KR101382734B1 - ＨＢＶ의 ｐｒｅＳ1 Ｗ4Ｐ 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ＨＢＶ 유전체 및 이의 용도 - Google Patents

ＨＢＶ의 ｐｒｅＳ1 Ｗ4Ｐ 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ＨＢＶ 유전체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

HBV의 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체, 상기 HBV 유전체를 포함하는 발현시스템, 상기 HBV 유전체로부터 생성된 HBV 변이주 및 이를 이용한 HBV 감염 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법이 제시되어 있다. 본 발명의 HBV 유전체는 외피 항원의 합성을 유도하고 유전체 복제 및 비리온 생성능이 높아, B형 간염 바이러스를 타겟으로 하는 HBV 감염 치료용 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하며, 기타 HBV 비리온 형성 및 복제와 관련된 간질환의 악화 유도 기전 발굴의 도구로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＢＶ의 ｐｒｅＳ1 Ｗ4Ｐ 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ＨＢＶ 유전체 및 이의 용도 {HBV genome comprising a nucleotide sequence encoding W4P preS1 varaint and use thereof}
본원은 B형 간염 바이러스의 W4P 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체 및 그 용도에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (HBV)는 전세계적으로 약 3억명 이상이 감염되어 있으며, 급/만성 간염, 간경변증, 또는 간세포암 등에 이르게 한다.
HBV의 감염은 무증상 감염, 만성 간염, 간경변, 간세포암으로 이행하는 다양한 임상경과를 보이며, 이러한 임상경과에 영향을 미치는 요인으로서, HBV 염기서열 변이와 HBV 유전자형(genotype)이 주목받고 있는데, 최근의 연구결과에 의하면 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전형 C를 가지는 것으로 보고되고 있다(Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42(6):496-501(2003)).
대부분의 HBV가 유전형 B와, 유전형 B에 비해 상대적으로 병원성이 높은 것으로 알려진 유전형 C가 동등한 수준으로 발견되는 것과는 달리, 국내 환자에서 발견되는 HBV는 유전형 C를 높은 빈도로 포함하며, 지역 특이적인 변이주를 발생시킬 가능성이 높기 때문에, 이에 대한 관심이 증폭되고 있으나, 뚜렷한 치료법은 아직 개발되지 않은 상태로, 새로운 표적, 기전에 근거한 치료제 발굴 방법 및 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 간세포암(HCC, Hepatocelluar carcinoma)은 성별에 따라 발생빈도가 다른 것으로 알려져 있다(W. E. Naugler et al., Science 317:121(2007)). 성별에 따른 간세포암 발생 빈도는 전세계적으로 2.9:1(남성:여성)의 비율로 나타나고(Shimizu, I., et al. World J. Gastroenteology, 13(32):4295(2007)), 국내에서는 남성이 여성에 비해 3~5 배 정도 더 빈번하게, 전세계적인 인구를 대상으로 한 수치보다 높게 나타난다(대한민국 통계청, 2007년).
쥐를 이용한 HCC 모델에서는 성별에 따른 발생빈도의 차이가 사람에서보다 더 뚜렷하며, 수컷 생쥐에 에스트로겐을 투여하면 화학적 암유발물질(chemical carcinogen)에 의해 유도되는 HCC의 발생을 억제할 수 있다고 한다(W. E. Naugler et al., Science 317:121(2007)).
대한민국 공개특허 제2008-0114290호는 복제능 및 감염성이 증가된 C형 간염 바이러스 변이주로서, JFH-1의 NS5A 유전자 C-말단 또는 NS5B 유전자 N-말단의 특정 아미노산이 돌연변이된 변이주를 개시하고 있다.
대한민국 공개특허 제2007-0030168호는 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자에 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실을 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며 항-HBV제에 대하여 감수성이 감소된 분리된 HBV 변이체를 개시하고 있다.
미국 등록특허 제7485312호는 HBV의 표면 단백질(HBsAg) 변이체 및 상기 변이체 단백질의 용도를 개시하고 있다.
