CN1196089A - 与卡波济氏肉瘤和腹膜后纤维瘤病相关的γ疱疹病毒的DNA聚合酶 - Google Patents

与卡波济氏肉瘤和腹膜后纤维瘤病相关的γ疱疹病毒的DNA聚合酶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了分离的编码疱疹病毒γ亚族三个成员的DNA聚合酶的多核苷酸。两个来自感染腹膜后纤维瘤病的猕猴,另一个来自感染卡波济氏肉瘤的人AIDS患者。一个编码靠近DNA聚合酶活性部位的区域的454碱基对片段在这三个病毒间同一性为69—83%,但与其它已知γ疱疹病毒序列间的同一性只有54—68%,与α和β疱疹病毒序列间的同一性小于55%。本发明也提供了编码RFHV/KSHV亚族内相关病毒DNA聚合酶的多核苷酸。根据序列数据制备的多核苷酸可用作检测和鉴定相关序列的试剂。这类试剂可用来检测RFHV/KSHV亚族的成员,包括但不限于RFHV、RFHV2和KSHV。相应的多肽和肽片段可通过表达多核苷酸或通过化学合成获得。它们可用来检测感染受试者血清中可能存在的特异性抗体。它们也可用来设计或筛选通过抑制DNA聚合酶活性而限制病毒复制的药物化合物。

Description

与卡波济氏肉瘤和腹膜后纤维瘤病相关的 γ疱疹病毒的DNA聚合酶
交叉参考的相关申请
本申请是1995年7月14日提交的美国临时专利申请顺序号60/001，148和1996年7月11日提交的待审查美国专利申请顺序号(待审查，代理人备案目录号2993820001.00)的部分继续申请，这两个申请已全文列入本文参考文献。
对在联邦政府出资的研究中所作发明的权利的说明
本发明部分地是在由国立卫生研究院拨款支持的工作(RR00166-34)中作出的，政府对本发明拥有某种权利。
技术领域
本发明一般涉及病毒学领域，尤其是疱疹病毒家族的病毒。本发明更具体地涉及病毒亚族的DNA聚合酶的鉴定和特征描述，所述病毒亚族的成员与包括人的灵长类动物的纤维增殖性和肿瘤疾病相关。
                    背景技术
卡波济氏肉瘤是一种损坏外形并潜在致命的出血性肉瘤形式，其特征在于在皮肤上以深色斑或小结出现的多发性脉管肿瘤。在组织学水平上，其特征在于相对一致的纺锤形细胞的增殖，形成束和脉管裂缝。在炎症浸润中经常会出现浆细胞，T细胞和单核细胞，胃肠损害处或相关的淋巴瘤处出血的最终结果可能是死亡(一般参见Martin等人，Finesmith等人)。
一旦遇到相对而言起因不明的疾病，公众的注意力立刻会转向该疾病与AIDS的相关性。多达20％的某些感染了AIDS的群体在疾病过程中会患卡波济氏肉瘤，卡波济氏肉瘤也出现在与免疫缺损相关的其它疾病中，包括肾透析和治疗级免疫抑制，然而此疾病的流行病学暗示免疫缺损不是唯一的引发因素。具体地说，卡波济氏肉瘤与某些性服务高水平的相关性暗示非人类免疫缺损病毒这一病原因子的介入(Berel等人)。
已鉴定出得自AIDS病人卡波济氏损害的组织样品中疱疹病毒样DNA序列(Chang等人，由Ambroziuk等人进一步证实)，通过表现度差异分析得到序列(Lisitsyn等人)，其中使用不相关的引物寡核苷酸扩增了已感染和未感染组织中的DNA，然后使所述DNA与细胞之间最重要的差异部分杂交到一起。此序列与Epstein Barr病毒和疱疹病毒saimiri的已知序列部分相同，它编码两个结构组分-衣壳和外被蛋白。在概括研究多种来源的组织时发现不论病人的HIV状况如何，95％的卡波济氏肉瘤损害中都有此序列(Moore等人)。相同病人的21％未介入组织呈阳性，而对照群体样品中5％呈阳性，样品之间大约有0.5％的序列差异。在体腔淋巴瘤中也检测到较高拷贝数的此序列，所述淋巴瘤的渗出物中所含B细胞的基因型只在AIDS病人中出现(Cesarman等人)。其它与AIDS相关的淋巴瘤为阴性。
疱疹病毒家族含有很多大小约为100nm的多包膜病毒，所述病毒能够感染脊椎动物(一般性评论例见Emery等人，Field等人)。双链DNA基因组异乎寻常得大-长度约为88-229个千碱基，它在病毒生命周期的不同时期可产生50个以上不同的转录本。在其中一个时期，产生了多种核苷酸和多核苷酸加工酶以供病毒复制的需要，包括DNA聚合酶，DNA酶，dUTP酶，核糖核苷酸还原酶，尿嘧啶-DNA糖基化酶和胸苷激酶。与外部的病毒成分相比，不同种间的这些功能性蛋白质趋于相对较保守(Karlin等人)。
疱疹病毒家族已被分成几个亚族，对每一类目的划分起先是基于生物学特性基础，当基因组序列数据出现时才得以精简。α亚族含有的病毒具有宽宿主范围，短的复制周期，和对感觉神经节的亲和性，它们包括人单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。β亚族含有的病毒的宿主范围受到限制，它们包括巨细胞病毒和人疱疹病毒6型。γ亚族含有的病毒通常嗜淋巴细胞，其DNA的特征在于约110千碱基的低GC含量的片段旁侧有多个高GC含量的串联重复，此亚族包括Epstein Barr病毒(EBV)，疱疹病毒saimiri，马疱疹病毒2和5型，和牛疱疹病毒4型。
疱疹病毒与具有复杂临床进程的疾病有关，很多疱疹病毒的特征是能够在宿主体内进入潜伏期达相当长的时间。α亚族的病毒在感觉和植物性神经节中保持潜伏状态，而γ亚族的病毒在例如淋巴细胞谱系的细胞中保持潜伏状态。潜伏期与某些病毒基因的转录有关，并可以持续几十年直至身体状况最适于病毒恢复活性复制，这种身体状况可包括免疫缺损。另外，一些γ亚族的疱疹病毒能够遗传转化它们感染的细胞，例如，EBV与B细胞淋巴瘤，口毛白斑病，淋巴组织间质肺炎和鼻咽癌有关。
在人和其它脊椎动物中出现的许多其它疾病涉及纤维增殖和前-肿瘤细胞的产生，出现在人中的疾病的例子是腹膜后纤维变性，小结状纤维瘤病，假肉瘤纤维瘤病，和硬化肠系膜炎。在华盛顿大学的地区性灵长类动物研究中心的猕猴群体中已观察到已知为地方性腹膜后纤维瘤病(RF)的另一种疾病(Giddens等人)。此疾病晚期的特征在于纤维组织围绕肠系膜和腹膜腔的背面部分增殖，延伸至腹股沟内，穿过隔膜，并进入腹壁。一旦在临床上出现此病的明显症状，病人一律在1-2个月内死亡。此病与由D型猿猴逆转录病毒SRV-2造成的猿猴免疫缺损(SAIDS)相关(Tsai等人)，但是在感染了SAIDS的其它猴群体中未显示出相同的RF频率，近年来华盛顿的RF频率已有所降低。
在非人灵长类动物中研究这种疾病是重要的，这不仅是由于它可作为人疾病的模型，也是因为一种灵长类动可作为感染另一种灵长类动物的病毒的来源库，例如，疱疹病毒saimiri在其天然宿主松鼠猴(Saimirisciureus)中似乎不会引起疾病，但它在其它灵长类动物，尤其是猫头鹰(owl)猴中会引起多克隆的T-细胞淋巴瘤和急性白血病。
有必要开发试剂和方法以用于检测和治疗疱疹病毒感染。
例如，有必要开发能够用于诊断和评价卡波济氏肉瘤和类似疾病的试剂和方法。能够检测新病人的病原因子在鉴别诊断中会起作用；能够评价正在发生的疾病病原因子的水平在临床处理时会起作用。在此方面，Chang等人的编码外被蛋白的多核苷酸的实用性已受到限制，需要得到能够区分活动感染和潜伏感染的标记物，也需要得到免疫原性的标记物，当在抗体应答中证明时，所述标记物可用于评价对病原因子的免疫学暴露。
第二，有必要开发能够用于开发治疗卡波济氏肉瘤和类似疾病的新药物的试剂和方法。对卡波济氏肉瘤的最新治疗方法是放射性疗法与传统的化学疗法，如长春新碱(Northfelt，Mitsuyasu)的联合，尽管损害会对这些物理疗法作出反应，但反应是暂时的，不好的临床进程一般会恢复，甚至实验性的疗法，如用细胞因子治疗也是针对疾病综合征而不是病因。基于病原因子的药物筛选和合理的药物设计可直接针对对于具有长期效力的临床方案的长期需要。
第三，有必要开发能够用于鉴定可能与其它纤维增殖性疾病相关的病毒因子的试剂和方法。Chang等人使用的表现度差异分析技术非常复杂，可能不适于作为一般的筛选试验。在研究多种怀疑含有相关病原因子的组织样品的更常规的试验中能用作试剂的一套引物或探针更加合乎需要，优选此试剂能充分地交叉反应以鉴定以前未描述过的病原因子，但此试剂要有足够的特异性以避免鉴定出不需要的病毒或宿主的内源成分。
发明内容
本发明的目的是提供分离的多核苷酸、多肽、和抗体，它们或得自新的DNA聚合酶基因，或能与所述基因的产物反应，所述基因存在于疱疹病毒中，该病毒与尤其发生于人和非人灵长类中的纤维增殖性疾病和肿瘤相关。本发明的另一个目的是提供多核苷酸引物和探针以检测和鉴定疱疹病毒家族，尤其是γ疱疹病毒亚族的任何成员中的DNA聚合酶基因。本发明的另一个目的是提供基于这些多核苷酸、多肽、和抗体的材料和方法以用于诊断和治疗灵长类，尤其是人中的γ疱疹病毒感染。
本发明的实施方案包括下列内容：·  含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多
核苷酸含有与选自SEQ. ID NO：1和SEQ. ID NO：3的核苷酸27-501
至少有69％相同的序列(优选长度为475个核苷酸)。·  含有上述实施方案中的编码DNA聚合酶的多核苷酸区中的至少18
个，更优选至少约35个，再更优选约50个连串的核苷酸片段的分
离的多核苷酸，其中SEQ.ID NOS：110或111中不含所述片段的序
列，优选的例子是含有SEQ.ID NOS：1，3，116，或118中所含的至
少18个连串核苷酸片段的分离的多核苷酸。·  含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多
核苷酸含有与寡核苷酸LSGGA(SEQ.ID NO：107)至少有80％相
同的26个核苷酸长的序列。·  含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多
核苷酸含有与寡核苷酸CTDPA(SEQ.ID NO：108)至少有69％相
同的29个核苷酸长的序列。·  含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多
核苷酸含有与寡核苷酸KMLEA(SEQ. ID NO：22)至少有80％相同
的32个核苷酸长的序列。·  含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多
核苷酸含有与寡核苷酸GISPA(SEQ.ID NO：109)至少有69％相同
的29个核苷酸长的序列。·  含有上述实施方案中的编码DNA聚合酶的多核苷酸区中的至少18
个，更优选至少约35个，更优选约50个连串的核苷酸片段的分离
的多核苷酸，其中SEQ.ID NOS：110或111中不含所述片段的序列。
任一个上述实施方案中的多核苷酸，其中所述疱疹病毒能够感染灵
长类动物，优选的例子是RFHV，KSHV，和RFHV2。·  含有与SEQ.ID NO：1所含的核苷酸27-501之间，或SEQ.ID NO：
3所含的核苷酸27-501之间，或SEQ.ID NO：116所含的核苷酸36
-2499之间，或SEQ ID NO：118所含的核苷酸1-454之间的线性序
列至少有18个核苷酸相同，而不与SEQ.ID NO：110或SEQ.ID NO：
111中所含线性序列相同的线性序列的分离的多核苷酸，分离的多核
苷酸优选含有基本上与SEQ.ID NO：1的核苷酸27-501，或SEQ.ID
NO：3的核苷酸27-501，或SEQ.ID NO：116的核苷酸36-2499，
或SEQ.ID NO：118的核苷酸1-454相同的线性序列。·  本发明包括的任一个多核苷酸编码的分离的多肽。
分离的多肽，含有基本上与SEQ. ID NO：2所含氨基酸10-167之
间，或SEQ ID NO：4所含氨基酸10-167之间，或SEQ.ID NO：117
所含氨基酸13-833之间的序列，或与SEQ.ID NOS：119-123中
的任一个所含的氨基酸序列至少有11个，优选12个，更优选15个
氨基酸相同，而不与SEQ.ID NOS：112或SEQ.ID NO：113中所含氨
基酸序列相同的线性序列。
融合多肽，含有与第二个氨基酸序列相连的上述实施方案的分离多
肽的氨基酸序列。·  上述实施方案的分离的多肽，具有核酸结合活性，核苷酸结合活性，
或DNA聚合酶的活性。·  分离的多肽，含有与选自SEQ.ID NO：80，82，84，86，88，和90-103
的氨基酸序列相同的线性序列。·  编码本发明中包括的多肽的分离的多核苷酸。·  编码本发明中包括的多肽的非天然产生的多核苷酸。·  编码融合多肽的多核苷酸，含有与编码多肽的第二多核苷酸直接相
连的本发明中包括的多核苷酸。·  重组克隆载体，含有编码与SEQ. ID NO：2所含氨基酸10-167之
间，或SEQ ID NO：4所含氨基酸10-167之间，或SEQ.ID NO：117
所含氨基酸13-833之间的序列，或与SEQ.ID NOS：119-123中
的任一个所含的氨基酸序列至少有11个，优选12个，更优选15个
连串的氨基酸相同，而不与SEQ ID NOS：12或SEQ.ID NO：113中
所含氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸序列。·  重组表达载体，含有与调控多核苷酸序列有效相连的编码与SEQ.
ID NO：2所含氨基酸10-167之间，或SEQ ID NO：4所含氨基酸10
-167之间，或SEQ.ID NO：17所含氨基酸13-833之间的序列，
或与SEQ.ID NOS：119-123中的任一个所含的氨基酸序列至少有
11个，优选12个，更优选15个连串的氨基酸相同，而不与SEQ ID
NOS：112或SEQ. ID NO：113中所含氨基酸序列相同的多肽的多核苷
酸序列。·  重组克隆载体，含有与SEQ.ID NOS：1，3，116，或118中所含的，
而不是SEQ ID NOS：110或111中所含的线性序列至少有18个核苷
酸相同的线性序列。·  在遗传上被本发明的多核苷酸，克隆载体，或表达载体中的任一个
所改变的宿主细胞。·  特异针对本发明多核苷酸的所述编码区所编码的DNA聚合酶的单
克隆或分离的多克隆抗体。·  特异针对本发明多肽的单克隆或分离的多克隆抗体。·  基本上与选自SEQ ID NOS：5-16，21，22，104-109，和124-152
的寡核苷酸相同的寡核苷酸。·  得到编码DNA聚合酶的多核苷酸的扩增拷贝的方法，包括用本发明
的寡核苷酸接触多核苷酸并延伸已与多核苷酸形成双螺旋的寡核苷
酸的步骤，所述寡核苷酸可以是1型，2型或3型寡核苷酸，扩增
反应优选为聚合酶链反应(PCR)，PCR优选包括退火和延伸的重
复循环，退火在至少60℃的温度下进行。·  PCR优选在含有10-30mM(NH4)2SO4和1-10mM MgCl2的缓冲
液，如WB4缓冲液中进行。·  得到编码DNA聚合酶的多核苷酸的扩增拷贝的方法，其中被扩增
的多核苷酸首先得自生物样品，所述生物样品取自患有以成纤维细
胞增殖和胶原沉积为特征的疾病的个体。·  得到编码DNA聚合酶的多核苷酸的扩增拷贝的方法，其中被扩增
的多核苷酸首先得自生物样品，所述生物样品取自患有淋巴细胞谱
系恶性肿瘤的个体，另外包括的方法中，被扩增的多核苷酸首先得
自生物样品，所述生物样品取自患有选自腹膜后纤维变性，小结状
纤维瘤病，假肉瘤纤维瘤病，纤维肉瘤，硬化肠系膜炎，急性呼吸
病综合症，特发性肺纤维变性，扩散增殖性肾小球肾炎，神经胶质
瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质增生，白血病和淋巴瘤的疾病的个体。·  检测来源于灵长类动物的样品中病毒DNA或RNA的方法，包括的
步骤有：将样品中的DNA或RNA与含有本发明多核苷酸的探针接
触，所处条件应能允许探针与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核苷
酸，和具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID
NOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和如
果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。涉及的
条件是一单套满足所有列出的标准的反应参数，如保温时间，温度，
溶质浓度和洗涤步骤。在这些条件下，多核苷酸如果与具有SEQ.ID
NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷
酸接触，可以形成稳定的双螺旋，如果与具有SEQ.ID NO：24-SEQ.
ID NO：29中任一个的序列的多核苷酸接触，不能形成稳定的双螺
旋。只要在检测条件下稳定双螺旋的形成取决于所示序列，即可通
过与仅由所示序列组成的多核苷酸接触，或通过与含有与另外的核
苷酸相连的所示序列的多核苷酸接触非强制性地检测反应条件。使
用本发明的其它多核苷酸的类似方法也包括在本发明中，它包括在
与探针接触之前，对样品中的DNA或RNA进行扩增反应，可使用
本发明的寡核苷酸引物进行扩增反应。·  检测来源于灵长类动物的样品中病毒DNA或RNA的方法，包括的
步骤有：将样品中的DNA或RNA与含有SEQ.ID NOS：21，22，107，
108，或109中所示序列的寡核苷酸探针接触，所处的条件应能允许
探针与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.ID
NO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：24-29中任
一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和如果有的话，检测形
成的所述稳定双螺旋的存在。·  检测样品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步骤有：将样品中的
DNA或RNA与含有SEQ. ID NOS：22，107，108，或109中所示序列
的寡核苷酸探针接触，所处的条件应能允许探针与具有SEQ.ID
NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷
酸，而不与具有SEQ.ID NOS：23-29中任一个的序列的多核苷酸形
成稳定的双螺旋；和如果有的话，检测形成的所述稳定双螺旋的存
在。·  检测样品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步骤有：在反应中使
用本发明的寡核苷酸作为引物对样品中的多核苷酸进行扩增反应；
和如果有的话，检测多核苷酸扩增拷贝的存在。·  能与含有选自SEQ.ID NO：107，SEQ.ID NO：108和它们各自的互
补序列的序列的寡核苷酸形成稳定双螺旋的分离的多核苷酸，所处
的条件中寡核苷酸能与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核苷酸，和
具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：
23-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋。分离的多肽
含有由上述实施方案中多核苷酸编码的至少11个氨基酸，优选至少
12个氨基酸，更优选至少15个氨基酸的线性序列。·  检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括检测得自个体的生物样品
中的病毒DNA或RNA，其中通过本发明中包括的方法检测病毒
DNA或RNA。另外包括的检测疱疹病毒对个体的感染的方法中包
括检测得自个体的生物样品中的病毒DNA或RNA，其中病毒DNA
或RNA的检测通过下列方法进行：a)将样品中的DNA或RNA与
含有本发明多核苷酸的探针接触，所处的条件应能允许探针与具有
选自SEQ.ID NOS：1，3，116，或118的至少一个序列的多核苷酸，而
不与具有SEQ.ID NOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳
定的双螺旋；和b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定
双螺旋的存在。另外包括的检测疱疹病毒对个体的感染的方法中包
括检测得自个体的生物样品中的病毒DNA或RNA，其中病毒DNA
或RNA的检测通过下列方法进行：a)将样品中的DNA或RNA与
含有本发明多核苷酸的探针接触，所处的条件应能允许探针与具有
SEQ.ID NO：116中所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：
24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和b)如果
有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。·  检测生物样品中疱疹病毒多核苷酸的诊断试剂盒，它含有适当包装
的试剂，其中试剂包括本发明的多核苷酸。
检测生物样品中疱疹病毒多核苷酸的诊断试剂盒，它含有适当包装
的试剂，其中试剂包括本发明的寡核苷酸。·  检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括下列步骤：将得自个体的
样品中的抗体与本发明的多肽接触，所处的条件能允许稳定的抗原
-抗体复合物的形成；和如果有的话，检测所形成的所述稳定复合
物。·  检测生物样品中存在的抗-疱疹病毒抗体的诊断试剂盒，它含有适
当包装的试剂，其中试剂包括本发明的多肽。·  检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括下列步骤：将得自个体的
样品中的抗体与本发明的多肽接触，所处的条件能允许稳定的抗原
-抗体复合物的形成；和如果有的话，检测所形成的所述稳定复合
物。·  检测生物样品中存在的抗-疱疹病毒抗体的诊断试剂盒，它含有适
当包装的试剂，其中试剂包括本发明的多肽。·  检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括下列步骤：将得自个体的
样品中的多肽与本发明的抗体接触，所处的条件能允许稳定的抗原
-抗体复合物的形成；和如果有的话，检测所形成的所述稳定复合
物。·  检测生物样品中存在的疱疹病毒多肽的诊断试剂盒，它含有适当包
装的试剂，其中试剂包括本发明的抗体。·  用于治疗疱疹病毒感染的组合物，包括本发明的多核苷酸，多肽，
或抗体。·  确定候选药物是否能用于治疗γ疱疹病毒感染的方法，包括下列步
骤：将本发明的多肽与候选药物接触；并确定候选药物是否能改变
多肽的生化功能。被确定的多肽生化功能可以是多肽与核酸的结
合，或DNA聚合酶的活性。·  确定候选药物是否能用于治疗γ疱疹病毒感染的方法，包括下列步
骤：使用本发明的多核苷酸在遗传上改变细胞，并与未被多核苷酸
在遗传上改变的细胞相比确定候选药物对细胞的影响。·  得到用于治疗被疱疹病毒感染之个体的化合物的方法，包括下列步
骤：产生能与涉及与核酸的相互作用的本发明多肽区结合的化合
物；并确定化合物是否干扰多肽的生化功能。
附图简述
图1列出了从RFHV和KSHV的DNA聚合酶编码区扩增的多核苷酸序列，以及被编码的多肽，下划线部分是每个多核苷酸在引物DFASA和GDTD1B之间的475-碱基的片段。以小写字母表示的是用作扩增引物的寡核苷酸，它与DNA聚合酶基因的相应区域排在一起。DFASA，VYGA和GDTD1B是含有共有的和简并的区段的寡核苷酸，它们可用于扩增任何疱疹病毒DNA聚合酶基因。LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA是特异针对疱疹病毒RFHV/KSHV亚族的寡核苷酸。VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是RFHV-特异性引物。SGILA，CLNIA，IEASB和EARFB是KSHV-特异性引物。在编码序列的方向上起始扩增的寡核苷酸(名称以“A”结束)以5′→3′的方向被列出。以与编码序列的方向相反的方向起始扩增的寡核苷酸(名称以“B”结束)以3′→5′的方向被列出以显示出与RFHV和KSHV多核苷酸中的相应序列的对比。
图2列出了以前已知的其它疱疹病毒DNA聚合酶的多肽序列，显示出种之间相对保守的区域。
图3列出了以前已知的靠近保守的REGION 2的疱疹病毒多核苷酸序列，显示出排成行的寡核苷酸DFASA和DFQSA以及从中它们被设计的序列。
图4列出了以前已知的靠近保守的REGION 3的疱疹病毒多核苷酸序列，显示出排成行的寡核苷酸VYGA，VYGCA和VYGSQA以及从中它们被设计的序列。
图5列出了以前已知的靠近保守的REGION 1的疱疹病毒多核苷酸序列，显示出排成行的寡核苷酸GDTD1B和GDTDSQB以及从中它们被设计的序列。
图6列出了γ疱疹病毒亚族DNA聚合酶的多核苷酸序列的比较，所示片段是DFASA和GDTD1B杂交位点之间的475个碱基对。
图7列出了相同病毒DNA聚合酶有关图6所示相同片段的多肽序列之间的比较。该图也显示了可能的抗体结合区的例子，包括特异针对RFHV、KSHV或RFHV/KSHV亚族的那些。
图8比较了较广范围的疱疹病毒中DFASA和GDTD1B之间编码的片段的多肽序列，显示出α，β，和γ亚族疱疹病毒，和内源性哺乳动物DNA聚合酶的序列。
图9是以图8所示多肽序列为基础的DNA聚合酶关系图谱。
