JP2002525130A - ヒトｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ｄｎａポリメラーゼのインビトロ活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびｈｂｖｄｎａポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにｈｂｖｄｎａポリメラーゼの産生方法 - Google Patents
ヒトｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ｄｎａポリメラーゼのインビトロ活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびｈｂｖｄｎａポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにｈｂｖｄｎａポリメラーゼの産生方法Info
- Publication number
- JP2002525130A JP2002525130A JP2000572415A JP2000572415A JP2002525130A JP 2002525130 A JP2002525130 A JP 2002525130A JP 2000572415 A JP2000572415 A JP 2000572415A JP 2000572415 A JP2000572415 A JP 2000572415A JP 2002525130 A JP2002525130 A JP 2002525130A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbv
- dna polymerase
- activity
- human
- polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼを簡便にインビトロ分析する。
【解決手段】 ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ活性の分析法であって、サンプルからのＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ増幅するときの５’オリゴヌクレオチドとして、ＳＰ６ウイルスプロモーターが導入されたオリゴヌクレオチドを用い、放射標識剤の存在下にＰＣＲ生成物を直接的に転写し翻訳し、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミングを測定する方法を提供する。更に、そのような分析法を用いて各種の血清サンプルの活性を分析して、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤をスクリーニングし、および／またはヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を抑制する抗ＨＢＶ剤の機能をスクリーニングする。
Description
【０００１】
本発明は、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ
活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびＨＢＶ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにＨＢＶ ＤＮＡ
ポリメラーゼの産生方法に関する。
活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびＨＢＶ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにＨＢＶ ＤＮＡ
ポリメラーゼの産生方法に関する。
【０００２】
ポリメラーゼは生物にとってきわめて重要な酵素の１つである。ポリメラーゼ
は、核酸の合成およびそれらをタンパク質の合成に必要な他の核酸に変化させる
のに関与する。したがって、ポリメラーゼは、あらゆる種類の細胞に存在し、こ
れにはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の原因となるＤＮＡウイルスも含まれる。
は、核酸の合成およびそれらをタンパク質の合成に必要な他の核酸に変化させる
のに関与する。したがって、ポリメラーゼは、あらゆる種類の細胞に存在し、こ
れにはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の原因となるＤＮＡウイルスも含まれる。
【０００３】 ＨＢＶは、最も知られた感染症の１種である肝炎の原因となり、これが進行し
た肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界中で最も知られた癌の１種である。現在ＨＢＶの感
染と疾病を予防する現在までの最も効果的な方法は、ＨＢＶに対する免疫を施す
ことである。現在許可されているＨＢＶワクチンは主要表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
から成るものであり、天然型（血漿由来）または組換型（酵母細胞から精製）の
いずれかの形態がある。ワクチンによって誘起された抗体は、ＨＢｓＡｇの１２
４から１４７の残基に位置する最も抗原性の高い「ａ」エピトープに結合して、
ＨＢＶ複製に対して効果的な中和をもたらすことが見出されている。
た肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界中で最も知られた癌の１種である。現在ＨＢＶの感
染と疾病を予防する現在までの最も効果的な方法は、ＨＢＶに対する免疫を施す
ことである。現在許可されているＨＢＶワクチンは主要表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
から成るものであり、天然型（血漿由来）または組換型（酵母細胞から精製）の
いずれかの形態がある。ワクチンによって誘起された抗体は、ＨＢｓＡｇの１２
４から１４７の残基に位置する最も抗原性の高い「ａ」エピトープに結合して、
ＨＢＶ複製に対して効果的な中和をもたらすことが見出されている。
【０００４】 そのようなワクチン接種プログラムによりＨＢＶの集団的な感染は減少したが
、「ａ」エピトープ内に位置する変異体も増加している。ワクチンによって誘起
されたこれらのＨＢＶ変異体は、現在の免疫系に基く診断システムから逃れるこ
とができ且つ独立して複製する能力を有する点において、興味深い。
、「ａ」エピトープ内に位置する変異体も増加している。ワクチンによって誘起
されたこれらのＨＢＶ変異体は、現在の免疫系に基く診断システムから逃れるこ
とができ且つ独立して複製する能力を有する点において、興味深い。
【０００５】 ＨＢｓＡｇの「ａ」エピトープ上の変異は、オーバーラップＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼにおけるアミノ酸の置換、特に逆転写酵素ドメイン内の位置に置換を
もたらすという事実は、ワクチンによって誘起された変異体は、ウイルス複製に
とって重要な因子である逆転写酵素活性を変化させているということを示してい
るのかも知れない。
リメラーゼにおけるアミノ酸の置換、特に逆転写酵素ドメイン内の位置に置換を
もたらすという事実は、ワクチンによって誘起された変異体は、ウイルス複製に
とって重要な因子である逆転写酵素活性を変化させているということを示してい
るのかも知れない。
【０００６】 ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体の逆転写によりゲノムを複製するＤＮＡウイルスであ
る。このＲＮＡプレゲノム（ゲノム前駆体）のヌクレオキャプシドへのパッケジ
ングおよび複製の開始は、主として、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼとエンキャプ
シデーションシグナルとの相互作用に依存する。ＲＮＡプレゲノムにはエンキャ
プシデーションシグナルの２種類のコピーが存在する。プライミング反応に対し
ては、５’コピーのみが鋳型として機能する。マイナス鎖ＤＮＡ合成が開始され
た後、未知の機構によりＤＮＡオリゴマー（４ヌクレオチド）がＲＮＡプレゲノ
ムの３’端に移され、それに相補的な配列とハイブリダイズする。しかる後、Ｒ
ＮＡ鋳型の５’末端に向かって逆転写が続行する。ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ
とＲＮＡプレゲノムの相互作用は、ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に位置するチロ
シン残基とエンキャプシデーションシグナル内の特定のヌクレオチドとの共有結
合として生じる。ＨＢＶ逆転写酵素は、大きなＤＮＡポリメラーゼ内の４つのド
メインの１つである。他のドメインとは、ｉ）Ｎ末端タンパク質（これは、該ポ
リメラーゼがＲＮＡプレゲノムに共有結合するのに関与する）、ii）突然変異に
寛容なスペーサー領域、iii）ｍRNA中間体の分解に関与するＲＮＡｓｅＨドメイ
ンである。
る。このＲＮＡプレゲノム（ゲノム前駆体）のヌクレオキャプシドへのパッケジ
ングおよび複製の開始は、主として、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼとエンキャプ
シデーションシグナルとの相互作用に依存する。ＲＮＡプレゲノムにはエンキャ
プシデーションシグナルの２種類のコピーが存在する。プライミング反応に対し
ては、５’コピーのみが鋳型として機能する。マイナス鎖ＤＮＡ合成が開始され
た後、未知の機構によりＤＮＡオリゴマー（４ヌクレオチド）がＲＮＡプレゲノ
ムの３’端に移され、それに相補的な配列とハイブリダイズする。しかる後、Ｒ
ＮＡ鋳型の５’末端に向かって逆転写が続行する。ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ
とＲＮＡプレゲノムの相互作用は、ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に位置するチロ
シン残基とエンキャプシデーションシグナル内の特定のヌクレオチドとの共有結
合として生じる。ＨＢＶ逆転写酵素は、大きなＤＮＡポリメラーゼ内の４つのド
メインの１つである。他のドメインとは、ｉ）Ｎ末端タンパク質（これは、該ポ
リメラーゼがＲＮＡプレゲノムに共有結合するのに関与する）、ii）突然変異に
寛容なスペーサー領域、iii）ｍRNA中間体の分解に関与するＲＮＡｓｅＨドメイ
ンである。
【０００７】 他のポリメラーゼと同様に、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ活性の
検出結果を利用して、下記の３つのようなことを行うことができる。 ・複製性ウイルスとして新たに単離されたウイルスの特性を把握し既知の他のウ
イルスとの相違を評価すること。これは、特に、表面抗原の変異型と関係する。
・感染患者の被検物質からウイルスが単離されたことを確認する。 ・抗ウイルス剤と成り得るようなポリメラーゼインヒビターのインビトロ性能を
評価すること。
検出結果を利用して、下記の３つのようなことを行うことができる。 ・複製性ウイルスとして新たに単離されたウイルスの特性を把握し既知の他のウ
イルスとの相違を評価すること。これは、特に、表面抗原の変異型と関係する。
・感染患者の被検物質からウイルスが単離されたことを確認する。 ・抗ウイルス剤と成り得るようなポリメラーゼインヒビターのインビトロ性能を
評価すること。
【０００８】 ウイルスの複製および他のウイルスタンパクの非存在下におけるＨＢＶ ＤＮ
Ａポリメラーゼのインビトロ活性を測定するには各種の手法が確立されている。
興味深い発見の一つは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミング活性が検出
できるようになるためには、Ｎ末端タンパク質のみならず、機能的な逆転酵素ド
メインも必要であるということである。したがって、これらの手法の共通の特徴
の１つは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性の指標となるＨＢＶ ＤＮＡポリメ
ラーゼのプライミング活性を検出することである。
Ａポリメラーゼのインビトロ活性を測定するには各種の手法が確立されている。
興味深い発見の一つは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミング活性が検出
できるようになるためには、Ｎ末端タンパク質のみならず、機能的な逆転酵素ド
メインも必要であるということである。したがって、これらの手法の共通の特徴
の１つは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性の指標となるＨＢＶ ＤＮＡポリメ
ラーゼのプライミング活性を検出することである。
【０００９】 そのような手法の内、２つはアヒルＨＢＶ（ＤＨＢＶ）ポリメラーゼを利用す
るものであり、そしていずれの手法においても、逆転写酵素活性が鋳型に依存し
タンパク質をプライミングすることを示している。ＤＨＢＶ法のうちの一方は、
ＤＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ翻訳を利用して機能的ＤＮＡポリメ
ラーゼを含有するリゼート（溶解物）を得るものであり、もう一方は、ＤＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼの活性な融合タンパク質を酵母のレトロトランスポゾンＴ
ｙｌ由来のウイルス様粒子内にパッケージするものである。活性なＤＮＡポリメ
ラーゼは、そのプライミング活性によって測定されており、プライミングヌクレ