그러나, B형 간염으로부터 유래된 다양한 임상적 증상에 있어서, HBV의 변이된 간염 바이러스 유전체가 비리온 합성과 증식을 유도할 것이라는 가정 하에 그에 따른 연구를 하고 있으나 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이며, 상기 특허문헌은 preS1 변이 및 이의 용도에 대하여는 개시하고 있지 않으며, 돌연변이의 타겟이나 돌연변이의 내용 및 이로 인한 발명의 용도가 본 발명과는 구별되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 HBV의 합성과 증식을 유도할 수 있는 W4P preS1 유전자 변이를 보유하는 B형 간염 바이러스 유전체 및 그 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, HBV (Hepatitis B virus, B형 간염바이러스)의 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체를 제공한다. 상기 변이체는 preS1 항원 단백질의 특정 위치의 아미노산을 암호화하는 유전자 코드가 트립토판에서 프롤린을 암호화하도록 유전자가 변이된 것이다. 본원에 따르면 상기 preS1 W4P 유전자 변이를 가진 유전형 A 또는 유전형 C의 HBV 유전체가 W4P preS1 변이 단백질의 발현으로 인해 HBsAg의 합성을 유도하고 유전체의 복제 및 비리온의 생성능이 야생주보다 더 높은 것을 확인하였다.
본원은 또한 상기 HBV 유전체는 A형 또는 C형인 HBV유전체를 제공하며, 한 구현예에서 상기 A형 HBV 유전체는 서열번호 1의 염기서열 중 1433 번째부터 4674 번째까지의 염기서열을 가지며, 상기 C형 HBV 유전체는 서열번호 2의 염기서열 중 1448 번째부터 4694 번째까지의 염기서열을 갖으나, 이로 한정하는 것은 아니며, 동일 유형에서도 서열변이가 나타날 수 있으며, 이도 본원에 포함된다.
본원은 또한 본원에 따른 HBV 유전체는 감염성 또는 비감염성 바이러스의 생성 증가, 또는 감염성 및 비감염성 바이러스 생성을 모두 증가시키는 것인 HBV 유전체를 제공하며, 상기 비감염성 및 감염성 바이러스 생성은 외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, HBV의 W4P preS1 유전자 변이를 가지는 HBV 유전체를 포함하는 발현 시스템, 상기 발현 시스템이 도입된 숙주세포 및 상기 HBV 유전체로부터 생성된 HBV 변이주를 제공한다. 상기 HBV의 preS1 W4P 유전자 변이를 가지는 HBV 유전체를 포함하는 발현 시스템은 일예로 상기 변이를 가지는 유전체를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 구현예에서 상기 벡터는 서열번호 1 또는 2로 나타낸다. 상기 발현 시스템이 도입된 숙주 세포는 예를 들어 상기 발현 벡터로 형질감염(transfection), 형질전환(transformation) 또는 형질도입(transduction)된 것이다. 본원의 벡터가 도입될 수 있는 것이라면, 당업자라면 원하는 목적에 맞추어 적절한 세포를 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 숙주세포로는 Huh7 세포주, HepG2 세포주, Chang 세포주 등을 포함하는 간세포주를 예로 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면,
i) 본원에 따른 유전체 또는 HBV 변이주로 감염된 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 샘플에 HBV 감염 치료용 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
iii) 상기 후보 화합물이 샘플 내 HBV 변이주의 활성을 저해하는지 여부를 평가하는 단계를 포함하는, HBV 감염 치료용 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 HBV 변이주의 활성은 감염성 또는 비감염성 바이러스 생성을 측정하여 결정할 수 있으며, 상기 비감염성 및 감염성 바이러스 생성은 외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 HBV의 W4P preS1 유전자 변이를 포함하는 유전체는 비리온을 대량으로 복제할 수 있는 특성이 있기 때문에, 국내의 B형 간염 및 이로 인한 질환의 치료를 위한 치료제 스크리닝을 목적으로 하는 여러 생물학적 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 HBV 유전체는 외피 항원 (HBsAg)의 합성을 유도하고 비리온을 대량으로 복제 가능할 수 있는 특성이 있기 때문에, B형 간염 바이러스를 타겟으로 하는, HBV 감염 치료용 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하며, 기타 HBV 비리온 형성 및 복제와 관련된 간질환의 악화 유도 기전의 연구에도 사용될 수 있다.
도 1A와 도 1B는 HBV의 W4P preS1 유전자 변이를 보유한 유전형 A (genotype A)와 유전형 C (genotype C)의 유전체가 각각 삽입된 벡터의 간단한 유전자 지도를 나타낸 것이다. 유전형 A의 1.1x HBV 게놈을 포함하고 있는 pHY92 벡터와 유전형 C의 1.2x HBV 게놈을 포함하고 있는 pRC CMV 벡터를 이용하여 W4P preS1 HBV 변이주를 제작하기 위하여 위치 지향 돌연변이법(site directed mutagenesis)를 이용하여 preS1 W4P 유전자 변이를 보유한 유전형 A의 유전체와 유전형 C의 유전체를 완성하였다. 이들 벡터의 유전자 지도에서 pCMV는 사이토메갈로바이러스의 프로모터이다. preS1 W4P 변이를 포함하는 유전형 A의 유전체와 유전형 C의 유전체는 B형 간염바이러스의 코어, 외피항원, 폴리머라제, 및 x 의 4개의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하고 있다.
