JP4398379B2 - B型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法 - Google Patents
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Description
B型肝炎の診断には、肝組織像に加え、ALT、HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBVポリメラーゼ、HBV−DNA量などの血清マーカーが用いられる。このうち、抗ウイルス剤の治療効果の判定には血中HBV−DNA量が重視されている。すなわち、HBV−DNA量がいちじるしく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。
HBVの遺伝子は約3,200塩基対からなる環状不完全2本鎖DNAである。このHBVの遺伝子の複製には、逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の4段階に分けられる。
▲1▼細胞の核内で内因性のDNAポリメラーゼにより完全2本鎖環状DNAとなり、これが閉環して閉環2本鎖DNA(covalently closed circular DNA:cccDNA、)となる段階。このcccDNAは超らせん構造をとっている。
▲2▼cccDNAを鋳型として細胞のRNAポリメラーゼIIによりmRNAが転写される段階。このうち最長の3.5kbのものがpregenome RNAとして、逆転写の鋳型となる。このRNAの5’および3’末端に”ε”シグナル(encapsidation signal)が存在し、このうち5’側のシグナルがpregenome RNAおよびウイルスポリメラーゼのコアの粒子内へのパッケージングに重要な作用をすると考えられている。
▲3▼コア粒子内でRNA依存性DNAポリメラーゼによリプライマーとしてオリゴヌクレオチドが合成され、pregenome RNAを鋳型として逆転写により(−)鎖DNAが合成される段階。
▲4▼pregenome RNAの5’末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、(−)鎖DNAを鋳型として(+)鎖DNAが合成される段階。
これらの過程のいずれかを阻害することにより、HBVの遺伝子の複製は止められ、ウイルスの増殖が抑えられると考えられる。特に、HBVの複製には逆転写の過程があり、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)もその増殖に逆転写の過程を有していることから、治療薬としてRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害剤のスクリーニングが行われてきた。
ラミブジンも、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初はHIV治療薬としての開発が行われたが、HBVに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、1992年からB型慢性肝炎の治療薬としての開発が始まった。
ラミブジンのHBVに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド(シチジン)誘導体の抗ウイルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤のHBVに対する増殖抑制機序の一つは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)阻害によりプレゲノムRNAの逆転写を阻害することである。
もう一つの機序として、ウイルスDNA鎖に取り込まれ、その伸長を止めることも考えられている。また、免疫系への間接的な影響として、ラミブジン投与によりウイルスの減少が起こると、血流中のウイルス蛋白が減少し、HBV抗原に対するT細胞の低反応性が回復することも報告されている(Boni Cet al.Journal of Clinical Investigation,102,968−975,1998)。
このような作用機序により、HBV感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中ウイルス量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。ラミブジンがより効果的である症例を選択するためのウイルス側の遺伝子変化と治療効果の関係を論じた研究として、主にラミブジンのターゲットであるDNAポリメラーゼのB及びCドメインについてのものは数多く見られるが(Ono−Nita SK et al.Hepatology,29,939−945,1999)(Allen MI et al.Hepatology,27,1670−1677,1998)、それ以外の領域について検討された報告は少ない。
また、HBVの遺伝子型の研究として、HBs領域の配列を比較してGenotype A−Dの遺伝子型を決定した例が報告されている(Journal of Medical Virology,2002,68,522−528)。この報告は、この遺伝子型の違いにより、HBVに対するインターフェロンの治療効果が異なることを示している。さらに、コアプロモーター領域の遺伝子において、HBV−DNAの1896番目の塩基GがAに、1899番目の塩基GがAに変異していることなども報告されている。しかしながら、これらの遺伝子の変化は、ウイルスの遺伝子型ではなく感染後の変異と考えられており、またHBVの治療との関係は明らかになっていない(唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウイルス病学 基礎・臨床・予防 下巻 A、B、D、E型火炎ウイルス、1995年、52−57)。このようにコアプロモーター領域の遺伝子変異は報告されているが、この領域の変異がHBVの遺伝子型であるという概念は報告されていない。