オチドの存在下における放射標識化タンパク質（すなわち、ＤＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼに対する[α−32Ｐ]）が指標とされる。最近、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼに関して同様の分析法（アッセイ）が報告されている。報告されてい
る全てのコンストラクトにおいて、エンキャプシデーションシグナルを含有する
ポリメラーゼの３５０塩基対の３’非コード領域が含まれており、これがインビ
トロ活性の分析に重要である旨指摘されている。
るものであり、そしていずれの手法においても、逆転写酵素活性が鋳型に依存し
タンパク質をプライミングすることを示している。ＤＨＢＶ法のうちの一方は、
ＤＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ翻訳を利用して機能的ＤＮＡポリメ
ラーゼを含有するリゼート（溶解物）を得るものであり、もう一方は、ＤＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼの活性な融合タンパク質を酵母のレトロトランスポゾンＴ
ｙｌ由来のウイルス様粒子内にパッケージするものである。活性なＤＮＡポリメ
ラーゼは、そのプライミング活性によって測定されており、プライミングヌクレ
オチドの存在下における放射標識化タンパク質（すなわち、ＤＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼに対する[α−32Ｐ]）が指標とされる。最近、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼに関して同様の分析法（アッセイ）が報告されている。報告されてい
る全てのコンストラクトにおいて、エンキャプシデーションシグナルを含有する
ポリメラーゼの３５０塩基対の３’非コード領域が含まれており、これがインビ
トロ活性の分析に重要である旨指摘されている。
【００１０】 ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ活性の分析法（アッセイ）の直
接的な応用の一つは、新規な抗ウイルス剤をスクリーニングすることであろう。
慢性的なＨＢＶ感染の抗ウイルス剤療法には未だ課題が残されており、幾つかの
臨床試験が示すところによれば、インターフェロンまたはヌクレオシドアナログ
に対して持続的な応答を示すのは被検患者の３０〜４０％にすぎない。長期ＨＢ
Ｖキャリヤーおよび免疫無防備患者においては、この応答比率は更に低くなって
しまう。多くの患者が該ウイルスの感染を取り除くことができずに、肝臓病の進
行および（原発性）肝細胞癌（ＨＣＣ）になる大きな危険性を有しているので、
ＨＢＶを除去する化学療法に対する新しいプロトコールの設計が求められている
。さらに、ヒトＨＢＶ表面抗原変異に対するそのような薬剤による抗ウイルス作
用を評価することに特に関心がもたらされている。
接的な応用の一つは、新規な抗ウイルス剤をスクリーニングすることであろう。
慢性的なＨＢＶ感染の抗ウイルス剤療法には未だ課題が残されており、幾つかの
臨床試験が示すところによれば、インターフェロンまたはヌクレオシドアナログ
に対して持続的な応答を示すのは被検患者の３０〜４０％にすぎない。長期ＨＢ
Ｖキャリヤーおよび免疫無防備患者においては、この応答比率は更に低くなって
しまう。多くの患者が該ウイルスの感染を取り除くことができずに、肝臓病の進
行および（原発性）肝細胞癌（ＨＣＣ）になる大きな危険性を有しているので、
ＨＢＶを除去する化学療法に対する新しいプロトコールの設計が求められている
。さらに、ヒトＨＢＶ表面抗原変異に対するそのような薬剤による抗ウイルス作
用を評価することに特に関心がもたらされている。
【００１１】 しかしながら、これまでに確立されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのイン
ビトロ活性分析法を用いる抗ウイルス試験には制限が存する。その制限の一つは
、これまでに確立されている全ての手法において、ウイルスのポリメラーゼプロ
モーター（例えばＳＰ６またはＴ７）の制御下にあるようにプロモーター（例え
ばＳＰ６またはＴ７）の制御下にあるようにＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコー
ド領域をプラスミド（例えばｐＧＥＭ−Ｔ）に配置するクローニング工程が必要
とされていることである。ＨＢＶの変異が多数であることを考慮すると、このよ
うな煩雑な操作は実用的でない。
ビトロ活性分析法を用いる抗ウイルス試験には制限が存する。その制限の一つは
、これまでに確立されている全ての手法において、ウイルスのポリメラーゼプロ
モーター（例えばＳＰ６またはＴ７）の制御下にあるようにプロモーター（例え
ばＳＰ６またはＴ７）の制御下にあるようにＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコー
ド領域をプラスミド（例えばｐＧＥＭ−Ｔ）に配置するクローニング工程が必要
とされていることである。ＨＢＶの変異が多数であることを考慮すると、このよ
うな煩雑な操作は実用的でない。
【００１２】
本発明に従えば、先ず、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡのインビトロ
活性を分析する方法であって、サンプルからＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをＰＣ
Ｒ増幅する際の５’オリゴヌクレオチドとして、ＳＰ６ウイルスポリメラーゼプ
ロモーターが導入されたオリゴヌクレオチドを用いること、真核細胞を含まない
リゼート中でＰＣＲ生成物を直接転写し翻訳させること、および、放射性標識剤
の存在下にＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミングを測定することから成る
方法が提供される。
活性を分析する方法であって、サンプルからＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをＰＣ
Ｒ増幅する際の５’オリゴヌクレオチドとして、ＳＰ６ウイルスポリメラーゼプ
ロモーターが導入されたオリゴヌクレオチドを用いること、真核細胞を含まない
リゼート中でＰＣＲ生成物を直接転写し翻訳させること、および、放射性標識剤
の存在下にＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミングを測定することから成る
方法が提供される。
【００１３】 さらに、本発明の第２の視点に従えば、本発明に従う上記の分析法を用いる、
各種血清サンプルの活性分析法および／またはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのイ
ンヒビター（阻害剤）のスクリーニング法が提供される。
各種血清サンプルの活性分析法および／またはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのイ
ンヒビター（阻害剤）のスクリーニング法が提供される。
【００１４】 本発明の第３の視点に従えば、本発明に従う上記の分析法を用いる、ヒトＨＢ
Ｖ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害能を有する抗Ｈ
ＢＶ薬剤の試験および／またはスクリーニング法が提供される。この方法は好ま
しくは次の工程を含む。 ａ）所定量のアッセイバッファー（分析緩衝液）に溶かした少なくとも１つのサ
ンプルを調製し、各サンプルに、鋳型として線状ＰＣＲ生成物、および、ステム
ループ構造を形成することのできる配列を含むＨＢＶマイナス鎖合成のＲＮＡ鋳
型を用いて無真核細胞（真核細胞を含まない）リゼート（溶解液）中でインビト
ロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を含有させる工程、 ｂ）前記アッセイバッファーと等量のアッセイバッファーに溶かしたコントロー
ル（対照）サンプルを調製し、該コントロールサンプルに、鋳型として線状ＰＣ
Ｒ生成物、および、（ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの結合およびプライミン
グに必須である）ステムループ構造を形成することのできる配列を含むＨＢＶマ
イナス鎖合成のＲＮＡ鋳型を用いてインビトロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼタンパク質を含有させる工程、 ｃ）それらのサンプルをインキュベートして、ＤＮＡポリメラーゼおよび放射性
標識剤から成るコンプレックス（複合体）を得る工程、 ｄ）アッセイバッファーからコンプレックスを分離する工程、および ｅ）分離された各コンプレックス中の放射性標識剤の量を測定して、ヒトＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工程。
Ｖ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害能を有する抗Ｈ
ＢＶ薬剤の試験および／またはスクリーニング法が提供される。この方法は好ま
しくは次の工程を含む。 ａ）所定量のアッセイバッファー（分析緩衝液）に溶かした少なくとも１つのサ
ンプルを調製し、各サンプルに、鋳型として線状ＰＣＲ生成物、および、ステム
ループ構造を形成することのできる配列を含むＨＢＶマイナス鎖合成のＲＮＡ鋳
型を用いて無真核細胞（真核細胞を含まない）リゼート（溶解液）中でインビト
ロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を含有させる工程、 ｂ）前記アッセイバッファーと等量のアッセイバッファーに溶かしたコントロー
ル（対照）サンプルを調製し、該コントロールサンプルに、鋳型として線状ＰＣ
Ｒ生成物、および、（ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの結合およびプライミン
グに必須である）ステムループ構造を形成することのできる配列を含むＨＢＶマ
イナス鎖合成のＲＮＡ鋳型を用いてインビトロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼタンパク質を含有させる工程、 ｃ）それらのサンプルをインキュベートして、ＤＮＡポリメラーゼおよび放射性
標識剤から成るコンプレックス（複合体）を得る工程、 ｄ）アッセイバッファーからコンプレックスを分離する工程、および ｅ）分離された各コンプレックス中の放射性標識剤の量を測定して、ヒトＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工程。
【００１５】 上記の工程ｃ）、ｄ）およびｅ）は下記の工程と置き換えることもできる。 ｃ）上述したような試験管とコントロール用試験管のそれぞれを、前記ＨＢＶマ
イナス鎖ＤＮＡに導入された第１のヌクレオチドを含む放射標識された三リン酸
ヌクレオチドの等量を用いて、前記ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプ
ライミング活性に好適な条件下にインキュベートして、前記ＤＮＡポリメラーゼ
と前記放射標識された三リン酸ヌクレオチドから成るコンプレックスを形成させ
る工程； ｄ）ニトロセルロース膜を用いたろ過により、前記試験管およびコントロール用
試験管のそれぞれのアッセイバッファーから前記コンプレックスを分離する工程
； ｅ）分離された各コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドの量を測定
して、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工
程； ｆ）前記試験管およびコントロール用試験管の各々のニトロセルロース膜に結合
して残存している分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドのそれ
ぞれの量を比較し、試験管の分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオ
チドの量の減少をコントロール用試験管と比較したものから、抗ＨＢＶ薬剤によ
る、ヒトＨＢＶ ＤＮＡのポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害
能を調べる工程。
イナス鎖ＤＮＡに導入された第１のヌクレオチドを含む放射標識された三リン酸
ヌクレオチドの等量を用いて、前記ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプ
ライミング活性に好適な条件下にインキュベートして、前記ＤＮＡポリメラーゼ
と前記放射標識された三リン酸ヌクレオチドから成るコンプレックスを形成させ
る工程； ｄ）ニトロセルロース膜を用いたろ過により、前記試験管およびコントロール用
試験管のそれぞれのアッセイバッファーから前記コンプレックスを分離する工程
； ｅ）分離された各コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドの量を測定
して、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工
程； ｆ）前記試験管およびコントロール用試験管の各々のニトロセルロース膜に結合
して残存している分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドのそれ
ぞれの量を比較し、試験管の分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオ
チドの量の減少をコントロール用試験管と比較したものから、抗ＨＢＶ薬剤によ
る、ヒトＨＢＶ ＤＮＡのポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害
能を調べる工程。
【００１６】 本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼに対する簡便な活
性アッセイ（分析法）に関し、この分析法は従来の分析法よりも迅速に行うこと
ができる。本発明の方法では、オリゴヌクレオチド内にＳＰ６ウイルスポリメラ
ーゼプロモーターを導入し、次にこれを、血清サンプルからＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼをＰＣＲ増幅するに際して５’オリゴヌクレオチドとして用いる。全コ
ード領域およびエンキャプシデーションシグナルを有する３’非コード領域を含
有するＰＣＲ生成物が、コムギ胚無細胞エクストラクト中で直接転写され翻訳さ
れる。中間体であるＲＮＡ鋳型へのＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミング
が、該酵素の活性の鍵となる指標であり、放射標識された[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの
存在下にこのプライミングを測定する。本発明の用途には、各種の血清サンプル
（主要表面抗原が変異したＨＢＶを有するものを含む）の活性をアッセイするこ
と、およびＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤をスクリーニングすることが挙
げられる。
性アッセイ（分析法）に関し、この分析法は従来の分析法よりも迅速に行うこと
ができる。本発明の方法では、オリゴヌクレオチド内にＳＰ６ウイルスポリメラ
ーゼプロモーターを導入し、次にこれを、血清サンプルからＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼをＰＣＲ増幅するに際して５’オリゴヌクレオチドとして用いる。全コ
ード領域およびエンキャプシデーションシグナルを有する３’非コード領域を含
有するＰＣＲ生成物が、コムギ胚無細胞エクストラクト中で直接転写され翻訳さ
れる。中間体であるＲＮＡ鋳型へのＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのプライミング
が、該酵素の活性の鍵となる指標であり、放射標識された[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの
存在下にこのプライミングを測定する。本発明の用途には、各種の血清サンプル
（主要表面抗原が変異したＨＢＶを有するものを含む）の活性をアッセイするこ
と、およびＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤をスクリーニングすることが挙
げられる。
【００１７】 本発明は、血清サンプルから増幅した線状ＤＮＡ鋳型から直接的にヒトＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼ活性をインビトロ分析する簡便な方法を提供するものであ
る。５’末端にＳＰ６ウイルスポリメラーゼプロモーターを含有する線状ＤＮＡ
鋳型の転写と翻訳を結合することにより、一般にコムギ胚無細胞系内で、活性分
析に関与するタンパク質が産生される。
ＤＮＡポリメラーゼ活性をインビトロ分析する簡便な方法を提供するものであ
る。５’末端にＳＰ６ウイルスポリメラーゼプロモーターを含有する線状ＤＮＡ
鋳型の転写と翻訳を結合することにより、一般にコムギ胚無細胞系内で、活性分
析に関与するタンパク質が産生される。
【００１８】 既述したような目的および他の目的を達成するため、本発明に従えば、血清サ
ンプルから増幅された線状ＤＮＡフラグメントから直接的にＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼを産生する方法が提供される。得られるタンパク質を[α−32Ｐ]ｄＴＴ
Ｐのような放射性標識剤の存在下に分析し、Ｂ型肝炎ウイルスの複製にきわめて
重要な過程であるプライミング活性を調べる。
ンプルから増幅された線状ＤＮＡフラグメントから直接的にＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼを産生する方法が提供される。得られるタンパク質を[α−32Ｐ]ｄＴＴ
Ｐのような放射性標識剤の存在下に分析し、Ｂ型肝炎ウイルスの複製にきわめて
重要な過程であるプライミング活性を調べる。
【００１９】
本発明は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性に特異的な簡便、高感度且つ迅速
な分析法を提供するものである。本発明は、次の工程から成り血清サンプルから
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性を検出する方法が含まれる。 ・フェノール／クロロホルムを用いて血清からＨＢＶ ＤＮＡをワンステップで
抽出する。 ・ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコード領域（２４００塩基対）およびその３’
非コード領域（３１０塩基対）をＰＣＲ増幅する。５’オリゴヌクレオチドは、
５’近辺にＳＰ６ウイルスポリメラーゼを含むようにする。 ・ＰＣＲ増幅生成物を鋳型としてＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをインビトロ翻訳
する。 ・翻訳されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを含有する抽出物について放射標識さ
れたプライミングヌクレオチドの存在下に活性分析する。
な分析法を提供するものである。本発明は、次の工程から成り血清サンプルから
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性を検出する方法が含まれる。 ・フェノール／クロロホルムを用いて血清からＨＢＶ ＤＮＡをワンステップで
抽出する。 ・ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコード領域（２４００塩基対）およびその３’
非コード領域（３１０塩基対）をＰＣＲ増幅する。５’オリゴヌクレオチドは、
５’近辺にＳＰ６ウイルスポリメラーゼを含むようにする。 ・ＰＣＲ増幅生成物を鋳型としてＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをインビトロ翻訳
する。 ・翻訳されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを含有する抽出物について放射標識さ
れたプライミングヌクレオチドの存在下に活性分析する。
【００２０】 本発明は、さらに、上記の方法を実施するための試薬、ポリメラーゼ活性や表
面抗原が変異したＨＢＶ変異体のポリメラーゼ活性に対する物質の阻害効果を測
定する方法も提供する。
面抗原が変異したＨＢＶ変異体のポリメラーゼ活性に対する物質の阻害効果を測
定する方法も提供する。
【００２１】 本発明に従えば、血清サンプルが、非特定のＤＮＡポリメラーゼ活性を有する
ＨＢＶ変異体を含有してもよい。本発明は、その定性的な測定を可能にする。Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性の定量的測定が必要な場合には、本発明の活性分析法を更
に進展させる（すなわち、プライミングされたＤＮＡポリメラーゼをニトロセル
ロース膜上で測定すればよい）。ＤＮＡポリメラーゼに対する或る分子の阻害能
を測定しようとする場合には、プライミングされたＤＮＡポリメラーゼの量を阻
害性分子の存在しないコントロール（対照）用サンプルから得られた量と比較す
ればよい。
ＨＢＶ変異体を含有してもよい。本発明は、その定性的な測定を可能にする。Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性の定量的測定が必要な場合には、本発明の活性分析法を更
に進展させる（すなわち、プライミングされたＤＮＡポリメラーゼをニトロセル
ロース膜上で測定すればよい）。ＤＮＡポリメラーゼに対する或る分子の阻害能
を測定しようとする場合には、プライミングされたＤＮＡポリメラーゼの量を阻
害性分子の存在しないコントロール（対照）用サンプルから得られた量と比較す
ればよい。
【００２２】 本発明の特徴を更に理解できるように、添付図面を参照しながら実施例に沿っ
て本発明を説明する。
て本発明を説明する。
【００２３】 図１は、ヒトＨＢＶのゲノム構造を線状化して示すものである。本発明のＰＣ
Ｒ増幅においては、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコード領域（ボックス）
およびその３’非コード領域（赤線）が含まれるようにした。下方の数字は、Ge
nBankで定義されているように、adwから成る野性型ヒトＨＢＶゲノムにおける位
置を表すものである。矢印は、ＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチドの位置と
方向を示し、それぞれの配列を矢印の上方（５’）および下方（３’）に示した
。ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの開始部分（コード領域の最初の２７塩基）にマ
ッチングする配列に加えて、ＳＰ６ウイルスプロモーター（ATTTAGGTGACACTATAG
AACTC）を５’オリゴヌクレオチドに導入する。５’センスオリゴヌクレオチド
の位置は、２３０９位から２３３５位までであり（矢印）、一方、３’アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは１９１７から１９４０の領域を含むものである（矢印
）。
Ｒ増幅においては、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのコード領域（ボックス）
およびその３’非コード領域（赤線）が含まれるようにした。下方の数字は、Ge
nBankで定義されているように、adwから成る野性型ヒトＨＢＶゲノムにおける位
置を表すものである。矢印は、ＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチドの位置と
方向を示し、それぞれの配列を矢印の上方（５’）および下方（３’）に示した
。ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの開始部分（コード領域の最初の２７塩基）にマ
ッチングする配列に加えて、ＳＰ６ウイルスプロモーター（ATTTAGGTGACACTATAG
AACTC）を５’オリゴヌクレオチドに導入する。５’センスオリゴヌクレオチド
の位置は、２３０９位から２３３５位までであり（矢印）、一方、３’アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは１９１７から１９４０の領域を含むものである（矢印
）。
【００２４】 図２は、野性型ＨＢＶを有する血清から単離したウイルスＤＮＡを用いて増幅
したＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す写真である。所期の２８００塩基対
から成るサイズを有するフラグメントは矢印で示されている。更に、「Ｍ」レー
ンには、分子サイズマーカー（１ｋｂのＤＮＡラダー、ＭＢＩ Fermentas）の
泳動位置が示されている。
したＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す写真である。所期の２８００塩基対
から成るサイズを有するフラグメントは矢印で示されている。更に、「Ｍ」レー
ンには、分子サイズマーカー（１ｋｂのＤＮＡラダー、ＭＢＩ Fermentas）の
泳動位置が示されている。
【００２５】 図３は、[35Ｓ]メチオニンの存在下にＰＣＲ増幅生成物から直接、コムギ胚リ
ゼート中でインビトロ翻訳された野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを示すオー
トラジオグラフである。所期の９０キロダルトン（ｋＤ）の[35Ｓ]標識化ヒトＨ
ＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示されている。左側に示しているのは、分子
サイズマーカー（Rainbowプロテイン泳動マーカー、Amersham製）の位置である
。
ゼート中でインビトロ翻訳された野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを示すオー
トラジオグラフである。所期の９０キロダルトン（ｋＤ）の[35Ｓ]標識化ヒトＨ
ＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示されている。左側に示しているのは、分子
サイズマーカー（Rainbowプロテイン泳動マーカー、Amersham製）の位置である
。
【００２６】 図４は、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの存在下における野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（コムギ胚リゼート中で合成）のインビトロのプライミング活性を示すオー
トラジオグラフである。所期のように９０キロダルトンから成る[α−32Ｐ]ｄＴ