도 2는 preS1 W4P 유전자 변이를 보유한 전체 HBV에서 발현된 large 외피 항원에 면역침전을 행한 분석결과이다. 유전형 A 또는 유전형 C의 W4P preS1 변이를 가지는 HBV 유전체를 각각 포함하는 플라스미드를 서로 독립적으로 Huh7 (사람 간세포암 세포주) 세포에 형질감염시켜 3일간 배양한 세포에서 단백질을 회수하여 발현된 항원 단백질을 면역침전법으로 확인하였다.
도 3은 HBV의 preS1 W4P 유전자 변이를 보유한 HBV 유전체의 비리온 형성능을 관찰한 HBsAg ELISA 결과이다. HBV의 W4P preS1 유전자 변이를 보유한 유전형 A 의 유전체와 유전형 C의 유전체를 Huh7 (사람 간세포암 세포주)에 형질 감염 시킨 후 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양하였다. 24시간 간격으로 배지를 모아 분비된 비리온을 HBsAg ELISA를 이용하여 관찰하였다.
도 4는 HBV의 preS1 W4P 유전자 변이를 보유한 HBV 유전체의 비리온 복제능을 관찰한 실시간 정량 PCR 결과이다. HBV의 W4P preS1 유전자 변이를 보유한 A 형 유전체와 C형 유전체를 각각 지니는 벡터를 서로 독립적으로 Huh7 에 형질감염시켜 72시간 후 세포 내와 세포 외에 복제된 비리온을 관찰하기 위하여 세포와 배지에서 비리온 DNA를 회수하였다. 상기 회수된 DNA를 주형으로 하고 외피 항원 유전자를 검출할 수 있는 프라이머와 SYBR green을 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하였다.
이하, 명세서에 사용된 용어의 정의를 포함하여 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.
본원에서는 B형 간염 바이러스(HBV)의 preS1 단백질에서 4번째 아미노산이 트립토판(W)에서 프롤린(P)으로 변이된 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 HBV 유전체를 제작하였고, 상기 HBV 유전체는 외피 항원 (HBsAg)의 합성을 유도하고 유전체 복제능 및 비리온 생성능력이 야생주보다 훨씬 더 높음을 확인하였다.
HBV 변이주 중에서 preS1 부위의 유전자 변이, 특히 결손(deletion) 유전자 변이(Hsieh YH et al., Carcinogenesis 25:2023-2032(2004))와 preS1의 시작 부위의 유전자 변이(Raimondo G et al., J Hepatol 40:515-519(2004))가 간질환의 악화, 특히 간세포암과 관련이 있다고 알려져 있다. preS 부위는 preS1 부위와 preS2 부위로 이루어져 있으며 이들은 S 항원과 함께 1개의 ORF로 구성되어 있고, 각각 S 항원과 같은 C 말단을 공유하는 Large S 항원과 Middle S 항원을 코딩한다.
preS1 부위는 HBV에 대한 T 및 B 세포 수준에서의 숙주 면역반응의 표적이 되는 부위를 갖고 있으며, 이 부위의 유전자 변이가 급발성 간염 및 간세포암과 연관되어 있다고 알려져 있다. 이 preS1 부위의 염기서열 변이가 간질환의 악화에 영향을 미치는 기전은 아직까지 확실하게 알려져 있지 않지만, 유전자 변이가 Large S 항원, Middle S 항원 및 Small S 항원 세 단백질의 발현 비율에 영향을 미쳐서 결국 세포 밖으로 이 단백질들이 분비되지 않고 세포 내 소포체(Endoplasmic Reticulum, ER)에 축적되기 때문에 세포독성이 유발된 결과일 가능성이 있다(Chisari FV and Ferrari C. Annu Rev Immunol. 13:29-60(1995)). preS1 부위의 이러한 일반적 기능에도 불구하고, 아미노산 수준에서의 감염과정에서의 기능과 역할에 대하여는 알려진 바 없다.
