CN113718035B - 环状RNA hsa_circ_0003552的应用及检测其的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用。所述环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1的核苷酸序列；所述试剂盒用于包括如下步骤的方法：a)分析患者样本中所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平；b)确定所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平是否显著高于健康对照。本发明的应用有效解决了现有技术上环状RNA利用的不足，且可以高效、准确地对存在宫颈癌癌细胞的组织进行检测。

Description

环状RNA hsa_circ_0003552的应用及检测其的试剂盒

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种特异性检测环状RNA hsa_circ_0003552含量的试剂在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用、检测环状RNA hsa_circ_0003552的试剂在在筛选治疗宫颈癌药物中的应用、含特异性检测环状RNA hsa_circ_0003552含量的试剂的试剂盒，还涉及一种体外构建宫颈癌细胞模型的方法。

背景技术

宫颈癌(Cervical Cancer,CC)是全球女性高发癌症之一，具有较高的发病率与死亡率。局部晚期宫颈癌控制率低、侵袭度高，肿瘤细胞通过各种途径转移播散至邻近和远处器官，如盆腔淋巴结，腹膜后等，进而造成新的肿瘤出现，治疗效果差。因此，对于宫颈癌而言，深入研究复发和转移的分子机制以开发更有效的治疗方案，准确进行疗效监测与预后评估，有助于进一步降低死亡率。目前常见的宫颈癌预后评估指标主要包括FIGO分期，淋巴结转移，间质浸润深度，肿瘤大小，脉管瘤栓等高危因素，但这些临床病理特征在预后评估方面尚不够精确，利用分子生物学技术确定可靠的标志物有助于更早更准确地预测临床结局，也为靶向治疗和评价疗效提供一定的参考机制。然而，现有的肿瘤标志物敏感性和特异性有限，迫切需要探索新的生物标志物以提供更灵敏更有针对性的信息。深入开展基础研究，寻找和鉴定宫颈癌转移复发的关键调控分子与生物标志物，探讨其临床应用价值，这对于开发精准而高效的治疗方法、改善临床晚期转移性宫颈癌患者治疗不佳的现状具有重要意义。

环状RNA(circularRNAs,circRNAs)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。与传统的线性RNA(linear RNA)不同，circRNAs分子表达更稳定，不受RNA外切酶影响。CircRNAs通过非经典剪接方式进行反向剪接形成。现有研究证实，circRNA可充当miRNA海绵或诱饵，与RNA结合蛋白相互作用，甚至翻译功能肽，广泛参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭转移等多种病理生理的调控。同时circRNAs具有内源性、丰富、保守、稳定等特点，且既可在癌症组织中特异表达，也存在于唾液、尿液、血液中。CircRNAs的以上特性，使其具有作为肿瘤诊断标志物和应用治疗的潜能。

截至目前为止，越来越多的研究提示，circRNA参与调控了宫颈癌相关的基因表达与信号转导，影响宫颈癌的发生发展。例如，hsa_circ_0000263在宫颈癌中高表达，与miR-150-5p竞争MDM4 mRNA作用位点，进而上调MDM4以限制抑癌基因p53基因的表达，形成hsa_circ_0000263/miR-150-5p/MDM4/p53调控网络(PMID:30569515)；hsa_circ_000284通过海绵作用，与miR-506竞争，上调Snail-2基因表达(PMID:29511454)；hsa_circ_101996作为miR-8075的海绵，可通过抑制miR-8075表达，激活TPX2基因的表达(PMID:30633364)。上述circRNAs的异常高表达最终影响宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡等生理过程。这些研究揭示了circRNAs可能在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用，它具有成为诊断和治疗的分子标记物的潜能。但总体而言，当前对circRNAs在宫颈癌中的研究仍不够全面与深入，circRNAs在宫颈癌中的分子机制仍处于基础研究阶段，对circRNAs是否可作为宫颈癌肿瘤诊断标志物等方面存在较大研究空间。