图10列出了γ疱疹病毒亚族成员与图6所示相同区域有关的DNA聚合酶基因，此图显示出排成一行的寡核苷酸LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA以及从中它们被设计的序列，这些寡核苷酸特异针对RFHV/KSHV病毒亚族的DNA聚合酶。
图11是VYGA和GDTD1B之间编码的RFHV多肽片段的Hopp-Woods抗原性图，下面示出的是序列中疏水性和抗原性残基的跨度。
图12是DFASA和GDTD1B之间编码的KSHV多肽片段的Hopp-Woods抗原性图，下面示出的是序列中疏水性和抗原性残基的跨度。
图13列出了KSHV的估计约3000个核苷酸长的DNA聚合酶编码序列中的约2511个核苷酸，以及氨基酸翻译，从图1所示的PCR片段中以5′和3′方向提供另外的序列资料。
图14列出了KSHV的DNA聚合酶氨基酸序列部分与其它疱疹病毒的相应部分的比较，星号(*)和圆点(·)表示保守的残基或保守的取代，箭头(↑)表示在其它疱疹病毒中保守，但在KSHV序列中有所不同的残基。
图15列出了KSHV DNA聚合酶氨基酸序列已知的变体。
图16列出了从RFHVMm(此处被称为RFMm)的DNA聚合酶编码区扩增的多核苷酸序列，RFHVMm是根据本发明的标准鉴定的RFHV/KSHV疱疹病毒亚族的第三个成员，此图显示了RFHV(此处被称为RFMn)的DNA聚合酶编码区和KSHV的DNA聚合酶编码区之间的比较。
图17列出了RFHVMm的DNA聚合酶编码区所编码的氨基酸序列与RFHVMn，KSHV和三种其它疱疹病毒的相应序列之间的比较。
图18是图17中的氨基酸行列的统计学的系统发育分析，所示数目是100次重复以外的自举值。
图19是显示RFHV/KSHV亚族成员的DNA聚合酶核苷酸序列中1型，2型，和3型寡核苷酸探针的大致杂交位置的图。
图20是在使用病毒-特异性寡核苷酸引物的嵌套扩增试验中有代表性地筛选豚尾猴(泳道A-D，I，和J)和猕猴(泳道G和H)中RFHVMn和RFHVMm疱疹病毒序列的流行。
实施本发明的最佳方式
我们已从疱疹病毒RFHV/KSHV亚族的典型成员RFHV，RFHV2和KSHV中发现并鉴定了编码DNA聚合酶的多核苷酸，所得多核苷酸，相关的多核苷酸，和相应的多肽和抗体能用于诊断，临床监测和治疗疱疹病毒感染以及相关疾病。
RFHV和KSHV的上述多核苷酸分别来自取自患有腹膜后纤维瘤病(“RF”)的豚尾猴和患有卡波济氏肉瘤(“KS”)的人的被感染组织的样品。我们预测同这些疾病相关的病毒与引起任何同时期的免疫缺损的病毒有所不同。我们预先不知道会牵涉到RF和KS相关病毒。
我们决定检验这一前提，即与这两种疾病都相关的病毒是疱疹病毒家族中的成员，因此我们设计了用于扩增反应的寡核苷酸以得到大范围的疱疹病毒中编码DNA聚合酶的多核苷酸。将此前已描述过的疱疹病毒氨基酸序列进行比较，鉴定出三个保守区。使用相应的已知的多核苷酸序列构建含有简并区段和共有区段的寡核苷酸。这些寡核苷酸在扩增反应中可用作引物，所述扩增反应可从两种组织来源的每一种中产生编码DNA聚合酶之区段的片段。
扩增反应最后一步得到的多核苷酸片段的序列示于图1(分别为SEQ.ID NO：1和SEQ.ID NO：3)，尽管这两个序列含有与其它疱疹病毒DNA聚合酶序列区域高度同源的区域，但这两个序列仍是新的。感染豚尾猴的病毒被称为“腹膜后纤维瘤病疱疹病毒”(“RFHV”)，感染人患者的病毒被称为“卡波济氏肉瘤疱疹病毒”(“KSHV”)。所示多核苷酸序列包括的区段的每一末端对应于扩增反应中所用DFASA和GDTD1B引物的杂交区域。引物之间475个碱基对的片段表示RFHV和KSHV的DNA聚合酶基因的扩增部分。
鉴于设计引物是为了扩增大范围的DNA聚合酶，我们惊奇地发现相对于任何其它已知的疱疹病毒DNA聚合酶而言，这两个DNA聚合酶序列相互之间显然更加密切相关(在核苷酸水平上有71％相同)。下一个最密切相关的多核苷酸序列来自马疱疹病毒2(eHV2)，松鼠猴疱疹病毒1型(sHVI)和Epstein Barr病毒(EBV)，因此我们预测RFHV和KSHV都是疱疹病毒γ亚族的成员。RFHV和KSHV与其它γ疱疹病毒的共有特征是与异常的细胞或纤维变性生长的相关性，以及与包括免疫抑制和B细胞发育异常的免疫异常的相关性。然而RFHV和KSHVDNA聚合酶序列在CpG二核苷酸的频率上与sHV1和EBV有所不同。RFHV和KSHV DNA聚合酶的核苷酸序列和以此为根据的寡核苷酸确定了下文所述的RFHV/KSHV亚族。还提供了感染猕猴的该亚族第三成员RFHV2的DNA聚合酶序列。
DNA聚合酶之间保守的程度意味着本发明中包含的多核苷酸和多肽是RFHV和KSHV不同毒株中可靠的标记物。由于DNA聚合酶是隐蔽抗原，因此它不在相同水平的免疫学压力下形成逃逸突变体。另外，此序列受这些区域在DNA聚合酶催化活性中所起到的关键性作用的限制。因此，本发明中包含的多核苷酸，多肽和抗体在此应用中可用于检测个体中由属相同亚族的RFHV，KSHV或其它疱疹病毒引起的病毒感染。本发明的实施方案也可用于鉴定疱疹病毒DNA聚合酶和设计药物疗法。
由于DNA聚合酶在病毒复制中起关键性作用，因此它是药理干涉的适当的目标。此分子中特别敏感的区域是那些涉及底物识别，模板结合，催化作用，与调节性亚单位结合的区域。
在下文章节中将进一步详细描述RFHV/KSHV亚族的多核苷酸，相关的寡核苷酸探针和引物，相关的多肽和抗原，相关的特异性抗体，这些化合物的制备和用途和相关的方法及产品。缩写
本文使用的下列缩写指的是疱疹病毒的种类，以及从中得到的编码DNA聚合酶的多核苷酸和基因：
                            表1：疱疹病毒株的缩写
   名称             病毒    暂时的亚族排布
   RFHVKSHVeHV2sHV1hEBVhCMVmCMVgpCMVhHV6hVZVhHSV1hHSV2eHV1iHV1     与猕猴腹膜后纤维瘤病相关的疱疹病毒与人卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒马疱疹病毒2型saimiri猴疱疹病毒1型人Epstein-Barr病毒人巨细胞病毒鼠巨细胞病毒豚鼠巨细胞病毒人疱疹病毒6型人水痘-带状疱疹病毒人单纯疱疹病毒1型人单纯疱疹病毒2型马疱疹病毒1型ictalurid catfish疱疹病毒     γ-疱疹病毒
    β-疱疹病毒
    α-疱疹病毒
   hPOLdbPOLd      人内源性DNA聚合酶牛内源性DNA聚合酶 真核生物δDNA聚合酶
定义
“RFHV”和“KSHV”分别是在被感染的豚尾猴和人的组织样品中检测到的疱疹病毒家族的病毒。被这些病毒感染的细胞含有编码本文所述的各种DNA聚合酶的多核苷酸。“RFHV”是术语“RFHV1”，“RFHVMn”和“RFMn”的同义词。RFHV/KSHV亚族的第三成员是在猕猴中鉴定出的病毒，本文中将此病毒称作“RFHV2”，“RFHV2”是术语“RFHVMm”和“RFMm”的同义词。
“RFHV/KSHV亚族”这一术语用于本文是指能感染脊椎动物种类的疱疹病毒的总和，组成这一亚族的成员所具有的序列与RFHV或KSHV的相应序列之间的相关性与这些病毒中的任一种与表1所列的其它任何病毒之间的相关性相比，前者更加密切。可以在多核苷酸水平上也可以在多肽水平上进行序列比较，序列比较可以横跨完整的基因或蛋白质，或横跨其片段。本文所用的亚族指的是这样一些疱疹病毒，它们含有编码DNA聚合酶的多核苷酸部分，所述多核苷酸与RFHV或KSHV的相应区域较这些病毒中任一个与表1中病毒之间更加一致。优选编码聚合酶的多核苷酸含有在残基27和501之间与RFHV(SEQ.ID NO：1)或KSHV(SEQ.ID NO：3)的相应部分至少有69％相同的区段；或与寡核苷酸LSGGA至少有80％相同；或与寡核苷酸CTDPA至少有69％相同；或与寡核苷酸KMLEA至少有80％相同；或与寡核苷酸GISPA至少有69％相同。
本文所用的“DNA聚合酶”是蛋白质或蛋白质类似物，在适当条件下能够催化DNA多核苷酸与序列的装配，所述序列与用作模板的多核苷酸互补。DNA聚合酶也可以含有其它催化活性，如3′-5′外切核酸酶活性；任何一种活性都可能占优势。DNA聚合酶可能需要与附加的蛋白质或辅-因子连接以行使其催化功能。“DNA聚合酶活性”指的是针对DNA多核苷酸装配的催化活性，“DNA聚合酶反应”是核苷酸聚合途径中反应机理的任何步骤，包括与底物，辅因子和调节性亚单位的连接，中间体的形成，和反应产物的形成。
术语“DNA聚合酶基因”包括能编码可催化DNA聚合酶反应之多肽的任何基因。因其与其它DNA聚合酶基因的同源性或其相对于相邻基因的位置，“DNA聚合酶基因”也包括据信衍生自编码DNA聚合酶的原始基因的任何基因；这种基因可以编码非功能性的DNA聚合酶类似物，DNA聚合酶片段或突变体，或此基因不能被转录或翻译。
“调节性的亚单位”对于具有DNA聚合酶活性的第一多肽而言是当与第一多肽连接时能调节其DNA聚合酶活性的第二多肽。UL42是调节性亚单位的一例。
“UL42”或“UL42亚单位”是一些疱疹病毒基因组中编码的辅助蛋白，它能与病毒的DNA聚合酶连接。在某些条件下，它可增强由DNA聚合酶基因编码的多肽的DNA聚合酶活性，病毒可能需要它才能复制。本文所用的定义是功能性定义，不取决于相应基因的结构或基因组位置，因此RFHV或KSHV的UL 42亚单位所具有的序列与其它病毒的UL42亚单位实质上并不相同。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，它们指的是任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸或者是核糖核苷酸，或者是它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并可行使已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸非限制性的例子：基因或基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列分离的DNA，任何序列分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可含有经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，则可在聚合物装配之前或之后对核苷酸结构进行修饰。非核苷酸成分可打断核苷酸的序列，聚合之后可通过例如与标记成分结合进一步修饰多核苷酸。
本文使用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有特别说明或需要，本文所述发明的任何实施方案中的多核苷酸既包含双链形式，也包含已知或预测组成此双链形式的两个互补单链形式中的每一种。
在多核苷酸的上下文中，“线性序列”或“序列”是多核苷酸中5′至3′方向上的核苷酸顺序，其中在序列中互为邻居的残基在多核苷酸的一级结构中是邻接的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上含有额外残基的多核苷酸之一部分的线性序列。
“杂交”指的是一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物通过核苷酸残基碱基之间的氢键得以稳定。Watson-Crick碱基配对，Hoogsteen结合或任何其它序列-特异性方式都可能产生氢键键合。复合物可含有形成双螺旋结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单条自身杂交链或任何它们的组合。在更加外延的方法，如PCR的起始，或通过核酶酶促裂解多核苷酸中，杂交反应可构成一个步骤。
可在不同的“严紧”条件下进行杂交反应。增加杂交反应严紧性的条件已广为人知并已在本技术领域中公开，例见Sambrook Fritsch&Maniatis。相关条件的例子包括(以增加严紧性的次序)：保温温度为25℃，37℃，50℃和68℃；缓冲液浓度为10×SSC，6×SSC，1×SSC，0.1×SSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸缓冲液)和使用其它缓冲液系统的它们的等同物；甲酰胺浓度为0％，25％，50％和75％；保温时间为5分钟至24小时；和洗涤持续时间渐长，频率渐增或缓冲液浓度逐渐降低。
“Tm”是实验条件下50％多核苷酸双螺旋解离成单链时的摄氏温度，所述双螺旋由通过Watson-Crick碱基配对在反平行方向以氢键键合的互补链组成。根据标准公式可预测Tm，例如：
Tm＝81.5+16.6log[Na+]+0.41(％G/C)-0.61(％F)-600/L其中Na+是以mol/L表示的阳离子浓度(通常为钠离子)；(％G/C)是以在双螺旋中占总残基的百分比表示的G和C残基的数目；(％F)是溶液中甲酰胺的百分含量(wt/vol)；L是双螺旋的每一链中核苷酸的数目。
多核苷酸“稳定的双螺旋”或生化反应中任何两个或多个成分之间形成的“稳定的复合物”指的是在双螺旋或复合物的形成和其随后的检测之间能维持足够长时间的双螺旋或复合物。双螺旋或复合物无论在何种条件存在下都应该能维持并在形成时刻和检测时刻之间的某一时刻被导入，这些条件是所进行的检测或反应的参数。非强制性存在的能破坏双螺旋或复合物的有关条件包括洗涤，加热，在反应混合物中加入额外的溶质或溶剂(如变性剂)，和与多余的反应类别竞争。稳定的双螺旋或复合物可以是不可逆的，也可以是可逆的，但必须满足此定义的其它必需条件。因此，反应混合物中可能形成瞬时复合物，但是如果它自动解离或者由于在检测前引入新增加的条件或操作而发生解离，就不能构成稳定的复合物。
当在两个单链多核苷酸之间以反平行的构型形成稳定的双螺旋时，特别是在高度严紧的条件下，链基本上是“互补的”。双链多核苷酸可以与另一个多核苷酸“互补”，条件是第一多核苷酸中的一条链和第二多核苷酸中的一条链之间能形成稳定的双螺旋。从单链多核苷酸序列推测的互补序列是有望根据广泛为人接受的碱基配对规则与单链多核苷酸形成氢键键合的标准核苷酸的最适序列。
“有义”链和“反义”链当用于相同的上下文中时指的是相互之间互补的单链多核苷酸。它们可以是双链多核苷酸的相反链，或者根据广泛为人接受的碱基配对规则由一条链推测另一条链。除非另有特别说明或暗示，可任意地将一条链或其它链指定为“有义”或“反义”链。
如果每一线性序列中的核苷酸顺序相同，并且不存在取代，缺失或物质替换，则核苷酸线性序列与另一个线性序列“相同”。应理解就Watson-Crick碱基配对而言，具有类似结构的嘌呤和嘧啶含氮碱基在功能上是等价的；类似的含氮碱基，特别是尿嘧啶和胸腺嘧啶的相互取代，或者例如通过甲基化作用对含氮碱基的修饰不会构成物质替换。当RNA序列反映出多核糖核苷酸中含氮碱基的顺序，DNA序列反映出多脱氧核糖核苷酸中含氮碱基的顺序，且这两个序列满足此定义的其它需求时，RNA和DNA多核苷酸具有相同的序列。在至少一个序列是含有多义残基的简并寡核苷酸时，如果简并寡核苷酸的至少一个可替换的形式与它所比较的序列相同，则这两个序列是相同的，例如，如果AYAAA是ATAAA和ACAAA的混合物，则AYAAA与ATAAA相同。
当在多核苷酸之间进行比较时，只能理解为容易产生互补链，选择有义或反义链，或者预测它们能使被比较的多核苷酸之间的相同程度最大化。例如，当被比较的多核苷酸中的一个或两个是双链时，如果第一多核苷酸的一条链与第二多核苷酸的一条链相同，则序列相同。类似地，当多核苷酸探针被描述成与其靶相同时，应理解它是靶的互补链，所述互补链参与了探针和靶之间的杂交反应。
如果两个序列都能与相同的互补多核苷酸杂交形成双螺旋，则其中一个核苷酸的线性序列与另一个线性序列“基本上相同”，更优选能在较严紧的条件下杂交的序列。应理解杂交反应可容纳核苷酸序列中的插入，缺失和取代。因此即使一些核苷酸残基不能精确地对应或匹配，核苷酸的线性序列也基本上相同，相比之下更优选与本发明公开的更加对应或匹配的序列。通常约为25个残基的多核苷酸区域与另一个区域基本上相同，条件是序列至少约80％相同；更优选序列至少约90％相同；更优选序列至少约95％相同；再更优选序列为100％相同。在同源部分相互匹配之后，40或更多个残基的多核苷酸区域与另一个区域基本上相同，条件是序列至少约75％相同；更优选序列至少约80％相同；更优选序列至少约85％相同；甚至更优选序列至少约90％相同；再更优选序列为100％相同。
在测定多核苷酸序列是否基本上相同时，特别优选保留了多核苷酸的功能性并以此进行比较的序列。可通过不同的参数测定功能性，例如，如果多核苷酸用于涉及与另一个多核苷酸杂交的反应中，则优选的序列为那些在类似条件下与相同靶杂交的序列。通常，对于200或更多个残基的双螺旋而言，序列的同一性每减少1％，DNA双螺旋的Tm约降低1℃；或对于少于40个残基的双螺旋而言约降低5℃，这取决于错配残基的位置(例见Meinkoth等人)。一般而言，约100个残基的基本上相同的序列在低于Tm约20℃时能与彼此各自互补的序列形成稳定的双螺旋；优选它们能在低于Tm约15℃时形成稳定的双螺旋；更优选它们能在低于Tm约10℃时形成稳定的双螺旋，甚至更优选它们能在低于Tm约5℃时形成稳定的双螺旋；再更优选它们能在约Tm时形成稳定的双螺旋。在另一个实施例中，如果由多核苷酸编码的多肽是其功能性的重要部分，则优选的序列为那些编码相同或基本上相同的多肽的序列。因此能导致保守的氨基酸取代的核苷酸差异比那些导致非保守取代的核苷酸差异更加优选，更优选不会改变氨基酸序列的核苷酸差异，而甚至更优选相同的核苷酸。导致多肽插入或缺失的多核苷酸插入或缺失比那些导致下游编码区变得不能同时协调的多核苷酸插入或缺失更加优选，甚至更优选不含插入或缺失的多核苷酸序列。杂交特性和多核苷酸编码的多肽序列的相对重要性取决于本发明的应用。
多核苷酸具有与另一个多核苷酸相同的“特性”，条件是这两个多核苷酸在类似的最高严紧度的条件下，都能与特殊的第三个多核苷酸形成稳定的双螺旋。优选除了类似的杂交特性外，多核苷酸也编码基本上相同的多肽。
多核苷酸序列的“保守”残基是那些不变地出现在被比较的两个或多个相关序列的相同位置上的残基。相对保守的残基是那些相对于在序列别处出现的残基而言，在更相关的序列中保守的残基。
“相关的”多核苷酸是共用相同残基的有意义部分的多核苷酸。
本文所用的“简并”寡核苷酸序列是按下述衍生自至少两个相关的来源多核苷酸序列的经设计的序列：在来源序列中保守的残基被保留在简并序列中，而在来源序列中不保守的残基可以简并序列中的几个可替代物提供。例如，可从来源序列ATACA和ACAGA出发设计简并序列AYASA，其中Y是C或T，S是C或G。Y和S是“多义”残基的例子。简并区段是含有简并序列的多核苷酸区段。
应理解含有简并序列的合成寡核苷酸实际上是除了在多义位置以外共用相同序列的密切相关的寡核苷酸混合物。这种寡核苷酸通常被合成为多义位置处的核苷酸的所有可能的组合的混合物，混合物中每种寡核苷酸被称作“可替换的形式”，混合物中该形式的数目等于 Π i = 1 n k i 其中ki是每个位置处允许的可替换核苷酸的数目。
本文所用的“共有”寡核苷酸序列是按下述衍生自至少两个相关的来源多核苷酸序列的经设计序列；在所有来源序列中保守的残基被保留在共有序列中；而在残基不保守的位置处，从来源序列中选择了一个替代物。通常选择的核苷酸是在来源序列中以最高频率出现的核苷酸。例如，可由来源序列CAAAA，AAGAA和AAAAT出发设计共有序列AAAAA，共有区段是含有共有序列的多核苷酸区段。
本文所用的多核苷酸“片段”或“插入物”通常表示全长形式的次分区域，但也可包括完整的全长多核苷酸。
如果一个多核苷酸最终衍生自另一个多核苷酸，那么不同的多核苷酸相互“对应”。例如，信使RNA对应于它所转录的基因，cDNA对应于通过例如逆转录反应，或基于RNA序列知识的DNA化学合成而产生它的RNA，cDNA也对应于编码RNA的基因。如果多核苷酸在被比较的不同种，株或变体中行使类似的功能，如编码相关的多肽，则这些多核苷酸也相互“对应”。
在多核苷酸操作上下文中所用的“探针”指的是以试剂的形式提供以通过与靶杂交检测受试样品中潜在存在的靶的寡核苷酸。通常探针会含有标记物或者使标记物在杂交反应之前或之后能被结合的物质。适当的标记物包括但不限于放射性同位素，荧光染料，化学发光化合物，染料和包括酶的蛋白质。
“引物”是通常具有游离的3′-OH基团的寡核苷酸，它能通过与靶杂交来结合受试样品中潜在存在的靶，然后促使与靶互补的多核苷酸聚合。
产生相同多核苷酸的复制拷贝的方法，如PCR或基因克隆在本文中被统称为“扩增”或“复制”。例如，可以复制单链或双链DNA以形成具有相同序列的另一个DNA。例如可通过RNA指导的RNA聚合酶，或通过逆转录DNA然后进行PCR来复制RNA。在后一种情况下，RNA的扩增拷贝是具有相同序列的DNA。
“聚合酶链反应”(“PCR”)是使用一种或多种引物和聚合作用催化剂，如逆转录酶或DNA聚合酶，特别是热稳定性的聚合酶由靶多核苷酸制成复制拷贝的反应。通常PCR涉及反复形成的三个步骤：“退火”，其中温度被调节，以使寡核苷酸引物能与欲被扩增的多核苷酸形成双螺旋；“延伸”，其中温度被调节，以使通过DNA聚合酶，使用它们已与之形成双螺旋的多核苷酸为模板，使得已形成双螺旋的寡核苷酸被延伸；和“解链”，其中温度被调节，以使多核苷酸和被延伸的寡核苷酸解离。然后重复此循环直至得到所需量的经扩增的多核苷酸。PCR方法参见美国专利号4,683,195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)。
基因内的元件包括但不限于启动子区域，增强子区域，阻遏物结合区域，转录起始位点，核糖体结合位点，翻译起始位点，蛋白质编码区域，内含子和外显子，和转录和翻译的终止位点。
“调控元件”或“调控序列”是涉及对多核苷酸的功能性调节有贡献的分子相互作用的核苷酸序列，所述作用包括多核苷酸的复制，重复，转录，剪接，翻译，或降解。调节可以影响到进程的频率，速度或特异性，也可以在性质上逐渐增强或被抑制。调控元件是本技术领域中已知的。例如，“启动子”就是一例调控元件。启动子是能在某些条件下结合RNA聚合酶并起动位于启动子下游(3′方向)的编码区转录的DNA区域。
“有效连接”指的是遗传元件的并列，其中元件的排列关系应能允许它们以预期的方式起作用。例如，如果启动子帮助起动编码序列的转录，则启动子与编码区域有效地连接，在启动子和编码区域之间应存在有相关的残基，只要这种功能关系能得以维持。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可含有经修饰的氨基酸，可被无氨基的酸打断。此术语也包含已被修饰的氨基酸聚合物；修饰可包括例如，二硫键的形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化，或任何其它操作，如与标记物成分缀合。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中N末端至C末端方向上的氨基酸顺序，其中序列中互相邻接的残基在多肽的一级结构中是邻接的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上含有额外残基的多肽的一部分的线性序列。
如果氨基酸的线性序列与另一个序列具有相当大程度上的序列同一性，则这两个序列“基本上相同”。应理解蛋白质的折叠和生化功能可容纳氨基酸序列中的插入，缺失和取代。因此，即使一些残基不能精确地对应或匹配，氨基酸的线性序列也基本上相同，更加优选与本发明未公开的更紧密对应或匹配的序列。还应理解一些氨基酸的取代更容易忍受。例如由具有类似特性的侧链的另一个氨基酸取代具有疏水侧链，芳香侧链，极性侧链，具有正或负电荷的侧链，或含有两个或较少碳原子的侧链的氨基酸不会影响两个序列基本上相同的特性。测定同源区域和评价同源性程度的方法是本技术领域中熟知的；例见Altschul等人和Henikoff等人。较能忍受的序列差异指的是“保守的取代”，因此具有保守取代的序列比那些在相同位置具有其它取代的序列更加优选；更优选在相同位置处具有相同残基的序列。通常约25个残基的多肽区域与另一个区域基本上相同的条件是序列至少约80％相同；更优选至少约85％相同；更优选至少约90％相同；更优选至少约95％相同；再更优选序列100％相同。同源部分匹配之后40个或更多个残基的多肽区域与另一区域基本上相同的条件是序列至少约70％相同；更优选它们至少约70％相同，并含有至少另一个10％的相同或保守取代；更优选它们至少约80％相同，并含有至少另一个10％的相同或保守取代；更优选它们至少约90％相同；再更优选序列100％相同。
在测定是否多肽序列基本上相同时，特别优选保留了与其进行比较的多肽的功能性的序列。可通过不同的参数确定功能性，如酶活性，底物  酶或受体-配体相互作用中的结合速率或亲和性，与抗体的结合亲和性和X-射线晶体结构。
如果多肽与另一个多肽显示出相同的生化功能，如酶活性，配体结合或抗体反应性，则这两个多肽具有相同的“特性”。与DNA聚合酶或DNA聚合酶片段相关之多肽的优选特性是DNA聚合酶活性，DNA模板结合和脱氧核糖核苷酸三磷酸的结合。也优选与所比较的多肽显示出相同生化功能的多肽，另外还优选据信通过计算机模拟预测或通过如X-射线晶体学这类技术测定，与所比较的多肽具有类似三维构象的多肽。
“生化功能”或“生物活性”包括通过适当的实验研究可检测到的多肽的任何特征。“改变的”生化功能指的是通过例如分子量测定，圆二色性，抗体结合，差异光谱学或核磁共振可以检测到的多肽一级，二级，三级或四级结构的改变。它也可以指反应性的改变，如催化某一反应的能力，或结合辅因子，底物，抑制物，药物，半抗原或其它多肽的能力。如果某物质以这些方式中的任一种改变了多肽的生化功能，就可以说此物质“干扰”了多肽的生化功能。
