CN1194667A - 用于癌症治疗、预防和检测的蛋白质磷酸酶2C－PP2Cα－在肿瘤细胞中表达的操作和检测方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种检测病人癌症的方法,它通过在从病人分离出的样本中,检测包括其遗传多态性在内的人型蛋白质磷酸酶2C(PP2Cα和PP2Cβ)编码基因活性的改变与否。本发明还提供了治疗癌症的方法,它包括步骤:先确定癌症类型和表达该癌症的细胞,然后制备会特异性地导向癌症细胞并含有控制PP2Cα表达的调控元件的载体。然后将该载体施用于病人。也可制备反义载体。

Description

用于癌症治疗、预防和检测的 蛋白质磷酸酶2C-PP2Cα-在肿瘤细胞中表达的操作和检测方法
发明背景
发明领域
本发明涉及通过利用人型蛋白质磷酸酶2C(PP2Cα和PP2Cβ)基因和基因产物来检测和治疗癌症的方法，以及用于实施本发明的试剂盒；制备天然的和转基因的有机体，其中产生由人PP2Cα基因或其在其他物种中的类似基因所编码的基因产物，或者天然PP2Cα基因的表达被修饰或被剔除。
背景技术
转化的(指转变为癌细胞(transformed))或恶性的细胞对健康构成了严重威胁。如果转化的表型可以被逆转，那么癌症细胞就可以被控制，从而提供一种治疗方法。在逆转过程中，细胞可以摆脱其瘤形成表型，从而重新恢复正常的细胞生长和/或分化，或者存在生长遏制，或者可以激活编程性细胞死亡-细胞程序死亡(apoptosis)途径。提供可以逆转转化表型的治疗手段是有利的，可通过治疗手段引发这些逆转方式中任一种。此外还表明，早期鉴别出转化事件是有利的，因为可以更早地开始治疗。
目前已鉴别出的涉及转化的基因有例如Ras、Fos PDGF、erb-B、erb-B2、RET、c-myc、Bci-2、APC、NF-1、RB、p53等。这些基因被分成两大类：原癌基因和肿瘤抑制基因。原癌基因编码刺激细胞分裂的蛋白质，因而当突变时(癌基因)会使刺激性蛋白质过分活跃，结果导致细胞过度增殖。肿瘤抑制基因编码抑制细胞分裂的蛋白质。突变和/或异常的调控会导致这些蛋白质失活，从而使细胞没有增殖约束。此外，当被不恰当地表达时，E2F和p53和其他基因可以既作为癌基因又作为肿瘤抑制基因发挥作用。在癌基因和肿瘤抑制基因中有作为转录因子和蛋白质激酶的基序(motif)。鉴别出这些特异性基因已经揭示出细胞生命周期如何进行的一些信息。
基因扩增是与恶性细胞和转化细胞系有关的显著的异常方面之一(对于扩增的回顾，可一般性参见“在哺乳动物细胞中的基因扩增，全面的指导”(“GeneAmplification in Mammalian Cells，A Comprehensive Guide”)，R.E.Hellems编辑，Marcel Dekker，Inc.)。该现象是表征瘤形成细胞的遗传不稳定性的一部分，而且极少发生在正常细胞中。已表明，某些癌基因和肿瘤抑制基因可以被扩增，如Ras、Erb、p53等。
包括癌基因和肿瘤抑制基因在内的结构蛋白质和调控蛋白质的磷酸化，是真核细胞中主要的细胞内控制机制[Wera和Hemmings，1995；Cohen，1989]。蛋白质的磷酸化和脱磷酸化是对信号传导、细胞周期进展和转录控制进行的调控周期的一部分。蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶两者在磷酸化-脱磷酸化循环中都分别发挥作用。在编码这些蛋白质的基因中发生的突变，可导致蛋白质磷酸化的失败。例如，在酵母中，2C型蛋白质磷酸酶的突变可导致渗透调节出现缺陷[Shiozaki和Russell，1995]。
pp2c是蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶[Cohen 1989]。pp2c家族由哺乳动物组织中的两种胞质同工酶[McGowan和Cohen，1987]构成，而且在酵母中至少3种pp2c-样酶表现出相同的酶特性和生物化学特性。两种哺乳动物同工酶都是单体，但是分子量有少许不同(44千道尔顿和42千道尔顿)并被命名为pp2cα和pp2cβ。对于它们的功能以及这些蛋白质磷酸酶与转化细胞之间的关系，有不一致的文献报道[Saadat等人，1994；Nishikawa等人，1995；Lau和Baylink，1993；Shiozaki等人，1994；Eden和Cedar，1994；McGowan和Cohen，1987；Wenk和Mieskes，1995]。
在需要正常细胞功能的场合下，能够在治疗上对蛋白质的磷酸化进行控制是很有利的。此外，在mRNA翻译之后的糖基化，对于许多基因产物发挥功能是至关重要的。蛋白质的异常糖基化能干扰蛋白质功能，并且可由不同的调控路径所造成。基因表达调控的一种重要模式是DNA甲基化[Eden和Cedar，1994]。DNA的异常甲基化可起作用，而且导致控制细胞周期的调控蛋白的不恰当的表达。
病毒是非常特化的感染物质，在许多情况下已演化到避开宿主的防御机制。腺伴随病毒是细小病毒(parvovirus)家族的成员，在1960年便已描述了它们的肿瘤抑制性能[对于回顾，可参见Rommelaere和Tattersal，1990]。它们是一组小病毒，具有约5000核苷酸的ssDNA基因组，特征是相同的154碱基的回文末端。AAVDA3基因组的左部分编码4个多功能的、重迭的、非结构性的蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，它们由P5和P19启动子驱动，从不同剪接而成mRNA翻译而得(登录号J01901、M12405、M12468、M12469)。在基因组的右侧，P40启动子开始编码3种重迭的外壳多肽(VP1-VP3)[Berns，1990；Leonard和Berns，1994]。这些极小的DNA病毒分2类存在于脊椎动物中，自主复制型和辅助病毒(helper)依赖型细小病毒[Siegl等人，1985]。
辅助病毒依赖型腺伴随病毒(AAV)的复制取决于共感染辅助病毒[Young和Mayor，1979a，b]，或取决于基因毒性(genotoxic)压力的条件[Yakobson等人，1987]，它们含有可感染人但没有明显病症的物质[Cukor等人，1984]。辅助病毒是腺病毒[Atchison等人，1965]、疱疹病毒[Salo和Mayor，1979]和牛痘病毒[Schlehofer等人，1986]。辅助病毒共有在它们感染周期的早期诱导染色体损伤的能力[Schlehofer和zur Hausen，1982]。
已发现了AAV的肿瘤抑制性能[可参见Schlehofer，1994]。已表明，在啮齿动物中由腺病毒、疱疹病毒或植入被这些病毒转化的细胞而诱导出的肿瘤的进展，可以通过用AAV感染动物细胞而加以抑制[Kirschtein等人，1968；Mayor等人，1973；de la Maza和Carter，1981；Ostrove等人，1981]。体内发现肿瘤抑制与表明体外抑制细胞转化的结果是一致的。这可用被病毒或被激活的癌基因转化的、不同来源的(仓鼠和小鼠)细胞加以显示。与对照相比，用AAV感染的细胞或用特异性的AAV DNA序列转染的细胞，表现出病灶形成和饱和密度的下降，这表明与转化有关的性状受到了抑制[Casto和Goodheart，1972；Katz和Carter，1986；Hermonat，1989；Hermonat，1994；Schlehofer等人，1983；Schlehofer，1994；Yang等人，1995；Kleinschmidt等人，1995]。
此外，在人群中的血清流行病学发现表明，癌症病人产生对AAV的抗体的频率小于相应的对照个体。在美国[Mayor等人，1976]、比利时[Sprecher-Goldberger等人，1971]、和德国[Georg-Fries等人，1984]，用不同的血清学技术进行了3个独立的研究，发现在正常人群中有高频率的针对AAV[2、3、和5型]的抗体，这与癌症病人中较低频率的血清阳性相反。
开发出控制细胞转化的治疗方法是有用的。如上面信息所示，逆转细胞的转化或特异性地杀灭转化的细胞是有可能的。在拥有已有的反义技术、载体输送技术等技术时，发现能够受控制从而以这些方法或其他方法逆转细胞转化的人细胞机制是有用的。
发明概述
根据本发明，公开了一种在病人中检测癌症的方法和试剂盒，它是通过在从该病人分离出的样本中，检测编码人型蛋白质即磷酸酶2C(pp2cα)的基因(PP2Cα或PP2Cβ)的活性及其遗传多态性的改变而进行的。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，它包括步骤：先确定癌症类型和表达该癌症的细胞，然后制备会特异性地导向癌症细胞并包含调控元件以控制PP2Cα表达的载体。接着再将该载体施用于病人。或者，可制备反义载体。
本发明还提供了一种通过控制PP2Cα的表达，治疗因异常磷酸化(因PP2Cα表达的改变而造成)而导致的疾病的方法。
附图简述
随着结合附图和下列的详细描述，可更好地理解本发明，并轻易地了解本发明的其他优点。其中：
图1A-B是CO60和两个AAV/neo细胞系913和916(如用于细胞周期分析那样进行制备)的FACS分析图。在接种后24小时，用胰蛋白酶处理细胞，并用PBS洗涤。将细胞再悬浮于含0.1％柠檬酸钠、0.1％Triton X-100和50微克碘化丙锭的1毫升缓冲液中，然后在FACS中进行处理。
图2是Southern印迹分析图，它显示CHINT与AAV在不同的AAV/neo细胞系中的整合是相关的。不同AAV/neo克隆、CO60 DNA的Southern印迹分析，是用BglII消化，然后用“CHINT”探针进行杂交。9-1、2、3、4和5为AAV/neo细胞系。93R是丢失含有AAV的整个染色体的回复体(revertant)。A6是小鼠细胞系。
图3是整合的AAV和在9-3细胞中侧翼细胞序列的结构示意图。用EMBL-4λ噬菌体从C9-3细胞制备一个基因组文库，然后筛选AAV阳性克隆。分离出克隆13Kb-λSL9-1，再将其亚克隆入Blue-script载体中。如图所示，获得了质粒pSL9-11(13Kb)、pSL9-8(10Kb)和pSL9-6(3Kb)。
图4A-B，其中(A)是Southern印迹分析的照片，它显示AAV靠近9-3细胞中编码PP2Cα的基因。这些Southern印迹分析是，对来自CO60和9-3细胞的基因组DNA，用EcoRI或XbaI进行消化，然后依次与下列探针进行杂交：1)AAV；2)CHINT；和3)大鼠PP2Cα探针。CHINT和PP2Cα序列是相邻的(4Kb EcoRI片段)。AAV CHINT和PP2Cα在9-3细胞中靠得很近(5.6Kb XbaI片段)。(B)pSL9-6在野生型中国仓鼠细胞中靠近PP2Cα。来自中国仓鼠neo细胞的、用BamHI消化的DNA与pSL9-6和PP2Cα探针进行杂交。在包括CO60在内的所有细胞系中，都出现了一个约8.5Kb的共同片段。相同的片段也与CHINT探针杂交(数据未给出)。
图5A-C是DA3(泳道8)和DA3J1-DA3J7细胞系(泳道1-7)的Southern印迹分析照片。用BglII消化基因组DNA。印迹依次与AAV/neo JDT277、pSL9-6和PP2Cα PCR探针进行杂交。4Kb片段与AAV探针和pSL9-6探针在J3(泳道3)、J4(泳道4)和J6(泳道6)中发生杂交。小于4Kb的片段与AAV和PP2Cα两者探针在J1(泳道1)、J2(泳道2)、J5(泳道5)和J6(泳道6)中发生杂交。
图6是显示PP2Cα mRNA的改变与致癌原处理相对应的照片。在用MNNG(分别为7.5微克/毫升和2.5微克/毫升)处理后48小时，从CO60和C9-3细胞中以及从未处理的细胞中分离出40微克总RNA，并在变性凝胶(1.2琼脂糖/6.6％甲醛凝胶)上进行分级。凝胶被印迹处理然后连续地与32P-标记的大鼠PP2Cα cDNA(A)pSL9-1DNA(B)和rRNA cDNA(C)杂交。
图7是在25、30和35个PCR循环之后的凝胶电泳分析图。从直肠结肠癌No.6(T6)或从其相邻的非肿瘤性的粘膜(N6)获得的、用寡聚(dT)引发合成的cDNA，用特异性PP2Cα和β-肌动蛋白有义和反义引物进行PCR反应。在正常和肿瘤组织中对PP2Cα cDNA进行25个PCR循环的结果没有显示，因为没有发现可见的产物。
图8为25、30、30和35个PCR循环之后的凝胶电泳分析图，其中从CHE细胞系或从其相邻的转化细胞系(CO60)获得的、用寡聚(dT)引发合成cDNA，被分成几份，用特异性PP2Cα和β-肌动蛋白有义和反义引物进行PCR反应。
图9A-B是以有义方向(pYM001)和反义方向(pYM002)含有PP2Cα cDNA的质粒示意图。
图10是肝脏提取物与一系列针对pp2cα的单克隆抗体进行免疫沉淀的凝胶电泳分析图；1D5、2A3、9F4、9F1是用于将pp2cα从肝脏提取物中沉淀出来的单克隆抗体；801和351是用于在免疫印迹之后进行检测的兔多克隆抗体。
图11是含有PP2Cα的第一个翻译外显子的基因组λ100克隆的示意图。噬菌体是从CHO文库中克隆而得的。被测序的区域用阴影标出(SEQ ID NO：15和16)。
图12是凝胶电泳照片，其中泳道1：用pSK1和pAV2共转染；泳道2：用SV40质粒pSK1 SV40复制物进行的转染；泳道3：用pSVK1和带有AAV基因组核苷酸125-263的140bp的质粒进行的共转染；泳道4：用pSVK1和pSL9-6进行的共转染。
图13是Northern印迹的照片，其中来自不同的小鼠组织的RNA与PP2CαcDNA杂交，结果表明有几种不同大小的(从小于2Kb至大于5Kb)mRNA。从卵巢(O)、睾丸(T)、肾(K)、肝(L)、肌肉(M)、心脏(H)、肺(Lu)和脑(B)中抽提RNA。
优选例子的详细描述
本发明公开了一种在病人中检测癌症的方法，它是通过在从该病人分离出的样本中，检测编码人型蛋白质磷酸酶2C(pp2cα)的基因(PP2Cα或PP2Cβ)的基因活性及其遗传多态性的改变而进行的。将病人的基因活性与正常对照的基因活性进行比较。活性的改变可以是基因活性的负调节或者与之相反是正调节，从而导致磷酸化的改变。此外，改变会导致基因产物的异常功能或者基因产物的缺失，还可导致基因产物在细胞中分布的变化。
多态性是基因序列的变异形式。它们可以是在不同人种和地理位置中发现的序列转变(shift)，尽管有不同的序列，但是会产生功能上等价的基因产物，即同种型(isoform)。多态性还包括这样的变异形式，即被归类为产生功能改变的基因产物的等位基因和/或突变。多态性也包括这样的变异形式，即被归类为不产生基因产物、或产生无活性的基因产物或产生更高水平的基因产物的等位基因和/或突变。本文所用的多态性还可包括因控制或编码区域中DNA甲基化的差异而造成的变异。此外，该术语还可适当地与等位基因互换使用。
癌症被定义为转化的(transformed)或恶性的细胞，即发生不受控的生长和扩散的细胞(一般情况可参见Scientific American，1996年9月)。
一般如下面实施例(实施例4、5)中所示，已发现，用细胞中基因产物数量的下降加以确定，在细胞转化中PP2Cα的活性/表达，与正常对照相比，是下降的。但是，本发明认为，更高的活性会导致蛋白质活性的改变，从而使细胞功能发生改变。
