JPH11512294A - 癌の治療、予防および発見を目的とする腫瘍細胞での蛋白ホスファターゼ２Ｃ−ＰＰ２Ｃα−発現の操作と検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト型蛋白ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２ＣαおよびＰＰ２Ｃβ）およびその遺伝学的多形性をコードする遺伝子の活性の変化を、患者から単離した標本で検出することによって患者の癌を検出する方法を開示する。本発明はさらに癌を治療する方法を提供するが、この方法は、先ず癌のタイプおよび癌を発現している細胞の型を決定し、続いてＰＰ２Ｃαの発現能力を制御するために調節要素を含むことができ、さらに癌細胞に特異的に標的到達することができるベクターを調製する工程を含む。該ベクターは続いて患者に投与される。また別にはアンチセンスベクターも調製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 癌の治療、予防および発見を目的とする腫瘍細胞での 蛋白ホスファターゼ２Ｃ−ＰＰ２Ｃα−発現の操作と検出 発明の背景 技術分野 本発明は、ヒト型ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２ＣαおよびＰＰ２Ｃβ）の遺伝 子およびその遺伝子産物を利用することによる癌の検出および治療方法、並びに 本発明を実施するためのキットに関する。本発明では、ヒトのＰＰ２Ｃα遺伝子 または他の種のＰＰ２Ｃαの同族体によってコードされる遺伝子産物が産生され るか、または天然のＰＰ２Ｃα遺伝子の発現が改変されているかもしくは破壊（ ノックアウト）されている天然の生物体および他種遺伝子を移された（トランス ジェニック）生物体が調製される。 従来技術 形質転換細胞または悪性細胞は健康を激烈に脅かす。もし形質転換表現型を逆 行させることができるならば、癌細胞は治療され制御が可能である。逆行させる ことによって細胞はその腫瘍性表現型を失い、それによって再び正常な細胞増殖 および／または分化が開始し、または増殖は停止し、または計画的な細胞死（ア ポプトシス経路）が活性化される。これらの逆行手段のいずれかを実施すること によって形質転換表現型を逆行させることができる治療手段を提供することは有 用であろう。さらに、治療を早期に開始することができるので、形質転換事象の 早期特定もまた有用であろう。 形質転換に必要な遺伝子（例えばRas、Fos、PDGF、erb-B、erb-B2、RET、c-my c、Bci-2、APC、NF-1、RB、p53など）が現在特定されている。これら遺伝子は、 ２つの大きなカテゴリー、プロトオンコジーンおよび腫瘍サプレッサー遺伝子に 分類される。プロトオンコジーンは、細胞分裂を刺激する蛋白をコードし、変異 した場合（オンコジーン）は刺激蛋白を活性過剰にし、細胞を過剰に増殖させる 結果を生じる。腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞分裂を抑圧する蛋白を コードする。変異および／または異常な調節はこれらの蛋白を不活化し、それに よって細胞の増殖抵抗性を失わせる。さらに、E2FおよびP53および他のものは不 適切に発現される場合はオンコジーンとしても腫瘍サプレッサーとしても作用す ることができる。オンコジーンおよび腫瘍サプレッサーには、転写因子として作 用するモチーフおよび蛋白キナーゼとして作用するモチーフがある。これら特定 の遺伝子の同定によって、細胞のライフサイクルがどの様に進行するかについて ある程度明らかにされた。 遺伝子の増幅は悪性細胞および形質転換細胞株に付随する明白な異常の１つで ある（増幅についての概説には次の文献を参照された：“Gene Amplification i n Mammalian Cells，A comprehensive Guide（哺乳類細胞における遺伝子増幅、 包括的ガイド）、R.E．Hellems編、Marcel Dekker，Inc．刊）。この現象は腫瘍 性細胞の特徴である遺伝学的不安定性の一環であり、正常な細胞ではほとんど発 生しない。いくつかのオンコジーンおよび腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばRas 、Erb、P53など）が増幅することが示された。 オンコジンーンおよび腫瘍サプレッサー遺伝子を含む構造性および調節性蛋白 質の燐酸化は、真核細胞における主要な細胞内制御メカニズムである（Wera & H emmings(1995); Cohen(1989)）。蛋白の燐酸化および脱燐酸化は、シグナル形質 導入、細胞サイクル進行および転写制御のための調節サイクルの一環である。蛋 白キナーゼおよび蛋白ホスファターゼはともに燐酸化−脱燐酸化サイクルにおい てそれぞれ役割を有する。これらの蛋白質をコードする遺伝子の変異は蛋白の燐 酸化の失敗につながる。例えば酵母では、２Ｃ型蛋白ホスファターゼの変異は浸 透圧調節の欠陥を生じる（Shiozak & Russel(1995)）。 ｐｐ２ｃは蛋白のセリン／スレオニンホスファターゼである（Cohen(1989))。 ｐｐ２ｃ類は、哺乳類組織の２つの細胞質同位酵素から成り（McGowan & Cohen( 1987)）、さらに酵母の少なくとも３つのｐｐ２ｃ様酵素は同じ酵素的、生化学 的特性を示す。この２つの哺乳類同位酵素はモノマーであるが、分子質量はわず かに異なり（４４ＫＤａおよび４２ＫＤａ）、ｐｐ２ｃαおよびｐｐ２ｃβと称 される。それらの機能、および形質転換細胞とこれら蛋白ホスファターゼとの付 随性に関しては相反する文献が存在する（Saadatら(1994);Nishikawaら(1995) ;Lau & Baylink(1993); Shiozakiら(1994); Eden & Cedar(1994); McGowan & Co hen(1987); Wenk & Mieskes(1995))。 正常な細胞機能が必要とされる場合に治療として蛋白の燐酸化を制御できるな らば有用であろう。さらに、ｍＲＮＡ翻訳に続く糖化は多くの遺伝子産物に機能 を果たさせるために必須である。蛋白の異常な糖化は蛋白の機能に干渉し、調節 経路の変化から生じるであろう。遺伝子発現制御の重要な方式はＤＮＡのメチル 化である（Eden & Cedar(1994)）。ＤＮＡの異常なメチル化は１つの役割を果た し、細胞サイクルを制御する調節性蛋白の不適切な発現をもたらすであろう。 ウイルスは非常に特殊化された感染因子で、多くの場合宿主の防御メカニズム を回避するように進化してきた。アデノ関連ウイルスはパルボウイルス科に属し 、それについての腫瘍抑圧特性が１９６０年に既に報告されている（概説にはRo mmelaere & Tattersal(1990)を参照されたい）。それらは、約５０００ヌクレオ チドのｓｓＤＮＡゲノムをもち、同一の回文構造をもつ１５４塩基の末端を有す る小さなウイルスのグループに入る。ＡＡＶＤＡ３ゲノムの左部分は多機能性で オーバーラップする非構造性蛋白(Rep78、Rep68、Rep52およびRep40)をコードし 、これらは、Ｐ５およびＰ１９プロモータによって駆動される弁別的にスプライ スされたｍＲＮＡ（取得番号J01901、M12405、M12468、M12469）から翻訳される 。このゲノムの右部分には、３つのオーバーラップするカプシドポリペプチド(V P1-VP3)がＰ４０プロモータからコードされる（Berns(1990); Leonard & Berns( 1994)）。これら極めて小さなＤＮＡウイルスは、脊椎動物では２つの属（自己 複製型パルボウイルスおよびヘルパー依存パルボウイル）によって代表される（ Siegelら(1985)）。 ヘルパー依存アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は，その複製についてヘルパーウ イルスの同時感染（Young & Meyor(1979a)）または遺伝子毒性ストレス状態（Ya kobsonら(1987)）に依存し、外見的疾患を示さないヒトに感染する因子を含む(C ukorら(1984))。ヘルパーウイルスは、アデノウイルス（Atchisonら(1965)）、 ヘルペス群ウイルス（Salo & Mayor(1979)）およびワクシニアウイルス（Schleh oferら(1986)）である。ヘルパーウイルスは、その感染サイクルの初期に染色体 の損傷を誘発する能力を共有する(Schlehofer & zur Hausen(1982))。 腫瘍抑圧特性がＡＡＶについて見出された（概説にはSchlehofer(1994)を参照 されたい）。アデノウイルス、ヘルペスウイルスによって、またはこれらのウイ ルスによって形質転換された細胞の移植によってゲッ歯類で誘発された腫瘍の発 達は、ＡＡＶを動物細胞に感染させることによって抑制できることが示された（ Kirschteinら(1968);Mayorら(1973); de la Maza & Carter(1981); Ostroveら(1 981)）。腫瘍抑圧についてのin vivoでの発見は、細胞の形質転換の抑制を示すi n vitroでの結果と一致する。このことは、ウイルスによってまたは活性化され たオンコジーンによって形質転換された種々の起源（ハムスターおよびマウス） の細胞について示された。コントロールと比較して、ＡＡＶを感染させるか、ま たは特定のＡＡＶＤＮＡ配列を核酸感染(transfect)させた細胞はフォーカス形 成の減少および飽和密度の減少を示し、形質転換に付随する特色の抑制を示した （Casto & Goodheart(1972); Katz & Carter(1986); Hermonat(1989); Hermonat (1994); Schlehoferら(1983); Schlehoferら(1994); Yangら(1995); Kleinschmi dtら(1995)）。 さらに、癌患者は対応するコントロール被験者よりもＡＡＶに対する抗体を有 する頻度が低いことを示す血清疫学的発見がある。異なる血清学的技術を用いて 米国(Mayorら(1976))、ベルギー(Sprecher-Goldbergerら(1976))およびドイツ(G eorg-Friesら(1984))で実施された別個の３実験によって、健常人の集団ではＡ ＡＶ（２、３および５型）に対する高い抗体が優勢であるのに対して、癌患者で は血清陽性の頻度が比較的低いことが見出された。 細胞の形質転換を制御する治療方法の開発は有用であろう。上記の情報が示唆 するように、細胞の形質転換を逆行させるか、または形質転換細胞を特異的に死 滅させることは可能である。利用可能なアンチセンス技術、ベクター送達技術な どが与えられるならば、これらの方法または新たに知られることとなる他の技術 を用いて細胞の形質転換の逆行を制御することができるヒトの細胞メカニズムを 見つけることは有益であろう。 発明の要旨 本発明にしたがえば、ヒト型蛋白ホスファターゼ２Ｃ（ｐｐ２ｃα）をコード する遺伝子（ＰＰ２ＣαまたはＰＰ２Ｃβ）の活性の変化および該遺伝子の多形 性を患者から分離した標本で検出することによって患者の癌を検出する方法およ びキットが開示される。 本発明はさらに癌を治療する方法を提供する。この方法は、癌のタイプおよび 癌を発現している細胞を先ず決定し、続いて特異的にこの癌細胞に標的到達し、 さらにＰＰ２Ｃαの発現能力を制御するために調節要素を包含させることができ るベクターを調製するという工程を含む。続いてこのベクターは患者に投与され る。また別にはアンチセンスベクターを調製できる。 本発明はさらに、ＰＰ２Ｃαの発現異常による異常な燐酸化に起因する疾患を ＰＰ２Ｃαの発現を制御することによって治療する方法を提供する。 図面の簡単な説明 本発明の他の利点は、付随の下記図面とともに以下の詳細な説明を参考に容易 に理解されよう。付随の図面は次の通りである。 図１Ａ−Ｂは、細胞サイクル分析用に調製したＣＯ６０および２つのＡＡＶ／ ｎｅｏ細胞株（９１３および９１６）のＦＡＣＳ分析のグラフである。播種後２ ４時間で細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。０．１％のクエン酸ナト リウム、０．１％のトリトンＸ−１００および５０μｇの沃化プロピジウムを含 む１ｍｌの緩衝液に細胞を再浮遊し、続いてＦＡＣＳで処理した。 図２は、ＣＨＩＮＴが種々のＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株でのＡＡＶ組み込みに付随 することを示すサザンブロット分析の写真である。サザンブロット分析では、種 々のＡＡＶ／ｎｅｏクローン、ＣＯ６０ＤＮＡをBglIIで消化し、“ＣＨＩＮＴ ”プローブ９−１、２、３、４および５でＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株でハイブリダイ ズした。９３ＲはＡＡＶを含む染色体全体を失った復帰突然変異体である。Ａ６ はマウス細胞株である。 図３は、９−３細胞の組み込まれたＡＡＶと隣接する細胞性配列の編成を示す 模式図である。ゲノムライブラリーをＥＭＢＬ−４ラムダファージを用いてＣ９ −３細胞から調製し、ＡＡＶ陽性クローンを記録した。13Kb-λSL9-1クローンを 単離し、後にBlue-scriptベクターでサブクローニングした。図に表示したよう にプラスミドpSL9-11（１３ｋｂ）およびpSL9-8（１０ｋｂ）およびpSL9-6（３ ｋｂ）を得た。 図４Ａ−Ｂは、９−３細胞でＡＡＶがＰＰ２Ｃαをコードする遺伝子に隣接す ることを示すサザンブロット分析の写真である。サザンブロット分析では、EcoR IまたはXbaIで消化したＣＯ６０および９−３細胞由来ゲノムＤＮＡは順次以下 のプローブでハイブリダイズした：１）ＡＡＶ、２）ＣＨＩＮＴおよび３）ラッ トＰＰ２Ｃαプローブ。ＣＨＩＮＴおよびＰＰ２Ｃα配列は隣接している（４ｋ ｂのEcoRIフラグメント）。ＡＡＶＣＨＩＮＴおよびＰＰ２Ｃαは９−３細胞で は極めて近傍にある（５．６ｋｂのXbaIフラグメント）。図４Ｂは、pSL9-6は野 性型チャイニーズハムスター細胞ではＰＰ２Ｃαに隣接することを示す。チャイ ニーズハムスターｎｅｏ細胞由来のBamHI消化ＤＮＡをpSL9-6およびＰＰ２Ｃα プローブにハイブリダイズさせた。〜８．５ｋｂの共通フラグメントがＣＯ６０ を含む全ての細胞株に出現した。同じフラグメントがまたＣＨＩＮＴプローブに もハイブリダイズした（データは示さず）。 図５Ａ−Ｃは、ＤＡ３（レーン８）およびＤＡ３Ｊ１−ＤＡ３Ｊ７細胞株（レ ーン１−７）のサザンブロット分析の写真である。ゲノムＤＮＡはBglIIで消化 した。ブロットを順次、AAV/neoJDT277、pSL9-6およびPP2CαのＰＣＲプローブ でハイブリダイズした。