 Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　ＩＴｈｒ　Ｇｌｙ　ＰｒB Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｌ：ｌｎ　Ｃｙ■ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ＡｌａＬｅｕ　Ａｌａ　Ｓ ｅｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒ ｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＬｅｕ　Ｇｌｕ　にｌｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ 　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　人１ａ 　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ″’、＝　Ｓｅｒ　Ｇｌｒ＋　ｄａ　 Ｇｉｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ１ コＬ５　１３２０　１３２５ Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ｄａ　Ｇ ｌｕ　Ｈｌｓ　Ｔ７ｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔλｒｇ　Ｓｅｒ　ｕａ 　Ｐｒｏ　ムユａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　人１ａ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　τｈｒＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　！’ｒａ　Ｃ１ｙ 　Ｔ７Ｔ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒムｒｇ　Ｓａｒ　Ｓｅｔ　Ａｌａ　 Ａｒｇ　Ａｒｇ１Ｂ６０　１８６５　１１１７０ ＳｅｒＧｉｎＡｌａＧｌｙＶｔユＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＰｒｏＧｌｙ ＡｒｇＡｊｒ１ＳｅｒＰｈｅＴＦ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　ＡｓｐΔｓｐτ卯ム５ｎム ｒｇ　Ｉｌｅ　）ｉｎ　にｎｕ　Ｌｅｕ　ＧＬｒＩＧｉｎ　Ａｒｇ　Ｊｕｎ　Ａ ｒｇ　ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　ＬｅｕＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙ ｓ　Ｔｙ＝　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｕ　Ｓｅｗムｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ１９２５　１９３０　Ｌ９３５ 工１ｅ　Ｔｈｒ　Ａ５Ｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｂｒ　Ｇｌｙ　 人ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇｈｒｇ　Ａｌａ　Ｓ ｅｒ　Ｍｅｔ　にｉｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　ｔｉｅ　Ａｌａ　にｍｕ　（ 、ｌｙ　Ｔｂｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｓ　Ｔｂ■ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｘ　Ａｒｇ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉ（ｉｓ　（ａｌｂ　にｌｙ　Ｐ秩B にｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ム１１　Ｔｂｒ　 Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　！’