CN1378552A - 新型转录因子bp1 - Google Patents
新型转录因子bp1 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1378552A CN1378552A CN00814096A CN00814096A CN1378552A CN 1378552 A CN1378552 A CN 1378552A CN 00814096 A CN00814096 A CN 00814096A CN 00814096 A CN00814096 A CN 00814096A CN 1378552 A CN1378552 A CN 1378552A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- gene
- dna
- expression
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000901614 Homo sapiens Homeobox protein DLX-4 Proteins 0.000 claims abstract description 392
- 102100022374 Homeobox protein DLX-4 Human genes 0.000 claims abstract description 384
- 101001098058 Protobothrops flavoviridis Basic phospholipase A2 BP-I Proteins 0.000 claims abstract description 309
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 150
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 50
- 230000003584 silencer Effects 0.000 claims description 34
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 24
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108091005903 Hemoglobin subunit delta Proteins 0.000 claims description 7
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 102100038617 Hemoglobin subunit gamma-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 55
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 abstract description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 169
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 67
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 41
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 23
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 22
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 22
- 108010087776 Proto-Oncogene Proteins c-myb Proteins 0.000 description 22
- 102000009096 Proto-Oncogene Proteins c-myb Human genes 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 21
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 21
- 230000008859 change Effects 0.000 description 18
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 18
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 17
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 12
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 12
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 12
- 108010003661 Distal-less homeobox proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 10
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000006517 limb development Effects 0.000 description 8
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 8
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 8
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 102000004648 Distal-less homeobox proteins Human genes 0.000 description 7
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 7
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 6
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 201000007423 tubular adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 208000025321 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 101000986346 Chironomus tentans High mobility group protein I Proteins 0.000 description 5
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 208000017414 Precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 208000017426 precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020003566 Antisense Oligodeoxyribonucleotides Proteins 0.000 description 4
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022103 Histone-lysine N-methyltransferase 2A Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003293 antisense oligodeoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 3
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 3
- 101000980898 Homo sapiens Cell division cycle-associated protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000632056 Homo sapiens Septin-9 Proteins 0.000 description 3
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 3
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 3
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 101150072154 hb gene Proteins 0.000 description 3
- 102000044493 human CDCA4 Human genes 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 2
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150033506 HOX gene Proteins 0.000 description 2
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 102000018802 High Mobility Group Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710176246 High mobility group protein Proteins 0.000 description 2
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 101100189471 Mus musculus Pbx1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 102400000977 Nuclear pore complex protein Nup98 Human genes 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000015602 Septin Human genes 0.000 description 2
- 108050004875 Septin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- 201000011176 T-cell adult acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N acetic acid phenyl ester Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004373 eye development Effects 0.000 description 2
- 230000027648 face development Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 108010038853 gamma-Globins Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001357 hemopoietic progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000001501 megacaryocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 108700021654 myb Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 101100070525 Arabidopsis thaliana HEN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101100428830 Caenorhabditis elegans mml-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 101150103203 D11 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100030826 Hemoglobin subunit epsilon Human genes 0.000 description 1
- 108091005879 Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 1
- 102100030339 Homeobox protein Hox-A10 Human genes 0.000 description 1
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 description 1
- 102100025056 Homeobox protein Hox-B6 Human genes 0.000 description 1
- 102100020759 Homeobox protein Hox-C4 Human genes 0.000 description 1
- 102100020762 Homeobox protein Hox-C5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022599 Homeobox protein Hox-C6 Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001083164 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A10 Proteins 0.000 description 1
- 101001019745 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B1 Proteins 0.000 description 1
- 101001019752 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B2 Proteins 0.000 description 1
- 101000839775 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B3 Proteins 0.000 description 1
- 101000839788 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B4 Proteins 0.000 description 1
- 101000840553 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B5 Proteins 0.000 description 1
- 101001077542 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B6 Proteins 0.000 description 1
- 101001077539 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B7 Proteins 0.000 description 1
- 101000988994 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B8 Proteins 0.000 description 1
- 101000989000 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B9 Proteins 0.000 description 1
- 101001002994 Homo sapiens Homeobox protein Hox-C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001002966 Homo sapiens Homeobox protein Hox-C5 Proteins 0.000 description 1
- 101001045154 Homo sapiens Homeobox protein Hox-C6 Proteins 0.000 description 1
- 101001069727 Homo sapiens Paired mesoderm homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000800488 Homo sapiens T-cell leukemia homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000700207 Mus macedonicus Species 0.000 description 1
- 101150065082 NRM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800000051 Nuclear pore complex protein Nup98 Proteins 0.000 description 1
- 101800002013 Nucleoporin nup98 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100033786 Paired mesoderm homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100028024 Septin-9 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100033111 T-cell leukemia homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000173347 Tonsilla Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000036676 acute undifferentiated leukemia Diseases 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000984 branchial region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 150000004652 butanoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000001653 corpus striatum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000001990 heterocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002122 leukaemogenic effect Effects 0.000 description 1
- YDTFRJLNMPSCFM-YDALLXLXSA-M levothyroxine sodium anhydrous Chemical compound [Na+].IC1=CC(C[C@H](N)C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 YDTFRJLNMPSCFM-YDALLXLXSA-M 0.000 description 1
- 210000000088 lip Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000005074 megakaryoblast Anatomy 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 108010054452 nuclear pore complex protein 98 Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000869 occipital lobe Anatomy 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011935 selective methylation Methods 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004281 subthalamic nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003478 temporal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
- FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N zorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(\C)=N\NC(=O)C=1C=CC=CC=1)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N 0.000 description 1
- 229960000641 zorubicin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供一种编码转录因子BP1、具有SEQ ID NO:1的分离的DNA,认为BP1是一种β-珠蛋白基因的阻抑蛋白。用含有所述DNA的载体转化的宿主细胞可以用来生产BP1。具有与所述BP1可读框有效连接的可控制启动子的载体,可以用来转化镰状细胞贫血患者的产生β-珠蛋白的细胞,由此提供治疗。因为BP1在白血病细胞和乳腺癌细胞中过量表达,所以可以通过测定可能患有这些疾病的患者的细胞样品中是否过量表达BP1,来筛选和诊断急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和乳腺癌。可以用编码BP1的DNA的反义DNA或RNA作为对急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和乳腺癌的治疗。
Description
本申请要求于1999年8月13日申请的第60/148,940号美国临时申请的优先权。该临时申请通过引用结合到本文中。
关于联邦资助研究的声明
本文所述的研究得到NIH资助号R01DK53533的支持。美国政府在本发明中享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及编码转录因子BP1的DNA、含有所述DNA的载体和含有所述DNA的宿主细胞。本发明也涉及编码BP1的DNA的反义DNA或RNA、用于通过给予有效量BP1治疗镰状细胞贫血的方法、以及用于筛选急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和乳腺癌的方法。