４ｋｂフラグメントが、Ｊ３（レーン３）、Ｊ４（レー ン４）およびＪ６（レーン６）でＡＡＶプローブおよびｐＳＬ９−６プローブと ハイブリダイズした。４ｋｂより小さいフラグメントは、Ｊ１（レーン１）、Ｊ ２（レーン２）、Ｊ５（レーン５）およびＪ６（レーン６）でＡＡＶプローブお よびＰＰ２Ｃαプローブの両方とハイブリダイズした。 図６は、発癌物質による処理に反応したＰＰ２ＣαｍＲＮＡの変化を示す。Ｍ ＮＮＧ（それぞれ７．５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌ）で処理後４８時間 でＣＯ６０およびＣ９−３細胞および無処理細胞から全ＲＮＡを４０μｇ単離し 、変性ゲル（１．２％アガロース／６．６％ホルムアルデヒドゲル）で分画した 。ゲルをブロットし、連続的に³²Ｐ標識ラットＰＰ２ＣαｃＤＮＡ（Ａ）、ｐＳ Ｌ９−１^DNA（Ｂ）およびｒＲＮＡのｃＤＮＡ（Ｃ）でハイブリダイズした。 図７は、２５、３０および３５ＰＣＲサイクル後のゲル電気泳動分析を示す写 真である。結腸直腸腫瘍Ｎｏ．６（Ｔ６）またはその隣接非腫瘍性粘膜（Ｎ６） から得たオリゴｄＴ反応開始（primed）ｃＤＮＡを、特異的ＰＰ２Ｃαおよびβ −アクチンセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ反応に付した。 正常および腫瘍組織のＰＰ２ＣαｃＤＮＡについての２５ＰＣＲサイクルは、目 に見える生成物が認められなかったので提示していない。 図８は、ＣＨＥ細胞株またはその隣接形質転換細胞株（ＣＯ６０）から得たオ リゴｄＴ反応開始ｃＤＮＡサンプルを、特異的ＰＰ２Ｃαおよびβ−アクチンセ ンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲに付した２５、３０、３０お よび３５ＰＣＲサイクル後のゲル電気泳動を示す写真である。 図９Ａ−Ｂは、（Ａ）センス方向（pYM001）および（Ｂ）アンチセンス方向（ pYM002）でＰＰ２ＣαｃＤＮＡを含むプラスミドを示す模式図である。 図１０は、ｐｐ２ｃαに対して作製した単クローン性抗体群と肝抽出物との免 疫沈降反応のゲル電気泳動分析を示す写真である。１Ｄ５、２Ａ３、９Ｆ４、９ Ｆ１が、肝抽出物からｐｐ２ｃαを沈澱させるために用いられた単クローン性抗 体で、８０１および３５１は免疫ブロッティング後の検出に用いた抗体である。 図１１は、ＰＰ２Ｃαの最初に翻訳されるエクソンを含むゲノムλ１００クロ ーンを示す模式図である。このファージはＣＨＯライブラリーからクローニング された。配列分析領域は斜線で表示されている（配列番号：１５および１６）。 図１２はゲル電気泳動の写真で、レーン１はｐＳＫ１とｐＡＶ２の同時核酸感 染（cotransfection）で、レーン２はＳＶ４０が複製されるＳＶ４０プラスミド ｐＳＫ１による核酸感染（transfection）で、レーン３はｐＳＶＫ１とＡＡＶゲ ノムのヌクレオチド１２５−２６３由来の１４０ｂｐを含むプラスミドの同時核 酸感染で、レーン４はｐＳＶＫ１とｐＳＬ９−６の同時核酸感染である。 図１３は、種々のマウス組織から得たＲＮＡをＰＰ２ＣαｃＤＮＡとハイブリ ダイズさせたノザンブロットの写真で、２ｋｂ未満から５．０ｋｂを越える種々 の範囲のサイズをもついくつかのｍＲＮＡが存在することを示している。ＲＮＡ は、卵巣（Ｏ）、精巣（Ｔ）、腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌ）、筋肉（Ｍ）、心臓（Ｈ ）、肺臓（Ｌｕ）および脳（Ｂ）から抽出された。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、ヒト型蛋白ホスファターゼ２Ｃ（ｐｐ２ｃα）をコードする遺伝子 （ＰＰ２Ｃα）の遺伝子活性における変化、および該遺伝子の多形性を患者から 単離した標本で検出することによって患者の癌を検出する方法を開示する。患者 の遺伝子活性は正常なコントロールのそれと比較される。活性における変化は該 遺伝子のダウンレギュレーションまたは逆にアップレギュレーションのどちらで も可能であるが、燐酸化の変化を生じる。さらに、変化によって遺伝子産物の異 常な機能または欠損、および細胞自体の内部における該遺伝子産物の分布の変化 がもたらされる。 多形性は該遺伝子の配列における変形体である。それらは異なる民族および地 理的局在（異なる配列を有する）間で認められる配列シフトであろうが、それら は配列が異なる一方、機能的に同等な遺伝子産物、アイソフォームを産生する。 多形性はまた、機能変化を有する遺伝子産物を産生することができる対立形質お よび／または突然変異として分類できる変形体も包含することができる。多形性 はまた、遺伝子産物を産生しないか、または不活性な遺伝子産物もしくはレベル の増加した遺伝子産物のいずれかを産生する対立形質および／または突然変異と して分類できる変形体も包含する。本明細書で用いられる多形性はまた、制御お よびコード領域におけるＤＮＡメチル化の違いに起因する変形体も包含すること ができる。さらに、この用語はまた適切な場合には対立形質と互換的に用いられ る。 癌は、形質転換細胞または悪性細胞（すなわち制御できない増殖および拡大を もつ細胞、概説にはScientific American，(1996)9月号を参照されたい）と定義 される。 一般には、細胞内の遺伝子産物量の減少によって決定されるように、ＰＰ２Ｃ αの活性／発現が正常なコントロールのそれと比較して減少しているのが、本明 細書の下記実施例（実施例４、５）で示すように細胞の形質転換で認められる。 しかしながら、活性の増加が蛋白活性の変化をもたらし、その結果、細胞機能に 変化があるようなものも本発明に包含される。 さらに、ＰＰ２Ｃαの遺伝子産物に１つ以上の形態が存在し、細胞で１つが減 少または変化し、一方ＰＰ２Ｃαの別の特異的形態が正常コントロールと較べて 上昇または優勢あることが本発明によって分かった。細胞は、病的状態でＰＰ２ Ｃα活性の変化を示すいずれの細胞型でもよい。さらに、第二の遺伝子が ＰＰ２Ｃαの活性の変化によって制御され、その結果それらの産物は上昇または 減少し、本発明の方法によってモニターすることができる。新規な転写物、転写 物の欠如またはこれらの転写物によってコードされる蛋白の変化がモニターされ る。 さらに、本発明は、ｐｐ２ｃαはチロシン、セリンおよびサイロニンを含む幾 つかの燐酸化部位を有するのでそれ自体燐酸化されるということ、さらに適切に それを燐酸化できないためにｐｐ２ｃαの機能不全をもたらすことを認めた。さ らに、ｐｐ２ｃαはまたそれ自体を脱燐酸化する。その自己燐酸化の失敗は細胞 サイクルの調節に影響を及ぼすであろう。 サンプルは疑いのある前癌病変または、本明細書で述べるようにＰＰ２Ｃα活 性もしくは遺伝子産物についてアッセイされる一切の組織もしくは体液から得ら れた生検材料であろう。血液、尿、脳脊髄液および唾液は適切な状態で検査する ことができる。 実施態様の１つでは、ＰＰ２Ｃα活性の検出は、in situハイブリダイゼーシ ョン、ノザンブロッティングおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応から成る群から 選ばれるアッセイを用いて、ＰＰ２ＣαＤＮＡ（その多形性も含む）に相補的な ｍＲＮＡについて標本をアッセイすることによって実施される。 また別の方法では、ＰＰ２Ｃαの活性および細胞分布の検出は、免疫組織化学 的および免疫細胞化学的染色、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット、免疫沈降反 応、ウェスタンブロット、遺伝子産物の活性についての機能的アッセイ、燐酸化 パターンについてのアッセイおよび蛋白短縮テストから成る群から選ばれるアッ セイを用いて、ＰＰ２Ｃα遺伝子産物（多形性およびそのペプチドフラグメント を含む）について標本をアッセイすることによって実施される。ｐｐ２ｃαによ って脱燐酸化される標的蛋白は、異なるサイズ特性および異なる等電点を有し、 さらにまた機能（例えば他の蛋白、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび他の細胞成分と相互作 用するそれらの能力）における変化を有するであろう。 さらに、染色体異常がＰＰ２Ｃαの変化に付随する場合は、これらの異常は当 技術分野で既知の標準的方法を用いてスクリーニングされる。 本明細書の下記実施例で示すように、細胞自体における遺伝子産物の存在場所 と量の変化の他に、本発明の方法によって体液中の遺伝子産物がスクリーニング される。遺伝子機能における変化とともに体液中の遺伝子産物レベルは影響を受 け、例えば糖化またはシグナル配列が影響を受ける場合は細胞からより多くが遊 離されるであろう。不完全な蛋白フラグメントは翻訳の妨害から生じるかもしれ ない。不完全な蛋白フラグメントは続いて細胞から遊離されモニターされる。 さらに、本発明は、種々の組織で種々のサイズおよび／または機能を生じるｐ ｐ２ｃαのｍＲＮＡの互い違いにスプライスされた形態を見分け、さらに適切な 組織で互い違いにスプライスされた形態を見分けることができるようにアッセイ はデザインされる。 特定の体液中の遺伝子産物における変化を特定することによって腫瘍の起源／ 場所が示唆されるであろう。例えば、中枢神経系の腫瘍については、遺伝子産物 は脳脊髄液で見出されるであろう。同様に、他の腫瘍または疾患の場所によって どの体液をスクリーニングすべきかが決定されるであろうし、その逆も当業者の 知りえるところであろう。 本発明はまた、ｍＲＮＡレベルまたは遺伝子産物レベルのいずれかにおけるＰ Ｐ２Ｃα活性および／または変化を検出するキットを提供する。このキットは、 ＰＰ２ＣαのｍＲＮＡのための分子プローブ、およびこの分子プローブを検出し それによってｍＲＮＡを検出する手段を含む。また別には、またはその他に、こ のキットはＰＰ２Ｃα遺伝子産物を検出するプローブを含むことができる。一般 的に、この検出手段は、該遺伝子産物または天然の蛋白を模倣した物質に対して 強い特異性をもつ抗体で、これはＰＰ２Ｃα遺伝子産物に結合する。当技術分野 で既知の他の物質もまた用いることができる。この抗体は下記および実施例３で 述べるように作製できる。これは、ＰＰ２ＣαまたはＰＰ２Ｃβ遺伝子産物（そ の多形性を含む）およびこの抗体の結合を検出する検出手段を特異的に認識し、 それによって当該遺伝子産物の存在を示唆し、さらにそれらを互いに識別する。 適切な場合には、このキットはまた、ＰＰ２Ｃα遺伝子の機能における変化の 影響を受ける第二の遺伝子産物に対して誘導された抗体を含むことができる。 本発明は、患者から単離した標本中のＰＰ２Ｃβ遺伝子活性レベルの変化を正 常な患者と比較して検出することによって患者の癌を検出する方法を開示する。 本発明はまたＰＰ２Ｃβ活性を検出するキットを提供する。このキットは、Ｐ Ｐ２Ｃα、その多形性に対するｍＲＮＡのための分子プローブ、および該分子プ ローブを検出してそれによってｍＲＮＡもしくは抗体を検出する検出手段、また は本明細書で述べるように正常なコントロールを越える遺伝子産物のレベルの変 化を識別する他の手段を含む。 本発明は抗体（多クローン性または単クローン性抗体のいずれか）を提供し、 これは下記実施例３で述べるようにＰＰ２Ｃαによってコードされるポリペプチ ド／蛋白に特異的に結合する。本発明の抗体はＰＰ２ＣαおよびＰＰ２Ｃβの遺 伝子産物を識別する場合に用いられる。本発明は、組換えによって産生されたＰ Ｐ２Ｃα、NDDTDSASTD(配列番号：１)、YKNDDTDSTSTDDMW(配列番号：２)、組換 えによって産生されたｐｐ２ｃβおよびPNKDNDGGA(配列番号：３)に対して作製 した単クローン性および多クローン性抗体を提供する。 本発明はまた、単離および精製されたペプチドNDDTDSASTD(配列番号：１)、YK NDDTDSTSTDDMW(配列番号：２)およびPNKDNDGGA(配列番号：３)を提供する。これ らのペプチドは組換えによって製造することができる。 さらに本発明は、５’ＵＴＲの特定の構造またはＰＰ２Ｃαの発現制御に必要 なＲＮＡ−蛋白複合体を認識する抗体を提供する。特定のＲＮＡ構造を特異的に 認識する抗体もまた提供される。 一般に抗体の調製では、完全なｐｐ２ｃα蛋白またはそのペプチド配列のいず れか、さらにその多形性が抗原として用いられる。さらに抗イディオタイプ抗体 もこれら抗体に対して作製することができる。これら抗体は単クローン性抗体ま たは多クローン性抗体のいずれでもよい。便宜的には、これら抗体は該配列を基 にした合成ペプチドに対して作製してもよく、またはクローニング技術によって 組換えによって調製してもよい。また、天然の遺伝子産物および／またはその部 分を単離して免疫原として用いてもよい。そのような蛋白またはペプチドは、当 業者に周知の標準的抗体産生技術によって抗体を産生させるために用いることが できる。そのような標準的技術は、一般的には「抗体：実験室マニュアル」(Har low & Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press刊、Cold Spring Harbor，ニューヨーク(1988))に記載されている。 多クローン性抗体を製造するためには、該蛋白またはペプチドを用いて一般的 にはアジュバントとともに、必要があれば担体と結合させてホスト（例えばウサ ギまたはヤギ）を免疫する。該蛋白に対する抗体は血清から採集する。 単クローン性抗体の製造のためには、蛋白またはペプチドフラグメントによる 適切なドナー（一般にはマウス）の過剰免疫と脾臓の抗体産生細胞の単離を必要 とする。これらの細胞を不朽性を有する細胞（例えばミエローマ細胞）に融合さ せ、不朽性を有し所望の抗体を分泌する融合細胞ハイブリッドを提供する。続い て細胞を大量に培養し単クローン性抗体を培養液から使用のために採集する。 この抗体は固形支持体基質に結合させるか、または検出可能な部分とともに共 役させるか、または当技術分野で周知のように結合と共役の両方を実施すること ができる。（蛍光または酵素部分の共役に関する一般的な考察に関しては「免疫 化学の実際」(Johnstone & Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications刊、オックスフォード(1982)を参照されたい。)抗体の 固形支持体基質への結合もまた当技術分野で周知である。（一般的な考察のため には「抗体：実験室マニュアル」(Harlow & Lane，Antibodies:A Laboratory Ma nual，Cold Spring HarborLaboratory Press刊、Cold Spring Harbor，ニューヨ ーク(1988))を参照されたい。）