此外，本发明认识到，有一种以上的PP2Cα基因产物，而且某一种可以在细胞中被减少或改变而另一种具体形式的PP2Cα会增加或更占优势(与正常对照相比)。细胞可以是在疾病状态中表现出PP2Cα活性改变的任何细胞类型。此外，第二个基因可以受PP2Cα活性改变的控制，从而使其产物增加或减少，因而可以用本发明方法进行监测。可以监测新的转录物、缺乏转录物或由这些转录物编码的蛋白质的改变。
此外，本发明认识到，pp2cα本身是磷酸化的，因为它有包括酪氨酸、丝氨酸和甲状腺原氨酸在内的多个磷酸化位点，而且不能合适地进行磷酸化便会导致pp2cα蛋白的功能失常。此外，pp2cα也可自身脱磷酸化。自我磷酸化的失败会对细胞周期调节有影响。
样本可以是来自癌前期的损伤或任何能够如此处进行PP2Cα活性或基因产物分析的组织或体液的活体检查材料。合适地，可以检查体液，如血液、尿液、脑脊液和唾液。
在一个例子中，PP2Cα活性的检测是通过分析样本中相对PP2Cα DNA的mRNA互补性(包括多态性)，其中可使用选自下组的分析方法：原位杂交、Northern印迹法和逆转录酶-聚合酶链反应。
在另一种方法中，PP2Cα活性和细胞分布的检测是通过分析样本的PP2Cα的基因产物，包括多态性和肽片段，其中使用选自下组的分析方法：免疫组织化学和免疫细胞化学染色、ELISA、RIA、免疫印迹、免疫沉淀、Western印迹法、基因产物活性的功能分析法、磷酸化方式的分析法和蛋白质截短分析。被pp2cα脱磷酸化的靶蛋白，在PAGE上会有不同的尺寸特征和不同的等电点以及功能上的改变，如它们与其他蛋白质、RNA、DNA和其他细胞组份相互作用的能力。
此外，如果染色体异常与改变的PP2Cα相关，可用本领域中已知的标准方法进行筛选。
除了基因产物本身在细胞中位置和数量方面的改变(如下面实施例中所示的那样)之外，本发明方法可筛选体液中的基因产物。随着基因功能的改变，在体液中的基因产物浓度会受影响，比如如果糖基化或信号序列受影响的话，那么会从细胞中释放出更多的基因产物。不完整的蛋白质片段会因翻译中断而产生，然后从细胞中释放出来，因而可被监测。
此外，本发明认识到，pp2cα mRNA的不同剪接形式会在不同组织中导致不同大小和/或功能，因而可设计分析方法以便在合适的组织中识别不同的剪接形式。
在特异性的体液中鉴别出基因产物的改变，就意味着肿瘤源/位置。例如，对于中枢神经系统中的肿瘤，会在脑脊液中发现基因产物。类似地，其他肿瘤或其他疾病的位置可决定应筛选哪些体液，反之亦然，这是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了或者在mRNA水平或者在基因产物水平上检测PP2Cα活性和/或改变的试剂盒。试剂盒包括针对PP2Cα mRNA的分子探针以及检测分子探针从而检测mRNA的检测装置。另外，或额外地，试剂盒可含有检测PP2Cα基因产物的探针。检测装置一般是对基因产物有高度特异性的抗体，或者是模拟天然蛋白与PP2Cα基因产物结合的物质。本领域中已知的其他物质也可使用。抗体可如下面所述及实施例3中那样进行制备，该抗体可特异性地识别PP2Cα或PP2Cβ基因产物(包括在细胞表面上的)及其多态性形式，以及用于检测抗体结合的检测装置，从而表明存在基因产物并也将一种产物与另一种产物区分开。
合适时，试剂盒还可含有针对次级基因产物的抗体，该次级基因产物受PP2Cα基因功能改变的影响。
本发明公开了一种检测病人癌症的方法，它是通过在从该病人分离出的样本中，检测PP2Cβ基因活性相对于正常而言的改变程度而进行的。
本发明还提供了检测PP2Cβ活性的试剂盒。试剂盒包括针对PP2Cα多态性mRNA的分子探针以及检测分子探针从而检测mRNA或抗体的检测装置，或者如本文所述在基因产物水平上鉴别相对正常对照而言的改变的其他装置。
本发明提供了多克隆或单克隆抗体，它可特异性地结合于由PP2Cα基因所编码的多肽/蛋白质，如下面实施例3所述的那样。本发明的抗体可用于鉴别PP2Cα和PP2Cβ的基因产物。本发明提供了针对重组产生的PP2Cα、NDDTDSASTD(SEQ ID NO：1)、YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ ID NO：2)、重组产生的pp2cβ和PNKDNDGGA(SEQ ID NO：3)的单克隆及多克隆抗体。
本发明还提供了分离和纯化的肽NDDTDSASTD(SEQ ID NO：1)、YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ ID NO：2)、和PNKDNDGGA(SEQ ID NO：3)。这些肽可重组产生。
本发明还提供了识别5′UTR(非翻译区)特殊结构或负责PP2Cα受控表达的RNA-蛋白质复合物的抗体。还提供了特异性识别特殊RNA结构的抗体。
一般在制备抗体时，可将完整的pp2cα或其肽序列和多态性形式用作免疫原。此外，可制备针对这些抗体的抗独特型抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。方便地，可以针对基于该序列的合成肽制备抗体，或者用克隆技术重组制备抗体，或者将天然基因产物和/或其片段分离出并用作抗原。采用本领域技术人员熟知的标准抗体生产技术，如在Harlow和Lane，《抗体：实验手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988中所述的技术，可用这样的蛋白质或肽产生抗体。
对于产生多克隆抗体，可用蛋白质或肽(通常和佐剂一起，而且如果需要被偶联于载体)免疫宿主如兔或羊；然后从血清中收集针对蛋白质的抗体。
对于产生单克隆抗体，使用的技术是，用蛋白质或肽片段超免疫适当的供体(通常是小鼠)，然后分离出产生抗体的脾细胞。将这些细胞与具有无限增殖性的细胞(如骨髓瘤细胞)融合，从而形成融合的、具有无限增殖性并分泌所需抗体的杂交细胞。接着大量培养该细胞，并从培养基中收获单克隆抗体以供使用。
如本领域中已知的那样，抗体可以结合于固相载体基材或偶联(conjugate)于可检测的分子或者同时结合和偶联。(对于偶联于荧光或酶分子的全面论述，可参见Johnstone和Thorpe，《Immunochemistry in Practice》，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1982)。将抗体结合于固相载体基材也是本领域中熟知的(对于全面论述，可参见Harlow和Lane，《抗体：实验手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Publications，New York，1988)。本发明构想的可检测分子可包括(但并不限于)：荧光的、金属的、酶的和放射性的标记物，如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸镁、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、罗丹明、氚、14C和碘化。此外，毒素可被偶联于抗体上以便定向输送。
本发明还提供了转基因的人PP2Cα基因和多态性的PP2Cα基因、动物和细胞(细胞系)模型以及剔除(knockout)的PP2Cα模型。这些模型是用本领域中已知的标准技术构建的，并且公开于下列文献中：美国专利5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,385、5,175,384、5,175,383、4,736,866以及Burke和Olson[1991]、Capecchi[1989]、Davies等人[1992]、Dickinson等人[1993]、Huxley等人[1991]、Jakobovits等人[1993]、Lamb等人[1993]、Rothstein[1991]、Schedl等人[1993]、Strauss等人[1993]。此外，专利申请WO 94/23049、WO 93/14200、WO 94/06908、WO 94/28123也提供了信息。
本发明还提供了一种载体，它包括可操作地连于PP2Cα基因及其片段以及它们多态性序列的核酸序列(参见下面的实施例)的表达控制序列。本发明还提供了选自合适的真核和原核细胞的、被这些载体转化的宿主细胞。
可用本领域中已知的各种不同方法中一种，将载体引入细胞或组织中。这样的方法一般可在下列文献中找到：Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，(1992)；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)；Vega等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)；和Gilboa等人(1986)，而且包括例如：稳定的或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组的病毒载体进行感染。通过感染引入核酸的方法，相比其他方法有多个优点。因为感染的本质，可以获得更高的效率。此外，病毒是非常特化的，因而通常在特异的细胞类型中感染和繁殖。因此，可利用它们的天然特异性，将载体在体内、组织中或细胞的混合培养物中导向特定的细胞类型。病毒载体还可用特异性的受体或配体[Solderling，1993]进行修饰，以便通过受体介导事件而改变靶特异性。
更具体地，这样的载体是本领域技术人员已知的或可以构建的，它应包括为实现所需的序列转录而需要的所有表达元件。载体还可包含其他有益的性能，如以不同形式回收核酸的机制。噬菌粒是这类有益载体的一个具体例子，因为它们可以被用作质粒或用作噬菌体载体。其他载体的例子(参见下面的实施例)包括：病毒如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒、DNA病毒、粘粒、载体、脂质体和其他重组载体。这些载体还可含有用于原核或真核宿主系统的元件。本领域的普通技术人员知道，那些宿主系统是与特定的载体相匹配的。
还可用本领域已知的重组方法来实现靶核酸的有义、反义或三链体(triplex)抑制。例如，可用含有反义核酸的载体来表达蛋白质或反义信息，从而减少靶核酸的表达进而降低其活性。此外，可产生和使用核酶来“剔除(knock-out)”基因的mRNA表达[Cech，1986；Cech，1990；Hampel等人，1993；Sullivan，1994]。
一种用于引入和表达重组序列的DNA病毒载体的具体例子是腺病毒衍生载体Adenop53TK。该载体表达用于阳性或阴性选择的疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因，并有用于所需重组序列的表达盒。该载体可用于感染具有腺病毒受体的细胞，这包括大多数上皮起源和其他起源的癌症。该载体以及其他表现出类似的所需功能的载体，可用于处理细胞的混合群，其中可包括例如；体外或在活体外的细胞培养物，组织或人体对象。
还可赋予载体额外的特性，以保证它的安全性和/或提高其治疗效力。这样的特性包括例如，用于负选择被重组病毒感染的细胞的标记物。这种的负选择标记物的一个例子是上述的TK基因，它赋予对抗生素9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancyclovir)的敏感性。因此，负选择是控制感染的手段，因为它提供了通过加入抗生素而诱导的自杀。这种保护措施保证了，例如如果发生了产生不同形式的病毒载体或重组序列的突变，那么不会发生细胞的癌变。还可包括将表达局限于特定细胞类型的特征。这样的特性包括，例如，对所需的细胞类型特异的启动子和调控元件。
此外，重组的病毒载体可用于体内表达所需的核酸，因为它们提供了诸如侧向(lateral)感染和导向特异性之类的优点。侧向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的，它是这样的一个过程：一个被感染的细胞产生许多子代病毒颗粒，这些病毒颗粒出芽然后感染周围的细胞。结果是一大块区域被很快感染，而其中大部分起初并没有被最初的病毒颗粒所感染。这与垂直型感染相反，在这种感染中感染物质仅通过子后代(daughter progeny)传播。还可以产生不能侧向传播的病毒载体。如果所需的目的是将特定的基因仅引入局部的少数靶细胞，那么这一特征是有用的。
如上所述，病毒是非常特化的感染物质，在很多情况下它已演变得可以躲避宿主的防御机制。典型地，病毒感染并在特定的细胞类型中繁殖。病毒载体的导向特异性就是利用了它特异地导向预定细胞的天然特异性，从而可以将重组基因引入感染的细胞。用于本发明方法的载体取决于所需的待导向细胞类型，这是本领域技术人员已知的。例如，如果待治疗的是乳房癌的话，那么可以使用对上皮细胞特异的载体。同样，如果待治疗的是造血系统的疾病或病症，那么可以使用对血细胞及其前体特异的病毒载体，尤其是对造血细胞的特定类型特异的病毒载体。
可以构建逆转录病毒载体，使其发挥感染颗粒的作用，或者仅进行一轮最初感染。在前一情况下，病毒的基因组被修饰，从而保留所有必需的基因、调控序列和包装信号，从而合成新的病毒蛋白质和RNA。一旦这些分子被合成之后，宿主细胞就将RNA包装入新的病毒颗粒，从而能够进行下一轮次的感染。还可对载体基因组进行工程改造，以编码和表达所需的重组基因。在非感染性病毒载体的情况下，一般对载体基因组进行诱变以破坏将RNA包入病毒颗粒所需的病毒包装信号。没有这种信号，任何形成的颗粒就不会含有基因组，因而不能进行以下轮次的感染。载体的具体类型取决于所需的用途。实际的载体在本领域中也是已知的和可轻易获得的，或者可以由本领域技术人员用公知的方法加以构建。
重组载体的施用可以有多种方式，而且可以与合适的药物载体一起施用。例如，如果使用病毒载体，那么程序可利用它们的导向特异性，因而不必局部施用病灶。但是，局部施用(给药)可提供更快和更有效的治疗。给药还可以通过例如，静脉内或皮下注射入对象体内而进行。将病毒载体注射到脊髓液中，也可以作为一种给药方式，尤其是在神经变性疾病的情况下。在注射之后，病毒载体会被循环，直到它们以合适的导向特异性识别出宿主细胞，从而进行感染。
另一种施用PP2Cα载体的方法是，直接地局部接种到疾病或病症的部位，或者接种到给肿瘤提供营养物质的血管系统中。局部给药是有利的，因为没有稀释效应，因而只需要较小的剂量就可在大量靶定细胞中实现表达。此外，局部接种可降低导向要求(这是其他给药方式所需要的)，因为可以使用感染接种区域中所有细胞的载体。如果仅需要在接种区域特定的一小类(subset)细胞中进行表达，那么可以使用对所需的该小类特异的启动子和调控序列，以实现该目标。这样的非导向型载体可以是，例如，病毒载体、病毒基因组、质粒、噬菌粒等。也可使用诸如脂质体之类的转染载体，从而在接种区域将上述的非病毒载体引入受体细胞。这样的转染载体是本领域技术人员已知的。