“融合多肽”是与天然出现的多肽相比，含有序列中不同位置处的区域的多肽。此区域可以在不同的蛋白质中正常地存在，并在融合多肽中被连在一起；或者它们也可以正常地存在于相同的蛋白质中，但在融合多肽中以新的安排被放置。可通过例如化学合成，或通过以所需的关系产生和翻译编码肽区域的多核苷酸来产生融合多肽。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区上的至少一个抗原识别位点与靶(如多肽)特异性结合的免疫球蛋白分子。本文所用的术语不仅包含完整的抗体，也包含其片段，其突变体，融合蛋白，人源化抗体，和含有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。
“免疫识别”或“免疫反应性”指的是通过免疫球蛋白或相关分子上的至少一个抗原识别位点，如B细胞受体或T细胞受体与靶特异性地结合。
术语“抗原”指的是抗体通过其抗原识别位点特异性结合的靶分子。抗原可以但不必需在化学上与刺激抗体生成的免疫原相关。抗原可以是多价的或单价的半抗原。可被抗体识别的多种抗原的例子包括多肽，多核苷酸，其它抗体分子，寡糖，复合脂，药物和化合物。
“免疫原”是当注射到适当宿主，通常为哺乳动物体内时能够刺激抗体生成的抗原。通过本技术领域中已知的各种技术可使化合物变成免疫原性的化合物，所述技术包括与载体交联或缀合以增加价位，与促细胞分裂原混合以增强免疫应答，和与佐剂联合以增强呈递作用。
“疫苗”是供人或动物使用的药物制品，施用疫苗的目的是赋予受体抗特殊靶或靶组一定程度的特异性免疫反应性。免疫反应性可以是对靶具有免疫反应性的抗体或细胞(尤其是B细胞，浆细胞，T辅助细胞和细胞毒T淋巴细胞和它们的前体)，或它们的任何组合。可能的靶包括外来的或病理性的化合物，如外源蛋白质，病原性病毒或由癌细胞表达的抗原。免疫反应性对于实验目的，治疗特殊疾病，消除特殊物质或预防特殊疾病或物质是合乎需要的。
“被动疫苗”是不需要受体免疫应答参与以产生其效果的疫苗。通常它由对靶反应的抗体分子组成。抗体可得自供体受试者，并被充分纯化以施用给受体，或者它们也可在体外产生，例如来自杂交瘤细胞培养物，或者通过经基因工程改造的编码抗体分子的多核苷酸产生。
“主动疫苗”是经施用意欲在受体体内产生特异性免疫应答的疫苗，所述免疫应答则具有合乎需要的针对靶的免疫反应性。主动疫苗含有适当的免疫原。合乎需要的免疫应答可以是体液的或细胞的，全身性的或分泌性的，或它们的任何组合。
“试剂”多核苷酸，多肽或抗体是为反应提供的物质，此物质具有一些已知的和合乎反应需要的参数。反应混合物中也可含有试剂能与之反应的“靶”，如多核苷酸，抗体或多肽。例如在一些类型的诊断试验中，通过加入试剂，使试剂和靶反应，并测量反应产物的量可测定样品中靶的量。在临床处理的上下文中，“靶”也可以是被施用物质，如药物化合物之目标的细胞、细胞集合、组织或器官。
“分离的”多核苷酸，多肽，蛋白质，抗体，或其它物质指的是该物质制品缺乏至少一些该物质或类似物质天然存在或最初取得时也可存在的其它成分。因此例如可通过使用纯化技术从来源混合物中富集以制备分离的物质。可在绝对的基础(如每体积溶液的重量)之上测量富集，或者相对于来源混合物中存在的潜在干扰的第二物质来测量富集。本发明实施方案中富集的增加更为优选。因此，例如优选2-倍富集，更优选10-倍富集，更优选100-倍富集，甚至更优选1000-倍富集。通过人工装配的方法，如通过化学合成或重组表达也可以分离的状态提供物质。
反应中使用的多核苷酸，如杂交反应中使用的探针，PCR中使用的引物，或药物制品中存在的多核苷酸为“特异性的”或“选择性的”的条件是，相对于它与可替换的物质杂交或反应而言，它与想要的靶的杂交或反应更加频繁，更加快速，或者持续的时间更长。类似地，多肽为“特异性的”或“选择性的”的条件是：相对于它与可替换的物质的结合而言，它与想要的靶，如配体，半抗原，底物，抗体或其它多肽的结合更加频繁，更加快速，或持续的时间更长。抗体为“特异性的”或“选择性的”的条件是：相对于它与可替换的物质的结合而言，它通过至少一个抗原识别位点与想要的靶的结合更加频繁，更加快速，或持续的时间更长。多核苷酸，多肽或抗体被说成“选择性地抑制”或“选择性地干扰”反应的条件是：相对于它抑制或干扰可替换的底物之间的反应而言，它抑制或干扰特殊底物之间的反应的程度更高或持续时间更长。
“候选药物”或“候选药剂”是据信具有治疗潜力的化合物，其效力有待检测。候选药物的“筛选”指的是进行能够评价候选药物的效力和/或特异性的试验。在这一上下文中，“效力”指的是候选药物以有利的方式影响细胞或它所施用的生物体的能力：例如，限制因侵入病毒导致的病理学。
药物制品的“效应物成分”是当施用给提供细胞的受试者时，通过以合乎需要的方式改变靶细胞的功能以修饰靶细胞的成分。一些先进的药物制品也具有“靶向成分”，如抗体，它可协助将效应物成分更有效地传递到靶位点。依据所需要的作用，效应物成分可具有多种作用模式中的任何一种。例如，它可以恢复或增强细胞的正常功能，它可消除或抑制细胞不正常的功能，或者它可改变细胞的表型。或者它可使具有病理学特征的细胞，如被病毒感染的细胞被杀死或变成休眠状态。以后的章节中会提供效应物成分的例子。
“细胞系”或“细胞培养物”表示在体外生长或维持的较高级的真核生物的细胞。应理解细胞的后代与母细胞不完全相同(无论是形态学，基因型还是表型)。
“宿主细胞”是通过施用外源多核苷酸已经被转化，或者能够被转化的细胞。“宿主细胞”包括原始转化子的后代。
“遗传改变”指的是不通过自然的细胞分裂而使遗传因子导入细胞的过程。所述遗传因子对于细胞而言可以是异源的，它也可以是细胞中已存在的遗传因子的多余的拷贝或改良的形式。通过例如本领域中已知的任何方法用重组质粒或其它多核苷酸转染细胞，所述方法如电穿孔，磷酸钙沉淀，与多核苷酸-脂质体复合物接触，或者通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染能够实现遗传改变。这种改变优选、但并不必需由经改变细胞的后代遗传下去。
“个体”指的是脊椎动物，特别是哺乳动物种的成员，它包括但不限于家养动物，野生动物和包括人的灵长类动物。
本文所用的术语“灵长类动物”指的是哺乳动物中进化地位最高的任何成员。它们包括(但不限于)原猴类，如狐猴和懒猴；跗猴类，如跗猴；新世界猴，如松鼠猴(Saimiri sciureus)和；旧世界猴，如猕猴(包括豚尾猴，食蟹猴，和日本猴)；长臂猿类，如长臂猿和合趾猴；猩猩类，如马来猩猩，大猩猩，和黑猩猩；和包括人的人科动物。
由疱疹病毒感染引起的“病理学”是损害宿主健康或正常生理学的一切事情。它可包括(但不限于)病毒破坏性地侵入先前未被感染的细胞，病毒在损害细胞正常代谢的情况下复制，病毒产生毒素或其它非天然的分子，细胞或细胞间结构的不规则生长(包括纤维变性)，被感染细胞的不寻常或受抑制的生物活性，恶性转化，干扰邻近细胞的正常功能，炎症或免疫反应的加重或抑制，对其它病原生物体和疾病的易感性增加。
对个体或细胞的“治疗”是试图改变个体或细胞的自然进程的任何形式的介入。例如，进行对个体的治疗可以降低或限制由感染个体的疱疹病毒引起的病理学。治疗包括(但不限于)施用如药物组合物的组合物，可以在病理事件开始或与病原因子接触之后预防性地，也可以治疗性地进行。
应理解临床或生物“样品”包含得自受试者并可用于体外步骤，如诊断试验的各种样品类型。此定义包含以外科手术切除的方式得到的固体组织样品，病理学样本，或活体解剖样本，从中得到的组织培养物或细胞及其后代，从这些来源中的任一个制备的切片或涂片。非限制性的例子是得自被感染的部位，纤维化的部位，未受影响的部位和肿瘤的样品。此定义也包含血液，脊髓液和生物来源的其它液体样品，也可以指其中悬浮的细胞或细胞片段，或指液体介质及其溶质。此定义也包括已经被溶解或已经富集了某些成分，如DNA，RNA，蛋白质或抗体的样品。
本文所述的寡核苷酸引物和探针已经按下述被命名：名称的第一部分是它们所根据的DNA聚合酶保守区部分的单个氨基酸密码子，通常为4个残基长。紧随其后的是字母A或B，分别表示寡核苷酸与DNA聚合酶编码区的有义或反义链互补。用于测序的次级共有寡核苷酸在名称末端具有字母SQ。一般技术
除非另有说明，本发明的操作将使用本技术领域中熟知的分子生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的常规技术。这类技术在文献中有全面的解释，例见“Molecular Cloning：A laboratory  Manual”，第二版(Sambrook. Fritsch&Maniatis，1989)，“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait，编，1984)，“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，编，1987)；系列“Methods in Enzymology”(AcademicPress，Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”(D.MWeir & C.C.Blackwell，编)，“Gene Transfer Vectors forMammalian Cells”(J.M.Miller & M.P.Calos，编，1987)，“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等，编，1987)；和“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等，编，1991)。
上文和下文提到的所有专利，专利申请，文章和出版物都已列入本文参考文献。编码疱疹病毒RFHV/KSHV亚族DNA聚合酶的多核苷酸
本发明包括衍生自疱疹病毒中存在的DNA聚合酶基因和分离的多核苷酸区段，优选编码能进行DNA聚合酶反应之多肽片段的多核苷酸区段。所提供的多核苷酸来自疱疹病毒RFHV/KSHV亚族。优选的多核苷酸是那些编码RFHV或KSHV之DNA聚合酶片段的多核苷酸。优选的片段是按下文实施例所述已经由DNA聚合酶基因扩增并分离的那些片段。片段的例子示于图1，并分别被称作SEQ.ID NO：1和SEQ.ID NO：3，特别优选的多核苷酸含有RFHV序列残基27和501之间的序列(SEQ.ID NO：1)和KSHV序列残基27和329之间的序列(SEQ.ID NO：3)。
RFHV和KSHV的残基27和501之间的多核苷酸区段(图1中下划线的475个碱基对的片段)71％相同，共用残基在图1中由“*”表示，此区段内RFHV和KSHV之间共用的连串碱基的最大数目为17。
相对于它们中的任一个与以前已经测序的表1中的任何疱疹病毒的相应区段相比，RFHV和KSHV 475个碱基对的片段相互之间更加一致。下一个最密切相关的序列是eHV2病毒的DNA聚合酶，它的此区域与RFHV或KSHV的相应区域约68％相同。此区域内含有第一个20个碱基对的亚片段(SEQ.ID NO：110)和eHV2与RFHV共同享有的第二个20个碱基对的亚片段(SEQ.ID NO：111)。RFHV或KSHV与得自能感染灵长类动物的疱疹病毒，包括sHV1和EBV的其它已知DNA聚合酶序列相比，475个碱基对区域的同一性低于约65％。在RFHV或KSHV与sHV1之间共同享有的最长亚片段长约14个碱基。在RFHV或KSHV与EBV之间共同享用的最长亚片段长约15个碱基。据此推测疱疹病毒之间DNA聚合酶编码区的多核苷酸序列比与其它多核苷酸之间似乎更保守。因此，除了与eHV2共用的两个亚片段外，据信RFHV或KSHV序列18个碱基对或更长的任何亚片段对于RFHV/KSHV亚族而言，或者对于此亚族内特定的疱疹病毒种和变体而言是独特的。
本发明包括RFHV/KSHV亚族的DNA聚合酶基因中所含的亚片段，优选包括对应于如图1所示残基27-501之间的475个碱基对片段的区域中所含的亚片段。优选亚片段至少约16个残基长；更优选它们至少长为18个残基；更优选它们至少长为20个核苷酸；更优选它们至少长约为25个核苷酸；更优选它们至少长约35个核苷酸；再更优选它们至少长约50个核苷酸；更加优选它们至少长约75个核苷酸，甚至更优选它们为100个核苷酸长或更长。本发明中还包括含有每种独自的疱疹病毒DNA聚合酶的整个开放阅读框的多核苷酸。
为了预测被编码的肽片段在DNA聚合酶的生物功能中所起的作用，可与其它DNA聚合酶进行比较。多种疱疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列的保守区域示于图2。被标记为ExoI，ExoII，和ExoIII的区域已显示出为金属配体在3′-5′外切核酸酶活性位点处的重要结合位点(Derbyshire等，Bernard等，(1989)，Simon等，Soengas等)。被称作REGION 1的区域已显示出对聚合活性和既作为药物结合位点又作为聚合底物(脱氧核糖核苷酸三磷酸)结合位点之功能的重要性(Dorsky等，(1988，1990)，Bernard等，(1990))。单纯疱疹病毒(HSV)1型DNA聚合酶的此区域中氨基酸G突变成A会抑制被病毒感染的细胞中聚合酶的活性。将F突变成C，Y或M会对如核苷和焦磷酸盐类似物，和蚜肠霉素的药物产生不同的敏感性。HSV1 DNA聚合酶的REGION 2和REGION 3似乎涉及药物和底物的识别(Gibbs等，(1988a，1988b)，Basco等，(1993))。REGION 3涉及与DNA模板的结合(Basco等，(1992))。REGION 7可能对聚合活性较重要(Basco等，(1993))。在一些疱疹病毒，如HSV 1中，c-末端附近的氨基酸涉及与已知为UL42的调节性亚单位结合，所述亚单位在疱疹病毒基因组的别处编码，对于与病毒复制相关的DNA聚合酶活性而言是必需的(Dignard等，Stow)。
图1所示的RFHV和KSHV多核苷酸是编码DNA聚合酶重要功能部分的多核苷酸的邻近区域。具体地说，寡核苷酸DFASA，VYGA和GDTD1B分别对应于REGION 2，REGION 3和REGION 1。得自KSHVDFASA和GDTD1B之间的片段包含完整的REGION 4和REGION 3序列，并与REGION 2和REGION 1序列重叠。
相对于RFHV或KSHV与表1所列的任何其它病毒的比较而言，组成RFHV/KSHV亚族的成员所具有的序列与RFHV或KSHV的相应序列更加一致。根据图1相应区域中DNA聚合酶基因的序列可鉴定出此家族中优选的成员。表2提供了此区域内序列同一性的程度：
                              表2：选定疱疹病毒和RFHV和KSHV的DNA聚合酶之间序列的同一性
  病毒DNA聚合酶序列    SEQ .ID NO：           与RFHV片段的同一性(SEQ.ID NO：1)          与KSHV片段的同一性(SEQ.ID NO：3)
   碱基27-501    碱基27-329    碱基330-501    碱基27-501    碱基29-329    碱基320-501
  RFHVKSHV    13  (100％)71％  (100％)72％  (100％)70％    71％(100％)    72％(100％)    70％(100％)
  eHV2sHV1EBVhCMVhHV6hVZVhHSV1    23242526272829    68％59％64％53％46％45％53％    68％60％66％54％52％46％58％    67％59％58％＜50％＜50％＜50％＜50％    68％62％62％49％48％48％53％    71％65％62％49％50％47％53％    63％58％57％＜50％＜50％＜50％＜50％
通过首先排列被编码的氨基酸序列，进行编码多核苷酸的相应对比，然后计算所比较的序列之间每个排列位置处共用的残基数目即可计算出序列同一性的百分比。插入或缺失的存在不会产生不利的后果，但是只有在被排列的序列之一中需要容纳数目明显增加的氨基酸残基的地方才允许插入或缺失。无论在多肽水平上还是在多核苷酸水平上都不允许仅为了改善序列排列的补偿性插入。因此，多核苷酸序列中的任何插入的长度均为3的倍数。给出了受试序列中与比较或参照序列中的残基相同的残基的百分比。
已经计算出表2病毒之间如图1所示编号的RFHV和KSHV序列之区段的同一性水平。
本发明优选的编码DNA聚合酶的多核苷酸序列是那些衍生自RFHV/KSHV疱疹病毒亚族的序列。它们包括那些与图1所示的RFHV或KSHV序列的碱基27和501之间至少69％相同的序列；更优选序列至少70％相同；更优选序列至少约72％相同；更优选序列至少约75％相同；更优选序列至少约80％相同；更优选序列至少约85％相同；更优选序列至少约90％相同；甚至更优选序列95％以上相同。也优选与RFHV序列的碱基27和329之间至少69％相同的序列；更优选它们70％相同；更优选它们至少72％相同；更优选它们至少75％相同；更优选它们至少80％相同；更优选序列至少90％相同；甚至更优选序列至少95％相同。也优选与KSHV序列的碱基27和329之间至少72％相同的序列；更优选它们至少75％相同；更优选它们至少80％相同；更优选它们至少90％相同；甚至更优选它们95％相同或更高程度地相同。
下一章节将更详细地描述，通过与RFHV/KSHV亚族特异性的寡核苷酸相比之下的同一性百分比可鉴定出其它优选的编码DNA聚合酶的多核苷酸序列。RFHV和KSHV DNA聚合酶与寡核苷酸实例之间的同一性百分比示于表3：
                  表3：选定疱疹病毒的DNA聚合酶和RFHV/KSHV亚族特异性的寡核苷酸之间的序列同一性
 病毒DNA聚合酶序列   SEQID NO：   与LSGGA的同一性(SEQ. IDNO：107)   与CTDPA的同一性(SEQ.IDNO：108)   与PCLNA的同一性(SEQ.IDNO：21)    与KMLEA的同一性(SEQ.IDNO：22)  与GISPA的同一性(SEQ.IDNO：109)
 RFHV           1KSHV           3    92％96％    86％86％    93％93％     94％88％   100％90％
 eHV2           23sHV1           24EBV            25hCMV           26hHV6           27hVZV           28hHSV1          29    77％65％65％＜50％＜50％54％50％    55％62％66％＜50％＜50％＜50％＜50％    93％76％73％54％＜50％＜50％50％     72％78％78％53％47％＜50％58％    66％66％66％48％38％38％52％
对于如图6所示排列的病毒序列的相应残基，计算出如表3所示的同一性百分比。
优选的DNA聚合酶序列是那些所覆盖的相应区域与LSGGA至少约80％相同的序列；更优选它们至少约83％相同；更优选它们至少约86％相同；更优选它们至少约90％相同；甚至更优选它们至少95％相同。其它优选的DNA聚合酶序列是那些所覆盖的相应区域与CTDPA至少约69％相同的序列；更优选它们至少约72％相同；更优选它们至少约75％相同；更优选它们至少约80％相同；更优选它们至少约85％相同；甚至更优选它们至少约95％相同。其它优选的DNA聚合酶序列是那些所覆盖的相应区域与PCLNA至少约95％相同的序列。其它优选的DNA聚合酶序列是那些所覆盖的相应区域与KMLEA至少约80％相同的序列；更优选它们至少约83％相同；更优选它们至少约86％相同；更优选它们至少约90％相同；甚至更优选它们至少95％或95％以上相同。其它优选的DNA聚合酶序列是那些所覆盖的相应区域与GISPA至少约69％相同的序列；更优选它们至少约72％相同；更优选它们至少约75％相同；更优选它们至少约80％相同；更优选它们至少约85％相同，甚至更优选它们至少约95％相同。
通过使用RFHV或KSHV序列，或者亚族特异性寡核苷酸的前述序列比较中的任一种鉴定出的RFHV/KSHV亚族成员的DNA聚合酶编码序列同样是优选的。特别优选RFHV和KSHV的DNA聚合酶编码序列。本发明中还包括亚族的DNA聚合酶编码序列的片段，和含有这种多核苷酸片段的较长的多核苷酸。
本章节描述的多核苷酸序列提供了得到以后章节中概述的合成的寡核苷酸，蛋白质和抗体的基础。使用本领域普通技术人员已知的一般性技术可制备这些化合物，如下文所述，所述化合物可用于各种研究，诊断和治疗目的。多核苷酸的制备
可通过本领域中已知的任何适当的方法制备本发明的多核苷酸和寡核苷酸。例如，如下文实施例3和实施例5所述，在PCR扩增得自被疱疹病毒感染之组织的DNA时，可以使用寡核苷酸引物。或者如下文实施例10所述，可以使用寡核苷酸鉴定DNA文库中适当的细菌克隆。
也可以通过化学合成由本文提供的序列出发直接制备多核苷酸。本领域中已知几种合成方法，包括三酯法和亚磷酸酯法。在优选的方法中，通过使用单核苷氨基亚磷酸酯偶联单位的固相合成法制备多核苷酸，例见Horise等，Beaucage等，Kumar等，和U.S.专利号4,415,732。
典型的固相合成包括重复进行的四个步骤：脱保护，偶联，加帽和氧化。这可以导致在3′至5′方向上逐步合成寡核苷酸。
在第一步中，其3′末端通过(-O-)基团与固相支持物结合的逐渐增长的寡核苷酸在其5′末端脱保护。例如，通过-ODMT基团可以保护5′末端，所述-ODMT基团是通过与吡啶中的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)反应而形成的。此基团在碱性条件下是稳定的，但是在酸性条件下容易被除去，例如在二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)的存在下易被除去。脱保护提供了5′-OH反应基团。
在第二步中，寡核苷酸与所需的核苷酸单体反应，所述单体自身已先转变成5′-保护的3′-氨基亚磷酸酯。单体的5′-OH可以例如-ODMT基团的形式被保护，3′-OH基团可以转变成氨基亚磷酸酯，例如-OP(OR′)NR2；其中R是异丙基-CH(CH3)2；R′是例如-H(产生氨基亚磷酸酯二酯)，或-CH3，-CH2CH3，或β-氰乙基-CH2CH2CN(产生氨基亚磷酸酯三酯)。单体的3′-氨基亚磷酸酯基团与逐渐增长的寡核苷酸的5′-OH基团反应可产生亚磷酸酯连键5′-OP(OR′)O-3′。
在第三步中，未与单体偶联的寡核苷酸退出进一步合成以防止不完全聚合物的形成。通过与乙酸酐(CH3C(O)-O-C(O)CH3)反应，以乙酸酯(-OC(O)CH3)的形式给保持原状的5′-OH基团加帽可以做到这一点。
在第四步中，新形成的亚磷酸酯基团(即5′-OP(OR′)O-3′)被氧化成磷酸酯基团(即5′-OP(＝O)(OR′)O-3′)；例如可通过与含水的碘和吡啶反应做到这一点。
由于在所述方法最后得到的寡核苷酸的5′端得到保护，并可用于第一步中，因此可重复进行四步法。当已得到合乎要求的全长寡核苷酸时，可通过例如碱和热处理从固相支持物上将它裂解下来。此步骤也可用于将磷酸三酯(即当R′不是-H时)转变成磷酸二酯(-OP(＝O)2O-)，并使核苷酸碱基的碱基-不稳定地被保护的氨基基团脱保护。
可以通过任何一般性技术，如PCR扩增或基因克隆来复制通过这些方法中的任一种而制备的多核苷酸，以提供较丰富的多核苷酸来源。含有编码DNA聚合酶之多核苷酸的克隆和表达载体
本发明中提供的克隆载体和表达载体含有编码疱疹病毒DNA聚合酶的序列或其变异体或其片段。可根据标准技术构建适当的克隆载体，或者也可从本领域中适用的大量克隆载体中选择。尽管根据欲被使用的宿主细胞而选择的克隆载体会有所不同，但有用的克隆载体一般应具有自我复制的能力，对于特定的限制性核酸内切酶具有单个作用位点，并携有能用于选择被转染之克隆的标记物的基因。适当的例子包括质粒和细菌的病毒；如pUC 18，mp 18，mp 19，pBR 322，pMB 9，ColE1，pCR 1，RP 4，噬菌体DNA和如pSA 3和pAT 28的穿梭载体。
表达载体通常为与适当的转录和翻译调控元件有效连接的编码多肽的可复制多核苷酸构建体。转录调控元件的例子是启动子，增强子，转录起始位点和转录终止位点。翻译调控元件的例子是核糖体结合位点，翻译起始位点和终止密码子。也可包括蛋白质加工元件：例如编码前导或信号肽以及将多肽跨膜转运或从细胞中分泌出来所需的蛋白酶裂解位点的区域。所用元件在用于表达的宿主细胞中可能是功能性的。调控元件可以得自与载体中所用的相同的DNA聚合酶基因，或者它们也可以是异源的(即衍生自其它基因和/或其它生物体)。
可以通过本领域中任何已知方法将多核苷酸插入宿主细胞。适当的宿主细胞包括如大肠杆菌，分枝杆菌的细菌细胞，其它原核微生物和真核细胞(包括真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞)。通过直接摄入，胞吞作用，转染，f-交配或电穿孔插入外源多核苷酸可以转化细胞。随后，外源多核苷酸在细胞内以未-整合的载体，如质粒的形式被维持，或者也可以被整合到宿主细胞基因组中。
克隆载体可被用于得到它们所含的多核苷酸的复制拷贝，或者作为将多核苷酸贮存到仓库中以供将来回收的工具。表达载体和宿主细胞可被用于得到由它们所含的多核苷酸转录的多肽。它们也可以用于如药物筛选试验的试验中，其中具有能合成多肽的完整细胞才合乎需要。疱疹病毒DNA聚合酶的用作杂交探针和扩增引物的合成寡核苷酸
本发明中包括的由疱疹病毒DNA聚合酶序列设计的寡核苷酸可被用作鉴定相关序列的探针，或者在如PCR的扩增反应中用作引物。
