WO2004053162A1

WO2004053162A1 - Ｂ型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法

Info

Publication number: WO2004053162A1
Application number: PCT/JP2003/015810
Authority: WO
Inventors: Akinori Rokuhara; Akihiro Matsumoto; Eiji Tanaka; Kendo Kiyosawa
Original assignee: Advanced Life Science Institute, Inc.
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2004-06-24
Also published as: JP4398379B2; KR20050095584A; CN100422343C; AU2003289016A1; CN1726287A; JPWO2004053162A1

Abstract

ＨＢＶの薬物抵抗性を簡便に識別する方法を提供する。　Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、HBVの薬剤抵抗性を識別する方法。

Description

明細書

B型肝炎ウィルスの薬物抵抗性を識別する方法技術分野

本発明は、例えばラミプジンなどの B型慢性肝炎治療薬に対する B型肝炎ウィルス（ H B V ) の抵抗性を、 H B Vコアプロモーター領域における遺伝子型を確認することで識別する方法に関する。

従来の技術

B型肝炎ウィルス（HBV)の感染者は、世界でおよそ 3億人に達すると見積もられている。 HBVの感染は急性および慢性の肝炎（B型肝炎）を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌の原因となる。

B型肝炎の診断には、肝組織像に加え、 ALT、 HBsAg, HBsAb、 HBcAb、 HBeAg、 HBeAb、 HBVポリメラ一ゼ、 HBV-DNA量などの血清マ一力一が用いられる。このうち、抗ウィルス剤の治療効果の判定には血中 HBV-DNA量が重視されている。すなわち、 HBV-DNA量がいちじるしく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。

H B Vの遺伝子は約 3 ， 2 0 0塩基対からなる環状不完全 2 本鎖 D N Aである。この H B Vの遺伝子の複製には、逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の 4 段階に分けられる。

①細胞の核内で内因性の D N Aポリメラ一ゼにより完全 2 本鎖環状 D N A となり、これが閉環して閉環 2 本鎖 D N A

( covalently closed circular DNA: cccDNA^ ) となる段階。この cccDNAは超らせん構造をとつている。

② cccDNA を銪型として細胞の R N A ポリメラ一ゼ II により m R N Aが転写される段階。このうち最長の 3.5kb のものが pregenome RNAとして、逆転写の錶型となる。この RNAの 5' および 3'末端に " ε "シグナル（ encapsidation signal) が存在し、このうち 5'側のシグナルが pregenome RNAおよびウィルスポリメラ一ゼのコアの粒子内へのパッケージングに重要な作用をすると考えられている。

③コア粒子内で RNA依存性 DNAポリメラ一ゼによりプライマ一としてオリゴヌクレオチドが合成され、 pregenome RNAを銪型として逆転写により（ -) 鎖 DNAが合成される段階。 ④ pregenome RNA の 5'末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、（一）鎖 DNAを錶型として（ + ) 鎖 DNAが合成される段階。

これらの過程のいずれかを阻害することにより、 H B Vの遺伝子の複製は止められ、ウィルスの増殖が抑えられると考えられる。特に、 H B Vの複製には逆転写の過程があり、ヒト免疫不全ウィルス（ H I V ) もその増殖に逆転写の過程を有，していることから、治療薬として RNA依存性 DNAポリメラーゼ阻害剤のスクリーニングが行われてきた。

ラミブジンも、ヒト免疫不全ウィルス（ H I V ) の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初は H I V治療薬としての開発が行われたが、 H B Vに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、 1 9 9 2年から B型慢性肝炎の治療薬としての開発が始まった。

ラミブジンの H B Vに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド（シチジン）誘導体の抗ウィルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤の H B Vに対する増殖抑制機序の一つは、 R N A依存性 D N Aポリメラ一ゼ（逆転写酵素）阻害によりプレゲノム R N Aの逆転写を阻害することである。