在一个较佳例子中，使用基于修饰过的AAV的病毒载体。已表明，AAV可在染色体19q13.3处整合人人基因组。使用的是改变AAV基因组，其改变方式是允许其以位点特异方式整合入PP2Cα调控区域(参见实施例7)。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，它包括步骤：先确定癌症类型和表达该癌症的细胞，然后如上所述制备会特异性地导向癌症细胞并包含调控元件以控制PP2Cα表达的载体。接着再将该载体施用于病人，而且其中可包含合适的不影响载体生物活性的药物载体。或者，制备反义载体并用于控制PP2Cα的表达。
pp2c是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶这一蛋白质[Cohen 1989]。它在磷酸酶中是独特的，因为它需要镁而且对于某些磷酸酶抑制剂如冈田酸是不敏感的[Cohen1991]。pp2c家族由哺乳动物组织中的两种胞质同工酶[McGowan和Cohen，1987]构成，而且在酵母中有至少3种pp2c-样酶表现出相同的酶特性和生物化学特性。两种哺乳动物同工酶都是单体，但是分子量有少许不同(44千道尔顿和42千道尔顿)，因而被命名为pp2cα和pp2cβ。在α和β同种型之间有70％同源性。在pp2cα的羧基端，有一个15个氨基酸的序列不同于pp2cβ。在人中，该序列是YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ ID NO：2)。
一种用于编码pp2cα和额外的FosB和ERCCI蛋白质的106Kb粘粒，已经被测序[Martin-Gallardo等人，1992](GENBANK登录号：M89651)。此外，人PP2Cα的cDNA序列是已知的[Mann等人，1992]。但是，将cDNA的5′UTR与基因组序列进行对齐排列(align)的尝试没有成功。
可对上述观察结果进行假设，但是应理解，本发明并不局限于这样的某种假设。申请人提出，UTR是由若干个小外显子和大内含子所构成的，而且提出PP2Cα和FosB具有共同的调控区域(ERCCI也可能共享这一调控区域)。或者，有可能PP2Cα是非常大的基因，而且5′端和控制区域并不在106Kb粘粒中靠近106Kb粘粒5′端的区域。作为另一种可能，来自粘粒的9Kb区域因为高G/C含量而没有被测序，它可能含有5′UTR区域和启动子。
在一个优选例子中，AAV病毒和/或CHINT或其他与PP2Cα基因有关的调控序列被用于载体，尤其是那些用于治疗病人的载体。CHINT是一细胞序列，它在9-3细胞中被重组入AAV；其序列列于表5(iht.li；SEQ ID NO：19)。载体可参与PP2Cα的调控并改变PP2Cα的表达，其方式与AAV改变被其整合的细胞相同，因为AAV是癌抑制病毒。因而这样可以恢复正常的细胞生长，或者发生生长抑制，或者激活细胞的程序死亡-即编程性细胞死亡途径，这取决于细胞类型、癌症类型、分化阶段和本领域技术人员已知的其他因子[Schlehofer，1994]。
利用下列观察结果，可将在AAV和/或CHINT中或在PP2Cα调控元件中有数个元件用于控制PP2Cα表达：
1.PP2Cα有非常长的5′和3′UTR(它们大于编码序列长度)。RNA的特异折叠以及与特异组别蛋白质的相互作用，可能会显著影响其表达。在某些阶段，可能有不同的折叠方式，而且这些不同的蛋白质与RNA相互作用并改变其表达。
2.在整合中所涉及的CHINT序列，具有非常有趣的、可用于位点特异性整合的基序。此外，申请人拥有的数据表明，靠近AAV整合位点的特异性AAV序列负责抑制DNA扩增。这些序列可用于载体作为治疗物，在下面被描述为沉默子(SEQ ID NO：13)和小沉默子(SEQ ID NO：14)。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，其中使用基于AAV的载体或其他用于癌症治疗的载体，它仅在PP2Cα被不适当地激活的细胞中特异性地发挥功能。载体被施用于已被诊断出有肿瘤的对象，这是本领域技术人员已知的。在一个例子中，AAV载体(或其他此处所公开的调控因子)处于启动子rep的控制之下，该载体在转化的细胞中是表达的。如实施例中所示的那样，整合的载体会在细胞中控制PP2Cα的表达并逆转癌变过程。此外，载体还可被导向已癌变的细胞类型。
此外，因为PP2Cα的基因产物是在细胞表面上表达的，所以通过信号转导途径，针对基因产物的抗体可激活/失活基因的表达。因此，可治疗性地使用抗体来治疗PP2Cα基因需要再调节的病人。可使用Fab片段或其他本领域中已知的其他形式，以确保施用于病人之后抗体不产生次级的副作用。或者可以使用能特异性地结合于PP2Cα基因产物的配体或其他分子。因此，本发明提供了与细胞表面上表达的PP2Cα基因产物结合，从而诱导信号转导，进而抑制癌变表型的方法。
本发明还提供了一种通过控制PP2Cα表达而治疗疾病的方法，这些疾病的起因是因PP2Cα表达改变而导致异常磷酸化。这种疾病可以是神经学上的。例如，行为改变可能与异常磷酸化有关。如Brown等人所述，fosB的1996种突变会导致行为改变。如本文上面所述，FosB和PP2Cα都在106Kb粘粒上。有某种显示表明它们可能是被共调控的。因此，PP2Cα的异常表达可表现为行为改变。此外，与其他组织相比，在心脏和肾脏组织中的PP2Cα活性水平极高。因此，PP2Cα活性的改变会在这些组织中得以反映。
本发明提供了一种通过中断DNA聚合酶α引发酶和RNA聚合酶II与PP2Cα基因产物的结合或作用，而抑制基因扩增的方法，它是通过制备一反义载体，该反义载体会特异性地针对DNA聚合酶α引发酶和RNA聚合酶II与PP2Cα基因产物的结合区域，然后将该载体输送至细胞，正如基于实施例9中的观察结果那样。申请人已观察到，在肿瘤细胞中，pp2cα结合于RNA聚合酶II的CTD结构域。因此，也可以利用竞争性结合策略，通过输送具有CTD结构域的肽来控制导致基因扩增的结合情况。
为了调查AAV在肿瘤抑制中作用，将AAV/neo病毒JDT277引入SV40转化的中国仓鼠(CO60和OD4细胞)以及小鼠乳房肿瘤细胞(DA3)。CO60是被SV40转化的中国仓鼠胚胎细胞系[Lavi，1981]。OD细胞系是用缺失了起点的SV40DNA转染中国仓鼠胚胎细胞而建立的[Lavi，1985]。小鼠DA3细胞系衍生自与BALB/c小鼠同系的乳房肿瘤[Sotomayor等人，1991]。JDT277病毒含有部分AAV2基因组(编码病毒Rep蛋白)、AAV末端反向重复序列(terminal invertedrepeats，TIR)和赋予G418抗性的原核的新霉素磷酸转移酶基因(neo)。neo基因被插入核苷酸1882位，造成羧基端被截短的Rep蛋白。rep蛋白的截短并不影响AAV/neo病毒在被腺病毒共感染的人细胞中进行复制的能力。
在G418存在下，分离出单个集落并通过一系列传代而扩增。对于衍生自CO60细胞的抗性细胞被称为9-1至9-5，而衍生自OD4细胞的抗性细胞被称为A20-A29。衍生自小鼠细胞DA3的细胞系被称为J1-J15。
癌变表型的改变
在AAV整合之后，细胞丧失了几种癌变特征。
1.抑制SV40 DNA扩增(实施例7)
肿瘤细胞的一个特征性本质是能够扩增DNA。将CO60细胞用作研究基因扩增的模型系统，通过用致癌剂处理可以在细胞中诱导SV40扩增[Lavi，1981：Aladjem和Lavi，1992]。在AAV/neo病毒整合之后，细胞不能扩增SV40。在用致癌剂处理之后，与亲代CO60细胞相反，大多数衍生自CO60细胞的AAV/neo细胞系丧失了扩增SV40的能力[Tal Burstyn，1993]。衍生自OD4和CO60细胞的AVV/neo细胞的提取物丧失了体外扩增SV40的能力[Winocour等人，1992；TalBurstyn，1993]。
2.携带整合的SV40的细胞变得对用UV或MNNG处理高度敏感[Winocour等人，1992]。
3.癌变细胞丧失了在软琼脂中生长的能力，而这是癌变细胞的典型的特征。
4.用下列方法测得，细胞表现出细胞程序死亡的表型：
a)细胞周期模式被改变，在AAV/neo细胞中自发地出现按程序死亡的细胞，而且在用DNA破坏剂处理之后水平上升。(图1A，表3A和图1B，表3B)。
b)染色质和细胞质的凝聚和断裂(fragmentation)。通过用吖啶橙染色，监测染色质的凝聚和断裂。溴化乙锭不会对这些细胞进行染色。
吖啶橙会被活细胞和死细胞摄取，产生荧光绿信号；而溴化乙锭仅被无活力的细胞摄取并产生亮红色的荧光。这种双重染色系统提供了一种区分死细胞和活细胞，以及在丧失膜完整性之前发生细胞程序死亡的细胞。在活细胞中的正常核或程序死亡的核发出亮绿色荧光。形成鲜明对比的是，在死细胞中的正常核和程序死亡核发出亮红色荧光。
一部分经证实的细胞表现出细胞程序死亡的核，在用吖啶橙染色之后显示出凝聚的染色质。此外，细胞显示出强烈的细胞质收缩。通常，核被碎裂成多个微核。这些细胞发生了程序死亡并且没有丧失其膜完整性。溴化乙锭不能渗透入这些细胞，因此细胞仍然是活的。在处理的AAV阳性细胞中发现了大量活的程序死亡细胞核，这与处理的(7.5微克/毫升MNNG)和对照的CO60细胞中很低的百分比不同。在所有AAV/neo细胞系中都重复相同的染色模式。因此，这种细胞程序死亡表型是所有AAV/neo细胞的共同特征。
C)染色体DNA的断裂：
已表明，细胞程序死亡与DNA断裂有关。这种检测细胞程序死亡的方法的基础是，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)与DNA 3′-OH端的特异性结合，从而开始聚脱氧核苷酸聚合物的合成[Gavrieli等人，1992]。通过将生物素化的脱氧尿苷加至固定的细胞，可使用TDT将这些核苷酸掺入到DNA断裂的位置。信号通过FITC-亲和素结合而放大，从而能够通过荧光显微镜而鉴别出。在所有的AAV/neo细胞中，申请人都能检测到区别性的核染色模式，这与染色质在程序死亡细胞中的典型降解是直接相关的。因为这一反应是特异的，所以只有程序死亡的细胞核被染色。作为该技术有效性的阳性对照，申请人使用被DNase处理的CO60细胞核。
在用2.5微克/毫升MNNG处理后48显示，AVV阳性克隆C9-2和C9-3显示出明亮的核荧光，而未经处理的对照仅显示出浅的背景荧光。申请人看到了特征性的降解，即核被降解成多个高荧光的微核。获得的荧光与阳性对照相似。
未处理的AAV/neo细胞和对照以及处理过的CO60(7.5微克/毫升MNNG)不显示任何荧光信号。这种核降解模式在所有测试的AAV/neo细胞系(约20个)中都出现，但是在不同的细胞系中断裂的程度不同。
出乎意料的是，命名为C9-3-2和C9-3-12的回复体(revertant)细胞(它们是根据丧失对G418的抗性而选择出的，而且它们丧失了整合的AAV序列[Burstyn，1993])，在用2.5微克/毫升或5微克/毫升MNNG处理之后，仍然维持它们的程序死亡表型。
用FACS、Giemsa染色和从高分子量细胞DNA中电泳分离核小体DNA片段进行的进一步分析，支持这些结果。
在AAV/neo细胞中整合的AAV(实施例6和7)
对来自中国仓鼠A20至A29、9-1至9-5和小鼠DA3衍生系的细胞提取物，通过用抗-Rep抗体免疫印迹而进行的是否表达rep蛋白的分析表明，在所有的细胞系中都不存在真的Rep产物。在某些细胞系中，有一短蛋白(可能是截短的蛋白质)与抗-Rep抗体反应[Winocour等人，1992]。
对于大多数细胞系是否存在完整rep启动子区域，PCR分析表明，在大多数细胞系中，Rep蛋白的启动子区域因AAV序列的缺失、插入或重排而重新组织(reorganized)，因而消除了真Rep蛋白的表达。
申请人着重对衍生自CO60细胞的一个中国仓鼠细胞系9-3的分析(图3)。整合的AAV在该细胞中发生了复制，而携带AAV的染色体有两个整合了AAV的区域。AAV的复制可以是由AAV整合后中国仓鼠基因组中发生的大量重排事件所导致的。在目前所有通过原位杂交而研究的中国仓鼠细胞系中(6个独立的细胞系)，携带整合的AAV的染色体都被改变，而且在许多方面与典型的中国仓鼠染色体不同，因此不能建立染色体的等同性。
整合的AAV和9-3的侧翼细胞序列被克隆入噬菌体(图3)。如图3所示，病毒基因组发生了若干变化。在AAV p5启动子下游的序列被缺失了，并被细胞片段“CHINT”所替换。此外，观察到了AAV/neo基因组5′部分中的缺失和重排。与之相反，编码Neo基因的区域和病毒基因组的3′端保持完整。(类似的改变也在所有测试的AA中国仓鼠和小鼠细胞系中观察到)。
“CHINT”序列被用作在不同AAV/neo中国仓鼠克隆中分析AAV整合位点的探针(图2)。在几个AAV/neo克隆中有该片段的偏移现象，这暗示在AAV整合之后该片段的大小发生了改变。某些偏移的条带也与AAV探针杂交，这表明AAV的确整合入该区域。来自衍生自侧翼细胞序列(图3)的亚克隆质粒pSL9-6的探针，与小鼠DA3 AAV/neo细胞杂交，在大多数情况下这与AAV整合有关。这些结果暗示，AAV在中国仓鼠中的整合位点可能与在小鼠中位点相似。
用Genetic Computer Group Inc.软件进行的序列比较表明，CHINT序列与人染色体19q13.3中的序列有58.3％同源性。该人序列是已被自动测序和分析的106Kb片段的一部分[Martin-Gallardo等人，1992](GENBANK登录号：M89651)。与CHINT序列有同源性的区域是编码人型蛋白质磷酸酶2C(pp2cα)的基因的一部分。根据该基因的cDNA序列，与CHINT同源的确切区域被确定为PP2Cα的5′UTR的上游(表5)(GENBANK登录号：人PP2CαS87759，兔PP2Cα S87757)。
用两个PP2Cα引物(引物1和4，方法如下面所述)获得一PCR片段，再用该PCR片段来探测9-3的cDNA，发现一个XbaI片段与AAV、CHINT和PP2Cα杂交，一个EcoRI片段与CO60 DNA中的PP2Cα和CHINT杂交。因此，PP2Cα在CO60细胞中的位置的确与CHINT非常靠近，而且位于9-3细胞的整合位点。原位杂交证实了这一结论(图4A)。
在中国仓鼠(CO60和OD4)以及小鼠细胞(DA3)中，一部分PP2Cα序列与位于pSL9-6中的CHINT仓鼠序列(图3)相邻，而pSL9-6来自AAV整合位点的λ克隆。因此在正常的中国仓鼠和小鼠染色体中，PP2Cα事实上靠得非常紧密，与整合的AVV周围的序列相距小于4Kb(图4B)。
此外，在携带整合的AAV基因组的小鼠DA3细胞中，AAV序列与PP2Cα或片段6相关，或者与两者相关(图5)。整合的AAV是从DA3J7(λDA37A)中克隆出，而且部分噬菌体被测序，如图中所示。发现的同源性针对在λSL9-1质粒中(图3)整合的AAV中的一个区域(图3)和针对粘粒MMDA中人染色体19q13.3位置23467-23715(登录号#M63796)，该片段被自动测序并在MMDBC位置59770含有PP2Cα的第一个编码外显子(GenBank登录号#M89657)，以及35-3.seg和35-T7，如图3所示。MMDA和MMDBC是在相同毗连群中的两个粘粒。(在下面实施例10中有更多有关序列的详情)。