(在所述临时申请中,转录因子BP1有时称为“BP1/Dlx9”或“BP1/D1x9”。在本文中,为了更加明确,将该转录因子简称为“BP1”。)
β-珠蛋白簇中的珠蛋白基因的表达局限于红细胞生成细胞,在胚胎发育(ε)、胎儿发育(Gγ和Aγ)和成体发育(δ和β)期间表达5种不同的基因。珠蛋白基因的转录激活不仅由于转录激活蛋白与待激活基因的启动子结合而发生,也由于位于β-珠蛋白簇上游6-18kb的调节元件-基因座控制区(LCR)而发生(参见例如Berg,P.E.和A.N.Schechter.1992.血红蛋白疾病的分子遗传学。载于T.Friedmann(编著),Molecular Genetic Medicine.Academic Press,San Diego.;Forrester,W.C.,C.Thompson,J.T.Elder和Groudine,M.1986.人类β-珠蛋白基因簇中发育稳定的染色质结构。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1359-1363;和Tuan,D.,W.Soloman,Q.Li和I.M.London.1985.人类类红细胞中的“β-样珠蛋白”基因结构域.Proc。Natl.Acad.Sci.USA 82:6384-6388。)。个体发育期间β-珠蛋白簇基因的顺序激活必定遇到特定发育阶段期间无活性的珠蛋白基因的阻抑。阻抑由于阻抑蛋白与启动子/上游DNA的结合所致,在成体β-珠蛋白基因的情况下,也可能由于缺乏LCR的激活作用所致(参见例如Crossley,M.和S.H.Orkin.1993.β-珠蛋白基因座的调节。Curr.Opinion Gen.Dev.3:232-237。)。虽然对于与β-珠蛋白基因附近的DNA序列结合的转录激活蛋白的了解相当多,但对于阻抑其转录的蛋白质知之甚少。
如以下所讨论的,已经表明BP1与β-珠蛋白基因上游的两个沉默子DNA序列结合,因此有强有力的证据表明,BP1蛋白是一种β-珠蛋白基因的阻抑蛋白。本发明提供编码BP1的DNA序列、使用得自所述DNA序列知识的信息筛选疾病例如乳腺癌、急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的方法。已经发现所述DNA序列与其它两种人类基因DLX4和DLX7密切相关,描述于Quinn,L.M.,B.V.Johnson,J.Nicholl,G.R.Sutherland和B.Kalionis.1997.从人类胎盘中分离和鉴定包括Distal-less家族新成员DLX4在内的同源框基因。Gene 187:55-61和Nakamura S,Stock,DW,Wydner,KL,Bollekens JA,Takeshita K,Nagai BM,Chiba,Kitamura T,Freeland TM,Zhao Z,Minowada J,Lawrence JB,Weiss KB和Ruddle FH.一种新的哺乳动物Distal-less基因Dlx-7的基因组分析。Genomics 1996;38:314-324。
许多类型癌症的存活率与早期检测和治疗相关。此外,监测进行之中的癌症治疗有助于确定有效性。因此,一直需要可靠的癌细胞筛选方法。一个筛选方法是检测和监测与正常细胞相比特定类型癌细胞中过量表达或表达不足的基因的表达。检测技术和具体标记已经公开于例如以下美国专利中:Smith等的美国专利第5,776,683号、Pardee等的美国专利第5,965,409号、Cole等的美国专利第6,037,129号、Holt等的美国专利第5,677,125号、Watson等的美国专利第6,004,756号、Mulshine等的美国专利第5,994,062号、Zon等的美国专利第5,700,927号和Rio等的美国专利第5,981,218号,上述专利通过引用结合到本文中。
因为没有一种标记或筛选方法是完全可靠的,因此在本领域中一直需要另外的遗传标记。特别是,一直需要用于鉴定乳腺癌、急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的遗传标记。本发明通过提供DNABP1组合物和用于筛选乳腺癌、急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的方法,解决了本领域的这一问题。
问题也在于本领域中缺乏有关β-珠蛋白基因阻抑的信息。正如下文所讨论的,有例如镰状细胞贫血的医学病症可以通过阻抑β-珠蛋白的表达而得到治疗,本发明提供了一种推定的β-珠蛋白阻抑蛋白BP1的制备。
发明的公开
本发明的一个目的是提供编码BP1的DNA序列。
本发明的另一目的是提供用于检测急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的标记和方法。
本发明的另一目的是提供用于检测乳腺癌的标记和方法。
本发明的另一目的是提供可以通过阻抑β-珠蛋白基因的表达而减轻的病症的疗法。
本发明的另一目的是提供镰状细胞贫血的疗法。
本发明的另一目的是提供可以通过阻断BP1的表达而减轻的病症的疗法。
在本发明中通过提供具有SEQ ID NO:1、编码BP1的分离的DNA,达到这些目的和其它目的。BP1表现出阻抑蛋白的功能:它与β-珠蛋白基因上游的沉默子I和II结合,并且与δ-珠蛋白基因上游-530bp的序列结合。
本发明也包括包含编码BP1的DNA的载体和用所述载体转化的宿主细胞。
在一个替代的实施方案中,本发明涉及编码BP1、具有SEQ ID NO:1的DNA的反义DNA或反义RNA。
本发明还提供治疗镰状细胞贫血的方法,所述方法包括给予有效量的BP1。
本发明提供急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病的筛选和/或诊断方法,所述方法包括以下步骤:(a)从患者获取细胞样品,和(b)测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1。
本发明也提供乳腺癌的筛选和/或诊断方法,所述方法包括以下步骤:(a)从患者获取细胞样品,和(b)测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1。
本发明还提供抗BP1的多克隆抗体。
本发明还提供用于扩增SEQ ID NO:1的DNA的一组PCR引物。
根据以下详述和附图,本发明的上述目的和其它目的对于相关领域技术人员将变得显而易见,其中仅显示和描述了本发明的优选实施方案,这些实施方案仅仅用于说明实施本发明的最佳模式。正如众所周知的,可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下,在相关领域的技术范围内对本发明进行修改。
附图简述
图1图示了β-珠蛋白上游-100至-600bp的区域,表明BP1于相对于加帽位点(+1)的-530bp与沉默子I结合和于-300bp与沉默子II结合,而另一种DNA结合蛋白BP2于-270bp与沉默子II结合。
图2是一幅放射自显影图,表明EMSA竞争测定的结果,证实所述cDNA编码一种蛋白质,该蛋白质具有预期的BP1结合特异性,即与β-珠蛋白基因上游的沉默子I和II结合以及与δ-珠蛋白基因上游-530bp的序列结合的能力。从λ溶原体表达了与β-半乳糖苷酶融合的所述推定的BP1蛋白。将这种融合蛋白部分纯化,并且与用于筛选所述文库的沉默子II探针一起温育,产生一条第1泳道中由箭头所示的变动的条带。
图3A是一幅放射自显影图,显示了使用630bp BP1 cDNA(如本文所述获得的)一部分作为探针进行的K562 RNA的RNA印迹的结果。识别出一条2.1kb的RNA条带。
图3B是一幅放射自显影图,显示了使用图3A中所述的同一探针进行的胎儿组织的RNA印迹的结果。
图4是BP1的序列。该序列也描述于所附序列表的SEQ ID NO:1中。指明了该序列的可读框以及预测的蛋白质序列,所述蛋白质序列也描述于序列表的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12中。
图5A和图5B图示了瞬时转染测定中相对于增加量pRSV/BP1-ORF(如本文所述亚克隆的)或相对于空载体的K562细胞的相对CAT活性。在图5A中,pεCAT/SI是靶DNA;在图5B中,pεCAT/SII是靶DNA。用增加量的或者空载体或者pRSV/BP1-ORF与靶质粒一起瞬时共转染K562细胞。
图6是一幅放射自显影图,显示了通过RT-PCR检测的BP1在类红细胞谱系细胞系和髓细胞谱系细胞系中的表达。
图7A和图7B是放射自显影图,显示了通过RT-PCR检测的BP1、DLX7和DLX4在T细胞ALL细胞系和红髓细胞(erythromyloid)细胞系中的表达。
图8是一幅放射自显影图,显示了BP1、DLX7和DLX4在正常骨髓、B细胞和T细胞中的表达。使用半定量RT-PCR测定表达。
图9是一幅放射自显影图,显示了BP1、DLX7和DLX4在急性髓细胞白血病中的表达。显示了得自6位患者的样品。(-)表示表达等于或低于正常对照;(+)表示表达高于对照;(+)表示表达率至少三倍于(+)表达率。
图10是一幅图,比较了BP1、DLX7和DLX4在AML和T细胞ALL中的表达。黑色条带代表成年AML,而白色条带代表儿童T细胞ALL。
图11是一幅放射自显影图,显示了BP1在CD34+细胞和CD34-细胞中的表达。
图12是一幅图,显示了在与接受空载体的对照细胞(9A和9B)相比,用BP1反义生产质粒(10B和10D)转化的细胞系4天过程中的生存力百分比。
图13是一幅放射自显影图,显示了接受空载体(第1-2泳道)的细胞系(9A-9B)和用BP1反义生产质粒转化的细胞系10B-10D(第3-4泳道)的BP1表达。
图14是一幅放射自显影图,显示了包括乳腺癌系MCF7 ADR、MDA468和T47D的几种乳腺癌细胞系的BP1表达,而在新乳腺组织中没有表达。
图15是一幅放射自显影图,显示了正常乳腺组织和恶性乳腺组织中BP1的表达。
实施本发明的最佳模式
本发明涉及具有SEQ ID NO:1或基本上由SEQ ID NO:1构成并且编码转录因子BP1的分离的DNA。转录因子BP1表现出β-珠蛋白阻抑蛋白的功能,并且与β-珠蛋白基因上游的沉默子I和II结合、与δ-珠蛋白基因上游-530 bp的序列结合,也与印度(Indian)单倍型D序列结合。BP1通常在胎盘和肾中表达。根据SEQ ID NO:1的分离DNA的可读框推导的BP1的预测序列以SEQ ID NO:2和12给出。在图4中一起给出所述DNA序列和所述蛋白质序列。本文所用的术语“分离的DNA”是指不处于其天然环境的DNA。
在本发明的一个优选实施方案中,编码BP1的所述分离的DNA是一种1251bp的cDNA。所述分离的DNA也包含一个可读框(ORF)。
本发明还涉及含有所述DNA的载体,以及涉及用含有所述DNA的载体转化的宿主细胞。在一个优选实施方案中,所述转化宿主细胞是真核宿主细胞。
本发明还包括具有SEQ ID NO:1的DNA的反义DNA或反义RNA。
本发明还包括镰状细胞贫血的治疗方法,所述方法包括给予需要所述治疗的患者有效量的BP1的步骤。在本发明的该方法中,BP1减少患者体内的β-珠蛋白表达,并且降低HbS的胞内浓度。
本发明还包括急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病的筛选和诊断方法,所述方法包括以下步骤:
(a) 从患者获取细胞样品,和
(b) 确定与正常细胞相比,所述细胞样品是否过量表达BP1。
本发明也包括乳腺癌的筛选和诊断方法,所述方法包括以下步骤:
(a) 从患者获取细胞样品,和
(b) 确定与正常细胞相比,所述细胞样品是否过量表达BP1。
在所述检测白血病和乳腺癌的方法,可以通过用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测编码BP1的mRNA,或通过用免疫组织化学检测来检测BP1自身,确定BP1的过量表达。
本发明还包括从编码BP1的mRNA的cDNA底物扩增单一DNA分子的PCR引物。这类PCR引物可以容易地得自SEQ ID NO:1的DNA序列。本文所用的术语“单一DNA分子”是指具有足够特异性来确定扩增的底物来源于SEQ ID NO:1序列的DNA。
本发明还包括抗BP1的多克隆抗体和单克隆抗体。可以如下所述,通过用BP1或其抗原性片段免疫哺乳动物,以诱导产生含有多克隆抗体的血清,获得多克隆抗体。抗BP1的单克隆抗体可以采用杂交瘤技术获得,杂交瘤技术通常还包括以下步骤:从免疫后的哺乳动物分离脾细胞,将其与骨髓瘤细胞融合,然后鉴定分泌与BP1结合的抗体的融合细胞。
本发明还包括阻抑β-珠蛋白基因的方法,所述方法包括给予有效量的BP1。
以下进一步表征本发明的这些方面。首先,表明BP1 cDNA的克隆及其在瞬时共转染测定中的过量表达引起与β-珠蛋白基因的或者沉默子I或者沉默子II连接的报道基因的阻抑。这提供了BP1是一种β-珠蛋白基因的阻抑蛋白的证据。测序揭示了编码BP1的DNA含有一个同源框,使得将所述DNA置于相互调节并且也调节不相关基因的一个保守基因家族中(参见例如Jaynes,J.B.P.H.和O’Farrell.1988.结合一个共同位点的含同源域蛋白对转录的激活和阻抑。Nature 336:744-749和其中的参考文献;Levine,M.和T.Hoey.1988.作为序列特异性转录因子的同源框蛋白。Cell 55:537-540。)。序列比较表明,编码BP1的DNA属于同源框基因的Distal-less家族,该家族在早期发育期间表达(参见例如Cohen,S.M.和G.Jurgens.1989.果蝇属(Drosophila)中的近端-远端模式形成:在肢体发育中细胞对于Distal-less基因活性的自发需求。EMBO J 8:2045-2055;Cohen,S.M.,G.Bronner,F.Kuttner,G.Jurgens和H.Jackle.1989.在果蝇属中Distal-less编码肢体发育所需的一种同源域蛋白。Nature 338:432-434;Dolle,P.,M.Price和D.Duboule.1992.在面部、眼部和肢体发育期间鼠Dlx-1同源框基因的表达。Differentiation 49:93-99;Robinson,G.W.和K.Mahon.1994.Dlx-2和Dlx-3的分化和重叠表达结构域提示Distal-less同源框基因在颅面发育中的独特作用。Mech.Dev.48:199-215;Simeone,A.,D.Acampora,M.Pannese,M.D’Esposito,A.Stornaiuolo,M.Gulisano,A.Mallamaci,K.Kastury,T.Druck和K.Huebner.1994.脊椎动物Dlx基因家族两个成员的克隆和特征鉴定。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2250-54;和Stock,D.W.,D.L.Ellies,Z.Zhao,M.Ekker,F.H.Ruddle和K.M.Weiss.1996.脊椎动物Dlx家族的进化。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10858-10863。)。编码BP1的DNA的表达是高度局限性的,这是发育上重要的基因的特征。克隆和表征BP1材料和方法:
克隆BP1:用一种寡核苷酸探针筛选λgt11 K562细胞cDNA表达文库(Clontech,Inc.),所述寡核苷酸探针含有位于沉默子II DNA中的BPl结合部位,这包括β-珠蛋白基因上游-336bp和-278bp之间的序列。如已描述的方法(参见例如Vinson,C.R.,K.L.LaMarco,P.F.Johnson,W.H.Landschulz和S.L.McKnight.1988.由一种重组噬菌体特化的序列特异性DNA结合活性的原位检测。Genes & Devel.2:801-806),其中对其进行几处修改,进行筛选。滤膜在含有5%Carnation的即溶奶粉的结合缓冲液(参见例如Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.AcidsRes.17:8833-8852)中,于4℃预杂交30分钟,然后在同一缓冲液中于4℃振摇杂交2-12小时。纯化阳性噬斑,并经过另外三轮筛选。
电泳迁移率变动分析(EMSA):结合反应包括加入结合缓冲液(10mM Tris,pH 7.5,50mM NaCl,5%甘油,1mM DTT,1μl 1 mg/ml BSA,1μg poly(dI-dC))中的500pg融合蛋白或250ng核提取物和5,000-10,000cpm 32P-dCTP标记的探针。在室温下保温30分钟。按照Dignam等所述(Dignam,J.D.,R.M.Lebovitz和R.G.Roeder.1983.在得自分离的哺乳动物细胞核的可溶性提取物中由RNA聚合酶II引起的准确转录起始。Nucl.Acids Res.11:1475-1489)制备核提取物。按照已描述的方法(参见例如Cowell,I.G.和H.C.Hurst.199.从cDNA表达文库克隆转录因子,载于D.S.Latchman(编著),Transcription factors:a practicalapproach.第120-122页,IRL Press,New York)制备得自溶原体的蛋白质提取物。将竞争者与核提取物一起预保温20分钟,然后加入所述探针。用于EMSA分析的探针和竞争者的寡核苷酸序列示于下面。名称 序列-530参比 TGTATATATACACATATATATATATATTTTTTTT
CTTTTCTTACCAGAAGGTTT (SEQ ID NO:3)-530 Indian TGTACATATACACATATATATATATATATA
TTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTT (SEQ ID NO:4)-300 β TTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACG
ATCTTCAATATGCTTACCAAGCTG (SEQ ID NO:5)-530 δ TTCTTTTAA TGGATATTTATTTCAATATAAT
AAAAAATTAGAGTTTTA (SEQ ID NO:6)非特异性 TGCATATATATGTATATGTATGTGTGTATA (SEQ ID
NO:7)
质粒的构建:为了构建表达BP1 cDNA可读框的质粒,通过RT-PCR从K562细胞muRNA扩增BP1 cDNA。将所得的1000bp产物克隆到pGEM7载体(Promega,Inc.)中,并且通过测序确证其身份。该质粒用HindIII和XbaI切割,以释放BP1 ORF,将其定向克隆到pRc/RSV(Invitrogen,Inc.)中。
转染和CAT测定:用DMRIE-C试剂(Gibco-BRL,Inc.),在K562细胞中进行瞬时转染测定。让细胞生长至5×105细胞/ml的密度,每个转染反应使用总共2×106细胞。使用OPTI-MEM无血清培养基(Gibco-BRL,Inc.),在6个孔板中进行转染。在加入总共8μg的质粒DNA和鲑精DNA,在室温下与1ml OPTI-MEM I减少血清培养基(Gibco-BRL,Inc.)中的16μl DMRIE-C试剂络合15-45分钟。每孔加入0.2ml无血清培养基中的2×106细胞,将孔板于37℃孵育4-5小时。加入2ml生长培养基,在48小时后收获细胞。如已描述的方法(参见例如Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.Acids Res.17:8833-8852)进行CAT测定。
RNA印迹分析:用RNeasy试剂盒和Oligotex试剂盒(Qiagen,Inc.)分离RNA。每个泳道电泳2μg mRNA,然后通过毛细管作用将其转移至Hybond N滤膜(Amersham)上。用Stratolinker(Stratagene)将RNA交联至滤膜上,用或者标准方法或者夹心法进行滤膜的杂交,这消除了背景(参见例如Wu,S.,Q.Lu和A.L.Kriz.1995.RNA印迹和DNA印迹的一步多夹心杂交。BioTechniques 18:585-586。)。购买RNA斑点印迹(Clontech,Inc.);所述印迹上加载的RNA的量已经由厂商相对于8种不同管家基因标准化,不需要将样品标准化。探针是一种630bp的DNA片段,是通过PCR扩增克隆于pBluescript的BP1 cDNA,随后用Eco RI消化释放缺乏同源框序列的部分3’BP1 cDNA而获得的。将其通过随机引发进行标记,然后于65℃杂交过夜。洗涤印迹并且对X光胶片曝光。
RT-PCR:用TRIzol试剂(GIBCO BRL),按照厂商的说明分离总RNA。用SuperScript II RT(GIBCO BRL),在20μl的总反应体积中对1微克RNA进行反转录。在分别由16.8μl蒸馏水、2.5μl 10×PCR缓冲液(200mM Tris-HCl[pH 8.4],500mM KCl)、1.5μl 25mM MgCl2、0.5μl 10mM dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mM)、0.2μl(1单位)Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)以及10μM β肌动蛋白或BP1正向引物和反向引物各1μl构成的25μl总反应体积中,用1μl反转录产物进行PCR。根据线性测定结果,对于BP1使用以下PCR条件。每个PCR循环如下组成:一个变性步骤(94℃,1分钟)、一个退火步骤(58℃,1分钟)和一个延伸步骤(72℃,1.5分钟),进行27个循环,然后是一个额外的延伸(72℃,5分钟)。设计扩增一种581bp产物的引物是:正向:5’-CACCTCCTGTCTTACCCCTACACC-3’SEQ ID NO:8;反向:5’-GCCCTTCCCCAGATTCACATCATC-3’SEQ ID NO:9。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,用溴化乙锭显现。该产物通过用限制性酶切割并且与内部探针杂交来确证。
或者,可以用以下引物:正向5’-GTATGGCCACCTCCTGTCTT-3’(SEQ ID NO:10)和反向:5’-GAGTAGATGGTCCTCGGCTT-3’(SEQID NO:11),在以下条件下获得一种225bp的产物:94℃2分钟;然后94℃1分钟、62℃1分钟和72℃1.5分钟,30个循环;72℃10分钟。BP1 cDNA的克隆:
用一种含有-300bp BP1结合部位的多聚化寡核苷酸,探测由人K562细胞制备的λgt11 cDNA表达文库。筛选两百万个噬斑,分离出一个阳性噬斑,该噬斑表达一种识别-300bp BP1结合部位、但不识别阴性对照序列的蛋白质。
为了确证该cDNA编码具有BP1的预期结合特异性(即与β-珠蛋白基因上游的沉默子I和II结合并且与δ-珠蛋白基因上游-530bp的序列结合的能力(参见例如Berg,P.E.,S.Abhyankar和M.Chase.1994.高速泳动族蛋白HMG-I(Y)与人类β-珠蛋白基因上游的一个沉默子DNA序列结合。Blood 84增刊1:262a))的蛋白质,进行EMSA竞争测定。如上所述,从一种λ溶原体表达与β-半乳糖苷酶融合的推定的BP1蛋白。将这种融合蛋白部分纯化,与用于筛选该文库的沉默子II探针一起温育,产生单一的变动的条带,如箭头所示(图2,第1泳道)。顶部的条带标记所述孔的位置,而底部的条带含有未变动的探针。加入100倍和200倍摩尔过量的冷竞争者,以测定特异性。变动的条带受到自身DNA(未标记的-300结合部位,第2-3泳道)、含有或者参比序列(野生型)或者印度单倍型序列的沉默子I中-530bp的BP1结合部位(第6-9泳道)和δ-珠蛋白基因上游发现的BP1结合部位(第10-11泳道)的竞争,而不与非特异性DNA竞争(第4-5泳道)。注意:所述印度序列是优于所述参比序列的竞争者,表明BP1与印度序列的结合更为紧密,正如先前用K562核提取物观察到的(参见例如Elion,J.,P.E.Berg,C.Lapoumeroulie,G.Trabuchet,M.Mittelman,R.Krishnamoorthy,A.N.Schechter和D.Labie.1992.β-珠蛋白基因5’的负控制区中DNA序列的变异与βs突变的表型表达相关。Blood 79:787-792。)。阴性对照-纯β半乳糖苷酶蛋白没有表现出对所述探针的结合活性(数据未显示)。EMSA分析因此证明:所述融合蛋白的结合特性符合预期的BP1的特性。