发明内容

针对现有技术中对环状RNA(circRNA)研究不够全面与深入、缺少宫颈癌诊断标志物的缺陷，本发明的发明人发现了环状RNA hsa_circ_0003552与宫颈癌之间存在关联，由此本发明提供了一种环状RNA hsa_circ_0003552的应用及检测其的试剂盒。环状RNA hsa_circ_0003552经验证，可以作为宫颈癌检测的有效标志物，且在非宫颈癌细胞中表达量很低，环状RNA hsa_circ_0003552的应用大大提高宫颈癌检测的准确性。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：特异性检测环状RNA hsa_circ_0003552含量的试剂在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1的核苷酸序列；

所述试剂盒用于包括如下步骤的方法：

a)分析患者样本中所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平；

b)确定所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平是否显著高于健康对照。

本发明中，所述显著是指在本领域中具有统计学上差异，例如P值小于0.05、P值小于0.01。

本发明中，所述健康对照是指宫颈癌病例的非癌变正常细胞，包括未癌变的癌旁细胞。

一般地，当所述表达水平高于健康对照时，所述患者样本中包含宫颈癌细胞；当所述表达水平低于或等于健康对照时，所述患者样本中不包含宫颈癌细胞。优选地，所述健康对照为同一患者的健康组织，以避免个体差异对表达水平差异产生影响。

较佳地，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌，所述HPV阳性宫颈癌优选为宫颈鳞状细胞癌。

在本发明一具体实施方案中，所述试剂为与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针。较佳地，所述引物分别含有如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

较佳地，所述样本选自以下的组，所述组包括：子宫组织、淋巴结、尿液、精液、血液、血清、血浆、血液或者淋巴中的循环肿瘤细胞，包含转移瘤的组织，以及包含宫颈癌细胞或者其部分的来源，以及来自宫颈癌细胞的游离的或与蛋白质结合的RNA分子；

较佳地，所述样本为活检材料。

在本发明一具体实施方案中，所述表达水平的分析可按照本领域对细胞RNA分析的方法进行，例如通过qRT-PCR进行。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：测定环状RNA hsa_circ_0003552表达量的试剂在筛选治疗宫颈癌药物中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

较佳地，所述试剂为与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针；所述引物优选分别含有如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

较佳地，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌，所述HPV阳性宫颈癌优选为宫颈鳞状细胞癌。

在本发明一具体实施方案中，如技术方案之二所述的应用包括：将所述治疗宫颈癌药物施用于体外培养的宫颈癌细胞和/或宫颈癌组织，用所述试剂检测所述宫颈癌细胞或者所述宫颈癌组织中环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平。一般而言，所述环状RNAhsa_circ_0003552的表达水平显著下降表明所述治疗宫颈癌药物有效。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测环状RNA hsa_circ_0003552含量的试剂。

优选地，所述试剂为与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针。

更优选地，所述引物含有分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

较佳地，所述试剂盒还包括所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、反转录试剂和/或实时荧光定量PCR试剂，所述实时荧光定量PCR的荧光染料可为本领域常规，优选为SYBGREEN。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种体外构建宫颈癌细胞模型的方法，所述方法包括在宫颈癌细胞中过表达环状RNA hsa_circ_0003552。

较佳地，所述宫颈癌细胞为人子宫颈鳞癌细胞Siha。

更佳地，所述过表达使用含线性化RNA hsa_circ_0003552片段的过表达载体，所述过表达载体的骨架载体为pZW1-FCS。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

较佳地，所述引物或探针为靶向环状RNA hsa_circ_0003552的shRNA，所述shRNA的正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在本发明一具体实施方案中，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌，所述HPV阳性宫颈癌优选为宫颈鳞状细胞癌。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：降低或抑制环状RNA hsa_circ_0003552表达的试剂在制备治疗和/或预防宫颈癌药物中的应用。

较佳地，所述试剂为靶向环状RNA hsa_circ_0003552的shRNA。更佳地，所述shRNA的正义链和反义链分别包含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。

在本发明一具体实施方案中，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌，所述HPV阳性宫颈癌优选为宫颈鳞状细胞癌。

在本发明一具体实施方案中，所述药物包括表达载体，所述表达载体用于在细胞内表达所述试剂，所述表达载体例如pLKO.1-puro、pRNAT-U6.1/neo、pSilencer2.1-U6neo、pSilencer 4.1-CMV puro、pLVX-shRNA1和pAAV-tdTomato-shRNA。优选地，所述药物还包括递送载体，所述递送载体用于将含所述试剂的表达载体递送进细胞，例如以慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体为例的病毒递送载体和以脂质体为例的脂溶性载体。