本発明で意図される検出可能な部分には、蛍光 性、金属性、酵素性および放射能マーカー（例えばビオチン、金、フェリチン、 アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレア ーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、¹⁴Ｃおよび沃素付加）が含ま れるが、これらに限られるものではない。さらに、毒素も標的到達のために抗体 に結合させることができる。 本発明はまた、ヒトＰＰ２Ｃα遺伝子および多形性ＰＰ２Ｃα遺伝子のトラン スジェニック動物並びに細胞（細胞株）モデルさらにはノックアウトＰＰ２Ｃα モデルを提供する。これらのモデルは、当技術分野で既知の標準的方法および以 下の文献で説明された方法を用いて構築される：米国特許第5387742号、5360735 号、5347075号、5298422号、5288846号、5221778号、5175385号、5175384号、51 75383号、4736866号およびBurkr & Olson(1991); Capecchi(1989); Daviesら(19 92); Dickinsonら(1993); Huxleyら(1991); Jakobovitsら (1993); Lambら(1993); Rothstein(1991); Schedlら(1993); Straussら(1993)。 さらに特許出願WO94/23049号、WO93/14200号、WO94/06908号、WO94/28123号でも 情報が提供される。 本発明は、ＰＰ２Ｃα遺伝子およびその部分さらにその多形性配列の核酸配列 に機能的に連結された発現制御配列を含むベクターを提供する（下記実施例参照 ）。本発明はさらにこれらのベクターで形質転換される宿主細胞（適切な真核お よび原核細胞から選ばれる）を提供する。 これらベクターを、当技術分野で既知の種々の方法のいずれか１つを用いて細 胞または組織に導入することができる。そのような方法は一般に下の著書に記載 され（Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning :A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク(19 92);Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecul ar Biology)」John Wiley & Sons刊、バルチモア、ニューヨーク、メリーランド (1989);Changら、「身体の遺伝子治療(Somatic Gene THerapy)」、CRC Press刊 、Ann Arbor、ミシガン(1995); Vegaら、「遺伝子の標的到達(Gene Targeting) 」、CRC Press刊、Ann Arbor、ミシガン(1995)およびGilboaら(1986)）、例えば 安定的もしくは一過性核酸感染、リポフェクチン、電気的穿孔(electroporation )および組換えウイルスベクターによる感染を含む。感染による核酸の導入は他 の列記した方法を凌ぐいくつかの利点を提供する。より高い効率がそれらの感染 特性によって得られる。さらにまた、ウイルスは非常に特異化されており、典型 的には特定の細胞型で感染し増殖する。したがって、それらの天然の特異性は、 ベクターをin vivoで特定の細胞型、または組織もしくは細胞の混合培養に標的 到達させるために用いることができる。ウイルスベクターはまた、特定のレセプ ターまたはリガンドを用いて改変され（Solderling(1993)）、レセプター仲介事 象による標的特異性を変化させることができる。 より具体的には、そのようなベクターは既知であるか、または当業者には構築 可能であるが、該配列の所望の転写を達成させるために必要な全ての発現要素含 むべきである。ベクターは他の有利な特性（例えば種々の形態をもつ核酸の回収 系）もまた含むことができる。ファージミドは、それらがプラスミドとしてまた はバクテリオファージベクターとして用いることができるのでそのようなベクタ ーの利点の固有例である。他のベクターの例（下記実施例参照）には、例えばバ クテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、 ＤＮＡウイルス、コスミド、プラスミド、リポゾームおよび他の組換えベクター が含まれる。ベクターはまた、原核もしくは真核宿主系のいずれかで使用するた めの要素を含むことができる。当業者はどの宿主系が特定のベクターに適合する かを知るであろう。 また当技術分野で既知の組換えの方法を用いて標的核酸のセンス、アンチセン スまたはトリプレックス抑制を達成できる。例えば、アンチセンス核酸を含むベ クターを利用して、標的核酸の発現を減少させ、したがってその活性を減少させ るために蛋白またはアンチセンスメッセージを発現させることができる。さらに 、リボザイムを作出して遺伝子のｍＲＮＡの発現を“ノックアウト”するために 用いることができる(Cech(1986); Cech(1990; Hampelら(1993); Sullivan(1994) )。 リコンビナント配列を導入し発現させるＤＮＡウイルスベクターの具体例は、 アデノウイルス由来ベクターAdenoP53TKである。このベクターは、正または負の 選別でヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現させ、さらに 所望のリコンビナント配列のための発現カセットを発現させる。このベクターは 、アデノウイルスレセプターを有する細胞（上皮起源さらに他の起源の殆どの癌 を含む）に感染させるために用いることができる。このベクターさらに同様な所 望の機能を示す他のベクターを細胞の混合集団を処理するために用いることがで きる。これらの混合細胞集団には、例えばin vitroもしくはex vivo細胞培養、 組織またはヒト自体が含まれる。 このベクターには、その安全性を保証しおよび／またはその治療効果を高める さらなる特徴が付加される。そのような特徴には、例えば組換えウイルスに感染 した細胞に対して負の選別を実施するために用いることができるマーカーが含ま れる。そのような負の選別マーカーの例は、上記に述べたＴＫ遺伝子で、これは 抗生物質ガンシクロビルに対する感受性を付与する。負の選別はしたがって感染 を制御することができる手段である。なぜならば、それは抗生物質の添加によっ て自滅を誘発することができるからである。そのような防御によって、例えばウ イルスベクターまたはリコンビナント配列の変化型を産生する変異が生じた場合 に細胞の形質転換が生じないよう担保する。特定の細胞型に発現を限定させると いう特徴もまた包含させることができる。そのような特徴には、例えば所望の細 胞型に特異的なプロモータおよび調節要素が含まれる。 さらに、リコンビナントウイルスベクターは、例えば水平感染（lateralinfec tion)および標的到達特異性のような利点を提供するので所望の核酸のin vivo発 現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有で 、これはただ１つの感染細胞が多くの基本ウイルス粒子（ビリオン）の子孫を産 生しする過程で、このビリオンは発芽し近隣の細胞に感染する。その結果広い領 域が急速に感染するが、その大半は初めに元のウイルス粒子に感染していなかっ た。これは垂直型感染と対照的で、この垂直型感染では感染因子は娘ウイルスに よってのみ伝播される。水平に伝播されないウイルスベクターもまた作製するこ とができる。所望の目的が特定の遺伝子が局在する標的細胞集団にのみ導入する ことである場合は、この特徴は有用であろう。 上記のように、ウイルスは、多くの場合宿主の防御メカニズムを排除するため に進化してきた非常に特殊化された感染因子である。典型的には、ウイルスは特 定の細胞型に感染し増殖する。ウイルスベクターのこの標的特異性は、予め定め られた細胞型に特異的に標的到達するその天然の特異性を利用する。本発明の方 法で用いられるべきベクターは標的送達されるべき所望の細胞型に依存し、当業 者はそれを知ることができるであろう。例えば乳癌を処置する場合は、そのよう な上皮細胞に特異的なベクターが用いられるであろう。同様に、造血系の疾患ま たは病的状態を処置する場合は、血液細胞およびそれらの前駆細胞（好ましくは 造血細胞の特定の型）に特異的なウイルスベクターが用いられるであろう。 レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するように、またはただ１ 回の最初の感染のみが成立するように構築することができる。前者の場合には、 ウイルスゲノムは全ての必要な遺伝子、調節配列およびパッケージングシグナル を維持し、新しいウイルス蛋白およびＲＮＡを合成できるように改変される。こ れらの分子は一旦合成されると、宿主細胞は更なる感染ラウンドを成立させるこ とができる新しいウイルス粒子中にＲＮＡをパッケージする。ベクターのゲノム はまた所望のリコンビナント遺伝子をコードし発現するように操作される。非感 染性ウイルスベクターの場合には、ＲＮＡのウイルス粒子中への被包化(encapsu late)に必要なウイルスパッケージングシグナルを破壊するために、通常ベクタ ーゲノムを変異させる。そのようなシグナルがなければ、形成される全ての粒子 はゲノムを含まず、したがってその後の感染ラウンドを進行させることができな い。ベクターの具体的な型は目的とされる応用によって左右される。実際のベク ターは当技術分野で既知であり、容易に入手可能であるか、または当業者は周知 の方法で構築することができる。 リコンビナントベクターは、いくつかの方法で、さらに適切な医薬担体と組み 合わせて投与することができる。例えばウイルスベクターが用いられる場合は、 その方法によって標的特異性という利点を得ることができ、その結果疾患部位に 局所的に投与する必要がない。しかしながら、局所投与はより迅速でより効果的 な治療を提供することができる。また投与は、患者に例えば静脈内または皮下注 射することによって実施することができる。脊髄液へのウイルスベクターの注射 もまた投与態様の１つとして、特に神経退行性疾患の場合に用いることができる 。注射に続いて、ウイルスベクターは、感染のために適切な標的特異性をもつ宿 主細胞を認識するまで循環するであろう。 ＰＰ２Ｃαベクターのまた別の投与態様は、疾患部位もしくは病的状態部位に 局所的に直接接種することによるか、または腫瘍に栄養物を供給する脈管系に接 種することによるものであろう。局所投与は、希釈作用がなく、したがって標的 細胞の大半で発現させるために必要な用量がより少ないので有利である。さらに 、ベクターは接種領域の全ての細胞の感染に使われるので、他の投与形態で必要 な標的到達のための必要条件が局所接種では軽減される。接種領域内の特定の細 胞のサブセットでのみ発現が要求される場合には、所望の細胞サブセットに特異 的なプロモータおよび調節要素を用いてこのゴールを達成できる。そのような標 的到達処置を施されていないベクターは、例えばウイルスベクター、ウイルスゲ ノム、プラスミド、ファージミドなどである。核酸感染用担体（例えばリポゾー ム）もまた、接種領域内の受容細胞に上記の非ウイルス性ベクターを導入するた めに用いることができる。そのような核酸感染用担体は当業者には既知である。 好ましい実施態様では、改変ＡＡＶを基にしたウイルスベクターが用いられる 。ＡＡＶはヒトゲノム染色体１９ｑ１３．３に組み込まれることが示された。Ａ ＡＶゲノムのＰＰ２Ｃα調節領域への位置特異的態様での組み込みを可能にする ようにＡＡＶゲノムの改変が実施される（実施例７参照）。 本発明はさらに癌の治療方法を提供するが、これは、最初に癌のタイプおよび 癌を発現している細胞の型を決定し、続いて上記に述べたように特異的に癌細胞 に標的到達するベクターを調製する工程を含む。このベクターはＰＰ２Ｃαの発 現能力を制御するために調節要素を含む。このベクターを続いて患者に投与し、 さらにベクターの生物活性に影響を与えない医薬担体をベクターに包含させるこ とができる。また別には、アンチセンスベクターを調製し、ＰＰ２Ｃαの発現を 制御するために用いることができる。 ｐｐ２ｃは蛋白セリン／スレオニンホスファターゼである(Cohen(1989))。ｐ ｐ２ｃはマグネシウムを必要とし、ある種のホスファターゼ抑制物質(例えばオ カダイック酸(okadaic acid))に感受性をもたないのでホスファターゼの中で類 をみない(Cohen(1991))。このｐｐ２ｃ類は哺乳類組織の２つの細胞質同位酵素 から成り(McGowan & Cohen(1987))、酵母の少なくとも３つのｐｐ２ｃ様酵素が 同じ酵素的、生化学的特性を示す。この２つの哺乳類の同位酵素はモノマーであ るが、分子質量がわずかに異なり（４４ＫＤａおよび４２ＫＤａ）、ｐｐ２ｃα およびｐｐ２ｃβと称される。αおよびβアイソフォーム間には７０％相同性が 存在する。ｐｐ２ｃαのカルボキシ末端にはｐｐ２ｃβと異なる１５のアミノ酸 配列が存在する。ヒトではその配列はYKNDDTDSTSTDDMW(配列番号：２)である。 ｐｐ２ｃαおよび付加蛋白ＦｏｓＢおよびＥＲＣＣＩをコードする１０６ｋｂ のコスミドの配列が分析された(Martin-Gallardoら(1992))（GENBANK取得番号M8 9615）。さらに、ヒトのＰＰ２ＣαのｃＤＮＡ配列は分かっている（Mannら(199 2)）。しかしながらこのｃＤＮＡの５’ＵＴＲをゲノム配列を用いて整列(align ment)させる試みは成功しなかった。 上記の観察についての仮説をたてることができるが、しかし本発明はこの１つ の方式に限定されると考えるべきではない。出願人らは以下のように提唱する： ＵＴＲは大きなイントロンを有するいくつかの小さなエクソンから成り、ＰＰ２ ＣαおよびＦｏｓＢは共通の調節領域を有する（ＥＲＣＣＩはまたこの調節領域 を共有する）。また別には、ＰＰ２Ｃαは非常に大きな遺伝子で、さらに５’末 端および制御領域は１０６ｋｂのコスミドの５’に位置する領域のコスミド内に は存在しない。また別の選択肢として、コスミドから９ｋｂの領域はその高いＧ ／Ｃ含有量のために配列は調べられておらず、それは５’ＵＴＲ領域およびプロ モータを含んでいるかもしれない。 好ましい実施態様では、ＡＡＶウイルスおよび／またはＣＨＩＮＴまたはＰＰ ２Ｃαに関連する他の調節配列がベクターで、特に患者を治療するために使用さ れるもので用いられる。ＣＨＩＮＴは、９−３細胞のＡＡＶに再結合された細胞 性配列である。この配列は表５で説明される（int.li；配列番号：１９）。この ベクターはＰＰ２Ｃαの調節制御に組み込まれ、ＡＡＶが（それは腫瘍抑圧ウイ ルスであるので）それが組み込まれる細胞を変えるのと同じ方法でその発現を変 えることができる。