所得BP1 cDNA的长度为630bp。当在含K562 RNA的RNA印迹中用该序列的部分作为探针时,识别一条2.1kb的RNA条带(图3A)。这一结果表明:克隆了不完整的cDNA。为了延伸所述cDNA序列,使用cDNA末端的快速扩增(RACE)。获得5’方向和3’方向的额外序列,得到1366bp的cDNA。随后的微调产生SEQ ID NO:1(和图4)的1251bp序列。此外,获得了预测的可读框(ORF)。
使用BLAST的计算机分析表明,BP1含有一个同源框(HB),这将其分类为已知在发育中重要的一个基因家族中。已经定义了几个同源框基因的亚家族。根据与这些基因的同源框的序列同源性,BP1是Distal-less(Dlx)家族的一员。在图4中,同源框以下划线标注,并且也指示在同源域(参见例如Pabo,C.O.和R.T.Sauer.1992.转录因子:DNA识别的结构家族和原理。Annu.Rev.Biochem.61:1053-1095。)中发现包含三个预测α螺旋的氨基酸。第二个和第三个螺旋包含螺旋-转角-螺旋(HTH)基序,这是同源域的特征。根据与Kozak共有序列(参见例如Kozak,M.1987.得自699种脊椎动物信使RNA的5’非编码序列的分析。Nucl.Acids Res.15:8125-8148)的同源性,确定了一个推定的翻译起始位点。显示了可读框(ORF)及其预测的氨基酸序列。瞬时转染测定:
为了检查所克隆的BP1 ORF的功能,进行瞬时转染测定。将上述可读框(ORF)亚克隆,以构建pRSV/BP1-ORF。用增加量的或者空载体或者pRSV/BP1-ORF与靶质粒一起瞬时共转染K562细胞(图5A和5B)。靶DNA由克隆到一种表达载体中的沉默子I(pεCAT/SI)或沉默子II(pεCAT/SII)构成,所述表达载体含有与CAT报道基因融合的ε-珠蛋白启动子。(最初将该质粒用于确定沉默子I和II的实验中(参见例如Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.Acids Res.17:8833-8852))。将CAT活性对共转染的内部标准pCMV/βgal标准化。相对CAT活性以接受pRSV/BP1-ORF的细胞中的CAT活性与仅接受空载体的细胞的CAT活性之比来计算。当将增加量的pRSV/BP1-ORF DNA加入pεCAT/SI时(图5A),CAT活性以依赖于剂量的方式受到阻抑,平台始于3μgpRSV/BP1-ORF。同样,在pεCAT/SII中增加pRSV/BP1-ORF DNA的加入,引起CAT报道基因的阻抑增加(图5B),但加入最低量1μg时,引起CAT表达的急剧降低。对照-缺乏沉默子DNA的εCAT质粒对于pRSV/BP1-ORF的加入无反应(数据未显示)。因此,表明BP1对β-珠蛋白基因的两个沉默子均表现出阻抑蛋白活性。BP1的表达分析:
进行RNA分析,以确定人类组织和细胞系中BP1表达的模式。在胎盘中,BP1探针识别三个条带:2.1kb、2.6kb和3.2kb(图3A)。也探测了胎儿组织的RNA印迹,结果示于图3B中。在胎肾和胎肺中有表达(第1和3泳道),为2.1kb和6.3kb的条带,而在胎肝或胎脑中没有检测到表达(第2和4泳道)。2.1kb的条带可能对应于BP1,因为它是从中克隆BP1的K562细胞中的唯一条带。其它条带可以代表其它的同种型,通常与同源框基因相关(参见例如Cohen,S.M.和G.Jurgens.1989.果蝇属(Drosophila)中的近端-远端模式形成:在肢体发育中细胞对于Distal-less基因活性的自发需求。EMBO J 8:2045-2055;Lowney,P.,J.Corral,M.M.LeBean,L.Deaven,H.J.Lawrence和C.Largman.1991.一种人类Hoxl同源框基因在人类造血细胞中表现出可变转录物的骨髓特异性表达。Nucl.Acids Res.19:3443-3449和O’Connor,M.B.,R.Binari,L.A.Perkins和W.Bender.1988.得自双胸复合体的超双胸域的可变RNA产物。EMBO J 7:435-445。)。
为了分析各种各样组织中的表达,探测了含有得自50种组织的正常人类RNA的斑点印迹(以下表1)。在胎盘和肾中观察到强表达,而在脑皮质、脾、乳腺、小肠、肺、胎肺和胎肾(后两者存在于图3B的RNA印迹上和RNA斑点印迹上)中观察到弱表达。得自另外41种组织的RNA没有表现出表达。
表1 BP1的组织特异性表达强 弱 阴性 阴性胎盘 脑皮质 全脑 甲状腺肾 脾 扁桃体 唾液腺
乳腺 尾状核 垂体腺
小肠 气管
肺 小脑 外周淋巴细胞
胎肺 海马 淋巴结
胎肾 额叶 骨髓
延髓 阑尾
枕叶 丘脑
豆状核 肝
黑质 脊髓
胎脾
颞叶 胎胸腺
底丘脑核 胎脑
胸腺 胎心
心脏 胎肝
主动脉
骨骼肌
结肠
膀胱
子宫
前列腺
胃
睾丸
卵巢
胰
肾上腺
迄今为止,已经描述了在正常血细胞生成发育(hematopoieticdevelopment)期间和白血病细胞系中通常以谱系特异性方式表达的、属于HOX家族的25种人类同源框基因(参见例如Lawrence,H.J.和C.Largman.1992.正常血细胞生成和白血病中的同源框基因。Blood 80:2445-2453)。因此,通过RT-PCR检查红细胞类谱系和骨髓谱系细胞系中BP1的表达(图6)。在类红细胞K562和HEL细胞以及单核细胞THP-1和U937细胞中观察到最强表达,而在巨核细胞MEG-01和单核细胞/粒细胞HL60中观察到较低的表达。虽然该实验中所用的细胞系通常用于检查造血谱系的基因表达,但应该注意到,它们来源于白血病。
如上所述,BP1表现出阻抑蛋白的功能。使用增加量的含有所述ORF的质粒,引起对含有沉默子I或II DNA的靶εCAT报道基因的阻抑增加。所述报道基因的表达没有被完全消除,据信是由于对于其它低丰度阻抑蛋白结合的可能需要所致。一种这样的蛋白质是BP2,它也与沉默子II DNA结合,看来具有阻抑蛋白功能(Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.Acids Res.17:8833-8852和Ebb,D.,D.C.Tang,L.Drew,K.Chin,P.E.Berg和G.P.Rodgers.1998.阻抑成体β-样珠蛋白基因的调节元件的鉴定。Blood Cells,Mol.,Dis.24:356-369。)。沉默子II功能需要完整的BP1结合部位的数据和事实(参见例如Ebb,D.,D.C.Tang,L.Drew,K.Chin,P.E.Berg和G.P.Rodgers.1998.阻抑成体β-样珠蛋白基因的调节元件的鉴定。Blood Cells,Mol.,Dis.24:356-369。)表明,BP1最可能是一种β-珠蛋白基因的阻抑蛋白。因此,它是被克隆的第一个β-珠蛋白阻抑蛋白。
BP1是一种同源框基因,也是Distal-less家族的成员(参见例如Cohen,S.M.,G.Bronner,F.Kuttner,G.Jurgens和H.Jackle.1989.在果蝇属中Distal-less编码肢体发育所需的一种同源域蛋白。Nature338:432-434。)。同源框基因被认为是发育期间的主调节基因,因为在突变时,发生大量的形态异常。Distal-less基因发现于如小鼠、非洲蟾蜍属(Xenopus)、斑马鱼和人类的多种多样的生物中(参见例如Stock,D.W.,D.L.Ellies,Z.Zhao,M.Ekker,F.H.Ruddle和K.M.Weiss.1996.脊椎动物Dlx家族的进化。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10858-10863)。在果蝇属中,幼虫头部和胸部感觉器官的正常发育需要Distal-less(称为D11)。在幼虫和成体果蝇中,D11在肢体远端区发育中起重要作用(参见例如Cohen,S.M.和G.Jurgens.1989.果蝇属(Drosophila)中的近端-远端模式形成:在肢体发育中细胞对于Distal-less基因活性的自发需求。EMBO J 8:2045-2055和Cohen,S.M.,G.Bronner,F.Kuttner,G.Jurgens和H.Jackle.1989.在果蝇属中Distal-less编码肢体发育所需的一种同源域蛋白。Nature 338:432-434。)。在果蝇属中有一个D11基因,但在其它生物中有多个Distal-less基因。在哺乳动物中,迄今已经鉴定出7个Distal-less(在哺乳动物中称为Dlx)基因。在鼠类发育期间,Dlx基因在鳃弓、前脑、肢体、眼、牙齿、骨和面间充质中表达(参见例如Dolle,P.,M.Price和D.Duboule.1992.在面部、眼部和肢体发育期间鼠Dlx-1同源框基因的表达。Differentiation 49:93-99,Robinson,G.W.和K.Mahon.1994.Dlx-2和Dlx-3的分化和重叠表达结构域提示Distal-less同源框基因在颅面发育中的独特作用。Mech.Dev.48:199-215和Simeone,A.,D.Acampora,M.Pannese,M.D’Esposito,A.Stornaiuolo,M.Gulisano,A.Mallamaci,K.Kastury,T.Druck和K.Huebner.1994.脊椎动物Dlx基因家族两个成员的克隆和特征鉴定。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2250-54)。
BP1和最近发现的两个人类基因DLX7(参见例如Nakamura S.,D.W.Stock,K.L.Wydner,J.A.Bollekens,K.Takeshita,B.M.Nagai,S.Chiba,T.Kitamura,T.M.Freeland,Z.Zhao,J.Minowada,J.B.Lawrence,K.B.Weiss和F.H.Ruddle.1996.一种新的哺乳动物Distal-less基因:Dlx-7的基因组分析。Genomics 38:314-324)和DLX4(先前称为Dlx8;参见例如Quinn,L.M.,B.V.Johnson,J.Nicholl,G.R.Sutherland和B.Kalionis.1997.从人类胎盘中分离和鉴定包括Distal-less家族新成员DLX4在内的同源框基因。Gene 187:55-61)看来是同种型,因为其同源框相同,并且它们表现出多个扩大的同源性区。在原位杂交中使用荧光,将BP1作图至染色体17q21-23,这也是DLX7和DLX4的基因座。此外,BP1和DLX7(参见例如Nakamura S.,D.W.Stock,K.L.Wydner,J.A.Bollekens,K.Takeshita,B.M.Nagai,S.Chiba,T.Kitamura,T.M.Freeland,Z.Zhao,J.Minowada,J.B.Lawrence,K.B.Weiss和F.H.Ruddle.1996.一种新的哺乳动物Distal-less基因:Dlx-7的基因组分析。Genomics 38:314-324和Price,J.A.,D.W.Bowden,J.T.Wright,M.J.Pettenati和T.C.Hart.1998.Dlx3中一个与tricho-dento-osseous(TDO)综合征有关的突变的鉴定。Hum.Mol.Gen.7:563-569)从BP1的核苷酸565-1250享有完全的序列同一性,虽然在nt 565更远的上游没有同源性。BP1和DLX4之间的序列同源性也始于BP1的nt 565,并且包括该同源框。尚不了解DLX7和DLX4的功能。然而,在K562细胞中DLX7表达的消除引起细胞凋亡(参见例如Shimamoto,T.,S.Nakamura,J.Bollekens,F.H.Ruddle和K.Takeshita.1997.对Dlx-7同源框基因的抑制引起GATA-1和c-myc基因表达的减少以及引起细胞凋亡。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3245-3249)。初步数据提示,在K562细胞中缺乏BP1引起细胞凋亡。
BP1的一个突出的特征是其局限性表达。BP1 mRNA在胎盘和肾中表达最强(表1和图3)。虽然在所述探针中没有同源框序列,但与DLX7有部分序列同源性。因此,采用BP1特异性引物,通过RT-PCR评价BP1在胎盘和骨髓中的表达;观察到正确大小的一个条带。表现出弱杂交的7种组织可能正在表达BP1和/或DLX7。
41种组织缺乏BP1的表达。如果BP1阻抑成体珠蛋白基因的表达,则在胎肝和胎脾中没有BP1 mRNA似乎出乎意料。然而,这两种组织均得自24周的胎儿,此时β-珠蛋白表达已经开始(参见例如Ley,T.J.,K.A.Maloney,J.I.Gordon和A.L.Schwartz.1989.人类红细胞类胎肝细胞中珠蛋白基因的表达。J.Clin.Invest.83:1032-1038,Mavilio,F.,A.Giampaolo,A.Care,G.Migliaccio,M.Calandrini,G.Russo,G.L.Pagliardi,G.Mastroberardino,M.Marinucci和C.Peschle.1983.人类血红蛋白开关的分子机制:珠蛋白基因在胚胎、胎儿和成体成红细胞中的选择性甲基化不足和表达。Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80:6907-6911,和Papayannopoulou,T.,T.H.Shepard和G.Stamatoyannoupoulos.1983.使用抗γ-珠蛋白和抗β-珠蛋白链荧光抗体研究人类早期胎儿的类红细胞中血红蛋白表达。载于:G.Stamatoyannopoulos和A.W.Nienhuis(编著),Globin Gene Expressionand Hematopoietic Differentiation.第421-430页,Alan R.Liss,NewYork)。为了进一步检查这一点,对4个10周胎肝样品进行RT-PCR。甚至到10周时,β-珠蛋白的转录就已经开始了(参见例如Ley,T.J.,K.A.Maloney,J.I.Gordon和A.L.Schwartz.1989.人类红细胞类胎肝细胞中珠蛋白基因的表达。J.Clin.Invest.83:1032-1038),使用30个循环的扩增样品,没有检测到BP1的表达;使用35个循环时,在所述四个样品的每个样品中观察到可检测的正确大小的条带。因此,在胎肝中BP1的量非常低;没有得到卵黄囊组织以更好地追踪其表达模式。
至少25种HOX基因(这是最大的人类同源框基因家族)在血细胞生成发育期间通常以谱系特异性方式表达(有关综述参见Lawrence,H.J.和C.Largman.1992.正常血细胞生成和白血病中的同源框基因。Blood 80:2445-2453。)。然而,尚不了解这些基因的功能。BP1被鉴定为β-珠蛋白基因的调节物,使其成为第一个在血细胞生成中具有已知功能的人类同源框基因。
除上文讨论的沉默子I和沉默子II结合部位外,已经鉴定出可能受BP1调节的其它潜在的基因靶。进行序列分析,以鉴定与已知的BP1结合部位具有至少75%同源性的DNA序列。在γ-珠蛋白基因上游鉴定出三个位点。这些位点位于Gγ-珠蛋白基因上游-1427bp和-1091bp以及Aγ-珠蛋白基因上游-1091bp。使用电泳迁移率变动分析,表明这些位点是BP1蛋白的结合部位。多克隆抗体的产生、免疫沉淀和蛋白质印迹分析
在兔子中产生针对独特N末端BP1肽SYPYTEPANPGDSYLSCQQ(SEQ ID NO:13)的多克隆抗体(ResearchGenetics)。用A蛋白Sepharose珠(Biorad)对新鲜制备的K562细胞蛋白裂解液进行免疫沉淀。用等量的K562蛋白裂解液、免疫沉淀的裂解液和冷的体外转录/翻译蛋白产物,通过12.5%SDS-PAGE凝胶进行分析。将所述蛋白质电泳转移至硝化纤维素膜上。BP1抗体在PBS中稀释(1∶2500),并且将其加入,于室温达2小时,然后加入抗兔第二抗体。用ECL试剂盒,按照建议的方案(Amersham Pharmacia Biotech),完成所述信号的检测。含反义BP1 DNA的质粒的构建
如下将239bp(nt 219-558)的BP1 DNA片段以反义方向克隆到载体pMT中,置于绵羊金属硫蛋白启动子控制之下。用扩增所述BP1cDNA的nt 219和nt 1231之间的DNA的引物,进行RT-PCR。将该片段制成平端,克隆到pGEM7中。利用pGEM7的多接头中的一个5’BamHI位点和位于nt 558(在BP1内部)的一个Xho I位点,从该载体释放BP1 DNA。将这种239bp的BPI片段以反义反向定向克隆到pMT中。(参见例如Canelles,M.,Delgado,M.D.,Hyland,K.M.Lerga,A.,Richard,C.,Dang,C.V.和Leon,J.(1997)在人类骨髓细胞中Max和抑制性cMyc突变体诱导红细胞类分化和对细胞凋亡的抗性。Oncogene14,1315-1327。)。镰状细胞贫血的治疗
β-珠蛋白基因的第六个密码子中的一个突变导致镰状细胞贫血。目前对于镰状细胞贫血的疗法集中于对胎儿血红蛋白基因的重激活。这样的疗法可以包括基因治疗,这可以用来或者置换β-珠蛋白基因,或者加入经工程改造以过量表达胎儿珠蛋白的胎儿珠蛋白基因。然而,这些疗法由于存在缺陷型镰状细胞β蛋白而受到阻碍,缺陷型镰状细胞β蛋白干扰正常血红蛋白的形成。
如上所述,在β-珠蛋白基因上游有两个沉默子区,有两种蛋白质BP1和BP2与它们结合(参见例如Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.AcidsRes.17:8833-8852)。BP1在位于相对于加帽位点(+1)的-530bp与沉默子I结合和于-300bp与沉默子II结合,而BP2于-270bp与沉默子II结合,如图1所示。有趣的是,发现一种构筑蛋白-高速泳动族蛋白I(HMG-I(Y)),与沉默子I中BP1结合部位或其附近的DNA结合并且使其弯曲,但不与沉默子II中BP1结合部位或其附近的DNA结合(参见例如Chase,M.B.,S.Haga,W.D.Hankins,D.M.Williams,Z.Bi,J.W.Strovel,C.Obriecht和P.E.Berg.1999.HMG-I(Y)的结合引发人类β-珠蛋白基因的一个沉默子中的结构变化。Am.J.Hem.60:27-35)。HMG-I(Y)可能促进BP1和其它可能的阻抑蛋白在该区中的结合。沉默子II中BP1位点的突变部分缓解阻抑(参见例如Ebb,D.,D.C.Tang,L.Drew,K.Chin,P.E.Berg和G.P.Rodgers.1998.阻抑成体β-样珠蛋白基因的调节元件的鉴定。Blood Cells,Mol.,Dis.24:356-369),提示BP1可能作为β-珠蛋白基因的阻抑蛋白起作用。此外,BP1结合于另一成体珠蛋白基因δ-珠蛋白基因上游的负调节区中(参见例如Berg,P.E.,S.Abhyankar和M.Chase.1994.高速泳动族蛋白HMG-I(Y)与人类β-珠蛋白基因上游的一个沉默子DNA序列结合。Blood 84增刊1:262a)。本发明人认为,BP1协同调节成体珠蛋白基因的表达。
BP1蛋白可能直接参与发育期间从胎儿血红蛋白至成体血红蛋白的开关,因为它与胎儿γ-珠蛋白基因附近的DNA结合,也与成体δ-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因附近的DNA结合。实验已经证明,BP1结合活性在胎儿珠蛋白基因的药理学重激活时增强。
由于认为BP1激活胎儿基因,而阻抑成体基因,故可以潜在地将其用来治疗镰状细胞贫血,作为涉及加入正常β基因或γ基因的治疗的一种替代方法。
已经观察到在BP1的结合亲和力和镰状细胞贫血(SCA)严重程度之间的负相关(参见例如Elion,J.,P.E.Berg,C.Lapoumeroulie,G.Trabuchet,M.Mittelman,R.Krishnamoorthy,A.N.Schechter和D.Labie.1992.β-珠蛋白基因5’的负控制区中DNA序列的变异与βs突变的表型表达相关。Blood 79:787-792。)。在镰状细胞贫血中,突变的β-珠蛋白基因(βs)与5种限制单倍型绝对地连锁不平衡(参见例如Kulozik,A.E.,J.S.Wainscoat,G.R.Serjeant,B.D.Kar,B.Al-Awamy,G.J.F.Essan,A.G.Falusi,S.K.Haque,A.M.Hilali,S.Kate,W.A.E.P.Ranasinghe和D.J.Weatherall.1986.βs-珠蛋白基因单倍型的地理研究:镰状细胞突变独立的亚洲起源的证据。Am.J.Hum.Genet.39:239-244;Lapoumeroulie,C.,O.Dunda,G.Trabuchet,M.Mony-Lobe,D.Labie,J.Elion和R.Krishnamoorthy.1989.再一种非洲起源的新型镰状基因:喀麦隆型。Blood 74:225a和Pagnier,J.,J.G.Mears,O.Dunda-Belkhodja,K.E.Schaefer-Rego,C.Beldjord,R.L.Nagel和D.Labie.1984.非洲血红蛋白S基因多中心起源的证据。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1771-1773。)。在所述单倍型中镰状细胞贫血的临床严重程度有差异,印度-阿拉伯型(Indian-Arabo)(下文称为印度单倍型)是最轻的,而班图型(Bantu)最为严重(参见例如Ali,S.A.1970.与异常高水平胎儿血红蛋白相关的科威特阿拉伯人中镰状细胞病的较轻度变异体。Br.J.Haematol.19:613-619和Perrine,R.P.,M.E.Pembrey,S.Perrine和F.Shoup.1978.沙特阿拉伯人中镰状细胞贫血的自然史。对270位受治疗者的研究。Ann.Internal.Med.88:1-6)。BP1的-530bp结合部位中的序列多态性也与这5种SCA单倍型连锁不平衡(参见例如Chebloune,Y.,J.Pagnier,G.Trabuchet,C.Faure,G.Verdier,D.Labie和V.M.Nigon.1988.非洲镰状细胞贫血患者中β-珠蛋白基因5’侧翼区的结构分析:非洲镰状细胞突变三种起源的进一步的证据。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4431-4435)。