이에, 한 양태에서 본원은 HBV(Hepatitis B virus)의 preS1 부위의 4번째 아미노산 잔기가 트립토판에서 프롤린으로 변이된, preS1 W4P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체에 관한 것이다.
본원에 따른 HBV 유전체는 상기 변이를 포함하는 한, 다양한 유형의 HBV 유전체가 본원에 포함된다. 본원의 한 구현예에서는 A형 또는 C형이 포함되며, 1.1 x(배), 1.2x, 1.35x 및 1.5x와 같은 유전체가 포함된다. 특히 1.1 배의 HBV의 유전형 A 또는 1.2 배의 유전형 C이다. 동일한 유형에서도 서열변이가 나타날 수 있으며, 이러한 것도 본원의 범위에 포함된다. 한 구현예에서, 본원에 따른 HBV 유전체는 이러한 유전체는 서열번호 1의 염기서열 중 1433 번째부터 4674번째까지의 염기서열을 가지며, C형의 경우, 서열번호 2의 염기서열 중 1448 번째부터 4694 번째까지의 염기서열을 가진다.
본원에 따른 HBV 유전체는 감염성 또는 비감염성 바이러스의 생성 증가, 또는 감염성 및 비감염성 바이러스 생성을 모두 증가시킨다. 비감염성 바이러스란 외피는 있으나 내부에 HBV 유전체가 전혀 포함되어 있지 않거나 비리온 생성에 부적합한 유전체를 포함하는 것을 의미한다. 상기 비감염성 및 감염성 바이러스 생성은 예를 들면 외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 'W4P preS1 변이 단백질'이란 preS1 항원 단백질의 4번(preS1부터 4번째) 아미노산을 암호화하는 유전자 코드가 tgg에서 ccg로 변이된 결과 생긴 번역 산물로 preS1부터 4번째 아미노산이 트립토판(W)에서 프롤린(P)으로 치환된 단백질을 말한다. 또한, 용어 preS1 유전자 변이는 상기 W4P preS1 변이 단백질'을 코딩하는 유전자에 생긴 변이를 말한다.
본 명세서에서, 용어 '뉴클레오티드'는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지는 핵산 분자의 기본 구성 단위이며, 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오티드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HBV 유전체는 적합한 유전자 운반체(gene carrier)에 탑재되어 세포주의 형질전환에 이용될 수 있다. 상기 유전자 운반체로서 W4P preS1 변이 단백질 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체는 적합한 발현 시스템, 예컨대 발현 벡터나 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 벡터 또는 발현 컨스트럭트는 "프로모터-W4P preS1 변이 단백질 코딩 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 서열-폴리아데닐화 서열"을 포함한다.
상기 발현 벡터 또는 발현 컨스트럭트에서, W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전체는 프로모터에 동작가능하게(작동적으로) 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 '동작가능하게 연결된'은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 상기 발현 벡터 또는 발현 컨스트럭트에서 이용 가능한 프로모터는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 벡터 또는 발현 컨스트럭트는 이용 가능한 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 이용될 수 있는 발현 벡터 백본은 당업계에 공지된 것으로 HBV 유전체의 발현에 적합한 다양한 벡터로부터 필요에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, pHY92 벡터, pRC CMV 벡터, pIRES2-EGFP 발현벡터, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, YIp5 벡터, YCpl9 벡터, 엡스테인-바 바이러스 벡터, pMSG 벡터, pAV009/A+ 벡터, pMAMneo-5 벡터, 배큘로바이러스 pDSVE 벡터, pSecTag2B 벡터 또는 yT&A 벡터가 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 pHY92 벡터 또는 pRC CMV가 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 pHY92 벡터에 삽입되어 있는 1.1배의 유전형 A의 HBV의 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 pRC CMV 벡터에 삽입되어 있는 1.2배의 유전형 C의 HBV의 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 기재되어 있으며, 이러한 변이는 위치 지향 돌연변이 PCR과 같은 당업계의 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
한 구현예에서 본원에 따른 HBV의 W4P preS1 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체는 pHY92 벡터에 삽입될 수 있으며 예를 들면 서열번호 1로 나타낼 수 있으며, 다른 구현예에서 pRCCMV 벡터에 삽입될 수 있으며, 예를 들면 서열번호 2로 나타낼 수 있다.