在以下章节中描述了具有不同特性的不同寡核苷酸。被称作Type 1的寡核苷酸被设计成能与编码任何疱疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸杂交，并可用于检测先前已知的疱疹病毒种。它们也可用于检测和鉴定疱疹病毒新种。被称作Type 2的寡核苷酸被设计成能与RFHV/KSHV亚族(包括仍未被鉴定的成员)的编码DNA聚合酶的多核苷酸杂交，但不能与其它疱疹病毒的多核苷酸杂交的被称作Type 3的寡核苷酸被设计成只能与RFHV或KSHV的编码DNA聚合酶的多核苷酸特异性杂交。
优选的Type 1寡核苷酸的例子列于表4，这些寡核苷酸对于广范围疱疹病毒的编码DNA聚合酶的多核苷酸具有特异性。
                               表4：用于检测、扩增或鉴定疱疹病毒编码DNA聚合酶的多核苷酸的Type/寡核苷酸
    名称  序列(5′至3′)   长度   类型数目       靶：   方向   SEQID：
    DFASADFQSA  GTGTTCGACTTYGCNAGYYTNTAYCCGTGTTCGACTTYCARAGYYTNTAYCC   2626   256128    疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶尤其是β亚族  5′→3′5′→3′    56
    VYGAVYGCAVYGSQA  ACGTGCAACGCGGTGTAYGGNKTNACNGGACGTGCAACGCGGTGTACGGSGTSACSGGACGTGCAACGCGGTGTA   292917   25681    疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶(富含GC)疱疹病毒DNA聚合酶  5′→3′5′→3′5′→3′    789
    GDTD1BGDTDSQB  CGGCATGCGACAAACACGGAGTCNGTRTCNCCRTACGGCATGCGACAAACACGGA   3520    641    疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶  3′→5′3′→5′    1112
所示方向与多核苷酸的编码区相关。5′→3′方向的寡聚体与编码链的反义链杂交并以编码序列的方向起动扩增。3′→5′方向的寡聚体与编码链杂交并以与编码序列相反的方向起动扩增。
这些寡核苷酸已被设计成具有几个希望有的特性：1)即使当来源材料中存在的靶DNA拷贝数很低时，对靶DNA仍有特异性；2)有足够的特异性以避免与不需要的序列，如宿主中存在的内源DNA聚合酶序列杂交；3)有足够的交叉反应性以使未知靶和用于设计它的序列之间的差异不会阻止寡核苷酸与靶形成稳定的双螺旋。
对于一些应用而言，特别有效的设计是在3′末端具有简并区段的寡核苷酸，所述寡核苷酸是从至少2个据信在某种程度上与多核苷酸靶有保守部分的已知多核苷酸的区域设计成的。多义残基的各种变换有助于确保寡核苷酸的至少一个可替换的形式能与靶杂交。在寡核苷酸的5′末端与简并区段邻接的是加强任何可能形成的双螺旋或允许在较高温度下进行杂交或扩增反应的共有区段。简并区段位于分子的3′末端以增加寡核苷酸和靶之间在聚合酶链反应过程中延伸开始的位点处紧密匹配的可能性。
根据下列密码子表示序列简并部分中的多义残基：
                   表5：多义位置的单字母密码子
    密码子        代表物
      RYWSMKBDHVN      A或G(嘌呤)C或T(嘧啶)A或TC或GA或CG或TC或G或T(非A)A或G或T(非C)A或C或T(非G)A或C或G(非T)A或C或G或T
表4所示的Type 1寡核苷酸通常用于与编码DNA聚合酶的多核苷酸区段杂交。可以进行这种杂交以检测多核苷酸的存在，或者引发扩增反应以使多核苷酸可以被进一步鉴定。适当的靶包括编码广谱疱疹病毒DNA聚合酶区域的多核苷酸，所述病毒包括那些α，β和γ疱疹病毒中的成员，那些感染任何脊椎动物，包括人和非人灵长类动物的病毒，不论聚合酶或病毒是否已知或已经被描述。非限制性的例子包括编码表1所列任何疱疹病毒的DNA聚合酶的多核苷酸。我们已经使用这些寡核苷酸得到了一组包括α，β和γ亚族的代表RFHV，KSHV，EBV，HSV1，HHV6和HHV7之DNA聚合酶的区段。
寡核苷酸可以特别地用于引发从寡核苷酸杂交的位点起向3′方向扩增靶多核苷酸区域的反应。DFASA，DFQSA，VYGA，VYGCA和GDTD1B是在邻近简并区段处具有共有区段的寡核苷酸，可以用于那种目的，并且当靶DNA序列未知时也可以使用。寡核苷酸DFASA和DFQSA之间的取舍取决于靶多核苷酸的序列。DFQSA在促进HHV6-样序列的扩增方面某种程度上优于其它序列；DFASA既可以促进HHV6样序列的扩增，也可以促进非-HHV6-样序列的扩增。VYGA具有宽的交叉反应性，作为使用通过另一引物，如DFASA首次扩增的多核苷酸进行的第二次扩增反应的引物特别有用。VYGCA是VYGA富含GC的类似物，它产生较少的多重扩增混合物，并允许在较高温度下进行杂交反应。VYGSQA和GDTDSQB是特异性的非简并寡核苷酸，它们可特别地用于测序分别由VYGA或GDTD1B制得的扩增产物；或者用于在用简并引物初步扩增之后更特异性地扩增靶多核苷酸。
用作表4寡核苷酸的靶的优选DNA来源是任何生物样品(包括固形组织和组织培养物)，特别是已知或怀疑携带疱疹病毒的脊椎动物来源的样品。通过本领域中已知的任何方法，包括用有机溶剂提取或在高盐浓度下沉淀可从样品来源中提取DNA。
优选的扩增方法是聚合酶链反应：一般可参见美国专利号4,683,195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)；对于病毒多核苷酸的应用参见美国专利5,176,995(Sninsky等人)。通过将欲被扩增的靶多核苷酸与能同靶杂交的短寡核苷酸结合，并用作聚合反应的引物即可进行扩增反应。还需加入底物单核苷酸和热稳定性的依赖于DNA的DNA聚合酶，如Taq。用于扩增反应的条件一般为本领域中已知的条件，使用已知病毒源，如RFHV，KSHV，EBV或HSV1凭经验可使条件最优化。条件也可以改变，例如可改变扩增循环，尤其是杂交时相的时间和温度；改变寡核苷酸引物的重量摩尔浓度；改变缓冲液浓度；改变扩增循环的数目。细微调节扩增的条件对于本领域技术人员而言是常规技术。
在一个方法中，扩增中使用了本发明的单个引物，可选择使用第二个引物，如随机引物以起动相反方向上的第一引物下游的复制。在优选的方法中，相同反应中至少使用了两个本发明的引物以起动相反方向上的复制。至少两个特异性引物的使用增强了扩增反应的特异性，并限定了样品之间比较片段的大小。例如，使用引物DFASA和GDTD1B可以进行扩增。更优选以嵌套方式使用所有三个引物以增强扩增。通过使用包含中间体片段的引物进行首次扩增可实现嵌套，所述片段含有第三引物的结合位点。接着使用第三引物进行第二次扩增，从而提供最终的片段，此片段是中间体片段的亚片段。特别优选使用引物DFASA和引物GDTD1B首次扩增，再使用引物VYGA和引物GDTD1B第二次扩增。当对RFHV或KSHV DNA聚合酶基因的多核苷酸进行扩增时，片段的大小约为236个碱基。
在扩增反应的任何阶段，通过例如大小测定即可鉴定出经扩增的多核苷酸。优选通过在约1-2％的琼脂糖凝胶上电泳多核苷酸来进行鉴定。如果凝胶中的多核苷酸以充足的量存在，即可用溴化乙锭染色并在紫外灯下检测。或者也可以在上样到约6％的聚丙烯酰胺凝胶之前，用如32P或35S的放射性同位素标记多核苷酸，随后可利用凝胶产生放射自显影图。优选的标记经扩增之多核苷酸的方法是使用多核苷酸激酶和γ-[32P]-ATP，连续扩增约5-15个循环以用32P末端标记如VYGA或VYGSQA的寡核苷酸引物。
如果需要，在制备经扩增的多核苷酸时也可将大小分离用作一个步骤。当发现扩增混合物含有不同大小的假象多核苷酸，如可能是由于与不需要的靶的交叉反应性而引起这一现象时，所述方法特别有用。如上一段落中描述的凝胶被放在其背后的纸上晾干并用于产生放射自显影图。切下凝胶中对应于放射自显影图上所需带的位置，并通过标准技术提取。提取出的多核苷酸能被直接鉴定，克隆或用于下一个扩增循环。
通过采用更特异的寡核苷酸引物也可以降低扩增反应混合物中不需要的多核苷酸的比例。例如，使用1/5至1/25正常量的引物VYGA和GDTD1B进行最初的3-5个循环扩增，然后加入摩尔过量(例如50pmol)的GDTDSQB和/或VYGSQA，再继续扩增30-35个循环。这可以降低扩增混合物中存在的寡核苷酸的复杂度，并使反应温度增高以减少不需要的多核苷酸的扩增。
优选的Type 2寡核苷酸的例子列于表6：
                      表6：编码RFHV/KSHV亚族病毒DNA聚合酶的多核苷酸特异的Type 2寡核苷酸
    名称    序列(5′至3′)   长度  类型数目     靶：   方向  SEQID：
    LSGGACTDPAPCLNAKMLEAGISPA TACGAAACCTTTGACCTNAGYGGNGGCGCAAGAACCTGGCCTCNTGYACNGAYCCGTCGCCTCTGGCATCCTNCCNTGYCTNAACAGGGCCGGAAGATGCTGGARACRTCNCARGCTCTCAGGCGTTCGTAGARGGNATHTCNCC   2629293229   32641283296  RFHV/KSHV亚族的DNA聚合酶  5′→3′5′→3′5′→3′5′→3′5′→3′  1071082122109
LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA是在5′末端具有共有区段的所有寡核苷酸，所述区段与3′末端的简并区段直接相连。所述寡核苷酸能与编码RFHV，KSHV或RFHV/KSHV亚族中其它病毒之DNA聚合酶的多核苷酸形成稳定的双螺旋。它们可被用于需要这种特异性的任何目的，如检测或扩增RFHV/KSHV亚族的多核苷酸。
在一个应用中，可单个使用或者组合使用这些Type 2寡核苷酸作为扩增引物。在此应用的一个实施例中，对得自组织样品中的DNA直接使用寡核苷酸以得到衍生自RFHV，KSHV或密切相关之病毒，而不是如EBV，CMV或HSV的更不相关之病毒的DNA聚合酶区段。在另一个实施例中，用特异性较差的一套探针，如DFASA或VYGA联合GDTD1B首次扩增组织样品中的DNA，然后在第二轮扩增中使用表6寡核苷酸中的一个，从而提供RFHV，KSHV和RFHV/KSHV亚族的其它成员特异的敏感的嵌套扩增试验。
在另一个应用中，Type 2寡核苷酸，或含有这些序列的寡核苷酸或其片段被用作检测试验中的探针。例如，它们可被提供成具有适当的标记物，如32P，然后用于具有适当靶，如使用DFASA和/或VYGA与GDTD1B一起扩增的DNA的杂交试验中。
优选的Type 3寡核苷酸的例子示于表7：
                          表7：编码RFHV或KSHV DNA聚合酶的多核苷酸特异的Type 3寡核苷酸
 名称 序列(5′至3′)    长度   类型数目     靶：    万向   SEQID：
 VASGAILPCAPIEABPEAPB CGTCGCTTCCGGCATCCTACCGGCATCCTACCGTGCCTGAACCCGGAGACGCCTCGATCGGTCAACCTGGCTTCCGGAGACGCC    21212121    1111  RFHV DNA聚合酶  5′→3′5′→3′3′→5′3′→5′   13141516
 SGILACLNIAIEASBEARFB GCGTTGCCTCTGGCATACTGCTGCCTTGCCTAAACATAGCGGGTGAGACGTCTATTGGCCTAATCGGGCGTCGGGTGAGACG    20212021    1111  KSHV DNA聚合酶  5′→3′5′→3′3′→5′3′→5′   17181920
这些是非简并的寡核苷酸，它们被设计成特异性针对编码特殊疱疹病毒，即RFHV或KSHV之DNA聚合酶的多核苷酸。选定的特殊序列来自编码区域的区段，与相邻区段相比，它与其它病毒的编码区域的区段更不相同。
VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是RFHV DNA聚合酶的特异性非简并寡核苷酸，可被用于在高严紧条件下进行的杂交反应。例如，它们可以单独或联合用作引物以扩增编码RFHV DNA聚合酶的靶多核苷酸。优选使用嵌套形式的寡核苷酸进行扩增：例如使用VASGA和PEARB作为引物进行首次扩增；然后使用ILPCA和PIEAB作为引物进行第二次扩增。
类似地，SGILA，CLNIA，IEASB和EARFB是KSHV DNA聚合酶的特异性非简并寡核苷酸，可以类似的方式被使用，包括作为扩增反应的引物。优选使用嵌套形式的寡核苷酸进行扩增：例如使用SGILA和EARFB作为引物进行首次扩增；然后使用CLNIA和IEASB作为引物进行第二次扩增。这可以提供特异针对KSHV DNA聚合酶的极度敏感的扩增试验。
本领域技术人员会很快认识到Type 1，2和3寡核苷酸(尤其是那些表4，6和7中所示的)可以互相联合用于PCR以扩增编码DNA聚合酶之多核苷酸的不同部分。扩增反应的特异性一般由具有最少量交叉反应性的引物决定。扩增片段的大小和位置由扩增的最后一次循环所用的引物决定。例如，LSSGA与GDTD1B联合使用会扩增约361个碱基的编码RFHV/KSHV亚族病毒DNA聚合酶的多核苷酸。类似地，VYGA与PEARB联合使用会扩增约444个碱基的编码RFHV DNA聚合酶的多核苷酸。寡核苷酸的适当联合可被用作嵌套形式的扩增引物。使用合成的寡核苷酸鉴定多核苷酸靶
如前面章节所述，本发明中包含的寡核苷酸可被用作引物以扩增编码疱疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸，尤其在聚合酶链反应中更是如此。
进行PCR的条件取决于所使用寡核苷酸的特性。具体地说，当所用寡核苷酸含有的简并区段或共有区段与靶的相应区段只部分相同时，和当靶多核苷酸含有未知序列时，条件的选择对于扩增的成功会很重要。对于新引物或新多核苷酸靶的条件的最优化是本领域技术人员的常规技术。下文是有助于此目的的指导性方案。
首先，使PCR退火步骤的温度最优化以增加被扩增的靶多核苷酸的量，使之大于被扩增的不相关多核苷酸的量。理想状态下，所述温度允许引物与靶序列杂交，而不与其它序列杂交。对于含有共有区段的引物而言，退火步骤的温度一般至少约为55℃；优选至少约60℃。病毒特异性的引物更有选择性，在较宽的温度范围，50℃至65℃之间都是有效的。
第二，使缓冲液条件最优化。我们已发现由Taq聚合酶的商购制品提供的缓冲液有时难以使用，这部分是由于对镁离子浓度的严格的依赖性。使用如M.Wigler(Lisitsyn et al)推荐的缓冲液一般更容易进行使用本发明的寡核苷酸进行的PCR。优选最终的PCR反应混合物含有(NH4)2SO4代替KCl成为主要的离子源。优选最终反应混合物中(NH4)2SO4的浓度约为5-50mM，更优选约10-30mM，甚至更优选16mM。缓冲成分优选为Tris，优选其终浓度约67mM，pH约8.8。在这些条件下，MgCl2浓度不必严格限制。优选其终浓度约1-10mM，更优选约3-6mM，最佳约为4mM。反应混合物也含有约10mM β-疏基乙醇和0.05-1mg/ml牛血清白蛋白。特别优选的缓冲液是WB4缓冲液(67mM Tris缓冲液，pH 8.8，4mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，10mM β-疏基乙醇和0.1mg/ml白蛋白)。下文实施例3中提供了进行此反应的优选条件。
使用本发明的任何寡核苷酸作为引物的扩增反应产生了编码DNA聚合酶部分的多核苷酸片段。通过本领域技术人员已知的大量技术可以鉴定这些片段。一些鉴定片段的非限制性方法如下所述：
在一个方法中，可根据本领域已知的任何序列测定法测定片段的序列，所述方法包括Maxam & Gilbert法，或者Sanger & Nicholson法。或者也可以将片段提交给任何提供多核苷酸测序服务的商业机构。在测序前可任选将片段克隆和/或扩增。核苷酸序列可被用于预测由此片段编码的氨基酸序列。可使用序列资料或者在多核苷酸水平上或者在氨基酸水平上与其它被测序的DNA聚合酶比较，以鉴定原始来源材料中存在的疱疹病毒种类。在制作模型的算法规则中也可使用序列资料预测抗原区或三维结构。
在第二个鉴定方法中，可通过任何适当的方法测定片段的大小，所述方法如在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上电泳，或通过适当的密度梯度离心。例如，对于RFHV和KSHV而言，VYGA和GDTD1B之间的片段约为172个碱基。因此包括引物结合区域的整个扩增片段的长度约为236个碱基。相应的EBV片段含有额外的9个碱基对。因此，例如通过将由每个片段扩增的多核苷酸片段置于分离凝胶的相邻泳道上电泳，或者通过将EBV片段置于适当的分子量标准旁边电泳即可将EBV片段与RFHV或KSHV的片段区分开来。在大小上与RFHV和KSHV相同的多核苷酸片段可衍生自这些病毒之一的变异株，或密切相关的种。大小基本上不同的片段更可能衍生自不同的疱疹病毒。
在第三个鉴定方法中，通过尝试将片段与寡核苷酸探针杂交来检测片段。在优选的实施例中，检测了片段与RFHV或KSHV的DNA聚合酶编码区的相关性。可使用含有DNA聚合酶编码区序列或其遗传互补物的探针进行试验。适当的探针是含有RFHV或KSHV的序列的多核苷酸，这种多核苷酸的混合物，或含有衍生自RFHV和KSHV的简并序列，如表6所列寡核苷酸的多核苷酸。
探针的长度和特性以及杂交条件的选择取决于试验的目的。如果目的是仅仅检测得自RFHV或KSHV的多核苷酸，包括次要变体，那么在高严紧性的条件下进行杂交。使用了来自各个RFHV或KSHV DNA聚合酶的序列。较长的序列改善了试验的特异性，可以在较高严紧性的条件下使用。优选探针含有至少约30个核苷酸的DNA聚合酶序列；更优选此序列至少约50个核苷酸；甚至更优选此序列至少约75个核苷酸长。
如果目的是检测与RFHV或KSHV相关的多核苷酸，如在筛选试验或征集先前未曾描述过的RFHV/KSHV亚族病毒的试验中，可选择不同的条件。得自RFHV或KSHV的序列可以被使用，但一般优选两个的混合物或简并探针。选择序列的长度和杂交反应的条件以提供足够的特异性，从而排除不需要的序列，但要么提供与潜在靶的最大程度的交叉反应性。使用上文给出的公式，通过计算Tm，再计算能忍受的最大程度错配的相应温度即可预测适当的条件。通过检测探针与含有编码疱疹病毒DNA聚合酶的已知靶多核苷酸样品的交叉反应性，即可凭经验检测出条件的适当性。
在此试验条件下形成稳定双螺旋所需的最小程度的互补性将决定何种DNA聚合酶序列会与探针杂交。考虑到例如扩增得自人或非人灵长类动物的靶产生了对应于图1的碱基330-501的片段，可用RFHV多核苷酸的相应片段来作探针。根据表2中的资料，如果杂交反应在仅需要约50％相同即可形成稳定双螺旋的条件下进行，探针会与得自任何已被测序的γ疱疹病毒(包括EBV和sHV1)DNA聚合酶基因的靶杂交。如果反应在需要探针和靶之间至少约有62％相同，优选至少约65％相同，更优选至少约68％相同，甚至更优选至少约70％相同才能形成稳定双螺旋的条件下进行，此试验将检测来自RFHV，KSHV，或来自仍未被测序的相关疱疹病毒DNA聚合酶的靶多核苷酸。在这些条件下编码EBV或sHV1 DNA聚合酶的多核苷酸无望形成稳定的双螺旋。由于据信eHV2不能感染灵长类动物，因此在被检测的DNA中无望存在编码eHV2 DNA聚合酶的多核苷酸。
可以将通过大小的鉴定与通过杂交的鉴定联合。例如，可在丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上分离被扩增的多核苷酸，将所述多核苷酸印迹到适当材料的膜上，如硝酸纤维素膜上，然后与具有适当标记物，如32P的探针杂交。洗涤后标记物的存在反映了样品中可杂交材料的存在，而与适当分子量标准比较的迁移距离反映了材料的大小。在高严紧度条件下与前述探针之一杂交但具有非预期大小的片段序列表示与探针有高水平的同一性，但与RFHV或KSHV有所不同的DNA聚合酶序列。使用多核苷酸和寡核苷酸检测疱疹病毒感染
本发明中包含的编码疱疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸，和根据此多核苷酸的合成寡核苷酸可用于诊断与疱疹病毒感染相关的临床疾病。例如，临床样品中可检测到疱疹病毒DNA聚合酶的存在可暗示各个疱疹病毒作为病原因子参与了疾病的发展。特殊组织而不是周围组织中聚合酶的存在可用于定位感染的损害。临床样品中γ疱疹病毒和其它疱疹病毒之间的鉴别，或RFHV，KSHV和EBV之间的鉴别可用于预测感染的临床进程或选择适于治疗的药物。
另外，由于DNA聚合酶可活跃地参与疱疹病毒的复制，因此对于某些应用而言，DNA聚合酶比其它标记物更优选。DNA聚合酶在水痘-带状疱疹病毒的潜伏期不表达，但在其复制期表达(Meier等人)。因此，DNA聚合酶的测定有助于测定被γ疱疹病毒感染的个体当前是否处于疾病的活动期。HSV1株从眼睛转移到脑的能力与DNA聚合酶活性相关(Yeung等人)。因此，DNA聚合酶的测定有助于预测γ疱疹病毒感染的侵袭或侵染。
进行诊断试验的方法是本领域中广为人知的，对于本领域普通技术人员而言是常规技术。通常为了进行本发明的诊断方法，本发明的一个组合物被提供成试剂以检测临床样品中与之反应的靶。例如，本发明的多核苷酸可被用作试剂以检测如可能存在于被疱疹病毒感染的细胞中的DNA或RNA靶。本发明的多肽可被用作试剂以检测能与之形成特异性复合物的靶。如抗体分子或(如果多肽是受体)相应配体。本发明的抗体可被用作试剂以检测它特异性识别的靶，如由病毒感染细胞表达的多肽。
通过从被测量诊断参数的个体处得到适当的组织样品即可提供靶。相关的试验样品是那些得自怀疑携带疱疹病毒的个体的样品。各种类型的样品适于这一目的，包括那些通过活组织检查或外科解剖得自感染或病理学可疑部位附近的样品，衍生自它们的体外细胞培养物，溶解的提取物，血液和血液成分。如果需要，在进行检测前可从样品中不完全地纯化靶或将靶扩增。通过在允许试剂与靶之间形成复合物的条件下将试剂与样品接触来进行反应。可在溶液中进行反应，或者例如使用组织学切片在固体组织样品上进行反应。通过各种本领域中已知的技术可检测复合物的形成。例如可提供具有标记物的试剂，从复合物中除去未反应的试剂；从而剩下的标记物的量可表示所形成复合物的量。在说明书下文中将提供复合物检测的进一步的细节和替换物。
为了测定所形成的复合物的量是否代表了感染或未感染疱疹病毒的细胞，优选将试验结果与对对照样品进行的类似试验结果相比较。一般优选使用得自未感染来源的对照样品，要么对照样品在组成上类似于被检测的临床样品。然而，如果已知对照样品中靶的相对量，或者此相对量能用于比较的目的，则任何对照样品都适合。通常优选同时对试验样品和对照样品进行检测。然而，如果所形成复合物的量可以定量并且有足够的一致性，则在不同日期或不同实验室检测试验样品和对照样品是可以接受的。
因此，本发明所包含的编码RFHV/KSHV亚族DNA聚合酶的多核苷酸和合成的寡核苷酸可被用于检测生物样品中可能存在的γ疱疹病毒的多核苷酸。在具体的诊断试验中使用多核苷酸的一般方法是本领域技术人员所熟知的，例见日本专利申请5309000(1atron)。
例如：1)通过与特异性探针进行杂交反应；2)通过与特异性引物进行扩增，或3)通过上述两种方法的联合可使使用多核苷酸试剂的检测变成特异性的。
为了进行因与特异性探针杂交而被赋予特异性的试验，选定的多核苷酸应具有所需程度的与想要的靶的互补性。优选的探针包括长度至少约为16个核苷酸的编码RFHV，KSHV或RFHV/KSHV亚族成员DNA聚合酶的一部分的多核苷酸。更加优选的探针含有至少约18，20，25，30，50或100个核苷酸长的DNA聚合酶编码区。还优选能与RFHV/KSHV亚族的多核苷酸而不能与其它疱疹病毒的多核苷酸形成稳定双螺旋的简并探针。
一般情况下提供的探针具有标记物。经常用于这种类型检测的一些标记物包括如32P和32P的放射性同位素，化学发光剂或如荧光素的荧光剂，能产生有色溶质或沉淀物的酶，如碱性磷酸酶。标记物对于试剂而言可以是内源性的，它可通过直接的化学键被连接，或者通过一系列中间反应分子，如生物素-亲和来复合物或一系列相互反应的多核苷酸被连接。可在与靶多核苷酸杂交之前或之后在试剂中加入标记物。为了改善试验的敏感性，经常需要增加因杂交引起的信号，通过以复合标记物成分掺入每个复合物的方式使用系列杂交的多核苷酸或分支的多核苷酸的联合可以实现这一目的，参见美国专利号5,124,246(Urdea等人)。
如果需要，可从样品中提取靶多核苷酸，也可以将靶多核苷酸部分纯化。为了测量病毒颗粒，优选富集DNA的制备；为了测量DNA聚合酶的活性转录，优选富集RNA的制备。一般预期临床样品中疱疹病毒的多核苷酸水平较低，潜伏有病毒的每个细胞中仅有几拷贝编码聚合酶的DNA，或正在复制病毒的每个细胞中有多至几百拷贝的DNA。与那些聚合酶基因在其中无活性的细胞相比，活跃表达聚合酶的细胞中mRNA的水平较高，因此需要通过扩增DNA或RNA来增强样品中靶的水平。适当的扩增方法是PCR，优选使用本发明包含的一个或多个寡核苷酸引物进行PCR。通过使用逆转录酶制备cDNA拷贝，然后使用上述引物进行PCR可以扩增RNA。
靶多核苷酸可任选经受任何额外处理的联合，包括用限制性核酸内切酶消化，例如通过在琼脂糖或聚丙烯酰胺中电泳以进行大小分离，和贴在反应基质，如印迹材料上。