もう一つの機序として、ウィルス D N A鎖に取り込まれ、その伸長を止めることも考えられている。また、免疫系への間接的な影響として、ラミブジン投与によりウイルスの減少が起こると、血流中のウィルス蛋白が減少し、 H B V抗原に対する T 細胞の低反応性が回復することも報告されている（ B o n i G e t a l . J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n, 102, 9 6 8 — 9 7 5， 1 9 9 8 ) 。

このような作用機序により、 H B V感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中ウィルス量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。ラミブジンがより効果的である症例を選択するためのウィルス側の遺伝子変化と治療効果の関係を論じた研究として、主にラミブジンの夕一ゲヅトである D N Aポリメラ —ゼの B及び C ドメインについてのものは数多く見られるが ( O n o — N i t a.、„ K— e t a 1 . H e p a t o l o g y , 2 9 , 9 3 9 - 9 4 5 , 1 9 9 9 ) ( A l l e n M I e t a 1 . H e p a t o l o g y , 2 7 , 1 6 7 0 - 1 6 7 7 , 1 9 9 8 ) 、それ以外の領域について検討された報告は少ない。また、 H B Vの遺伝子型の研究として、 HBs領域の配列を比較して Genotype A-Dの遺伝子型を決定した例が報告されている ( Journal of Medical Virology, 2002, 68, 522-528) 。この報告は、この遺伝子型の違いにより、 H B Vに対するイン夕一フヱロンの治療効果が異なることを示している。さらに、コアプロモ一夕一領域の遺伝子において、 H B V— D N Aの 1896 番目の塩基 Gが Aに、 1899番目の塩基 Gが Aに変異していることなども報告されている。しかしながら、これらの遺伝子の変化は、ウィルスの遺伝子型ではなく感染後の変異と考えられており、また H B Vの治療との関係は明らかになつていない（唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウィルス病学基礎 * 臨床 '予防下卷 A、 B、 D、 E型火炎ウィルス、 1995年、 52-57)。このようにコアプロモー夕一領域の遺伝子変異は報告されているが、この領域の変異が H B Vの遺伝子型であるという概念は報告されていない。

非特許文献 1

O n o — N i t a ら . H e p a t o 丄 o g y , 2 9， 9 3 9 - 9 4 5 , 1 9 9 9 非特許文献 2

A l l e n M I ら、 H e p a t o l o g y , 2 7 , 1 6 7 0 - 1 6 7 7 , 1 9 9 8

非特許文献 3

Yuh ら， Journal of Virology, 66, 4073-4084, 1992 非特許文献 4

Honigwachs ら , Journal of Virology, 63, 919-924,

1989

非特許文献 5

Lopez- Cabrera ら , Proceedings of the national Academy of Sciences of the United States of America, 87, 5069-5073, 1990

非特許文献 6

唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウィルス病学基礎 · 臨床 ' 予防下巻 A、 B、 D、 E型火炎ウィルス、 1995年、 52-57

発明が解決しょうとする課題

H B V肝炎の薬物的治療において、当該薬物の効果を H B V との関連において客観的に知ることは、治療方針や薬物の選択に対して有益な情報となる。本発明は、 H B V肝炎に対する治療方針や薬物の選択に対する有益な情報を、遺伝子工学的見地から入手する方法を提供するものである。

課題を解決するための手段

本願発明者らは、 HBV肝炎の治療を薬物的に行う際の効果がウィルス側の要因によって影響されることを仮定し、ウィルスの増殖過程に関係がある遺伝子型の違い、特に H B Vのコアプロモ一夕一領域における塩基配列の多様性が H B Vに対する薬物の効果の違いに関与していることを新たに見出し、本発明を完成させたものである。

すなわち本発明は、 B型肝炎ウィルス（ H B V ) コアプロモ —夕一領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、 HBVの薬剤抵抗性を識別する方法である。

また本発明は、血中の H B V— D N Aを単離精製し、 P C R により H B Vコアプロモー夕一領域を増幅し、塩基配列を決定することにより、薬剤治療効果を左右するコアプロモー夕一遺伝子の変異を同定する方法に関する。