본원은 또한 HBV의 preS1 W4P 변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전체의 발현 시스템에 관한 것이다. 발현 시스템이란 표적 핵산의 직접적 발현 또는 폴리펩타이드의 생산 및/또는 어샘블리에 사용되는 물질을 언급하는 것으로, 특정 형태로 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 벡터(플라스미드)를 기본으로 할 수 도 있으며, 유전체 그 자체일 수도 있다. 한 구현예에서 상기 발현 시스템은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 따른 HBV 유전체를 포함하는 벡터이다. 본원의 시스템에 사용될 수 있는 벡터 및 프로모터에 관하여는 앞서 서술한 바와 같다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 유전체 또는 발현시스템으로 형질전환된/감염/형질도입된 세포를 제공한다. 이러한 세포는 이로 제한하는 것이나, HBV 유전체의 복제, 증식, 비리온의 형성, 분비 등의 목적을 달성할 수 있는 세포주로, HBV 바이러스로 감염될 수 있거나/있고 또는 바이러스를 전파할 수 있는 세포, 특히 진핵세포, 특히 불멸화되어 실험실에서 증식이 가능한, 예를 들면 Huh7, HepG2, 또는 Chang 세포주를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또다른 양태에서 본원은 본원에 따른 HBV 유전체로부터 생성된 preS1 W4P 변이를 갖는 HBV 변이주를 제공한다. 상기 변이주는 HBV 유전체는 물론 생성된 비리온을 포함하는 것이다. 비리온이란, 감염성이 있는 구조적으로 온전한 (intact) 바이러스 입자를 말하는 것이다.
또다른 양태에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 HBV 감염 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 i) 본원에 따른 유전체 또는 HBV 변이주로 감염된 샘플을 제공하는 단계; ii) 상기 샘플에 HBV 감염 치료용 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 iii) 상기 후보 화합물이 샘플 내 HBV 변이주의 활성을 저해하는지 여부를 평가하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 상기 HBV 변이주의 활성은 감염성 및/또는 비감염성 바이러스 생성을 측정하는 것이다. 상기 비감염성 및/또는 감염성 바이러스 생성은 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있으며, 예를 들면 감염성 및 비감염성 바이러스 생성외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있다.
상기 본원에 따른 HBV 유전체 또는 변이주로 감염된 샘플은 다양한 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 인간을 포함한 동물로부터 수득한 예를 들면 간조직에 본원에서 제작된 HBV 유전체를 전달이입하여 사용할 수 있다. 또한 상기 조직 또는 Huh7 세포 같은 적절한 세포 주에 본원의 유전체를 도입하여 생성된 비리온으로 감염된 조직 또는 세포일 수 있다. 또한 예를 들면 Huh7(Kim et al., (2001). "Through induction of juxtaposition and tyrosine kinase activity of Jak1, X-gene product of hepatitis B virus stimulates Ras and the transcriptional activation through AP-1, NF-kappaB, and SRE enhancers." Biochem Biophys Res Commun 286(5): 886-94) , Hep3B (ATCC HB 8064), HepG2 및 Chang 세포주 (Ariffin et al., (2009) "Intrinsic anticarcinogenic effects of Piper sarmentosum ethanolic extract on a human hepatoma cell line" Cancer Cell International, 9:6) 와 같은 적절한 세포주에 본원에 따른 HBV 유전체가 전달이입된 것일 수 있다. 상기 HBV 변이주의 활성은 감염능 (외피 항원 발현능), 비리온 복제와 비리온 형성/방출 능에 의해 측정될 수 있으며, 외피 항원 발현능은 단순히 바이러스 외피 항원의 발현만을 의미하는 것으로 이는 바이러스 내에 DNA 가 포함되지 않은 비감염성, 및 감염성 바이러스의 형성을 모두 포함하는 것이며, 유전체 또는 비리온 복제 및 형성능의 측정은 감염성 바이러스의 활성이 있는 것을 의미한다. 이러한 활성의 측정방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것과 같은 방법으로 측정될 수 있다. 본원에서 비리온과 관련돼서 사용된 용어, 복제능, 생성능, 형성능, 분비능은 서로 교환적으로 사용된다.
상기 방법에서 상기 후보 화합물이 샘플 내 HBV 변이주의 활성을 저해하는지 여부를 평가하기 위해, 비교 대상으로 대조군을 이용한 스크리닝이 함께 수행될 수 있다. 대조군이란 후보 화합물 처리 후 변화된 활성을 관찰하기에 적합한 샘플을 의미하는 것으로, 본원에 따른 본원과는 상이한 HBV 변이주로 감염된 샘플이나, 후보물질로 처리되지 않은 샘플, 기존에 알려진 간질환 치료 효과가 알려진 물질로 처리된 샘플, 또는 본원에 따른 변이를 포함하지 않는 대조군 HBV 유전체로 감염된 샘플을 예로 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
이런 측면에서 본원의 방법은 한 구현예에서 대조군 샘플을 제공하는 단계, 대조군 샘플에 후보 화합물을 처리하는 단계 및 후보 화합물이 샘플 내 HBV 변이주의 활성을 저해하는지 여부를 대조군에서 수득한 결과와 비교하여 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.