使用电泳迁移率变动竞争分析,发现BP1与印度单倍型序列结合的紧密程度5-6倍于与正常序列或参比序列的结合(参见例如Berg,P.E.,M.Mittelman,J.Elion,D.Labie和A.N.Schechter.1991.与β-珠蛋白合成降低相关的与人类β-珠蛋白基因的-530突变的蛋白结合增加。Am.J.Hematol.36:42-47;Elion,J.,P.E.Berg,C.Lapoumeroulie,G.Trabuchet,M.Mittelman,R.Krishnamoorthy,A.N.Schechter和D.Labie.1992.β-珠蛋白基因5’的负控制区中DNA序列的变异与βs突变的表型表达相关。Blood 79:787-792和Zeng,F.-y.,G.P.Rodgers,S.-z.Huang,A.N.Schechter,M.Salamah,S.Perrine和P.E.Berg.1994.具有阿拉伯单倍型的镰状细胞贫血患者β-珠蛋白基因的-530区的序列。Human Mutation 3:163-165)。另一方面,BP1与班图单倍型序列的结合比与参比序列的结合弱1-2倍(参见例如Elion,J.,P.E.Berg,C.Lapoumeroulie,G.Trabuchet,M.Mittelman,R.Krishnamoorthy,A.N.Schechter和D.Labie.1992.β-珠蛋白基因5’的负控制区中DNA序列的变异与βs突变的表型表达相关。Blood 79:787-792),这可能使得βs的转录更多,导致血红蛋白S的浓度增加。这与在班图型中观察到的镰状细胞病的严重程度增加相关。
如上所述,BP1是一种用于治疗镰状细胞贫血(SCA)的强有力的候选者。预期降低βs-珠蛋白的表达,将降低HbS的胞内浓度,进而降低HbS的胞内浓度和聚合物的形成,后者据信是SCA临床效应的主要原因(参见例如Schechter,A.N.,C.T.Noguchi和G.P.Rodgers.1987.镰状细胞病。载于G.Stamatoyannopoulos,A.W.Nienhuis,P.Leder,Majerus,P.W.(编著),The Molecuar Basis of Blood Diseases.第179-218页,Saunders Philadelphia)。另外,用阻抑蛋白例如BP1治疗,也可以间接再激活胎儿珠蛋白基因。这一观点基于已很好建立的体内和体外观察,所述观察证明胎儿珠蛋白基因和成体珠蛋白基因的交互调节。Dover和Boyer(参见例如Dover,G.J.和S.H.Boyer.1987.含胎儿血红蛋白的细胞具有与无胎儿血红蛋白的细胞相同的普通颗粒血红蛋白:正常研究对象和高胎儿血红蛋白产生的研究对象中的γ-珠蛋白基因表达和β-珠蛋白基因表达之间的交互关系。Blood 69:1109-1113)证明,交互调节存在于由于SCA而表达高水平HbF和低水平HbA、胎儿血红蛋白异型细胞遗传存留(HPFH)和β地中海贫血的个体中。Perrine等(参见例如Perrine,S.P.,B.A.Miller,M.F.Greene,R.A.Cohen,N.Cook,C.Shackleton和D.V.Faller.1987.丁酸类似物增加新生儿红细胞类祖细胞中的γ-珠蛋白基因的表达。Biochem.Biophys.Res.Comm.148:694-700)表明,在糖尿病母亲的婴儿血浆中以高水平存在的两种因子α-氨基-正丁酸和胰岛素增加γ-珠蛋白的表达,并且伴随有β-珠蛋白表达的降低。此外,培养的得自β地中海贫血患者和SCA患者的红细胞类祖细胞,当用丁酸钠、丁酸4-苯酯或乙酸苯酯处理时,表现出γ-珠蛋白表达增加和β-珠蛋白表达的交互降低(参见例如Fibach,E.,P.Prasanna,G.P.Rodgers和D.Samid.1993.得自正常供体以及得自镰状细胞贫血患者和β地中海贫血患者的红细胞类前体中由乙酸苯酯和丁酸4-苯酯引起的胎儿血红蛋白产生增强。Blood 82:2203-2209和Perrine,S.P.,B.A.Miller,D.V.Faller,R.A.Cohen,E.P.Vichinsky,D.Hurst,B.H.Lubin和T.Papayannopoulou.1989.丁酸钠增强HbSS和β地中海贫血患者红细胞类祖细胞中的胎儿珠蛋白基因表达。Blood 74:454-459)。由于目前SCA的治疗集中于对胎儿珠蛋白基因的化学再激活,因此对HbS的阻抑可能降低或消除对这类化学药品的需要。
作为镰状细胞贫血的一个疗法,优选方法是将编码BP1的DNA加入可以通过基因治疗给予患者的载体中,所述载体最好靶向表达珠蛋白基因的组织。为了避免由于BP1过量表达引起的潜在问题,可以将所述DNA与可控制型启动子连接。白血病的筛选
急性髓细胞白血病(AML)是第二种最常见的儿童白血病,并且是最常见的成人白血病(参见例如Pui C-H.儿童白血病。New Eng J Med1995;332:1618-1630和Karp JE.急性白血病:作为治疗靶的细胞存活机制。Int J Oncol 1997;11:657-674。)。在AML中存活率低,在儿童中存活率仅30-40%,而在成人中存活率为10-35%。另一方面,急性淋巴细胞白血病(ALL)是最常见的儿童白血病,但在成人中罕见。虽然几种分子标记与AML和ALL相关(参见例如Look AT.人类急性白血病中的癌基因转录因子。Science 1997;278:1059-1064;Tenen DG,Hromas R,Licht JD,Zhang D-E.转录因子、正常骨髓发育和白血病。Blood 1997;90:489-491;和Lawrence HJ,Sauvageau G,HumphriesRK,Largman C.HOX同源框基因在正常血细胞生成和白血病血细胞生成中的作用。Stem Cells 1996;14:281-291),显然需要鉴定可能有助于诊断和确定适当疗法、和/或潜在用作治疗靶的其它标记。
包括同源框基因(HB)在内的转录因子表达的改变与急性白血病相关,已经描述了白血病细胞系和原代白血病未成熟细胞(blast)中同源框基因的异常表达。同源框基因的特征为编码DNA结合结构域的保守的180 bp DNA序列(参见例如Levine M.Hoey T.作为序列特异性转录因子的同源框蛋白。Cell 1988;55:537-540)。它们是“主调节基因”,对于各种各样生物的自然发育极为重要。最近的研究已经证明,HB基因也在血细胞生成期间表达(参见例如Lawrence HJ,Sauvageau G,Humphries RK,Largman C.HOX同源框基因在正常血细胞生成和白血病血细胞生成中的作用。Stem Cells 1996;14:281-291)。有几个家族的HB基因,它们根据其同源框中特别的序列保守来限定。最大的家族由人类中39个成员组成,称为HOX。
某些白血病异常地将同源框基因表达为融合蛋白(关于综述参见Look AT.人类急性白血病中的癌基因转录因子。Science 1997;278:1059-1064)。在这些情况下,将得自一个基因的编码激活结构域的DNA与编码另一基因的DNA结合区的DNA融合,给新蛋白产物带来一种不同的功能。已经确定了与AML或ALL相关的融合基因的下游靶。例如,在前B细胞成淋巴细胞白血病中,HB基因Pbx1与E2A融合(参见例如Lu Q,Wright DD,Kamps MP.在携带t(1;19)易位的人类白血病中与E2A的融合将Pbx1同源域蛋白转化为组成型转录激活蛋白。Mol Cell Biol 1994;14:3938-3948),而在急性髓细胞白血病(AML)中,HOXA9与NUP98-HOXA9融合(参见例如Borrow J.Shearman A.M.,Stanton Jr.V.P.,Becher R,Collins T,Williams AJ,Dube I,Katz F,Kwong YL,Morris C,Ohyashiki K,Toyama K,Rowley J,HousmanDE.急性髓细胞白血病中t(7;11)(p15;p15)易位将核孔蛋白NUP98基因和I类同源异型蛋白HOXA9的基因融合。Nature Genetics 1996;12:159-167和Nakamura T,Yamazaki Y,Hatano Y,Miura I.在具有染色体易位t(1;11)(q23;p15)的人类急性髓细胞自血病中NUP98与PMX1同源框基因融合。Blood 1999;94:741-747)。在不涉及明显的细胞遗传学改变的其它类型白血病中,在早期造血祖细胞中一种通常沉默的基因或者被激活,或者也许不被减量调节。在T-ALL或B-ALL中表达的9种HOXB基因中的四种中观察到这一点,但在正常的T淋巴细胞或B淋巴细胞中没有观察到这一点(参见例如Petrini M,Quaranta MT,Testa U,Samoggia P,Tritarelli E,Care A,Cianetti L,Valtieri M,Barletta C,Peschle C.选定的人类HOX基因在B/T急性淋巴细胞白血病和白介素-2/白介素-1β刺激的天然杀伤淋巴细胞中的表达。Blood1992;80:185-193)。
在得自成人和儿童急性髓细胞白血病(AML)、儿童急性T细胞淋巴细胞白血病(ALL)以及儿童前B细胞ALL的红髓细胞白血病细胞系和淋巴细胞白血病细胞系和骨髓样品中,研究了BP1表达。因为BP1有两种明显的同种型,称为DLX7和Dlx4,所以测量它们在所述样品中的表达。所有三种都在类红细胞细胞系和单核细胞细胞系以及在至少一半的所述淋巴细胞系中共表达。它们在正常骨髓、PHA刺激的T细胞或B细胞中如果有的话,也是几乎检测不到的。在63%的AML病例中发现BP1 RNA,包括81%儿科病例和47%的成人病例,在32%的T-ALL病例中发现BP1 RNA,但在任何前B ALL病例中没有表达。用DLX7和Dlx4获得相似的结果,所有三种对在相当数量的白血病中共表达。该数据表明,BP1表达发生于早期祖细胞中。因此,在白血病未成熟细胞中BP1 RNA的存在是原始细胞的分子标记和/或可能表明BP1是癌基因途径中的一种重要的上游因子。
BP1是致白血病的假设得到本研究的支持,本研究表明,BP1的过量表达引起细胞系K562中克隆发生增加,以及导致这些细胞经历红细胞分化的能力降低。BP1在红白血病细胞系K562中的过量表达导致在软琼脂中生长增加,这是致白血病潜力的一个指标。
认为BP1表达引起K562细胞中增殖和存活增加,而分化减少。当众所周知的两种已知癌基因c-myc和c-myb中任一种过量表达时,在K562细胞中发现相似的结果。因此,所述数据表明,BP1在AML和T细胞ALL病症中作为一种癌基因起作用。
以下更为详细地描述了为了测定BP1的表达而进行的研究:材料和方法:
白血病细胞系的培养:让T-ALL细胞系和B-ALL细胞系在补充2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibco-BRL)中生长。红髓细胞细胞系在补充2 mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素100μg/ml链霉素、10mM HEPES和10%胎牛血清的RPMI 1640中培养。
临床样品:从马里兰大学(the University of Maryland)的发育疾病脑组织库(the Brain Tissue Bank for Developmental Disorders)获得正常骨髓(BM)。成人AML骨髓样品得自马里兰大学Greenebaum CancerCenter and The Johns Hopkins Cancer Center Cytogenetics CoreLaboratory。得自儿童T-ALL和B-ALL患者的骨髓样品得自PediatricOncology Group(POG)。在当地机构从每位患者或监护人获得了书面同意(informed consent)。白血病样品含有至少85%的未成熟细胞。通过对流淘析,然后用磁珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)进行谱系特异性分离,获得来自正常供体外周血的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
RT-PCR:分离单核细胞以通过Ficoll-Paque进行RNA分析。用TRIzol试剂(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD),从所有样品中提取总RNA。对于反转录(RT)反应,将1微克DNA酶I处理的RNA加入2.5μM寡聚d(T)引物(PE Biosystems)、10U RNA酶抑制剂(Gibco-BRL)、0.5mM dNTPs和100U MMLV反转录酶(Promega)中。RT反应在热循环仪中于25℃进行10分钟,4分钟斜线升温(ramp),42℃50分钟和99℃5分钟。在该PCR反应中使用1-2微升该反应物。设计对于BP1、DLX4和DLX7特异性的引物,通过限制性酶分析证实所述PCR产物。已经进行对于每组引物的线性分析,并且因此调节了循环条件(数据未显示)。引物序列和PCR循环条件示于以下表2中。
表2:PCR引物引物 序列 PCR条件 产物 参考文献BP1 上游: 94℃/1 min.;62℃/1 min; 581bp
5’CACCTCCTGTCTTAC 72℃/1.5min.30个
CCCTACACC3’(SEQ ID 循环
NO:8)
下游:
5’GCCCTTCCCCAGATT
CACATCATC3’(SEQ ID
NO:9)DLX7 上游: 94℃/1min.;60℃/1 min.; 406bp
5’CCTACACCGTGTTGT 72℃/1.5 min.30个
GCTGC3’(SEQ ID NO: 循环
14)
下游:
5’CTGTTGCCATAGCCA
CTG3’(SEQ ID NO:15)DLX4 上游: 94℃/1 min;60℃/1 min; 350bp
5’CACGGTGTGGCGGG 72℃/1.5 min.30个
GGAGACAT3’(SEQ ID 循环
NO:16)
下游:
5’CTGCGGTGGGAGGT
CGGAGTTC3’(SEQ ID
NO:17)β-肌动 上游: 94℃/1 min.;60℃/1 min.; 626bp Raff等,1996蛋白 5’GGATCTTCATGAGGT 72℃/1.5 min.20个
AGTCAGTC3’(SEQ ID 循环
NO:18)
下游:
5’CCTCGCCTTTGCCGA
TCC3’(SEQ ID NO:19)c-myb 上游: 94℃/30秒;55℃/30秒; 228bp Majello等,1986
5’ATTAGGTAATGAATT 72℃/1 min.28个
GTAGCCAG3’(SEQ ID 循环 Shimamoto等,
NO:20) 1997
下游:
5’ACTTAGAGTAATGCT
TTACTGA3’(SEQ ID
NO:21)GATA-1 上游: 94℃/30秒;58℃/30秒; 249bp Tsai等,1989
5’CCATTGCTCAACTGT 72℃/1 min.28个
ATGGAGGG3’(SEQ ID 循环 Shinamoto等,
NO:22) 1997
下游:
5’ACTATTGGGGACAG
GGAGTGATG3’(SEQ ID
NO:23)SCL 上游: 94℃/45秒;55℃/45秒; 144bp Chen等,1990
5’CAATCGAGTGAAGA 72℃/1.5 min.30个
GGAGACCTCC3’(SEQ 循环
ID NO:24)
下游:
5’TTGCGGAGCTCGGC
AAAGGC3’(SEQ ID NO:
25)
半定量RT-PCR:对于每种产物特异性的寡核苷酸用γ-32P-dATP末端标记,然后加入至所述PCR产物(2.5μl)的10%。在热循环仪中进行杂交(94℃15秒;42℃1分钟)。杂交产物在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳,将凝胶干燥,然后对胶片曝光。将放射自显影图与凝胶对准,切下条带,然后经闪烁计数来定量。
表达通过对β-肌动蛋白标准化,以阴性(-)、阳性(+)或不明确(+/-)记录:通过将代表BP1、DLX7或DLX4的条带的cpm除以得自同一样品的β-肌动蛋白条带的cpm,计算比值。在每个AML实验中包括一个正常BM和一个缓解(remission)BM;BP1、DLX7和DLX4的平均比值(每个6次重复)为0.01,将其作为指导,针对所述指导,样品记录为-(0.0-0.10)、+/-(0.11-0.15)、+(>0.15)或++(>0.45)。两种植物凝集素(PHA)刺激的正常T细胞培养物是T细胞ALL的对照;其平均比值(10次重复)是0.05;用同一标准如上所述对BP1、DLX7和DLX4评分。c-myb和GATA-1在正常BM中表达(我们的观察,并且在以下文献中有记录:Gewirtz AM,Calabretta B.c-myb反义寡脱氧核苷酸在体外抑制正常的人血细胞生成。Science 1988;242:1303-1306。Guerrasio A,Saglio G,Rosso C,Alfarano A,Camaschella C,Lo Coco F,Biondi A,Ranbaldi A,Nicolis S,Ottolenghi S.人类髓细胞白血病细胞中GATA-1 mRNA的表达。Leukemia 1994;6:1034-1038)。BM中c-myb和GATA-1的平均比值分别为0.57和2.1。比值在0.10和1.14之间(c-myb)或0.10和4.2(GATA-1)之间的样品记录为(+),即在正常BM范围内,而大于1.14(c-myb)或大于4.2(GATA-1)的比值记录为(++)。每个RT-PCR和杂交独立地进行两次。
CD34细胞的分离:按照NIH的Institutional Review Board批准的准则,从同意的健康成人供体的髂后嵴抽取骨髓细胞。首先用Histopaque-1077密度梯度离心制备细胞。然后将单核细胞与CD34(QBEnd10)缀合的磁微珠(AmCellCorp,Sunnyvale,CA)一起孵育,通过MACS磁分离柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)加工,以获得纯化的CD34+细胞。对于较高纯度的CD34+细胞,使用第二轮柱分离。所分离的CD34+细胞的纯度一般高于90%,用碘化丙锭排除法评估的细胞生存力总是高于95%。剩余的CD34-细胞的纯度高于95%。
过量表达BP1的细胞系的构建:通过RT-PCR,用根据原始cDNA设计的引物,从K562细胞RNA扩增了含有完整可读框的1013 bp的BP1 cDNA片段。将该片段克隆到pGEM7中,对其测序,然后用HindIII和XbaI将其亚克隆到pRC/RSV(Invitrogen)中。
统计学分析:用费歇耳恰当检定法,评价BP1、DLX4和DLX7表达之间相关的显著性。所报道的所有p值均为双侧的。详细结果:
正常细胞中BP1的表达:在四个正常骨髓样品、一个得自缓解的AML患者的骨髓样品、以及得自正常骨髓的5个PHA刺激的T细胞和5个B细胞的制剂中,测定BP1的RNA水平。在对6个代表性样品的半定量RT-PCR分析后获得的结果示于图8中。在这些对照样品的任一个中,BP1 RNA几乎不可见;DLX4和DLX7的结果相似。在较长时间的放射自显影曝光后,几种所述同种型在所有6种样品中观察到一个模糊条带(数据未显示)。
细胞系中BP1的表达:在多种白血病细胞系中,通过RT-PCR检查BP1的表达。分析了14种淋巴起源的细胞系的BP1表达。BP1 RNA存在于8种T细胞ALL细胞系中的4种中和4种淋巴瘤细胞系中的3种中(表3)。表3:造血细胞系中BP1的表达淋巴 BP1表达 骨髓 BP1表达B细胞谱系 红细胞类正常 +/- K562 +ALL HEL +REH + 单核细胞RS4;11 + THP-1 +伯基特淋巴瘤 U937 +Raji - 巨核细胞Daudi + MEG-01 +/-
单核细胞/粒细胞T细胞谱系 HL60 +/-正常 +/-ALLJurkat +MOLT-3 +MOLT-4 +MOLT-13 +CCRF-CEM -HSB2 -MOLT-16 -RPMI 8402 -淋巴瘤
HUT78 +
Sup-T1 +
也在T细胞ALL细胞系中测定DLX7和DLX4 RNA水平(图7A),在所述细胞系中所述三种同种型共表达。在6种红髓细胞细胞系中的4种(K562、HEL、THP-1和U937)中也容易检测到BP1 mRNA,在MEG-01和HL60细胞中的表达较低。1对在那些细胞系中DLX7和DLX4的分析表明,BP1、DLX7和DLX4通常共表达,在K562和U937细胞中所有三种同种型的表达都最高(图7B)。与在多样化髓细胞白血病细胞系和淋巴白血病细胞系中发现的表达相比,在正常骨髓中任何所述同种型的表达都很少或没有表达(如上所述),这一事实使得我们用半定量RT-PCR检查了急性白血病患者骨髓中的BP1、DLX7和DLX4的相对表达。
急性髓细胞白血病中BP1的表达:在儿童和成人AML患者中检查了BP1的表达。总共研究了39位AML患者,其中18位不足18岁(儿童;病例8-27),21位18岁或18岁以上(成人;病例29-49)。以下表4总结了对所述AML样品的分析和得到的每位患者的临床数据,包括细胞遗传学、表面标记的表达和对治疗的初始反应;所有患者都没有得到结果数据,因此将其排除在外。数据按照法国-美洲-英国(French-American-British)(FAB)标准分组。(参见例如Bennett JM,Catovsky D,Daniel MT,Flandrin G,Galton DAG,Gralnick,HR,Sultan C.French-American-British Cooperative Group分类的建议的修订标准。Ann Intern Med 1985;103:620-625)。表达水平的确定如材料和方法中所述。对于该分析,用正常骨髓作为阴性基线,将临床样品与其进行比较。分类为+/-的样品被排除在统计学分析之外。BP1以确定的方式在81%(13/16)的儿童骨髓样品和47%(9/19)的成人病例中过量表达。DLX7在59%(10/17)的儿科病例和38%(6/16)的成人病例中过量表达,而DLX4在79%(11/14)的儿科病例和79%(15/19)的成人病例中过量表达。表明在选定样品中表达的RT-PCR分析的一个实例示于图9中。这里,患者15表现除最高水平的BP1和DLX7以及较低的DLX4表达。根据费歇耳恰当检测,BP1和DLX7之间(p=0.0002)、BP1和DLX4之间(p=0.0016)以及DLX7和DLX4之间(p=0.023)的相关性具有统计学显著性。
表4. BP1、DLX7和DLX4的表达和AML患者中的临床生物学特征FAB 患者 BP1 DLX7 DLX4 c-mvb GATA-1 CD34 CD33 CD13 核型 反应**正常B.M. - - - + +M0 12- ++ + +/- ++ + + + + ND PR
37 +/- + + ++ + + + + 46.XY,1(1;15),Inisomy 1q NR
47 - - - ND ND + + + 47,XY,+13 NRM1 15- ++ ++ + ++ + + + + 46.XY.t(1;9)(q23;p13.1) CR
17- +/- - +/- ++ + + + + 46,Y,t(X;7)(q13;p15),dup(12)(p11p13) CR
19- - - - ++ + + + + 46,XX CR
22+ ++ ++ ++ +++ + + + + 47,XX,+21 NO
26+ + + +/- + + + + + 46,XX CR
27+ - - + + + + + + 46,XY CR
29 - - + ++ + + + + 46,XY,del(5)(q31 q34) NR
40 ++ ++ ++ ++ +/- - + + 46,XY,t(1;12) CTC
45 + + + ND ND - + + 46,XY,del(1)(q32),del(13)(q12-22) CRM2 18+ - - - +/- + + + + 47,XX,+8 CR
20- + - + + - - + + 46,XY CR
44 - ND +/- ND ND + + + 46,XY CR
45 - - - ND ND + + - 45,X-Y CR(<6 mo.)