ｈｅ　Ｐｒｏ　人ｒｇ　Ｐｒｏ　ｋｌ■■ τｈｒ　Ｐｒｏ　人ｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇ１７　Ａｒｇ　 Ｌｙｉ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ム１ａＧｌｒＩＬｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ａｌａ　ｕａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌ ａ　ＡＬＰ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　に１ｎＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃ，ｌ ｙ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｕ＆　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡＩ ＪＬ　Ｓｅｒ　Ｉfｒ。

ＡＪｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ａｒｇ　Ｘ１ｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ人１ａ　Ｓｅｒ　Ａｌ ｈ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　人１ａ　ムｌａ　Ｉｌｅ　にｌｙ　ム１ａ　Ｔｂ ｒ　Ｐｒｏ　人ｒｇ　人１ａ　Ｌｙｓ（２）配列番号５の情報 （１１）分子の型：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記７ａ：配列番号５： （２）配列番号６の情報： （１１）分子の型：　ＤＮＡ （χＩ）配列の記載、配列番号６： ロ７χフ話πＣユωＬ紅πＣ＾口Ｃυ議πＣＧＣ口Ｌτυ、τＣＣ○、Ｇζソ、 Ｃ３４８ＦＩＧ、３．１ ＦＩＧ、３．２ ＦＩＧ、４ ａｖｅｒａｇｅ　ｎｏｒｍａｌ　３４４７　１２８４　５７５９ａｖｅｒａｇｅ 　ｃａｎｃｅｒ　９４４２　７０６９　２６３２１補正書の写しく翻訳文）提出 書（特許法第１８４条の８）平成６年、２月２、Ｕ］

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１の、その変種を含むＤＮＡ配列を含む分離核酸。 ２．厳格なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイプリ ダイズする分離核酸。 ３．請求の範囲第１項または第２項の核酸をトランスフェクトした宿主細胞。 ４．請求の範囲第１項または第２項の核酸を含むベクター。 ５．配列番号１の、その変種を含むＤＮＡ配列によってコードされ、アジュバン トと組み合わされた蛋白または蛋白フラグメント。 ６．その変種を含む配列番号１の配列を有する組換え体ＤＮＡによって宿主細胞 で生成され、当該宿主細胞から分離された蛋白。 ７．請求の範囲第６項の蛋白上のエピトープと結合する結合蛋白。 ８．当該結合蛋白が抗体または抗体フラグメントである、請求の範囲第７項の結 合蛋白。 ９．ａ）その変種を含む配列番号１または３のＤＮＡによってコードされる、組 換え体によって製造した蛋白または蛋白フラグメントをアジュバントと組み合わ せて、哺乳類の注射に適した組成物を形成し； ｂ）該組成物を哺乳類に注射し、組換え体により製造した当該蛋白または蛋白フ ラグメントに対して当該哺乳類に抗体産生を誘発し； ｃ）当該哺乳類から当該抗体を分離するという、ａ）−ｃ）の工程を含む、異常 な細胞型の検出に使用する抗体の製造方法。 １０．当該抗体を当該哺乳類から分離する当該工程が、当該抗体を産生する細胞 を当咳哺乳類から分離することによって実施される請求の範囲第９項の方法。 １１．（ａ）配列番号１もしくは３またはその変種のＤＮＡによってコードされ るアミノ酸配列を含むマーカー蛋白上のエピトープを認識する結合蛋白とサンプ ルを接触させ；（ｂ）当該マーカー蛋白またはそのフラグメントのサンプル中の 存在を検出するという、（ａ）および（ｂ）の工程を含む、細胞または細胞核残 層を含むサンプルにおいて異常細胞型を検出する方法。 １２．当該異常細胞型が悪性細胞型である請求の範囲第９項または１１項の方法 。 １３．当該悪性細胞型が膀胱、乳房、前立腺、肺、結腸、卵巣または子宮頸部の 悪性細胞型の特徴を有する請求の範囲第１２項の方法。 １４．当該結合蛋白が、当該マーカー蛋白または蛋白フラグメント上のエピトー プに特異的に結合する抗体である請求の範囲第１１項の方法。 １５．当該抗体が、当該エピトープに対して１０５Ｍ−１より大きい結合親和性 を有する請求の範囲第１４項の方法。 １６．当該抗体が、１０７Ｍ−１より大きい結合親和性を有する請求の範囲第１ ５項の方法。 １７．当該サンプルにおいて当該マーカー蛋白の豊富さを定量する付加的工程を 含む請求の範囲第１１項の方法。 １８．当該サンプルが体液を含む請求の範囲第１１項の方法。 １９．当該体液が、血清、血漿、血液、尿、精液、膣分泌物、髄液、腹水、腹腔 液、痰、および乳房塗出物から成る群から選ばれる請求の範囲第１８項の方法。 ２０．（ａ）配列番号１もしくは３またはその変種のＤＮＡによってコードされ るアミノ酸配列を含むマーカー蛋白上のエピトープを細胞死として認識する結合 蛋白とサンプルを接触させ；さらに、 （ｂ）当該組織の細胞から遊離される、配列番号１もしくは３またはその変種の ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含む当該マーカー蛋白またはそ のフラグメントの濃度を検出するという、（ａ）および（ｂ）の工程を含む組織 の細胞死の程度を決定する方法であって、検出される当該マーカー蛋白または蛋 白フラグメントの濃度が当該組織の細胞死の程度の指標となる細胞死の程度を決 定する方法。 ２１．ｃ）間隔を置いて当該マーカー蛋白またはその蛋白フラグメントの濃度を 検出する工程を繰り返し；さらに、ｄ）当該検出濃度を比較するという付加的工 程を含む請求の範囲第２０項の方法であって、ここで、当該検出濃度における変 化が当該組織の状態の指標となる請求の範囲第２０項の方法。 ２２．当該検出濃度の減少が細胞死の減少の指標となり、当該検出濃度の増加が 細胞死の増加の指標となる、病状の変化または治療効果をモニターするために使 用する請求の範囲第２０項の方法。 ２３．当該組織が乳房、前立腺、肺、結腸、卵巣、膀胱または子宮頸部組織の特 徴を示す請求の範囲第２０項の方法。 ２４．ａ）配列番号１または３のＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ転写 物であって、翻訳されたときには配列番号１もしくは３またはその変種のアミノ 酸配列をコードする当該転写物と特異的にハイプリダイズする核酸とサンプルを 接触させ；さらに、 ｂ）該サンプルにおいて当該ｍＲＮＡ転写物もしくはフラグメントまたはその変 種の存在を検出するという、ａ）およびｂ）の工程を含む細胞または細胞核残層 を含むサンプルにおける異常細胞型の検出方法。 ２５．当該異常細胞型が悪性細胞型である請求の範囲第２４項の方法。 ２６．当該悪性細胞型が、乳房、前立腺、肺、結腸、子宮頸部または膀胱の悪性 細胞型の特徴を示す請求の範囲第２５項の方法。 ２７．当該核酸が、当該ｍＲＮＡ転写物と厳格なハイブリダイゼーシヨン条件下 でハイプリダイズする請求の範囲第２４項の方法。 ２８．当該サンブル中の当該転写物の豊富さを定量する付加的工程を含む請求の 範囲第２４項の方法。 ２９．その変種を含むＭＴ１またはＭＴ２のｍＲＮＡ転写物もしくは蛋白生成物 と結合することができる分子の、癌治療剤製造のための使用。 ３０．詣該癌治療剤が、乳癌、前立腺癌、子宮頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌 または肺癌用である請求の範囲第２９項の使用． 。３１．当該分子が、配列番号１または３のＤＮＡ配列の少なくとも一部分と相 補的なオリゴヌクレオチドである請求の範囲第３０項の使用。 ３２．当該オリゴヌクレオチドが、合成オリゴヌクレオチドで、配列番号５また は６の配列の少なくとも一部分を含む請求の範囲第３１項の使用。 ３３．当該分子が、ＭＴ１もしくはＭＴ２またはその変種と実質的に不可逆的に 結合することができる結合対の構成物である請求の範囲第２９項の使用。 ３４．当該結合対の当該構成物が、ＭＴ１もしくはＭＴ２またはその変種と約１ ０９Ｍ−１より大きい親和性で結合する請求の範囲第３３項の使用。 ３５．治療薬の製造に使用する医薬担体と混合された合成オリゴヌクレオチドで あって、当該合成オリゴヌクレオチドが、ＭＴ１もしくはＭＴ２またはその変種 のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分と相補的な配列を含んでいる、当該医薬担 体と混合された合成オリゴヌクレオチド。 ３６．配列番号１もしくは３またはその変種のＤＮＡ配列の少なくとも一部と相 補的な配列を含む、請求の範囲第３５項の合成オリゴヌクレオチド。 ３７．配列番号５もしくは６またはその変種の配列の少なくとも一部分を含む、 請求の範囲第３５項の合成オリゴヌクレオチド。 ３８．長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、請求の範囲第３５項の合成オ リゴヌクレオチド。 ３９．医薬の製造に使用する結合蛋白であって、当該結合蛋白が、配列番号１も しくは３またはその変種のＤＮＡによってコードされる蛋白に対して、約１０９ Ｍ−１より大きい結合親和性を有している、当該医薬の製造に使用する結合蛋白 。