在适当的反应条件下，通过将试剂多核苷酸与怀疑含有靶多核苷酸的样品混合，可允许杂交发生。接着通过洗涤或分离以除去未反应的试剂。一般情况下，靶多核苷酸和试剂必须都至少部分地被平衡成单链形式以便互补序列能有效杂交。因此，通过本领域技术人员已知的标准变性技术制备样品是有用的(特别是在DNA检测中)。
选定的杂交条件的严紧性水平取决于检测的目的。如果需要此检测对于RFHV或KSHV是特异性的，则可使用含有各个DNA聚合酶一个区段的探针，在高严紧性的条件下进行反应。例如对于优选的50个或更多个核苷酸的探针所用的一套优选条件是37℃，50％甲酰胺，6×SSC，然后在低离子强度下洗涤。一般需要靶与多核苷酸探针至少约90％相同才形成稳定的双螺旋。通过增加所用探针的长度也可以增加对RFHV或KSHV反应的特异性。因此对于本发明的这一应用特别优选较长的探针。
或者，如果需要试验能检测与RFHV或KSHV相关的γ疱疹病毒，则可使用较低的严紧性。适当的探针包括得自RFHV或KSHV DNA聚合酶的片段，其混合物，或如表6所列的那些简并寡核苷酸。
适当的杂交条件被确定成仅允许探针与特定的DNA聚合酶序列杂交，所述序列具有所需程度的与探针的同一性。所需的严紧性取决于多核苷酸探针的长度和探针与所需靶序列之间同一性的程度。考虑到例如探针由DFASA和GDTD1B杂交位点之间的KSHV多核苷酸片段组成，需要最少55％同一性的条件会导致与KSHV，RFHV和EBV的相应多核苷酸形成稳定的双螺旋；需要最少68％同一性的条件会导致与KSHV，RFHV的多核苷酸，或相关的多核苷酸，而不是EBV的多核苷酸形成稳定的双螺旋；需要最少80％同一性的条件会导致与KSHV的多核苷酸，而不是RFHV或EBV的多核苷酸形成稳定的双螺旋(见表2)。
使用上文给出的公式可预先估计条件。优选通过用已知含有多核苷酸的分离样品检测探针以进一步确证精确的条件，所述样品包括那些在试验中需被检测的和那些不需被检测的多核苷酸。或者通过由公开序列合成多核苷酸，或者通过从据信被各个疱疹病毒感染的组织中提取和扩增DNA可以提供这种样品。确定杂交条件对于本领域技术人员而言是一种常规的调整，不需要太多的实验。由于eHV2，sHV1和EBV相对于α和β亚族的成员而言，与RFHV或KSHV更加密切相同，排除了那些病毒的多核苷酸的条件一般也排除了表1所列的其它疱疹病毒。另外，如果据信在最终测定中，某些病毒不会存在于受试样品中(如eHV2在人组织样品中)，那么当确定了试验条件后即可任选忽略相应的靶序列。因此条件可被确定为允许如LSGGA，CTDPA，KMLEA或GISPA的寡核苷酸探针能与含有SEQ.ID NO：1和SEQ.ID NO：3的多核苷酸序列，而不与选自SEQ.ID NO：23至SEQ.ID NO：29的序列形成稳定的双螺旋。条件也可被确定为允许如PCLNA(SEQ.ID NO：21)或含有SEQ. ID NO：1或SEQ.ID NO：3的至少18个或更多个连串碱基的任何适当片段的寡核苷酸探针能与含有SEQ.ID NO：1的多核苷酸和含有SEQ.ID NO：3的多核苷酸，而不与含有SEQ.ID NO：23至SEQ.IDNO：29中之一的多核苷酸形成稳定的双螺旋。
或者为了进行因用特异性引物扩增而被赋予特异性的试验，可如前所述从生物样品中制备DNA或RNA。任选在PCR中使用非种特异性的引物，如表4中所列的那些，预扩增靶多核苷酸。然后使用特异性引物，如表6或表7中所列的那些扩增靶。例如，如果需要检测对于RFHV是特异性的，则可使用VASGA，ILPCA，PIEAB，PEARB或它们的组合。如果需要检测对于KSHV是特异性的，则可以使用SGILA，CLNIA，IEASB，EARFB或它们的组合。如果需要试验能够检测与RFHV或KSHV相关的γ疱疹病毒，则可使用简并或交叉反应性探针，如表6中所列的那些，或它们的组合。在优选的实施方案中，以嵌套形式使用寡核苷酸引物进行了两轮扩增：第一轮中为病毒特异性或非特异性；第二轮中为病毒特异性。这提供了既敏感又特异的试验。
扩增过程中特异性引物的使用足以提供所需的特异性。扩增系列的最后充足的反应产物的存在表示阳性试验。通过例如将反应混合物印迹到如硝酸纤维素的介质上并用溴化乙锭染色可以检测被扩增的多核苷酸。或者可以在最终的扩增循环期间在混合物中加入经放射性标记的底物；将掺入的标记物与未掺入的标记物分开(例如通过印迹或通过大小分离)，检测标记物(例如通过计数或放射性自显影)。如果在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳，产物的大小将有助于进一步证实被扩增片段的本质。通过使用得自前述方法的扩增混合物作为前文概述的杂交反应的靶源，在特异性扩增之后可进行特异性杂交。多核苷酸用于基因治疗
本发明中包含的药物含有病毒特异性多核苷酸，多肽或抗体作为活性组分。这种组合物会降低病毒或感染细胞本身的病理学，或者使得病毒或被感染的细胞对非特异性药物化合物的治疗更加敏感。
可以使用本发明编码疱疹病毒DNA聚合酶部分的多核苷酸，例如给被感染的个体用药以进行基因治疗(一般参见美国专利号5,399,346；Anderson等人)。一般的原理是以干扰相应基因表达的方式施用多核苷酸，例如可通过与基因自身络合或与由此基因转录的RNA络合来实现这一目的。通过本领域中已知的适当技术，如以适当的载体形式提供多核苷酸，或将多核苷酸包裹在脂质体内，便于多核苷酸进入细胞。多核苷酸可以全身性注射，或者通过抗原特异性寻靶机制，或通过直接注射将多核苷酸提供给感染部位。
优选的基因治疗模式是以能在细胞内部复制，增强和延长干扰效果的方式提供多核苷酸。因此，可使多核苷酸与适当的启动子有效连接，所述启动子如相应基因的天然启动子，在被感染的细胞中有内在活性的异源启动子，或能够通过适当试剂被诱导的异源启动子。优选设计构建体以使与启动子有效连接的多核苷酸序列与相应基因的序列互补。因此，一旦整合到细胞基因组内，所施用的多核苷酸的转录本将与基因的转录本互补，并能与之杂交。此方法已知为反义治疗。RFHV/KSHV亚族具有DNA聚合酶活性的多肽及其片段
图1所示的RFHV和KSHV多核苷酸都具有开放阅读框。被编码的多肽分别被称为SEQ.ID NO：2和SEQ.ID NO：4。多肽具有显著数目的与其它被测序的疱疹病毒DNA聚合酶同源的残基。相对于其它被测序的病毒的相应片段而言，它们在此片段内相互之间有更密切的同一性。据信此片段包含的残基在完整蛋白质的核苷酸底物结合位点附近。此区域可能在聚合酶的催化活性中起作用。得自RFHV/KSHV亚族其它成员、具有DNA聚合酶活性的多肽预期共用此区域大部分相同的残基。通常，在RFHV和KSHV之间保守的残基预期在亚族内相对保守。
从SEQ.ID NO：2的约氨基酸89开始，有一个RFHV和KSHVDNA聚合酶之间共同享有的约46个残基的线性序列。从SEQ.ID NO：2的约氨基酸88开始，有一个RFHV和eHV2 DNA聚合酶之间共用的约31个残基的线性序列。与eHV2共用的序列分开列于SEQ.ID NO：112。SEQ.ID NO：112中还含有RFHV和sHV1之间共用的约26个氨基酸的序列，和两个RFHV和EBV之间共用的12个氨基酸的序列。从SEQ.ID NO：4的约氨基酸10开始，有一个KSHV和各种其它γ疱疹病毒之间共用的约15个残基的线性序列。此共用序列分开列于SEQ.IDNO：113中。SEQ.ID NO：2或4而不是SEQ.ID NOS：112或113中所含的、与其它已知的疱疹病毒DNA聚合酶共用的最长序列为10个氨基酸长。因此，RFHV或KSHV DNA聚合酶蛋白质序列的11个氨基酸或更长的任何片段(不是SEQ.ID NOS：112或113中所含的)据信对于RFHV/KSHV亚族，或其中的种和变异体而言是特异性的。
本发明既包含RFHV/KSHV亚族疱疹病毒完整的DNA聚合酶，也包含对此亚族有特异性的其任何片段。本发明的优选DNA聚合酶片段至少11个氨基酸长；更优选它们约12个氨基酸长；更优选它们至少约15个氨基酸长；甚至更优选它们至少约20个氨基酸长，再更优选它们至少约30个氨基酸长。
RFHV和KSHV DNA聚合酶片段的氨基酸序列可用于鉴定病毒特异性和交叉反应性的抗原区域。
原则上，特异性的抗体会识别序列间非抗体来源物种共有的任何氨基酸差异。抗体结合位点一般应足够大以包含抗原的5至9个氨基酸残基，所述位点应足能识别单个氨基酸的差异。特异性抗体可能是多克隆应答的一部分，所述应答在被表达DNA聚合酶的病毒感染的动物中自发地产生。也可以通过给实验动物注射完整的聚合酶或聚合酶片段来诱导特异性的抗体。
因此，RFHV或KSHV独特的5个或更多个氨基酸的任何肽是潜在的病毒特异性抗原，可以被RFHV-或KSHV-特异性抗体识别。在RFHV和KSHV，而不是EBV，eHV2和sHV1之间共用的至少5个氨基酸的肽是潜在的RFHV/KSHV亚族特异性抗原。
优选肽的一些例子示于表8。本领域技术人员很快会认识到通过细微改变所列肽的长度和/或在任一方向上将肽的框架移动几个残基即可设计出具有类似特异性的其它肽。
在γ疱疹病毒亚族的所有已知DNA聚合酶多肽序列之间，表8所示的I类肽是保守的。针对此区域中的一个这种DNA聚合酶的抗体预期能与其它抗体交叉反应。在RFHV和KSHV之间II类肽是保守的，但在sHV1和EBV之间II类肽却不保守。针对此区域的抗体预期在RFHV，KSHV和RFHV/KSHV亚族的其它病毒之间能交叉反应。RFHV和KSHV的III类肽有所不同。与此区域，特别是与不相同的残基结合的抗体预期可将RFHV DNA聚合酶与KSHV DNA聚合酶区分开来。
                       表8：抗原肽
  特异性      序列      SEQ.ID NO：
   I类RFHV/KSHV亚族和其它γ疱疹病毒的一些成员共用的      RTILDKQQLAIKVTCNAVYGFTGVASGILPCL内所含的肽(SEQ.ID NO：112)
     SIIQAHNLCYSTLIP所含的肽(SEQ.ID NO：113)
    IAETVTL          73
   II类RFHV/KSHV亚族的成员共用的1     PDDYETF          90
    KRKEIRK          91
    LAKRKEI          92
    LASCTDP          93
    VASGILP2          74
        GILPCLN         75
        CLNIAET         76
        QGRKMLE         77
        SQAFVE         78
        ARFKVI         79
     III类：RFHV或KSHV特异性的3     TGSALHG (RFHV)PGDSLHL (KSHV)         9495
    SALHGHP (RFHV)DSLHLHP (KSHV)GHPELTP (RFHV)LHPHLGP (KSHV)         96979899
    HLSGGTV (RFHV)VLSGGLV (KSHV)         100101
    TDPTMRT (RFHV)TDPALKT (KSHV)         102103
    LETSQAF (RFHV)LERSQAF (KSHV)         8081
    EGISPTA (RFHV)EAISPER (KSHV)         8283
    ADLLQRP (RFHV)AGLLRRP (KSHV)         8485
    QRPIEAS (RFHV)RRPIDVS (KSHV)         8687
    IEASPEA (RFHV)IDVSPDA (KSHV)         8889
1.除非特指，否则不与eHV2，sHV1或EBV共用2.也与eHV2共用，但不与sHV1或EBV共用3.不与其它任何被测序的疱疹病毒共用；可能存在于一些未测序的RFHV/KSHV亚族的病毒中
特别优选的II类和III类肽是QGRKMLE，ARFKVI，RRPIDVS，QRPIEAS，IEASPEA和IDVSPDA。给出RFHV和/或KSHV之DNA聚合酶的完整序列，通过类似分析可预测分子其它区域的病毒或亚族特异性肽。多肽的制备
可通过本领域技术人员已知的几个不同方法制备本发明的多肽，包括完整的蛋白质，蛋白质片段和抗原区域。例如，可将全长cDNA的适当链与适当的启动子有效连接，并转染适当的宿主细胞。再在允许转录和翻译发生的条件下培养宿主细胞，随后回收多肽。有关通过转染酿酒酵母以表达和回收疱疹病毒DNA聚合酶的描述参见Haffey等人和专利申请EP 0337441。有关在哺乳动物细胞中表达疱疹病毒另一个蛋白质的描述参见美国专利号5,244,792(Burke等人)。
也可以通过化学合成从序列资料出发直接制备多肽。合成的几个方法是本领域中已知的方法。优选的方法是固相Merrifield技术。或者可通过前文描述的任何方法制备编码所需多肽的多核苷酸，并使用体外翻译系统，如兔网织红细胞系统翻译，例见Dorsky等人。使用多肽评估疱疹病毒感染
在几个不同的应用中，本发明所包含的多肽也可被用来检测或评估个体中疱疹病毒感染的现状。
在一个应用中，编码疱疹病毒DNA聚合酶一部分的多肽被提供成检测用的试剂以检测可特异性地识别它的抗体的存在。这种抗体可能存在于例如目前或继往被疱疹病毒感染的个体的循环系统中。
循环系统中抗DNA聚合酶之抗体的存在能提供病理状况的早期征兆。抗乙型肝炎病毒DNA聚合酶的抗体是急性乙型肝炎病毒感染的早期征兆(WO 8904964：Fietelson等人)。抗DNA聚合酶的抗体可用于诊断鼻咽癌(Lin等人，Liu等人)。类似地，在卡波济氏肉瘤的损害临床显示之前它也能用于监测被HIV感染的病人中抗KSHV DNA聚合酶抗体的存在。
被测量其中的抗体水平的适当临床样品包括得自怀疑有γ疱疹病毒感染的个体的血清或血浆。通过例如免疫测定法可测定抗体的存在。
本领域中已确立了大量免疫测定法以使用病毒肽进行抗体的定量(例见美国专利号5,350,671：Houghton等人)。例如，可以将潜在含有特异性抗体的试验样品与预先确定的不限定量的试剂多肽混合。此试剂可含有直接结合的标记物，如酶或放射性同位素。对于液相检测而言，通过如过滤或层析的分离技术除去未反应的试剂。或者，通过固相上的试剂首先捕获样品中的抗体。所述试剂可以是例如特异性的多肽，抗-免疫球蛋白，或A蛋白，然后用如结合有标记物的特异性多肽，抗-免疫球蛋白或A蛋白的第二试剂检测被捕获的抗体。至少一种捕获试剂或检测试剂必须是特异性多肽。在第三种变化中，含有多肽的细胞或组织切片可首先被含有抗体的试验样品覆盖，然后被如经标记的抗-免疫球蛋白的检测试剂覆盖。在所有这些例子中，复合物中捕获的标记物的量与试验样品中存在的特异性抗体的量正相关。可设计类似的试验，其中试验样品中的抗体与经标记的抗体竞争同有限量的特异肽结合，那么复合物中标记物的量与试验样品中特异性抗体的量负相关。比较试验样品和得自未被感染之个体的对照样品之间使用这些试验中的任一个得到的结果。
通过适当选择试剂多肽，可检测所需特异性的抗体。例如，如果使用完整的DNA聚合酶，或者使用含有疱疹病毒保守区域的片段，则在试验样品中检测到的抗体可能是病毒特异性的，交叉反应性的，或两者皆是。优选将此特性的试剂用于疱疹病毒感染的一般性筛选试验中。为了使试验特异针对抗RFHV或抗KSHV的抗体，可选择含有适当病毒DNA聚合酶的非保守区的抗原肽，如表8的III类所列的那些肽，优选使用这种肽的混合物。为了同时检测抗RFHV，KSHV，和密切相关的γ疱疹病毒家族的病毒，而不抗sHVl和EBV的抗体，可选择具有表8 II类所列肽之特性的抗原肽，优选使用这种肽的混合物。
一旦感染消退，在疱疹病毒感染期间刺激产生的抗体也会消退，或者它们也可以作为宿主免疫记忆的一部分被保存。在后一种情况下，通过测定抗体的类别可将因目前的感染产生的抗体与因免疫记忆产生的抗体区分开来。例如，可进行这样一种试验，其中试验样品中的抗体被特异性的多肽捕获，再用经标记的抗-IgM或抗-IgG使之显现出来。试验样品中IgM类特异性抗体的存在表明感染正在发生，而只存在IgG抗体表明活性是由于先前感染或免疫接种的免疫记忆而产生的。
在本发明的另一个应用中，从样品中分离疱疹病毒编码的DNA聚合酶，并通过酶测定法测定DNA聚合酶存在的量。通过例如提取聚合酶和进行适当的聚合试验可进行生物样品中DNA聚合酶活性的测定。通过标准技术，如使用如TRITONTM X-100或脱氧胆酸盐的非离子去污剂可从固体组织样品或组织匀浆液中使聚合酶增溶。或者，如果聚合酶是由被感染的细胞分泌的，则可以对液体样品，如血浆或淋巴液进行检测。
进行DNA聚合酶试验的方法是本领域中已知的。例如，制备出的聚合混合物含有推定的DNA聚合酶，含有至少一种经标记的核苷酸的核苷酸混合物，如M13噬菌体DNA的DNA模板，和如有必要还含有调节性亚单位。在37℃下将混合物保温足够长时间以允许聚合发生。通过测量标记物掺入多核苷酸的量可测定聚合酶活性有或无。本领域技术人员无需进行过多的实验即可方便地确定进行DNA聚合酶试验的最适条件。例如，O′Donnell等人已公开了检测HSV DNA聚合酶的试验条件。预期检测RFHV和KSHV DNA聚合酶的最适试验条件与之类似。使用多肽作为主动疫苗的成分
本发明所包含的多肽如何有效用于治疗的例子是通过免疫接种。
在此应用的一个实施方案中，多肽作为主动疫苗的一部分被施用以刺激能抗病原性生物体的抗体；在这种情况下，所述病原体为RFHV/KSHV亚族的疱疹病毒。本领域技术人员已知由分离的疱疹病毒成分开发主动疫苗：例见美国专利号5,171,568(Berke et al)。此种类型的疫苗对预防特别有用，这是因为在病原性生物体有机会侵入宿主细胞并开始复制循环之前，疫苗所刺激产生的抗体就能够中和遇到的病原体。
制备和施用多肽疫苗的方法是本领域技术人员已知的方法。肽能够独立地产生免疫应答，或者通过化学操作，如与KLH类的蛋白质载体交联或结合使其变得更具有免疫原性。优选此疫苗也含有佐剂，如明矾，胞壁酰二肽，脂质体或DETOXTM。疫苗可含有辅助性物质，如润湿剂，乳化剂和有机或无机盐或酸。它也含有药物可接受的赋形剂，所述赋形剂与活性成分相容，并适合于施药的途径。合乎需要的肽疫苗剂量通常为10μg至1mg，具有宽的有效范围。优选首次以引发剂量施用疫苗，通常至少4周后再以加强免疫的剂量施用一次。也可进一步加强免疫剂量以增强效果。负责治疗的人士通常可确定剂量和其时间的选择。
在此应用的另一个实施方案中，多肽是经设计可刺激特异性细胞毒T淋巴细胞之疫苗的活性成分。此种类型的疫苗对于治疗受试者体内已经存在的疱疹病毒感染特别有用。疱疹病毒的DNA聚合酶是细胞毒T细胞疫苗适当的靶；这不仅是由于其相对保守的结构，也是由于它是病毒重要的内部成分。通过循环完整的病毒和有缺损的病毒颗粒可表达外部病毒成分，该外部成分具有引导免疫系统远离被感染细胞的潜力。然而，被病毒感染的细胞仅在胞外表达内部的病毒成分，所述细胞将所述成分显示于组织相容性1类分子附近。这种细胞是特异性细胞毒T细胞理想的靶，因为它们表示病毒复制的部位，所以它们是宿主内病毒最易被攻击的位置。
与那些需被用于刺激抗体的疫苗相比，细胞毒T细胞疫苗可含有不同的抗原区域。T细胞表位与抗体表位有所不同；它们一般较少依赖于构象的前后关系，和/或可由能重叠成两亲性α-螺旋之肽区域产生。细胞毒T细胞疫苗也可含有能增强肽至T细胞群的呈递和/或帮助征集细胞毒T细胞谱系之细胞的另外的活性成分或细胞因子。
在前述实施方案之任一个的变体中，免疫接种的肽不是以分离的蛋白质或蛋白质片段的形式被提供，而是以表达载体的形式被提供。编码肽的多核苷酸与适当的转录和翻译控制元件有效连接，然后被转染到适当的载体中。适当的载体包括疫苗病毒或疱疹病毒的减毒形式。使用多肽设计或筛选抗病毒药物
干扰DNA聚合酶基因或基因产物会修饰感染的进程或疾病的进展。本发明的目的之一是提供一种方法，通过此方法可开发和试验有用的药物组合物和利用这种化合物治疗γ疱疹病毒感染的方法。特别优选可用于治疗RFHV和KSHV感染的药物化合物。适当的药物可以干扰DNA聚合酶基因的转录或翻译，并能干扰由此基因编码的多肽的催化功能。不需要知道干扰的机理；只需要明白对于与感染过程相关的反应而言，干扰是优先的。
优选的药物包括那些竞争干扰DNA聚合酶与底物核苷酸三磷酸，DNA模板结合的药物，也优选核苷酸类似物，它们可掺入由酶合成的聚合链，但形成能防止进一步聚合的死端(dead-end)复合物(Reardon等人)。可由本文所述方法检测的优选药物的一些非限制性例子是蚜肠霉素，无环鸟苷，9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤，磷卡萘替，卵孢菌素，BHCG，PMEA，其它核苷酸类似物，这些化合物的isotrene以及与所列的这些化合物在结构或功能上相关的其它化合物。
还优选能干扰DNA聚合酶与催化活性所必需的调节性亚单位的联系的药物。如上文所述，在HSV的复制过程中，UL42亚单位对于HSV的DNA聚合酶活性而言是必需的。由UL42序列设计得到的小肽可抑制UL42和DNA聚合酶之间的结合，此小肽是聚合酶活性有效的抑制剂(美国专利号5,223,391；Coen等人)。HSV DNA聚合酶的c-末端区域负责UL42亚单位的结合。因此预期在某些条件下(如那些病毒复制所必需的)，RFHV和KSHV DNA聚合酶会需要可能是也可能不是UL42的类似物的调节性亚单位，以表达全部的聚合酶活性。因此，与U.S.5,223,391中描述的那些肽功能上相当，经适当改变能用于γ疱疹病毒的肽预期具有抑制活性及治疗用途。
本发明提供了筛选候选药物以决定哪种适于临床使用的方法。此方法会瞄准目前已知的抗病毒化合物和那些将来设计的抗病毒化合物。
此方法包括将有活性的DNA聚合酶与候选药物联合，并测定候选药物是否改变了生化功能。DNA聚合酶可以是由RFHV或KSHV的DNA聚合酶基因编码的具有DNA聚合酶活性的任何片段。通过表达编码分子活性位点的经遗传工程改造的多肽，或通过用蛋白酶裂解DNA聚合酶并纯化活性片段可得到适当的片段。在优选的实施方案中，提供了完整的DNA聚合酶。反应混合物也可含有适当的DNA模板，底物脱氧核糖核苷酸三磷酸和进行反应所必需的任何调节性亚单位。筛选方法的一个实施方案是在体外进行DNA聚合酶检测。DNA聚合酶以分离的形式被提供，并在适当的缓冲液中与其它反应化合物混合。按上文章节中所述方法进行和监测DNA聚合酶试验，通过例如放射性标记的核苷酸掺入合成链中的比率测量反应混合物中每摩尔或每克酶的聚合酶活性的量。通过平行进行两个反应可以测定候选药物的效果，所述两个反应除了一个含有候选药物外，具有相同的反应物质混合物。或者通过在正在进行的聚合酶反应中加入候选药物，并测定反应速率是否改变来测定候选药物的效果。合乎需要的效果可以消除或降低经标记DNA的合成速率。
筛选方法的另一个实施方案是在宿主细胞中表达编码DNA聚合酶活性区域的多核苷酸。用此多核苷酸转染会增强宿主细胞的复制速率，此时通过测量细胞复制的速率可监测聚合酶的活性。或者聚合酶的活性也能被表示为细胞内部如经标记的多核苷酸之类的产物产生的速率，因此通过将其效果与DNA聚合酶活性相联系可以测定药物的效果。适当的对照实验包括在无药物存在时测量DNA聚合酶活性，并测定药物对未被转化的宿主细胞的影响。
筛选方法的另一个实施方案是测量候选药物与分离的DNA聚合酶或其片段的结合。与催化位点或调节性亚单位的结合位点结合的化合物预期会干扰DNA聚合酶的活性。因此，可将完整的DNA聚合酶，或含有催化位点或调节性亚单位的结合位点的片段与候选药物混合。通过例如以放射性标记或稳定的同位素标记的形式提供候选药物可直接测量候选药物的结合。通过例如将聚合酶和适当的抗体一起沉淀，或者通过提供与固相结合的聚合酶并在反应后洗涤固相可测定与聚合酶结合的标记物的存在。通过例如差异光谱学，核磁共振或圆二色性检测也可将候选药物与聚合酶的结合以聚合酶构象的改变进行观察。或者也可在竞争性试验中测定结合：例如，将DNA聚合酶与候选药物混合，再加入经标记的核苷酸或调节性亚单位的片段。候选药物与生化相关位点的结合应能抑制经标记化合物随后的结合。
本发明也通过合理的药物设计提供了治疗疱疹病毒感染之药物的开发，一般可参见Hodgson和Erickson等人。在此实施方案中，或者通过以氨基酸序列为基础的预测模型，或者优选通过实验测定法可测定DNA聚合酶的三维结构。实验的方法包括抗体作用，突变分析和抗-独特型的形成。特别优选X-射线晶体学。知道蛋白酶的三维结构，特别是核苷酸和调节性亚单位结合位点附近的重要氨基酸基团的方向，就可以从头设计化合物，或者可适当修饰现有的化合物。经设计的化合物要具有适当的电荷平衡，疏水性，和/或形状以使得它能在聚合酶活性位点的附近结合，并在空间上干扰此位点的正常生化功能。优选随后在上文所述的药物筛选试验中检测通过此方法设计的化合物。抗DNA聚合酶的抗体及其制备
本发明中包含的疱疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列对于所述病毒感染的宿主而言是外源的。聚合酶较大，并潜在含有大量抗原区域，它们在各个病毒的衣壳内被掩蔽，不太可能模拟宿主抗原。因此希望这些聚合酶基本上是免疫原性的。脊椎动物宿主在被完整的疱疹病毒感染的过程中会自发产生抗病毒的抗体。预期通过给实验动物注射分离的DNA聚合酶和适当制备的片段也可产生抗体。实施例5和实施例10所述的观察结果支持这些预期。
一般可通过本领域已知的任何方法制备抗多肽的抗体。为了在实验动物体内刺激抗体的产生，经常优选通过如与戊二醛聚合，或与如弗氏佐剂等佐剂联合这类技术增强多肽的免疫原性。将免疫原注射到适当的实验动物体内：优选注射到啮齿动物体内以制备单克隆抗体；优选注射到如免或绵羊的较大动物中以制备多克隆抗体。优选在约4周后提供第二次或加强注射，并在不少于约1周后开始收获抗体源。