本発明は、ラミプジンに代表される R N A依存性 D N Aポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤による B型肝炎ウィルス（ H B V ) 感染の治療効果を予測する一助として、 H B Vコアプロモ —夕一核酸配列の変化（変異）を同定（検出）する方法にも関する。特に、 H B Vコアプロモ一夕一核酸配列の変異を少なくとも 1 つ同定（検出）することにより、薬物投与後の血中 H B V量の低下を予測する一助ともなる。

さらに本発明は、 H B Vコアプロモー夕一核酸配列の特定の部分配列（例えば配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7 に記載された配列）の少なくとも 1 つの変異を同定（検出）すること、好ましくは配列番号 1 に記載された 7番目の核酸 C、 2 8番目の核酸 T、 3 3番目の核酸 Α , 5 7番目の核酸 A、 7 3番目の核酸 T、 1 0 6番目の核酸 Α、 1 0 7番目の核酸 Τ、 2 0 0番目の核酸 Α、 2 5 0 番目の核酸 G、または 2 5 3番目の核酸 Gのいずれか 1 つもしくはそれ以上の核酸が変化していることを同定（検出）することに関する。

本発明は、さらに好ましくは、配列番号 1 に記載された 7番目の核酸 Cが T、または 2 8番目の核酸 Τが C、または 3 3番目の核酸 Aが G、または 5 7番目の核酸 Aが Gまたは C、または 7 3番目の核酸 Tが G、または 1 0 6番目の核酸 Aが T または Cまたは G、または 1 0 7番目の核酸 T が C または G、 2 0 0番目の核酸 Aが T または C、 2 5 0 番目の核酸 Gが A、 2 5 3番目の核酸 Gが A となっているいずれか 1 つもしくはそれ以上の変異を同定（検出）することに関するものである。 H B V の薬剤抵抗性、あるいは感受性の違いは H B Vの遺伝子型による種類の違いに起因すると考えられる。そのため本発明は H B Vのコアプロモ一夕一に上述した変異のいずれかを有する H B Vの遺伝子型を提供する。この遺伝子型を利用する薬剤抵抗性の予測方法を提供する。また本発明は H B Vの遺伝子型を同定する方法も提供する。

本発明は、遺伝子の変異を同定（検出）検出する方法が、核酸の配列を決定する方法であるものを含む。さらに、プローブまたはプライマ一として核酸を用いた核酸同士の 2 本鎖形成 (ハイブリダィゼ一ション）を利用した方法であるものを含む。さらに本発明は、上記の H B Vコアプロモー夕一領域の遺伝子変異を検出するための診断薬、診断キットを提供する。

また本発明は、 H B Vコアプロモ一夕一の配列番号 1 またはその一部の遺伝子配列を有する核酸を用いた新たな H B V治療薬に関する。かかる核酸は圆（デコイ）核酸として、 H B Vコアブロモ一夕一の野生株の遺伝子配列を夕ーゲットとする蛋白質に特異的に結合し、本来の夕ーゲットである H B V自身のコアブロモ一夕一への該蛋白質の結合を拮抗的に妨げる効果を有する。従って、本発明のデコイ核酸を生体に投与することにより、 H B Vコアプロモ一夕一からの転写を抑制し、 H B Vの増殖を阻害することが可能となる。

H B Vのコアプロモー夕一領域は、報告により多少の差はあるが、基本的には転写開始部位の上流約 2 0 0 b p までがコアプロモー夕一領域として同定されている（ Yuh CH, et al, Journal of Virology, 66, 4073-4084, 1992； Honigwachs J et al, Journal of Virology, 63， 919-924, 1989； Lopez-Cabrera M et al Proceedings of the national Academy of Sciences of the United States of America, 87, 5069-5073, 1990) 。