실험결과 대조군과의 비교를 통하여 후보 화합물로의 처리에 의해 활성을 감소시키는 경우를 후보물질로 선별할 수 있다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 HBV 감염 치료용 후보 화합물 (또는 시험 물질)은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme)이다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "비드 1-화합물"라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 및 면역학 분야의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 또한 Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley &Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt &Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley &Sons 1998)을 참조할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)을 참조할 수 있다.
실시예 1 : W4P preS1 유전자 변이를 포함하는 HBV 유전체 제작
1-1 HBV preS1 항원 발현 HBV 벡터의 제작 - W4P preS1 유전자 변이를 가지는 전체 HBV 벡터 컨스트럭트 제작을 위한 위치지향 돌연변이
W4P 변이주가 이를 포함하는 전체 게놈 HBV 상태에서 비리온 생성과 증식능, 유전체 복제능 및 large 항원 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 위치 지향 돌연변이법(site directed-mutagenesis) 벡터 컨스트럭트를 다음과 같이 제작하였다. Delaney W et al.(Antiviral Res 2004;61:27-36)로부터 제공받은 pHY92 벡터는 완전한 1.1X단위 길이 HBV 게놈 (유전형 A, serotype adw2, HBV strain identical to GenBank #AF305422)을 포함하고 있고 (도 1A 및 도 1B 참조). pHBV 1.2X 벡터 (Jung GH et al.,Gastroenterology 2005;128:2042-2053)는 유전형 C이고 혈청형(serotype) adr인 preS1에 15bp 결손이 있는 전체 HBV 게놈을 포함하고 있다(도 1A 및 도 1B 참조).
상기 pHY92 벡터는 본원에서 설계한 CCG-muta-F (5'-AAC AAG AGC TAC AGC ATG GGA GGT CCG TCA TCA AAA CCT C -3')와 CCG-muta-R (5'- GAG GTT TTG ATG ACG GAC CTC CCA TGC TGT AGC TCT TGT T-3')를 프라이머로 이용하고, pHBV 1.2X는 1.2X-CCG-F (5'- CAA GAG CTA CAG CAT GGG AGG TCC GTC TTC CAA ACC TCG A-3')와 1.2X-CCG-R (5'- TCG AGG TTT GGA AGA CGG ACC TCC CAT GCT GTA GCT CTT G-3')을 이용하여 위치 지향 돌연변이 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 반응 시약으로 i-pfu DNA Polymerase (2.5 U의 i-pfu DNA Polymerase, 10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgCl2, 0.25mMdNTP; iNtRON Biotechnology INC., Kyungki-Do, Korea)를 이용하고, 96-well cycler (Model 9600 thermalcycler, Applied Biosystems, USA)에서 초기 변성 반응 94℃ 5분; 94℃ 45초, 52℃ 45초, 72℃ 7분의 15 사이클 증폭반응; 및 최종 연장 반응 72℃ 10분의 PCR 조건으로 수행하였다.
증폭된 PCR 산물은 별도의 정제 과정없이 삽입 유전자로 사용하여 Top10 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 컴피턴트 세포에 도입(42℃, 30초간 열 충격)하고 상기 세포를 앰피실린 (SIGMA-ALDRICH, INC., St. Louis, MO, USA)이 첨가된 LB 플레이트에서 배양하여 다음과 같이 목적 유전자의 삽입 여부 및 서열변이를 확인하였다. 유전자 변이 양상을 확인하기 위하여 PureYield Plasmid Maxiprep kit (Promega Co., Madison, WI, USA) 을 제조자의 지시대로 사용하여 DNA를 추출한 후, 이들을 주형으로 Del-preS1 R (5’- ATG CTC CCR CTC CTA CCK GAT - 3’) 프라이머를 사용하여 직접 염기서열 분석방법 (BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction V. 2)으로 형광 373A DNA sequencer (Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 분석된 염기서열은 Chromas 2.13 (Technelysium, AU) 과 DNAStar 사(USA) 프로그램을 이용하여 변이를 확인 하였다. 수득된 서열은 pHY92 HBV 는 CMV 프로모터를 포함하여 3963bp 이고 pHBV 1.2X 는 3805bp 이었다.