ＴＰ標識化ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示している。左側に示して
いるのは、分子サイズマーカー（Rainbowプロテイン泳動マーカー、Amersham製
）の位置である。
ーゼ（コムギ胚リゼート中で合成）のインビトロのプライミング活性を示すオー
トラジオグラフである。所期のように９０キロダルトンから成る[α−32Ｐ]ｄＴ
ＴＰ標識化ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示している。左側に示して
いるのは、分子サイズマーカー（Rainbowプロテイン泳動マーカー、Amersham製
）の位置である。
【００２７】 図５は、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ存在下における野性型（レーン１）ならびに表面
抗原変異体‘Ｓ’１４５（レーン２）および‘Ｓ’１２６（レーン３）のＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのインビトロのプライミング活性を示すオートラジオグラ
フである。３種類のウイルス株の全てについて、所期の９０キロダルトンから成
る[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ標識化ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示されて
いるものである。左側に示しているのは、分子サイズマーカー（Rainbowプロテ
イン泳動マーカー、Amersham製）の位置である。
抗原変異体‘Ｓ’１４５（レーン２）および‘Ｓ’１２６（レーン３）のＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのインビトロのプライミング活性を示すオートラジオグラ
フである。３種類のウイルス株の全てについて、所期の９０キロダルトンから成
る[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ標識化ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは矢印で示されて
いるものである。左側に示しているのは、分子サイズマーカー（Rainbowプロテ
イン泳動マーカー、Amersham製）の位置である。
【００２８】 図６は、野性型のヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するヌクレオチドアナ
ログの抗プライミング効果をまとめたものである。各カラムは、ニトロセルロー
ス膜に残存する放射標識化されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ（ｃｐｍにより測
定）を表す。コントロールとは、ヌクレオチドアナログの非存在下におけるヒト
ＨＢＶポリメラーゼのインビトロのプライミング活性を示す。特定のヌクレオチ
ドアナログ存在下における活性分析の結果はそれぞれに応じて示しているとおり
である（すなわち、＋ｄｄＴＴＰとはｄｄＴＴＰ存在下の活性分析の結果である
）。ｄｄＴＴＰまたはｄｄＡＴＰのいずれかの存在下においてインキュベーショ
ンが行なわれた場合には、コントロールの場合に比べて、明らかな抗プライミン
グ効果が存しない。対照的に、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰについては、阻害（抑制
）効果が認められている。本発明による結果と同様の抗プライミング効果がラミ
ブジン（lamivudine）〔３’−チアシチジンの（−）エノンチオマーであり、Ｈ
ＢＶ複製の活性なＨＢＶキャリヤーの治療のために臨床的に広く用いられている
シトシンジデオキシヌクレオチドアナログ〕を添加した場合に認められる。一般的説明 野性型のＨＢＶのウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより血清サン
プルから抽出する。特定のオリゴヌクレオチドを用いて（図１参照）本発明の第
１の工程としてＰＣＲ増幅を行なう。５’センスヌクレオチドは、ＨＢＶ ＤＮ
Ａポリメラーゼのコード領域の最初の２７個のヌクレオチドにマッチしており、
且つ、その近辺端にＳＰ６プロモーターを有する。３’アンチセンスオリゴヌク
レオチドは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの停止コドンの３００塩基下流にマッ
チング領域を有する。得られる線状ＤＮＡ増幅生成物（２８００塩基対）（図２
）を、メーカー（米国Promega）のマニュアルに従い、直接、コムギ胚油無細胞
系内でインビトロ転写／翻訳に供する。
ログの抗プライミング効果をまとめたものである。各カラムは、ニトロセルロー
ス膜に残存する放射標識化されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ（ｃｐｍにより測
定）を表す。コントロールとは、ヌクレオチドアナログの非存在下におけるヒト
ＨＢＶポリメラーゼのインビトロのプライミング活性を示す。特定のヌクレオチ
ドアナログ存在下における活性分析の結果はそれぞれに応じて示しているとおり
である（すなわち、＋ｄｄＴＴＰとはｄｄＴＴＰ存在下の活性分析の結果である
）。ｄｄＴＴＰまたはｄｄＡＴＰのいずれかの存在下においてインキュベーショ
ンが行なわれた場合には、コントロールの場合に比べて、明らかな抗プライミン
グ効果が存しない。対照的に、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰについては、阻害（抑制
）効果が認められている。本発明による結果と同様の抗プライミング効果がラミ
ブジン（lamivudine）〔３’−チアシチジンの（−）エノンチオマーであり、Ｈ
ＢＶ複製の活性なＨＢＶキャリヤーの治療のために臨床的に広く用いられている
シトシンジデオキシヌクレオチドアナログ〕を添加した場合に認められる。一般的説明 野性型のＨＢＶのウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより血清サン
プルから抽出する。特定のオリゴヌクレオチドを用いて（図１参照）本発明の第
１の工程としてＰＣＲ増幅を行なう。５’センスヌクレオチドは、ＨＢＶ ＤＮ
Ａポリメラーゼのコード領域の最初の２７個のヌクレオチドにマッチしており、
且つ、その近辺端にＳＰ６プロモーターを有する。３’アンチセンスオリゴヌク
レオチドは、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの停止コドンの３００塩基下流にマッ
チング領域を有する。得られる線状ＤＮＡ増幅生成物（２８００塩基対）（図２
）を、メーカー（米国Promega）のマニュアルに従い、直接、コムギ胚油無細胞
系内でインビトロ転写／翻訳に供する。
【００２９】 [35Ｓ]メチオニンの存在下に合成すると、図３に示されるように８４３個のア
ミノ酸から成るポリメラーゼポリペプチドとして予期される約９０ｋＤの分子サ
イズのタンパク質生成物がインビトロ翻訳によって得られる。この結果は、ＤＨ
ＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイに関する以前の報告と一致しており、そ
して、更に重要なことには、線状ＰＣＲ増幅生成物を鋳型として用いることによ
りヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼが適切に翻訳されたということを示している
。
ミノ酸から成るポリメラーゼポリペプチドとして予期される約９０ｋＤの分子サ
イズのタンパク質生成物がインビトロ翻訳によって得られる。この結果は、ＤＨ
ＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイに関する以前の報告と一致しており、そ
して、更に重要なことには、線状ＰＣＲ増幅生成物を鋳型として用いることによ
りヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼが適切に翻訳されたということを示している
。
【００３０】 ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性を分析するために、放射標識されたアミ
ノ酸（すなわち、[35Ｓ]メチオニン）の非存在下に新たに合成されたポリメラー
ゼを含有するインビトロ翻訳反応混合物を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよ
び放射標識された[α−32Ｐ]ｄＴＴＰを含有する溶液中でインキュベートする。
プライミングされるポリメラーゼに導入されるヌクレオチドを標識（ラベル）す
るには、ヌクレオチドの分析分野で従来より用いられている任意のタイプのラベ
ル（例えば、蛍光ラベルや吸光ラベル）を用いることができるが、放射性ラベル
を使用するのが好ましい。[α−32Ｐ]ｄＴＴＰは、他の３種類のヌクレオチドに
比べてプライミング特異性が高いので本発明ではこれを用いる。
ノ酸（すなわち、[35Ｓ]メチオニン）の非存在下に新たに合成されたポリメラー
ゼを含有するインビトロ翻訳反応混合物を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよ
び放射標識された[α−32Ｐ]ｄＴＴＰを含有する溶液中でインキュベートする。
プライミングされるポリメラーゼに導入されるヌクレオチドを標識（ラベル）す
るには、ヌクレオチドの分析分野で従来より用いられている任意のタイプのラベ
ル（例えば、蛍光ラベルや吸光ラベル）を用いることができるが、放射性ラベル
を使用するのが好ましい。[α−32Ｐ]ｄＴＴＰは、他の３種類のヌクレオチドに
比べてプライミング特異性が高いので本発明ではこれを用いる。
【００３１】 使用するラベル（標識）のタイプに応じて、放射標識されプライミングされた
ポリメラーゼ生成物の検出は任意の適当な手段によって実施することができる。
これには、通常、プライミングされた放射標識化ポリメラーゼ生成物から標識化
モノヌクレオチド（すなわち、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ）を分離する工程が含まれる
。本発明においては、プライミング反応の生成物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析することが好ましい。図４は、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの
存在下における野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するプライミング活性分
析の結果を示すものである。オートラジオグラフィ−に供したときに所期のサイ
ズのタンパク質バンドが検出されることにより、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの
プライミング活性が示されている。
ポリメラーゼ生成物の検出は任意の適当な手段によって実施することができる。
これには、通常、プライミングされた放射標識化ポリメラーゼ生成物から標識化
モノヌクレオチド（すなわち、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ）を分離する工程が含まれる
。本発明においては、プライミング反応の生成物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析することが好ましい。図４は、[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの
存在下における野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するプライミング活性分
析の結果を示すものである。オートラジオグラフィ−に供したときに所期のサイ
ズのタンパク質バンドが検出されることにより、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの
プライミング活性が示されている。
【００３２】 ニトロセルロース膜を用いるろ過によりポリメラーゼ活性分析を行なうことも
可能である。好適な条件下では、ニトロセルロース膜上に保持されている極少量
の非結合[α−32Ｐ]ｄＴＴＰにより、プライミングされた放射標識化ポリメラー
ゼの結合を定量的に知ることができる。
可能である。好適な条件下では、ニトロセルロース膜上に保持されている極少量
の非結合[α−32Ｐ]ｄＴＴＰにより、プライミングされた放射標識化ポリメラー
ゼの結合を定量的に知ることができる。
【００３３】 以下に実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
されるものではない。
【００３４】
【実施例】実験方法一般 野性型のＨＢＶを保有する血清から以下のようにウイルスＤＮＡを単離した。
２００μｌの血清サンプルを４００μｌの溶解バッファー（塩化トリス１０ｍＭ
、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウム２％）、および２５μ
ｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、６５℃で３時間インキュベ
ートした。次に、フェノール／クロロホルムによりウイルスＤＮＡを抽出し、エ
タノールで沈殿させた。５’オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド
（AAATTTAGGTGACACTATAGAATATGCCCCTATCTTATCAACACTTCC）であり、その近辺端に