在本发明一具体实施方案中，所述降低或抑制环状RNA hsa_circ_0003552表达的试剂的有效组分包裹在慢病毒中。

在本发明中，所述宫颈癌包括人宫颈癌。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明和现有技术相比，其优点在于：

本发明基于环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌组织及细胞中呈现高表达，即宫颈癌组织中环状RNA的含量远高于癌旁组织中该RNA含量这一发现，提供了与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用。当前尚无该分子在肿瘤进程中表达模式的研究报道，本发明有效解决了现有技术上环状RNA利用的不足，且可以高效、准确地对存在宫颈癌癌细胞的组织进行检测。

附图说明

图1示出本发明的hsa_circ_0003552基因结构与全长序列图；

图2示出本发明的hsa_circ_0003552引物熔解曲线结果图；

图3示出本发明的hsa_circ_0003552PCR产物Sanger测序结果图，图中序列如SEQID NO:15所示；

图4示出本发明的real-time PCR检测hsa_circ_0003552在宫颈癌组织及癌旁组织中差异表达图；

图5示出本发明的real-time PCR检测hsa_circ_0003552在宫颈癌细胞中表达图；

图6示出本发明的宫颈癌组织中hsa_circ_0003552检测结果的ROC曲线；

图7示出hsa_circ_0003552干扰载体效果验证(Siha细胞)；

图8示出抑制hsa_circ_0003552表达对Siha细胞增殖能力的影响(Siha细胞)；

图9示出hsa_circ_0003552过表达载体效果验证(Siha细胞)；

图10示过表达hsa_circ_0003552对Siha细胞增殖能力的影响；

图11示hsa_circ_0003552RNA-FISH探针设计与原位检测Siha细胞中表达。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1环状RNA hsa_circ_0003552的作用及其核苷酸序列

通过circBase、CSCD及circbank数据库，获得环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与结构信息，可见该环状RNA定位于人类第18号染色体(33775219-33783152)，起源于其线性亲本基因MOCOS第2-5号外显子。

图1为环状RNA的基因结构图，其核苷酸序列全长为876nt(SEQ ID NO:1)。其中，起始两个核苷酸与最末两个核苷酸为成环结合位点。

进一步对hsa_circ_0003552的作用进行验证：

(一)shRNA慢病毒干扰抑制hsa_circ_0003552的效果

构建hsa_circ_0003552干扰载体，验证载体效果验证：如下图7所示，sh-hsa_circ_0003552可特异性抑制环状RNA3552表达，而对其线性亲本基因MOCOS无影响。具体如下：

一、hsa_circ_0003552基因干扰载体的构建

1、shRNA靶点设计：hsa_circ_0003552属于外显子环化circRNA，针对其剪切位点(backsplice junction)前后序列设计干扰靶点序列：AGAGCGCCTCACAGGAACTGT(SEQ IDNO:4)。

2、DNA oligo序列合成：根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT或TTTTTT转录终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列；在正链5’端添加C，反链3’端添加互补碱基，茎环序列(CTCGAG)位于寡核苷酸中央连接两条寡核苷酸；同时设计一条错义序列作为对照组，由苏州金唯智生物科技有限公司合成单链DNA oligo。所述shRNA干扰序列如下所示：

Hsa_circ_0003552-shRNA正义链(SEQ ID NO:5)：

CCGGAGAGCGCCTCACAGGAACTGTCTCGAGACAGTTCCTGTGAGGCGCTCTTTTTTG；

Hsa_circ_0003552-shRNA反义链(SEQ ID NO:6)：

AATTCAAAAAAGAGCGCCTCACAGGAACTGTCTCGAGACAGTTCCTGTGAGGCGCTCT；

所述对照组错义序列如下所示：

NC-shRNA正义链(SEQ ID NO:7)：

CCGGGACTAGACTGTCAACTGTCTACTCGAGTAGACAGTTGACAGTCTAGTCTTTTTG

NC-shRNA反义链(SEQ ID NO:8)：

AATTCAAAAAGACTAGACTGTCAACTGTCTACTCGAGTAGACAGTTGACAGTCTAGTC

3、Hsa_circ_0003552基因的shRNA慢病毒表达载体的构建：

(1)DNA oligo序列退火

将正义链(100μM)和反义链(100μM)DNA oligo1:1混匀，使其终浓度为50μM，加入退火缓冲液,在PCR仪上进行退火(95℃，30s；72℃，2min；37℃，2min；25℃，2min)，形成DNA双链，即为shRNA模板。将退火后所得shRNA模板采用RNase-free water稀释，使其终浓度为200nM，用于连接反应。