본원의 변이를 포함하는 HBV 유전체를 포함하는 제작된 벡터 pHY92- Genotype A 1.1x-CCG 및 pRC CMV- Genotype C 1.2x-CCG는 각각 서열번호 1 및 2로 나타냈다.
세포주의 배양
사람 간세포암 Huh7 세포주(한국세포주은행, Korean Cell Line Bank)는 RPMI 1640 배지에 (Hyclon, USA) 10% 우태아혈청(Invitrogen Co., USA)과, 2 mmol/ml L-글루타민, 100 ㎍/ml 페니실린과 100 units/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
실시예 2 : PreS1 의 W4P 유전자 변이를 포함하는 전체 HBV 게놈을 이용한 large 외피 항원 단백질 발현 분석
100mm 디쉬에 Huh7 세포 4x106 개를 플레이팅 한 후, 실시예 1에서 제작된 야생형 전체 게놈 HBV와 W4P 변이를 포함하는 전체 게놈 HBV를 β-갈락토사이다제 유전자를 포함하는 pCMV-β-gal 벡터와 공트랜스펙션(co-transient transfection)을 하였다. 상기 pCMV-β-gal 벡터와의 co-transient 트랜스펙션은 트랜스펙션 효율을 보정하기 위한 것이다.
W4P 변이를 포함하는 전체 간염 바이러스의 비리온의 외피 항원 발현을 관찰하기 위하여 상기 트랜스펙션 후 3일 배양하여 세포 펠렛을 모아 단백질을 추출하여 다음과 같이 면역침전을 수행하였다. 우선, 준비된 단백질 시료에 Protein A/G Plus-Agarose 면역침전시약 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 20㎕를 넣어 4°C에서 두 시간 동안 선제거(pre-clearing)를 수행하고, 이어 상기 선제거가 수행된 융해물(lysate) 400㎍의 단백질에 Protein A/G Plus-Agarose 면역침전시약 (Santa Cruz Biotechnology)을 20㎕ 첨가한 뒤 4㎍의 1차 항체 (preS1 특이적 단일클론 항체, anit-AP1, Aprogen, Daejeon, Korea)를 넣어 4°C에서 24시간 반응시켰다. 다음날 2000rpm에서 원심 분리하고 씻어준 후 다시 단백질 융해(lysis) 용액 50㎕로 현탁한 뒤 2차 항체(anti-mouse-IgG- HRP-conjugate (Invitrogen, Carland, USA))를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다.
그 결과, 유전형 A에 W4P preS1 변이가 포함된 HBV 유전체는 야생형에 비해 약 3배, 유전형 C에 W4P preS1 변이가 포함된 HBV 유전체는 야생형에 비해 약 1.5배가량 large 외피 항원 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다(도 2 참조).
실시예 3 : W4P 변이주를 포함한 전체 HBV 게놈을 이용한 HBV 비리온 생성능 분석
실시예 2에서 같이 100mm 디쉬에 Huh7 세포 4x106 개를 주입하여 야생형 전체 HBV 게놈과 W4P 변이를 포함하는 유전형 A와 유전형 C의 전체 HBV 게놈을 각각 β-갈락토사이다제 유전자를 포함하는 pCMV-β-gal 벡터와 co-transient 트랜스펙션하였다. 상기 pCMV-β-gal 벡터와의 co-transient 트랜스펙션은 트랜스펙션 효율을 보정하기 위한 것이다.
상기 트랜스펙션 후 3일 동안 매 24 시간마다 배지를 교체해 주면서 배양하여 24시간 마다 상층액을 모으고, 이를 분석하기 위하여 HBsAg을 검출할 수 있는 일반화된 Bioelisa HBsAg colour ELISA Kit (BIOKIT S.A., Barcelona, Spain)을 제공된 실험지침에 따라 사용하여 ELISA를 수행하였다.
그 결과, 형질감염 뒤 48시간 후부터 비리온이 형성이 증가하기 시작하며 72시간에는 유전형 A의 유전체와 유전형 C의 유전체 모두 야생형 HBV 유전체에 비해 약 1.8 배 비리온 분비 또는 형성능이 증가함을 확인하였다(도 3 참조).