ＳＰ６プロモーターを含有し（下線を施した配列）、また、ＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼのコード領域の開始領域にマッチング領域を有した（野性型ＨＢＶゲノ
ムの２３０９から２３４０位）。３’オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（ACAGTAGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCA）であり、これは、ＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼの停止コドンの３００塩基対下流にマッチング領域を有した
（野生型ＨＢＶゲノムの１９４０から１９１１位）。したがって、得られたＰＣ
Ｒ生成物は、既発表の報告におけるものより短い（５０塩基対）ものであった。
[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）および[35Ｓ]メチオニン（１
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はAmershamから入手した。非標識のｄＡＴＰ、ｄＣＴ
ＰおよびｄＧＴＰはPromegaから入手した。
２００μｌの血清サンプルを４００μｌの溶解バッファー（塩化トリス１０ｍＭ
、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウム２％）、および２５μ
ｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、６５℃で３時間インキュベ
ートした。次に、フェノール／クロロホルムによりウイルスＤＮＡを抽出し、エ
タノールで沈殿させた。５’オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド
（AAATTTAGGTGACACTATAGAATATGCCCCTATCTTATCAACACTTCC）であり、その近辺端に
ＳＰ６プロモーターを含有し（下線を施した配列）、また、ＨＢＶ ＤＮＡポリ
メラーゼのコード領域の開始領域にマッチング領域を有した（野性型ＨＢＶゲノ
ムの２３０９から２３４０位）。３’オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（ACAGTAGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCA）であり、これは、ＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼの停止コドンの３００塩基対下流にマッチング領域を有した
（野生型ＨＢＶゲノムの１９４０から１９１１位）。したがって、得られたＰＣ
Ｒ生成物は、既発表の報告におけるものより短い（５０塩基対）ものであった。
[α−32Ｐ]ｄＴＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）および[35Ｓ]メチオニン（１
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はAmershamから入手した。非標識のｄＡＴＰ、ｄＣＴ
ＰおよびｄＧＴＰはPromegaから入手した。
【００３５】 特に註記しない限り、ポリメラーゼ活性の測定は、１００ｍＭのトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセ
ロール、４ｍＭのジチオスレイトール、各１００μＭの非標識デオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）および５μＣｉの[α
−32Ｐ]ｄＴＴＰを含有する溶液中で行なった。この反応系を３０℃で３０分間
インキュベートし、その後、トリシンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファー（米国Novex製）８
５μｌに５μｌのアリコートを添加し、さらに、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１
０μｌを分析した。電気泳動の後、ゲルを１０％メタノール＋１０％酢酸中に浸
漬することにより固定化し、真空乾燥した。乾燥ゲルをＸ線フィルムに露光し、
レーザーデンシトメトリーによりシグナルを定量した。実施例１：ＨＢＶ表面抗原変異体のポリメラーゼ活性分析 本発明に従うヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの簡便な分析法の直接的な用途
の一つは、主要表面抗原が変異したＨＢＶ変異体（特にワクチン接種（すなわち
、‘ｓ’１４５）によって誘起された変異体）の相対的活性を評価することであ
る。そのようなＨＢＶ変異体を含有する血清サンプルから上記のようにしてウイ
ルスＤＮＡを抽出した。本発明で用いる変異体は、‘ｓ’１４５（グリシンから
アルギニンへの変異）および‘ｓ’１２６（スレオニンからアラニンへの変異）
を含み、これらの変異は現在適用されている検出系を免れることができ独立して
複製することができるものである。同じオリゴヌクレオチド対を用い、該ウイル
スＤＮＡを鋳型としＴａｑポリメラーゼ（米国Promega製）を用いてＤＮＡサー
マルサイクラー（米国CetusのPerkin-Elmer製）で３５サイクルのＰＣＲ増幅を
行なった。各サイクルは、変性温度（９４℃）で１．５分間、アニ−リング温度
（５３℃）で２分間、および伸長温度（７２℃）で４分間とした。
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセ
ロール、４ｍＭのジチオスレイトール、各１００μＭの非標識デオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）および５μＣｉの[α
−32Ｐ]ｄＴＴＰを含有する溶液中で行なった。この反応系を３０℃で３０分間
インキュベートし、その後、トリシンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファー（米国Novex製）８
５μｌに５μｌのアリコートを添加し、さらに、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１
０μｌを分析した。電気泳動の後、ゲルを１０％メタノール＋１０％酢酸中に浸
漬することにより固定化し、真空乾燥した。乾燥ゲルをＸ線フィルムに露光し、
レーザーデンシトメトリーによりシグナルを定量した。実施例１：ＨＢＶ表面抗原変異体のポリメラーゼ活性分析 本発明に従うヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの簡便な分析法の直接的な用途
の一つは、主要表面抗原が変異したＨＢＶ変異体（特にワクチン接種（すなわち
、‘ｓ’１４５）によって誘起された変異体）の相対的活性を評価することであ
る。そのようなＨＢＶ変異体を含有する血清サンプルから上記のようにしてウイ
ルスＤＮＡを抽出した。本発明で用いる変異体は、‘ｓ’１４５（グリシンから
アルギニンへの変異）および‘ｓ’１２６（スレオニンからアラニンへの変異）
を含み、これらの変異は現在適用されている検出系を免れることができ独立して
複製することができるものである。同じオリゴヌクレオチド対を用い、該ウイル
スＤＮＡを鋳型としＴａｑポリメラーゼ（米国Promega製）を用いてＤＮＡサー
マルサイクラー（米国CetusのPerkin-Elmer製）で３５サイクルのＰＣＲ増幅を
行なった。各サイクルは、変性温度（９４℃）で１．５分間、アニ−リング温度
（５３℃）で２分間、および伸長温度（７２℃）で４分間とした。
【００３６】 ＳＰ６を含有し且つ各変異ＨＢＶから増幅されたＰＣＲ生成物をコムギ胚無細
胞系に添加した。メーカー（米国のPromega）によって与えられた指示に従って
、連結したインビトロの転写／翻訳を実施した。略述すると、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼ、アミノ酸混合物（[35Ｓ]メチオニンは不存在）、ＲＮＡｓｅインヒビ
ターおよび反応バッファーが補足されたコムギ胚抽出物２５μｌに、１０μｌの
ＰＣＲ生成物を添加し、得られた反応混合物を３０℃で６０分間インキュベート
した。こうして得られ翻訳されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを含有する抽出物
を「実験方法一般」に記載した溶液に添加し、上述したようにポリメラーゼ活性
を分析した。図５の分析結果が示すように、変異‘Ｓ’１４５（レーン２）また
は‘Ｓ’１２６（レーン３）のいすれかのＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは、野性
型酵素（レーン１）に類似のプライミング活性を有する。このような方法の代わ
りに、レーザーデンシメトリーによって定量的な測定を行ってもよく、これによ
って、プライミングされた放射標識化ポリメラーゼの強さを比較することができ
る。実施例２：ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインヒビター試験 ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するインヒビター（阻害剤）をスクリー
ニングすることは、ＨＢＶ感染に対する新しい治療剤を提供することになると考
えられる。ポリメラーゼ活性を効果的に阻害すれば、ＨＢＶウイルスの複製が抑
制されるからである。本発明に従う簡便な活性アッセイ（分析法）によれば、主
要表面抗原が変異したＨＢＶ変異体のＤＮＡポリメラーゼに対して、新たに見出
された分子が奏する阻害効果を迅速に分析することができる。すなわち、候補と
なる阻害剤を、先ず、既述したように本発明に従ってＰＣＲ増幅されインビトロ
翻訳された野性型のヒトＨＢＶ ＤＮＡとともにインキュベートした。インキュ
ベーションは[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの存在下で且つ他の条件は上述したのと同じに
して行なった。阻害効果の測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後にレーザーデンシ
メトリーを行うか、または、ろ過の後に、ニトロセルロース膜に結合した放射標
識化ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの量を測定することにより行なう。ここで注目
すべきことは、このような抗ウイルス剤の阻害機能の分析法は、ＨＢＶ変異体（
ワクチンによって誘起される変異‘Ｓ’１４５を含む）にも簡単に適用できるこ
とであり（図５）、これも本発明に包含されるものである。さらに、上述したア
ッセイに従う阻害機能の分析法は、他の系、例えば、ＨＢＶ産生細胞系およびト
ランスジェニック動物モデルにも拡張できる。
胞系に添加した。メーカー（米国のPromega）によって与えられた指示に従って
、連結したインビトロの転写／翻訳を実施した。略述すると、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼ、アミノ酸混合物（[35Ｓ]メチオニンは不存在）、ＲＮＡｓｅインヒビ
ターおよび反応バッファーが補足されたコムギ胚抽出物２５μｌに、１０μｌの
ＰＣＲ生成物を添加し、得られた反応混合物を３０℃で６０分間インキュベート
した。こうして得られ翻訳されたＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを含有する抽出物
を「実験方法一般」に記載した溶液に添加し、上述したようにポリメラーゼ活性
を分析した。図５の分析結果が示すように、変異‘Ｓ’１４５（レーン２）また
は‘Ｓ’１２６（レーン３）のいすれかのＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼは、野性
型酵素（レーン１）に類似のプライミング活性を有する。このような方法の代わ
りに、レーザーデンシメトリーによって定量的な測定を行ってもよく、これによ
って、プライミングされた放射標識化ポリメラーゼの強さを比較することができ
る。実施例２：ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインヒビター試験 ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するインヒビター（阻害剤）をスクリー
ニングすることは、ＨＢＶ感染に対する新しい治療剤を提供することになると考
えられる。ポリメラーゼ活性を効果的に阻害すれば、ＨＢＶウイルスの複製が抑
制されるからである。本発明に従う簡便な活性アッセイ（分析法）によれば、主
要表面抗原が変異したＨＢＶ変異体のＤＮＡポリメラーゼに対して、新たに見出
された分子が奏する阻害効果を迅速に分析することができる。すなわち、候補と
なる阻害剤を、先ず、既述したように本発明に従ってＰＣＲ増幅されインビトロ
翻訳された野性型のヒトＨＢＶ ＤＮＡとともにインキュベートした。インキュ
ベーションは[α−32Ｐ]ｄＴＴＰの存在下で且つ他の条件は上述したのと同じに
して行なった。阻害効果の測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後にレーザーデンシ
メトリーを行うか、または、ろ過の後に、ニトロセルロース膜に結合した放射標
識化ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの量を測定することにより行なう。ここで注目
すべきことは、このような抗ウイルス剤の阻害機能の分析法は、ＨＢＶ変異体（