对于PP2Cα在细胞中的角色或其天然底物的情况了解甚少，因为缺乏特异性的PP2Cα抑制物。在粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中已表明，PP2Cα-样酶对热激反应以及渗透压调节中是至关重要的[Shiozaki，1995；Shiozaki，1994]。在酿酒酵母中，pp2cα-样活性涉及tRNA剪接的调节和细胞分离[Robinson等人，1994]。在神经细胞中，pp2cα在调节Ca++/钙调蛋白依赖型蛋白激酶II的Ca++-非依赖性活性(Ca++-independent activity)中发挥作用[Fukugana，1993]。除此之外，有关pp2cα的信息是匮乏的。
pp2cα本身可以是细胞标记物。已有技术没有提供pp2cα在肿瘤细胞中表达方面的信息。有一篇出版物暗示pp2cα可能在肌原性(myogenic)分化中发挥作用[Ohishi，1992]。以存在10个氨基酸的基序(它似乎还存在于其他的转录因子中)为根据，pp2cα似乎象转录因子那样发挥作用，而且可能在特异性生长条件和组织中调控细胞中的转录。因此，它的行为象E2F，它是一个主要的转录因子，而且当不适当地表达时能作为癌基因或作为转录抑制因子发挥作用[Weinberg，1996]。
出乎意料的是，对AAV/neo细胞中PP2Cα mRNA的分析表明，在用DNA破坏剂处理之后，基因的转录被减少，这与亲代的SV40转化的细胞是相反的，在亲代细胞中，在处理之后PP2Cα被诱导(图6)。
下列是杂交信号的密度测定分析结果：
   CO60 C   CO60 T  CO60 T/CO60 C   C9-3C   C9-3T  C9-3T/C9-3C
PP2Cα/rRNA     0.15    0.31     2.06   0.26    0.15     0.57
在用MNNG处理之后，C9-3中PP2Cα的转录下降，这与亲代SV40转化细胞(其中在处理之后PP2Cα被诱导)相反。
编码pp2cα的完整cDNA是从cDNA文库(由M.Oren提供，the WeizmannInstitute of Science，Rehovot)中克隆出的，并将PP2Cα克隆稳定地引入在AAV整合后丧失癌变表型的AAV/neo细胞中。在PP2Cα克隆于PP2Cα neo细胞中表达之后，癌变特征被挽救，细胞重新获得了癌变细胞的特征，在软琼脂中生长并丧失了程序死亡表型，但是细胞不能繁殖。用含有无关基因截短的cDNA的对照质粒并以相同效率转染的类似细胞，并没有重新获得在软琼脂中生长的能力。
根据这些结果，很明显，PP2Cα在癌变细胞的引发和/或维持中起关键作用。应指出，尽管细胞在软琼脂中生长，但是申请人不能分离出活的细胞，这暗示细胞的失衡表达导致异常的生长和细胞死亡。
PP2Cα似乎在发育中是重要的。在进化中基因和蛋白质的高保守性，以及包括5′UTR处IRES(内部核糖体进入位点)在内的特异性控制信号都支持这一观点。其他实验室的发现，即AAV感染特异性地影响肿瘤细胞，可能有2种解释：1)病毒不感染正常细胞或不能以特异的方式整合人它们的基因组。2)或者，如果在正常细胞中AAV整合入PP2Cα，那么该基因的破坏可能不影响它们，或者可能是致命的从而使这些细胞不能存活。仅一个PP2Cα等位基因失活这一事实，造成了癌变表型中的变化，而引入有功能的PP2CαcDNA克隆可恢复癌变表型，这表明了PP2Cα的重要性。申请人还注意到，在衍生自9-3的高肿瘤发生的中国仓鼠细胞中，携带PP2Cα的整个染色体被复制了3、4、甚至5次。
在人中，在相同的染色体上，在PP2Cα附近有一个重要的肿瘤特异性标记物，它被称为癌胚抗原(cancer embryonic antigen，CEA)并出现在大多数肿瘤细胞中。这两个基因都被定位于染色体19q13.3。将治疗针对携带标记物如CEA的细胞应有帮助。(可能CEA本身与癌症并不相关，但是它与PP2Cα的增强表达或含有这两个基因的染色体区域的复制有关)。
上述的论述提供了将PP2C用于癌症检测和治疗的事实基础。本发明的使用方法和应用可由下列非限定性的实施例和附图显示。
实施例
方法
分子生物学的通用方法：本领域中已知的和没有具体描述的分子生物学标准技术一般按照下列文献：Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Cold SpringHarbor Laboratory，New York，1992)，和Ausubel等人，《分子生物学的现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1994)。聚合酶链反应(PCR)一般按《PCR方案：方法和应用指南》(PCRProtocols：A Guide To Methods and Applications)，Academic Press，San Diego，CA(1990)。
涉及其他核酸技术的反应和操作，除非另外说明，一般按Sambrook等人，1989，《分子克隆：实验室手册》(Cold Spring Harbor Laboratory，New York)所述的方法，以及美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法进行。这些文献在此引用作为参考。
抗体捕获分析：该方法的步骤是：(1)将抗原结合于固相；(2)将抗体结合于抗原；和(3)将标记的二级抗体结合于复合物。通过将恒定量的rpp2cα结合于固相，申请人已用这种技术检测和定量分析了克隆过程中的单克隆抗体，并比较了来自不同兔和伤流(bleeding)的多克隆抗体。该分析还可用于在细胞培养物和组织的粗提取物中检测pp2cαα。
免疫印迹：该方法的步骤是：(1)制备抗原样品；组织提取物、细胞培养提取物或rpp2cα制剂；(2)用SDS-PAGE将样品分离开；(3)将分离开的蛋白质转移至硝酸纤维素膜；(4)封闭膜上的非特异性位点；(5)与多克隆或单克隆抗体一起温育；和(6)用标记的二级抗体进行检测。申请人将免疫印迹法用于对本文上述的各抗体进行了定性研究，并用于在细胞和组织提取物中检测pp2cαα。[Harlow和Lane]
免疫沉淀：该方法的步骤是：(1)将单克隆抗体固定于固相基质上(抗-鼠IgG偶联的琼脂糖)；(2)将抗原结合于固定化的抗体；(3)用SDS-PAGE将结合的蛋白质分离开；和(4)免疫印迹和用亲和纯化的兔多克隆抗体检测抗原。已用该方法来估计所发现的不同大小的pp2cα和β多肽的数量和分子量。
pp2cα活性分析：用通用程序从小鼠细胞中纯化出PP2Cα基因产物，通过其使[32P]酪蛋白脱磷酸化的能力而分析活性[McGowan和Cohen，1988]。
反向PCR的寡聚核苷酸引物：用兔PP2Cα cDNA特异性引物进行逆转录和PCR。这些引物是从General Biotechnology，Rehovot获得的，并且不经进一步纯化就使用。引物位置是根据Tamura等人[1989]报道的、在Genbank中的大鼠肾PP2Cα cDNA核苷酸序列(登录号：Gb ro：Ratpp2c，J04503)。在大鼠PP2CαcDNA上的每个引物的大约位置是：
引物#1：5′-AGGATCAAGT CATAATGGGA-3′(74-93核苷酸，有义)(SEQ ID NO：4)
引物#4：5′-GCTGGAGTCT GATTTACAAC-3′(1454-1473核苷酸，反义)(SEQ IDNO：5)
反义RNA：合成与PP2Cα基因互补的、人工反义RNA，再用Inouye的方法[1988]转染鼠细胞。
用示差法鉴别基因表达中独特的改变：为了检测由AAV整合所介导的细胞基因表达方面的改变，使用示差法[Liang和Pardee，1992；McClelliand等人，1995]。该方法用于在—对哺乳动物细胞群(如感染的和未感染的细胞)的约15,000个各种mRNA中，鉴别差异表达的基因，并回收其cDNA和基因组克隆。该方法策略由下列步骤构成：(1)用一套锚定引物在组份中进行逆转录，(2)用一套任意引物和锚定引物，通过标记的PCR从各组份中扩增出cDNA，(3)在测序凝胶上电泳分离得到的片段，(4)对在两种情况下不同的片段进行再扩增、克隆和测序，和(5)用独立的RNA分析技术证实差异表达。
更具体地，按Sambrook等人所述，从细胞中分离出总RNA。用设计成与聚(A)尾部5′边界结合的寡聚dT引物，对RNA进行逆转录。用寡聚dT引物和第二种序列任意的10聚体引物，通过PCR反应扩增cDNA。在[35S]-dATP存在下，并在下列条件下进行40个循环的PCR：94℃，30秒；42℃，60秒；和72℃，30秒。扩增的cDNA在6％测序凝胶上分离，然后对X光胶片进行曝光。
从凝胶上切取感兴趣的条带(显示有差别的条带)，用产生最初PCR产物的相同引物再进行扩增。为了证实各候选条带的差异调控，进行Northern印迹杂交。感兴趣的片段用TA克隆试剂盒进行克隆，然后进行测序。用该方法检测出的基因与来自合适细胞的Northern印迹进行杂交。
在潜伏感染的细胞中染色质的结构：更高级的染色质结构会影响细胞基因的转录。以它们对DNAse I或微球菌核酸酶消化的敏感度的增加来判断，转录活跃的染色质区域比含有转录不活跃基因的染色质要包裹得较不紧密。部分纯化染色质，并用微球菌核酸酶进行消化[Roth等人，1990]。纯化的DNA片断用单一限制性酶进行消化，以产生一系列片段，这些片段的一端由微球菌核酸酶界定而另一端由限制性酶界定。这些片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜，用标记的DNA片段进行探测。类似地，纯化和处理裸露的DNA。可通过比较来自裸露DNA和染色质的片段，推导出核小体位置和核酸酶敏感区域。
基因的甲基化状态可表示染色质的变化。用甲基化分析法[Kafri等人，1992]测定基因特异性的DNA甲基化。在该方法中，用甲基-敏感性酶如HpaII或HhaI消化总细胞DNA，用侧翼的寡核苷酸引物扩增那些含有这些位点的DNA特异片段。如果特异性位点是甲基化的，那么扩增可正常地进行。另一方面，存在未甲基化的位点会导致片段被消化，随后就不能看到扩增产物。当适当校准时，该方法在大范围的DNA浓度下是线性的，因而可用于准确地测量特异位点处的DNA甲基化程度。
实施例1对AAV进行研究的实施例A.用AAV感染小鼠细胞：
A1.产生具有稳定整合的AAV的小鼠细胞：
用稍加改变的Winocour等人[1992]的方法，用JDT277 AAV/neo杂交病毒感染DA3细胞。在G418存在下，分离出单个克隆并通过一系列传代而扩增。抗性细胞系被命名为DA3J。
DA3细胞系衍生自与BALB/c小鼠同系的体内D1-DMBA-3哺乳动物肿瘤。DA3细胞系在BALB/c小鼠中以相同的生长动力学方式产生肿瘤，而且在其表面表达与亲代相同的肿瘤相关抗原(Ag)。细胞表达对肿瘤细胞特异的标记物，并且停止表达正常乳房细胞典型的特异性抗原[Sotomayor等人，1991]。
为了评估AAV对小鼠细胞的影响，用JDT277 AAV/neo杂交病毒[Tratschin，1985]感染DA3细胞。JDT277病毒含有部分AAV2基因组(编码Rep蛋白)、AAV末端反向重复序列(TIR)和赋予G418抗性的原核新霉素磷酸转移酶基因(neo)。neo基因被插入在核苷酸1882位，造成羧基端被截短的Rep蛋白。Rep蛋白的截短并不影响AAV/neo病毒在被腺病毒共感染的人细胞中进行复制的能力。
分离单个克隆，然后在G418存在下通过系列传代而扩增。抗性细胞被命名为DA35。
A2.在DA3J细胞中AAV基因组的定性研究
a.Southern分析
从DA3J1-DA3J7克隆中分离出的基因组DNA用不同的限制性酶(BglII或EcoRI)消化，电泳并与放射性标记的AAV DNA杂交。在每个克隆中的杂交模式不同，这可能是由AAV基因组的重排造成的。事实上，已知AAV DNA的整合常伴随着病毒序列中的改变[Walz和Schlehofer，1992]。
b.PCR分析
为了确定rep启动子和ORF是否存在于DA3J细胞系中，用不同的与AAV和neo序列互补的寡核苷酸引物，对13个克隆(DA3J1-DA3J13)进行PCR反应。结果表明，在每个克隆中的病毒序列部分有一些被中断。在所有的被检测细胞系中，AAV rep ORF是不完整的，因此危害了AAV特异性蛋白质的表达。
在两个克隆DA3J3和DA3J4中，有两个AAV分子以头-尾(head-to-tail)方式整合人宿主基因组。该发现与较早时候的研究是相符的，即至少在某些情况下，AAV DNA以一个以上病毒基因组的头-尾多联体形式，通过病毒分子的末端序列而整合人中国仓鼠宿主DNA中[Cheung等人，1980；Walz和Schlehofer，1992]。在一个与下面实施例7类似的分析方法中，DA3J7中的整合AAV在293细胞中作为SV40复制的沉默子。
A3.AAV基因在感染的DA3J细胞中的表达
根据Winocour等人[1992]的方法，制备来自感染的DA3的细胞提取物。提取物样品在12％PAGE上进行电泳，然后用抗-Rep抗体进行免疫印迹。结果显示，两个主要的Rep蛋白Rep78和Rep68在所有感染的细胞中都没有表达，而小Rep蛋白中的一种(即Rep40)，却在2个克隆(DA3J11和DA3J13)中表达。可根据PCR分析(该分析显示，在所有检测的细胞系中rep ORF都不完整)，可预期该结果。B.位点特异件整合
B1.AAV在小鼠细胞中的整合位点与AAV在中国仓鼠细胞中的整合位点之间的比较：
用BglII或EcoRI消化来自亲代DA3和DA3J克隆(DA3 J1-DA3J7)的基因组DNA。在电泳之后，将印迹与来自病毒/细胞接界(junction)(分离自C9-3[psL9-6])的细胞序列进行一次杂交，而且与放射性标记的AAV DNA进行一次杂交。在3个细胞系(DA3J3、DA3J4和DA3J6)中，细胞探针和AAV探针与共同的条带杂交。用PP2Cα探针时，申请人发现在BglII消化的DNA中AAV和PP2Cα两者都与相同的条带杂交。因此，在中国仓鼠和小鼠中，AAV都总是整合在PP2Cα附近的相同位点。应注意，在包括亲代DA3细胞在内的所有细胞系中，PP2Cα和细胞克隆6探针都与相同的整合前位点的条带杂交。C.AAV对细胞表型的影响
在感染的DA3与亲代细胞之间，比较下列细胞学特性：
a.铺平板效率
如表1所示，与亲代DA3细胞的铺平板效率相比，DA3J细胞的铺平板效率下降了，为11％(DA3J2)至54％(DA3J3)。
b.对紫外线辐射的敏感度
如表2所示，与亲代DA3细胞相比，DA3J细胞对紫外线辐射的敏感度增加了。与DA3细胞相比，DA3J细胞的存活率下降了5％-55％。
这些结果与其他研究相符，这些研究显示，与未感染的细胞相比，AAV感染的细胞(Hela，CO60)会表现出铺平板效率下降，和对紫外线辐射敏感度上升。[Walz和Schlehofer，1992；Winocour等人，1992]
有趣的是，应注意DA3J3表现出最低的铺平板效率和最高的对紫外线辐射的敏感度。这可能是因为DA3J3含有两个整合的AAV分子，而DA3J1和DA3J2只含有一个AAV分子。
c.FACS分析