(2)载体线性化

将慢病毒表达载体pLKO.1-puro用AgeI/EcoRI进行双酶切，进行载体的线性化处理，酶切体系如下表1所示：

表1酶切体系

组分	用量
		Vector	4μg
AgeI	1μL
		EcoRI	1μL
Buffer(10×)	5μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL

于37℃酶切反应3h，对载体酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将其浓度用RNase-free water稀释至50ng/μL。

(3)目的片段与载体连接

将步骤(2)得到的线性化pLKO.1-puro与步骤(1)得到的shRNA模板连接，采用T4连接酶进行连接反应。连接体系如下表2所示：

表2连接体系

于16℃连接过夜，之后进行转化实验。

(4)转化及阳性克隆的PCR鉴定与测序

将5μL连接产物加入到50μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；加入500μL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h；取菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。次日，挑取单菌落，进行菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆进行测序(苏州金唯智生物科技有限公司)，进行测序比对后，鉴定阳性克隆即为构建成功的pLKO.1-puro-hsa_circ_0003552-shRNA慢病毒载体。

二、hsa_circ_0003552-shRNA慢病毒感染人宫颈癌细胞(Siha)及稳转株建立

(1)将提取的重组质粒pLKO.1-puro-hsa_circ_0003552-shRNA、辅助质粒psPAX2及PMD2.G共同转染HEK-293T细胞，分别于48h、72h收集病毒上清，同法收集对照NC-shRNA病毒上清；

(2)取对数生长期Siha细胞，调整细胞浓度至以2×10⁵/孔接种于6孔板中；

(3)次日，分别加入hsa_circ_0003552-shRNA及对照NC-shRNA病毒溶解液至培养基，每孔加入8μg转染增强试剂polybrene，摇晃混匀；

(4)培养12小时候更换含病毒稀释液的培养基，同法复感2次；于显微镜下观察荧光及感染效率。若荧光效率＞80％，且细胞状态良好，细胞融合度＞80％，则感染成功。此后以含嘌呤霉素(浓度1μg/mL)的培养基进行筛选培养。每72h更换培养液一次，连续3次可得稳转细胞系。

三、hsa_circ_0003552-shRNA慢病毒干扰效率验证

(1)实验分组：对照组(NC-shRNA组)、干扰组(hsa_circ_0003552-shRNA组)；

(2)收集各组细胞，按照Total RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取细胞总RNA；

(3)用反转录试剂盒(上海同科生物科技有限公司)反转录合成cDNA；

(4)进行Real-Time PCR检测DUXAP8 cDNA，程序为：95℃预变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共进行38个循环。ABI7500荧光定量PCR仪器选定熔解曲线程序，在爬坡过程中连续收集样品荧光信号以获得熔解曲线。Real-Time PCR采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物序列如表3所示：

表3特异性扩增引物序列及相关信息

如图7所示，相比对照组，实验组hsa_circ_0003552-shRNA能够降低hsa_circ_0003552的表达水平，具有统计学差异，对其亲本基因MOCOS无影响，因此hsa_circ_0003552-shRNA用于进行后续的实验。

四、干扰载体抑制hsa_circ_0003552的影响

将上述干扰载体应用干扰载体抑制hsa_circ_0003552后，发现细胞增殖能力变弱，即hsa_circ_0003552低表达抑制人宫颈癌细胞(Siha)的增殖，见图8。具体步骤如下：