ワクチンによって誘起される変異‘Ｓ’１４５を含む）にも簡単に適用できるこ
とであり（図５）、これも本発明に包含されるものである。さらに、上述したア
ッセイに従う阻害機能の分析法は、他の系、例えば、ＨＢＶ産生細胞系およびト
ランスジェニック動物モデルにも拡張できる。
【００３７】 標識されたハイブリッドＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ生成物の検出は、用いた
標識（ラベル）の種類に応じて、任意の適当な手段により行なうことができる。
一般的に、これには、標識されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼから標識され
たモノヌクレオチドを分離する工程が含まれる。好ましい態様においては、サン
プル混合物（この時点では、標識されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼと標識
された過剰のモノヌクレオチドを含有している）をニトロセルロース膜を通して
ろ過することによって、検出を行なう。結合されていない過剰の標識化モノヌク
レオチドはニトロセルロース膜を通りぬけるが、標識されたハイブリッドポリメ
ラーゼ反応性生物はニトロセルロース膜上に捕獲される。上述の本発明に従う簡
略な分析法におけるように標識（ラベル）が放射性標識である場合には、次に、
プレートを読み取るシンチレーションカウンターを用いて、フィルターに結合さ
れた放射活性の量を定量することができる。このような測定は、電気泳動工程を
包含しないという点において従来のものよりきわめて有利である。
標識（ラベル）の種類に応じて、任意の適当な手段により行なうことができる。
一般的に、これには、標識されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼから標識され
たモノヌクレオチドを分離する工程が含まれる。好ましい態様においては、サン
プル混合物（この時点では、標識されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼと標識
された過剰のモノヌクレオチドを含有している）をニトロセルロース膜を通して
ろ過することによって、検出を行なう。結合されていない過剰の標識化モノヌク
レオチドはニトロセルロース膜を通りぬけるが、標識されたハイブリッドポリメ
ラーゼ反応性生物はニトロセルロース膜上に捕獲される。上述の本発明に従う簡
略な分析法におけるように標識（ラベル）が放射性標識である場合には、次に、
プレートを読み取るシンチレーションカウンターを用いて、フィルターに結合さ
れた放射活性の量を定量することができる。このような測定は、電気泳動工程を
包含しないという点において従来のものよりきわめて有利である。
【００３８】 本発明においては、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することのできる
以下のようなヌクレオチドアナログを分析して、それらのプライミング活性を分
析する。すなわち、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰおよびラ
ミブジン（lamivudine）である。分析条件は、「実験方法一般」に記述したのと
同じである。略述すると、分析混合物中のヌクレオチドの代わりに、特定のヌク
レオチドアナログの抗プライミング試験における対応するヌクレオチドアナログ
を用いる（すなわち、ｄＧＴＰは、ｄｄＧＴＰの抗プライミング活性測定用のｄ
ｄＧＴＰと置換しなければならない）。反対に、ｄｄＴＴＰ（放射標識されたヌ
クレオチドはｄＴＴＰである）やラミブジンの抗プライミング活性を試験する場
合には、ヌクレオチドを置換しない。インキュベーションが終了した時点で、反
応混合物を静かにドッティングすることにより２×２ｃｍのニトロセルロース膜
に移す。次に、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ2および０．５％ウシ血清アルブミン４００ｍｌでニトロセルロース
膜を洗うことにより、結合されていない標識化ｄＴＴＰを分離する。その後、ニ
トロセルロース膜に結合している放射標識された残存ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメ
ラーゼをプレート読み取りシンチレーションカウンターを用いて定量する。図６
の結果が示すように、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰの存在下においては、対照の
分析（ヌクレオチドアナログが存在しない）に比べて、[32ｐ]で標識されたヒト
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの量が有意に低下しており、したがって、それらが
抗プライミング活性を有することを示している。対照的に、ｄｄＴＴＰまたはｄ
ｄＡＴＰのいずれについても抗プライミング活性は認められない。
以下のようなヌクレオチドアナログを分析して、それらのプライミング活性を分
析する。すなわち、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰおよびラ
ミブジン（lamivudine）である。分析条件は、「実験方法一般」に記述したのと
同じである。略述すると、分析混合物中のヌクレオチドの代わりに、特定のヌク
レオチドアナログの抗プライミング試験における対応するヌクレオチドアナログ
を用いる（すなわち、ｄＧＴＰは、ｄｄＧＴＰの抗プライミング活性測定用のｄ
ｄＧＴＰと置換しなければならない）。反対に、ｄｄＴＴＰ（放射標識されたヌ
クレオチドはｄＴＴＰである）やラミブジンの抗プライミング活性を試験する場
合には、ヌクレオチドを置換しない。インキュベーションが終了した時点で、反
応混合物を静かにドッティングすることにより２×２ｃｍのニトロセルロース膜
に移す。次に、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ2および０．５％ウシ血清アルブミン４００ｍｌでニトロセルロース
膜を洗うことにより、結合されていない標識化ｄＴＴＰを分離する。その後、ニ
トロセルロース膜に結合している放射標識された残存ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメ
ラーゼをプレート読み取りシンチレーションカウンターを用いて定量する。図６
の結果が示すように、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰの存在下においては、対照の
分析（ヌクレオチドアナログが存在しない）に比べて、[32ｐ]で標識されたヒト
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの量が有意に低下しており、したがって、それらが
抗プライミング活性を有することを示している。対照的に、ｄｄＴＴＰまたはｄ
ｄＡＴＰのいずれについても抗プライミング活性は認められない。
【００３９】
本発明は、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの簡便な活性分析法に基づくもの
である。本発明に従えば、クローニングを必要とすることなく血清サンプルから
直接的にヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを測定することができる。したがって
、本発明によれば、数が増加している、主要表面抗原の変異するＨＢＶ変異体の
迅速な評価と監視が可能となる。さらに、本発明は、そのようなＨＳＶ変異体、
特に、肝臓疾病に関連しワクチン接種によって誘発されるＨＢＶ変異体（例えば
、‘Ｓ’１４５）や、最終的には肝臓疾患に罹ると考えられる無症候性患者に見
出されるようなＨＢＶ変異体に対する抗ウイルス剤の阻害効果を調べるための簡
単に利用できる分析法を与えるものである。
である。本発明に従えば、クローニングを必要とすることなく血清サンプルから
直接的にヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを測定することができる。したがって
、本発明によれば、数が増加している、主要表面抗原の変異するＨＢＶ変異体の
迅速な評価と監視が可能となる。さらに、本発明は、そのようなＨＳＶ変異体、
特に、肝臓疾病に関連しワクチン接種によって誘発されるＨＢＶ変異体（例えば
、‘Ｓ’１４５）や、最終的には肝臓疾患に罹ると考えられる無症候性患者に見
出されるようなＨＢＶ変異体に対する抗ウイルス剤の阻害効果を調べるための簡
単に利用できる分析法を与えるものである。
【図１】 ヒトＨＢＶのゲノム構造を線状化して示すものである。
【図２】 野性型ＨＢＶを有する血清から単離したウイルスＤＮＡを用いて増幅したＰＣ
Ｒ生成物の電気泳動パターンを示す写真である。
Ｒ生成物の電気泳動パターンを示す写真である。
【図３】 コムギ胚リゼート中でインビトロ翻訳された野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラー
ゼを示すオートラジオグラフである。
ゼを示すオートラジオグラフである。
【図４】 野性型ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロのプライミング活性を示すオ
ートラジオグラフである。
ートラジオグラフである。
【図５】 野性型および表面抗原が変異したＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのインビトロの
プライミング活性を示すオートラジオグラフである。
プライミング活性を示すオートラジオグラフである。
【図６】 野性型のヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対するヌクレオチドアナログの抗
プライミング効果をまとめたものである。
プライミング効果をまとめたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 チェン・ウェイ・ニン シンガポール 080104 スポッティスウッ デ パーク ロード ナンバー 22−114 ブロック 104 シンガポール ミニス トリー オブ ヘルス ディパートメント オブ クリニカル リサーチ ランサム リサーチ ラボラトリー シニア リサ ーチ サイエンティスト (72)発明者 リム・ゲック・コウ シンガポール 426180 ロロン ジー テ ロッククラウ 16 シンガポール ミニス トリー オブ ヘルス ディパートメント オブ クリニカル リサーチ ランサム リサーチ ラボラトリー シニア メディ カル テクノロジスト (72)発明者 リォン・アイ・リン シンガポール 760263 ナンバー 12− 161イーシュン ストリート 22 ブロッ ク 263 シンガポール ミニストリー オブ ヘルス ディパートメント オブ クリニカル リサーチ ランサム リサー チ ラボラトリー ラボラトリー テクニ シャン Ｆターム(参考） 2G045 BB50 BB51 DA13 FB01 FB05 FB08 4B024 AA03 AA11 BA10 CA02 CA20 DA20 EA10 FA02 GA11 HA11 4B050 CC03 DD01 EE01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA01 QA05 QQ28 QQ61 QR08 QR32 QR39 QR42 QR49 QR62 QR78 QR90 QX07 (54)【発明の名称】 ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼのインビトロ活性分析法、該分析法を用い る各種血清サンプルの活性分析法およびＨＢＶＤＮＡポリメラーゼのインヒビターのスクリーニ ング法、ならびにＨＢＶＤＮＡポリメラーゼの産生方法
Claims (18)
- 【請求項１】 ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡのインビトロ活性を
分析する方法であって、サンプルからＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ増幅
する際の５’オリゴヌクレオチドとして、ＳＰ６ウイルスプロモーターが導入さ
れたオリゴヌクレオチドを用いること、真核細胞を含まないリゼート中でＰＣＲ
生成物を直接転写し翻訳させること、および、放射性標識剤の存在下にＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのプライミングを測定することを含むことを特徴とする分析
法。 - 【請求項２】 放射性標識剤が放射標識された三リン酸ヌクレオチドである
請求項１に従う分析法。 - 【請求項３】 放射標識された三リン酸ヌクレオチドがｄＴＴＰまたはその
アナログである請求項２に従う分析法。 - 【請求項４】 放射性標識剤がアッセイバッファーである請求項１，２また
は３に従う分析法。 - 【請求項５】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、コンプレックスが
アッセイバッファーから分離される請求項４に従う分析法。 - 【請求項６】 ろ過により、コンプレックスがアッセイバッファーから分離
される請求項４に従う分析法。 - 【請求項７】 サンプルが血清サンプルである請求項１〜６のいずれかに従
う分析法。 - 【請求項８】 血清サンプルが、ヒトＨＢＶ野性型ウイルスまたは表面抗原
変異体（例えば、ワクチンエスケープ、平常個体群およびＢ型肝炎罹患者由来の
もの）を含有する請求項７に従う分析法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに従う分析法を用いる、各種血清サ