从经免疫的动物体内收获的血清提供了多克隆抗体的来源。从来源材料中纯化特异性抗体活性的详细方法是本领域中已知的。如有必要，可通过如A蛋白层析，硫酸铵沉淀，离子交换层析，高效液相色谱和在偶联至固体支持物上的免疫多肽柱上进行的免疫亲和层析之类的技术进一步纯化特异性抗体活性。
通过完整的DNA聚合酶或含有保守序列的片段免疫产生的多克隆抗体在疱疹病毒之间可能有交叉反应。通过用适当的特异性抗原，如上文表8中所列的那些抗原免疫可产生病毒或亚族特异性的抗体。或者，通过例如使抗体穿过由其它病毒聚合酶制成的吸附剂并收集未结合的级分以除去不需要的抗其它病毒DNA聚合酶的活性，可以使得抗较大片段产生的多克隆抗体为特异性的。
或者，可以从免疫动物体内回收如脾细胞等免疫细胞并用于制备能产生单克隆抗体的细胞系，例见Harrow&Lane(1988)，美国专利号4,472,500(Milstein等人)，和U.S.4,444,887(Hoffman等人)。
简单地说，可以特别地通过细胞融合，或者通过用Epstein Barr病毒转化产生抗体的细胞，或者用致癌DNA转化来产生能生产抗体的细胞系。克隆并培养经处理的细胞，选择能产生所需特异性抗体的克隆。可通过多种技术对培养物上清液进行特异性检测，所述技术如在标准的免疫测定法中使用免疫多肽作为检测试剂，或者在免疫组化法中使用表达多肽的细胞。可从大体积的组织培养物上清液，或者从注射有克隆的适当准备的宿主动物腹水液中纯化选定克隆的单克隆抗体供应。
此方法的有效变动包括对分离的细胞进行多肽的免疫接种。通过标准的蛋白质化学方法，如用蛋白酶使抗体裂解可制备抗体片段和其它衍生物。通过得到编码抗体的多核苷酸，并应用一般的分子生物学方法以引入突变并翻译变异体可以产生抗体的经遗传工程改造的变异体。
通过注射完整的DNA聚合酶或含有保守序列的片段而产生的单克隆抗体在疱疹病毒之间可能有交叉反应。通过用适当的特异性抗原，如选自表8的那些抗原免疫可产生病毒或亚族特异性的抗体。或者，通过在筛选方法中使用适当的抗原，如选自表8中的一个抗原可从经克隆的杂交瘤中选择病毒特异性的克隆。使用抗体检测生物样品中的DNA聚合酶
抗体可被用于检测可能存在于，例如，固形组织样品和经培养的细胞中病毒来源的DNA聚合酶多肽和片段。进行这种测定的免疫组织学技术对于本领域技术人员而言是显而易见的。一般情况下通过下述技术的联合可保护组织，所述技术包括冷冻，在不同的溶剂内交换，用如低聚甲醛的试剂固定，用如醇的试剂干燥，或在如石蜡或OCT的商购介质中包埋。适当制备样品的切片，并用特异针对蛋白质的第一抗体覆盖。
可直接提供具有适当标记物的第一抗体。更多情况下使用多种易生产或可商购的显色剂中的一种来检测第一抗体。典型地，这些显色剂是抗  免疫球蛋白或A蛋白，它们一般具有的标记物包括但不限于：如荧光素的荧光标记物，如过氧化物酶的能沉淀适当化合物的酶，如胶体金的电子密度高的标记物或如125I的放射性同位素。再使用适当的显微技术观察切片，比较怀疑受病毒感染的细胞和对照细胞之间的标记水平，所述对照细胞如感染区域周围或得自较远部位的细胞。
在标准的定量免疫测定法中，也可检测由DNA聚合酶基因编码的蛋白质。如果蛋白质由受感染的细胞以一定的量分泌或排出，则可在血浆或血清样品中检测到蛋白质。或者，可从固形组织样品中溶解或提取靶蛋白质。定量前可通过例如印迹技术或使用捕获抗体将蛋白质粘附于固相上。
本领域中已建立了大量进行定量的免疫测定法，例如，可将蛋白质与预定的非限制性量的特异针对蛋白质的试剂抗体相混合。试剂抗体可含有直接结合的标记物，如酶或放射性同位素，或者也可加入第二个经标记的试剂，如抗免疫球蛋白或A蛋白。对于固相测定法而言，通过洗涤除去未反应的试剂。对于液相测定法而言，通过一些其它的分离技术，如过滤或层析除去未反应的试剂。复合物中捕获的标记物量与试验样品中存在的靶蛋白质量正相关。此技术的变体是竞争测定法，其中靶蛋白质与经标记的类似物竞争特异性抗体的结合位点，此时被捕获的标记物量与试验样品中存在的靶蛋白质的量负相关。比较试验样品和得自未受感染之来源的对照样品之间使用任何这类检定法得到的结果。
抗疱疹病毒DNA聚合酶的特异性抗体在开发，诊断和治疗研究中有很多用途。例如，抗体可用于药物筛选(见美国专利号5,120,639)或用于制备被动疫苗。它们也可按下文所述，被用于检测生物样品中的疱疹病毒和使药物靶向作用。使用抗体使药物靶向作用
抗体如何能被用于治疗疱疹病毒感染的例子是效应物成分的特异性靶向作用，被病毒感染的细胞一般将病毒的肽(包括内部病毒成分)呈现于它们的细胞表面组织相容性1类抗原的前后序列中，因此肽为被感染的细胞提供了可与特异性抗体结合的标记物。而与抗体结合的效应物成分在被感染的细胞附近变得密集；改善了对感染细胞的效应并降低了对未受感染之细胞的效应。并且，如果抗体能诱导胞吞作用，则可增强效应物进入细胞内部的能力。
为了靶向作用这一目的，优选通过共价或高亲和性键使特异针对病毒多肽(此时为DNA聚合酶的区域)的抗体与适当的效应物成分缀合。这种组合物中适当的效应物成分包括如131I等放射性核素，有毒的化合物和如白喉毒素的有毒肽。另一个适当的效应物成分是可包裹于脂质体中的反义多核苷酸。
在抗体分子对人治疗的大多数应用中，优选使用人单克隆抗体，或已通过本领域已知技术人源化的抗体。这有助于防止抗体分子自身成为宿主免疫系统的靶。诊断试剂盒
诊断实验室，实验性实验室，技术人员或私人都可进行使用本发明的多核苷酸，寡核苷酸，肽或抗体的诊断步骤。本发明提供了能用于这些装置的诊断试剂盒。在得自受感染个体的临床样品中，个体中存在疱疹病毒表现为样品中所含DNA，RNA，蛋白质或抗体的改变。与得自健康个体的样品中的成分相比，因疱疹病毒的存在而导致的这些成分之一的变化采取的形式是成分水平的增加或降低，或成分形式的变化。任选预处理临床样品以富集被检测的靶。然后使用者可使用试剂盒中所含的试剂以检测诊断成分改变的水平或形式变化。
每个试剂盒必须含有赋予方法特异性的试剂：用于检测靶DNA或RNA的试剂多核苷酸；用于检测靶蛋白质的试剂抗体；用于检测欲被分析的样品中可能存在的靶抗体的试剂多肽。可以适于贮存的固体形式或液体缓冲液形式提供试剂，然后当进行试验时，用于交换或加入反应介质中。还提供了适当的包装。此试剂盒可提供对此方法有用的另外的成分，这些可选择的成分包括缓冲剂，捕获试剂，显色剂，标记物，反应表面，检测的工具，对照样品，说明书和解释性的资料。RFHV/KSHV亚族的其它成员
RFHV和KSHV是RFHV/KSHV亚族成员的例子。本发明包含编码如本文所限定的亚族其它成员DNA聚合酶的多核苷酸序列。我们希望能鉴定和描述此亚族的其它成员，包括能感染包括人的灵长类动物的那些成员。一个这类成员是感染猴的另一个病毒，它被称为RFHV2。如实施例11所述，从得猕猴的RF组织中克隆了此病毒DNA聚合酶编码序列的区段。
为了鉴定和描述此家族中的其它成员，对提取自怀疑被这种病毒感染的组织样品的DNA使用本发明的试剂和方法。适当的来源包括得自在人和其它脊椎动物中出现的广范围疾病的生物样品。优选疾病中的因子与γ疱疹病毒亚族的其它成员相似，被怀疑是嗜淋巴细胞的；例如非EBV来源的感染性单核细胞增多。更优选的疾病在至少一个临床或组织学特征上类似于与RFHV或KSHV相关之疾病。这些疾病包括：a)纤维增殖是疾病病理学一部分的疾病，尤其是与胶原沉积相关的疾病，和尤其是纤维组织被打乱的疾病；b)涉及血管发育异常的疾病；c)涉及恶性转化的疾病，特别是但不限于淋巴细胞谱系的细胞；d)隐伏的免疫缺损影响疾病的频率或严重性的疾病；e)在器官的各个位点或在全身自发产生的疾病；f)其流行病学的资料暗示与传染性或环境因子相关的疾病。相对而言更优选满足不止一个上述标准的疾病。特别优选的一些疾病的例子包括腹膜后纤维变性，小结状纤维瘤病，假肉瘤纤维瘤病，纤维肉瘤，硬化肠系膜炎，急性呼吸病综合征，自发性肺纤维变性，不同类型的扩散增殖性肾小球肾炎，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质增生和所有类型的白血病和淋巴瘤。
鉴定RFHV/KSHV亚族之成员的方法优选包括或单独地或联合地使用本发明提供的方法和试剂。
一个方法涉及扩增和/或鉴定样品中编码DNA聚合酶的多核苷酸。例如可通过使用如表6所列的那些RFHV/KSHV亚族特异性的寡核苷酸作为反应中的引物在如PCR的反应中扩增多核苷酸来实施此方法。经扩增的反应产物的存在表明样品中存在有得自RFHV/KSHV亚族之成员的多核苷酸。
通过使用适当的探针对样品中的多核苷酸进行杂交试验也可鉴定亚族的成员。在例如通过使用表4或表6中所列的寡核苷酸在PCR中进行杂交试验以前，任选扩增欲被检测的多核苷酸。优选的杂交试验探针包括表6的寡核苷酸，其它优选的探针是编码RFHV或KSHV之DNA聚合酶的16个核苷酸或更多个核苷酸的多核苷酸片段，优选SEQ.ID NO：1或SEQ.ID NO：3中所含的那些。在最不严紧的条件下进行杂交反应，其中探针不与含有SEQ.ID NO：23至29中任一个的多核苷酸形成稳定的双螺旋，而与含有SEQ.ID NO：1的多核苷酸或含有SEQ.ID NO：3的多核苷酸，优选它们中的任一个形成稳定的双螺旋。在这些条件下与受试多核苷酸形成稳定的双螺旋表明在样品中有得自RFHV/KSHV亚族之成员的多核苷酸存在。
也可以使用特异性的试剂抗体鉴定亚族的成员，所述抗体能与由亚族成员产生的抗原交叉反应，但不与其它抗原，包括由非亚族成员的疱疹病毒产生的那些抗原交叉反应。产生这种抗体的方法在前文已有概述。通过例如在对制备自患有上文所列疾病之个体的组织切片进行免疫组化研究中使用抗体可进行检测。组织切片被抗体正染色表明样品中存在RFHV/KSHV亚族之成员的DNA聚合酶，这可能是由于组织已被病毒感染。类似地，如果在个体的循环系统中发现抗体能与RFHV或KSHV抗原交叉反应，但不与其它疱疹病毒抗原交叉反应，这表明个体已经被RFHV/KSHV亚族的成员现时或既往感染。
一旦怀疑生物样品中存在RFHV/KSHV亚族的成员，就需要得到相应于图1核苷酸330-501的DNA聚合酶基因片段。根据标准技术测定片段的序列以确定病毒是否是本文所限定的RFHV/KSHV亚族的bonefide成员。下文实施例11和12中提供了鉴定RFHV/KSHV亚族之成员的优选方法。
一旦已鉴定出RFHV/KSHV亚族的新成员，本发明的其它实施方案将致力于检测、诊断和药物开发的目的。使它们适于新亚族成员的变化如果是必需的，则希望此变化较小，并且根据新的序列资料是显而易见的，或者可以常规调节。RFHV/KSHV亚族之DNA聚合酶的变化形式
本发明也包括RFHV/KSHV亚族之DNA聚合酶的变化形式，如上文所描述，对其它疱疹病毒的DNA聚合酶所作的研究有助于精确定位涉及底物结合，聚合酶活性或药物抗性之分子的活性区域和残基。已描述的一些残基出现在聚合酶分子的保守区域，并且在RFHV，KSHV和它们最初被描述的病毒之间，这些残基是相同的。用类似的方法，RFHV/KSHV亚族DNA聚合酶的相同残基的突变有望具有类似的效果：
                      表9：RFHV/KSHV亚族之DNA聚合酶中氨基酸取代的可能的影响
     变化    位置            影响
     Y→F     8     DNA聚合酶的活性下降
     N→Y    103
    Y→F或S    106
     G→D    107
     Y→F    168
     G→R    169
    D→G或N    170
    T→K或P    171
    D→A或G    172
     A→V     5   增加对抗病毒化合物的抗性
     S→N     10
     P→T     85
     T→M    101
     P→S    130
表9中残基的编号开始于由图1所示的KSHV整个DNA聚合酶多核苷酸片段编码的第一个氨基酸(即SEQ.ID NO：4的第一个氨基酸)。
据信DNA聚合酶活性对于疱疹病毒的复制是必需的。因此表9所列的预期损害DNA聚合酶活性的突变可用于产生各个病毒的减毒形式。其它突变可以增加或降低RFHV或KSHV聚合酶对抗病毒药物的抗体。
疱疹病毒，尤其是它的减毒形式可用于开发以治疗为目的的病毒载体(Johnson等人，Ward等人)。一种这类用途是开发多价疫苗。特别是在发展中国家需要提供能刺激免疫系统同时抗几种潜在的病原体的预防性疫苗。经遗传工程改造可表达几种不同病原体的免疫原性肽的疫苗可实现此目的。由于疱疹病毒大的基因组可轻易容纳几千个碱基的编码肽的额外DNA，因此疱疹病毒是特别合适的载体。理想的情况是病毒载体足够完整以表现出一些生物活性并吸引宿主免疫系统的注意，而同时又被充分减毒以免引起显著的病理状况。因此，RFHV/KSHV亚族的减毒病毒可用作抗类似毒性形式的疫苗，并且可以被修饰以表达另外的肽和拓宽免疫保护的范围。
疱疹病毒减毒形式的另一用途是作为基因疗法的传递载体(Latchman等人，Glorioso等人)。为了有效，基因疗法中的多核苷酸必须被传递到靶组织部位。在治疗纤维性疾病，恶性肿瘤和相关疾病的过程中，由于RFHV/KSHV亚族的减毒病毒载体具有靶向受感染组织的能力，故优于其它靶向作用机理，包括其它疱疹病毒。在此实施方案中，病毒先被减毒，然后被修饰以含有基因疗法所需的多核苷酸，如前文所概述的那些。
前文描述特别地提供了有关疱疹病毒的DNA聚合酶编码区如何被鉴定和它们的序列如何被得到的详细解释。提供了RFHV和KSHV DNA聚合酶基因区域的多核苷酸序列。
据信所提供的多核苷酸序列是用于此研究之组织样品中疱疹病毒多核苷酸所含序列的精确复本。然而据认为由如PCR的扩增方法得到的序列可能由于扩增而在序列中含有偶然的错误。对于单次测定而言，估计错误率在约0.44％至0.75％之间；对于总共n个不同的测定而言，错误率约为相同的频率被√(n-1)除。不过，错误率可能高至2％或更高。通过制备疱疹病毒多核苷酸序列文库，使用如表7所提供的那些寡核苷酸选择相关克隆，并测定选定克隆中DNA的序列即可得到没有扩增错误的序列。相关的方法学是本领域普通技术人员所熟知的，例见实施例9。
据认为出现了疱疹病毒的等位变体和逃逸变体，在不违背本发明精神的前提下，可分离或得到掺入突变的多核苷酸和多肽，所述突变或者为自然产生，或者为偶然地或故意地诱导产生。
提供下文所示实施例是为了进一步指导本领域的普通技术人员，而不是以任何方式限制本发明。
实施例实施例1：疱疹病毒DNA聚合酶的寡核苷酸引物
已知的疱疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列得自PIR蛋白质数据库，或衍生自得自GenBank数据库的DNA序列，通过计算机辅助的排列程序和通过手工排列序列。几个保守的区域显而易见。选择三个最高度保守的区域以设计扩增引物。选定的区域在图2中被表示为REGION 1，REGION 2和REGION 3。
已鉴定出氨基酸序列的适当保守的区域，使用这些区域的DNA序列来设计寡核苷酸引物。引物被设计成在3′末端具有12-14碱基对的简并片段，在5′末端具有18-30碱基对的共有区段。这可以提供具有最适敏感性和特异性的引物。
简并区段延伸跨越了疱疹病毒DNA聚合酶序列的最高度保守的区域，该区域包含最少数目的可替换密码子。因此引物可以在简并位置用可替换的核苷酸残基合成并产生最少数目的组合。所得到的每个引物有不超过256个的可替换形式。
共有区段衍生自DNA聚合酶序列的相应侧翼区域。通常，通过选择被分析的所有DNA聚合酶序列的每个位置处最经常出现的核苷酸可得到共有区段。然而，更倾向于选择C或G核苷酸以使引物形成稳定双螺旋的能力最大化。
结果示于图3-5，并概括于表4。图3表示REGION 2附近的已知疱疹病毒DNA聚合酶基因的DNA序列。使用这些序列设计如图所示的寡核苷酸DFASA和DFQSA。在PCR中，通过与编码链的反义链杂交，并在与DNA聚合酶编码序列的相同方向上起动聚合可将这些寡核苷酸用作引物。图4表示RFGION 3附近的DNA序列，由此设计了寡核苷酸VYGA，VYGCA和VYGSQA以在5′方向上起动聚合。图5表示REGION3附近的DNA序列，由此设计了寡核苷酸GDTD1B和GDTDSQB。这些寡核苷酸会与编码链杂交并在与DNA聚合酶编码序列相反的方向上起动聚合。
根据设计好的序列的合成寡核苷酸订购自Oligo Etc，Inc。实施例2：DNA提取
活组织检查的样本得自被诊断为患AIDS的人受试者的卡波济氏肉瘤损害，样本也可得自华盛顿大学地区灵长类动物研究中心的豚尾猴，食蟹猴，和日本猴群体的腹膜后纤维瘤病损害。
样本被固定于低聚甲醛中并包埋于石蜡中，如此进行以供正常的组织学检查。
在1.5ml的EPPENDORFTM圆锥形离心管中用500μl的二甲苯提取石蜡样品的片段。在室温下将样品缓慢摇晃5分钟，将试管置于EPPENDORFTM台式离心机中，以14,000rpm的转速离心5分钟。用巴氏吸管除去二甲苯后，加入500μl 95％的乙醇，重新悬浮样品，然后再离心。除去乙醇，重复洗涤步骤。再将样品自然干燥约1小时，加入500μl蛋白酶-K缓冲液(0.5％TWEENTM 20，一种去污剂；50mM Tris缓冲液，pH 7.5，50mM NaCl)和5μl蛋白酶K(20mg/ml)，将样品在55℃下保温3小时。通过在95℃下保温10分钟使蛋白酶K失活。实施例3：得到RFHV和KSHV DNA聚合酶的经扩增区段
根据下述方法，使用实施例1中得到的寡核苷酸扩增实施例2中提取的DNA。
使用1μl DNA模板，1μl寡核苷酸DFASA(50pmol/μl)，1μl寡核苷酸GDTD1B(50pmol/μl)，10μl 10×WB4缓冲液(0.67MTris缓冲液，pH 8.8，40mM MgCl2，0.16M(NH4)2SO4，0.1M β巯基乙醇，1mg/ml牛血清白蛋白)，1μl含有2.5mM的各种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)，66μl蒸馏水和50μl矿物油进行第一次PCR反应。在Perkin-Elmer(Model 480)PCR仪中将混合物加热至75℃。再加入0.5μl Taq聚合酶(BRL，5U/μl)和19。5μl水。以下列顺序进行35次扩增循环：94℃1分钟，60℃1分钟和72℃1分钟。
按下述进行第二次PCR反应：在前一步骤的1μl反应混合物中加入10μl 9-10×WB4缓冲液，1μl dNTPs，0.5μl Taq聚合酶，86.5μl水和50μl矿物油。将混合物加热至75℃，加入1μl寡核苷酸VYGA(50pmol/μl)和寡核苷酸GDTD1B(50pmol/μl)中的每一种。如上进行35次扩增循环。实施例4：236个碱基之片段的序列
通过在2％的琼脂糖凝胶上电泳纯化每份样品的最终扩增混合物的等分试样。在所用的9只豚尾猴和1只食蟹猴样品中，4只豚尾猴样品产生了扩增产物。扩增产物也可得自人样品。用溴化乙锭将琼脂糖凝胶染色，并使用紫外灯观察DNA。将正确大小的带洗脱在DEAE纸上。将提取的每个多核苷酸连接到PGEM-TTM载体上并转化感受态细菌(大肠杆菌JM-109)。挑选并培养含有经扩增之DNA的细菌克隆。裂解细菌，并接着使用酚-氯仿通过乙醇沉淀来提取DNA。通过使用M13正向和反向引物的Sanger&Nicholson双脱氧核苷酸法进行测序。
引物杂交区域之间的片段长度为172个碱基对。对于所用的4只豚尾猴样品都产生了相同的序列资料。RFHV和KSHV之间的片段大约有70％的残基相同。与最密切相关的疱疹病毒家族已知序列相比，序列之间的差异沿着此片段整个长度分布。在此片段的任何两个序列之间相同的最长一段连串核苷酸是11个。
RFHV和KSHV之间由此片段编码的多肽有81％相同。其中前24个残基100％相同，前31个残基97％相同。RFHV或KSHV和其它已知的疱疹病毒DNA聚合酶中的任一个之间，此片段中相同的最长一段连串氨基酸是10个。实施例5：RFHV和KSHV特异性扩增试验
根据RFHV和KSHV DNA聚合酶之多核苷酸片段的序列制备四种寡核苷酸以用于嵌套病毒-特异性扩增反应。引物VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是以RFHV序列为基础的；引物SGILA，CLNIA，LEASB，和EARFB是以KSHV序列为基础的(表7)。按下述使用RFHV引物扩增得自猕猴PBL的DNA样品。
从出生于华盛顿大学之猴群体的20只豚尾猴体内收集未凝结的全血样品。30个血液样品得自在野外捕获的豚尾猴。没有一只动物具有明显的纤维瘤病症状。通过离心分离血浆和血细胞，根据标准的血液分离技术，通过密度梯度离心细胞以制备外周血单核细胞(PBMC)。根据实施例2中的方法从细胞中提取DNA。再先使用引物VASGA和PEARB，后使用引物ILPCA和PIEAB以扩增DNA。扩增的条件与实施例3中的类似。在琼脂糖凝胶上电泳反应产物，用溴化乙锭染色并在紫外灯下检查。
当在重复试验中和在避免PCR反应产物交叉污染的条件下进行检测时，此试验中没有一个无RF症状的猴被发现在其外周血中有可测水平的编码DNA聚合酶的RFHV多核苷酸。
也可通过免疫组织学技术检查PBMC以进一步证实阳性PCR产物和RFHV抗原血症之间的相关性。将PBMC涂布在显微镜的载玻片上，并用50％甲醇，20％丙酮和30％水的混合物固定PBMC。用初级血清覆盖之，洗涤，用FITC-(兔抗-猴IgG)(Nordic Labs)覆盖，再次洗涤，然后通过荧光显微镜检查。
可从显示出阳性RFHV扩增试验结果的猴体内得到含抗体的血清，或者也可从经RFHV或RFHV提取物免疫接种的动物体内得到含抗体的血清。可将得自具有阴性结果之猴的血清用作对照。由于RFHV抗原成分的抗原血症，在扩增试验中显示出阳性结果之动物的PBMC也显示出阳性的免疫组织学结果。
为了对KSHV进行扩增试验，可从怀疑携有病毒的组织中提取DNA；特别是从具有卡波济氏肉瘤损害和体腔B-细胞淋巴瘤之人受试者的活组织检查样品中提取DNA。分两个阶段扩增DNA，第一阶段中使用引物SGILA和EARFB，第二阶段中使用引物CLNIA和IEASB。如上文所述，经溴化乙锭染色检测，反应产物中充足的多核苷酸的存在表示阳性结果。实施例6：RFHV和KSHV DNA聚合酶的上游序列
将与实施例3所用相类似的卡波济氏肉瘤组织的DNA用于另外的扩增反应中以得到编码KSHV DNA聚合酶之基因的较长片段。如实施例3所述，使用寡核苷酸DFASA和GDTD1B作为第一阶段扩增反应的引物，在琼脂糖凝胶上分离反应产物。从已知的sHV1和EBV序列估计出从DFASA到GDTD1B的片段大小(现在已经知道为536个碱基长)，从凝胶中回收相应的带。使用相同引物对提取到的多核苷酸进行第二轮扩增。如实施例4所述将产物克隆到大肠杆菌中。
从提取自组织的DNA的三个不同扩增产物中鉴定含有适当插入物的克隆。使用载体特异性寡核苷酸(M13正向和反向引物)从两端测定克隆插入物的序列。对于所有三个扩增产物而言，测定从5′端开始的约160个核苷酸(包括DFASA杂交区域)和从3′端开始的约233个核苷酸(包括GDTD1B杂交区域)的序列。在三个扩增产物的一个中测定最靠近片段中间部分的序列。
适当时，通过联合三个测定的结果和实施例4的结果可得到片段的共有序列。与实施例4中测定的RFHV DNA聚合酶片段的序列相比较的数据示于图1。两个序列都是从引物DFASA的第一个位置开始编号的。
对应于DFASA和GDTD1B之杂交位点的每个序列的区域可能不能准确地反映靶序列。据信引物之间的片段代表被用来扩增用于测序的多核苷酸的DNA。然而，在扩增过程中可能已引入偶发性的错误。假定KSHV的共有序列准确反映了提取自组织的DNA的序列，则不包括与引物杂交的区域，在往5′末端的方向上，每一扩增产物的核苷酸序列中约有0.75％的错误率，而在往3′末端的方向上序列中约有0.44％的错误率。
为了得到相应的RFHV多核苷酸序列，首先使用广特异性的DNA聚合酶引物DFASA与RFHV特异性引物PEARB的联合扩增得自猕猴冷冻RF组织之DNA，再通过使用DFASA与RFHV特异性引物PIEAB的联合扩增上述DNA。
过程如下：将5μl DNA模板与1μl各种引物(50pmol/μl)，10μl10×WB4缓冲液，1μl 2.5mM dNTP，59-65μl水和60μl矿物油相混合。升高温度至60℃，加入Taq聚合酶(0.5μl酶用水稀释至20μl)，以94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟将DNA扩增35个循环。在2μl扩增产物中加入10μl 10×WB4缓冲液，1μl 2.5mM dNTP，66.5μl水，0.5μl Taq聚合酶和60μl矿物油。升高温度至60℃，再加入1μl PIEAB(50pmol/μl)，2μl DFASA(50pmol/μl)和18μl水的混合物，按前述进行扩增循环。最后进行第三轮扩增以引入放射性标记，用γ32P-ATP末端标记寡核苷酸PIEAB，在1μl经标记的PIEAB中加入20μl得自上述扩增步骤的反应混合物以及1μl 2.5mM dNTP和1μl Taq聚合酶，按上述方法进行94℃，55℃和72℃的5个扩增循环。
在6％聚丙烯酰胺测序凝胶上电泳经放射性标记的反应产物的等分试样，通过放射自显影术鉴定正确大小的带(通过与KSHV序列类似的方法预测)，并从干燥的凝胶上切下正确大小的带。通过在50μl水中保温洗脱DNA。使用2μl洗脱下的DNA，10μl 10×WB4缓冲液，1μl2.5mM dNTP，1μl PIEAB(50pmol/μl)，1μl DFASA(50pmol/μl)，0.5μl Taq聚合酶和84.5μl水进行进一步的扩增反应，以95℃30秒，60℃30秒和72℃65秒进行35次扩增循环。使用QUIAEXTM凝胶提取试剂盒分离经扩增的产物，将DNA克隆到PGTMTM-t载体中。用DNA转化JM-109细胞，分离含有插入物的菌落，使用含有正确大小之插入物的菌落以得到用于测序的DNA。