Ono−Nitaら.Hepatology,29,939−945,1999 Allen MIら、Hepatology,27,1670−1677,1998 Yuhら,Journal of Virology,66,4073−4084,1992 Honigwachsら,Journal of Virology,63,919−924,1989 Lopez−Cabreraら,Proceedings of the national Academy of Sciences of the United States of America,87,5069−5073,1990 唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウイルス病学 基礎・臨床・予防 下巻 A、B、D、E型火炎ウイルス、1995年、52−57
すなわち本発明は、B型肝炎ウイルス(HBV)コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、HBVの薬剤抵抗性を識別する方法である。
また本発明は、血中のHBV−DNAを単離精製し、PCRによりHBVコアプロモーター領域を増幅し、塩基配列を決定することにより、薬剤治療効果を左右するコアプロモーター遺伝子の変異を同定する方法に関する。
本発明は、ラミブジンに代表されるRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の治療効果を予測する一助として、HBVコアプロモーター核酸配列の変化(変異)を同定(検出)する方法にも関する。特に、HBVコアプロモーター核酸配列の変異を少なくとも1つ同定(検出)することにより、薬物投与後の血中HBV量の低下を予測する一助ともなる。
さらに本発明は、HBVコアプロモーター核酸配列の特定の部分配列(例えば配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7に記載された配列)の少なくとも1つの変異を同定(検出)すること、好ましくは配列番号1に記載された7番目の核酸C、28番目の核酸T、33番目の核酸A,57番目の核酸A、73番目の核酸T、106番目の核酸A、107番目の核酸T、200番目の核酸A、250番目の核酸G、または253番目の核酸Gのいずれか1つもしくはそれ以上の核酸が変化していることを同定(検出)することに関する。
本発明は、さらに好ましくは、配列番号1に記載された7番目の核酸CがT、または28番目の核酸TがC、または33番目の核酸AがG、または57番目の核酸AがGまたはC、または73番目の核酸TがG、または106番目の核酸AがTまたはCまたはG、または107番目の核酸TがCまたはG、200番目の核酸AがTまたはC、250番目の核酸GがA、253番目の核酸GがAとなっているいずれか1つもしくはそれ以上の変異を同定(検出)することに関するものである。HBVの薬剤抵抗性、あるいは感受性の違いはHBVの遺伝子型による種類の違いに起因すると考えられる。そのため本発明はHBVのコアプロモーターに上述した変異のいずれかを有するHBVの遺伝子型を提供する。この遺伝子型を利用する薬剤抵抗性の予測方法を提供する。また本発明はHBVの遺伝子型を同定する方法も提供する。
本発明は、遺伝子の変異を同定(検出)検出する方法が、核酸の配列を決定する方法であるものを含む。さらに、プローブまたはプライマーとして核酸を用いた核酸同士の2本鎖形成(ハイブリダイゼーション)を利用した方法であるものを含む。
さらに本発明は、上記のHBVコアプロモーター領域の遺伝子変異を検出するための診断薬、診断キットを提供する。
また本発明は、HBVコアプロモーターの配列番号1またはその一部の遺伝子配列を有する核酸を用いた新たなHBV治療薬に関する。かかる核酸は囮(デコイ)核酸として、HBVコアプロモーターの野生株の遺伝子配列をターゲットとする蛋白質に特異的に結合し、本来のターゲットであるHBV自身のコアプロモーターへの該蛋白質の結合を拮抗的に妨げる効果を有する。従って、本発明のデコイ核酸を生体に投与することにより、HBVコアプロモーターからの転写を抑制し、HBVの増殖を阻害することが可能となる。
HBVのコアプロモーター領域は、報告により多少の差はあるが、基本的には転写開始部位の上流約200bpまでがコアプロモーター領域として同定されている(Yuh CH,et al,Journal of Virology,66,4073−4084,1992;Honigwachs J et al,Journal of Virology,63,919−924,1989;Lopez−Cabrera M et al,Proceedings of the national Academy of Sciences of the United States of America,87,5069−5073,1990)。
本発明では、説明の便宜上、塩基配列の番号を、HBVの2本鎖DNAの制限酵素EcoRI部位GAATTCの最初のTを核酸番号1として表記する。この便宜的な番号を用いた場合に、本発明に言うHBVコアプロモーター領域は、核酸番号1631からコア蛋白の開始アミノ酸までの核酸番号1900として規定される。