(1)实验分组：对照组(NC-shRNA组)、干扰组(hsa_circ_0003552-shRNA组)；

(2)取上述各组对数生长期细胞，调整细胞浓度至以3×10³/孔接种于96孔板中，每组3个复孔。

(3)继续培养1-3天，利用CCK-8实验检测干扰hsa_circ_0003552对细胞增殖的影响。

如图8所示，干扰hsa_circ_0003552表达抑制人宫颈癌细胞(Siha)增殖能力。

(二)hsa_circ_0003552过表达效果的验证

进一步构建hsa_circ_0003552过表达载体，对表达载体的效果进行验证，结果见图9。

一、hsa_circ_0003552基因过表达载体的构建

1.hsa_circ_0003552线性化片段扩增与获得：以人宫颈癌细胞(Siha)的cDNA为模板，用引物3552-F和3552-R扩增出hsa_circ_0003552的线性片段，大小为879bp。

3552-F：CCTTACCTCACCTCTCTAGGAACTGTCTATCTTGACC(SEQ ID NO:13)

3552-R：GTTTCCATTTGGACCACACACTGTGAGGCGCTCTAGGG(SEQ ID NO:14)

2.hsa_circ_0003552基因过表达载体构建：将上述hsa_circ_0003552线性化片段与骨架载体pZW1-FCS同源重组以获得hsa_circ_0003552基因过表达载体，构建方法见(文章PMID:25242744)。

二、hsa_circ_0003552基因过表达载体效果验证

(1)实验分组：对照组(pZW1-FCS组)、过表达组(pZW1-FCS-hsa_circ_0003552组)；

(2)取对数生长期Siha细胞，调整细胞浓度至以3×10⁵/孔接种于6孔板中；

(3)次日，应用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)进行各组质粒瞬时转染；

(4)48小时后，收集各组细胞，按照Total RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取细胞总RNA；

(5)用反转录试剂盒(上海同科生物科技有限公司)反转录合成cDNA；

(6)进行Real-Time PCR检测hsa_circ_0003552cDNA，程序为：95℃预变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共进行38个循环。ABI 7500荧光定量PCR仪器选定熔解曲线程序，在爬坡过程中连续收集样品荧光信号以获得熔解曲线。Real-TimePCR采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物序列如表所示：

如图9所示，相比对照组，实验组pZW1-FCS-hsa_circ_0003552能够显著升高hsa_circ_0003552的表达水平，具有统计学差异。

三、将上述过表达载体用于上调hsa_circ_0003552后，发现细胞增殖能力变强，即hsa_circ_0003552高表达促进人宫颈癌细胞(Siha)的增殖，见图10。具体步骤如下：

(1)实验分组：对照组(pZW1-FCS组)、过表达组(pZW1-FCS-hsa_circ_0003552组)；

(2)取上述各组对数生长期细胞，调整细胞浓度至以3×10³/孔接种于96孔板中，每组3个复孔；

(3)继续培养1-4天，利用CCK-8实验检测过表达hsa_circ_0003552对细胞增殖的影响；

如图10所示，升高hsa_circ_0003552表达促进人宫颈癌细胞(Siha)增殖能力。

最后，设计hsa_circ_0003552RNA-FISH探针，构建方法见文章PMID:29319504)，原位检测了宫颈癌细胞中hsa_circ_0003552的表达和亚细胞定位，结果见图11。

实施例2环状RNA hsa_circ_0003552的特异性扩增引物

步骤1，circ RNA分子扩增引物设计：

(1)设计原则：①遵循普通引物设计原则；②引物跨越剪切位点处(backsplicejunction)处设计。

(2)序列重拼接：为满足跨剪切位点的设计需求，依据实施例1circRNA全长核苷酸序列，截取3'端100-300nt长度序列置于5'端100-300nt长度序列前面，以重拼接形成一个新序列，该序列包括成环拼接后的剪切位点。

(3)引物设计：针对重拼接所得序列，以常规方法设计引物，按照一般序列线性存储规则，默认按照5'→3'方向书写。

(4)引物输出与特异性调试：将3)所得引物序列导入NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中，采用“Primer-Blast”工具进行引物特异性比对分析与优化。

(5)所得引物信息(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)：

上游引物的核苷酸序列为：5’-GCCTCACAGGAACTGTCTATC-3’(SEQ ID NO:2)；

下游引物的核苷酸序列为：5’-GGCTGTGAGGATTACCATAAGT-3’(SEQ ID NO:3)。

在一种可实现的方式中，上游引物的GC含量为52.38％，下游引物的GC含量为45.45％，其中，GC含量是指在DNA4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。进一步地，上游引物的TM值为57.83度，下游引物的TM值57.58度，TM值是指上游引物或者下游引物的熔解温度。