本発明では、説明の便宜上、塩基配列の番号を、 H B Vの 2 本鎖 D N Aの制限酵素 E c o R I 部位 G A A T T Cの最初の T を核酸番号 1 として表記する。この便宜的な番号を用いた場合に、本発明に言う H B Vコアプロモーター領域は、核酸番号 1 6 3 1 からコア蛋白の開始アミノ酸までの核酸番号 1 9 0 0 として規定される。この領域には、増殖に重要なェンハンサ一 I I領域（ E n h I I ) 及びプレゲノム U N Aのコア粒子への包含に必要なェンカブシデ一シヨンシグナル（ ε ) 領域が存在し、 Η Β Vの D Ν Αポリメラーゼゃ肝細胞特異的な核内因子の結合部位となっているため、一度変異が生ずるとウィルスの増殖 · 複製に重要な変化が生じると考えられる。この £領域は HBVの DNAポリメラ一ゼのプライミングおよび逆転写活性に必要である（ Urb an M., et al. Journal of General Virology (1998), 79, 1121-2231) 。また、ェンハンサ一 I I 領域（ E n h l I ) には footprnting あるいは metliylaton interference で同定される footprintll または Βοχα、 footprints Box ?の調節エレメントが存在している。

本発明は、ポリメラ一ゼ等が結合する領域及び、ウィルス遺伝子複製の調節に重要な役目を果たしているェンハンサ一領域に着目して、 B型肝炎の治療薬、特にラミプジンの治療効果に影響を与えるコアプロモーターの遺伝子変異を同定するものである。

本発明により B型慢性肝炎患者の治療前診断に有用な H B V コアプロモ一夕一遺伝子変異を検出することで、薬剤耐性株や肝炎再燃の少ないティラーメ一ド医療に貢献でき、また新たな診断薬を開発することができる。また、ラミブジン等の逆転写阻害剤で治療効果をあげにくいウィルスが同定できることから、こうした変異ウィルスの配列を用いることにより、かかるウイルスにも効果の高い新規抗 H BV 薬の開発に役立てることがでぎる。

本発明は、具体的には、コアプロモー夕一領域の核酸配列を確認して H B Vの遺伝子変異を同定することを含む方法であるこの領域はウィルスの増殖に重要な部位であり、遺伝子配列の違いにより、 H B Vの治療に用いられる薬剤に対する感受性が異なるという関係を有することが、本発明者らの研究により演繹的に証明された。この研究過程において、コアプロモ一夕一領域の中でも、 6 つの短い領域、さらにその中でもある特定の核酸配列の変化を確認することで、 H B Vの薬物抵抗性の違いを簡便に識別し得ることが見出いだされた。

以下、代表的な H B Vの治療薬であるラミブジンを例として本発明を説明するが、本発明はラミブジンの治療にのみ限定されるものではない。

H B Vの代表的な治療薬であるラミブジンによる治療は、血中ウィルス量を示す H B V— D N A量及び肝細胞内のウィルス量を反映するマーカ一である H B e抗原量の高力価症例において、ウィルス量が減少しにくい例が多数存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。

しかし、 H B V— D N A量や H B e抗原量の高力価症例においても、ラミブジンが奏効し、血中の H B V— D N A量を速やかに減少させ、肝炎を鎮静化させる症例が存在する。

本発明者らは、ラミブジン治療を受ける B型慢性肝炎患者の治療前血清と治療開始 6 ヶ月後の血清を用いて、 T M A法にて血中 H B V— D N A量を測定し、治療 6 ヶ月後の H B V— D N A量が検出感度未満（ S O O O c o p i e s Zm l未満）に低下した場合、ウィルス陰性群と判定し、それ以上である場合をウィルス陽性群とし、有意差検定により予後因子を検索した。次に、六波羅ら（ J o u r n a l o f M e d i c a l V i r o 1 o g y , 6 2 , 4 7 1 - 4 7 8 , 2 0 0 0 ) の方法により、採取した治療前の血清検体から市販の核酸抽出キットを用いて H B V— D N Aを抽出し、 P C R法を用いて H B Vコアプロモ一夕一領域を増幅し、 3 %ァガロースゲルにて電気泳動後、ゲルより陽性バンドを切出し、核酸を精製し、ダイレクトシークェンス法にて塩基配列を決定した。さらに、治療前のコァプロモーター領域の塩基配列と野生株との比較により、遺伝子変異を起こしている部位を選別し、治療 6 ヶ月後のウィルス陽性群と陰性群を指標に有意差検定を行い、ラミブジン治療効果を予測できる遺伝子変異部位を解析した。