この領域には、増殖に重要なエンハンサーII領域(EnhII)及びプレゲノムRNAのコア粒子への包含に必要なエンカプシデーションシグナル(ε)領域が存在し、HBVのDNAポリメラーゼや肝細胞特異的な核内因子の結合部位となっているため、一度変異が生ずるとウイルスの増殖・複製に重要な変化が生じると考えられる。このε領域はHBVのDNAポリメラーゼのプライミングおよび逆転写活性に必要である(Urban M.,et al.Journal of General Virology(1998),79,1121−2231)。また、エンハンサーII領域(EnhII)にはfootprntingあるいはmethylaton interferenceで同定されるfootprintIIまたはBoxα、footprintI、Boxβの調節エレメントが存在している。
本発明は、ポリメラーゼ等が結合する領域及び、ウイルス遺伝子複製の調節に重要な役目を果たしているエンハンサー領域に着目して、B型肝炎の治療薬、特にラミブジンの治療効果に影響を与えるコアプロモーターの遺伝子変異を同定するものである。
本発明によりB型慢性肝炎患者の治療前診断に有用なHBVコアプロモーター遺伝子変異を検出することで、薬剤耐性株や肝炎再燃の少ないテイラーメード医療に貢献でき、また新たな診断薬を開発することができる。また、ラミブジン等の逆転写阻害剤で治療効果をあげにくいウイルスが同定できることから、こうした変異ウイルスの配列を用いることにより、かかるウイルスにも効果の高い新規抗HBV薬の開発に役立てることができる。
本発明は、具体的には、コアプロモーター領域の核酸配列を確認してHBVの遺伝子変異を同定することを含む方法である。この領域はウイルスの増殖に重要な部位であり、遺伝子配列の違いにより、HBVの治療に用いられる薬剤に対する感受性が異なるという関係を有することが、本発明者らの研究により演繹的に証明された。この研究過程において、コアプロモーター領域の中でも、6つの短い領域、さらにその中でもある特定の核酸配列の変化を確認することで、HBVの薬物抵抗性の違いを簡便に識別し得ることが見出いだされた。
以下、代表的なHBVの治療薬であるラミブジンを例として本発明を説明するが、本発明はラミブジンの治療にのみ限定されるものではない。
HBVの代表的な治療薬であるラミブジンによる治療は、血中ウイルス量を示すHBV−DNA量及び肝細胞内のウイルス量を反映するマーカーであるHBe抗原量の高力価症例において、ウイルス量が減少しにくい例が多数存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。
しかし、HBV−DNA量やHBe抗原量の高力価症例においても、ラミブジンが奏効し、血中のHBV−DNA量を速やかに減少させ、肝炎を鎮静化させる症例が存在する。
本発明者らは、ラミブジン治療を受けるB型慢性肝炎患者の治療前血清と治療開始6ヶ月後の血清を用いて、TMA法にて血中HBV−DNA量を測定し、治療6ヶ月後のHBV−DNA量が検出感度未満(5000copies/ml未満)に低下した場合、ウイルス陰性群と判定し、それ以上である場合をウイルス陽性群とし、有意差検定により予後因子を検索した。
次に、六波羅ら(Journal of Medical Virology,62,471−478,2000)の方法により、採取した治療前の血清検体から市販の核酸抽出キットを用いてHBV−DNAを抽出し、PCR法を用いてHBVコアプロモーター領域を増幅し、3%アガロースゲルにて電気泳動後、ゲルより陽性バンドを切出し、核酸を精製し、ダイレクトシークエンス法にて塩基配列を決定した。さらに、治療前のコアプロモーター領域の塩基配列と野生株との比較により、遺伝子変異を起こしている部位を選別し、治療6ヶ月後のウイルス陽性群と陰性群を指標に有意差検定を行い、ラミブジン治療効果を予測できる遺伝子変異部位を解析した。
その結果、従来報告されているHBe抗原陽性、HBV−DNA量が有意な予後マーカーとして抽出されてきたが、年齢・性別・既往歴・病型・血小板値・アルブミン値・ALT値・ビリルビン値に有意差は見られなかった。しかしながら、コアプロモーター領域の遺伝子変異を解析したところ、3箇所において有意にラミブジン治療効果と関連する遺伝子変異が検出された。
また、そのHBVコアプロモーター領域における遺伝子変異が、少なくとも一つでもある場合においては、6ヶ月後のウイルス陽性群と陰性群との間に有意差(P<0.0001)が認められ、この変異を確認することでラミブジンの治療効果を予測できることが証明された。この遺伝子変異を有するHBVと有しないHBVは異なる遺伝子型のHBVと考えられる。この遺伝子型の違いはHBVの増殖能等の生物学的な機能とも相関している可能性がある。
このように、本発明のHBVコアプロモーター領域の変異は、HBVのDNAポリメラーゼや肝細胞特異的な核内因子に係わるHBVの増殖・複製の阻害効果に関係することが明らかとなり、この変異を同定することで、ラミブジン治療の奏効率の向上を促すことができる。したがって、HBVのコアプロモーター領域の遺伝子変異がラミブジン治療効果の予測マーカーとして用いることが可能である。
核酸配列を決定するためのDNAは、PCRで本発明のコアプロモーター領域を増幅し、そのままダイレクトシークエンス法で核酸の配列を決定してもよい。また一度PCR産物をベクターにクローニングしてから配列の決定を行っても構わない。あるいはポイントミューテーション(点突然変異)を見つけるシークエンス法を用いてもよい。
