CN111534517A - 一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表观遗传学、肿瘤学和新型抗肿瘤药物研究领域，提供了一种抑制原癌基因c‑myc表达的反义RNA MYC‑AS1及其应用。该RNA来源于人8号染色体基因组中原癌基因c‑myc衍生的反义长链非编码RNA，采用RACE和PCR克隆技术鉴定后，将其命名为MYC‑AS1，其cDNA 具有SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。本发明通过构建MYC‑AS1过表达载体质粒，体外实验显示MYC‑AS1可以抑制原癌基因c‑myc表达和肿瘤细胞增殖。本研究发明不仅提供了抑制原癌基因c‑myc的新手段，也为抗肿瘤药物的研究提供了新思路。

Description

一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1及其应用,属于表观遗传学、肿瘤学和新型抗肿瘤药物研究领域。

背景技术

肿瘤的发生归因于多种内在因素，如遗传突变，表观遗传变异以及代谢异常等。普遍认为，主要有两类基因与肿瘤的发生密切相关，即癌基因和抑癌基因。正常细胞中，癌基因和抑癌基因表达保持一定的平衡比例。遗传和表观遗传突变均能引起癌基因和抑癌基因表达异常，促使正常细胞转化成癌细胞。

虽然已知遗传突变与癌症发生有关，但越来越多的证据表明，表观遗传异常也与癌症的发生、发展和转移密切相关。抑癌基因表观遗传沉默的分子机制已被充分阐明。癌基因在癌细胞中的异常激活，除了报道与遗传突变有关外，至今未有关于表观遗传机制的报道。抑癌基因表观遗传沉默的发现，导致表观遗传药物引入临床治疗。如5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，AZA)及其类似物5-阿扎胞苷(5-Azacytidine)作为DNA甲基化抑制剂用于白血病的临床治疗以及一些实体肿瘤的临床治疗研究。然而DNA甲基化抑制剂的应用也引起了一些困惑。由于该表观遗传药物的非特异性，AZA在激活抑癌基因的同时，是否也会激活癌基因或癌相关基因。因此，进一步揭示表观遗传药物DNA甲基化抑制剂抑癌机制是癌症研究的另一个重要科学问题。

对反义RNA的研究中，我们意外发现不仅抑癌基因存在反义RNA，许多癌基因也存在反义RNA。在癌细胞中，这些反义RNA处于沉默(Silencing)状态，DNA甲基化抑制剂AZA可明显激活这些反义RNA表达，且反义RNA与对应的正义癌基因呈显著负相关关系。因此，癌细胞中的一些癌基因可能受其反义RNA的调控，这些癌基因的激活可能归因于它们反义RNA的表观遗传沉默，致使癌基因去抑制(Derepression)，从而导致癌基因的激活。这种全新的癌基因的致癌表观遗传学机制，对基础研究和临床医学研究均具重大意义。癌基因衍生的反义RNA在抑制肿瘤细胞增殖中的作用及其表观遗传学机制将逐渐被阐明，有望成为新型的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA序列以及作为新型抗肿瘤药物的应用前景，具体为一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1及其应用。

本发明的目的是这样实现的，一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1，其特征在于,MYC-AS1的cDNA具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO：1为：

GCCTTTTCATTGTTTTCCAACTCCGGGATCTGGTCACGCAGGGCAAAAAAGCTCCGTTTTAGCTCGTTCCTCCTCT GGCGCTCCAAGACGTTGTGTGTTCGCCTCTTGACATTCTCCTCGGTGTCCGAGGACCTGGGGCTGGTGCATTTTCGGTTG TTGCTGATCTGTCTCAGGACTCTGACACTGTCCAACTTGACCCTCTTGGCAGCAGGATAGTCCTTCCGAGTGGAGGGAGG CGCTGCGTAGTTGTGCTGATGTGTGGAGACGTGGCACCTCTTGAGGACCAGTGGGCTGTGAGGAGGTTTGCTGTGGCCTC CAGCAGAAGGTGATCCAGACTCTGACCTTTTGCCAGGAGCCTGCCTCTTTTCCACAGAAACAACATCGATTTCTTCCTCA TCTTCTTGTTCCTCCTCTTTAAGAAAGGAAATAGAAATCACTCCTTTAGCAAGGTTACATTAAAATAATCAATTACCAGA TTAATGCTGTACAAATACAAGGCATGAATACGTTAGAAAGGTCTCTGGACAAAATTATCTCCCCAAAGAGCCACATCTAA GCCTGGTGCCCTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCGTGAGGTCAGGAGAGACCA TCCTGGCCAACACGATGAAACCCCATCTCTACTAAAATTACAAAAATTAGCCTGGCATGGTGGTGTGCACCTGTAGTCCC AGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCTCTTGAACCAGGGGGTTGGAGGTTGATTGCGCCACTGCACTCCAGCCTAGTGACAGAGTGAGACTCCGTCTTAAAAAAGG。