步骤2，在步骤1的基础上，进一步通过real-time PCR实验、Sanger测序以验证引物：

(1)溶解曲线：溶解曲线单峰，TM值在正常范围之内；

(2)电泳图：电泳条带单一，条带大小正确；

(3)Sanger测序：测序结果单峰，环化位点正确。

图2为环状RNA引物验证结果，可见其溶解曲线显示单峰；取其PCR产物进行Sanger测序，显示测序结果单峰(见图3)，且环化位点正确。由此，完成环状RNA的引物验证。

实施例3包含环状RNA hsa_circ_0003552的特异性扩增引物的诊断试剂盒

其中，试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、ddH₂O、DNA聚合酶、荧光染料和dNTP混合液中的至少一种；试剂盒可使用real-time PCR方法检测宫颈癌组织中的hsa_circ_0003552，用于诊断宫颈癌。

以下实施例中如无特殊说明，所采用的试剂和生物材料均来源于市售。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例4 Real-time PCR检测环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌组织中表达

1、设计特异性扩增引物：

本申请人所设计的特异性扩增引物序列及相关信息如表4所示：

表4特异性扩增引物序列及相关信息

2、总RNA提取：

步骤(1)Trizol法提取宫颈癌组织的总RNA，样本信息见表5：取约0.2g宫颈癌组织，在液氮条件下进行研磨，直至组织呈粉末状态，随后加入1mL Trizol(Invitrogen，货号15596026)，充分研磨后吹匀；

步骤(2)步骤(1)制得的液体样品于室温下裂解5min，按照每1mL的Trizol加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖紧管盖，涡旋震荡15s后，静置5min待出现分层后，4℃条件下12000rpm离心15min，离心后混合液体分层为下层氯仿相，中层蛋白层，上层无色水相，RNA全部被分配于水相中；

步骤(3)将水相转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于-20℃静置30min后，4℃条件下12000rpm离心10min，得沉淀，RNA全部存在于沉淀中；

步骤(4)移去上清液，向体系中加入1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀，于4℃条件下7500rpm离心5min；

步骤(5)重复步骤(4)；

步骤(6)去除乙醇溶液，室温下干燥5-10min，至乙醇挥发，将无RNA酶的ddH₂O水加入离心管，充分溶解以获得总RNA；

步骤(7)NanoDrop ND-2000测定RNA的浓度与纯度，确定RNA质量达标后，分装并置于-80℃保存。

步骤3、第一链cDNA序列的合成：

取PCR管配制逆转录体系(仪器：Bio-rad伯乐S1000梯度PCR仪；试剂盒：上海同科生物科技有限公司，TonkBioTM First Chain cDNA Synthesis Kit，TB30001B)，逆转录体系为：1μL总RNA(约500-1000ng)，1μL随机引物，10μL ddH₂O，2μL dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，4μL逆转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂，1μL逆转录酶，总体积20μL；反应条件为：42℃下反应60min，70℃下反应5min。逆转录得到的cDNA置于-80℃储存备用。

4、Real-time PCR扩增反应使用逆转录得到的cDNA样品进行检测。(仪器：ABI7500实时荧光定量PCR仪；试剂盒：上海同科生物科技有限公司，Golden qPCR SYBR GreenMaster Mix(2×)，TK03013)

步骤(1)反应体系为：2μL步骤3逆转录得到的cDNA，0.8μL上游引物(SEQ ID NO:2)，0.8μL下游引物(SEQ ID NO:3)，6.4μL ddH₂O，10μL qPCR扩增Mix(含SYBGREEN染料)，总体积20μL；

步骤(2)Real-time PCR反应条件：95℃预变性10min，然后以95℃变性15s、52℃退火30s、72℃延伸30s，共进行38个循环。ABI 7500荧光定量PCR仪器选定熔解曲线程序，在爬坡过程中连续收集样品荧光信号以获得熔解曲线。