本発明の核酸配列の変異を検出する方法は、遺伝子配列を決定する以外にも、1塩基から数塩基の違いを検出する方法であればどのような方法でも使用することが可能である。例えばSSCP、DGGE、CFLP、RFLPのような遺伝子変異の検出法が利用可能である。また1塩基変異のSNPの検出に用いられているインベーダー法も利用可能である。さらに相補的な核酸が二本鎖を形成するハイブリダイゼーションの原理を利用した変異検出法もすべて利用可能である。これらの遺伝子、核酸の変異の検出法はプローブまたはプライマーを用いた方法あるいはそれらを組合せた方法がある。これらのプローブまたはプライマーは核酸に限らず標的の核酸とハイブリダイゼーションで結合可能なものが含まれる。
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
慢性B型肝炎感染患者53人(男性40例、女性13例、平均年齢49.8±9.4歳、慢性肝炎38例、肝硬変15例)にラミブジンを100mg/day経口連日投与し、投与前のデータおよび投与後のデータを解析した。ラミブジン投与6ヶ月の時点でHBV−DNA量がTMA法にて感度未満(3.7LGE/mL未満)に低下した時、ウイルス陰性化と判定した。
ウイルスが陰性化した人と陽性のままだった人について、年齢、性別、HBeAg陽性率、治療前のHBV DNA量、既往歴、病型、血小板値、アルブミン、ALT、ビリルビン値等について治療効果の予測因子となり得るかについて、Fisherの直接法、Mann−Whitney U検定で有意差を検定した。
表1より、従来報告されているHBe抗原陽性、HBV−DNA量が有意な予後マーカーとして抽出されてきたが、年齢・性別・既往歴・病型・血小板値・アルブミン値・ALT値・ビリルビン値に有意差は見られなかった。
<実施例2> HBVコアプロモーター領域の塩基配列の決定
実施例1でラミブジン治療を行った53例のうち、43例の治療前患者血清50μlからウイルスDNAをDNA抽出キット(スマイテスト、(株)ゲノムサイエンス研究所)でマニュアルに従って抽出した。
抽出DNA2ul、0.5UのAmpliTaq Gold(PE applied Biosystems)を反応液(200μM dNTP,50mM KCL,10mM Tris−HCL[pH8.3],2.0mM MgCl2,0.001%gelatin)25μlに加え、is2:5’−GAG ACC ACC GTG AAC GCC CA(1611−1630)およびCB4:5’−AAA AGA GAG TAA CTC CAC AG(1954−1935)の各プライマー0.25mMで増幅した。
PCR protocolはpreheatの後、94℃、30秒、55℃、1分のサイクルを43サイクル繰り返した。サーマルサイクラーはDNA Engine(MJ Research Corp.Watertown,MA)を用いた。PCR陰性検体は、outer primer setにて1st PCRを行った後、2nd PCRは30サイクルとした。このPCRで陰性だった検体は、outer primers setとして、es2:5’−ACG TCG CAT GGA GAC CAC CG(1601−1620)、CB2:5’−GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA(1974−1955)を用い、1st PCRを行った後に、is2とCB4のプライマーで30サイクルの2nd PCRを行なった。
このPCR産物を3%アガロースゲルで電気泳動後、ゲルからバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia Biotec Inc)で精製した。シークエンスはジデオキシ法である、Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kitで反応させ、fluorescent DNA sequencer(Applied Biosystems)で解析した。配列を決定した43例の患者のコアプロモーター領域配列を第1−1図〜第1−3図に示す。
H5から262までの31検体がラミブジン治療により、6ヵ月後に血中のDNA量が検出限界以下に減少した患者の配列である。A17からA5までの11検体がDNAが検出限界以下まで減少せず、ラミブジンの治療効果が少なかった患者の配列である。
各図の一番上の列は、元になる配列(野生型)の配列を示している。各図の上段31検体と下段12検体では配列に違いがあることがわかる。またその違いは一定の領域に集中していることが明らかである。ラミブジンの効果のある群(効果群)では、塩基番号で1671〜1682番目の領域(配列番号2)に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に1674番目(配列番号1の28番目)の核酸TがCに、1679番目(配列番号1の33番目)のAがGに変化しているが、ラミブジンの効果のない群(非効果群)ではそのような変化は見られない。
またラミブジンの治療効果を奏した群では、塩基番号で1701〜1721番目の領域(配列番号3)に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に1703番目(配列番号1の57番目)の核酸AがCまたはGに、1719番目(配列番号1の73番目)のTがGに変化しているが、ラミブジンの治療効果を奏さなかった非効果群ではそのような変化は見られない。
同様に、効果群では塩基番号で1736〜1761番目の領域(配列番号4)に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に1752番目(配列番号1の106番目)の核酸AがTまたはCまたはGに、1753番目(配列番号1の107番目)のTがGまたはCに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。