将这些实验数据与实施例4中的数据相联合可提供对应于RFHV和KSHV DNA聚合酶基因的536个碱基对的序列。忽略最外周的引物杂交区域，已测定了RFHV和KSHV每个序列的475个碱基对。与其它被测序的γ疱疹病毒DNA聚合酶基因的相应区域相比较的这些序列列于图6。RFHV序列和任何其它病毒之间相同的最长区域是与eHV2共用的第一个20个碱基对的亚片段(SEQ. ID NO：110)和第二个20个碱基对的片段(SEQ.ID NO：111)。
图7表示相应被编码的多肽序列。在RFHV和eHV2的DNA聚合酶之间共用的SEQ ID NO：2中间附近有一个约31个残基的线性序列。此共用序列被单独列于SEQ.ID NO：112。在RFHV和sHV1之间的相同区域有一个共用的26个氨基酸的序列，在RFHV和EBV之间有两个共用的12个氨基酸的序列。这些同源性区域图在其它疱疹病毒DNA聚合酶序列保守的REGION 3附近(图2)。KSHV和其它γ疱疹病毒之间的第二个共用序列出现在SEQ. ID NO：4的起点附近。此序列图在其它疱疹病毒DNA聚合酶序列保守的REGION 2附近，KSHV和其它γ疱疹病毒之间共用的此序列片段单独列于SEQ. ID NO：113。
图8提供了横跨不同疱疹病毒范围的对应于由本文得到的RFHV和KSHV的475个碱基对序列编码之序列的蛋白质序列间的比较。
如图9所示，序列之间的同一性水平可被用于构建DNA聚合酶之间的关系图。种之间的关系可反映多肽之间和编码它们的生物体之间相对的祖先关系。基于此分析，RFHV和KSHV暂时被排在疱疹病毒的γ亚族之列，此亚族中还包括eHV2，sHV1和EBV，在此基础上RFHV/KSHV亚族的其它病毒也可以被列于疱疹病毒γ亚族。实施例7：RFHV/KSHV亚族的寡核苷酸引物和探针
基于得自RFHV和KSHV的475个碱基对的多核苷酸片段序列，设计出5个寡核苷酸，它们可以被RFHV/KSHV亚族成员用作PCR引物或杂交探针。这些寡核苷酸被称作LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA。
图10中显示出这些寡核苷酸以及它们的来源序列。与实施例1中的寡核苷酸相似，它们在往5′末端的方向上具有共有区段，在往3′末端的方向上具有简并区段。然而，这些寡核苷酸仅以RFHV和KSHV序列为基础，因此优先与RFHV/KSHV亚族的DNA聚合酶形成稳定的双螺旋。在允许它们与RFHV或KSHV编码多核苷酸片段形成稳定双螺旋杂交的条件下，与或单独或联合的RFHV或KSHV序列的等长多核苷酸相比，它们预期与更多的RFHV/KSHV亚族成员形成稳定的双螺旋。
两个寡核苷酸的方向相同。在PCR扩增反应中，这些寡核苷酸中的一个或另一个可以与具有相反方向的引物，如GDTD1B联合用作引物。实施例8：RFHV和KSHV DNA聚合酶的抗原性和免疫原性区域
基于RFHV和KSHV DNA聚合酶编码区域的475个碱基对的多核苷酸序列，可以预测对于每个病毒而言蛋白质上的什么位点是独特的，因此构成了潜在的结合病毒特异性抗体的位点。
图7表示6或7个氨基酸的肽的例子。与相应的γ疱疹病毒肽相比，一些肽含有或者对RFHV或KSHV而言(III类)或者对RFHV/KSHV亚族而言(II类)为独特的一个或多个残基。这些肽已列入前文表8。图7和表8中氨基酸残基的编号都开始于在VYGA引物的杂交位点之后编码的第一个氨基酸(图1的核苷酸331处)。
为了进一步证实DNA聚合酶的这一57个氨基酸的区域内所含区域可以被抗体识别，可进行计算机分析以产生Hopp和Wooks抗原性作图。Hopp和Woods测定法部分地基于连串氨基酸残基的亲水性和疏水性(Hopp等人)。
结果示于图11和图12。RFHV的编号开始于在VYGA引物之后编码的第一个氨基酸(如图7)。图12中KSHV多肽残基的编号开始于DFASA引物的杂交位点之后编码的第一个氨基酸(图1的核苷酸28处)。
RFHV和KSHV都含有经预测可能是抗体靶位点的几个区域。例如，沿着RFHV的氨基酸序列出现了几个疏水的和抗原性的小段序列。KSHV从残基26，44，52，121和151开始出现了疏水性的小段序列；从残基8，37，45和94开始出现了抗原性的小段序列。尤其是对应于一些这些区域的图7的肽是抗原性的。实施例9：测定RFHV和KSHV DNA聚合酶完整编码区的序列
已经得到KSHV DNA聚合酶编码区域中实施例6所述区段5′和3′方向上的另外的序列资料。
根据实施例2中的方法，使用被称作K-12和K-15的两个卡波济氏肉瘤样品来制备DNA。
设计另外的Type 1寡核苷酸引物以同已得到的KSHV序列侧翼的疱疹病毒DNA聚合酶核酸序列杂交，例子列于表10：
                     表10：用于检测、扩增或鉴定编码疱疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸的另外的Type 1寡核苷酸
  名称    序列(5′至3′)     长度   类型数目      靶：   方向   SEQID：
  QAHNAQAHNB CCAAGTATCATHCARGCNCAYAAGGAGTAGCACAARTTRTGNGCYTG     2324    4832   疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶  5′→3′3′→5′   105106
  YGDT1B AACACAGAGTCNGTRTCNCCRTA     23    64   疱疹病毒DNA聚合酶  3′→5′   124
  HNLCA AGCATCATCATGGCCCAYAAYCTNTGYT     28    32   疱疹病毒DNA聚合酶  5′→3′   125
 DFASLYA GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC     20   512   疱疹病毒DNA聚合酶  5′→3′   126
 FDIEC1B CACCCATRCAYTCDATRTCRAA     22    48   疱疹病毒DNA聚合酶  3′→5′   127
  DIECA TACAACGTCCTCTCCTTYGAYATHGARTG     29    24   疱疹病毒DNA聚合酶  5′→3′   128
  CVN1A GTCTGCGTGAAYGTNTTYGGNCA   23   64   疱疹病毒DNA聚合酶   5′→3′   129
  CVNVACVNVSQA GACGACCGCAGCGTGTGCGTGAAYGTNTTYGGNCAACGACCGCAGCGTGTGCGTG   3520   641   疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶   5′→3′5′→3′   130131
  CVNVBCVNVSQB TAAAAGTACAGCTCCTGCCCGAANACRTTNACRCATAAAAGTACAGCTCCTGCCCGAA   3523   641   疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶   3′→5′3′→5′   132133
  SLYP1ASLYP2ASLYPSQA TTTGACTTTGCCAGCCTGTAYCCNAGYATNATTTTGACTTTGCCAGCCTGTAYCCNTCNATNATTTTGACTTTGCCAGCCTGTA   323220   2561281   疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶   5′→3′5′→3′5′→3′   134135136
  GDTD2BYFDKB CGGCATGCGACAAACACGGAGTCCGTRTCNCCRTADATTTAGCTACTCCGTGGAGCAGYTTRTCRAARTA   3832   4816   疱疹病毒DNA聚合酶疱疹病毒DNA聚合酶(尤其是γ亚族的)   3′→5′3′→5′   137138
按下述进行PCR扩增：首先在下述条件下于总体积为50μl的反应缓冲液中扩增得自每个样品的100ng DNA：1×PCR缓冲液(67mMTris缓冲液，pH8.8，16mM(NH4)2SO4，10mM β-巯基乙醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白)，20mM MgCl2，50pmol每种寡核苷酸CVN1A和FDIEClB，100μM(每种)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，1.25单位的Taq DNA聚合酶(AMPLITAQTM，Perkin-ElmerCetus)。以95℃30秒；50℃30秒和72℃30秒进行45次扩增循环，在2％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并通过溴化乙锭染色观察。
使用QLAQUICK SPINTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，ChatsworthCA)纯化PCR产物。将产物克隆至PT7BLUE载体(Novagen，MadisonWI)中。使用QUIAGEN SPINTM质粒微量制备试剂盒纯化质粒，使用ABI自动测序方法，使用M13正向和反向引物测定经纯化之质粒的序列。从K-12和K-15的每一种中测定5个克隆的序列。
被称为BC-1和BC-2的两个体腔淋巴瘤细胞系被用作下游序列测定的DNA来源。用PBS洗涤每一细胞系中的5×105个细胞，并分开沉淀之。在每份沉淀物中加入蛋白酶-K缓冲液并在65℃下保温1小时。用1∶1(vol∶vol)的酚∶氯仿将DNA抽提两次，用乙醇沉淀并洗涤，并重新悬浮于10mM Tris缓冲液，pH 8.0中。
在总体积为100μl的1×PCR缓冲液中，同时使用大约0.5μg来自BC-1和BC-2细胞系的总基因组DNA以及25pmol寡核苷酸引物CVNVA和EARFB，2.5单位的Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim)，250μM dNTP和4mM MgCl2。在加入Taq聚合酶之前，在70℃下“热启动”1分钟以进行PCR扩增，并进行94℃45秒，60℃45秒和72℃90秒的35次扩增循环。在2％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物并通过溴化乙锭染色观察。
按上述方法纯化PCR产物并克隆到PT7BLUE载体中。使用ABI自动测序方法测定经纯化质粒的序列，该方法使用了KSHV序列的特异性引物RDSWA，FDCSA，YSTLB和DYETB。对单个排列开放阅读框使用GenePro算法分析DNA序列。对于多重排列使用Clustalw算法确定共有序列。
所得核苷酸序列(SEQ.ID NO：116)与其编码的氨基酸序列(SEQ.ID NO：117)一起示于图13。总共显示出2511个核苷酸，其中开始的35个对应于CVNVA引物，最后的12个对应于YFDKB引物。对应于SEQ.ID NO：117之氨基酸13至833的SEQ.ID NO：116的碱基36至2499表示KSHV DNA聚合酶的序列。
KSHV DNA聚合酶的部分氨基酸序列与其它疱疹病毒之序列的对比示于图14。用星号(*)标记的残基在所有示出的序列中是相同的。以圆点(·)标记的残基表示保守的氨基酸取代。用箭头(↑)标记的残基是令人感兴趣的，因为在其它疱疹病毒之间它们是保守的，但在KSHV中却是不同的。这些残基中的一个是在KSHV中为组氨酸，而在其它病毒中相同位置却是天冬氨酸，这是非保守性的差异。用箭头标记的残基可能是特异针对KSHV或RFHV/KSHV亚族之抗体或药物的适当的靶。
在所得的四个KSHV DNA聚合酶核苷酸序列中，在四个位置处标出了变异。据信这些表示自然发生的等位变异。约在核苷酸319处，序列TTCTCG也可为TTTTGG，这是沉默突变(不会影响所编码的蛋白质序列)。约在核苷酸348处，序列AACCCG也可为AATCCG，这也是沉默突变。约在核苷酸1795处，序列CCAGTA也可为CCAATA，这表示被编码的肽从-Pro-Val-变成了-Pro-Ile。约在核苷酸1822处，序列TTCAAG也可为TTCAGG，这表示被编码的肽从-Phe-Lys-变成-Phe-Arg-。KSHV氨基酸序列的变体与其它疱疹病毒DNA聚合酶序列的对比示于图15。
据信KSHV DNA聚合酶核苷酸序列与其它疱疹病毒相应序列的比较可设计表11所列的另外的Type 3(病毒特异性)寡核苷酸：
                   表11：特异针对编码KSHV  DNA聚合酶的多核苷酸的另外的Type 3寡核苷酸
  名称    序列(5′至3′)   长度  类型数目     靶：   方向   SEQID：
 SIIQBHVLQBSCGFBLPHLAQARQAKIIQB TTGTGCGCTTGGAGATACTGGAGGGCCTGCTGGAGGACGTGCGGTGGAGAAGCCGCAGGATGACCTCCCGCACCTGACCGTGTAAGCTAGACAGGAGGAGCTTCACTTGAATTATCTTGACGAAC   212121212121   111111     KSHVDNA聚合酶  3′→5′3′→5′3′→5′5′→3′5′→3′3′→5′   139140141142143144
 KVLMA ACGACAAGGTTCTGATGAAGG   21    1  5′→3′  145
 RDSWAFDCSAYSTLBDYETB AGAGACTCTTGGACGGAACTGAGTTTGACTGCAGCTGGGAGGCGGGTATCAGTGTGGAGTAGCGAGGACAAAGGTTTCGTAGTC   21212121    1111    KSHVDNA聚合酶  5′→3′5′→3′3′→5′3′→5′  146147148149
根据其它γ疱疹病毒，预测KSHV DNA聚合酶序列含有总共约3000个碱基对，在所示序列的5′和3′方向上都具有另外的核苷酸，通过进行针对受感染组织样品描述的方法，使用Type 1寡核苷酸测定DNA聚合酶上游和下游的侧翼基因序列即可测定剩余的序列。
或者，通过产生受感染组织的DNA文库也可得到完整的DNA聚合酶序列。对于RFHV序列而言，文库制备自由实施例5的扩增试验已知含有RFHV DNA的猕猴PBMC，对于KSHV序列而言，文库制备自卡波济氏肉瘤损害或B细胞体腔淋巴瘤。
用蛋白酶K消化DNA裂解物，使用酚-氯仿提取DNA。充分透析后，用Sau3AI限制性核酸内切酶部分消化制品。在蔗糖梯度中离心消化物，回收约10-23千碱基的片段。通过用BamHI切割制备λDASH2TM载体噬菌体(Stratagene)。然后将选定大小的片段与载体混合，并使用DNA连接酶连接。
根据厂商的指导，用Stratagene的包装提取物制备经连接的载体，将所述载体用于感染XLI-BLUETM MRA细菌。在琼脂上以每个平板约20,000个细菌的密度涂布约200,000个被噬菌体感染的细菌。培养后，用硝酸纤维素覆盖平板上的菌落，将硝酸纤维素切成片段，从片段上洗脱噬菌体，使用适当的病毒特异性引物对它们的DNA进行扩增反应。在琼脂糖凝胶上电泳反应产物，并用溴化乙锭染色。从显示出所期望之大小的经扩增的DNA的平板区域回收噬菌体。将回收的噬菌体用于感染新的XLI细菌并重新涂布于新鲜培养基上，重复此过程直至得到有限稀释的单个克隆。
然后使用限制性核酸酶作出由此方法选择的每个克隆的图谱以确证所掺入的片段大小。使用载体特异性引物由两个末端测定大于完整DNA聚合酶序列的插入物的序列。将此序列与完整的EBV基因组的已知多核苷酸序列相比较以确定此片段是否跨越了完整的DNA聚合酶序列。从适当的克隆中得到DNA，剪切，并通过根据标准技术的鸟枪克隆测定DNA的序列。实施例10：鉴定免疫原性位点
为了鉴定在RFHV感染的自然过程中会产生何种抗体，从如实施例5所述在用PBMC进行的RFHV DNA聚合酶扩增试验中呈现出阳性结果的10-20只猕猴体内得到系列血清样品。为了检测抗KSHV的抗体，从10-20个具有卡波济氏肉瘤损害的AIDS受试者，10-20个HIV-阳性、症状-阴性的受试者和10-20个HIV-阴性对照中得到血清样品。在最初的研究中，合并每一群体中的血清以分析抗体。
适当时可根据RFHV或KSHV序列合成12个残基长的肽。制备覆盖了整个序列并有8个残基重叠的顺序(Sequential)肽。根据厂商指导使用Genosys的SPOTSTM试剂盒的标准F-Moc化学法，在尼龙膜支持物上制备肽。用血清覆盖制备出的膜，洗涤，并在适当时用与β-半乳糖偶联的抗-猴IgG或抗-人IgG覆盖。加入底物X-gal以显色，阳性染色表明血清中存在抗相应肽的IgG抗体反应性。实施例11：得到RFHV/KSHV亚族的其它DNA聚合酶序列
按下述得到RFHV/KSHV疱疹病毒亚族第三成员的DNA聚合酶编码序列。
从患有腹膜后纤维瘤病的猕猴的两个冷冻组织样品中提取DNA。根据实施例1中所述方法进行提取。在40μg糖原载体存在的情况下用乙醇沉淀经提取的DNA，用70％乙醇洗涤，并重新悬浮于10mM Tris缓冲液，pH8.0中。
使用三重-嵌套的PCR扩增DNA聚合酶编码序列的151个碱基对片段：在100μl总反应缓冲液中以下述条件首次扩增100ng各个样品的DNA：1×PCR缓冲液(67mM Tris缓冲液，pH8.8，16mM(NH4)2SO4，10mM β-巯基乙醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白)，4mMMgCl2，25pmol每种寡核苷酸VYGA和VYGCA，和50pmol寡核苷酸GDTD1B，25μM(每种)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，2.5单位的Taq DNA聚合酶(Boehringer-Mannheim)。在加入Taq聚合酶之前，在70℃下“热启动”1分钟以进行扩增，以94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒进行42次扩增循环。使用2μl初次PCR产物作为模板如前所述在50μl反应体积中进行第二次扩增，但使用25pmol每种寡核苷酸PCLNA和GDTDSQB和1.25单位Taq聚合酶。如前所述使用“热启动”和相同条件下的35次循环进行扩增。使用2μl第二次PCR的产物作为模板如前所述在50μl反应体积中进行第三次扩增，但使用25pmol每种寡核苷酸KMLEA和GDTDSQB和1.25单位Taq聚合酶。使用“热启动”和94℃30秒，65℃30秒和72℃30秒的35次循环进行扩增。
在3％琼脂糖凝胶上电泳最终的PCR产物，通过溴化乙锭染色观察。使用QIAQUICK SPINTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，ChatsworthCA)纯化PCR产物。将产物克隆到PC7BLUE载体中(Novagen，Madison WI)，使用QUIAGEN SPINTM质粒微量制备试剂盒纯化质粒。用USB测序酶7-脱氮-dGTP试剂盒，使用M13正向和反向引物测定纯化质粒的序列。
基于151个碱基对片段的序列，设计了两个被称为KVIYB和ASPDB的序列特异性(Type 3)寡核苷酸。将这些寡核苷酸与Type 1寡核苷酸QAHNA一起用于嵌套PCR扩增可得到468个碱基对的片段。如前所述，通过在100μl PCR混合物中使用～1μg每种DNA样品来进行第一次扩增，但50pmol的每种QAHNA和KVIYB被用作引物。使用“热启动”和94℃30秒，55℃60秒和72℃60秒的35次循环进行扩增。在100μl反应体积中使用3μl初次PCR产物作为模板，50pmol QAHNA和ASPDB作为引物进行第二次扩增，使用“热启动”和94℃30秒，60℃60秒和72℃60秒的40次循环进行扩增。然后在2.5％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物并通过溴化乙锭染色观察。如前所述将PCR产物克隆到PC7BLUE载体中并测序。
图16中表示了所得的核苷酸序列命名为“RFMm”(SEQ. ID NO：118)。这相当于在本申请的其它地方被称作“RFHVMm”或“RFHV2”的DNA聚合酶编码序列。被编码的蛋白质序列示于图17(SEQ. IDNO：119)。
RFHVMm与其它疱疹病毒的DNA聚合酶序列同一性分析示于表12：
                     表12：RFHV2和其它疱疹病毒之间的序列同一性
     病毒DNA聚合酶序列    SEQ.IDNO：    与RFHV 2片段的同一性(SEQ. ID NO：118)碱基1-454    与RFHV片段的同一性(SEQ. ID NO：1)碱基48-501    与KSHV片段的同一性(SEQ.ID NO：3)碱基48-501
     RFHV/KSHV亚族：        碱基83％(90％)69％(81％)       碱基83％(90％)71％(84％)       碱基71％(84％)69％(81％)-
     RFHV2(RFHVMm)RFHV1(RFHVMn)KSHV   11813
     γ疱疹病毒 63％(66％)60％(64％)57％(62％) 68％(68％)59％(64％)54％(63％) 68％(73％)62％(68％)62％(68％)
     eHV2sHV1EBV    232425
     α疱疹病毒 52％(43％)53％(44％)42％(41％) 53％(46％)53％(46％)45％(43％) 53％(46％)53％(46％)48％(45％)
     HSV1HSV2VZV    363735
     β疱疹病毒
     hCMVhHV6    3342     45％(38％)44％(38％)    53％(41％)46％(41％)    49％(40％)48％(41％)
    多核苷酸水平和(氨基酸水平)的同一性百分数
使用PHYLIP分析包装中提供的距离矩阵，邻近值并接和自举分析的方法进行系统分析。图18表示自举分析的结果，所示数目为支持所示支化点的总分为100的分数。此分析有力支持将RFHV/KSHV亚族与其它γ疱疹病毒分开的支化点。与它们中的任一个与KSHV相比之结果相比，RFHVMm和RFHVMn相互之间更加密切相关。
还分析了序列的G+C含量，结果示于表13。显示出了使用GerePro软件(Riverside Scientific)计算出的跨越RFHVMn 454bp的相应区域的G+C百分含量。括号中的值是为已知的完整DNA聚合酶序列计算出的G+C含量。还显示出了CpG的比率，考虑到单核苷酸组分，此比率为CpG频率观测值：期望值的比值。
                                 表13：不同疱疹病毒DNA聚合酶基因中G+C单核苷酸和CpG二核苷酸的频率
   疱疹病毒      亚族         G+C      CpG比率
    RFHVMnRFHVMmKSHV   RFHV/KSHV(γ)        55.9％51.1％54.4％        0.961.130.91
    eHV2sHV1EBV     其它γ    64.8％(63.6％)39.9％(34.9％)64.4％(61.8％)     0.71(0.75)0.28(0.33)0.73(0.70)
    HSV1VZV      α    67.6％(65.8％)41.5％(42.2％)     0.99(1.06)1.37(1.15)
    hCMVhHV6      β    60.2％(59 9％)46.0％(40.9％)     1.27(1.23)1.00(1.12)
KS和RF序列的G+C频率互相之间十分类似，该值处于EBV和eHV2之高G+C含量与sHV1之低G+C含量的中间。KS和RF的CpG二核苷酸频率十分类似，根据它们的单核苷酸组成，此值接近期望值(1.00)。相对于非RFHV/KSHV亚族的γ疱疹病毒而言，这些值更接近于α和β疱疹病毒。CpG数据表明RFHVMn，RFHVMm和KSHV基因组在未分裂的细胞中保持潜伏状态，与之形成对照的是sHV1和EBV在增殖的成淋巴细胞中保持潜伏状态。
系统分析，CpG分析和由三种病毒引起的症状之间的相似性都支持使用猴病毒作为KSHV和可能感染人的RFHV/KSHV亚族其它成员的模型。
RFHVMm-特异性Type 3寡核苷酸的例子示于表14：
                        表14：特异针对编码RFHV 2 DNA聚合酶的多核苷酸的Type 3寡核苷酸
  名称   序列(5′至3′)   长度  类型数目     靶：    方向   SEQID：
 LCYSAKVIYBASPDB GTATGTTACTCTACCCTGATTGTATATCTCTTTAAACCTGGCAACCTGGCGTCCGGGGAAGCG   212121   111   RFHVMmDNA聚合酶   5′→3′3′→5′3′→5′   150151152