その結果、従来報告されている H B e抗原陽性、 H B V— D

N A量が有意な予後マーカ一として抽出されてきたが、年齢性別 · 既往歴 · 病型，血小板値 - アルブミン値 · A L T値 ' ビリルビン値に有意差は見られなかった。しかしながら、コアプ口モー夕一領域の遺伝子変異を解析したところ、 3 箇所において有意にラミプジン治療効果と関連する遺伝子変異が検出された。

また、その H B Vコアプロモー夕一領域における遺伝子変異が、少なくとも一つでもある場合においては、 6 ヶ月後のウイルス陽性群と陰性群との間に有意差（ P < 0 . 0 0 0 1 ) が認められ、この変異を確認することでラミブジンの治療効果を予測できることが証明された。この遺伝子変異を有する H B Vと有しない H B Vは異なる遺伝子型の H B V と考えられる。この遺伝子型の違いは H B Vの増殖能等の生物学的な機能とも相関している可能性がある。

このように、本発明の H B Vコアプロモーター領域の変異は、 H B Vの D N Aポリメラ一ゼゃ肝細胞特異的な核内因子に係わる H B Vの増殖 · 複製の阻害効果に関係することが明らかとなり、この変異を同定することで、ラミブジン治療の奏効率の向上を促すことができる。したがって、 H B Vのコアプロモ一夕一領域の遺伝子変異がラミブジン治療効果の予測マーカ一として用いることが可能である。

発明の実施の形態

本発明の遺伝子の変異を同定検出する方法は、例えば HBVのコアプロモ一夕一領域の核酸配列を決定することによって行うことが可能である。核酸配列決定の方法は、基本的には Maxam & Gilb ert法あるいはジデオシキ法の改良法が使用されている。これらの詳しい解説は「 Molecular cloning: A LABORATORY MANUAL, THIRD EDITION ( COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, Cold Spring Harbor, New York) 」あるいは「新生化学実験講座 2核酸 II構造と性質 p 59-100」に詳述されている。また各種のキヅトが多くのメーカ一から発売されており、これらも利用可能である。核酸配列を決定するための DNA は、 P CR で本発明のコアプ口モーター領域を増幅し、そのままダイレクトシークェンス法で核酸の配列を決定してもよい。また一度 P CR産物をべクタ一にクローニングしてから配列の決定を行っても構わない。あるいはポイントミューテ―シヨン（点突然変異）を見つけるシ一クエンス法を用いてもよい。

本発明の核酸配列の変異を検出する方法は、遺伝子配列を決定する以外にも、 1 塩基から数塩基の違いを検出する方法であればどのような方法でも使用することが可能である。例えば S S C P、 D GGE _S C FLP、 RFLPのような遺伝子変異の検出法が利用可能である。また 1 塩基変異の S NPの検出に用いられているィンベーダ一法も利用可能である。さらに相補的な核酸が二本鎖を形成するハイブリダィゼ一ションの原理を利用した変異検出法もすベて利用可能である。これらの遺伝子、核酸の変異の検出法はプローブまたはプライマ一を用いた方法あるいはそれらを組合せた方法がある。これらのプロ一プまたはブライマーは核酸に限らず標的の核酸とハイプリダイゼ一ションで結合可能なものが含まれる。

以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによつて本発明の範囲を制限するものではない。

実施例

<実施例 1 >ラミプジン治療とウィルス陰性化に関与する予後因子の検索

慢性 B型肝炎感染患者 5 3人（男性 40例、女性 13例、平均年齢 49.8±9.4歳、慢性肝炎 38例、肝硬変 15 例）にラミブジンを 100m_g/day経口連日投与し、投与前のデ一夕および投与後のデータを解析した。ラミブジン投与 6 ヶ月の時点で HBV-DNA 量が TMA 法にて感度未満（3.7LGE/mL 未満）に低下した時、ゥィルス陰性化と判定した。