步骤(3)扩增反应在实时荧光定量PCR仪ABI7500(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)上进行，在扩增目的基因的同时扩增GAPDH作为内参对照(GAPDH的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成)，并通过2(-ΔCT)法计算基因的相对表达量。

对于实施例4，分别取不同样本，重复10次。其中，在内参GAPDH基因及hsa_circ_0003552基因real-time PCR溶解曲线图中，可看出，扩增峰单一，无杂峰，证明引物特异性良好，扩增实验正常。

实施例5 Real-time PCR检测环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌癌旁组织中的表达

重复实施例4的过程，区别在于：在步骤2中，提取宫颈癌癌旁组织中的总RNA。

本实施例中，分别取源自不同宫颈癌病例的癌旁组织样本(不包括放疗耐受的宫颈癌，因放疗会非特异性的抑制很多分子，除非特异性去研究放疗耐受，通常研究过程中会把术前接受过放化疗的病例剔除)，信息见表5，重复10次。

表5临床样本信息

上述样本中，与癌旁对照相比，癌组织中hsa_circ_0003552表达量显著升高。

实施例6 Real-time PCR检测环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌细胞及癌旁组织以外的人正常细胞中表达

重复实施例4的过程，区别在于：在步骤2中，提取人正常细胞系(HaCat)、HPV阴性宫颈癌细胞系(C33-A)、HPV阳性宫颈癌细胞系(Hela，Siha及Caski)的总RNA。其中，HaCat细胞购自中国典型培养物保藏中心细胞库；Hela与Siha细胞购自中国科学院细胞库；C33-A与Caski细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

本实施例分别取不同样本，重复5次。

实施例4-6的real-time PCR结果分析，

1、基因表达分析

其中，hsa_circ_0003552的表达结果如图4-图5所示：

(1)在图4的配对组织中，相对于宫颈癌癌旁组织，环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌组织中表达显著上调；

(2)在图5的细胞样本中，与正常对照细胞系HaCat相比，hsa_circ_0003552在宫颈癌细胞样本中普遍上调；另外，与HPV阴性细胞系C33-A相比，hsa_circ_0003552在HPV阳性宫颈癌细胞系中进一步上调。

以上结果表明，环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌组织及癌旁组织中具有差异表达，同样，在宫颈癌细胞及非宫颈癌细胞中具有差异表达，具体地，环状RNA hsa_circ_0003552在宫颈癌组织及细胞中均为高表达，因此，环状RNA hsa_circ_0003552可以用于宫颈癌的诊断。

2、ROC曲线分析

对实施例4-5得到的试验数据进行分析，得到ROC曲线，如图6所示，其中，曲线下面积AUC为0.970(P<0.001)，表示检测靶点能够作为检测该环状RNA的特异性标志物。

本领域技术人员知道，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性，该值大于0.7即表示检测靶点能够作为该种检测的特异性标示物。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，上面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行了清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽同科生物科技有限公司

<120> 环状RNA hsa_circ_0003552的应用及检测其的试剂盒

<130> P21014848C

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

tgccgcatct cttctgctac ccagctcaga gtaacttttc tggagtcaga taccccctgt 60

cctggataga agaggtcaag tctgggcggt tgcaccctgt gagcacgcct gggaagtggt 120

ttgtgctgct ggatgcagcc tcctacgtga gcacctcgcc tttggacctg tcagctcacc 180

aggccgactt tgtccccatc tccttctata agatcttcgg gtttcctaca ggcctgggcg 240

ctctgctggt ccataatcgt gcggctcctc tactgaggaa gacctacttt ggaggaggga 300

cagcctctgc gtacctagca ggagaagact tctacatccc gaggcagtcg gtagctcaga 360

ggtttgaaga tggcaccatc tcattccttg atgttatcgc gctaaaacat ggatttgaca 420

ccctagagcg cctcacagga actgtctatc ttgaccatgc aggtgccacc ttgttctccc 480

agagccagct cgaaagcttc actagtgatc tcatggaaaa cacttatggt aatcctcaca 540

gccagaacat cagcagcaag ctcacccatg acactgtgga gcaggtgcgc tacagaatcc 600

tggcgcactt ccacaccacc gcagaagact acactgtgat cttcactgcc gggagcacgg 660

ctgctctcaa actggtggca gaggcctttc catgggtgtc ccagggccca gagagcagtg 720

ggagtcgctt ctgttacctc accgacagcc acacctccgt agtgggtatg cggaacgtga 780

ccatggctat aaatgtcata tccaccccgg tcaggccaga ggacctgtgg tctgcagagg 840

aacgtagtgc ttcagccagc aacccagact gccagc 876

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 环状RNA hsa_circ_0003552上游引物

<400> 2

gcctcacagg aactgtctat c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 环状RNA hsa_circ_0003552下游引物