したがってこれによって、細胞型、癌のタイプ、分化のステ ージおよび当業者に既知の他の因子に応じて、正常な細胞の増殖が回復するか、 または増殖が停止するか、または計画的細胞死（アポプトシス経路）の活性化が 生じる（Schlehofer(1994)）。 ＡＡＶおよび／またはＣＨＩＮＴまたはＰＰ２Ｃαの調節要素にはいくつかの 要素が存在し、これらは、以下の観察を利用してＰＰ２Ｃαの発現を制御するた めに用いることができる： １．ＰＰ２Ｃαは非常に長い５’および３’ＵＴＲを有する（それらはコード能 力よりも長い）。ＲＮＡの特異的な折り畳みおよび特定の蛋白セットとの相互作 用はその発現に劇的な影響を与えるかもしれない。ある段階では、異なる折り畳 み方式が存在するかもしれず、これら異なる蛋白はＲＮＡと相互作用してその発 現に変化を与えるかもしれない。 ２．組み込みに必要なＣＨＩＮＴ配列は非常に興味深いモチーフを有し、これら を位置特異的組み込みに用いることができるかもしれない。さらにまた、出願人 は、ＡＡＶ組み込みに隣接する特定のＡＡＶ配列はＤＮＡ増幅の抑圧をもたらす ということを示すデータを得ている。これらの配列は治療薬としてベクターに用 いることができ、サイレンサー（配列番号：１３）およびミニサイレンサー（配 列番号：１４）として下記で述べる。 本発明はさらに、ＡＡＶを基にしたベクターまたは、ＰＰ２Ｃαが不適切に活 性化されている細胞でのみ特異的に機能する他の癌治療用ベクターを用いること によって癌を治療する方法を提供する。このベクターは、当業者に既知の癌と診 断された患者に投与される。ある実施態様では、ＡＡＶベクター（または本明細 書で開示する他の調節因子）は、形質転換細胞で発現されるプロモータ(ｒｅｐ) の制御下にある。組み込まれたベクターは細胞内でＰＰ２Ｃαの発現を制御し、 実施例に示すように形質転換を逆行させるであろう。さらにこのベクターは既に 形質転換された細胞型に標的送達されるであろう。 さらに、ＰＰ２Ｃαの遺伝子産物は細胞表面で発現されるので、この遺伝子産 物に対して誘導された抗体はシグナル形質導入経路を介してこの遺伝子の発現を 活性化／不活化させることができる。したがって、抗体は、ＰＰ２Ｃα遺伝子の 再調節を必要とする患者を処置するために治療的に用いることができる。Ｆａｂ フラグメントを使用するか、さらに当技術分野で既知の他の手段によって患者へ の投与に際してこの抗体が望ましくない二次的作用を与えないように担保するこ とができる。また別には、ＰＰ２Ｃα遺伝子産物に特異的に結合することができ るリガンドまたは他の分子を用いてもよい。したがって本発明は、シグナル形質 導入を誘発してそれによって形質転換表現型を抑圧するために、細胞表面に発現 されたＰＰ２Ｃαの遺伝子産物に結合させる方法を提供する。 さらに、本発明は、ＰＰ２Ｃαの発現を制御することによって、ＰＰ２Ｃαの 発現変化による異常な燐酸化に起因する疾患を治療する方法を提供する。そのよ うな疾患は神経性のものでもよい。例えば、行動変化は異常な燐酸化と連動して いる。ブラウンら(Brownら(1996))が示したように、ｆｏｓＢの変異は行動変化 を生じる。下記で考察するように、ｆｏｓＢおよびＰＰ２Ｃαは１０６ｋＤコス ミドに存在する。それらの同時調節の可能性が示唆されている。したがって、Ｐ Ｐ２Ｃαの異常な発現は行動変化として発現されうる。さらに、心臓および腎臓 組織のＰＰ２Ｃα活性レベルは他の組織と較べて極めて高い。したがって、ＰＰ ２Ｃα活性の変化はこれらの組織で反映されるであろう。 本発明は、ＤＮＡポリメラーゼのαプリマーゼおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ のＰＰ２Ｃα遺伝子産物との結合および作用を妨害することによって遺伝子増幅 を抑圧する方法を提供する。これは、ＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼおよびＲ ＮＡポリメラーゼＩＩとＰＰ２Ｃα遺伝子産物との結合領域に特異的に標的到達 するアンチセンスベクターを調製し、実施例９で述べる観察に基づいてこのベク ターを細胞に送達させることによって実施される。出願人らの観察によれば、腫 瘍細胞ではｐｐ２ｃαはＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤドメインに結合する。 したがって、遺伝子増幅をもたらす結合を制御するために、結合に競合する手段 を介してＣＴＤドメインを有するペプチドの送達を利用することができる。 腫瘍抑圧におけるＡＡＶの役割を解明するために、ＡＡＶ／ｎｅｏウイルスＪ ＤＴ２７７をＳＶ４０形質転換チャイニーズハムスター（ＣＯ６０およびＯＤ４ 細胞）およびマウス乳癌細胞（ＤＡ３）に導入した。ＣＯ６０はＳＶ４０形質転 換チャイニーズハムスター胎児細胞株である（Lavi(1981)）。ＯＤ細胞株はチャ イニーズハムスター胎児細胞に複製開始点欠損ＳＶ４０ＤＮＡを核酸感染させて 樹立された（Lavi(1985)）。マウスＤＡ３細胞株はＢＡＬＢ／ｃマウスと同系の 乳癌に由来する(Sotomayorら(1991))。ＪＤＴ２７７ウイルスはＡＡＶ２ゲノム の一部分を含み、これはウイルスＲｅｐ蛋白、ＡＡＶ末端倒置リピート(termina l inverted repeat)（ＴＩＲ）および原核細胞ネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）（これはＧ４１８への耐性を付与する）をコードする。 このｎｅｏ遺伝子はヌクレオチド１８８２に挿入され、カルボキシ末端が切り縮 められたｒｅｐ蛋白を生じる。ｒｅｐ蛋白の短縮はＡＡＶ／ｎｅｏウイルスがア デノウイルス同時感染ヒト細胞で複製する能力に影響を与えない。 ただ１つのコロニーを単離し、Ｇ４１８の存在下での連続的継代によって増幅 させた。耐性細胞をＣＯ６０細胞に由来するものについては９−１から９−５と 、ＯＤ４細胞に由来するものについてはＡ２０−Ａ２９と称した。マウス細胞Ｄ Ａ３に由来する細胞株はＪ１−Ｊ１５と称した。 形質転換表現型の改変： ＡＡＶの組み込みに続いて、細胞はそれらの形質転換特性の幾つかを失った。 １．ＳＶ４０ＤＮＡ増幅の抑圧（実施例７） 腫瘍細胞の特徴はＤＮＡを増幅させる能力である。ＣＯ６０細胞は遺伝子増幅 を調べるモデル系として用いられ、ＳＶ４０の増幅は発癌物質による処理の結果 として細胞に導入することができる（Lavi(1981); Aladjem & Lavi(1992)）。Ａ ＡＶ／ｎｅｏウイルスの組み込みに続いて、細胞はＳＶ４０を増幅させることが できなくなった。ＣＯ６０細胞に由来するほとんどのＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株は、 親のＣＯ６０細胞とは対照的に発癌物質による処理に際してＳＶ４０を増幅させ る能力を失った(Tal Burstyn(1993))。ＯＤ４およびＣＯ６０細胞に由来するＡ ＡＶ／ｎｅｏ細胞の抽出物は、in vitroでＳＶ４０を増幅させる能力を失った(W inocourら(1992); Tal Burstyn(1993))。 ２．組み込みＳＶ４０を宿す細胞はＵＶまたはＭＮＮＧによる処理に極めて鋭敏 になった（Winocourら(1992)）。 ３．形質転換細胞は軟寒天中で増殖する能力（形質転換細胞に典型的な性質）を 失った。 ４．以下によって判定したとき細胞はアポプトシス表現型を示した： ａ）細胞サイクルは変化し、アポプトシス細胞はＡＡＶ／ｎｅｏ細胞に偶発的に 出現し、そのレベルはＤＮＡ損傷物質による処理に続いて高くなった（図１Ａ、 表３Ａおよび図１Ｂ、表３Ｂ）。 ｂ）クロマチンおよび細胞質の凝集と断片化。クロマチンの凝集と断片化は、ア クリジンオレンジによる染色でモニターした。エチジウムブロマイドではこれら の細胞は染色されなかった。 アクリジンオレンジは生細胞および死細胞の両方で取り込まれ蛍光性の緑色シ グナルを生じ、一方、エチジウムブロマイドは成育能力をもたない細胞によって のみ取り込まれて明るい赤色蛍光を生じる。この二重染色システムによって、生 細胞と死細胞、および膜統合性を失う前のアポプトシスが進行している細胞を区 別する手段が提供される。生細胞の正常な核またはアポプトシスの核は両方とも 蛍光性の明るい緑色である。極めて対照的に、死細胞の正常な核およびアポプト シスの核は蛍光性の明るい赤色である。 実質的な細胞の分画によって、アクリジンオレンジによる染色に際して凝集ク ロマチンを示すアポプトシスの核が示された。さらに、細胞は細胞質の強い収縮 を示した。しばしば核は破壊され多数の微細核になった。これらの細胞では膜の 統合性を失うことなくアポプトシスが進行した。ＥｔＢｒはこれらの細胞に浸透 せず、したがって細胞は依然として生きていた。処理（７．５μｇ／ｍ１ＭＮＮ Ｇ）ＣＯ６０およびコントロールＣＯ６０細胞での顕著に低い％と較べて、大量 の生きたアポプトシス核がＡＡＶ陽性処理細胞で認められた。同じ染色パターン がすべてのＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株で繰り返された。したがって、このアポプトシ ス表現型は全てのＡＡＶ／ｎｅｏ細胞に共通の特徴であった。 ｃ）染色体ＤＮＡの破壊。計画的細胞死はＤＮＡ断片化に付随していることが示 された。アポプトシスを検出するこのアプローチは、末端デオキシヌクレオチジ ルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のＤＮＡの３'-ＯＨ末端への特異的な結合（結 果としてポリデオキシヌクレオチドポリマーの合成をもたらす）に基づいている （Gavrieliら(1992)）。固定細胞にビオチニル付加デオキシウリジンを添加する ことによって、ＴＤＴを用いてＤＮＡ破壊部位にこれらヌクレオチドを取り込ま せた。シグナルは、蛍光顕微鏡による識別が可能なＦＩＴＣ−アビジン結合によ って増幅させた。全てのＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株で、出願人らはアポプトシス細胞 の典型的なクロマチンの分解と正比例する、他と明瞭に識別できる核染色パター ンを検出することができた。この反応は特異的であるので、アポプトシスの核の みが染色される。この技術の有効性を示す陽性コントロールとして、出願人らは ＤＮアーゼで処理したＣＯ６０の核を用いた。 Ｃ９−２およびＣ９−３（ＡＶＶ陽性クローン）は２．５μｇ／ｍｌのＭＮＮ Ｇ処理後４８時間で核に明るい蛍光を示し、一方、一切処理を行なわなかったコ ントロールは低いバックグラウンドの蛍光のみを示した。出願人らは、核が強い 蛍光をもつ多数の微細核に特徴的に分解するのを認めた。得られた蛍光は陽性コ ントロールと同様であった。 未処理のＡＡＶ／ｎｅｏ細胞およびコントロールおよび処理ＣＯ６０（７．５ μｇ／ｍｌのＭＮＮＧ）はいかなる蛍光の徴候も示さなかった。この核の分解パ ターンは検査した全てのＡＡＶ／ｎｅｏ細胞株（約２０）で出現したが、断片化 の程度は種々の細胞株で変動した。 予期しなかったことには、復帰細胞（Ｃ９−３−２およびＣ９−３−１２と称 する、これらはＧ４１８への耐性の消失を基に選別され、組み込まれたＡＡＶ配 列を失っていた(Burstyn(1993))は、２．５μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのＭ ＮＮＧによる処理の後なおそのアポプトシス表現型を維持していた。 ＦＡＣＳ、ギムザ染色、および高分子量の細胞性ＤＮＡからヌクレオソームＤ ＮＡフラグメントの電気泳動による分離によって実施した更なる分析もこれらの 結果を支持した。 ＡＡＶ／ｎｅｏ細胞の組み込まれたＡＡＶ（実施例６および７） チャイニーズハムスターＡ２０−Ａ２９、９−１から９−５およびマウスＤＡ ３誘導株に由来する細胞抽出物をｒｅｐ蛋白の発現について抗Ｒｅｐ抗体を用い て免疫ブロッティングで分析したところ、全ての細胞株で真正のＲｅｐ生成物は 存在しないことが明らかになった。いくつかの細胞株では、短い蛋白（おそらく 短縮蛋白）が抗Ｒｅｐ抗体と反応した（Winocourら(1992)）。 完全なｒｅｐプロモーター領域の存在についての殆どの細胞株のＰＣＲ分析に よって、ほとんどの細胞株ではＲｅｐ蛋白のプロモーター領域はＡＡＶ配列の欠 失、挿入および再編成の結果として再構成され、したがって真正のＲｅｐ蛋白の 発現が除去されたことが明らかになった。 出願人らは、ＣＯ６０細胞に由来する１つのチャイニーズハムスター細胞株の 分析に焦点を当てた（図３）。組み込まれたＡＡＶはこの細胞株では重複化を受 け、ＡＡＶを宿す染色体はＡＡＶを組み込む２つの領域を含む。このＡＡＶ重複 は、おそらくＡＡＶ組み込みに続いてチャイニーズハムスターゲノムで生じる大 きな再編成の結果生じたのであろう。in situハイブリダイゼーションでこれま で調べた全てのチャイニーズハムスター細胞株では、組み込まれたＡＡＶを宿す 染色体は改変され、典型的なチャイニーズハムスターの全ての染色体と多くの点 で異なっており、したがって染色体の同一性は確定できなかった。 ９−３について組み込まれたＡＡＶとそれと隣合う細胞性配列をファージにク ローニングした（図３）。図３に模式的に示したように、ウイルスゲノムはいく つかの変化を受けていた。ＡＡＶｐ５プロモーターに対して下流の配列は欠失し 、細胞性フラグメント“ＣＨＩＮＴ”によって置換されていた。さらに、ＡＡＶ ／ｎｅｏゲノムの５’部分の欠失および再編成が認められた。対照的に、Ｎｅｏ 遺伝子およびウイルスゲノムの３’末端をコードする領域は無傷のままであった 。（同様な変化が調べた全てのＡＡＶ／ｎｅｏチャイニーズハムスターおよびマ ウス細胞株で観察された。） “ＣＨＩＮＴ”配列は、種々のＡＡＶ／ｎｅｏチャイニーズハムスタークロー ンにおけるＡＡＶ組み込み部位を分析するためにプローブとして用いられた（図 ２）。いくつかのＡＡＶ／ｎｅｏクローンではこのフラグメント内にシフトがあ り、このフラグメントのサイズがＡＡＶ組み込みに際して変化したことを示唆し た。シフトしたバンドのいくつかはまたＡＡＶプローブとハイブリダイズし、Ａ ＡＶが実際この領域に組み込まれたことを示した。隣合う細胞性配列に由来する サブクローニングしたプラスミドpSL9-6から得たプローブ（図３）をマウスＤＡ ３ＡＡＶ／ｎｅｏ細胞とハイブリダイズさせたところ、殆どの事例でそれはＡＡ Ｖの組み込みに付随していた。これらの結果は、チャイニーズハムスターでのＡ ＡＶ組み込み部位はマウス細胞における組み込み部位と同様である可能性を示唆 している。 ジネティック・コンピュータ・グループ社(Genetic Computer Group Inc.)の ソフトを用いた配列比較によって、ＣＨＩＮＴ配列はヒト染色体１９ｑ１３．