ンプルの活性分析法。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれかに従う分析法を用いる、ＨＢＶ
ＤＮＡポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法。 - 【請求項１１】 請求項１〜８のいずれかに従う分析法を用いる、ヒトＨＢ
Ｖ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害能を有する抗Ｈ
ＢＶ薬剤の試験および／またはスクリーニング法。 - 【請求項１２】 次の工程を含む請求項１１の方法。 ａ）所定量のアッセイバッファーに溶かした少なくとも１つのサンプルを調製し
、各サンプルに、鋳型として線状ＰＣＲ生成物、および、ステムループ構造を形
成することのできる配列を含むＨＢＶマイナス鎖合成のＲＮＡ鋳型を用いて無真
核細胞リゼート中でインビトロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼタン
パク質を含有させる工程、 ｂ）前記アッセイバッファーと等量のアッセイバッファーに溶かしたコントロー
ルサンプルを調製し、該コントロールサンプルに、鋳型として線状ＰＣＲ生成物
、および、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの結合およびプライミングに必須で
ある、ステムループ構造を形成することのできる配列を含むＨＢＶマイナス鎖合
成のＲＮＡ鋳型を用いてインビトロ翻訳されたヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ
タンパク質を含有させる工程、 ｃ）それらのサンプルをインキュベートして、ＤＮＡポリメラーゼおよび放射性
標識剤から成るコンプレックスを得る工程、 ｄ）アッセイバッファーからコンプレックスを分離する工程、および ｅ）分離された各コンプレックス中の放射性標識剤の量を測定して、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工程。 - 【請求項１３】 分離したコンプレックス中の放射性標識剤の量を比較する
ことを含む請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 工程ｃ）、ｄ）およびｅ）が下記の工程と置換される請求
項１２の方法。 ｃ）前記の試験管とコントロール用試験管のそれぞれを、前記ＨＢＶマイナス鎖
ＤＮＡに導入された第１のヌクレオチドを含む放射標識された三リン酸ヌクレオ
チドの等量を用いて、前記ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミン
グ活性に好適な条件下にインキュベートして、前記ＤＮＡポリメラーゼと前記放
射標識された三リン酸ヌクレオチドから成るコンプレックスを形成させる工程；
ｄ）ニトロセルロース膜を用いたろ過により、前記試験管およびコントロール用
試験管のそれぞれのアッセイバッファーから前記コンプレックスを分離する工程
； ｅ）分離された各コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドの量を測定
して、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性を検知する工
程； ｆ）前記試験管およびコントロール用試験管の各々のニトロセルロース膜に結合
して残存している分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオチドのそれ
ぞれの量を比較し、試験管の分離コンプレックス中の放射標識三リン酸ヌクレオ
チドの量の減少をコントロール用試験管と比較したものから、抗ＨＢＶ薬剤によ
る、ヒトＨＢＶ ＤＮＡのポリメラーゼのＤＮＡプライミング活性に対する阻害
能を調べる工程。 - 【請求項１５】 鋳型として線状ＰＣＲ生成物を用いる線状ＤＮＡフラグメ
ントから直接、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼを産生する方法。 - 【請求項１６】 ５’センスオリゴヌクレオチドにＳＰ６ポリメラーゼプロ
モーターを導入することを含む請求項１５に従う方法。 - 【請求項１７】 ５’センスオリゴヌクレオチドが、ヒトＨＢＶ ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子のコード領域の最初の３０のヌクレオチドを含み、ＳＰ６プロ
モーターが該オリゴヌクレオチドにおいてＨＢＶ配列の上流に位置している請求
項１６に従う方法。 - 【請求項１８】 ヒトＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の停止コドンの上
流３００塩基対に位置する３’アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成すること
を含む請求項１５に従う方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SG98/00077 | 1998-09-29 | ||
| PCT/SG1998/000077 WO2000018958A2 (en) | 1998-09-29 | 1998-09-29 | An in vitro activity assay for human hepatits b virus (hbv) dna polymerase, the use of such an assay to assay activity of various serum samples and to screen for inhibitors of the hbv dna polymerase and a method of producing hbv dna polymerase |
| PCT/SG1999/000017 WO2000018968A1 (en) | 1998-09-29 | 1999-03-13 | An in vitro activity assay for human hepatitis b virus (hbv) dna polymerase, and its use for screening for inhibitors of hbv dna polymerase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002525130A true JP2002525130A (ja) | 2002-08-13 |
Family
ID=20429877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000572415A Pending JP2002525130A (ja) | 1998-09-29 | 1999-03-13 | ヒトｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ｄｎａポリメラーゼのインビトロ活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびｈｂｖｄｎａポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにｈｂｖｄｎａポリメラーゼの産生方法 |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6593082B1 (ja) |
| EP (1) | EP1117843A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002525130A (ja) |
| KR (1) | KR100445958B1 (ja) |
| CN (1) | CN1197978C (ja) |
| AR (1) | AR030012A1 (ja) |
| AU (2) | AU9372698A (ja) |
| BR (1) | BR9914099A (ja) |
| CA (1) | CA2344282A1 (ja) |
| HK (1) | HK1039161A1 (ja) |
| HR (1) | HRP20010230B1 (ja) |
| HU (1) | HUP0103735A3 (ja) |
| IL (2) | IL142288A0 (ja) |
| IS (1) | IS5900A (ja) |
| MY (1) | MY123274A (ja) |
| NO (1) | NO20011510L (ja) |
| NZ (1) | NZ510704A (ja) |
| PL (1) | PL347026A1 (ja) |
| RU (1) | RU2202620C2 (ja) |
| TR (1) | TR200100899T2 (ja) |
| UA (1) | UA75028C2 (ja) |
| WO (2) | WO2000018958A2 (ja) |
| YU (1) | YU23601A (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7893501A (en) * | 2000-07-14 | 2002-01-30 | Replidyne Inc | Novel dna polymerase iii holoenzyme delta subunit nucleic acid molecules and proteins |
| AUPS037002A0 (en) * | 2002-02-07 | 2002-02-28 | Melbourne Health | Viral variants and uses therefor |
| KR20030075638A (ko) * | 2002-03-20 | 2003-09-26 | (주) 비엔씨바이오팜 | Ｂ형 간염바이러스의 프라이밍 저해제의 스크리닝 방법 |
| WO2006132598A1 (en) | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Porcine circovirus type 2 vaccines |
| US9249423B2 (en) | 2007-02-02 | 2016-02-02 | Yale University | Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA |
| US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
| WO2008097926A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Yale University | Transient transfection with rna |
| EP2512491B1 (en) | 2009-10-16 | 2017-10-11 | Glaxo Group Limited | Hbv antisense inhibitors |
| CN104316682B (zh) * | 2014-10-10 | 2015-12-30 | 三峡大学 | 一种s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法及其应用 |
| RU2763173C1 (ru) * | 2020-07-27 | 2021-12-28 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ выявления ДНК вируса гепатита В в биологическом материале при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной ПЦР с детекцией по трем мишеням в режиме реального времени |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5492817A (en) * | 1993-11-09 | 1996-02-20 | Promega Corporation | Coupled transcription and translation in eukaryotic cell-free extract |
| US5360714A (en) * | 1992-08-28 | 1994-11-01 | Fox Chase Cancer Center | Hepadnavirus polymerase gene product having RNA-dependent DNA priming and reverse transcriptase activities and methods of measuring the activities thereof |
| WO1994005812A1 (en) | 1992-09-02 | 1994-03-17 | The Scripps Research Institute | Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system |
| US5709998A (en) | 1993-12-15 | 1998-01-20 | The Johns Hopkins University | Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis |
| WO1996010649A1 (en) | 1994-09-30 | 1996-04-11 | Southwest Foundation For Biomedical Research | Isolated human hepatitis b virus polymerase and uses thereof |