さらに、効果群では塩基番号で1799〜1817の領域(配列番号5)に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多く、1802番目、1803番目、1809番目、1810番目、1811番目、1812番目、1814番目に変化が見られるが、非効果群ではそのような変化は見られない。さらに効果群では1843−1860番目の領域(配列番号6)に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に1846番目(配列番号1の200番目)の核酸AがTまたはCに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。効果群では1893−1902番目の領域(配列番号7)に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に1896番目(配列番号1の250番目)の核酸GがAに、1899番目(配列番号1の253番目)のGがAに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。
<実施例3>コアプロモーター領域の遺伝子変異による解析
(A)遺伝子変異部位による統計的解析
さらに効果のあった患者9人および効果の無かった患者2検体のコアプロモーター領域を実施例1の方法に従って配列決定し、合計53検体についてラミブジンの治療効果と核酸配列の変化(変異)関係を調べ、Fisherの直接法で有意差を検定した。表2に有意差のあった変異と、陽性群には見られず、陰性化群に見られた変異を示す。
表2の陰性化群(n=40)はラミブジン治療の効果のある群、陽性群(n=13)はラミブジン治療の効果のない群である。このようにいくつかのポイントで有意差があることが示された。
尚、コアプロモーター変異(A1762T,G1764A)については、陰性化群、陽性群でそれぞれ82.5%,84.6%にみられ、有意差はなかった。
(B)コアプロモーター領域全体における変異の統計的解析
表2に示した核酸の変化が見られる検体と全く見られない検体で、ラミブジンの治療効果の予測ができるかについて、Fisherの直接法で有意差を検定した。
いずれかの変化が見られる患者は53人中38人でそのうち35人はラミブジン治療の効果が認められた。また一箇所も変化が見られなかった患者は15人で、そのうち10人は治療効果が見られなかった。このことはこのコアプロモーター領域の核酸配列の変化がラミブジン治療の効果に顕著な関連があることを示している。ラミブジンはRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有しており、それがHBVの増殖抑制に関与していると考えられる。
本発明の効果
本発明によれば、ウイルス側の遺伝子変異を治療前または治療中に検出することにより、ラミブジンに代表されるHBV治療の効果を予測でき、治療成績を向上させる、または耐性株や肝炎再燃をおさえるなどの効果が期待できる。
第1−2図は、ラミブジン治療を行った患者のHBVコアプロモーター領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段31検体がラミブジン治療効果のある検体、下段12検体が治療効果が無かった検体を表す。
第1−3図は、ラミブジン治療を行った患者のHBVコアプロモーター領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段31検体がラミブジン治療効果のある検体、下段12検体が治療効果が無かった検体を表す。
Claims (6)
- B型肝炎ウイルス(HBV)コアプロモーター領域の核酸配列において、配列番号1に記載された28番目の核酸TがCに、33番目の核酸AがGに、57番目の核酸AがGもしくはCに、73番目の核酸TがGに、106番目の核酸AがTもしくはCもしくはGに、107番目の核酸TがCもしくはGに、200番目の核酸AがTもしくはCに、または253番目の核酸GがAに変化したいずれか1つもしくはそれ以上の遺伝子変異を確認することからなる、HBVの薬剤抵抗性を識別する方法。
- HBVの薬剤抵抗性がRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤への抵抗性である、請求項1に記載の方法。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである、請求項2に記載の方法。
- HBVコアプロモーター領域の核酸配列において、配列番号1に記載された28番目の核酸TがCに、33番目の核酸AがGに、57番目の核酸AがGもしくはCに、73番目の核酸TがGに、106番目の核酸AがTもしくはCもしくはGに、107番目の核酸TがCもしくはGに、200番目の核酸AがTもしくはCに、または253番目の核酸GがAに変化したいずれか一つもしくはそれ以上の遺伝子変異を有するHBV遺伝子型を同定する方法。
- 遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定をHBVの塩基配列を決定することで行う、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定をプローブまたはプライマーを用いた方法で行う、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
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