３ の配列と５８．３％相同であることが分かった。このヒトの配列は自動配列分析 を実施して調べられた１０６ｋｂのフラグメントの一部分である(Martin-Gallar doら(1992))（GENBANK取得番号：M89651）。ＣＨＩＮＴ配列との相同性が示され た領域は、ヒト型蛋白ホスファターゼ２Ｃ（ｐｐ２ｃα）をコードする遺伝子の 一部分であった。この遺伝子のｃＤＮＡ配列にしたがえば、ＣＨＩＮＴと相同な 正確な領域はＰＰ２Ｃαの５’ＵＴＲに対して上流に位置する（表５）(GENBANK 取得番号：ヒトＰＰ２Ｃα 87759、ウサギＰＰ２Ｃα S87757)。 ＰＰ２Ｃα用の２つのプライマー（プライマー１および４、下記方法の項参照 ）を用いることによって得られたＰＣＲフラグメントをプローブとして使用し、 ９−３のｃＤＮＡのＤＮＡを調べて、ＡＡＶ、ＣＨＩＮＴおよびＰＰ２Ｃαとハ イ ブリダイズするXbaIフラグメントを見つけ、さらにＣＯ６０のＤＮＡのＰＰ２Ｃ αおよびＣＨＩＮＴとハイブリダイズするEcoRIフラグメントを見出した。した がって、ＰＰ２Ｃαは実際ＣＯ６０細胞のＣＨＩＮＴの極めて近傍に位置してお り、９−３細胞の組み込み部位に存在する。in situハイブリダイゼーションに よってこの結論は確認された（図４Ａ）。 チャイニーズハムスター（ＣＯ６０およびＯＤ４）およびマウス細胞(ＤＡ３) の両方で、ＰＰ２Ｃα配列の一部分は、ＡＡＶ組み込み部位のラムダクローンに 由来するpSL9-6（図３）に存在するＣＨＩＮＴハムスター配列に隣接していた。 したがって、正常なチャイニーズハムスターおよびマウス染色体でＰＰ２Ｃαは 実際、組み込まれたＡＡＶの周辺の配列から４ｋｂ未満の極めて近傍に位置する （図４Ｂ）。 さらに、組み込まれたＡＡＶゲノムを宿すマウスのＤＡ３細胞では、ＡＡＶ配 列はＰＰ２Ｃαに付随しているか、またはフラグメント６またはその両方に付随 していた（図５）。組み込まれたＡＡＶをＤＡ３Ｊ７（λＤＡ３７Ａ）からクロ ーニングし、図に示すようにファージの部品の配列を分析した。相同性がλSL9- 1プラスミド（図３）中の組み込まれたＡＡＶ内の領域に対して、さらにコスミ ドＭＭＤＡ（取得番号M63796）の２３４６７−２３７１５位のヒト染色体１９ｑ １３．３に対して見出された。コスミドＭＭＤＡは自動配列分析され、図３に示 すように、３５−３．ｓｅｇおよび３５−Ｔ７と同様にＭＭＤＢＣ(GenBank取得 番号M89657)の５９７７０位にＰＰ３Ｃαの最初のコードエクソンをに含んでい た。ＭＭＤＡおよびＭＭＤＢＣは同じ接触状態(contig)を有する２つのコスミド である（より詳細な配列は下記実施例１０に記載されている）。 ＰＰ２Ｃαが特異的な抑制物質を欠いているという主たる理由のために、ＰＰ ２Ｃαの細胞内での役割またはその天然の基質についてはほとんど分かっていな い。Schizosaccharomyces pombeでは、ｐｐ２ｃα様酵素は、熱ショック反応に 関して、さらに浸透圧調節において重要であることが示された（Shiozaki(1995) ; Shiozaki(1994)）。Saccharomyces cerevisiaeでは、ｐｐ２ｃ様活性はｔＲ ＮＡスプライシングと細胞分離の調節に関連していた（Robinsonら(1994)）。神 経細胞ではｐｐ２ｃαは、Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存蛋白キナーゼＩＩの Ｃａ²⁺非依存性活性の調節で役割を有するかもしれない（Fukugana(1993)）。そ れ以外にはｐｐ２ｃαについての情報はほとんどない。 ｐｐ２ｃαは細胞マーカーそれ自体かもしれない。従来技術は腫瘍細胞におけ るｐｐ２ｃαの発現に関する情報を提供していない。ｐｐ２ｃαは筋原性分化時 に役割を果たすかもしれないということを示唆する文献がある(Ohishi(1992))。 他の転写因子にも出現する１０アミノ酸のモチーフの存在を基にしてｐｐ２ｃα は転写因子のように機能するかもしれないし、特定の増殖条件下の細胞および組 織で転写を調節するかもしれない。したがってそれは、主要な転写因子であるＥ ２Ｆのように機能し、さらに不適切に発現されるときはオンコジーンとしてまた は腫瘍サプレッサー因子として作用することができる（Weinberg(1996)）。 予期せぬことながら、ＡＡＶ／ｎｅｏ細胞のＰＰ２ＣαのｍＲＮＡの分析によ って、この遺伝子の転写は、ＤＮＡ損傷薬剤による処理に続いてＰＰ２Ｃαが誘 発される親のＳＶ４０形質転換細胞と比較してＤＮＡ損傷薬剤による処理に際し て減少することが示された（図６）。 以下はハイブリダイゼーションシグナルのデンシトメトリー分析である。 Ｃ９−３におけるＰＰ２Ｃαの転写は、ＭＮＮＧ処理に続いてＰＰ２Ｃαが誘 発される親のＳＶ４０形質転換細胞と比較してＭＮＮＧによる処理に際して減少 した。 ｐｐ２ｃαをコードする完全なｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリー（M．Oren(We izmann Institute of Science，Rehovot)提供）からクローニングし、ＰＰ２Ｃ αクローンをＡＡＶ組み込みに続いて形質転換表現型を失ったＡＡＶ／ｎｅｏ細 胞に安定的に導入した。ＰＰ２Ｃαｎｅｏ細胞ではＰＰ２Ｃαクローンの発現に 続いて形質転換の特徴は救出され、細胞は形質転換細胞の特性を取り戻して軟寒 天で増殖し、さらにそのアポプトシス表現型を喪失したが増殖すること はできなかった。非関連遺伝子の短縮ｃＤＮＡを含むコントロールプラスミドを 同じ効率で核酸感染させた同じ細胞では軟寒天で増殖する能力は回復しなかった 。 これらの実験から、ＰＰ２Ｃαは形質転換細胞の開始および／または維持にお いて中心的役割を有することが明らかである。細胞は軟寒天で増殖するが、生細 胞を単離することはできなかったということは留意されるべきである。このこと は、細胞の不均衡な発現は異常増殖と細胞死をもたらすことを示唆している。 ＰＰ２Ｃαは発生において重要であるらしい。進化を通して遺伝子および蛋白 質の高度な保存性、特異的な制御シグナル（５’ＵＴＲにおけるＩＲＥＳ(inter nal ribosome entry saite)を含む）はこのことを支持する。ＡＡＶ感染は腫瘍 細胞に特異的に影響を与えるという他の研究室による発見には２つの説明が可能 である。１）このウイルスは正常な細胞に感染しないか、または特定の態様では それらのゲノムに組み込まれることはできない。２）別の選択肢としては、ＡＡ Ｖが正常な細胞のＰＰ２Ｃαに組み込まれるとしたら、この遺伝子の破壊はそれ らに影響を与えないか、または致死的でそのような細胞の生存を許容しないかも しれない。ＰＰ２Ｃαのただ１つの対立形質の不活化は形質転換表現型の変化の 原因であるという事実、および機能的ＰＰ２ＣαｃＤＮＡクローンの導入は形質 転換表現型を救出するという事実はＰＰ２Ｃαの重要性を示している。出願人は また、９−３に由来する高度に腫瘍誘発性チャイニーズハムスター細胞はＰＰ２ Ｃαを含む完全な染色体が３倍、４倍さらには５倍も重複化されていることを認 めた。 ヒトでは同じ染色体上のＰＰ２Ｃαの極めて近傍に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ） と呼ばれる重要な腫瘍特異的マーカー（これはほとんどの腫瘍細胞に出現する） が存在する。両方の遺伝子が染色体１９ｑ１３．３にマッピングされている。Ｃ ＥＡのようなマーカーをもつ細胞に治療を標的到達させることは役立つはずであ る。（ＣＥＡはそれだけでは癌と関連しないが、ＰＰ２Ｃαの発現強化に付随し ているか、またはこの染色体領域の重複化は両方の遺伝子を含む可能性があるか もしれない。） 上記の考察は、癌の検出と治療でＰＰ２Ｃを使用をするために実際的な基礎を 提供する。本発明でおよび本発明の利用に関して用いられる方法は、以下の非限 定的実施例および添付の図面によって示されるであろう。 実施例 方法 分子生物学における一般的方法 ： 当技術分野で既知の標準的分子生物学の技術で特別に記載されていないものは 以下の著書にしたがった：Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル (Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1992)およびAusubelら、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，バルチモア、メリーラ ンド(1984))。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般に「ＰＣＲプロトコル ：方法と応用の手引（PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications） 」（Academic Press刊、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)）にしたがって実 施した。 他の核酸技術を必要とする反応および操作は、特に記載がなければサンブルッ クら（「分子クローニング：実験室マニュアル」（Cold Spring Harbor Laborat ory刊(1989)が一般的に記載したように、さらに米国特許第4666828号、4683202 号、4801531号、5192659号および5272057号（これらは参照により本明細書に含 まれる）で説明された方法にしたがって実施した。抗体捕捉アッセイ： この方法の工程は以下のとおりである：（１）固相への抗原の結合；（２）該 抗原への抗体の結合；（３）該複合体への標識二次抗体の結合。出願人らは、ク ローニング時の単クローン性抗体の検出および定量に、並びに異なるウサギおよ び採血の多クローン性抗体の比較に、固相に一定量のｒｐｐ２ｃαを結合させる ことによってこの技術を用いた。このアッセイはまた組織および細胞培養の粗抽 出物中のｐｐ２ｃαを検出するために用いられた。免疫ブロット： この方法の工程は以下のとおりである：（１）抗原サンプル（組織抽出物、細 胞培養抽出物またはｒｐｐ２ｃα調製物）の調製；（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでサ ンプルを個々の成分に解離；（３）該解離蛋白のニトロセルロース膜への移転； （４）膜上の非特異的部位の封鎖；（５）多クローン性または単クローン性抗体 とともに保温；および（６）標識二次抗体による検出。出願人らは、本明細書で 述べる抗体の性状分析のために、さらに細胞および組織抽出物中のｐｐ２ｃαの 検出のために免疫ブロッティングを用いた(Harlow & Lane)。免疫沈降反応： この方法の工程は以下のとおりである：（１）単クローン性抗体の固相マトリ ックス（抗マウスＩｇＧ共役アガロース）への固定；（２）固定抗体への抗原の 結合；（３）結合蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで個々の成分に解離；および（４）免 疫ブロッティングおよびアフィニティー精製ウサギ多クローン性抗体による抗原 の検出。この方法は、発見した種々のサイズのｐｐ２ｃαおよびβポリペプチド の量および分子質量を概算するために用いられた。ｐｐ２ｃα活性のアッセイ： ＰＰ２Ｃα遺伝子産物は一般的な方法でマウス細胞から精製され、その活性は 〔³²Ｐ〕カゼインを脱燐酸化させる能力によってアッセイされる(McGowan & Coh en(1988))。逆ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー： ｃＤＮＡ特異的プライマーを逆転写およびＰＣＲに用いた。これらのプライマ ーはGeneral Biotechnology(Rehovot)から購入し、それ以上精製することなく使 用した。このプライマーの位置はタムラら（Tamuraら(1989)）によって報告され たＰＰ２ＣαｃＤＮＡのラット腎ヌクレオチド配列(Genbank取得番号、Gb＿ro:R atpp2c，J04503）にしたがう。 各プライマーのＰＰ２ＣαｃＤＮＡ上のおおよその位置は以下のとおりである： プライマー＃１：5'-AGGATCAAGTCATAATGGGA-3'（７４−９３ヌクレオチド、セン ス）（配列番号：４） プライマー＃4：5'-GCTGGAGTCTGATTTACAAC-3’（１４５４−１４７３ヌクレオチ ド、アンチセンス）（配列番号：５）アンチセンスＲＮＡ： ＰＰ２Ｃα遺伝子に相補的な人工的アンチセンスＲＮＡを合成し、イノウエの 方法(Inoue(1988))でマウス細胞に核酸感染させる。弁別的表示による遺伝子発現における固有の変化の特定： ＡＡＶ組み込みによって仲介される細胞性遺伝子の発現の変化を検出するため に弁別的表示法を用いる（Liang & Pardee(1992);McClelliandら(1995)）。この 方法は、一対の哺乳類の細胞集団（例えば感染および非感染細胞）の約１５００ ０種の個々のｍＲＮＡ間で弁別的に発現される遺伝子の特定、並びにそれらのｃ ＤＮＡおよびゲノムクローンの回収を目的とする。この方法の手順は以下の工程 から成る：（１）アンカー付加プライマー一式を用いて分画の逆転写、（２）任 意のプライマーおよびアンカー付加プライマー一式を用いて標識ＰＣＲによる各 分画の増幅、（３）得られたフラグメントの配列分析ゲルでの電気泳動分離、（ ４）２つの状況（クローニングと配列分析）で異なるフラグメントの増幅、およ び（５）それぞれ別個のＲＮＡ分析技術による弁別的発現の確認。 より具体的には、全ＲＮＡをSambrookらの記載にしたがって細胞から単離する 。ポリＡテールの５’境界に結合するようにデザインしたオリゴｄＴプライマー を用いて前記ＲＮＡを逆転写する。オリゴｄＴプライマーおよび配列が任意の第 二の１０塩基を用いてＰＣＲ反応でこのｃＤＮＡを増幅する。〔³⁵Ｓ〕−ｄＡＴ Ｐの存在下でＰＣＲを４０サイクル以下の条件下で実施する：９４℃で３０秒、 ４２℃で６０秒および７２℃で３０秒。増幅したｃＤＮＡを６％配列分析ゲルで 分離し、続いてＸ線フィルムに感光させる。 問題のバンド（弁別的に表示されるバンド）をゲルから切り出し、最初のＰＣ Ｒ生成物を作製するために用いたものと同じプライマーを用いて再増幅させる。 個々の候補バンドの弁別的調節を確認するために、ノザンブロットハイブリダイ ゼーションを実施する。問題のフラグメントをＴＡクローニングキットを用いて クローニングし配列を分析する。この方法で検出される遺伝子を適切な細胞から 得たノザンブロットとハイブリダイズする。水平感染のクロマチン構造 ： クロマチンの高次構造は細胞性遺伝子の転写に影響を与えるかもしれない。