-
1998
- 1998-09-29 WO PCT/SG1998/000077 patent/WO2000018958A2/en active Application Filing
- 1998-09-29 AU AU93726/98A patent/AU9372698A/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-03-13 CN CNB998115274A patent/CN1197978C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-13 AU AU29694/99A patent/AU772819B2/en not_active Ceased
- 1999-03-13 PL PL99347026A patent/PL347026A1/xx unknown
- 1999-03-13 BR BR9914099-3A patent/BR9914099A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-03-13 YU YU23601A patent/YU23601A/sh unknown
- 1999-03-13 US US09/674,465 patent/US6593082B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-13 JP JP2000572415A patent/JP2002525130A/ja active Pending
- 1999-03-13 WO PCT/SG1999/000017 patent/WO2000018968A1/en active IP Right Grant
- 1999-03-13 RU RU2001108496/14A patent/RU2202620C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-03-13 NZ NZ510704A patent/NZ510704A/xx unknown
- 1999-03-13 EP EP99910940A patent/EP1117843A1/en not_active Withdrawn
- 1999-03-13 HU HU0103735A patent/HUP0103735A3/hu unknown
- 1999-03-13 KR KR10-2001-7004053A patent/KR100445958B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-03-13 IL IL14228899A patent/IL142288A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-13 TR TR2001/00899T patent/TR200100899T2/xx unknown
- 1999-03-13 UA UA2001032047A patent/UA75028C2/uk unknown
- 1999-03-13 CA CA002344282A patent/CA2344282A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-24 MY MYPI99004150A patent/MY123274A/en unknown
- 1999-09-28 AR ARP990104895A patent/AR030012A1/es unknown
-
2001
- 2001-03-19 IS IS5900A patent/IS5900A/is unknown
- 2001-03-23 NO NO20011510A patent/NO20011510L/no unknown
- 2001-03-27 IL IL142288A patent/IL142288A/en unknown
- 2001-03-27 HR HR20010230A patent/HRP20010230B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-01-16 HK HK02100353.9A patent/HK1039161A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU772819B2 (en) | 2004-05-06 |
| IS5900A (is) | 2001-03-19 |
| WO2000018968A8 (en) | 2002-11-07 |
| YU23601A (sh) | 2005-07-19 |
| CN1197978C (zh) | 2005-04-20 |
| RU2202620C2 (ru) | 2003-04-20 |
| KR20010083879A (ko) | 2001-09-03 |
| EP1117843A1 (en) | 2001-07-25 |
| BR9914099A (pt) | 2001-07-31 |
| NZ510704A (en) | 2002-10-25 |
| UA75028C2 (en) | 2006-03-15 |
| HK1039161A1 (zh) | 2002-04-12 |
| HRP20010230B1 (en) | 2006-05-31 |
| AR030012A1 (es) | 2003-08-13 |
| CN1320167A (zh) | 2001-10-31 |
| HRP20010230A2 (en) | 2002-06-30 |
| NO20011510D0 (no) | 2001-03-23 |
| HUP0103735A3 (en) | 2005-12-28 |
| TR200100899T2 (tr) | 2001-07-23 |
| AU2969499A (en) | 2000-04-17 |
| PL347026A1 (en) | 2002-03-11 |
| AU9372698A (en) | 2000-04-17 |
| KR100445958B1 (ko) | 2004-08-25 |
| IL142288A (en) | 2006-12-31 |
| MY123274A (en) | 2006-05-31 |
| WO2000018968A1 (en) | 2000-04-06 |
| NO20011510L (no) | 2001-05-28 |
| IL142288A0 (en) | 2002-03-10 |
| US6593082B1 (en) | 2003-07-15 |
| WO2000018958A2 (en) | 2000-04-06 |
| CA2344282A1 (en) | 2000-04-06 |
| HUP0103735A2 (hu) | 2002-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5534406A (en) | Method of detecting antigenic nucleic acid-containing macromolecular entities | |
| US5789153A (en) | Method of quantitating nucleic acid | |
| TWI248515B (en) | Array of two or more oligonucleotide primers immobilized to a solid support, and HBV variant generally in isolated form and method for identifying expression products | |
| HU227499B1 (en) | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus | |
| JP2002525130A (ja) | ヒトｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ｄｎａポリメラーゼのインビトロ活性分析法、該分析法を用いる各種血清サンプルの活性分析法およびｈｂｖｄｎａポリメラーゼのインヒビターのスクリーニング法、ならびにｈｂｖｄｎａポリメラーゼの産生方法 | |
| JP2005058234A (ja) | Ｂ型肝炎検査用のｐｃｒプライマーセット及びそれを利用したｂ型肝炎検査方法 | |
| JP2001501822A (ja) | 非ポリオエンテロウィルスの検出および同定 | |
| JP4866238B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウィルスの新規の表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）変異体 | |
| Raimondo et al. | Persistence of “wild-type” and “e-minus” hepatitis B virus infection in chronic healthy HBsAg/anti-HBe positive carriers | |
| Hsieh et al. | Telomerase activity correlates with cell cycle regulators in human hepatocellular carcinoma | |
| JP2003521249A (ja) | 薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）を検出する検定法 | |
| US7037682B2 (en) | In vitro activity assay for human hepatitis B virus (HBV) DNA polymerase, and its use for screening for inhibitors of HBV DNA polymerase | |
| JPWO2003000887A1 (ja) | 日本人からのｅ型肝炎ウイルスに由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマー、それらを有するチップ、それらを有するキット、並びにそれらによるｅ型肝炎ウイルスを検出する方法 | |
| JP4398379B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法 | |
| KR100498118B1 (ko) | 하나의 돌연변이 인체 ｂ형 간염 바이러스 균주 및 그용도 | |
| Wirth et al. | Molecular hybridization techniques in current diagnosis of chronic hepatitis B in childhood | |
| MXPA01003205A (en) | An in vitro | |
| JP2649285B2 (ja) | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスフュージョンプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 | |
| CN101555468B (zh) | 对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用 | |
| CN114182013A (zh) | 用于诊断肝细胞癌易感性的试剂盒及其应用 | |
| RU2270863C2 (ru) | Мутантный штамм вируса гепатита в и его применение | |
| Bonino et al. | New Diagnostic Techniques: Hepatitis B Virus-DNA in Serum and Liver | |
| JP4546212B2 (ja) | 抗原蛋白質を発現した細胞を利用する抗体測定方法 | |
| KR20020063071A (ko) | 피시알에 의한 ｂ형 간염바이러스의 검출용 키트 및 그검출방법 | |
| JPH05176773A (ja) | オリゴヌクレオチド、オリゴペプタイド、ならびに抗ｃ型肝 炎ウイルス抗体検出・鑑別方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040206 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040312 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040420 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040730 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040908 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040908 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20041013 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20041112 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070420 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070425 |