所述的抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1在制备抗肿瘤药物中的应用。

用于扩增所述抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1的全长序列的引物，其特征在于序列如下：

MYC-AS1-F：5′-GCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′；

MYC-AS1-R：5′-CCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′。

所述的引物在扩增MYC-AS1全长序列中的应用。

用于构建所述抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1的过表达载体质粒的引物，其特征在于序列如下：

MYC-AS1-HindIII-F:

5′-cccaagcttGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′；

MYC-AS1-BamHI-R:

5′-cgcggatccCCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′。

利用所述的引物在构建MYC-AS1过表达载体质粒中的应用。

一种抗肿瘤药物，其特征在于，该药物通过增加MYC-AS1的表达来发挥作用。

通过本发明，提供一种抑制原癌基因c-myc表达的反义长链非编码RNA(命名为MYC-AS1)，所述MYC-AS1的cDNA序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明提供扩增MYC-AS1全长序列引物，其序列如下：，

MYC-AS1-F：5′-GCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′(SEQ ID NO.2)

MYC-AS1-R：5′-CCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′(SEQ ID NO.3)

本发明提供构建MYC-AS1过表达载体质粒引物，其序列如下：

MYC-AS1-HindIII-F:

5′-cccaagcttGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′(SEQ ID NO.4)

MYC-AS1-BamHI-R:

5′-cgcggatccCCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′(SEQ ID NO.5)

本发明还提供了上述MYC-AS1-F、MYC-AS1-R、MYC-AS1-HindIII-F和 MYC-AS1-BamHI-R引物在制备MYC-AS1试剂盒中的应用。

本发明提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物通过抑制原癌基因c-myc基因表达来发挥其作用。

本发明还提供了所述RNAMYC-AS1在制备抗肿瘤药物中的应用。特别是在制备抑制原癌基因c-myc基因表达药物中的应用。所述RNA通过抑制原癌基因c-myc表达来抑制肿瘤细胞增殖。

附图说明

图1是MYC-AS1 RACE琼脂糖凝胶电泳图，5’RACE琼脂糖凝胶电泳图；

图1B是MYC-AS1 RACE琼脂糖凝胶电泳图，3’RACE琼脂糖凝胶电泳图。

图2是MYC-AS1在人8号染色体上的位置示意图。

图3A是MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，RT-qPCR分析MYC-AS1表达；

图3B是MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，RT-qPCR分析过表达 MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响；

图3C是MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，Western-blot分析过表达MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响；

图4是MYC-AS1抑制人结肠癌细胞系HCT116增殖能力分析。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 MYC-AS1全长序列的测定。

(1)鉴定MYC-AS1的5′和3′末端序列；

主要由Takara公司提供的

RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成。

首先，用

Reagent提取人结肠癌细胞系HCT116总RNA，然后用RNase-freeDNase I去除基因组。在SMARTScribeReverse Transcriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。

然后，按照

RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与 5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增(RACE琼脂糖凝胶电泳图见图1、图1B)，克隆测序获得MYC-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′- 末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：

MYC-AS1-5-race：

5′-CCACAGCAAACCTCCTCACAGCCCACT-3′(SEQ ID NO.6)

MYC-AS1-3-race：

5′-GTGTTCGCCTCTTGACATTCTCCTCGGT-3′(SEQ ID NO.7)。

(2)常规PCR扩增MYC-AS1产物。其中，所用引物MYC-AS1-F和MYC-AS1-R的核苷酸序列如下：

MYC-AS1-F：5′-GCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′(SEQ ID NO.2)

MYC-AS1-R：5′-CCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′(SEQ ID NO.3)