Ｄ ＮアーゼＩまたはミクロコッカスのヌクレアーゼによる消化に対する感受性の増 加で判断すると、転写活性を有するクロマチン領域は、転写的に不活性な遺伝子 を含むクロマチンよりもよりルーズにパックされている。クロマチンを部分的 に精製し、ミクロコッカスヌクレアーゼで消化する（Rothら(1990)）。精製ＤＮ Ａフラグメントを固有の制限酵素で消化し、一端がミクロコッカスヌクレアーゼ によって規定され、他端が制限酵素によって規定される一連のフラグメントを作 製する。フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースフ ィルターに移し、標識ＤＮＡフラグメントをプローブとして調べる。裸出ＤＮＡ を精製し同様に処理する。ヌクレオソームの位置およびヌクレアーゼ感受性領域 は裸出ＤＮＡとクロマチンから得たフラグメントの比較によって推論される。 遺伝子のメチル化の状態によってクロマチンの変化が示唆される。遺伝子特異 的ＤＮＡメチル化はメチル化アッセイによって測定される(Kafriら(1992))。こ の方法では、全細胞性ＤＮＡをメチル感受性酵素（例えばHpaIIまたはHpaI）で 消化し、これらの部位を含む特定のＤＮＡフラグメントを隣接オリゴヌクレオチ ドプライマーで増幅する。特定の部位がメチル化されている場合、増幅は正常に 進行する。他方、メチル化されていない部位が存在する場合はフラグメントは消 化され目に見える増幅生成物は得られない。目盛り付けが適切な場合、このアッ セイは広範囲のＤＮＡ濃度にわたって直線的で、特定部位のＤＮＡメチル化の程 度を正確に測定するために用いることができる。 実施例１ ＡＡＶに関する実験例 Ａ．ＡＡＶによるマウス細胞の感染 ： Ａ１．ＡＡＶが安定に組み込まれたマウス細胞の作製： 文献の方法（Winocourら(1992)）をわずかに改変してJDT277 AVV/neoハイブリ ッドウイルスをＤＡ３細胞に感染させた。単一コロニーを単離し、抗生物質Ｇ４ １８の存在下で連続継代によって増幅した。耐性細胞株はＤＡ３Ｊと称した。 ＤＡ３細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスと同系のＤ１−ＤＭＢＡ−３in vivo乳 癌由来であった。ＤＡ３細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでその親細胞と同じ増殖 動態を有する腫瘍をつくり、さらにその表面に親腫瘍と同じ腫瘍関連抗原(Ａｇ) を発現する。この細胞は腫瘍細胞の特定のマーカーを発現し、正常な乳房細胞に 典型的な特定Ａｇの発現を停止する(Sotomayorら(1991))。 マウス細胞に対するＡＡＶの影響を評価するために、ＤＡ３細胞にJDT277 AVV /neoハイブリッドウイルスを感染させた（Tratschin(19985)）。ＪＤＴ２７７は ＡＡＶゲノムの一部分を含み、この部分はＲｅｐタンパク、ＡＡＶ末端倒置リピ ート（ＴＩＲ）およびＧ４１８耐性を付与する原核細胞ネオマイシンホスホトラ ンスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）を含む。ｎｅｏ遺伝子はヌクレオチド１８８２ に挿入され、カルボキシ末端が切り縮められたＲｅｐ蛋白を生じた。Ｒｅｐ蛋白 の短縮は、ＡＡＶ／ｎｅｏウイルスがアデノウイルス同時感染ヒト細胞で複製す る能力に影響を与えない。 単一コロニーを単離し、Ｇ４１８の存在下で連続継代によって増幅させた。耐 性細胞をＤＡ３５と称した。 Ａ２．ＤＡ３Ｊ細胞でのＡＡＶゲノムの性状分析： ａ．サザン分析 ＤＡ３Ｊ１−ＤＡ３Ｊ７クローンから単離したゲノムＤＮＡを異なる制限酵素 (BglIIまたはEcoRI)で消化し、電気泳動して放射能標識ＡＡＶＤＮＡとハイブリ ダイズさせた。ハイブリダイゼーションパターンは各クローンで異なっていたが 、これはおそらくＡＡＶゲノムの再編成のためであろう。実際、ＡＡＶＤＮＡの 組み込みはしばしばウイルス配列内の改変を伴うことが知られている(Walz & Sc hlehofer(1992))。 ｂ．ＰＣＲ分析 ｒｅｐプロモータおよびＯＲＦ’ｓがＤＡ３Ｊ細胞株に存在するか否かを知る ために、ＡＡＶおよびｎｅｏ配列と相補的な異なるオリゴヌクレオチドプライマ ーを用いてＰＣＲ反応を１３クローン（ＤＡ３Ｊ１−ＤＡ３Ｊ１３）について実 施した。その結果、各クローンのウイルス配列の部品はいくぶん乱されているこ とが明らかにされた。調べた全ての細胞株で、ＡＡＶｒｅｐＯＲＦ’ｓは無傷で はなく、したがってＡＡＶ特異的蛋白の発現は損なわれた。 ２つのクローン（ＤＡ３Ｊ３およびＤＡ３Ｊ４）では、２つのＡＡＶ分子が頭 部が尾部に接続する（head-to-tail）パターンで宿主ゲノムに組み込まれた。こ の発見は、ＡＡＶＤＮＡはチャイニーズハムスター宿主ＤＮＡに（少なくともい くつかの事例では）、２つ以上のウイルスゲノムが（ウイルス分子の末端配列を 介して）頭部が尾部に接続したコンカテマーとして再結合されるということを示 した以前の実験と一致する(Cheungら(1980)；Walz & Schlehofer(1992))。ＤＡ ３Ｊ７由来の組み込まれたＡＡＶは、下記実施例７で述べたものと同様なアッセ イで２９３細胞でのＳＶ４０複製のためのサイレンサーとして機能した。 Ａ３．感染ＤＡ３Ｊ細胞でのＡＡＶ遺伝子の発現： 文献（Winocourら(1992)）にしたがって感染ＤＡ３から細胞抽出物を調製した 。 抽出物から得たサンプルを１２％ＰＡＧＥで電気泳動し、抗ｒｅｐ抗体で免疫ブ ロットを実施した。その結果、２つの主要なｒｅｐ蛋白（Ｒｅｐ７８およびＲｅ ｐ６８）はいずれの感染細胞でも発現されないが、小さなＲｅｐ蛋白の１つ（Ｒ ｅｐ４０）が２つのクローン（ＤＡ３Ｊ１１およびＤＡ３Ｊ１３）で発現される ことが示された。これらの結果はＰＣＲ分析結果からも予期された。この分析で は、調べた全ての細胞株でｒｅｐＯＲＦ’ｓは無傷ではなかった。Ｂ．位置特異的組み込み： Ｂ１．チャイニーズハムスター細胞のＡＡＶ組み込み部位とマウス細胞のＡ ＡＶ組み込み部位の比較： 親のＤＡ３およびＤＡＪ３クローン（ＤＡ３Ｊ１−ＤＡ３Ｊ７）のゲノムＤＮ ＡをBglIIまたはEcoRIで消化した。電気泳動に続いて、ブロットをウイルス／細 胞結合部の細胞性配列（Ｃ９−３（psL9-6）から単離）で一度ハイブリダイズさ せ、さらに放射能標識ＡＡＶＤＮＡで一度ハイブリダイズさせた。３つの細胞株 で（ＤＡ３ＪＡ、ＤＡ３Ｊ４およびＤＡ３Ｊ６）、細胞性プローブおよびＡＡＶ プローブは共通のバンドにハイブリダイズした。ＰＰ２Ｃαプローブを用いて、 出願人らは、ＡＡＶおよびＰＰ２Ｃαは両方とも同じバンドにハイブリダイズす ることをBglII消化ＤＮＡで見出した。したがって、チャイニーズハムスターお よびマウスの両方で、ＡＡＶは常にＰＰ２Ｃαの近傍の同じ部位に組み込まれた 。親のＤＡ３細胞を含む全ての細胞株で、ＰＰ２Ｃαおよび細胞性クローン６プ ローブは、前組み込み部位である同じバンドとハイブリダイズしたことは注目さ れるべきである。Ｃ．細胞表現型に対するＡＡＶの作用： ＤＡ３感染細胞および親細胞間で以下の細胞学的特性を比較した： ａ．播種効率 表１に示すように、ＤＡ３Ｊ細胞の播種効率(plating eficiency)は、親のＤ Ａ３細胞の播種効率と比べて１１％（ＤＡ３Ｊ２）から５４％（ＤＡ３Ｊ３）ま で減少した。 ｂ．ＵＶ照射の感受性 表２に示すように、ＤＡ３Ｊ細胞は親のＤＡ３細胞と比べてＵＶ照射の感受性 の増加を示す。ＤＡ３細胞と比べてＤＡ３Ｊ細胞の生存率は５％から５５％減少 する。 これらの結果は、ＡＡＶ感染細胞（ＨｅＬａ、ＣＯ６０）は、非感染細胞と比 べて播種効率の減少およびＵＶ照射に対する感受性の増加を示すという他の実験 と一致する(Walz & Schlehofer(1992))。 ＤＡ３Ｊ３はもっとも低い播種効率と最も高いＵＶ照射感受性をを示すという ことは興味深いことである。これは、ＤＡ３Ｊ３は２つの組み込みＡＡＶ分子を 含み、一方ＤＡ３Ｊ１およびＤＡ３Ｊ２はただ１つしか含まないという事実によ るのかもしれない。 ｃ．ＦＡＣＳ分析 文献（Vindelovら(1983)）の記載にしたがってＤＡ３、ＤＡ３Ｊ１、ＤＡ３Ｊ ２およびＤＡ３Ｊ３でＦＡＣＳ分析を実施した。この方法では、親のＤＡ３細胞 とＤＡ３Ｊ細胞との間に顕著な変化は認められなかった。 実施例２ ＰＰ２Ｃαのクローニングと発現 ＰＰ２ＣαｃＤＮＡの完全な長さのコード領域をラットのｃＤＮＡライブラリ ーから単離した。このｃＤＮＡを発現ベクターpET-17b(pET系、Novagen)のKpn1 およびNot1制限部位の間でクローニングした。この発現プラスミドで形質転換し た大腸菌細胞（BL21-DE3）は、ＳＤＳ−ＰＳＧＥの非常に強い〜４５ｋＤａのバ ンドで認められるように高レベルの組換えｐｐ２ｃα（ｒｐｐ２ｃα）を産出し た。ｐｐ２ｃα活性のアッセイ： 蛋白ホスファターゼ活性は、マックゴーワンとコーエンの方法(McGowan & Cohen，Methods Enzymol．159:416-429(1988))で測定したとき組換えプラスミド を宿す培養の粗抽出物で認められた。ｒｐｐ２ｃαの精製： アンピシリン含有ＬＢ培地で培養を一晩増殖させた。細胞を採集し音波破砕に よって破壊した。遠心沈殿によって清澄にした音波破砕物を、硫安沈澱およびＤ ＥＡＥセファデックスでの陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製 した。 実施例３ 抗体の製造と分析 ウサギでの多クローン性抗体の調製： 〜２５０−５００μｇのｒｐｐ２ｃαを含む粗細胞抽出物を１２％の調製用Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ（２００×１５０×１．５ｍｍ）で分離した。ｒｐｐ２ｃαバン ド（側片染色によって位置を決定）を切り出して−２０℃で貯蔵した。ウサギに 注射するために繰り返し１８ゲージの注射針に通し、等しい容積のフロイント（ Freund）のアジュバントと混合した。１つのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドから出発し た４ｍｌの乳濁液を用いて２匹のウサギを免疫した。予め採血したウサギの皮下 に４週間間隔で注射した。一次免疫のためにはフロイントの完全アジュバントを 用い、他の全ての注射はフロイントの不完全アジュバントを用いた。動物から２ 週間毎に採血し、遠心沈澱によって血清を清澄にした。抗体は３５１と３４３と 称した。特に記載しないかぎり、本明細書で述べる実験には３５１を使用した。単クローン性抗体の調製： 本明細書で述べるマウスハイブリドーマによる単クローン性抗体の調製には精 製ｒｐｐ２ｃαを用いた。ハイブリドーマコロニーは、抗体捕捉アッセイ（下記 参照）および細胞の免疫蛍光染色によってスクリーニング化た。陽性クローンの クローニングとスクリーニングを同じ方法で２回繰り返した。最後に８つの陽性 クローンを更なる実験のために選択した。これらのクローンの抗体は組織培養上 清として、また腹水として採集した。 ｐｐ２ｃαおよびｐｐ２ｃβに対して作製した抗体 （１）ウサギ多クローン性抗体（８０１と称する）をカルボキシ末端ペプチド （１０アミノ酸）に対して作製した。この抗体はｐｐ２ｃαを認識するがｐｐ２ ｃβは認識しない。 抗体はウサギで作製し、ｒｐｐ２ｃαに対してアフィニティー精製した。ほと んどの組織化学的分析にはこの抗体を用いた。 PNKDNDGGA(配列番号：３)(ｐｐ２ｃβのカルボキシ末端)に対してウサギの多 クローン性抗体を作製した。 （２）αおよびβの両方のエピトープを認識するｒｐｐ２ｃαに対するウサギ の多クローン性抗体（３５１と称する）を作製した。 （３）ｒｐｐ２ｃαに対して作製した８つのそれぞれ別個の単クローン性抗体 をスクリーニングし、ＥＬＩＳＡでのｒｐｐ２ｃαとの反応性によって、さらに ヘパトーマ細胞の免疫蛍光染色、ウェスタンブロッティングと免疫沈降反応によ ってｐｐ２ｃ（αおよびβまたはα）を認識する能力によって選別した。 表４は、抗体捕捉アッセイ、免疫ブロッティングおよび免疫沈降反応による８ 抗体の性状の分析を示す。これらのアッセイを組み合わせることによって、本発 明の適切な特異性を有する単クローン性抗体を単離することができる。 実施例４ 正常な乳房組織および乳房腫瘍でのｐｐ２ｃαの発現： 正常な乳房組織および乳癌から得たパラフィン包埋塊をｐｐ２ｃαに特異的な ８０１抗体で染色し、続いてペルオキシダーゼと共役させた二次抗体で染色した 。基質はＤＡＢであった。サンプルをメチレンブルーで対比染色した。幾つかの 実験では、用いた抗体はｐｐ２ｃαに特異的な単クローン性抗体２Ａ３であった 。倍率は×４００であった。正常な肝臓、ヘパトーマ組織および正常結腸および 結腸癌組織もまた調べた。 正常および過形成乳房サンプルでは核は抗体で極めて顕著に染色された。乳癌 では細胞質が顕著に染色された。侵襲性癌では抗ｐｐ２ｃαによる染色は認めら れなかった。興味深いことに肝の組織培養細胞では８０１または２Ａ３抗体で染 色したとき細胞表面が染色され、ＰＰ２Ｃα遺伝子産物は細胞膜で発現すること が示唆された。正常な肝臓細胞では、極めて強い細胞質染色がごくわずかの核領 域の非常に強い染色とともに認められた。ヘパトーマでは細胞質の染色はより淡 く核内の染色も弱かった。 細胞の外観が対比染色で悪性に進むにつれ、ｐｐ２ｃαが弁別的に消失するよ うにみえることは注目されるべきである。 実施例５ 正常な結腸直腸組織と結腸直腸癌におけるｐｐ２ｃαの発現： 正常な結腸組織と比べて結腸直腸癌組織で、さらに非許容性ＳＶ４０形質転換 チャイニーズハムスター細胞（ＣＯ６０）と比べてチャイニーズハムスター胎児 （ＣＨＥ）細胞株で、蛋白ホスファターゼ２Ｃα（ｐｐ２ｃα）の発現レベルを 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。 アンチセンスプライマーとして０．５ＭのオリゴｄＴ（１５塩基）の存在下で １μｇの全ＲＮＡサンプルを６５℃１０分間変性させ、直ちに氷上で冷却した。 以下を含む５０μｌの反応混合物中で３７℃で６０分後に第一の鎖のｃＤＮＡを 得た：０．２５ｍＭのｄＮＴＰ(Promega)、１０ｍＭのＤＴＴ、２０単位のＲＮ ａｓｉｎ、５０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素および５μｌの１０×反応緩衝液（ST RATAGENE）。９５℃で１０分不活化した後、得られたｃＤＮＡの３μｌを以下を 含む１００μｌのＰＣＲ反応物中で用いた：０．０２５ｍＭのｄＮＴＰ(PROMEGA )、１０ｍＭのＤＴＴ、２０単位のＲＮａｓｉｎ、５０単位のＭＭＬＶ逆転写酵 素および５μｌの１０×反応緩衝液（STRATAGENE）。 ９５℃で１０分不活化した後、得られたｃＤＮＡの３μｌを以下を含む１００ μｌのＰＣＲ反応物中で用いた：０．