실시예 4 : W4P 변이주를 포함한 전체 HBV 게놈을 이용한 HBV 유전체 복제 능 분석
간염 바이러스 preS1 W4P 유전자 변이주를 보유한 B형 간염바이러스 유전체 복제능 (비리온 생성능)을 관찰하기 위한 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 실시예 3에 기술된 것과 같은 방법으로 24시간마다 배지를 교체해 주면서 교체한 상층액 전체를 모아 비리온 DNA를 추출하여 QuantiTech SYBR Green Master-Mix kit(Qiagen, USA)를 제조자의 지침대로 사용하여 실시간 정량 (real-time quantitative) PCR 을 수행하였다.
전체 상층액은 SW28 스윙 로터로 20,000rpm에서 2시간 동안 초원심분리기로 바이러스를 침전시킨 후, 침전된 바이러스 펠렛을 멸균된 증류수 200㎕로 풀어주었다. 비리온 DNA를 추출하기 위해 100㎍/ml RNase A를 처리하고 용해 완충액 (0.25% SDS, 0.25M Tris, 0.25M EDTA) 100ul를 첨가한 후 proteinase K 를 500㎍/ml 을 넣어 37℃에서 2시간 반응시킨 뒤 페놀:클로로포름 방법으로 추출하여 주형 DNA를 준비하였다. 바이러스의 S 항원 부위를 표적으로 하는 실시간 PCR 프라이머 (SF-Real, 5’-TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA CC-3’; SR-Real, 5’-GGA GGT TGG GGA CTG CGA AT -3’)를 제작하고, 96 웰플레이트에 12.5㎕ IQ SYBR Green supermix (Biorad, California, USA), 1.25㎕ SF-Real 프라이머, 1.25㎕ SR-Real 프라미어, 9㎕ 멸균증류수, 1㎕ cDNA를 첨가하고 Exicycler™ 96 Real Time Quantitative Thermal Block system (Bioneer Co., Korea)를 이용하여 실시간 PCR 을 수행하였다. 실험 조건은 95 ℃에서 5분, 94 ℃에서 15초, 60 ℃에서 15 초로 40 주기를 수행하였고 이어 멜팅커브 분석을 위하여 95℃ 10초, 53℃ 30초와 초당 0.1℃씩 조절하여 53℃에서 90℃까지 온도를 상승시켰다. 모든 반응은 동일한 시료를 세쌍 씩으로 진행하였다.
그 결과, 야생형 HBV 유전체에 비해 세포 내에서는 preS1 W4P 변이를 보유한 유전형 A 형 유전체는 약 35배, preS1 W4P 변이를 보유한 유전형 C 형 역시 8배 이상 증가된 복제능을 나타내었다 (도 4 참조). 세포 외에서는 야생형 HBV 유전체에 비해 두 유전형의 유전체 모두 약 두 배 정도 복제능이 증가되는 것을 확인하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 2497 내지 2499번에 해당하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 B형 간염 바이러스 (HBV) A형 preS1 단백질의 아미노산 서열 중 4번째 서열이 트립토판에서 프롤린; 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 2468 내지 2470번에 해당하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 B형 간염 바이러스 (HBV) C형 preS1 단백질의 아미노산 서열 중 4번째 서열이 트립토판에서 프롤린으로 치환된, HBV 변이주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 치환은 감염성 또는 비감염성 바이러스의 생성 증가, 또는 감염성 및 비감염성 바이러스 생성을 모두 증가시키는 것인 HBV 변이주.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 비감염성 및 감염성 바이러스 생성은 외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있는, HBV 변이주.
  7. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 1433 번째부터 4674 번째까지의 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 중 1448 번째부터 4694 번째까지의 서열 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열로 표시되는 것인, 벡터.
  10. 제 7 항 또는 제 9 항에 따른 벡터로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 숙주 세포.
  11. 삭제
  12. i) 제 1 항에 따른 HBV 변이주로 감염된 샘플 또는 제 10 항에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계;
    ii) 상기 샘플에 HBV 감염 치료용 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
    iii) 상기 후보 화합물이 샘플 내 HBV 변이주의 활성을 저해하는지 여부를 평가하는 단계를 포함하는, HBV 감염 치료용 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 HBV 변이주의 활성은 감염성 또는 비감염성 바이러스 생성을 측정하는 것인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 비감염성 및 감염성 바이러스 생성은 외피 항원의 발현으로 측정될 수 있으며, 상기 감염성 바이러스의 생성은 유전체 복제능 또는 비리온 생성능으로 측정될 수 있는, 방법.
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