其反应体系包括：100ng人结肠癌细胞系HCT116cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物MYC-AS1-F与1μL(10μM)MYC-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase， 10μL5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min； 4℃维持。

(3)TA克隆测序获得MYC-AS1的全长cDNA序列，该序列在人8号染色体上的位置示意图见图2。具体cDNA序列如SEQ ID NO.1。

实施例2 MYC-AS1过表达载体构建。

本实施例2中，使用从实施例1中所获得的MYC-AS1全长序列，构建MYC-AS1过表达质粒。

具体包括如下步骤：

(1)从人结肠癌细胞系HCT116中，使用

Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组。使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。

(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增MYC-AS1全长序列，其中，所用引物MYC-AS1-HindIII-F和MYC-AS1-BamHI-R的核苷酸序列如下：

MYC-AS1-HindIII-F:

5′-cccaagcttGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′(SEQ ID NO.4)

MYC-AS1-BamHI-R:

5′-cgcggatccCCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′(SEQ ID NO.5)

其反应体系包括：100ng实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物MYC-AS1-HindIII-F与1μL(10μM)MYC-AS1-BamHI-R分别作为扩增引物，1μL DNAPolymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。

(3)以实施例2步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收产物并连接至T载体进行克隆测序。测序正确的阳性克隆质粒与pcDNA3.1(+)(Invitrogen)过表达质粒载体分别用HindIII和-BamHI酶切。最后，酶切回收的lnc-ALVE1-AS1目的片段DNA 和pcDNA3.1(+)载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物直接转化大肠杆菌。重组子经PCR、酶切和克隆测序鉴定正确后，命名为pcDNA3.1-MYC-AS1。

实施例3 MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析。

本实施例3中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-MYC-AS1过表达质粒，通过荧光定量PCR和Western-blot方法评估了MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力。

具体包括如下步骤：

(1)将人结肠癌细胞系HCT116细胞接种至6孔细胞培养板，然后转染 pcDNA3.1-MYC-AS1过表达质粒。同时转染pcDNA3.1-EGFP过表达质粒作为载体对照。

(2)转染后48小时，收集细胞；

(3)提取细胞总RNA，使用荧光定量PCR方法检测细胞中原癌基因c-myc表达水平。

(4)提取细胞总蛋白，Western-blot分析细胞中原癌基因c-myc蛋白表达水平。将pcDNA3.1-MYC-AS1和pcDNA3.1-EGFP过表达质粒转染后的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入人c-MYC抗体和 HRP标记的山羊抗鼠IgG进行孵育，观察结果。

通过荧光定量PCR和Western-blot分析，我们观察到MYC-AS1可以显著抑制原癌基因 c-myc表达(图3A、图3B)。

实施例4MYC-AS1抑制人结肠癌细胞系HCT116增殖能力分析。

本实施例4中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-MYC-AS1过表达质粒，通过MTT和CCK-8方法评估了MYC-AS1抑制人结肠癌细胞系HCT116增殖能力。

具体包括如下步骤：

(1)将人结肠癌细胞系HCT116接种至6孔细胞培养板，然后转染pcDNA3.1-MYC-AS1过表达质粒作为实验组。同时，转染pcDNA3.1-EGFP过表达质粒作为对照组。

(2)质粒转染后24小时，分别消化实验组和对照组HCT116细胞并接种至96孔细胞培养板。每孔100μL(约2000个细胞)，96孔板边缘孔中不铺细胞，加入100μL灭菌PBS。

(3)MTT实验：5％CO₂培养箱中37℃培养24小时后，选取6个孔，每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml)，5％CO₂培养箱37℃孵育2小时。吸去培养基，每孔加入150μL DMSO，5％CO₂培养箱37℃孵育30-60分钟。然后，将DMSO转移至新的96细胞培养板中，用酶联免疫检测仪在OD 570nm下检测吸收值，同时检测OD630 nm吸收值排除干扰。

(4)随后每隔24小时检测一次。最后以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

通过MTT实验，我们观察到MYC-AS1可以显著抑制人结肠癌细胞系HCT116增殖(图4)。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 826