０２５ｍＭのｄＮＴＰ(PROMEGA)、０．５ μＭのＰＰ２Ｃαセンスプライマー、5'-GAAGTAGTCGACACCTGT-3'（配列番号：６ ）、０．５μＭのＰＰ２Ｃαアンチセンスプライマー5'-GCTGGAGTCTGATTTACAAC- 3'（配列番号：５）、１０×反応緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂および２．５ 単位のＡＢＴａｑポリメラーゼ（Advanced BioTechnology）。下記の条件でＰＣ Ｒを３５サイクル実施した：９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分、その 後で７２℃１０分。同じＰＣＲ反応混合物中でβ−アクチンプライマー、5'GTTT GAGACCTTCAACACCCC-3'（配列番号：７）および5'GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'（ 配列番号：８）の存在下で実施する平行ＰＣＲ反応のためには同じｃＤＮＡを鋳 型として用いた。標本を２０、２５、３０および３５サイクル後に採取し、ゲル 電 気泳動で分析した。結果 ＰＰ２Ｃα特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、予 期したサイズ（４８０ｂｐ）をもつＲＴ−ＰＣＲが作製された。このＲＴ−ＰＣ Ｒ反応によって、８サンプルのうち７サンプルでＰＰ２ＣαｍＲＮＡレベルは、 周辺の結腸癌組織で得られたレベルよりも正常な結腸組織で顕著に高いことが示 された（図７）。ＣＨＥ細胞株のＰＰ２Ｃα発現レベルはＣＯ６０細胞株の場合 よりも高かった。 実施例６ ベクターと該ベクターを宿す形質転換細胞の製造 誘発可能ｔｅｔプロモータ下のＰＰ２ＣαｍＲＮＡの発現： 文献(Gossen & Bujard(1992))に記載されたように、哺乳類細胞でのセンスお よびアンチセンスＰＰ２ＣαｍＲＮＡの発現はテトラサイクリン調節誘発可能遺 伝子発現のための系を基にしている。 この系は、テトラサイクリンリプレッサーを単純庖疹ウイルスＶＰ１６の活性 化ドメインに結合させるテトラサイクリン制御トランスアクチベーター(ｔＴＡ) 融合蛋白の構造的発現に依拠する。ｔＴＡはラットの線維芽細胞およびＨｅＬａ 細胞で構造的に発現された。これら２つの細胞株では、ｔＴＡはヒトサイトメガ ロウイルスプロモータに由来する最小のプロモータおよびテトラサイクリンオペ レータから転写を刺激する。テトラサイクリンの添加に際して、ｔＴＡによる転 写刺激は抑制される。 ＰＰ２ＣαｍＲＮＡをセンス方向およびアンチセンス方向でｔＴＡ依存プロモ ータの制御下に含む発現ベクターを２つの細胞株に安定的に核酸感染してクロー ンを調製した。発現ベクターの構築： 発現ベクターとして用いられるプラスミドの構築は以下の工程を含む： １．ラットＰＰ２ＣαｍＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントの調製； ２．ラットＰＰ２ＣαｃＤＮＡのｔＴＡ含有プラスミドでのクローニング； ３．制限マップ分析によるプラスミドの検証； ４．ＰＰ２ＣαｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列分析。ラットＰＰ２ＣαｍＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントの調製： ラットＰＰ２ＣαｍＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを温度周期式増幅 によって調製した。増幅反応用鋳型はプラスミドskPP2C（ＰＰ２ＣαｃＤＮＡが skBLUESCRIPTプラスミドにクローニングされている）の挿入物であった。 増幅反応に用いられた高い方のプライマーは、ラットＰＰ２Ｃαの最初の６ア ミノ酸（Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ；配列番号：９）を コードする配列を含む。高い方のプライマーの配列は以下のとおりである： 5'CGGGATCCGC ATGGGAGCAT TTTTAGAC 3'(配列番号：１０)。 増幅反応に用いられる低い方のプライマーは、ラットＰＰ２Ｃαの最後の５ア ミノ酸（Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、＊＊＊；配列番号：１１） と終止コドンを含む。低い方のプライマーの配列は以下のとおりである： 5'CGCGGATCCT TACCACATAT CATCAGT 3'（配列番号：１２）。 このＤＮＡフラグメントの末端は、両端にBamHI制限部位を導入することによ って改変された。ラットＰＰ２ＣαｃＤＮＡのｔＴＡ含有プラスミドでのクローニング： ラットＰＰ２ＣαｃＤＮＡの増幅に続いて、このＤＮＡフラグメントを制限酵 素BamHIで切断し、テトラサイクリン反応性プロモータの下流でプラスミドpUHD1 0-3(Gossen & Bujard(1992))でクローニングした。制限マップ分析によるプラスミドの検証： ｃＤＮＡ挿入物の該プロモータに対する方向性を制限マップ分析によって決定 した。センス方向（pYM001）およびアンチセンス方向（pYM002）でこのｃＤＮＡ を含むプラスミドを選別した（図９）。ＰＰ２ＣαｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列分析： プラスミドpYM001のＤＮＡ挿入物の配列を自動ＤＮＡ配列分析で決定した。配 列分析に用いたプライマーはクローニングに用いたものと同じであった。この分 析の結果によって、クローン化フラグメントの配列はラットＰＰ２Ｃαのそれと 同一で、増幅反応中に変異は導入されなかったことが示された。核酸感染： 構造的にｔＴＡを発現するラットの線維芽細胞およびＨｅＬａ細胞株に、プラ スミドpYM001およびpYM002をプラスミドpBSpacとのＣａＰＯ₄共沈によって導入 した。プラスミドpBSpacは、ピューロマイシン(puromycin)耐性を付与する遺伝 学的選別マーカーを含む。 核酸感染後２４から４８時間してから、細胞を１：１０で継代し選択培地で増 殖させた。ＨｅＬａおよびラット線維芽細胞株用の選択培地は、０．３μｇ／ｍ ｌおよび１μｇ／ｍｌのノイロマイシンをそれぞれ含んでいた。２から３週間後 にクローンを単離し、２４穴（ウェル）の培養プレートに互いに合流するまで増 殖させて１０ｃｍの培養皿に移し、７０−９０％合流度まで増殖させて９０％ウ シ胎児血清と１０％ＤＭＳＯ中で凍結した。これらのクローンではＴｅｔの除去 に続いて、pYM001を宿しているクローンではPP2CαｍＲＮＡの誘発を、さらにア ンチセンスプラスミドpYM002を宿すクローンではＰＰ２Ｃαの内在性ｍＲＮＡの 減少が認められた。 実施例７ ＰＰ２Ｃα発現調節における組み込みＡＡＶの役割 この実験は遺伝子内の正確なＡＡＶ組み込み部位を特定しなかった。さらに、 これらのデータはヒトの組み込み部位（これはまた同じ染色体領域１９ｑ１３． ３に位置するが、１０６ｋｂのコスミド内には位置しない）について正確な部位 を提供しなかった。出願人らは、ＲＮＡと特異的蛋白に関する結果に基づいて、 ＡＡＶ組み込み部位はｐｐ２ｃαをコードする遺伝子内か、またはなんらかの方 法でＰＰ２Ｃαに付随しているその調節領域のいずれかであるという仮説を提唱 する。例えば、ｒｅｐはｐｐ２ｃα蛋白およびｒｅｐ連結ＡＡＶゲノムと相互作 用するかもしれないし、ＰＰ２ＣαはＰＰ２Ｃαの調節領域に付随しているかも しれない。 安定な細胞株では、ＳＶ４０増幅は組換えＡＡＶ／ｎｅｏウイルスの感染によ って抑圧され、出願人らは、ｒｅｐの発現またはｒｅｐをコードする配列を検出 することができなかった。したがって出願人らは抑圧活性をもつ配列を検索した 。この配列は、チャイニーズハムスターであれマウス由来であれ、ＡＡＶを宿す 全ての細胞に存在していた。 組み込まれたＡＡＶ配列とＡＡＶゲノムを宿す細胞のＰＰ２Ｃα活性の調節と の間の機能的相関性は未だ明らかではないが、ＡＡＶ組み込みの結果、本明細書 で述べたように形質転換特性に変化が生じることは明らかである。 下記に述べる実験に基づいて、位置特異的組み込み（ＰＰ２Ｃαの近傍で生じ る）の他に、ＡＡＶ配列は形質転換表現型の変化に何らかの重要性を有する可能 性がありそうである。 ＳＶ４０形質転換チャイニーズハムスター細胞（株９−３および他の細胞株） における組み込みＡＡＶは発癌剤誘発ＳＶ４０増幅の抑圧を招く。ＳＶ４０増幅 抑圧に必要なこのウイルス性要素（サイレンサー、配列番号：１３）をＳＶ４０ 増幅の一過性アッセイ（Yangら(1995)）によって明らかにし、ＡＡＶｒｅｐ蛋白 がＳＶ４０増幅の抑圧に必要であることを示した。このアッセイは、Ｔ抗原のコ ード領域およびウイルスの複製開始点を含むＳＶ４０ベクターによるヒト腎細胞 株２９３の核酸感染、並びに９−３、ＳＶ４０形質転換チャイニーズハムスター 胎児細胞（組み込みＡＡＶを含む）およびＤＡ３５７（形質転換表現型がＡＡＶ 組み込みに続いて変化した組み込みＡＡＶを宿すマウス細胞株）中のＡＡＶ組み 込みの近傍に由来するいくつかの異なる構築物によるコトランスフェクションを 基にしている。 異なる構築物を用いて、出願人らは抑圧を付与する最小のＡＡＶ要素を明らか にすることに成功した。この要素はＡＡＶゲノムの６４ヌクレオチドで構成され る（ヌクレオチド１２５−１８９）。 ACTCCATCAC TAGGGGTTC TGGAGGGGTG GAGTCGTGAC GTGAATTACG TCATAGGGTT AGGG この要素はＳＶ４０サイレンサー（配列番号：１３）と称するが、また別の実 施例では２１ヌクレオチド、１２５−１４５（配列番号：１４）のみが必要であ る。 ２９３細胞のＳＶ４０ベクターの複製はメチル化されていないＤＮＡを生じ、 したがってDpnII（非メチル化ＤＮＡのみを切断する酵素）で切断される。DpnII 消化ＤＮＡをゲルで分離し、ブロッテイングしてＳＶ４０プローブとハイブリダ イズさせた。結果を図１２に示す。 ブロットは以下を提供する： レーン１：ｐＳＫ１およびｐＡＶ２（完全なＡＡＶゲノムを含みｒｅｐ蛋白を発 現させるプラスミド）との同時核酸感染。ＳＶ４０複製は抑圧されていることに 注目されたい。 レーン２：ＳＶ４０が複製するＳＶ４０プラスミドｐＳＫ１の核酸感染。ＳＶ４ ０の鋳型の複製が認められる。 レーン３：ｐＳＶＫ１とＡＡＶゲノムの１３８ｂｐを宿すプラスミドとの同時核 酸感染。この要素によるＳＶ４０複製の抑圧が認められる。 レーン４：ｐＳＶＫ１とｐＳＬ９−６(非ＡＡＶＤＮＡ配列)との同時核酸感染。 したがって２９３細胞のＳＶ４０複製はｒｅｐによって、さらにサイレンサー 要素によって抑圧される。 同様に、ＳＶ４０複製は、細胞にわずか１２５−１４５（ＳＶ４０ミニサイレ ンサー、ハイブリダイズ１４）を含むプラスミドを核酸感染させた場合にも抑圧 された。 ５’Ａ₁₂₄Ｃ₁₂₅ＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ₁₄₅ コントロール実験では出願人らは、組み込みＡＡＶから得た他の配列および組 み込みＡＡＶから広がる細胞性配列（例えばｐＳＬ９−６およびその他、図１２ のレーン４を参照）を核酸感染させたが、ＳＶ４０ＤＮＡ複製の抑圧は検出され なかった。 マウスＤＡ３Ｊ７細胞株の組み込みＡＡＶおよび隣接する細胞性配列を含むλ クローンを用いて、同様なＳＶ４０複製抑圧が認められた。このクローンはサイ レンサー領域を含む６４ヌクレオチドを含む。 ＳＶ４０複製の抑圧は、Ｒｅｐ発現によって、さらに６４ｂｐサイレンサー要 素によって一過性アッセイで得られるということに注目されたい。 組み込みＡＡＶを失った復帰変異体はＳＶ４０を増幅させる能力を再び獲得し た。復帰株の１つＣ９−３−２で、出願人らは、復帰変異体は組み込みＡＡＶを 含む完全な染色体を喪失していることを示した。出願人らは、これをＦＩＳＨ、 極めて特徴的な異常染色体（これにＡＡＶが組み込まれている）の消失によって 示した。 上記の観察についての以下のような仮説が可能であるが、しかしこの一態様に 本発明が制限されるものではない。出願人らは、Ｒｅｐ蛋白（Heilbronn，Schle hoferら(1983); Kleinschmidtら(1995); Yangら(1995)）およびサイレンサー要 素は同様な蛋白または要素（おそらくはＰＰ２Ｃα）と直接的にまたは間接的に 相互作用することによってＳＶ４０の複製を抑圧することができるという仮説を 提唱する。 ＡＡＶゲノムの２１ｂｐ（ミニサイレンサー）は、制御領域の相互作用および 活性化によって同様にＰＰ２Ｃα活性を調節することが可能である。また別には 、サイレンサーは、ＳＶ４０の複製に付随する蛋白と直接的におよび／または間 接的に相互作用する優性の負の要素として作用することができる。ＰＰ２Ｃは脱 燐酸化によってそのような蛋白の作用を調節することができる。そのような相互 作用の例はＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼであろう。ｒｅｐ蛋白はそのような 相互作用にもまた直接必要とされるという可能性も存在する。 脱燐酸化ＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼは、ＣＯ６０細胞の発癌剤誘発増幅 時にＳＶ４０ＤＮＡの複製を開始させるために必要なようである。さらにまた、 この燐酸化−脱燐酸化過程は細胞周期によって制御されるようである。したがっ て、ＰＰ２ＣαはＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼの活性を調節することができ 、ｒｅｐに直接または間接的に結合することによるＰＰ２Ｃαの枯渇は、ＤＮＡ ポリメラーゼαプリマーゼの異常な燐酸化およびＳＶ４０ＤＮＡ複製開始の失敗 をもたらすかもしれない。 実施例８ ４２ｋｄよりも大きなｐｐ２ｃα蛋白が存在する ｒｐｐ２ｃαに対して作製された種々の単クローン性抗体は肝臓抽出物を免疫 沈降させた（上記実施例３を参照）。沈降物を２つの標本に分け、１２％ＰＡＧ Ｅで分離しブロッティングした。免疫沈降物の各セットを以下の多クローン性抗 体で処理した： （１）３５１−これはαおよびβの両方を認識する。 （２）８０１−ｐｐ２ｃαに特異的。 抗体３５１で反応させたときは図１０に示すように、４０−４３ｋｄの位置に 移動するいくつかのバンドが検出された。単クローン性抗体９Ｆ１１、９Ｆ４お よび１Ｄ５は、２−３本の強いバンドと１−２本の微弱なバンドの極めて類似し た像を示した。単クローン性抗体２Ａ３は微弱なバンドのみを沈降させた。 ブロットの第二の部分をα特異的抗体８０１で反応させた。〜４０−４３ｋｄ の位置に４つの全ての単クローン性抗体で２本のバンドを認めることができた。 