图19是显示本发明的某些寡核苷酸沿着DNA聚合酶的编码序列大致相对的杂交位置图。核苷酸残基的编号是大致的，并基于GlycoproteinB编码区域的起始位置，所述编码区在DNA聚合酶编码区的上游侧翼。每个寡核苷酸名称的后面是表示寡核苷酸类型的以小写表示的缩写：h＝所有疱疹病毒(Type 1)；sq＝可使用的另外的测序尾；g＝γ疱疹病毒(Type 1)；f＝RFHV/KSHV亚族疱疹病毒(Type 2)；m＝RFHVMm特异性(Type 3)；n＝RFHVMn特异性(Type 3)；ks＝KSHV特异性(Type 3)。
系统分析，CpG分析和由三种病毒引起的症状之间的相似性都支持使用猴病毒作为KSHV和可能感染人的RFHV/KSHV亚族其它成员的模型。
在筛选试验中使用寡核苷酸引物以检测多种生物样品中DNA聚合酶编码序列的存在，结果示于图20。豚尾猴#2，#3，#4，#7，#1和#5的RF样品结果分别示于泳道A-D，I和J。猕猴的RF样品结果示于泳道G&H。未受感染的SRV2-阴性豚尾猴的外周血淋巴细胞的结果示于泳道E&F。按下述使用嵌套PCR检测样品：对于豚尾猴样品，外部引物是VASGA和PEARB；内部引物是PEARB和PIEAB。对于猕猴样品，外部引物是FVEGA和KVIYB；内部引物是SPKDA和ASPDB。在这个和其它实验中，我们发现扩增产物的存在与样品的来源有两种方式的相关性：首先，扩增是病毒特异性的，RFHVMn特异性寡核苷酸不能扩增来自猕猴RF损害的序列，但RFHVMm特异性寡核苷酸可以。第二，没有RF-相关症状的豚尾猴样品不产生反应产物，甚至当其它病毒存在时也不产生。被SRV-2自然感染的多种组织中都不存在RFHVMn序列，所述组织包括胸腺，骨髓，脾，唾液腺，肝脏，肠系膜淋巴结，回盲肠的接合处，十二指肠，肾脏和性腺。实施例12：其它感染人的RFHV/KSHV亚族γ疱疹病毒的DNA聚合酶序列
冷冻保存怀疑含有上文未曾描述过的γ疱疹病毒，尤其是纤维增殖性疾病，淋巴细胞恶性肿瘤和与免疫缺损和免疫抑制相关之疾病，如急性呼吸道疾病综合症(ARDS)的人组织样品，按实施例2所述提取DNA。根据实施例3所述使用三个疱疹病毒寡核苷酸引物DFASA，VYGA和GDTD1B进行两轮PCR扩增。或者也可在此实施例中发现RFHV2时如前文所述使用亚族特异性(Type 2)引物。
在琼脂糖上电泳经扩增的多核苷酸并印迹到尼龙膜上。将印迹与经32P标记的，含有得自编码DNA聚合酶之RFHV多核苷酸的多核苷酸片段探针(图1的残基330-501)杂交。在允许探针和疱疹病毒DNA聚合酶之间形成稳定的双螺旋，但不允许探针与内源性的真核DNA聚合酶之间形成稳定双螺旋的条件下进行杂交反应。此条件需要探针和靶的杂交区段之间有大约60％的同一性以形成稳定的复合物。根据探针序列和靶的相应序列的长度，使用上文给出的公式计算这些条件。估计条件如下：a)允许探针在室温下，缺乏甲酰胺时，于6×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠缓冲液)中与靶杂交；和b)在室温下用2×SSC将新形成的双螺旋洗涤较短时间(5-10分钟)。
选择在这些条件下与经标记的探针杂交的经扩增的多核苷酸以进一步鉴定。对于与RFHV或KSHV相比没有插入或缺失、已用VYGA和GDTD1B作为内部引物进行扩增的病毒而言，包括引物结合区域的扩增的内部片段的预期大小是236碱基对。如实施例4所述测定片段的序列。通过与实施例9中相类似的方法选择含有与RFHV或KSHV不同之片段的样品以测定完整的DNA聚合酶基因序列。
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                                POL)JP 5309000      Iatron Lab Inc      (EBV POL的PCR检测)
                     序列表
    SEQ..ID    名称         描述   类型        来源
     1    RFHV   DNA聚合酶PCR区段   DNA       本发明
     2    RFHV   DNA聚合酶PCR区段  蛋白质       本发明
     3    KSHV   DNA聚合酶PCR区段   DNA       本发明
     4    KSHV   DNA聚合酶PCR区段  蛋白质       本发明
   5-12   疱疹病毒寡核苷酸   DNA       本发明
   13-16  RFHV特异性寡核苷酸   DNA       本发明
   17-20  KSHV特异性寡核苷酸   DNA       本发明
   21-22      RFHV/KSHV亚族寡核苷酸   DNA       本发明
    23    eHV2      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座EHVU20 824
    24    sHV1      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座HSVSPOLGBP
    25    EBV      DNA聚合酶   DNA   Genbank基因座EBV
    26    hCMV      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座HS5POL
    27    hHV6      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座HH6DNAPOL
    28    hVZV      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座HEVZVXX
    29    hHSV1      DNA聚合酶   DNA    Genbank基因座HEHSV1DP
    30    eHV2      DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座EHVU20824
    31    sHV1      DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座HSVSPOLGBP
   32    EBV     DNA聚合酶  蛋白质   Genbank基因座EBV
   33    hCMV     DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座HS5POL
   34    hHV6     DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座HH6DNAPOL
   35    hVZV     DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座HEVZVXX
   36    hHSV1     DNA聚合酶  蛋白质    Genbank基因座HEHSV1DP
   37    hHSV2     DNA聚合酶  蛋白质    PIR基因座DJBE21
   38    eHV1     DNA聚合酶  蛋白质    PIR基因座DJBEC3
   39    mCMV     DNA聚合酶  蛋白质    PIR基因座DJBEMC
   40    gpCMV     DNA聚合酶  蛋白质   PIR基因座L25706-B
   41    iHV1     DNA聚合酶  蛋白质    PIR基因座DJBEI1
   42    hHV6   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   43    hCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   44    gpCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   45    mCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   46    hHSV1   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   47    hHSV2   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   48    hVZV   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   49    eHV2   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   50    hEBV   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   51    sHV1   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   52    iHV1   DNA聚合酶区段   DNA         图3
   53    hHV6   DNA聚合酶区段   DNA         图4
   54    hCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图4
   55    gpCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图4
   56    mCMV   DNA聚合酶区段   DNA         图4
   57    hHSV1   DNA聚合酶区段   DNA         图4
   58    hVZV   DNA聚合酶区段   DNA         图4
    59    eHV2      DNA聚合酶区段   DNA     图4
    60    hEBV      DNA聚合酶区段   DNA     图4
    61    sHV1      DNA聚合酶区段   DNA     图4
    62    iHV1      DNA聚合酶区段   DNA     图4
    63    hHV6      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    64    hCMV      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    65    gpCMV      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    66    mCMV      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    67    hHSV1      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    68    hVZV      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    69    eHV2      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    70    sHV1      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    71    hEBV      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    72    iHV1      DNA聚合酶区段   DNA     图5
    73   IAETVTL     γ疱疹病毒抗原  蛋白质    本发明
   74-79    RFHV/KSHV亚族抗原  蛋白质    本发明
    80-103       RFHV或KSHV特异性抗原  蛋白质    本发明
   104    SIIQB   KSHV特异性寡核苷酸   DNA    本发明
   105    QAHNA   γ疱疹病毒寡核苷酸   DNA    本发明
   106    QAHNB   γ疱疹病毒寡核苷酸   DNA    本发明
   107-109     RFHV/KSHV亚族特异性寡核苷酸   DNA    本发明
   110    RFHV片段   共用的多核苷酸序列   DNA    本发明
   111    RFHV片段   共用的多核苷酸序列   DNA    本发明
   112    RFHV片段     共用的多肽序列  蛋白质    本发明
   113    KSHV片段     共用的多肽序列  蛋白质    本发明
   114   KSHV片段    KSHV片段    DNA     本发明
   115   KSHV片段    KSHV片段   蛋白质     本发明
   116   KSHV    DNA聚合酶区段    DNA     本发明
   117   KSHV    DNA聚合酶区段   蛋白质     本发明
   118   RFHV2    DNA聚合酶PCR区段    DNA     本发明
   119   RFHV2    DNA聚合酶PCR区段   蛋白质     本发明
   120   KSHV    DNA聚合酶变体   蛋白质     本发明
   121   KSHV    DNA聚合酶变体   蛋白质     本发明
   122   KSHV    DNA聚合酶变体   蛋白质     本发明
   123   KSHV    DNA聚合酶变体   蛋白质     本发明
   124-138    疱疹病毒(Type 1)寡核苷酸    DNA    本发明表10
   139-149    特异性寡核苷酸    DNA    本发明表11
   150-152    特异性寡核苷酸    DNA    本发明表14
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Claims (54)

1.含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有与选自SEQ.ID NO：1和SEQ.ID NO：3的核苷酸27-501至少有69％相同的核苷酸序列。
2.含有权利要求1之多核苷酸的DNA聚合酶编码区域中至少18个连串的核苷酸片段的分离的多核苷酸，其中SEQ.ID NOS：110或111中不含所述片段的序列。
3.含有权利要求1之多核苷酸的DNA聚合酶编码区域中至少50个连串的核苷酸片段的分离的多核苷酸。
4.权利要求2的分离的多核苷酸，它编码具有核酸结合活性，核苷酸结合活性，或DNA聚合酶活性的多肽。
5.含有编码疱疹病毒DNA聚合酶之区域的分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有与寡核苷酸LSGGA(SEQ.ID NO：107)至少有80％相同的26个核苷酸长的序列，或含有与寡核苷酸CTDPA(SEQ.ID NO：108)至少有69％相同的29个核苷酸长的序列，或含有与寡核苷酸KMLEA(SEQ. ID NO：22)至少有80％相同的32个核苷酸长的序列，或含有与寡核苷酸GISPA(SEQ.ID NO：109)至少有69％相同的29个核苷酸长的序列。
6.含有权利要求5之多核苷酸的DNA聚合酶编码区域中至少18个连串的核苷酸的片段，其中SEQ.ID NOS：110或111中不含所述片段的序列。
7.权利要求1或权利要求2的多核苷酸，其中所述疱疹病毒能够感染灵长类动物。
8.权利要求1或权利要求2的多核苷酸，其中所述疱疹病毒是RFHVRFHV2，或KSHV。
9.含有与SEQ. ID NO：1所含的核苷酸27-501之间，或SEQ.IDNO：3所含的核苷酸27-501之间，或SEQ.ID NO：116所含的核苷酸36-2499之间，或SEQ. ID NO：118所含的核苷酸1-454之间的线性序列至少有18个核苷酸相同，而不与SEQ.ID NO：110或SEQ. ID NO：111中所含的线性序列相同的线性序列的分离的多核苷酸。
10.权利要求9的分离的多核苷酸，含有基本上与SEQ. ID NO：1的核苷酸27-501，或SEQ.ID NO：3的核苷酸27-501，或SEQ.ID NO：116的核苷酸36-2499，或SEQ.ID NO：118的核苷酸1-454相同的线性序列。
11.由权利要求3的多核苷酸编码的分离的多肽。
12.分离的多肽，含有基本上与SEQ. ID NO：2所含氨基酸10-167之间，或SEQ ID NO：4所含氨基酸10-167之间，或SEQ.IDNO：117所含氨基酸13-833之间的序列，或与SEQ. ID NOS：119-123中的任-个所含的氨基酸序列至少有12个氨基酸相同的线性序列，但SEQ.ID NOS：112或SEQ.ID NO：113中不含该序列。
13.权利要求12的分离的多肽，具有核酸结合活性，核苷酸结合活性，或DNA聚合酶的活性。
14.含有与第二个氨基酸序列相连的权利要求12的分离肽氨基酸序列的融合多肽。
15.分离的多肽，含有与选自SEQ. ID NO：80，82，84，86，88，和90-103的氨基酸序列相同的线性序列。
16.编码权利要求12的多肽的分离的或非天然产生的多核苷酸。
17.编码融合多肽的多核苷酸，含有与编码多肽的第二多核苷酸直接相连的权利要求2的多核苷酸。
18.含有编码与根据权利要求12之多肽有至少12个连串的氨基酸相同之多肽的多核苷酸序列的重组克隆载体。
19.含有编码与根据权利要求12之多肽有至少12个连串的氨基酸相同之多肽的多核苷酸序列的重组表达载体。
20.含有编码疱疹病毒DNA聚合酶的线性序列的重组克隆载体，所述序列至少有18个核苷酸长并与SEQ.ID NOS：1，3，116，或118中所含的，而不是SEQ ID NOS：110或111中所含的线性序列相同。
21.在遗传上被权利要求16的多核苷酸，或权利要求18，19，或20的载体所改变的宿主细胞。
22.特异针对权利要求1多核苷酸的所述编码区所编码的DNA聚合酶的单克隆或分离的多克隆抗体。
23.特异针对权利要求12之多肽的单克隆或分离的多克隆抗体。
24权利要求22的抗体，它是单克隆抗体。
25.权利要求22的抗体，它是分离的多克隆抗体。
26.与选自SEQ ID NOS：5-16，21，22，104-109，和124-152的寡核苷酸基本上相同的寡核苷酸。
27.得到编码DNA聚合酶的多核苷酸的扩增拷贝的方法，包括步骤：
a)用权利要求26的寡核苷酸接触多核苷酸；并
b)延伸已与多核苷酸形成双螺旋的寡核苷酸。
28.权利要求27的方法，包含进行聚合酶链反应(PCR)。
29.权利要求28的方法，其中所述PCR包括退火和延伸的重复循环，其中退火在至少60℃的温度下进行。
30.权利要求28的方法，其中所述PCR在含有10-30mM(NH4)2SO4和1-10mM MgCl2的缓冲液中进行。
31.权利要求27的方法，其中被扩增的多核苷酸首先得自生物样品，所述生物样品取自患有以成纤维细胞增殖和胶原沉积为特征的疾病的个体。
32.检测来源于灵长类动物的样品中病毒DNA或RNA的方法，包括步骤：
a)将样品中的DNA或RNA与含有权利要求2的多核苷酸的探针接触，所处的条件应能允许探针与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。
33.权利要求32的方法，进一步包括在与探针接触之前对样品中的DNA或RNA进行扩增反应。
34.权利要求33的方法，其中使用含有根据权利要求26之序列的寡核苷酸引物进行扩增反应。
35.检测来源于灵长类动物的样品中病毒DNA或RNA的方法，包括步骤：
a)将样品中的DNA或RNA与含有SEQ.ID NOS：21，22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探针接触，所处的条件应能允许探针与具有SEQ. ID NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。
36.检测样品中病毒DNA或RNA的方法，包括步骤：
a)将样品中的DNA或RNA与含有SEQ.ID NOS：22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探针接触，所处的条件应能允许探针与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ. ID NOS：23-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。
37.检测样品中病毒DNA或RNA的方法，包括步骤：
a)在反应中使用权利要求26的寡核苷酸作为引物对样品中的多核苷酸进行扩增反应；和
b)如果有的话，检测多核苷酸扩增拷贝的存在。
38.能与含有选自SEQ. ID NO：107，SEQ. ID NO：108和它们各自的互补序列的序列的寡核苷酸形成稳定双螺旋的分离的多核苷酸，所处的条件中寡核苷酸能与具有SEQ.ID NO：1所示序列的多核酸，和具有SEQ.ID NO：3所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.ID NOS：23-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋。
39.含有由权利要求38之多核苷酸编码的12个氨基酸的线性序列的分离的多肽。
40.检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括检测得自个体的生物样品中的病毒DNA或RNA，其中通过权利要求32的方法检测病毒DNA或RNA。
41.检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括检测得自个体的生物样品中的病毒DNA或RNA，其中通过下列方法检测病毒DNA或RNA：
a)将样品中的DNA或RNA与含有权利要求2的多核苷酸的探针接触，所处的条件应能允许探针与具有选自SEQ.ID NOS：1，3，116，或118的至少一个序列的多核苷酸，而不与具有SEQ.IDNOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。
42.检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括检测得自个体的生物样品中的病毒DNA或RNA，其中通过下列方法检测病毒DNA或RNA：
a)将样品中的DNA或RNA与含有权利要求2的多核苷酸的探针接触，所处的条件应能允许探针与具有SEQ.ID NO：116中所示序列的多核苷酸，而不与具有SEQ. ID NOS：24-29中任一个的序列的多核苷酸形成稳定的双螺旋；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定双螺旋的存在。
43.检测生物样品中疱疹病毒多核苷酸的诊断试剂盒，它含有适当包装的试剂，其中试剂包括权利要求2的多核苷酸。
44.检测生物样品中疱疹病毒多核苷酸的诊断试剂盒，它含有适当包装的试剂，其中试剂包括权利要求26的寡核苷酸。
45.检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括下列步骤：
a)将得自个体的样品中的抗体与权利要求11或12的多肽接触，所处的条件能允许稳定的抗原-抗体复合物的形成；和
b)如果有的话，检测步骤a)中所形成的所述稳定复合物。
46.检测生物样品中存在的抗-疱疹病毒抗体的诊断试剂盒，它含有适当包装的试剂，其中试剂包括权利要求11或12的多肽。
47.检测疱疹病毒对个体的感染的方法，包括下列步骤：
a)将得自个体的样品中的多肽与权利要求22或23的抗体接触，所处的条件能允许稳定的抗原-抗体复合物的形成；和
b)如果有的话，检测步骤a)中形成的所述稳定复合物。
48.检测生物样品中存在的疱疹病毒多肽的诊断试剂盒，它含有适当包装的试剂，其中试剂包括权利要求22或23的抗体。
49.用于治疗疱疹病毒感染的组合物，包括权利要求2的多核苷酸和相容的药物赋形剂。
50.确定候选药物是否能用于治疗γ疱疹病毒感染的方法，包括下列步骤：
a)将权利要求11的多肽与候选药物接触；和
b)确定候选药物是否能改变多肽的生化功能。
51.权利要求50的方法，其中步骤b)中确定的多肽生化功能是多肽与核酸的结合。
52.权利要求50的方法，其中步骤b)中确定的多肽生化功能是DNA聚合酶的活性。
53.确定候选药物是否能用于治疗γ疱疹病毒感染的方法，包括下列步骤：
a)使用权利要求2的多核苷酸在遗传上改变细胞；和
b)与未被多核苷酸在遗传上改变的细胞相比确定候选药物对细胞的影响。
54.得到用于治疗被疱疹病毒感染之个体的化合物的方法，包括下列步骤：
a)产生能与涉及与核酸的相互作用的权利要求11或12的多肽区结合的化合物；和
b)确定化合物是否干扰多肽的生化功能。
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