48 + +/- ND ND ND + + + 47,XY,+8 NRM3 41 + + ++ + + - + + 46,XX,t(15;17)(q1;q12-21) CRM4 23+ +/- - - + + + + + 46,XX,inv(16)(p13q22) CR
31 - - - + + - + + 45,XY,-7 NR
32 - - - + + - + + 45,XX,-16 NR
35 + +/- + + + - + + 45,XX NR
49 - - + ND ND + + + 46,XY,inv(16)p13q22) CRM5 8+ + + + ++ - - - + 46,XX,t(11;17)(q23;q25) CR
9+ + +/- +/- + - - - + ND CR
11+ + + + ++ - - - + 46,XY NR
13+ + + + ++ + - - + 46,XY,der(1)t(1;6)(q32;p21.1), CR
add(11)(q23),der(22)t(t;22)(q23;q11.2)
14- + - + + + - + + 46,XX CR
16- + - + + + - + + 46,XX NA
30 - +/- + + - - + + 47,XY.+3 NA
33 - - + + + + + + 46,XY NR
34 + + + + + + + - 48.XX.add(4)(p15.1),del(5)(q21q33), NR
t(7;12)(p10;q10),add(11)(q23),+i(12)(p
10),add(16)(q11.2),-17,+18,-20,
+der(21)t(17;21)(q10;q10),+mer
36 + - + + + + + - 46,XY,del(7)(q22),+(8)(q24.3) NR
38 +/- - + + + + + + 46,XX CR
39 - +/- ++ + + - + + 46,XY.t(1;16),+7,+19 CTC
42 + + + + - 13% + 62% 47.XY,t(6;9)(q23;Q34)+8 RD
43 + + + ND ND - + + 46,XY. t(3;5)(q25;Q34) NRM7 21+ - ++ ++ +++ +++ + + - 46,XY CR
24- + + + ++ + + + + 45,XY,t(3;3)(q21;q26),-7 NR
年龄不足18岁
**完整反应(CR),无反应(NR),部分反应(PR),
完全肿瘤清楚(CTC)
残留的疾病(RD),没有确定(ND),未获得数据(NA)
对所述AML样品进行GATA-1和c-myc、原始细胞标记的分析,以表明表达BP1的细胞的分化状态。据信GATA-1参与骨髓发育的正调节,并且被认为在早期祖细胞中表达,然后在骨髓(而不是在红细胞类)分化中被减量调节,使其在骨髓途径中的表达成为未成熟的征兆。(参见例如Crotta S,Nicolis S,Ronchi A,Ottolenghi S,Ruzzi L,Shimada Y,Migliaccio AR.在GM依赖性和G-CSF依赖性骨髓细胞系中红细胞转录因子表达的渐进失活。Nucl Acids Res 1990;18:6863-6869)。这在特征为早期祖细胞扩充的急性白血病中检测到。(参见例如Guerrasio A,Saglio G.Rosso C,Alfarano A,Camaschella C,LoCoco F,Biondi A,Ranbaldi A,Nicolis S,Ottolenghi S.人类髓细胞白血病细胞中GATA-1 mRNA的表达。Leukemia 1994;6:1034-1038)。c-myb在未成熟造血细胞中表达,其表达随细胞分化而降低。(参见例如Gewirtz AM,Calabretta B.c-myb反义寡脱氧核苷酸在体外抑制正常的人血细胞生成。Scienec 1988;242:1303-1306;Gonda T,Metcalf D.鼠髓细胞白血病分化期间myb、myc和fos原癌基因的表达。Nature 1984;310:249-251和Luscher B,Eisenman RN.对Myc和Myb的新见解。第二部分。Myb。Genes & Devel 1990;4:2235-2241。)。由于c-myb和GATA-1在正常骨髓中表达(数据未显示)(参见例如Gewirtz AM,Calabretta B.c-myb反义寡脱氧核苷酸在体外抑制正常的人血细胞生成。Science 1988;242:1303-1306和Guerrasio A,Saglio G.Rosso C,Alfarano A,Camaschella C,Lo Coco F,Biondi A,Ranbaldi A,NicolisS,Ottolenghi S.人类髓细胞白血病细胞中GATA-1 mRNA的表达。Leukemia 1994;6:1034-1038。)。对于表达正常细胞水平的c-myb的样品给出阳性的分类(有关细节参见上文)。发现每种AML样品表现出c-myb表达至少与正常骨髓相等,并且42%(13/31)表现出较高的表达。与成人病例相比,较高比率的儿科病例表现出高水平的c-myb表达,与成人中比例为21%相比,在儿童中的比例为59%。在77%(24/31)的AML病例中存在GATA-1,在儿童中有72%表达,而在成人中有85%表达。
DLX7和DLX4与BP1共表达是惊人的:84%BP1+样品是DLX7+,而100%BP1+样品是DLX4+。GATA-1在74%的所述样品中共表达,所有都是c-myb阳性,45%表现出高水平c-myb。在该项研究中的另一参数是表面标记的分析。有趣的是,64%的BP1阳性样品为CD34阳性,73%是CD13阳性,而100%是CD33阳性。
在所述39位AML患者中,2位具有异常染色体17q臂,这是BP1的基因座。(参见例如Fu S,Strovel JW,Haga SB,Stamberg J.Berg PE.一种新同源框基因BP1作图至其同种型DLX7附近以及它们在β-珠蛋白基因阻抑中作用的特征鉴定。Am.J Hum.Gen.1998;63:A181)。患有急性前髓细胞白血病的患者41表现出t(15;17)易位,所述易位推测涉及17号染色体上的视黄酸受体。(参见例如LookAT.人类急性白血病中的癌基因转录因子。Science 1997;278:1059-1064。)。患者8表现出t(11;17)(q23;q25)易位。该易位被鉴定为染色体11q23上的MLL基因融合到或者AF17q25基因上或者融合到MSF上,后两者都位于17q25上,并且相差一个碱基。(参见例如Baer MR,Stewart CC,Lawrence D,Arthur DC,Mrozek K,Strout MP,Davey FR,SchifferCA,Bloomfield CD.带有11q23易位的急性髓细胞白血病:经多参数流式细胞术分析的髓单核细胞免疫表型。Leukemia 1998;12:317-325;Taki T,Ohnishi H,Shinohara K,Sako M,Bessho F,Yanagisawa M,Hayashi Y.在带有t(11;17)(q23;q25)的急性髓细胞白血病中一种推定的septin家族基因AF17q25融合MLL基因。Cancer Res 1999;59:4261-4265和Osaka M,Rowley JD,Zeleznik-Le NJ.带有t(11;17)(q23;q25)的治疗相关的急性髓细胞白血病中MLL的一种融合配偶体基因MSF(MLL septin样融合)。Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:6428-6433)。由于已知MLL基因激活几种HOX基因,(参见例如Yu BD,Hess JL,Horning SE,Brown GAJ,Korsmeyer S.Mll突变体小鼠中改变的Hox表达和区段同一性。Nature 1995;378:505-508)。人们可能很想推测在这种情况下该融合蛋白可能激活BP1。
急性淋巴白血病中BP1的表达:为了与骨髓谱系白血病相比,检查了19个儿童T细胞ALL病例(表5)。
表5. T细胞ALL儿童中BP1、DLX7和DLX4的表达
患者 RP1 DLX7 DLX4
1 - - -
2 - + -
3 - + -
4 + - -
5 + + +
6 - - -
7 - + +
8 - - -
9 - - -
10 + + +
11 - nd -
12 + - -
13 - - +
14 + + +
15 - nd nd
16 + + +
17 - nd nd
18 - nd nd
19 - nd nd
这里,32%(6/19)是BP1阳性。未获得这些患者的结果数据。DLX7和DLX4的分析表明,40%(6/15)的病例是DLX7阳性,40%(6/15)的病例是DLX4阳性。所述三种同种型在AML和T细胞ALL中表达的比较示于图10中。
接着,分析了19位前B-ALL儿童患者。在任何这些病例中都没有观察到可检测的BP1,虽然β-肌动蛋白对照正常表达(数据未显示)。
CD34+和CD34-细胞中的BP1表达:为了更精确地检查正常骨髓中BP1表达非常低的原因以及确定BP1是否在早期祖细胞中表达,测定了CD34+和CD34-细胞中的BP1表达。在CD34-细胞的两个独立分离物中有明显的表达(图11,第2和3泳道)。相比之下,CD34+骨髓的3个独立样品中几乎没有可检测的BP1 mRNA(第4、5和6泳道)。在第1泳道显示了在K562细胞中的表达,以用作比较,b-肌动蛋白作为加样对照测定。
过量表达BP1的K562细胞的克隆发生:已经发现K562细胞中BP1的强制表达导致分化降低和克隆发生增加。用人类红白血病细胞系K562检查BP1异位表达对红细胞分化的影响。分离出4个过量表达BP1的独立的K562克隆,将其与含有空载体的两个克隆相比。发现所有过量表达的细胞系都表现出经历红细胞分化的能力降低(数据未显示)。
可以根据白血病细胞在0.5%软琼脂中生长的能力,测量被认为是致癌性度量的克隆发生。与对照相比,3个过量表达BP1的细胞系表现出平板接种的每15,000细胞能够在软琼脂中生长菌落数显著增加(以下表6)。这些结果提示,BP1的过量表达可能与K562细胞中致癌性增加相关,并且可能提高增殖容量或细胞存活率。通过将30个菌落合并,以获得每个菌落的细胞平均数,可以测定每个菌落的细胞平均数(增殖的指标)(表6)。该数值在过量表达的细胞系中没有增加,过量表达的细胞系和对照的增殖曲线相同(数据未显示),使得有可能与7a和7b相比,所述过量表达表现出存活率增加,而不是增殖增加。综合而言,这些数据暗示,BP1的表达可能使K562细胞靠牺牲分化而存活,这是某些癌基因表现出的一个特征。表6. 过量表达BP1的K562细胞的克隆发生
平板接种 相对BP1 菌落/15,000 平均细胞数
的细胞系 表达 /菌落
7a(对照) 1 23±15 4400
7b(对照) 1 21±7 1300
8a 21 517±108 2900
8c 12 924±199 5300
8d 5 223±34 5800
8e 7 57±18 2300
K562细胞为BCL-2阴性、p53阴性,并且含有BCR-ABL易位;在K562细胞中过量表达BP1的效应在该转化背景下发生。为此,使用被无限增殖化、但未被转化的NIH 3T3细胞(如果将其注射到小鼠体内,则它们不引起恶性肿瘤)。BP1在那些细胞中的强制表达导致在软琼脂中生长增加,水平降低约4倍。过量表达BP1的NIH 3T3细胞也表现出转化灶形成增加约4倍。高BP1表达对K562细胞和NIH 3T3细胞效应的差异可能意味着在K562细胞中观察到的克隆发生增加约10倍需要其它的遗传改变。讨论:
总之,在81%儿童AML患者的骨髓中检测到BP1的显著RNA表达,相比之下,在47%的成人患者检测到BP1的显著RNA表达。相反,在正常骨髓中BP1的表达不可重现。BP1阳性的最高百分比发生在FAB分类M5(单核细胞)中,其中77%的AML病例是BP1阳性;在该类中得自100%的儿童的骨髓细胞是BP1阳性。2个剪接变异体DLX7和DLX4分别在48%和79%的AML患者中共表达。也在19例儿童T细胞ALL病例中评估了BP1、DLX7和DLX4水平。虽然表达的频率与AML相比较低,但BP1在32%T细胞ALL中过量表达,DLX7在50%T细胞ALL中过量表达,而DLX4在40%T细胞ALL中过量表达,相比之下在正常的PHA刺激的T淋巴细胞中的表达弱或没有表达。与此形成鲜明对比的是,在前B ALL中没有检测到BP1表达。虽然BP1在T细胞ALL中表达、而不在前B ALL中表达的原因尚不清楚,但这种差异可以提供了一种有用的诊断性区别。
c-myb在所有AML样品中表达,其表达水平与正常骨髓相当或较高。c-myb的表达与未成熟性相关,(参见例如Gewirtz AM,CalabrettaB.c-myb反义寡脱氧核苷酸在体外抑制正常的人血细胞生成。Science1988;242:1303-1306;Gonda T,MetcalfD.鼠髓细胞白血病分化期间myb、myc和fos原癌基因的表达。Nature 1984;310:249-251和LuscherB,Eisenman RN.对Myc和Myb的新见解。第二部分。Myb。Genes &Devel 1990;4:2235-2241。),因此在正常范围内的那些情况可以在早期祖细胞阶段受到阻滞。较高的c-myb表达可能是致白血病过程的一部分,因为c-myb的激活在小鼠中引起白血病。(参见例如Wolff L,Koller R,Bies J.Nazarov V,Hoffman B,Amanullah A,Krall M,MockB.鼠前单核细胞白血病中的反转录病毒插入诱变:c-myb和Mml1。Curr Topics Micro Immuno 1996;211:191-199。)。在这一方面,在高度表达c-myb并且可以评估BP1表达的11个样品中,9个样品是BP1阳性。关于HOX基因在恶性造血细胞系中的表达有相当多的数据。所述HOX基因在4个染色体上成簇存在,而DLX基因成对地位于相同染色体上。(参见例如Lawrence HJ,Sauvageau G,Humphries RK,Largman C.HOX同源框基因在正常血细胞生成和白血病血细胞生成中的作用。Stem Cells 1996;14:281-291和van Oostveen JW,Biji JJ,Raaphorst FM,Walbooners JJM,Meijer CJLM.同源框基因在正常血细胞生成和血液学恶性肿瘤中的作用。Leukemia 1999;13:1675-1690;Nakamura S,Stock DW,Wydner KL,Bollekens JA,Takeshita K,Nagai BM,Chiba,Kitamura T,Freeland TM,Zhao Z,Minowada J,Lawrence JB,Weiss JB和Ruddle FH.一种新的哺乳动物Distal-less基因:Dlx-7的基因组分析。Genomics 1996;38:314-324;Simeone,A.,Acampora D,Pannese M,D’Esposito M,Stornaiuolo A,Gulisano M,Mallamaci A,Kastury K,Druck T和Huebner K.脊椎动物Dlx基因家族两个成员的克隆和特征鉴定。PFoc Natl Acad Sci.USA 1994;91:2250-2254。)。BP1位于17号染色体上HOKB簇的3’端。(参见例如Fu S,Strovel JW,Haga SB,Stamberg J.Berg PE.一种新同源框基因BP1作图至其同种型DLX7附近以及它们在β-珠蛋白基因阻抑中作用的特征鉴定。Am.J.Hum.Gen.1998;63:A181。)。HOXB基因优先在包括K562和HEL细胞系在内的类红细胞中表达。(参见例如LawrenceHJ,Sauvageau G,Humphries RK,Largman C.HOX同源框基因在正常血细胞生成和白血病血细胞生成中的作用。Stem Cells 1996;14:281-291;Shen W-F,Largman C,Lowney P,Corral JC,Detmer K,Hauser CA,Simonitch TA,Hack FM,Lawrence HJ.含同源框基因在人类造血细胞系中的谱系限制表达。Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:8536-8540;Magli CM,Barba,P,Celetti A,De Vita G,Cillo,C,Boncinelli E.在人类造血细胞中HOX基因的协同调节。Proc Natl AcadSci USA 1991;88:6348-6352;和Mathews CHE,Detmer K,BoncinelliE,Lawrence HJ,Largman C.人HOX2基因座的同源框基因的红细胞类限制表达。Blood 1991;78:2248-2252)。据信在所述HOX簇中基因在骨髓细胞中以区段为单位被关闭或打开。(参见例如38、40)。本文所示的数据提示,BP1可能是这种协同调节的一部分,因为在红髓细胞细胞系中的其表达模式与相邻的HOXB基因相似。HOX基因的转录也在AML、T-ALL和前B-ALL中发现,但与BP1不同,它们在正常骨髓容易被检测到。(参见例如Petrini M,Quaranta MT,Testa U,Samoggia P,Tritarelli E,Care A,Cianetti L,Valtieri M,Barletta C,Peschle C.选定的人类HOX基因在B/T急性淋巴细胞白血病和白介素-2/白介素-1 β刺激的天然杀伤淋巴细胞中的表达。Blood 1992;80:185-193;Lawrence HJ,Sauvageau G,Ahmadi N,Lopez AR,LeBeauMM,Link M,Humphries K,Largman C.HOXA10同源框基因在正常造血细胞和白血病造血细胞中的阶段特异性和谱系特异性表达。ExpHem 1995;23:1160-1166;Biji JJ,van Oostveen JW,WalboomersJMM,Brink ATP,Vos W,Ossenkoppele GJ,Meijer CJLM.HOXC4、HOXC5和HOXC6在髓细胞白血病和正常骨髓细胞中的分化和细胞类型限制性表达。Leukemia 1998;12:1724-1732;Kawagoe H,Humphries RK,Blair A,Sutherland HJ,Hogge DE.HOX基因、HOX辅因子和MLL在白血病和正常人造血细胞的表型和功能限定的亚群中的表达。Leukemia 1999;13:687-698;Salvati PD,Ranford PR,Ford J,Kees UR.在儿童急性成淋巴细胞白血病中HOX11的表达与T细胞表型相关。Oncogene 1995;11:1333-1338)。值得注意的是,在正常的造血分化期间,而不是在AML中,HOX基因的表达被减量调节。(参见例如Kawagoe H,Humphries RK,Blair A,Sutherland HJ,Hogge DE.HOX基因、HOX辅因子和MLL在白血病和正常人造血细胞的表型和功能限定的亚群中的表达。Leukemia 1999;13:687-698)。在急性白血病中BP1 RNA的表达可能代表白血病未成熟细胞分化阶段的一种标记,和/或可能直接参与白血病生成。本文所示的数据指出了这种可能性:AML中BP1的表达发生在早期祖细胞中:(i)如上所述,所有BP1阳性细胞也是c-myb阳性,而74%为GATA-1阳性,而c-myb和GATA-1为早期祖细胞的指示物。(参见例如20、22-24)。(ii)在正常骨髓AT中观察到几乎不可检测到BP1的表达与原始细胞中的表达相符,原始细胞包括非常少的正常骨髓亚群。(iii)BP1在髓细胞白血病和淋巴白血病中的过量表达说明白血病发生可能发生在干细胞或多能造血祖细胞中。(iv)进一步支持这一观点的是下述的观察:59%的BP1阳性未成熟细胞发现于被认为是原始的并且与干细胞白血病相关的FAB类中,即M0(分化最少的)、M5(单核细胞)或M7(巨核细胞)。(参见例如CuneoA,Mecucci C,Kerim S,Vandenberghe E,Dal Cin P,Van Orshoven A,Rodhain J,Bosly A,Michaux JL,Martiat P.,Boogaerts M,Carli MG,Castoldi G,Van Den Berghe H.多能干细胞涉及成巨核细胞白血病:15位患者中的细胞学和细胞遗传学证据。Blood 1989;74:1781-1790;Bonnet D,Dick JE.人类急性白血病作为起源于原始造血细胞的等级结构组构。Nature Medicine 1997;3:730-737;Venditti A,Del Poeta G,Buccisano F,Tamburini A,Cox MC,Stasi R,Bruno A,Aronica G,Mafiei L,Suppo G,Simone MD,Forte L,Cordero V,Postorino M,Tufilli V,Isacchi G,Masi M,Papa G,Amadori S.分化最少的急性髓细胞白血病(AML-MO):具有其它法国-美洲-英国亚型的25例病例的比较。Blood 1997;89:621-629)。(v)64%的BP1阳性病例是CD34阴性。CD34+干细胞表达几种HOX基因,这种表达在CD34-细胞中被减量调节。(参见例如van Oostveen JW,Biji JJ,Raaphorst FM,Walbooners JJM,Meijer CJLM.同源框基因在正常血细胞生成和血液学恶性肿瘤中的作用。Leukemia 1999;13:1675-1690和Sauvageau G,Lansdorp PM,Eaves CJ,Hogge DE,Dragowska WH,Reid DS,largman C,Lawreence J,Humphries RK.功能独特的人骨髓细胞CD34+亚群中同源框基因的差异表达。Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:12223-12227。)。相反,BP1在CD34-细胞中表达,而在CD34+细胞中被减量调节。这些结果与AML样品中的数据(点v)一致,在AML样品中BP1主要发现于CD34-细胞中。在CD34+细胞中非常低的表达可能代表或者在少数CD34+细胞表达,或者所述CD34+细胞污染有CD34-细胞。最近的论文支持存在一个在小鼠和人类中均具有繁殖能力的原始CD34-lin-干细胞亚群。(参见例如49-51)。在小鼠中,CD34-lin-干细胞被激活时可以转变为CD34+干细胞;这尚未在人类中研究过。(参见例如Goodell MA.CD34+或CD34-:它确实重要吗?Blood1999;94:2545-2547和Sato T,laver JH,Ogawa M.鼠造血干细胞可逆表达CD34。Blood 1999;94:2548-2554)。由于我们的CD34-细胞既含有lin+亚群,也含有lin-亚群,因此尚不了解BP1是否在干细胞中表达。然而,显然BP1在血细胞生成早期被激活。因此,假设BP1的表达随后在分化期间受到阻抑。这一观点得到以下观察的支持:在细胞系MB-02的红细胞分化期间BP1被减量调节。观察到过量表达BP1的稳定细胞系表现出克隆发生增加45倍,这支持BP1的可能的致癌作用。此外,在AML中的其高表达频率可能表明BP1是致癌途径中的一种上游因子。需要其它实验以描绘BP1在正常血细胞生成中的作用,以直接确定它是否在致瘤性转化中起作用,以及检查急性白血病中其表达的临床显著性。