按Vindelov等人[Vindelov等人，1983]的方法，对DA3、DA3J1、DA3J2和DA3J3进行FACS分析。在该程序中，没有观察到亲代DA3细胞和DA3J细胞之间的明显不同之处。
实施例2
PP2Cα的克隆和表达
从大鼠cDNA文库中分离PP2Cα的全长编码区域。将cDNA克隆入表达载体pET-17b(pET System，Novagen)的Kpnl和Notl限制性位点之间。用表达质粒转化的大肠杆菌细胞(BL21-DE3)产生高水平的重组pp2cα(rpp2cα)，在SDS-PAGE上可观察到非常明显的约45千道尔顿的条带。
分析pp2cα活性：用McGowan和Cohen[Methods.Enzymol.159：416-429，1988]的方法测定，在携带重组质粒的培养物粗提取物中发现了蛋白质磷酸酶活性。
pp2cα的纯化：过夜培养物在含有氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃生长。
收获细胞，然后进行超声波破碎。离心分离后的超声波处理液，再用硫酸铵沉淀法和DEAE-葡聚糖凝胶上的阴离子交换色谱进行纯化。
实施例3
抗体的生产和分析
在兔中制备多克隆抗体：含有约250-500微克rpp2cα的粗细胞提取物，在12％制备性SDS-PAGE(200×150×1.5毫米)上进行分离。切下通过侧带(side-strip)染色法而确定的rpp2cα条带，并储存在-20℃。对于在兔中注射，通过反复通过18规号的注射器针头而使条带碎化，然后与等体积的Freund佐剂混合。用1条SDS-PAGE条带所产生的4毫升乳剂，被用于注射2只兔子。预放血的兔子，在4周间隔进行皮下注射。对于初次免疫反应，使用完全Freund佐剂，而所有其他注射使用不完全的Freund佐剂。每隔2周对动物进行放血，通过离心分离出血清。抗体被命名为351和343。除非另外说明，此处所述的指定工作使用351。
单克隆抗体制备：用本文上述的鼠杂交瘤生产法，将纯化的rpp2cα用于制备单克隆抗体。通过抗体捕获分析法(参见下面内容)和免疫荧光细胞染色法，筛选出杂交瘤克隆。用相同方法，对阳性克隆进行两轮克隆和筛选。最后，选择了8个阳性克隆用于以后研究。以组织培养上清液和腹水形式，收集这些克隆的抗体。
开发针对pp2cα和pp2cβ的抗体
(1)产生了针对羧基端肽(10个氨基酸)的兔多克隆抗体(命名为801)。该抗体识别pp2cα而不识别pp2cβ。
抗体在兔中产生并对rpp2cα进行亲和纯化。该抗体在大多数组织化学分析中使用。
对pp2cβ的羧基端PNKDNDGGA(SEQ ID NO：3)，产生了一兔多克隆抗体。
(2)对rpp2cα出生了兔多克隆抗体351，它识别α和β两者上的表位。
(3)对rpp2cα产生了8个独立的单克隆抗体，并通过它们在ELISA中与rpp2cα的反应情况以及它们识别pp2c(α和β)的能力(通过Western印迹和免疫沉淀对肝癌细胞进行的免疫荧光染色)而加以筛选和选择。
表4提供了用抗体捕获分析、免疫印迹和免疫沉淀法，对8种单克隆抗体进行定性的结果。组合使用这些分析方法可以分离出具有本发明适当特异性的单克隆抗体。
实施例4
在正常乳房组织和乳房肿瘤中表达pp2cα：从正常乳房和乳房癌获得的石蜡块，用对pp2cα特异的801抗体进行染色，然后用偶联于过氧化物酶的二级抗体进行染色。底物是DAB。样品用亚甲蓝进行复染。在几个试验中，使用的抗体是对pp2cα特异的单克隆抗体2A3。放大倍数是400倍。还测试了正常的肝和肝癌组织，以及正常的结肠和结肠癌组织。
在正常的和增生性的乳房样本中，核很明显地被抗体染色。在乳房癌中，在细胞质中有明显的染色。在侵袭性癌中，没有观察到被抗-pp2cα染色的情况。有趣的是，在肝组织培养细胞中，当用801或2A3抗体进行染色时，细胞表面被染色，这表明PP2Cα基因产物是表达在细胞膜上的。在正常的肝细胞中，细胞质被非常显著地染色，而且有少数非常强的核区域被染色。在肝癌中，观察到较淡的细胞质染色，而且核染色程度更低。
应注意，随着细胞在复染中恶性表现程度的发展，似乎存在有差别的pp2cα丢失。
实施例5
在正常的结直肠(colorectal)组织和结直肠肿瘤中pp2cα的表达：通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，将蛋白质磷酸酶2Cα(pp2cα)的表达水平，在结直肠癌组织中与正常结肠组织进行比较，在中国仓鼠胚胎(CHE)细胞系中与在非许可的SV40转化的中国仓鼠细胞(CO60)进行比较，从而加以评估。
在作为反义引物的0.5M寡聚(dT)(15聚体)存在下，将1微克总RNA样品在65℃下变性10分钟，然后立刻在冰上冷却。在50微升反应混合物中于37℃，60分钟之后，获得了第一条cDNA链，其中反应混合物含有：0.25mMdNTP(Promega)、10mMDTT、20URNasin(RNA酶蛋白质抑制剂)、50UMMLV逆转录酶和5微升10×反应缓冲液(STRATAGENE)。在95℃失活10分钟之后，将3微升形成的cDNA用于100微升PCR反应，其中含有：0.025mMdNTP(PROMEGA)、10mM DTT、20U RNasin、50U MMLV逆转录酶和5微升10×反应缓冲液(STRATAGENE)。
在95℃失活10分钟之后，将3微升形成的cDNA用于100微升PCR反应，其中含有：0.025mM dNTP(PROMEGA)、0.5μM PP2Cα有义引物5′-GAAGTAGTCG ACACCTGT-3′(SEQ ID NO：6)、0.5μM PP2Cα反义引物5′-GCTGGAGTCT GATTTACAAC-3′(SEQ ID NO：5)、10×反应缓冲液、2.5毫摩氯化镁和2.5单位ABTaq聚合酶(Advanced BioTechnology)。在下列条件下进行35个循环的PCR：94℃，1分钟；60℃，1分钟；和72℃，1分钟，然后在72℃进行10分钟。将相同的cDNA用作模板，在β-肌动蛋白引物5′-GTTTGAGACCTTCAACACCC C-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GTGGCCATCT CTTGCTCGAA GTC-3′(SEQ IDNO：8)存在下，在相同的PCR反应混合物中进行平行PCR反应。在20、25、30和35个循环之后，取样并进行凝胶电泳分析。
结果
用PP2Cα特异性寡核苷酸引物，产生具有预期的大小为480bp的RT-PCR产物。RT-PCR反应显示，在8个样品中的7个，PP2Cα mRNA在正常结肠组织中的水平明显高于在相邻的结肠肿瘤组织中的水平(图7)。在CHE细胞系中的PP2Cα表达水平高于CO60细胞系中的水平(图8)。
实施例6
载体和携带载体的转化细胞的产生
在诱导型tet启动子下表达PP2CαmRNA：如Gossen和Bujard[1992]所述，在哺乳动物细胞中，有义和反义PP2CαmRNA的表达取决于四环素-调控的诱导型基因表达系统。
该系统依赖于四环素-调控的反式激活蛋白(tTA)融合蛋白的组成型表达，该融合蛋白将四环素抑制蛋白与单纯疱疹病毒VP16的激活结构域合并在在一起。在大鼠成纤维细胞和HeLa细胞中，tTA被组成型地表达。在这两个细胞系中，tTA会刺激衍生自人巨细胞病毒启动子和四环素操纵基因的最小启动子(minimalpromoter)的转录。一旦加入四环素，由tTA导致的转录刺激作用就被抑制。
用表达载体对两个细胞系进行稳定转染，从而制备克隆。其中表达载体含有在tTA-依赖性启动子控制下的，处于有义和反义方向的PP2Cα mRNA。
表达载本的构建：构建用作表达载体的质粒的过程包括下列步骤：
1.制备编码大鼠PP2C αmRNA的DNA片段。
2.将大鼠PP2Cα cDNA克隆入含tTA的质粒中。
3.通过限制性图谱分析证实质粒。
4.对PP2Cα cDNA插入片段进行DNA测序分析。
制备编码大鼠PP2Cα mRNA的DNA片段：通过热循环扩增法而制备编码大鼠PP2Cα mRNA的DNA片段。用于扩增反应的模板是质粒skPP2C的插入片段(克隆入sk BLUESCRIPT质粒中的PP2Cα cDNA)。
用于扩增反应的上游引物含有编码大鼠PP2Cα前6个氨基酸(Met Gly Ala PheLeu Asp；SEQ ID NO：9)的序列。上游引物的序列如下：5′-CGGGATCCGCATGGGAGCAT TTTTAGAC-3′(SEQ ID NO：10)。
用于扩增反应的下游引物含有编码大鼠PP2Cα最后5个氨基酸和终止密码子序列(Thr Asp Asp Met Trp***；SEQ ID NO：11)的序列。下游引物的序列如下：5′-CGCGGATCCT TACCACATAT CATCAGT-3′(SEQ ID NO：12)。
通过在两个末端引入BamHI限制性位点而修饰DNA片段的末端。
将大鼠PP2Cα cDNA克隆入含tTA的质粒中：在扩增了大鼠PP2Cα cDNA之后，用限制性酶BamHI酶切DNA片段，并克隆入质粒pUHD10-3[Gossen和Bujard，1992]中四环素响应启动子的下游。
通过限制性图谱分析证实质粒：通过限制性图谱确定cDNA插入片段相对于启动子的取向。选择出以有义方向含有cDNA的质粒(pYM001)和以反义方向含有cDNA的质粒(pYM002)(图9)。
对PP2Cα cDNA插入片段进行DNA测序分析：质粒pYM001的DNA插入片段的序列，通过自动DNA序列分析加以确定。用于测序的引物与用于克隆的引物是相同的。该分析的结果表明，克隆的片段序列与大鼠PP2Cα的序列是相同的，而且在扩增反应中没有引入突变。
转染：通过与质粒pBSpac一起进行CaPO4共沉淀，将质粒pYM001和pYM002引入组成型地表达tTA的大鼠成纤维细胞和HeLa细胞系中。质粒pBSpac含有赋予嘌呤霉素抗性的遗传选择标记物。
在转染后24至48小时，细胞以1∶10进行传代并在选择性培养基中生长。用于HeLa和大鼠成纤维细胞系的选择性培养基分别含有0.3微克/毫升和1微克/毫升嘌呤霉素。在2至3周之后，分离出克隆，在24孔培养板上生长至汇合，然后转移至10厘米培养皿中，生长至70-90％汇合度，在90％胎牛血清10％DMSO中进行冰冻。在这些克隆中，在去除了Tet之后，我们观察到，在携带pYM001的克隆中诱导了PP2Cα mRNA，而在携带反义质粒pYM002的克隆中内源性PP2Cα mRNA减少了。
实施例7
整合的AAV在PP2Cα表达调节中的作用
该工作不确定AAV在基因组中的确切整合位点。此外，数据也不提供确切入的整合位点，该位点也位于相同的染色体区域19q13.3但不在106Kb粘粒中。申请人假设，基于RNA和特异性蛋白质的数据，AAV整合位点或者在编码pp2cα的基因中，或者其调控区域与PP2Cα有某种方式相关。例如，rep可能与pp2cα蛋白相互作用，而与rep和PP2Cα相连的AAV基因组可能与PP2Cα调控区域相关。
在稳定的细胞系中，SV40扩增因重组AAV/neo病毒的感染而受到抑制，因而申请人不能检测到rep或rep编码序列的表达，因此申请人寻找具有抑制活性的序列。该序列位于所有携带AAV的细胞中，而不论该细胞的来源是中国仓鼠还是小鼠。
在整合的AAV序列与携带AAV基因组的细胞中PP2Cα活性调节之间的功能相关性，还没有显现出来。但是清楚的是，作为AAV整合的结果，会有本文所描述的癌变特征的改变。
根据下面描述的研究，除了在PP2Cα附近发生的位点特异性整合之外，有可能AAV序列在癌变表型的转变中起着某些重要作用。
在SV40转化的中国仓鼠细胞(细胞系9-3和其他细胞系)中整合的AAV负责抑制致癌剂诱导的SV40扩增。负责抑制SV40扩增的病毒元件(沉默子，SEQ IDNO：13)用针对SV40复制的瞬时分析[Yang等人1995]进行界定，结果表明AAVrep蛋白质负责抑制SV40复制。该分析以携带SV40载体的人肾细胞系293的转染为基础，其中该SV40载体含有T抗原的编码区域和病毒的复制起点，并且用几个不同的衍生自9-3、SV40转化的且含有整合的AAV和DA357的中国仓鼠胚细胞(这是携带整合的AAV的小鼠细胞系，其中在AAV整合之后癌变表型被改变)中AAV整合位置附近的构建物进行共转染。
用不同的构建物，申请人成功地界定了赋予抑制作用的最小AAV元件。该元件由AAV基因组的64个核苷酸构成(核苷酸125-189)。ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGGAGGGGTGGAGTCGTGAC GTGAATTACG TCATAGGGTT  AGGG
该元件被命名为SV40沉默子(SEQ ID NO：13)，尽管在另一例子中，是仅21个核苷酸负责，即核苷酸125-145(SEQ ID NO：14)。
SV40载体在293细胞中的复制，导致了没有被甲基化的DNA，因此会被DpnII(一种仅切割未甲基化DNA的酶)切割。DpnII消化的DNA在凝胶上被分开，印迹并与SV40探针杂交。结果示于图12。
印迹提供了下列情况：
泳道1：用pSK1和pAV2(一种含有完整的AAV基因组并表达rep蛋白的质粒)进行的共转染。注意，SV40复制被抑制。
泳道2：用SV40质粒pSK1 SV40复制物进行的转染。注意，观察到SV40模板的复制。
泳道3：用pSVK1和携带AAV基因组的138bp(核苷酸125-263)的质粒进行的共转染。SV40的复制被该元件所抑制。
泳道4：用pSVK1和pSL9-6(非AAV DNA序列)进行的共转染。
因此，SV40在293细胞中的复制被rep和沉默子元件所抑制。
类似地，当细胞用仅含有125-145(SV40小沉默子，SEQ ID NO：14)的质粒进行转染时，SV40的复制也被抑制。
5′A124C125TCCCATCA CTAGGGGTTC CT145
在对照试验中，申请人用衍生自整合的AAV和横跨整合AAV的细胞序列的其他序列，如pSL9-6和其他序列(参见图12，泳道4)，进行转染。没有观察到SV40 DNA复制受到抑制。
用来自鼠DA3J7细胞系的、含有整合的AAV和侧翼细胞序列的λ克隆时，也观察到类似的SV40复制受抑制的情况。该克隆含有作为沉默子的64个核苷酸。
注意，在瞬时分析中通过Rep表达以及通过64bp沉默子元件，可以在293细胞中抑制SV40的复制。
丢失了整合AAV的回复体重新获得了扩增SV40的能力。在一个回复体系C9-3-2中，申请人已显示了该回复体丧失了含有整合AAV的整个染色体。申请人通过FISH显示了该结果，其中非常有特征的、整合有AAV的异常染色体消失了。
可以作出对上述观察结果的假设，但是应理解，本发明并不局限于这样的一种作用方式。申请人提出，Rep蛋白[Heilbronn，Schlehofer等人，1983；Kleinschmidt等人，1995；Yang等人，1995]和沉默子元件，通过直接地或间接地与类似蛋白或元件(可能是PP2Cα)的相互作用，而抑制SV40的复制。
有可能AAV基因组的21bp(小沉默子)也通过与控制区域的相互作用和激活作用而调控PP2Cα活性。或者，沉默子能作为显性的负元件，直接地和/或间接地与SV40复制有关的蛋白发生作用。PP2C可通过脱磷酸化而调节这些蛋白质的作用。这种相互影响的一个例子是DNA聚合酶α引发酶。有可能rep蛋白质也直接与这种相互作用有关。