<400> 3

ggctgtgagg attaccataa gt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> hsa_circ_0003552的干扰靶点序列

<400> 4

agagcgcctc acaggaactg t 21

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hsa_circ_0003552-shRNA正义链

<400> 5

ccggagagcg cctcacagga actgtctcga gacagttcct gtgaggcgct cttttttg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hsa_circ_0003552-shRNA反义链

<400> 6

aattcaaaaa agagcgcctc acaggaactg tctcgagaca gttcctgtga ggcgctct 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> NC-shRNA正义链

<400> 7

ccgggactag actgtcaact gtctactcga gtagacagtt gacagtctag tctttttg 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> NC-shRNA反义链

<400> 8

aattcaaaaa gactagactg tcaactgtct actcgagtag acagttgaca gtctagtc 58

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> MOCOS上游引物

<400> 9

ggaacgtgac catggctata a 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> MOCOS下游引物

<400> 10

agctgggtag cagaagaga 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> GAPDH上游引物

<400> 11

caatgacccc ttcattgacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> GAPDH下游引物

<400> 12

gacaagcttc ccgttctcag 20

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> hsa_circ_0003552线性片段上游引物

<400> 13

ccttacctca cctctctagg aactgtctat cttgacc 37

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> hsa_circ_0003552线性片段下游引物

<400> 14

gtttccattt ggaccacaca ctgtgaggcg ctctaggg 38

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 环状RNA hsa_circ_0003552 PCR产物Sanger测序序列

<400> 15

cctcacagga actgtctatc ttgaccatgc aggtgcc 37

Claims (22)

1.特异性检测环状RNA hsa_circ_0003552含量的试剂在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列为如SEQ ID NO:1的核苷酸序列；

所述试剂盒用于包括如下步骤的方法：

a)分析患者样本中所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平；

b)确定所述环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平是否显著高于健康对照。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述HPV阳性宫颈癌为宫颈鳞状细胞癌。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物分别为如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本选自以下的组，所述组包括：子宫组织、淋巴结、尿液、精液、血液、血清、血浆、血液或者淋巴中的循环肿瘤细胞，包含转移瘤的组织，以及包含宫颈癌细胞的宫颈癌组织，以及来自宫颈癌细胞的游离的或与蛋白质结合的RNA分子。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本为活检材料。

8.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述表达水平的分析通过qRT-PCR进行。

9.测定环状RNA hsa_circ_0003552表达量的试剂在筛选治疗宫颈癌药物中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0003552相应的线性脱氧核糖核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂为与环状RNA hsa_circ_0003552特异性杂交的引物或探针。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述引物分别为如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述HPV阳性宫颈癌为宫颈鳞状细胞癌。

14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述治疗宫颈癌药物施用于体外培养的宫颈癌细胞和/或宫颈癌组织，用所述试剂检测所述宫颈癌细胞或者所述宫颈癌组织中环状RNA hsa_circ_0003552的表达水平。

15.一种体外构建宫颈癌细胞模型的方法，所述方法包括在宫颈癌细胞中过表达环状RNA hsa_circ_0003552。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述宫颈癌细胞为人子宫颈鳞癌细胞Siha。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述过表达使用含线性化RNA hsa_circ_0003552片段的过表达载体，所述过表达载体的骨架载体为pZW1-FCS。

18.降低或抑制环状RNA hsa_circ_0003552表达的试剂在制备治疗和/或预防宫颈癌药物中的应用。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述试剂为靶向环状RN A hsa_circ_0003552的shRNA。

20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述shRNA的正义链和反义链分别为如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。

21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。

22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述HPV阳性宫颈癌为宫颈鳞状细胞癌。

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