鉴于上述BP1在白血病中表达增加的发现,一种筛选急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病的方法包括以下步骤:从患者获取细胞样品,和确定与正常细胞相比所述细胞样品中的细胞是否过量表达BP1。通常,为了检查白血病,从例如骨髓或外周血的合适来源获取细胞样品。优选通过测定细胞样品中BP1 RNA水平或BP1蛋白水平,确定BP1是否过量表达。可以通过本领域已知的RNA测定,例如RNA印迹分析、狭线印迹分析和斑点印迹分析、RT-PCR和原位杂交,测定RNA水平。例如,例如在上述典型实例中描述的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,可以用来测定细胞是否产生BP1 RNA。具体地说,从样品细胞中分离RNA,将其转录以获得反转录产物(cDNA)。然后用得自SEQ ID NO:1的正向和反向PCR引物进行聚合酶链式反应。BP1的合适PCR引物对包括例如SEQ ID NO 8和9,它们扩增581bp产物,还包括SEQ ID NO 10和11,它们扩增225 bp产物。在任何合适的反应条件下进行聚合酶链式反应,以扩增BP1产物。例如,对于SEQ ID NO 8和9的引物而言,通常的反应条件包括一个变性步骤(94℃,1分钟)、一个退火步骤(58℃,1分钟)和一个延伸步骤(72℃,1.5分钟),进行27个循环,然后是一个额外的延伸(72℃,5分钟)。对于SEQ ID NO 10和11的引物而言,通常的反应条件包括将样品保持在94℃2分钟;然后进行30个循环:94℃1分钟、62℃1分钟72℃1.5分钟;然后将样品在72℃保持10分钟。然后从样品中分离PCR产物,用常用方法例如电泳进行显现或定量。可以通过本领域已知的蛋白质测定,例如免疫组织化学测定,直接测定BP1蛋白的水平。为了提供用于免疫测定的多克隆抗体或单克隆抗体,可以使用本文公开的BP1 DNA,通过本领域已知的技术,产生足够量的基本纯化的BP1,以用以接种哺乳动物,来产生与BP1特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。白血病的治疗
降低K562白血病细胞中BP1的表达引起细胞凋亡。为了证明这一点,构建了含有调节反义BP1表达的诱导型金属硫蛋白启动子的载体,并且将其稳定地导入K562细胞中。研究了4种细胞系,两种含有空载体的对照(9A和9B),两种含有所述反义质粒(10B和10D)。加入50μM的CdSO4(一种金属硫蛋白启动子的诱导物)达4天,以诱导反义BP1表达。通过锥虫篮测定,反义BP1的诱导导致生存力丧失(图12)。对照的生存力有一些损失,但10B和10D的细胞死亡显著较高。这与此时BP1 mRNA大大减少有关。图13显示了经RT-PCR测定的在50μM CdSO4存在下与10B和10D(反义,分别为第3和4泳道)、对照9A和9B(分别为第1和2泳道)的BP1 mRNA的表达。在10B和10D中,BP1 RNA的表达几乎消失。为了确定生存力的丧失是否由细胞凋亡增加所致,用膜连蛋白V评价了细胞,记录为膜连蛋白V阳性、碘化丙锭阴性细胞;含反义质粒的细胞的凋亡显著增加(数据未显示)。这些实验连同过量表达BP1的细胞看来表现出存活率增加的事实一起表明:降低BP1的表达与细胞凋亡有关,证实对BP1表达调节的强有力结果是K562细胞的细胞存活。表7. 诱导BP1反义RNA后K562细胞的凋亡百分比
细胞系 第1天 第2天 第3天
9A 9±1 7±3 13±3
9B 5±3 9±1 13±1
10B 6±1 15±2 53±4
10D 9±1 20±1 68±1
这些结果提示,白血病的一种可能的疗法可能是在患者体内诱导编码BP1的DNA的反义寡核苷酸,由此所述反义寡核苷酸阻断白血病细胞中BP1的表达,因此引起这些细胞凋亡。
也已经发现,BP1的强制表达使得白血病细胞对一种用来治疗AML患者的药物阿糖胞苷(Ara C)的敏感性提高。用不同浓度的ara C攻击过量表达BP1的K562细胞系。用50μm ara C攻击4天后,对照细胞的生存力为82-86%,而过量表达BP1的细胞的生存力范围为27-29%至66%,即生存力至多降低3倍(数据未显示)。在100μm Ara C下没有观察到所述数据的显著差异。在30分钟和60分钟的膜连蛋白V测定中,观察到生存力最低的细胞的凋亡细胞频率最高。因此,显然凋亡增加表明,具有强制BP1表达的细胞系表现出对Ara C的敏感性增加。
在治疗上可以利用上述发现,根据该患者的BP1表达水平将给予患者的Ara C的剂量优化。乳腺癌的筛选和治疗
为了确定在乳腺癌细胞系中是否过量表达BP1,本发明人进行了多项研究,以检测与正常乳腺组织相比BP1的过量表达。图14显示了用几种乳腺癌细胞系测定的BP1表达,所述细胞系包括乳腺癌系MCF7 ADR、MDA468和T47D。在进一步的研究中,在乳腺癌细胞系中通过RT-PCR检查了BP1的表达(表8)。
表8. 乳腺癌细胞系中的BP1表达细胞系 ER PR 恶性 致瘤性+ BP1Hs578T - - 腺管癌 否 +/-MCF7 + + 腺管癌 ** +MCF7ADR * ADR抗性 是 +++MDA-MB-231 - - 腺管癌 是 ++MDA-MB-435s - - 腺管癌 否 +MDA-MB-468 - - 腺管癌 是 ++T47D + + 腺管癌 NA +++MCF10A + + 正常 否 +/-*对雌二醇无应答+得自美国典型培养物保藏中心的数据。NA,未获得数据。**在不加入雌二醇时为非致瘤性。
在BP1表达和细胞系在小鼠中引起乳腺肿瘤的能力之间的相关性最为显著。有趣的是,在阿霉素(ADR)抗性MCF7细胞系-MCF7ADR中观察到高BP1表达。尚不了解在BP1表达和ADR之间是否有任何关系。来源于正常乳腺上皮的细胞系MCF10A表现出几乎不可检测到BP1 mRNA。
为了进一步证明BP1在乳腺癌中表达,在冷冻乳腺肿瘤组织和周围正常组织中检查了BP1表达。总共分析了15个肿瘤组织(表9)。BP1在所有12例ER阴性病例中表达,但仅在三个ER阳性病例中的一个中表达。这些数据表明BP1在高分类级别的ER、PR肿瘤组织中表达的倾向。表9. BP1表达与乳腺癌中ER和PR状况的比较
BP1+ BP1-
ER+PR+ 1 2
ER-PR- 12 0
对于来自正常乳腺组织和恶性乳腺组织的代表性样品的RT-PCR分析示于图15中。正常组织以N表示,而肿瘤以T表示。所有肿瘤组织都表现出ER-PR-。在第1-4泳道中,显示了肿瘤组织和相应的正常组织。没有观察到正常样品的表达,而BP1在所有肿瘤中均表达。已经分析了总共6个正常乳腺组织。其中5个是BP1阴性,一个表现出低BP1表达(数据未显示)。在第5-7泳道中显示了另外3个肿瘤组织。β-肌动蛋白的表达证明RNA的完整性,用作每种样品的加样对照。
鉴于以上所述,对BP1过量表达的检测是一种乳腺癌的筛选工具。该筛选方法的实施方式与白血病的筛选方法相同,只是在本方法中,从乳腺组织获得细胞样品。参考文献
Ali,S.A.1970.与异常高水平胎儿血红蛋白相关的科威特阿拉伯人中镰状细胞病的较轻度变异体。Br.J.Haematol.19:613-619。
Berg,P.E.,S.Fu和S.Haga.1998.未发表的数据。
Berg,P.E.,S.Abhyankar和M.Chase.1994.高速泳动族蛋白HMG-I(Y)与人类β-珠蛋白基因上游的一个沉默子DNA序列结合。Blood 84增刊1:262a。
Berg,P.E.和A.N.Schechter.1992.血红蛋白疾病的分子遗传学。载于T.Friedmann(编著),Molecular Genetic Medicine.AcademicPress,San Diego.。
Berg,P.E.,M.Mittelman,J.Elion,D.Labie和A.N.Schechter.1991.与β-珠蛋白合成降低相关的与人类β-珠蛋白基因的-530突变的蛋白结合增加。Am.J.Hematol.36:42-47。
Berg P.E.,D.M.Williams,R.-L.Qian,R.B.Cohen,S.X.Cao,M.Mittelman和A.N.Schechter.1989.一种共同蛋白质与人类β-珠蛋白基因5’的两个沉默子结合。Nucl.Acids Res.17:8833-8852。
Chase,M.B.,S.Haga,W.D.Hankins,D.M.Williams,Z.Bi,J.W.Strovel,C.Obriecht和P.E.Berg.1999.HMG-I(Y)的结合引发人类β-珠蛋白基因的一个沉默子中的结构变化。Am.J.Hem.60:27-35。
Chebloune,Y.,J.Pagnier,G.Trabuchet,C.Faure,G.Verdier,D.Labie和V.M.Nigon.1988.非洲镰状细胞贫血患者中β-珠蛋白基因5’侧翼区的结构分析:非洲镰状细胞突变三种起源的进一步的证据。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4431-4435。
Cho,K.E.Y.,J.Geotz,C.V.E.Wright,A.Fritz,A.Hardwicke和E.M.D.Roberts.1988.非洲蟾蜍属同源框基因中同一读框的差别利用编码享有同一DNA结合特异性的两种相关蛋白质。EMBO J.7:2139-2149。
Cohen,S.M.和G.Jurgens.1989.果蝇属(Drosophila)中的近端-远端模式形成:在肢体发育中细胞对于Distal-less基因活性的自发需求。EMBO J 8:2045-2055。
Cohen,S.M.,G.Bronner,F.Kuttner,G.Jurgens和H.Jackle.1989.在果蝇属中Distal-less编码肢体发育所需的一种同源域蛋白。Nature 338:432-434。
Cowell,I.G.和H.C.Hurst.199.从cDNA表达文库克隆转录因子,载于D.S.Latchman(编著),Transcription factors:a practical approach.第120-122页,IRL Press,New York。
Crossley,M.和S.H.Orkin.1993.β-珠蛋白基因座的调节。Curr.Opinion Gen.Dev.3:232-237。
Dignam,J.D.,R.M.Lebovitz和R.G.Roeder.1983.在得自分离的哺乳动物细胞核的可溶性提取物中由RNA聚合酶II引起的准确转录起始。Nucl.Acids Res.11:1475-1489。
Dolle,P.,M.Price和D.Duboule.1992.在面部、眼部和肢体发育期间鼠Dlx-1同源框基因的表达。Differentiation 49:93-99。
Dover,G.J.和S.H.Boyer.1987.含胎儿血红蛋白的细胞具有与无胎儿血红蛋白的细胞相同的普通颗粒血红蛋白:正常研究对象和高胎儿血红蛋白产生的研究对象中的γ-珠蛋白基因表达和β-珠蛋白基因表达之间的交互关系。Blood 69:1109-1113。
Ebb,D.,D.C.Tang,L.Drew,K.Chin,P.E.Berg和G.P.Rodgers.1998.阻抑成体β-样珠蛋白基因的调节元件的鉴定。BloodCells,Mol.,Dis.24:356-369。
Elion,J.,P.E.Berg,C.Lapoumeroulie,G.Trabuchet,M.Mittelman,R.Krishnamoorthy,A.N.Schechter和D.Labie.1992.β-珠蛋白基因5’的负控制区中DNA序列的变异与βs突变的表型表达相关。Blood 79:787-792。
Fibach,E.,P.Prasanna,G.P.Rodgers和D.Samid.1993.得自正常供体以及得自镰状细胞贫血患者和β地中海贫血患者的红细胞类前体中由乙酸苯酯和丁酸4-苯酯引起的胎儿血红蛋白产生增强。Blood 82:2203-2209。
Forrester,W.C.,C.Thompson,J.T.Elder和Groudine,M.1986.人类β-珠蛋白基因簇中发育稳定的染色质结构。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1359-1363。
Jaynes,J.B.P.H.和O’Farrell.1988.结合一个共同位点的含同源域蛋白对转录的激活和阻抑。Nature 336:744-749。
Kozak,M.1987.得自699种脊椎动物信使RNA的5’非编码序列的分析。Nucl.Acids Res.15:8125-8148。
Kulozik,A.E.,J.S.Wainscoat,G.R.Serjeant,B.D.Kar,B.Al-Awamy,G.J.F.Essan,A.G.Falusi,S.K.Haque,A.M.Hilali,S.Kate,W.A.E.P.Ranasinghe和D.J.Weatherall.1986.βs-珠蛋白基因单倍型的地理研究:镰状细胞突变独立的亚洲起源的证据。Am.J.Hum.Genet.39:239-244。
Lapoumeroulie,C.,O.Dunda,G.Trabuchet,M.Mony-Lobe,D.Labie,J.Elion和R.Krishnamoorthy.1989.再一种非洲起源的新型镰状基因:喀麦隆型。Blood 74:225a。
Lawrence,H.J.和C.Largman.1992.正常血细胞生成和白血病中的同源框基因。Blood 80:2445-2453。
Levine,M.和T.Hoey.1988.作为序列特异性转录因子的同源框蛋白。Cell 55:537-540。
Ley,T.J.,K.A.Maloney,J.I.Gordon和A.L.Schwartz.1989.人类红细胞类胎肝细胞中珠蛋白基因的表达。J.Clin.Invest.83:1032-1038。
Lowney,P.,J.Corral,M.M.LeBean,L.Deaven,H.J.Lawrence和C.Largman.1991.一种人类Hoxl同源框基因在人类造血细胞中表现出可变转录物的骨髓特异性表达。Nucl.Acids Res.19:3443-3449。
Mavilio,F.,A.Giampaolo,A.Care,G.Migliaccio,M.Calandrini,G.Russo,G.L.Pagliardi,G.Mastroberardino,M.Marinucci和C.Peschle.1983.人类血红蛋白开关的分子机制:珠蛋白基因在胚胎、胎儿和成体成红细胞中的选择性甲基化不足和表达。Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80:6907-6911。
Nakamura S.,D.W.Stock,K.L.Wydner,J.A.Bollekens,K.Takeshita,B.M.Nagai,S.Chiba,T.Kitamura,T.M.Freeland,Z.Zhao,J.Minowada,J.B.Lawrence,K.B.Weiss和F.H.Ruddle.1996.一种新的哺乳动物Distal-less基因:Dlx-7的基因组分析。Genomics 38:314-324。
O’Connor,M.B.,R.Binari,L.A.Perkins和W.Bender.1988.得自双胸复合体的超双胸域的可变RNA产物。EMBO J 7:435-445。
Pabo,C.O.和R.T.Sauer.1992.转录因子:DNA识别的结构家族和原理。Annu.Rev.Biochem.61:1053-1095。
Pagnier,J.,J.G.Mears,O.Dunda-Belkhodja,K.E.Schaefer-Rego,C.Beldjord,R.L.Nagel和D.Labie.1984.非洲血红蛋白S基因多中心起源的证据。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1771-1773。
Papayannopoulou,T.,T.H.Shepard和G.Stamatoyannoupoulos.1983.使用抗γ-珠蛋白和抗β-珠蛋白链荧光抗体研究人类早期胎儿的类红细胞中血红蛋白表达。载于:G.Stamatoyannopoulos和A.W.Nienhuis(编著),Globin Gene Expression and HematopoieticDifferentiation.第421-430页,Alan R.Liss,New York。
Perrine,S.P.,B.A.Miller,D.V.Faller,R.A.Cohen,E.P.Vichinsky,D.Hurst,B.H.Lubin和T.Papayannopoulou.1989.丁酸钠增强HbSS和β地中海贫血患者红细胞类祖细胞中的胎儿珠蛋白基因表达。Blood 74:454-459。
Perrine,S.P.,B.A.Miller,M.F.Greene,R.A.Cohen,N.Cook,C.Shackleton和D.V.Faller.1987.丁酸类似物增加新生儿红细胞类祖细胞中的γ-珠蛋白基因的表达。Biochem.Biophys.Res.Comm.148:694-700。
Perrine,R.P.,M.E.Pembrey,S.Perrine和F.Shoup.1978.沙特阿拉伯人中镰状细胞贫血的自然史。对270位受治疗者的研究。Ann.Internal.Med.88:1-6。
Price,J.A.,D.W.Bowden,J.T.Wright,M.J.Pettenati和T.C.Hart.1998.Dlx3中一个与tricho-dento-osseous(TDO)综合征有关的突变的鉴定。Hnm.Mol.Gen.7:563-569。
Quinn,L.M.,B.V.Johnson,J.Nicholl,G.R.Sutherland和B.Kalionis.1997.从人类胎盘中分离和鉴定包括Distal-less家族新成员DLX4在内的同源框基因。Gene 187:55-61。
Robinson,G.W.和K.Mahon.1994.Dlx-2和Dlx-3的分化和重叠表达结构域提示Distal-less同源框基因在颅面发育中的独特作用。Mech.Dev.48:199-215。