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gccttttcat tgttttccaa ctccgggatc tggtcacgca gggcaaaaaa gctccgtttt 60

agctcgttcc tcctctggcg ctccaagacg ttgtgtgttc gcctcttgac attctcctcg 120

gtgtccgagg acctggggct ggtgcatttt cggttgttgc tgatctgtct caggactctg 180

acactgtcca acttgaccct cttggcagca ggatagtcct tccgagtgga gggaggcgct 240

gcgtagttgt gctgatgtgt ggagacgtgg cacctcttga ggaccagtgg gctgtgagga 300

ggtttgctgt ggcctccagc agaaggtgat ccagactctg accttttgcc aggagcctgc 360

ctcttttcca cagaaacaac atcgatttct tcctcatctt cttgttcctc ctctttaaga 420

aaggaaatag aaatcactcc tttagcaagg ttacattaaa ataatcaatt accagattaa 480

tgctgtacaa atacaaggca tgaatacgtt agaaaggtct ctggacaaaa ttatctcccc 540

aaagagccac atctaagcct ggtgccctgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag 600

gccgaggtgg gcggatcgtg aggtcaggag agaccatcct ggccaacacg atgaaacccc 660

atctctacta aaattacaaa aattagcctg gcatggtggt gtgcacctgt agtcccagct 720

acttgggagg ctgaggcagg agaatctctt gaaccagggg gttggaggtt gattgcgcca 780

ctgcactcca gcctagtgac agagtgagac tccgtcttaa aaaagg 826

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gccttttcat tgttttcca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ccttttttaa gacggagtc 19

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

cccaagcttg ccttttcatt gttttcca 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cgcggatccc cttttttaag acggagtc 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ccacagcaaa cctcctcaca gcccact 27

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gtgttcgcct cttgacattc tcctcggt 28

Claims (7)

1.一种抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1，其特征在于, MYC-AS1的cDNA 具有SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO：1为：

GCCTTTTCATTGTTTTCCAACTCCGGGATCTGGTCACGCAGGGCAAAAAAGCTCCGTTTTAGCTCGTTCCTCCTCTGGCGCTCCAAGACGTTGTGTGTTCGCCTCTTGACATTCTCCTCGGTGTCCGAGGACCTGGGGCTGGTGCATTTTCGGTTGTTGCTGATCTGTCTCAGGACTCTGACACTGTCCAACTTGACCCTCTTGGCAGCAGGATAGTCCTTCCGAGTGGAGGGAGGCGCTGCGTAGTTGTGCTGATGTGTGGAGACGTGGCACCTCTTGAGGACCAGTGGGCTGTGAGGAGGTTTGCTGTGGCCTCCAGCAGAAGGTGATCCAGACTCTGACCTTTTGCCAGGAGCCTGCCTCTTTTCCACAGAAACAACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTTGTTCCTCCTCTTTAAGAAAGGAAATAGAAATCACTCCTTTAGCAAGGTTACATTAAAATAATCAATTACCAGATTAATGCTGTACAAATACAAGGCATGAATACGTTAGAAAGGTCTCTGGACAAAATTATCTCCCCAAAGAGCCACATCTAAGCCTGGTGCCCTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCGTGAGGTCAGGAGAGACCATCCTGGCCAACACGATGAAACCCCATCTCTACTAAAATTACAAAAATTAGCCTGGCATGGTGGTGTGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCTCTTGAACCAGGGGGTTGGAGGTTGATTGCGCCACTGCACTCCAGCCTAGTGACAGAGTGAGACTCCGTCTTAAAAAAGG。

2. 权利要求1所述的抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1在制备抗肿瘤药物中的应用。

3. 用于扩增权利要求1所述抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1的全长序列的引物，其特征在于序列如下：

MYC-AS1-F：5′-GCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′；

MYC-AS1-R：5′-CCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′。

4.利用权利要求3所述的引物在扩增MYC-AS1全长序列中的应用。

5. 用于构建权利要求1所述抑制原癌基因c-myc表达的反义RNA MYC-AS1的过表达载体质粒的引物，其特征在于序列如下：

MYC-AS1-HindIII-F:

5′-cccaagcttGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′；

MYC-AS1-BamHI-R:

5′-cgcggatccCCTTTTTTAAGACGGAGTC-3′。

6.利用权利要求5所述的引物在构建MYC-AS1过表达载体质粒中的应用。

7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，该药物通过增加MYC-AS1的表达来发挥作用。

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