在CO60细胞中致癌剂诱导的扩增过程中，似乎DNA聚合酶α引发酶脱磷酸化负责引发SV40 DNA的复制。此外，这种磷酸化-脱磷酸化过程受细胞周期的控制。因此，PP2Cα可调控DNA聚合酶α引发酶的活性，因直接或间接地结合于rep而造成的PP2Cα的匮乏，可能导致DNA聚合酶α引发酶的异常磷酸化并使其不能引发SV40 DNA的复制。
实施例8
除了43kd之外有多个pp2cα蛋白
用针对rpp2cα的、不同的单克隆抗体(参见上面的实施例3)对肝提取物进行免疫沉淀。沉淀被分成2份，它们在12％PAGE上分离开并进行印迹。每套免疫沉淀物用下列多克隆抗体进行攻击：
(1)351-它识别α和β两者
(2)801-它对pp2cα特异
如图10中所示，一旦与抗体351反应，检测到多个在40-43kd位置处迁移的条带。单克隆抗体9F11、9F4和1D5表现出类似的由2-3条深条带和1-2条浅条带组成的图案。单克隆抗体2A3仅沉淀出浅条带。
印迹的第二部分与α特异性抗体801反应。在约40-43kd位置上，对于所有的4个单克隆抗体都可看见2个条带。这些条带可能是被单克隆的2A3所检测出的条带。因此，单克隆抗体2A3是对pp2cα特异的。
此外，还检测到在75kd和大于约150kd的位置处的2个额外条带。这些蛋白质在肝脏中比40-43kd蛋白质多。因为所有8种单克隆抗体都识别这些蛋白质，而且因为801多克隆抗体也与其反应，所以很明显这两种大的蛋白质也共享pp2cα的若干个表位，这表明它们是同一基因但不同剪接后的产物。
当与免疫沉淀物进行反应时，还检测到75千道尔顿蛋白与多克隆抗体351之间的弱反应。但是，一旦对总肝脏提取物直接进行免疫印迹，看上去75千道尔顿是存在的，而且可检测出对更高分子量的蛋白质的弱反应。
用多克隆抗体351还检测到几种额外的高分子量蛋白质。这些蛋白质并不与多克隆抗体801(它对pp2cα特异)反应。这些结果表明，存在其他形式的α，而且有不同的分子量。
来自几个组织的mRNA的Northern印迹分析(图13)表明，有若干RNA条带与衍生自pp2cα 5′UTR的探针杂交或与完整的PP2Cα cDNA探针杂交。RNA是从不同组织中抽提的，而且在这些组织中表现出有不同大小的RNA。
实施例9
pp2cα调控mRNA的合成
表6总结了蛋白质或RNA序列的同源性，发现对pp2cα羧基端肽的10个氨基酸：NDDTDSASTD(SEQ ID NO：1)有同源性。如上所述，该肽被用于产生多克隆抗体801。
RNA聚合酶II的羧基细胞结构域(carboxy cellular domain，CTD)被融合于GST，并将融合复合体结合于琼脂糖凝胶谷胱甘肽(gluthation)珠上，与HeLa细胞提取物混合。在PAGE和印迹之后，结合于RNA聚合酶羧基端结构域(carboxyterminal domain，CTD)的蛋白质也结合于pp2cα。801和2A3都用于这种印迹。相关pp2cα的大小约为43千道尔顿。因此，RNA聚合酶II与pp2cα是相关的。
在第二个试验中，如上分析来自肿瘤细胞、肝癌和HeLa的提取物。仅在肿瘤提取物中观察到对GST-CTD的结合，而在来自正常肝细胞的细胞提取物中没有检测到这种活性。
基于研究结果[Chambers和Dahmus，1994]，即聚合酶αCTD结构域可被磷酸酶脱磷酸化，其性质与PP2Cα类似(但是不是PP2Cα)，本申请人提出，pp2cα使RNA聚合酶II脱磷酸化，并因而调控在特异的信使上开始mRNA合成。该肽可用于控制和调控其他因子协助的转录。
实施例10
其他序列
制备两个含有AAV整合位点的λ克隆。(1)一个是衍生自中国仓鼠细胞CO60，它被命名为λSL9-1(示于图3；SEQ ID NO：15和16)。各部分是图3所示的各序列。另一序列AN8T7(SEQ ID NO：18)衍生自质粒pSL9-8(图3)。(2)第二个λ噬菌体克隆自细胞系DA3J7，没有给出图谱定位(mapped)。各部分被亚克隆入质粒，并部分测序，如5h-1中所示(SEQ ID NO：17)。序列比较显示，5h-1与AN8T7同源。该比较区域也与粘粒MMDA 23，467-23715同源。在该申请中，通过引证方式引用了多种出版物，并通过专利号引用了专利文献。对于出版物的完全引证列于下面。这些出版物的公开内容全部在此引用到本申请中作为参考，以便更充分地描述本发明有关的已有技术的状态。
本发明以阐述形式加以描述，因而应理解，使用的专门名称所起的作用是描述性的而不是限制性的。
很明显，在看到上述的讲述内容之后，可以有许多种本发明的改动和变化形式。因此，应理解在所附权利要求的范围内，可以不按具体描述的那样实施本发明。
表1  与亲代DA3细胞系相比，DA3J克隆的铺平板效率
铺平板的细胞数目 生长出的集落数目(平均值±SD)，铺平板效率(％)
DA3 DA3J1 DA3J2 DA3J3
250 88(6)35％ 53(8)21％ 78(11)31％ 43(5)17％
500 181(36)36％ 103(10)20％ 131(20)26％ 82(9)17％
来自DA3、DA3J1、DA3J2和DA3J3细胞培养物的半汇合细胞，以250个和500个细胞接种至9厘米的培养皿上。培养物生长7天。然后固定细胞并用吉姆萨(Gimsa)染色。确定两次试验中生长集落的平均值。每次试验做3份。
表2  与亲代DA3细胞系相比，DA3J克隆的紫外线敏感度
J/平方米 生长出的集落数目(平均值±SD)，存活％)
DA3 DA3J1 DA3J2 DA3J3
0 91(4) 100％ 59(20) 100％ 79(6) 100％ 36(7) 100％
2.5 86(9) 95％ 54(9) 91％ 85(8) 1005 36(4) 100％
5 62(5) 68％ 25(30) 42％ 39(13) 49％ 11(11) 30％
10 22(6) 24％ 12(2) 20％ 19(4) 24％ 4(2) 11％
20 0(0) 0％ 0(0) 0％ 2(2) 2％ 0(0) 0％
来自DA3、DA3J1、DA3J2和DA3J3细胞培养物的半汇合生长的细胞，以250个细胞接种至9厘米的培养皿上。在48小时后，用紫外线照射培养物，然后温育7天。确定生长集落的平均值。每次试验做3份。
                        表3A文件：Shu…008    获得日期：10-5月-95总事件：7000      X参数：FL2-A(线性)
标记物 事件 ％总计 平均值 CV
全部 7000 100.00 384.11 48.19
G0/G1 3355 47.93 394.88 14.49
S 943 13.47 569.28 7.41
G2+M 668 9.54 727.76 8.06
Ap. 1485 21.21 132.36 36.21
                               表3B文件：Shu…010  获得日期：10-5月-95总事件：7000    X参数：FL2-A(线性)
标记物 事件 ％总计 平均值 CV
全部 7000 100.00 382.46 51.58
G0/G1 3019 43.13 393.54 14.79
S 938 13.40 574.35 7.10
G2+M 798 11.40 737.43 8.24
Ap. 1684 24.06 133.69 36.68
                        表4
               单克隆抗体的定性研究
抗体编号 抗体捕获(1) 免疫印迹(2) 免疫沉淀(3)
PP2C PET
1D5 +1/8 - +++ +++
2A3 +1/32 - +++ α-特异性
2H8 +1/16 +1/8 未测试 +++
9F4 +1/10 - +++ +++
9F11/169 - - 非特异 +++
9F11/53 +1/10 - +++ +++
10C6 +1/10 +1/10 ++ +++
10F8 +1/1 - + +++
(1)对2种抗原进行抗体捕获分析：纯化的rpp2cα-以鉴别抗pp2c抗体，以及来自含有pET表达载体但没有pp2c插入片段的细胞的蛋白质抽提物-以鉴别非特异性的抗体。结果用+或-表示，数字表示给出最高结果的抗体稀释度。
(2)对在12％PAGE-SDS上分离的rpp2cα和肝脏提取物进行的免疫印迹。
(3)免疫沉淀。用单克隆抗体沉淀来自肝脏提取物的蛋白质。蛋白质在12％SDS-PAGE上进行分离，用亲和纯化的兔多克隆抗体801(该抗体是α-特异性的)和351(它识别pp2cα和pp2cβ)进行检测。
                      表5
      CHINT(SEQ ID NO：19)与来自粘粒DNA MMDB的、
含有PP2C RNA5′端的人DNA序列(SEQ ID NO：20)之间的同源性位点HUMMMDBC 68505 bp ds-DNA         PRI 09-4月-1992定义：来自染色体19q13.3的粘粒DNA MMDB(f10080)和MMDC(f13544)
的人DNA(用自动序列分析而获得)登录号：M89651 M77823 M77824 M77825关键词：来源：人(文库：A.v.Carrano的Lawrist5载体文库)分值：Initl：61  Initn：150 Opt：82
在103bp的重迭区域有58.3％相同
     20         30       40        50         60         70int.li   TAGTGCCGGTCAAGGAACTGAACGTGCGATTCCGGGACAGGCTACCCACTCCGATCCCAG
          ||           |   |   |   |||||| |||||||||| |  ||   |||hummdb   CCTCACCTCCGCCCTGTTTCGTCCAGGTCCTCCGGGTCAGGCTACCCCCGTCGCCGCCA-
     55710     55720     55703     55740     55750     55760
     80        90        100       110       120       130int.li  GAGAAGTTGTCATGGTGAGGGCCACCCTAGGTCTCTGCCCCTGCTGTGTCCCCCATCTTA
    |||  |  |    || ||| ||  || | |    ||   ||| ||    ||||||||hummdb  GAG-CGCGGGGGAGGGGAGAGCTTCCTTTGTCTCCTATGCCTCCT---CCCCCCATCCCG
    55770      55780     55790     55800     55810         55820
    140        150         160        170        180        190int.li  CCCATCCAGTAGGATCTAGAGGCTGTCGCCCCCTTGTGGAATGCACAGAAGTCACAAGCG
     |  ||| |  ||     |  |  |   | ||   | | |    |    |       |hummdb  GCTCTCCTGCGGGCAAGCGCCGAGGGGACACCGGGGAGTACCCCACCTGAACCTCTGGGG
        55830     55840     55850     55860     55870      55880
                   表6
     与NDDTDSASTD同源的蛋白质或RNA序列肽序列#1  1)与不同的PP2Cα蛋白质和mRNA
2)与鼠属norvergian神经元、pentroxin前体mRNA
3)与非洲爪蟾属转录因子IIIA
4)与人DNA/RNA结合蛋白mRNA
5)与人转录因子IIIA
而且与其他额外蛋白质有少许程度同源性在RNA水平上的同源性#2  1)PP2Cα mRNA
2)人mRNA与非洲爪蟾属转录因子IIIA同源
3)人DNA/RNA结合蛋白mRNA
4)人转录因子IIIA#3  1)PP2Cα的不同形式
2)编码DNA介导的RNA聚合酶σ链的秀丽新杆线虫(C.elegans)粘粒
3)土豆的丙酮酸激酶mRNA
4)秀丽新杆线虫(C.elegans)粘粒
5)八面体疱疹病毒DNA聚合酶解旋酶
6)UIsnRNA特异性蛋白UIA的thabana mRNA
7)人蛔虫小核RNA(snRNA UI-1 UI-2 UI-3 U-I基因)
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                     序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Lavi，Sara
(ii)发明名称：用于癌症治疗、预防和检测的蛋白质
    磷酸酶2C-PP2Cα在肿瘤细胞中表达的操作和检测方法(iii)序列数目：20(iv)通信地址：
  (A)收信人：Kohn&Associates
  (B)街道：30500 Northwestern Hwy.
  (C)城市：Farmington Hills
  (D)州：Michigan
  (E)国家：US
  (F)邮编：48334(v)计算机可读形式：
  (A)记录介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容型
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申请资料：
  (A)申请号：
  (B)申请日：
  (C)分类：(viii)律师/代理人信息：
  (A)姓名：Kohn，Kenneth I.
  (B)登记号：30，955
  (C)参考/案卷号：2290.00037
(ix)通讯信息：
    (A)电话：(810)539-5050
    (B)传真：(810)539-5055(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
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(i)序列特征：
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(iv)反义：是
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(ii)分子类型：其他核酸
   (A)描述：/desc＝＂35-3.seg(图3)＂