Schechter,A.N.,C.T.Nogucbi和G.P.Rodgers.1987.镰状细胞病。载于G.Stamatoyannopoulos,A.W.Nienhuis,P.Leder,Majerus,P.W.(编著),The Molecular Basis of Blood Diseases.第179-218页,SaundersPhiladelphia。
Shimamoto,T.,S.Nakamura,J.Bollekens,F.H.Ruddle和K.Takeshita.1997.对Dlx-7同源框基因的抑制引起GATA-1和c-myc基因表达的减少以及引起细胞凋亡。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3245-3249。
Simeone,A.,D.Acampora,M.Pannese,M.D’Esposito,A.Stornaiuolo,M.Gulisano,A.Mallamaci,K.Kastury,T.Druck和K.Huebner.1994.脊椎动物Dlx基因家族两个成员的克隆和特征鉴定。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2250-54。
Stock,D.W.,D.L.Ellies,Z.Zhao,M.Ekker,F.H.Ruddle和K.M.Weiss.1996.脊椎动物Dlx家族的进化。Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:10858-10863。
Tuan,D.,W.Soloman,Q.Li和I.M.London.1985.人类类红细胞中的“β-样珠蛋白”基因结构域。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6384-6388。
Vinson,C.R.,K.L.LaMarco,P.F.Johnson,W.H.Landschulz和S.L.McKnight.1988.由一种重组噬菌体特化的序列特异性DNA结合活性的原位检测。Genes & Devel.2:801-806。
Wu,S.,Q.Lu和A.L.Kriz.1995.RNA印迹和DNA印迹的一步多夹心杂交。BioTechniques 18:585-586。
Zeng,F.-y.,G.P.Rodgers,S.-z.Huang,A.N.Schechter,M.Salamah,S.Perrine和P.E.Berg.1994.具有阿拉伯单倍型的镰状细胞贫血患者β-珠蛋白基因的-530区的序列。Human Mutation 3:163-165。
Chase MB,Haga S,Fu S,Davenport G,Morgan D,Mah A,BergPE.一种新的同源域蛋白BP1阻抑人类β-珠蛋白基因。已提交。
Levine,M.,Hoey T.作为序列特异性转录因子的同源框蛋白。Cell 1988;55:537-540。
van Oostveen JW,Biji JJ,Raaphorst FM,Walbooners JJM,Meijer CJLM.同源框基因在正常血细胞生成和血液学恶性肿瘤中的作用。Leukemia 1999;13:1675-1690。
Look AT.人类急性白血病中的癌基因转录因子。Science 1997;278:1059-1064。
Lu Q,Wright DD,Kamps MP.在携带t(1;19)易位的人类白血病中与E2A的融合将Pbx1同源域蛋白转化为组成型转录激活蛋白。MolCell Biol 1994;14:3938-3948。
Nakamura T,Yamazaki Y,Hatano Y,Miura I.在具有染色体易位t(1;11)(q23;p15)的人类急性髓细胞白血病中NUP98与PMX1同源框基因融合。Blood 1999;94:741-747。
Petrini M,Quaranta MT,Testa U,Samoggia P,Tritarelli E,CareA,Cianetti L,Valtieri M,Barletta C,Peschle C.选定的人类HOX基因在B/T急性淋巴细胞白血病和白介素-2/白介素-1 β刺激的天然杀伤淋巴细胞中的表达。Blood 1992;80:185-193。
Hawley RG,Fong AZC,Reis MD Zhang N,Lu M,Hawley TS.HOX11/TCL3同源框基因的转化功能。Cancer Res 1997;57:337-345。
Fu S,Strovel JW,Haga SB,Stamberg J.Berg PE.一种新同源框基因BP1作图至其同种型DLX7附近以及它们在β-珠蛋白基因阻抑中作用的特征鉴定。Am.J.Hum.Gen.1998;63:A181。
Pui C-H.儿童白血病。New Eng J Med 1995;332:1618-1630。
Karp JE.急性白血病:作为治疗靶的细胞存活机制。Int J Oncol1997;11:657-674。
Copelan EA,McGuire EA.成人急性成淋巴细胞白血病的生物学和治疗。Blood 1995;85:1151-1168。
Tenen DG,Hromas R,Licht JD,Zhang D-E.转录因子、正常骨髓发育和白血病。Blood 1997;90:489-491。
Gewirtz AM,Calabretta B.c-myb反义寡脱氧核苷酸在体外抑制正常的人血细胞生成。Science 1988;242:1303-1306。
Guerrasio A,Saglio G,Rosso C,Alfarano A,Camaschella C,LoCoco F,Biondi A,Ranbaldi A,Nicolis S,Ottolenghi S.人类髓细胞白血病细胞中GATA-1 mRNA的表达。Leukemia 1994;6:1034-1038。
Crotta S,Nicolis S,Ronchi A,Ottolenghi S,Ruzzi L,Shimada Y,Migliaccio AR.在GM依赖性和G-CSF依赖性骨髓细胞系中红细胞转录因子表达的渐进失活。Nucl Acids Res 1990;18:6863-6869。
Gonda T,Metcalf D.鼠髓细胞白血病分化期间myb、myc和fos原癌基因的表达。Nature 1984;310:249-251。
Luscher B,Eisenman RN.对Myc和Myb的新见解。第二部分。Myb。Genes & Devel 1990;4:2235-2241。
Raff T,van der Giet M,Endemann D,Wiederholt T,Paul M.用于RT-PCR的不共扩增加工假基因的β-肌动蛋白引物的设计和测试。Biotechniques 1997;23:456-460。
Majello B,Kenyon LC,Dalla-Favera R.人c-myb原癌基因:cDNA的核苷酸序列和基因组基因座的组构。Proc Natl Acad Sci 1986;83:9636-9640。
Tsai SF,Martin DIK,Zon LI,D’Andrea AD,Wong GG,OrkinSH.通过在哺乳动物细胞中表达克隆类红细胞谱系主要DNA结合蛋白的cDNA。Nature 1989;339:446-451。
Chen Q,Cheng J-T,Tsai L-H,Schneider N,Buchanan G,CarrollA,Crist W,Ozanne B,Siciliano MJ,Baer R.Tal基因在T细胞白血病中经历染色体易位并且优先编码一种螺旋-环-螺旋蛋白。EMBO J 1990;9:415-424。
Bennett JM,Catovsky D,Daniel MT,Flandrin G,Galton DAG,Gralnick,HR,Sultan C.French-American-British Cooperative Group分类的建议的修订标准。Ann Intern Med 1985;103:620-625。
Baer MR,Stewart CC,Lawrence D,Arthur DC,Mrozek K,Stront MP,Davey FR,Schiffer CA,Bloomfield CD.带有11q23易位的急性髓细胞白血病:经多参数流式细胞术分析的髓单核细胞免疫表型。Leukemia 1998;12:317-325。
Taki T,Ohnishi H,Shinohara K,Sako M,Bessho F,YanagisawaM,Hayashi Y.在带有t(11;17)(q23;q25)的急性髓细胞白血病中一种推定的septin家族基因AF17q25融合MLL基因。Cancer Res 1999;59:4261-4265。
Osaka M,Rowley JD,Zeleznik-Le NJ.带有t(11;17)(q23;q25)的治疗相关的急性髓细胞白血病中MLL的一种融合配偶体基因MSF(MLL septin样融合)。Proc.Natl.Acad Sci.USA 1999;96:6428-6433。
Yu BD,Hess JL,Horning SE,Brown GAJ,Korsmeyer S.Mll突变体小鼠中改变的Hox表达和区段同一性。Nature 1995;378:505-508。
Wolff L,Koller R,Bies J.Nazarov V,Hoffman B,Amanullah A,Krall M,Mock B.鼠前单核细胞白血病中的反转录病毒插入诱变:c-myb和Mml1。Curr Topics Micro Immuno 1996;211:191-199。
Shen W-F,Largman C,Lowney P,Corral JC,Detmer K,HauserCA,Simonitch TA,Hack FM,Lawrence HJ.含同源框基因在人类造血细胞系中的谱系限制表达。Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:8536-8540。
Magli CM,Barba,P,Celetti A,De Vita G,Cillo,C,Boncinelli E.人类造血细胞中HOX基因的协同调节。Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:6348-6352。
Mathews CHE,Detmer K,Boncinelli E,Lawrence HJ,LargmanC.人HOX2基因座的同源框基因的红细胞类限制表达。Blood 1991;78:2248-2252。
Celetti A,Barba P.Cillo C,Rotoli B,Boncinelli E,Magli MC.不同类型人类白血病中HOX基因表达的特征性模式。Int J Cancer 1993;53:237-244。
Lawrence HJ,Sauvageau G,Ahmadi N,Lopez AR,LeBeau MM,Link M,Humphries K,Largman C.HOXA10同源框基因在正常造血细胞和白血病造血细胞中的阶段特异性和谱系特异性表达。Exp Hem1995;23:1160-1166。
Biji JJ,van 0ostveen JW,Walboomers JMM,Brink ATP,Vos W,Ossenkoppele GJ,Meijer CJLM.HOXC4、HOXC5和HOXC6在髓细胞白血病和正常骨髓细胞中的分化和细胞类型限制性表达。Leukemia1998;12:1724-1732。
Kawagoe H,Humphries RK,Blair A,Sutherland HJ,Hogge DE.HOX基因、HOX辅因子和MLL在白血病和正常人造血细胞的表型和功能限定的亚群中的表达。Leukemia 1999;13:687-698。
Salvati PD,Ranford PR,Ford J,Kees UR.在儿童急性成淋巴细胞白血病中HOX11的表达与T细胞表型相关。Oncogene 1995;11:1333-1338。
Cuneo A,Mecucci C,Kerim S,Vandenberghe E,Dal Cin P,VanOrshoven A,Rodhain J,Bosly A,Michaux JL,Martiat P.,BoogaertsM,Carli MG,Castoldi G,Van Den Berghe H.多能干细胞涉及成巨核细胞白血病:15位患者中的细胞学和细胞遗传学证据。Blood 1989;74:1781-1790。
Bonnet D,Dick JE.人类急性白血病作为起源于原始造血细胞的等级结构组构。Nature Medicine 1997;3:730-737。
Venditti A,Del Poeta G,Buccisano F,Tamburini A,Cox MC,Stasi R,Bruno A,Aronica G,Maffei L,Suppo G,Simone MD,Forte L,Cordero V,Postorino M,Tufilli V,Isacchi G,Masi M,Papa G,Amadori S.分化最少的急性髓细胞白血病(AML-MO):具有其它法国-美洲-英国亚型的25例病例的比较。Blood 1997;89:621-629。
Sauvageau G,Lansdorp PM,Eaves CJ,Hogge DE,DragowskaWH,Reid DS,largman C,Lawreence J,Humphries RK.功能独特的人骨髓细胞CD34+亚群中同源框基因的差异表达。Proc Natl Acad SciUSA 1994;91:12223-12227。
Bhatia M,Bonnet D,Murdoch B,Gan OI,Dick JE.一类新发现的具有SCID-繁殖活性的人类造血细胞。Nature Med 1998;4:1038-1045。
Goodell MA.CD34+或CD34-:它确实重要吗?Blood 1999;94:2545-2547。
Sato T,laver JH,Ogawa M.鼠造血干细胞可逆表达CD34。Blood1999;94:2548-2554。
Schiffer CA.成人急性髓细胞白血病。载于:Holland JF,Frei E.,Bast RC,Kufe DW,Morton DL,Weichselbaum RR(编著):CancerMedicine.Philadelphia,PA.Lea & Febiger,1997。
Scott MP,Tamkun JW,Hartzel lll GW.同源域的结构和功能。Biochem Biophys Acta 989:25,1989。
Bennett JM,Catovsky D,Daniel MT,Flandrin G,Galton DAG,Gralnick,HR,Sultan C.French-American-British Cooperative Group分类的建议的修订标准。Ann Intern Med 103:103,1985。
Luscher B,Eisenman RN.对Myc和Myb的新见解。第二部分。Myb。Genes & Devel 4:2235,1990。
Crotta S,Nicolis S,Ronchi A,Ottolenghi S,Ruzzi L,Shimada Y,Migliacci AR.在GM依赖性和G-CSF依赖性骨髓细胞系中红细胞转录因子表达的渐进失活。Nucl Acids Res 18:6863,1990。
Romeo P-H,Prandini M-H,Joulin V,Mignotte V,Prenant M,Vainchenker W,Marguerie G,Uzan G.巨核细胞和红细胞谱系共享特异性转录因子。Nature 344:447,1990。
Martin DIK,Orkin SH:红细胞因子GM1/NF-E1/ERYF1引起的转录激活和DNA结合。Genes Dev 4:1886,1990。
Perkins A,Kongsuwan K,Visvader J,Adams JM,Cory S:同源框基因表达加自分泌生长因子的产生诱发髓细胞白血病。Proc NatlAcad Sci USA 87:8398,1990。
Lawrence HJ,Sauvageau G,Ahmadi N,Lopez AR,LeBeau MM,Link M,Humphries K,Largman C.HOXA10同源框基因在正常造血细胞和白血病造血细胞中的阶段特异性和谱系特异性表达。Exp Hem23:1160,1995。
Lawrence H.J.,Sauvageau G,Humphries R.K.,Largman C:HOX同源框基因在正常血细胞生成和白血病血细胞生成中的作用。Stem Cells 14:281,1996。
Thorsteinsdottir U,Sauvageau G,Humphries RK:HOX同源框基因作为正常血细胞生成和白血病血细胞生成的调节剂。Aplastic Anemiaand Stem Cell Biol 11:1221,1997。
Borrow J.Shearman A.M.,Stanton Jr.V.P.,Becher R,Collins T,Williams AJ,Dube I,Katz F,Kwong YL,Morris C,Ohyashiki K,Toyama K,Rowley J,Housman DE:急性髓细胞白血病中t(7;11)(p15;p15)易位将核孔蛋白NUP98基因和I类同源异型蛋白HOXA9的基因融合。Nature Genetics 12:159,1996。
Nakamura T,Largaespada DA,Lee MP,Johnson LA,OhyashikiK,Toyama K,Chen SJ,Willman CL,Chen l-M,Feinberg AP,JenkinsNA,Copeland NG,Shaughnessy Jr JD:人髓细胞白血病中染色体易位t(7;11)(p15;p15)引起的核孔蛋白基因NUP98与HOXA9融合。Nature Genetics 12:154,1996。
Shimamoto T,Ohyashiki K,Ohyashiki JH,Kawakubo K,Fujimura T,Iwama H,Nakazawa S,Toyama K:红细胞/巨核细胞相关的转录因子GATA-1和干细胞白血病基因的表达模式与造血分化相关以及与急性髓细胞白血病的结果有关。Blood 86:3173,1995。
Komatsu N,Kirito K,Izuma T,Eguchi M,Miura Y:GATA-1和红细胞生成素受体基因在红白血病中高度表达。Exp Hem 26:1148,1998。
Thompson MA,Ramsay RG:Myb:一种具有新作用的老癌蛋白质。Bioessays 17:341,1995。
Bash,R.O.,Hall,S.,Timmons,C.F.,Crist,W.M.,Amylone,M.和Smith和Baer,R.(1995)TALL基因的激活是发生在大多数T细胞急性成淋巴细胞白血病患者中吗?一项儿科肿瘤学分组研究。Blood86:666-676。
Brown,L.,Cheng,J-T.,Chen,Q.,Siciliano,M.J.,Crist,W.,Buchanan,G.和Baer,R.(1990)tar-1基因的定点重组在人类T细胞白血病中经常发生。EMBO J 9:3343-3351。
Bernard,O.,Lecointe,N.,Jonveaux,p.,Souyr,M.,Mauchauffe,M.,Berger,R.,Larsen,C.J.和Mathieu-Mahul,D.(1991)局限于人T细胞急性白血病的两个定点缺失和t(1;14)易位破坏tar-1基因的5’部分。Oncogene 6:1477-1488。
Aplan,P.D.,Lombardi,D.P.,Reaman,G.,Sather,H.,Hammond,G.和Kirsch,I.R.(1992),推定的造血转录因子SCL涉及T细胞急性成淋巴细胞白血病。Blood 79:1327-1333。
Begley,C.G.,Aplan,P.D.,Denning,S.M.,Haynes,B.F.,Waldmann,T.A.和Kirsch,I.R.(1989)基因SCL在早期血细胞生成期间表达并且编码一种分化相关DNA结合基序。Proc.Natl.Acad.Sci.86:10128-10132。
Visvader,J.,Begley,C.G.和Adams,J.M.(1990)LYL、SCL和E2A螺旋-环-螺旋基因在造血系统中的差异表达。Oncogene 6:187-194。
Civin Cl,Strauss LC,Broyall C,Fackler MJ,Schwartz JF,Shaper JH:血细胞生成的抗原性分析。iII.一种由针对KG-la细胞产生的单克隆抗体限定的造血祖细胞细胞表面抗原。J Immunol133:157,1984。