これらのバンドはおそらく単クローン性抗体２Ａ３で検出されたものである。し たがって、単クローン性抗体２Ａ３はｐｐ２ｃαに特異的である。 さらに、７５ｋｄおよび１５０ｋｄより大きい位置に移動するまた別の２本の バンドが検出された。これらの蛋白は肝臓では４０−４３ｋｄ蛋白よりも豊富で ある。８つの全ての単クローン性抗体がこれらの蛋白を認識し、８０１多クロー ン性抗体が同様に反応するので、これら２つの大型蛋白はｐｐ２ｃαといくつか のエピトープを共有することは明白であり、それらは同じ遺伝子の産物であるが 別のスプライシングによって生じることを示唆している。 免疫沈降物と反応させたとき、７５ｋｄ蛋白との弱い反応が多クローン性抗体 ３５１で検出される。しかしながら、全肝臓抽出物の直接免疫ブロッティングで は７５ｋｄは存在し、微弱な反応がより大きな分子量の蛋白に対して検出できる ように思えた。 また別のより大きな分子量のいくつかの蛋白が多クローン性抗体３５１でまた 検出された。これらの蛋白は多クローン性抗体８０１（ｐｐ２ｃα特異的）とは 反応しなかった。これらの結果は、αの他の形態が存在し、それら異なる分子量 をもつことを示唆している。 いくつかの組織に由来するｍＲＮＡのノザンブロット分析（図１３）によって 、ｐｐ２ｃαの５’ＵＴＲに由来するプローブ、または完全なＰＰ２ＣαｃＤＮ ＡプローブとハイブリダイズするいくつかのＲＮＡバンドが示された。このＲＮ Ａは種々の組織から抽出され、種々のサイズのＲＮＡがこれらの組織で出現した 。 実施例９ ｐｐ２ｃαはｍＲＮＡ合成を調節する 表６は、１０アミノ酸のカルボキシ末端ペプチド(NDDTDSASTD(配列番号：１)) について見出された蛋白またはＲＮＡ配列の相同性の要約である。このペプチド は上記で述べたように多クローン性抗体８０１の作製に用いられた。 ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシ細胞ドメイン（ＣＴＤ）をＧＳＴに融合 させ、セファロースグルタチオンビーズにこの融合複合体を結合させ、ＨｅＬａ 細胞抽出物と混合した。ＰＡＧＥとブロッティングの後で、ＲＮＡポリメラーゼ のカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）に結合した蛋白はｐｐ２ｃαにもまた結合 した。ブロッティングには８０１および２Ａ３の両方を用いた。結合したｐｐ２ ｃαのサイズは約４３ｋＤであった。したがって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩはｐ ｐ２ｃαと結合する。 第二の実験では腫瘍細胞（ヘパトーマ）およびＨｅＬＡの抽出物を上記のよう にアッセイした。腫瘍抽出物でのみＧＳＴ−ＣＴＤへの結合が認められたが、一 方、正常な肝細胞の細胞抽出物ではそのような活性は検出されなかった。 ポリメラーゼαＣＴＤドメインはＰＰ２Ｃαに対するその特性と同様なホスフ ァターゼによって脱燐酸化される（しかしＰＰ２Ｃαはそうではない）というこ とを示す実験(Chambers & Dahmus(1994))に基づいて、出願人らは、ｐｐ２ｃα はＲＮＡポリメラーゼＩＩを脱燐酸化し、したがって特定のメッセンジャーにつ いてｍＲＮＡの合成の開始を調節するという仮説を提唱する。このペプチドは、 他の因子によって促進される転写の制御および調節に用いることができる。 実施例１０ 更なる配列 ＡＡＶ組み込み部位を含む２つのλクローンを調製した。（１）１つはチャイ ニーズハムスター細胞ＣＯ６０に由来し、λＳＬ９−１と称する（図３に模式図 、配列番号：１５および１６）。部品は図３に示した配列である。更なる配列Ａ Ｎ８Ｔ７（配列番号：１８）はプラスミドｐＳＬ９−８に由来した（図３）。（ ２）第二のλファージは細胞株ＤＡ３Ｊ７からクローニングしたがマッピングは しなかった。部分をプラスミドでサブクローニングし、部品の配列を５ｈ−１で 説明したように分析した（配列番号：１７）。配列比較によって、５ｈ−１はＡ Ｎ８Ｔ７と相同であることが示された。この比較領域はまたコスミドＭＭＤＡ２ ３、４６７−２３７１５と相同であった。本出願を通して、種々の刊行物が引用 によって、さらに特許番号によって特許が参照されている。これら刊行物の完 全な引用は下記に示す。これら刊行物の完全な開示は、本発明が属する分野の状 態をより完全に説明するために参照により本明細書に含まれる。 本発明は説明的態様で記載してきた。さらにこれまで用いてきた用語は制限の ためではなくむしろ解説を目的とするものである。 上記の技術の範囲内で多くの改変および変形が明らかに可能である。したがっ て、添付の請求の範囲内で本発明は特に記載された以外に実施することが可能な ことは理解されよう。 ＤＡ₃、ＤＡ₃Ｊ₁、ＤＡ₃Ｊ₂およびＤＡ₃Ｊ₃細胞培養に由来するいくぶん合流 状態の細胞の２５０および５００細胞を９ｃｍのプラスチックペトリ皿に播種し た。続いて細胞を固定しギムザ染色した。２実験より増殖コロニーの平均数を求 めた。各実験は３例づつで実施した。 ＤＡ₃、ＤＡ₃Ｊ₁、ＤＡ₃Ｊ₂およびＤＡ₃Ｊ₃細胞培養から得たいくぶん合流状 態の細胞の２５０および５００細胞を９ｃｍのプラスチックペトリ皿に播種した 。４８時間後に培養にＵＶ光を照射し、続いて７日間保温した。増殖コロ ニーの平均数を求めた。各実験は３例づつで実施した。 （１）抗体捕捉アッセイは２つの抗原について実施した：精製ｒｐｐ２ｃ（抗ｐ ｐ２ｃ抗体の特定のため）、およびｐｐ２ｃ挿入物をもたないｐＥＴ発現ベクタ ーを含む細胞の蛋白抽出物（非特異的抗体の特定のため）。結果は＋または−で 示す。数値は最高の結果を与える抗体希釈である。 （２）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたｒｐｐ２ｃおよび肝抽出物の免疫ブロッ ティング。 （３）免疫沈降反応。単クローン性抗体を用いて肝抽出物の蛋白を沈降させた。 蛋白は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、アフィニティー精製ウサギ多クローン 性抗体８０１（α特異的）および３５１（ｐｐ２ｃαおよびｐｐ２ｃβを特定す る）で検出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 16/18 16/18 16/40 16/40 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者から単離された標本中のＰＰ２Ｃα遺伝子活性の変化を検出することに よって、患者の癌性細胞を検出する方法。 ２．該標本が、組織の生検および体液から成る群から選ばれる請求の範囲第１項 の方法。 ３．さらに 該変化が正常コントロールと比べてＰＰ２Ｃα遺伝子活性の減少で あるという特徴を有する請求の範囲第１項の方法。 ４．当該検出工程が、その多形性を含むＰＰ２ＣαＤＮＡに相補的なｍＲＮＡに ついて、in situハイブリダイゼーション、ノザンブロッティングおよび逆転写 酵素−ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選ばれるアッセイを用いて、該標本 をアッセイすることとさらに規定される請求の範囲第１項の方法。 ５．当該検出工程が、その多形性およびそのペプチドフラグメントを含むＰＰ２ Ｃα遺伝子産物について、免疫組織化学的および免疫細胞化学的染色、ＥＬＩＳ Ａ、ＲＩＡ、免疫ブロット、免疫沈降反応、ウェスタンブロッティング、機能ア ッセイ並びに蛋白短縮テストからなる群から選ばれるアッセイを用いて該標本を アッセイすることとさらに規定される請求の範囲第１項の方法。 ６．該標本が、尿、血液、脳脊髄液および唾液からなる群から選ばれる請求の範 囲第５項の方法。 ７．標本中のＰＰ２Ｃα遺伝子活性の検出が、ＰＰ２Ｃα遺伝子産物によって影 響を受ける蛋白の燐酸化パターンにおける変化を決定することによる請求の範囲 第１項の方法。 ８．その多形性を含むＰＰ２ＣαのｍＲＮＡの遺伝学的配列に相補的な分子プロ ーブ、および当該分子プローブとｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出し、 それによってＰＰ２Ｃα遺伝子の活性を示す検出手段を含む、請求の範囲第４項 に記載のＰＰ２Ｃα活性を検出するキット。 ９．その多形性およびそのペプチドフラグメントを含むＰＰ２Ｃα遺伝子産物か らなる群から選ばれるマーカーを高い特異性で認識する抗体、および該抗体との 結合を検出し、それによって該遺伝子産物の存在を示す検出手段を含む、請 求の範囲第５項に記載のＰＰ２Ｃ遺伝子活性に付随する遺伝子産物を検出するキ ット。 10．その多形性およびそのペプチドフラグメントを含むＰＰ２Ｃα遺伝子産物と 結合する天然の蛋白を模倣する薬剤、および該薬剤の結合を検出し、それによっ て該遺伝子産物の存在を示す検出手段を含む、請求の範囲第５項に記載のＰＰ２ Ｃα遺伝子活性に付随する遺伝子産物を検出するキット。 11．その多形性を含むヒトＰＰ２Ｃαのための発現可能な核酸配列を含む、遺伝 子導入非ヒト哺乳類または細胞株。 12．ＰＰ２Ｃαに匹敵する遺伝学的核酸配列がノックアウトされている非ヒト真 核細胞性有機体。 13．ＰＰ２Ｃαの核酸配列に機能的に連結された発現制御配列を含むベクター。 14．請求の範囲第１３項のベクターで形質転換された宿主細胞。 15．ＰＰ２Ｃαのアンチセンス配列を含むベクター。 16．ＰＰ２Ｃβの遺伝子産物からＰＰ２Ｃαの遺伝子産物を識別する、ＰＰ２Ｃ αの遺伝子産物（その多形性を含む）のエピトープと特異的に結合する抗体。 17．検出可能な部分と結合させた請求の範囲第１６項の抗体。 18．単クローン性および多クローン性抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第 １６項の抗体。 19．組換えによって製造されたＰＰ２Ｃαに対して作製された請求の範囲第１８ 項の多クローン性抗体。 20．NDDTDSASTD（配列番号：１）およびYKNDDTDSTSTDDMW（配列番号：２）から 成る群から選ばれるｐｐ２ｃαのカルボキシ末端ペプチドに対して作製された請 求の範囲第１８項の多クローン性抗体。 21．組換えによって製造されたｐｐ２ｃα、NDDTDSASTD（配列番号：１）および YKNDDTDSTSTDDMW（配列番号：２）からなる群から選ばれるペプチドに対して作 製され、さらにｐｐ２ｃβとは交差反応しない請求の範囲第１８項の単クローン 性抗体。 22．２Ａ３と称される請求の範囲第２１項の単クローン性抗体。 23．NDDTDSASTD（配列番号：１）、YKNDDTDSTSTDDMW（配列番号：２）およびPNK DNDGGA（配列番号：３）からなる群から選ばれる単離され精製されたペプチド。 24．組換えによって製造された請求の範囲第２３項のペプチド。 25．（ａ）癌のタイプおよび癌を発現している細胞の型を決定し、（ｂ）ＰＰ２ Ｃαの発現能力を制御する調節要素を含み、該癌細胞に特異的に標的到達するベ クターを調製し、さらに（ｃ）該ベクターを患者に投与する工程を含む癌を治療 する方法。 26．該ベクターがＡＡＶ改変配列またはＡＡＶ配列の一部分を含む請求の範囲第 ２５項に記載の方法。 27．該ベクターがＣＨＩＮＴ配列を含む請求の範囲第２５項に記載の方法。 28．該ベクターがサイレンサー領域（配列番号：１３）を含む請求の範囲第２５ 項に記載の方法。 29．該ベクターがミニサイレンサー領域（配列番号：１４）を含む請求の範囲第 ２５項に記載の方法。 30．（ａ）癌のタイプおよび癌を発現している細胞の型を決定し、（ｂ）該癌細 胞に特異的に標的到達してＰＰ２Ｃαの発現能力を制御するアンチセンスベクタ ーを調製し、さらに（ｃ）該ベクターを患者に投与する工程を含む癌を治療する 方法。 31．ベクターおよび医薬的に適切な担体から成る医薬組成物であって、当該ベク ターが、ＰＰ２Ｃαの発現能力を制御する調節要素を含み該癌細胞に特異的に標 的到達するベクター、並びに該癌細胞に特異的に標的到達してＰＰ２Ｃαの発現 能力を制御するアンチセンスベクターから成る群から選ばれる前記医薬組成物。 32．（ａ）異常な燐酸化を発現している細胞に特異的に標的到達してＰＰ２Ｃα の発現能力を制御するアンチセンスベクターを調製し、さらに（ｂ）該ベクター を患者に投与する工程を含む、ＰＰ２Ｃα発現の変化に起因する異常な燐酸化に よる疾患を治療する方法。 33．ＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼのＰＰ２Ｃα遺伝子産物との結合領域に特 異的に標的到達するアンチセンスベクターを調製し、さらに該ベクターを該細胞 に送達してＰＰ２Ｃαの遺伝子産物とＤＮＡポリメラーゼαプリマーゼとの非計 画的相互作用を妨害することによって抑圧遺伝子を増幅させる方法。 34．シグナル形質導入を誘発させるために細胞表面に発現されるＰＰ２Ｃα遺伝 子産物を活性化させる方法。 35．抗体がＰＰ２Ｃα遺伝子産物と結合させるために用いられる請求の範囲第３ ４項の方法。 36．患者から単離された標本中のＰＰ２Ｃβ遺伝子活性の変化を検出することに よって患者の癌を検出する方法。 37．さらに、ＰＰ２Ｃβ活性の増加を検出するという特徴を有する請求の範囲第 ３６項の方法。 38．ＰＰ２Ｃβ活性の検出が、その多形性を含むＰＰ２ＣβＤＮＡに相補的なｍ ＲＮＡについて、in situハイブリダイゼーション、ノザンブロッティングおよ び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選ばれるアッセイを用いて 該標本をアッセイすることによる請求の範囲第３６項の方法。 39．ＰＰ２Ｃβ活性の検出が、その多形性を含むＰＰ２Ｃβ遺伝子産物について 、免疫組織化学的および免疫細胞化学的染色、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロッ ト免疫沈降反応、ウェスタンブロッティング、機能アッセイ並びに蛋白短縮テス トからなる群から選ばれるアッセイを用いて該標本をアッセイすることによる請 求の範囲第３６項の方法。 40．ＰＰ２Ｃβの遺伝子産物からＰＰ２Ｃαの遺伝子産物を識別する、ＰＰ２Ｃ βの遺伝子産物（その多形性を含む）のエピトープと特異的に結合する抗体。 41．検出可能な部分と結合させた請求の範囲第４０項の抗体。 42．単クローン性および多クローン性抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第 ４０項の抗体。 43．組換えによって製造されたＰＰ２Ｃβに対して作製された請求の範囲第４０ 項の多クローン性抗体。 44．カルボキシ末端ペプチドPNKDNDGGA（配列番号：３）に対して作製された請 求 の範囲第４０項の多クローン性抗体。