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：AAGCTTGTCA  AAATTACTAT  TCAGTGTGAT  TTTTAGTGGA  TGAAACCTCA  TGACTAGTAT           60ATTATGACAT  TAGCTTTGCG  TAGTGAAGGC  ACAAGCTGCT  AAGTGGTTAG  GGATGTATTT           120TGCCGTAGCC  TGTATCACNC  CAGGTCCTGG  GCTCGGTTCC  TAGCATTACA  GGAAAAAGCA           180GGCGGTGGTT  GACCTTTAAT  GAATGGATTT  TTCAATTTAG  AAGTTGGTTT  CATTTTAAAG           240AATTCAAAAA  TGTTCCCCAT  AGCACTTTGT  TTTGACATTG  AGATCAGCTG  CTAATTGAGG           300TCCAGTATAT  ACTTAGAAAA  CTGAGCGAAA  CTTTGATGGA  CACACACACA  CACCCCTGTT           360GTTCATTTAA  TAATTGAACT  AAATAAAATA  CTGTTTAGTC  ATCCACGTAA  GCAAGAGGCC           420TGTGTAAACA  GTATTTGTAT  TAGTAAAAAC  TTTATAACAT  AGTTACATAA  TCAGCATCAT           480TTTTTTTATG  GACCTTATAG  TTGGCTACTT  CACTGGGTTT  GTTATAATTT  AATCAGACTC           540CTAAATAGGT  TAAATTTCTG  AATTGCCTAC  TTCAGTTTTG  AAGAATTATT  TTGTTTCATA           600ATTTCCCATG  CATATCTGGT  AAATAATTCT  GGATTGTTTC  TAAAGGGGAG  AGCAAGGTCT         660CTTATGCAAA  GTGAAAATCT  AGATATGCTG  TTTGTAAGAA  TATAATAGTG  ATAAAGTAGT         720GTCCTTTTGC  TCAGTGCCTC  CATTCTTACC  AGGCTGTGAC  TGATCTTCAG  TATTATTCAG         780ACAGTCACTA  TTAATATATC  CGTTGCACAG  TGGGGAAATT  GAGGGAAGTT  AGATAGGCAT         840CGGGTATCTT  AATCATAACT  CACATATACC  CAGCTGGCTA  GTCAGCCTAG  CTAAGACAGT         900TCACACCCAG  TTGAGGCAGC  TTGCTGTTGG  CCATTAGTAG  GTAACTTAAT  GGCTTGGTTT         960CTTCACTGGT  AAGGTGGGGA  TATAATAATG  CCAATAATTG  CATAATGATT  AAAGACATTA         1020ATATATTCCA  TAAAATTTCC  TGAATAGTGC  TTAGCTGGTA  CCCCTCCCCA  CACATGCACC         1080CCAGTCCAAT  GTTCAGATGT  TTACTTTGTT  AAGCCCAGTT  AATCCATTCC  CCCTAATATC         1140TTCTCCCAGT  TTGAAGAANG  TTGAAGAATG  TTGGGCTTGT  TAGTTTAATT  TTTTAAGAAG         1200CATATCATGT  TGCTTTTTTA  AAACATGTTT  CTTTGGGTTT  TGGCTTCCCC  TTTTGGAAAG         1260AATTCCAATT  TACACTTATG  GAAGAAAGCC  ATTGTCCCCT  CCAATTTCCC  CCCCTGTCCC         1320TTTCCAATAC  AGCCCAACTC  CCCATGTTTT  GACTTCCTCC  CCTGAACCAC  CCCGTTCTCC         1380TGTTTTTCCC  TCCCCCANAA  AAAAAACCCA  ATAATTTGAC  TTTGGTAATT  GAATTTCCCG         1440CCNGTTAGGC  NCCTGAATTG  CCGAAATAAT  TCCCCCGTGC  NCCCNGGANT  TTTGGCACCC         1500CCTGCCCCTT  AACCTGTTCT  GCTGCCCCCC  ATTTTTAAAT  GGCTTGCCGC  NTTACNCCAA         1560ANACTGCCTT  TCC      1573(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：2580碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸
(A)描述：/desc＝＂35-T7.seg(图3)＂(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CTCGATCTCA  CAAAGTCACA  GAGCTCTTCG  TTTCCCATGA  CATCCCAGAT  ACCATCACAT          60GCAAGAATAA  TGAACTGATC  GTCCTCTTCA  GACCTTTCAA  TATCATGGAC  TTCTGGCTCT          120GGTGAGACGA  GCTGCTCTGT  GGGACCTTTT  CCATGGACAC  ATTTGTAATC  GAAATCCCCA          180AGGGCCCTTG  ACACAGCCAG  AGAGCCATTT  ACACGCTGAA  TCATCACAGA  GCCCCCTGCA          240TTCTGAATTC  GTTCTTTTTC  CAGCGGGTTA  CTTGGTTTGT  GGTCTTGTGT  GAAGAAGTGA          300ACTTTCCTGT  TTCTACAAAG  CAAACCTCTC  GAGTCTCCAC  AGTTAATGAA  GTAAGTATGT          360TTGGGGAGAA  ATTAAGACCC  CCACAGCTGT  TTGACCCACT  TCCTATCTGC  ACCATGTTTT          420CCTTCCTCCT  GACATGACTC  CTCATGTTGT  TTCCATCAAT  CTCCCAGAAA  AACCTGTTCC          480TGATCCCCAT  TCCTTTACAT  TTTCCCACAG  AAAGGTGCTC  CCTGCAGAGC  CTTTTAAAAT          540CCCTGGTTTA  TTGGTGATGT  TGATTCTNAA  CAAATGCTCC  ACAGCCAGTA  TTTNGGCAAC          600CTTGAAAAAC  CAGCATGCCC  ATCCATATAC  AGCCAAGAAT  GACCATGTTC  TCCAGTTCCA          660CTTTNGGCAA  ACCCAATCCA  CAGCCGTTNT  GCGCATCCTC  CCATTTCAAC  TCCGCCCAAC          720CNTTGCNTGC  TGCNTTAAGC  CATATCGCAA  CCCATCCCCC  CTGCCCCCTG  GGGCATTATG          780CNTTTCCATC  TTTGGTTGTC  TAAAATGCTC  CCATTATGAC  TTGATCCTCT  AGGTCTGCAA       840AGGAAGAGAA  ATAAGAAAGT  TAGTAACTGT  CTTTGAAACA  AAGCACACAT  CCAACAGTCT       900TTTTGAAGCA  CCTACGAGAT  ACAAGGAAAC  GTAAAAACTC  ATAGGCTATA  GCCATAAGCA       960TTGTTCTACT  GACTTGGAAA  ATGTAGAGAT  TAATAAGAAA  GGGAAAGGCT  GATCAAGTAC       1020AGCTCAACCA  GACAAGCAGC  AGATGGAACT  AAGTCACCAG  GTAAAAGAGA  GCTTGTTTGC       1080CTCTCTGTGA  TACCAAGGAG  GCCCAGCAGT  GACCATTAAC  TTACATGAAC  TAGGCAAGAT       1140TTCAGGGTGC  ATTCATCATA  TGTAACCTCT  CAATTAAGTT  GTGTGTTGAT  TAAAAAAAAT       1200AATTCATAGA  AACATACAAG  TATCTACTAC  TTCAGGGAAC  CTTAGCTAAG  TACTCAGGAA       1260TGTTGAGAGT  TTGATTCCAT  GCTATTTAGT  TTTGTTTCTA  CAACTAGATA  CCTTTGGTAA       1320AAATAAAAAG  TAATTACTCA  CACTGGTCCA  AATTTTCAGT  GCCTTGTGCA  GGTCATTCTC       1380TTTAGCTGGA  ATTCCCTGCC  TCACCTCTTT  ACCAACAGAA  AAAAAATACA  CCTGTTTCTA       1440TCCTTTGAAA  TCCAGTTCAA  TTGTTCCCCC  TTCCTCCAGA  CTTTACAGTC  CTTGAAAAAA       1500ACAAGTTATT  AACTACAGAA  GTCAGCTTCC  ATTTCCAGTT  NGGAATGTTT  TTTAATGAAC       1560AATTTTATTG  TTCNAAATCT  NACNATATGA  TAACTAANCN  AATGGTAATA  ATATTTTCAN       1620CCCTGCCCTA  TGGCCGCTNT  TTTTAATCCT  NAAAAAAATC  NAAGGTCTAT  TCCNCCCNNC       1680CTTGCCAATA  CTTNACANCN  CCAGTTCCCT  GATCTGGAAT  GGACCCACAA  AGGTCAAGAC       1740TTAGGTTANC  CCTTGCTCAC  AAACTAAAGA  AAATCTTAAA  GGAGAACAGA  ATACTGAAGA       1800GAGAAATGAG  GGTGAAGGAC  AGTGTTCAGG  TGACGTTCTG  AAACCAGGGG  ACTAAANATA       1860CCANAANTGG  TGTTNCAGAC  AGAAATGGTA  TGGAAAACTC  CTTAGGAAAG  AAATGACANN        1920TNTTGTTTCG  CAGCAACCCC  CNCACATGGC  TTTCTCTTTT  TCCTTCTGCT  GATTAACTGA        1980TGCACNTGGT  ANAAAAGTCA  ACANACCCCT  CCTCCACNCA  GACTCCCACC  GAGTACANNG        2040GCCCATGTGC  TCANTACACT  CTGCCCCAAA  CTCNNANNAT  TCATTCNNCT  CCCCNTGTNA        2100TTTATNAGGG  CCTTTCCCNT  CAGTTNTCTN  ATCNCCAACG  GANATTANCC  TTCCANNNAT        2160TTACCCCCNN  TTTGTACANC  ACATNNTGGC  NNGTGCCACN  GTTANGCGTC  GGCNTCCCTG        2220TTNCACTNCA  TCCCTCATCN  TTAGGCCANG  TTTGATTCTC  CNGTGCANAN  TTTCCGCANN        2280ANCNTACCCC  TTGCACCNTC  CATNTCTNNG  GAANAACCTC  CGGTTCTGAA  TCTNCCCCNN        2340TCCCGTCNCT  CCCCCNTTCT  TTCTTTTCTC  TANTTTTTTC  CNNGGNACGG  GTTGNGGTNA        2400ATNAANNCCC  CTCCTTCGTC  TATTCANCCC  TTCCTATGNA  CACTTCCTGN  CCCCCTATCT        2460CTCTATNTNC  TNCTCTCTAT  ATCTNNATCC  CNTCTTCNCN  TGCCNCTCCC  TNGTNTTNNA        2520NCGGGTATTT  NTTNTTCTCC  TCNTCTTCTT  CCCCTNTNTA  NCCNTNCTNC  NNNCNNNCCC        2580(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：830碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其他核酸
   (A)描述：/desc＝＂5H-1(实施例10)＂