Elwood,N.J.,Cook,W.D.,Metcalf,D.和Begley,C.G.(1993)涉及人类T细胞白血病中的基因SCL在鼠T淋巴细胞细胞系中具有致癌性。Oncogene 8:3093-3101。
上述描述和实施例的目的是说明本发明的某些实施方案,而不是表示有任何限制。对于本领域技术人员显而易见的是,可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下,对本发明的组合物和方法进行各种修改和改变。本文引用的所用本专利和出版物通过引用全部结合到本文中。
Claims (33)
1.一种编码BP1的分离的DNA,所述DNA具有SEQ ID NO:1。
2.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1表现出阻抑蛋白功能。
3.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1于β-珠蛋白基因上游-530 bp与沉默子I结合,以及于β-珠蛋白基因上游-300 bp与沉默子II结合。
4.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1与δ-珠蛋白基因上游-530 bp的DNA序列结合。
5.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1与Gγ-珠蛋白基因上游-1400 bp和-1100的序列结合以及与Aγ-珠蛋白基因-1100的序列结合。
6.权利要求1的分离的DNA,其中所述DNA是1251 bp的cDNA。
7.权利要求1的分离的DNA,其中所述DNA含有一个可读框(ORF)。
8.一种载体,所述载体包含权利要求1的分离的DNA。
9.一种宿主细胞,所述宿主细胞是用权利要求8的载体转化的宿主细胞。
10.一种权利要求9的宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
11.一种反义DNA或反义RNA,所述反义DNA或反义RNA与具有SEQ ID NO:1的DNA互补。
12.一种治疗镰状细胞贫血的方法,所述方法包括给予患者有效量的BP1的步骤。
13.权利要求12的方法,其中通过用含有SEQ ID NO.1的可读框和一个可控制表达启动子的载体转化患者的产生β-珠蛋白的细胞,给予所述BP1,使得在所述患者的产生β-珠蛋白的细胞中可控制地产生BP1。
14.权利要求12的方法,其中所述BP1减少β-珠蛋白的表达,并且降低胞内HbS浓度。
15.一种筛选或诊断急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病的方法,所述方法包括以下步骤:
(a) 从患者获取细胞样品,和
(b) 测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1,其中如果有过量表达,则BP1的过量表达指示急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病的阳性诊断。
16.权利要求15的方法,其中所述细胞样品得自骨髓或外周血。
17.权利要求15的方法,其中测定BP1是否过量表达的步骤(b),通过用衍生自SEQ ID NO:1的PCR引物进行RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)来完成。
18.权利要求17的方法,其中所述PCR引物是SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9的寡核苷酸,其中所述BP1的表达通过581碱基对(bp)的PCR产物来指示。
19.权利要求17的方法,其中所述PCR引物是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的寡核苷酸,其中所述BP1的表达通过225碱基对(bp)的PCR产物来指示。
20.权利要求15的方法,其中所述方法还包括提供抗BP1抗体的步骤,并且其中测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1的步骤(b),通过用所述抗BP1抗体经免疫组织化学检测BP1来完成。
21.一种筛选/诊断乳腺癌的方法,所述方法包括以下步骤:
(a) 从患者的乳腺组织获取细胞样品,和
(b) 测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1,其中如果有过量表达,则BP1的过量表达指示乳腺癌的阳性诊断。
22.权利要求21的方法,其中测定BP1是否过量表达的步骤(b),通过用衍生自SEQ ID NO:1的PCR引物进行RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)来完成。
23.权利要求22的方法,其中所述PCR引物是SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9的寡核苷酸,其中所述BP1的表达通过581碱基对(bp)的PCR产物来指示。
24.权利要求22的方法,其中所述RT-PCR引物是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的寡核苷酸,其中所述BP1的表达通过225碱基对(bp)的PCR产物来指示。
25.权利要求21的方法,其中所述方法还包括提供抗BP1抗体的步骤,并且其中测定与正常细胞相比所述细胞样品是否过量表达BP1的步骤(b),通过用所述抗BP1抗体经免疫组织化学检测BP1来完成。
26.一种编码BP1蛋白的mRNA片段。
27.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1是一种同源框基因,并且是distal-less家族的成员。
28.权利要求1的分离的DNA,其中所述BP1作图至染色体17q21-22。
29.一种抗BP1的多克隆抗体。
30.一种抗BP1的单克隆抗体。
31.一种组合物,所述组合物包含一组PCR引物,所述引物从编码BP1的mRNA的cDNA底物扩增一种单一DNA分子。
32.权利要求31的组合物,其中所述PCR引物组包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的寡核苷酸。
33.权利要求31的组合物,其中所述PCR引物组包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的寡核苷酸。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14894099P | 1999-08-13 | 1999-08-13 | |
US60/148,940 | 1999-08-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1378552A true CN1378552A (zh) | 2002-11-06 |
Family
ID=22528120
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN00814096A Pending CN1378552A (zh) | 1999-08-13 | 2000-08-14 | 新型转录因子bp1 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6416956B1 (zh) |
EP (1) | EP1633769A4 (zh) |
JP (1) | JP2003507028A (zh) |
CN (1) | CN1378552A (zh) |
AU (1) | AU767733B2 (zh) |
CA (1) | CA2381863A1 (zh) |
HK (1) | HK1049846A1 (zh) |
IL (1) | IL148012A0 (zh) |
MX (1) | MXPA02001614A (zh) |
WO (1) | WO2001012648A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101275134B (zh) * | 2007-04-20 | 2010-06-02 | 清华大学深圳研究生院 | 治疗乳腺癌的药物及其专用反义寡核苷酸 |
CN104277102B (zh) * | 2014-06-27 | 2017-04-12 | 李光辉 | 一种检测乳腺癌标志物Annexin A1抗原表位氨基酸序列及应用 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005022149A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Coopersurgical, Inc. | Method for determining embryo quality |
US20050221341A1 (en) * | 2003-10-22 | 2005-10-06 | Shimkets Richard A | Sequence-based karyotyping |
US7228975B2 (en) * | 2004-04-22 | 2007-06-12 | Simplehuman Llc | Dish rack with swinging arm |
WO2006055852A1 (en) * | 2004-11-17 | 2006-05-26 | Mosaic Reproductive Health And Genetics, Llc | Methods of developing a stem cell line |
US7662183B2 (en) | 2006-01-24 | 2010-02-16 | Timothy Haines | Dynamic spinal implants incorporating cartilage bearing graft material |
NZ584848A (en) * | 2007-09-28 | 2012-09-28 | Intrexon Corp | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
WO2011068563A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Oncoimmune Inc. | Uses of hypoxia-inducible factor inhibitors |
US20120295286A1 (en) * | 2011-04-21 | 2012-11-22 | The George Washington University | Methods for the Diagnosis, Prognosis and Monitoring of Cancer Therapy Using BP1 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69332665T2 (de) | 1992-03-11 | 2003-11-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methode um mrna zu klonieren |
US5677125A (en) | 1994-01-14 | 1997-10-14 | Vanderbilt University | Method of detection and diagnosis of pre-invasive cancer |
US5700927A (en) | 1994-12-23 | 1997-12-23 | The Children's Medical Center Corporation | Tbc1 gene and uses thereof |
US5668267A (en) | 1995-05-31 | 1997-09-16 | Washington University | Polynucleotides encoding mammaglobin, a mammary-specific breast cancer protein |
US5981218A (en) | 1995-08-09 | 1999-11-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Isolated nucleic acid molecules useful as leukemia markers and in breast cancer prognosis and encoded polypeptides |
US5994062A (en) | 1995-10-02 | 1999-11-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Epithelial protein and DNA thereof for use in early cancer detection |
US5776683A (en) | 1996-07-11 | 1998-07-07 | California Pacific Medical Center | Methods for identifying genes amplified in cancer cells |
US6037129A (en) | 1998-05-28 | 2000-03-14 | Medical University Of South Carolina | Multi-marker RT-PCR panel for detecting metastatic breast cancer |
-
2000
- 2000-08-11 US US09/636,735 patent/US6416956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-14 EP EP00957403A patent/EP1633769A4/en not_active Withdrawn
- 2000-08-14 AU AU69029/00A patent/AU767733B2/en not_active Ceased
- 2000-08-14 CA CA002381863A patent/CA2381863A1/en not_active Abandoned
- 2000-08-14 WO PCT/US2000/022093 patent/WO2001012648A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-08-14 CN CN00814096A patent/CN1378552A/zh active Pending
- 2000-08-14 JP JP2001517546A patent/JP2003507028A/ja active Pending
- 2000-08-14 MX MXPA02001614A patent/MXPA02001614A/es unknown
- 2000-08-14 IL IL14801200A patent/IL148012A0/xx unknown
-
2002
- 2002-05-14 US US10/143,897 patent/US7176294B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-03-14 HK HK03101903.1A patent/HK1049846A1/zh unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101275134B (zh) * | 2007-04-20 | 2010-06-02 | 清华大学深圳研究生院 | 治疗乳腺癌的药物及其专用反义寡核苷酸 |
CN104277102B (zh) * | 2014-06-27 | 2017-04-12 | 李光辉 | 一种检测乳腺癌标志物Annexin A1抗原表位氨基酸序列及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2003507028A (ja) | 2003-02-25 |
EP1633769A1 (en) | 2006-03-15 |
WO2001012648A1 (en) | 2001-02-22 |
CA2381863A1 (en) | 2001-02-22 |
MXPA02001614A (es) | 2003-07-21 |
IL148012A0 (en) | 2002-09-12 |
US20030171273A1 (en) | 2003-09-11 |
AU6902900A (en) | 2001-03-13 |
AU767733B2 (en) | 2003-11-20 |
US6416956B1 (en) | 2002-07-09 |
EP1633769A4 (en) | 2006-03-15 |
US7176294B2 (en) | 2007-02-13 |
HK1049846A1 (zh) | 2003-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1246458C (zh) | 人宫颈癌2原癌基因及其编码的蛋白质 | |
CN1378552A (zh) | 新型转录因子bp1 | |
CN1592793A (zh) | 肝细胞癌-相关基因和多肽,以及检测肝细胞癌的方法 | |
CN1225476C (zh) | 人子宫颈癌1原癌基因以及所编码的蛋白质 | |
CN1688364A (zh) | 证实与肿瘤发生相关的鼠基因组区域在抗癌药物的开发和癌症诊断中的应用 | |
CN1246457C (zh) | 人tsc403基因和人ing1l基因 | |
CN1177864C (zh) | 在肝癌组织中具有表达差异的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1169954C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1170848C (zh) | 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列 | |
CN1199998C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1199997C (zh) | 具有促进小鼠nih/3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1194989C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1281962C (zh) | 作为肝癌标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途 | |
CN1169955C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1155615C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1169958C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1170929C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1900279A (zh) | 诱导细胞凋亡的多核苷酸及其编码的多肽和用途 | |
CN1169833C (zh) | 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1194010C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白及基编码序列 | |
CN1230445C (zh) | 具有促进小鼠nih/3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1243017C (zh) | 肿瘤抑制基因及其编码蛋白和应用 | |
CN1169956C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1177047C (zh) | 编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1231496C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1049846 Country of ref document: HK |