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：TGGGGGAGAG  GACTGAAATA  TTTCCACAGC  CTTTTTATTG  GTGGTGATGG  TAGTGATGGT           60TAGGATTCCT  TCTTTCTTTC  TTTCTTTCTT  TCTTTCTTTC  TTTCTTTTTT  TTTTTTTTTT           120TTTTTTTTTT  GAGACAGGGT  TTCTCTGGGT  ACTCCTGGAA  CTCACTTTGT  GGACCATGAA           180TGACATGAAT  ACTTCGATAT  ATACATACAT  ACAAAGACAC  ATATTTTTAA  AAAGAGAATT           240AGAGTAGAGC  TGGGGCAATT  GTGGAACACA  CCTTTAACCT  CAGGCAGATT  TCTGCGTTCA           300AGGTCACCTT  GGATTACAAG  GCAGCTAGGG  CTACACAGAG  AAACCATATC  TCAAAAAAAA           360GAAAAAATAA  TGAAAGAAAG  AAAGGAAGGA  AGGAAGGAAG  GAAGGAAGGA  AGGAAGGAAG           420AAAGGAAGGT  AGGAAGAAAG  GTATTTTCCT  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  TTTATTCCGG           480GCAGTGGTGG  CAAATGCTTT  TAATCCCACC  ATTTGGGAAA  GCAGAGGCAG  ACAGATTAAA           540TTTTCAAGGC  CCACCTGGTC  CTACACAGTG  AATTCCAGGA  ACACCTAGGT  TTACCCANAA           600AAAACCCCCC  CTTGAAATAA  ACAAAAATAA  ATTAAATAAA  TAAAATTTAA  AAATAAAACC           660CGGGCGTTAA  ACCCNCTTTT  ATCCCCCCAC  TTNGGAAGCA  AAAGCCGGCN  GATTTCTGAA           720TTCNAGGCCN  CCCTGTCTAT  GAATTANTTC  CCNGAACACC  CNAATTTTTC  NAAAAACCCC           780CCNTTTCTTA  AAAAANCCAA  ATTATTATTN  ATTAATTAAA  TNAAATTACC                       830(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：838碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸
   (A)描述：/desc＝＂AN8T7(实施例1 0)＂(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GGAGTCCAAC  AATGGTTTCC  ACTTGTCTGG  CGGCCGCTCT  AGAGTTTCCC  ATAAGCTGGA           60CTGAGAGATG  GTGTGATTGC  TGTGGGTGAC  AAAGACAGAG  GCACCTTTCA  TCTCTACCCT           120TCTCTTGTTT  TGTTGTTTGT  TTGAGACCGG  TTCCCACTAT  GTAGACCAGG  CTGGAGGACA           180GGGTCTCACT  ATGTAGACCA  GGCTGGCCTT  GAACTCAAAG  ACATCTGCCT  GCCTCTGCCT           240CCTGAGGGCT  GGGATTAAAG  GCGTGTGCTG  CCACTGACAG  CTTCTATCCT  CCTGTCATCA           300GTCCCGGCTC  ACAGGGCCAG  AAGATCTCTT  CTATGCTTCC  ACTATTTCCC  CAATCCATTC           360CCACGGCAGC  CTCTCCATCT  CCCTACCACC  AAGACAGCAG  CCTAGTGATA  TAACAAAACT           420TTTATTCACA  GGAAACCGGA  AAACAAAATC  ACAACCAATC  ATTTCTATCT  AGTCCCTGCC           480CTAGCCCTCC  CTCCAAGCCC  CTACATATCC  TCCATCTGAG  GGGGATGCAT  GCGTTGGGTG           540GGAGCTGCCG  GCATCCTTAT  CCTGGTTCCT  GGAGTAGNGA  AGAGTGGTTC  TTTTCAACGN           600CTAGGGNNCT  CCCCTCCAAG  TTNGGACCTC  TCTTCCCAGG  NCTTCNCCCC  TCCCTNACAG           660GGNACAAAAA  ACCAGGNACG  GCACNACGCC  AGGNAGGAAG  GGACTCTTGG  NAATGTTGGG           720CAGGACTTGT  CCTCAGAATT  CCNNGGAGGA  ATCAAGGGCC  TTGAATTCGG  GAACCACTNC           780CGAGGNCTTC  ANCANGGCAN  AGTTCAATTT  TCCATCCCGG  TTGGCCCANC  CTGGCCNG             838(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：180碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其他核酸
    (A)描述：/desc＝＂CHINT(表5)＂
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：TAGTGCCGGT  CAAGGAACTG  AACGTGCGAT  TCCGGGACAG  GCTACCCACT  CCGATCCCAG           60GAGAAGTTGT  CATGGTGAGG  GCCACCCTAG  GTCTCTGCCC  CTGCTGTGTC  CCCCATCTTA           120CCCATCCAGT  AGGATCTAGA  GGCTGTCGCC  CCCTTGTGGA  ATGCACAGAA  GTCACAAGCG           180(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：175碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其他核酸
   (A)描述：/desc＝＂HUMMDB(表5)＂
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：CCTCACCTCC  GCCCTGTTTC  GTCCAGGTCC  TCCGGGTCAG  GCTACCCCCG  TCGCCGCCAG           60AGCGCGGGGG  AGGGGAGAGC  TTCCTTTGTC  TCCTATGCCT  CCTCCCCCCA  TCCCGGCTCT           120CCTGCGGGCA  AGCGCCGAGG  GGACACCGGG  GAGTACCCCA  CCTGAACCTC  TGGGG                175

Claims (44)

1.一种在病人中检测癌细胞的方法，其特征在于，通过检测从病人分离出的样本中PP2Cα基因活性的改变情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该样本选自下组：组织活检样本和体液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该改变是，与正常对照相比，PP2Cα基因活性的下降。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该检测步骤被进一步定义为：分析样本中的mRNA与包括其多态性形式在内的PP2Cα DNA的互补性，其中所用的分析方法选自下组：原位杂交、Northern印迹法和逆转录酶-聚合酶链反应。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该检测步骤被进一步定义为：分析样本中的包括其多态性在内的PP2Cα DNA基因产物及其肽片段，其中所用的分析方法选自下组：免疫组织化学和免疫细胞化学染色法、ELISA、RIA、免疫印迹法、免疫沉淀法、Western印迹法、功能分析法和蛋白质截短分析法。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，样本是选自下组的体液：尿液、血液、脑脊液和唾液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在样本中检测PP2Cα基因活性是通过确定受PP2Cα基因产物影响的蛋白质磷酸化模式的改变情况。
8.一种如权利要求4所述，检测PP2Cα活性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
与包括其多态性在内的PP2Cα的mRNA遗传序列互补的分子探针，和
检测该分子探针与mRNA是否发生杂交从而表明PP2Cα基因活性的检测装置。
9.一种如权利要求5所述，检测与PP2C基因活性相关的基因产物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
高特异性地识别选自下组的标记物的抗体：包括其多态性在内的PP2Cα基因产物及其肽片段，和
检测该抗体是否发生结合从而表明存在基因产物的检测装置。
10.一种如权利要求5所述，检测与PP2C基因活性相关的基因产物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
一试剂，该试剂模拟与包括其多态性在内的PP2Cα基因产物及其肽片段发生结合的天然蛋白，和
检测该试剂是否发生结合从而表明存在基因产物的检测装置。
11.一种非人的转基因哺乳动物或细胞系，其特征在于，它含有可表达的包括其多态性在内的人PP2Cα的核酸序列。
12.一种非人的真核生物体，其特征在于，相当PP2Cα基因组核酸序列被剔除。
13.一种载体，其特征在于，它含有与PP2Cα核酸序列可操作地相连的表达控制序列。
14.一种用权利要求13所述的载体转化的宿主细胞。
15.一种载体，其特征在于，它含有PP2Cα的反义序列。
16.一种抗体，其特征在于，它特异性地结合于包括其多态性在内的PP2Cα基因产物的表位，该表位将PP2Cα的基因产物与PP2Cβ基因产物区分开。
17.如权利要求16所述的抗体，其特征在于，它偶联于可检测的分子。
18.如权利要求16所述的抗体，其特征在于，它选自下组：单克隆抗体和多克隆抗体。
19.如权利要求18所述的多克隆抗体，其特征在于，它针对重组产生的PP2Cα。
20.如权利要求18所述的多克隆抗体，其特征在于，它针对选自下组的pp2cα羧基端肽：NDDTDSASTD(SEQ ID NO：1)和YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ IDNO：2)。
21.如权利要求18所述的单克隆抗体，其特征在于，它不与pp2cβ发生交叉反应，而且它针对选自下组的肽：重组产生的pp2cα、NDDTDSASTD(SEQ ID NO：1)和YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ ID NO：2)。
22.如权利要求21所述的单克隆抗体，其特征在于，它是2A3。
23.一种分离和纯化的肽，其特征在于，它选自下组：NDDTDSASTD(SEQ IDNO：1)、YKNDDTDSTSTDDMW(SEQ ID NO：2)和PNKDNDGGA(SEQ IDNO：3)。
24.如权利要求23所述的肽，其特征在于，它是重组产生的。
25.一种治疗癌症的方法，其特征在于，它包括步骤：
a.确定癌症类型和表达该癌症的细胞，
b.制备一会特异性地导向癌症细胞的载体，该载体含有控制PP2Cα表达的调控元件，和
c.将该载体施用于病人。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，该载体含有AAV修饰序列或部分AAV序列。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，该载体含有CHINT序列。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，该载体含有沉默子区域(SEQ IDNO：13)。
29.如权利要求25所述的方法，其特征在于，该载体含有小沉默子区域(SEQ IDNO：14)。
30.一种治疗癌症的方法，其特征在于，它包括步骤：
a.确定癌症类型和表达该癌症的细胞，
b.制备会特异性地导向癌症细胞以控制PP2Cα表达的反义载体，和
c.将该载体施用于病人。
31.一种药物组合物，其特征在于，它由载体和药学上合适的载体组成，其中载体选自下组：会特异性地导向癌症细胞并含有控制PP2Cα表达的调控元件的载体，以及会特异性地导向癌症细胞以控制PP2Cα表达的反义载体。
32.一种治疗因PP2Cα表达改变而导致异常磷酸化，从而造成的疾病的方法，其特征在于，它包括：
a.制备会特异性地导向表达异常磷酸化的细胞以控制PP2Cα表达的反义载体
b.将该载体施用于病人。
33.一种通过中断DNA聚合酶α引发酶与PP2Cα基因产物间非计划性相互作用而抑制基因扩增的方法，其特征在于，它制备会特异性地导向DNA聚合酶α引发酶结合于PP2Cα基因产物的结合域的反义载体，和将该载体施用于细胞。
34.一种激活在细胞表面上表达的PP2Cα基因产物，从而诱导信号转导的方法。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，用抗体与PP2Cα基因产物进行结合。
36.一种在病人中检测癌症的方法，其特征在于，在从病人分离出的样本中检测PP2Cβ基因活性的改变与否。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，检测PP2Cβ活性的增加。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，PP2Cβ活性的检测是通过：分析样本中的mRNA与包括其多态性在内的PP2Cβ DNA的互补性，其中所用的分析方法选自下组：原位杂交、Northern印迹法和逆转录酶-聚合酶链反应。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，PP2Cβ活性的检测是通过：分析样本中的包括其多态性在内的PP2Cβ基因产物，其中所用的分析方法选自下组：免疫组织化学和免疫细胞化学染色法、ELISA、RIA、免疫印迹法、免疫沉淀法、Western印迹法、功能分析法和蛋白质截短分析法。
40.一种抗体，其特征在于，它特异性地结合于包括其多态性在内的PP2Cβ基因产物的表位，该表位可将PP2Cα基因产物与PP2Cβ基因产物区分开。
41.如权利要求40所述的抗体，其特征在于，它偶联于可检测的分子。
42.如权利要求40所述的抗体，其特征在于，它选自下组：单克隆抗体和多克隆抗体。
43.如权利要求40所述的多克隆抗体，其特征在于，它针对重组产生的PP2Cβ。
44.如权利要求18所述的多克隆抗体，其特征在于，它针对羧基端肽：PNKDNDGGA(SEQ ID NO：2)。
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