ウィルスが陰性化した人と陽性のままだった人について、年齢、性別、 HB eAg陽性率、治療前の HBV DNA量、既往歴、病型、血小板値、アルブミン、 ALT、ピリルビン値等について治療効果の予測因子となり得るかについて、 Fisherの直接法、 Mann-Whitney U検定で有意差を検定した。

表 1 剛匕群 ( =40) 陽隨 (η=13)

年齢 49.1 ±9.3 52.0±9.9 0.3007

'|^iJMan(%) 31(77.5) 9(69.2) 0.7119

HBeAg (％) 14(35.0) 12(92.3) 0.0003

HBV DNA^GE/mL 5.9 ±1.3 7.8±0.8 く 0.0001

表 1 より、従来報告されている H B e抗原陽性、 H B V— D N A量が有意な予後マ一カーとして抽出されてきたが、年齢 · 性別 ' 既往歴 · 病型 ' 血小板値 ' アルブミン値 ' A L T値 ' ビリルビン値に有意差は見られなかった。

<実施例 2 > H B Vコアプロモー夕一領域の塩基配列の決定

実施例 1 でラミブジン治療を行った 53例のうち、 4 3例の治療前患者血清 5 0 ^1 からウィルス： D N Aを D N A抽出キヅト (スマイテスト、 (株）ゲノムサイエンス研究所）でマ二ユアルに従って抽出した。

抽出 D N A 2ul、 0.5U の AmpliTaq Gold ( PE applied Biosystems ) を反応液 ( 200μΜ dNTP, 50mM KCL, lOmM Tris-HCL[pH 8.3], 2.0mM MgC12, 0.001%gelatin) 25μ1 にカロえ、 is2:5'-GAG ACC ACC GTG AAC GCC CA(1611 · 1630)および CB4:5'-AAA AGA GAG TAA CTC CAC AG (1954-1935)®各プライマー 0.25mMで増幅した。

PCR protocolは preheat の後、 94°C、 3 0秒、 5 5 °C、 1 分のサイクルを 43サイクル繰り返した。サ一マルサイクラ一は DNA Engine ( MJ Research Corp. Watertown, MA) を用いた。 PGR陰性検体は、 outer primer set にて Ist PCR を行った後、 2nd PCRは 30サイクルとした。この P CRで陰性だった検体は、 outer primers set として、 es2:5'.ACG TCG CAT GGA GAC CAC CG (1601-1620)、 CB2:5'-GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA (1974- 1955)を用レヽ、 1st PCRを行った後に、 is2 と CB4のプライマ一で 30サイクルの 2nd PCR を行なった。

この PCR 産物を 3 %ァガロースゲルで電気泳動後、ゲルからバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotec Inc) で精製した。シ一クェンスはジデォキシ法である、 Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit で反応させ、 fluorescent DNA sequencer (Applied Biosystems)で解析した。配列を決定した 43例の患者のコァプロモーター領域配列を第 1 一 1 図〜第 1 一 3 図に示す。

H5 から 2 6 2 までの 31 検体がラミブジン治療により、 6 力月後に血中の D NA 量が検出限界以下に減少した患者の配列である。 A 1 7 から A5 までの 1 1 検体が D NA が検出限界以下まで減少せず、ラミプジンの治療効果が少なかつた患者の配列である。

各図の一番上の列は、元になる配列（野生型）の配列を示している。各図の上段 3 1検体と下段 1 2検体では配列に違いがあることがわかる。またその違いは一定の領域に集中していることが明らかである。ラミブジンの効果のある群（効果群）では、塩基番号で 1 6 7 1 〜 1 6 8 2番目の領域（配列番号 2 ) に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に 16 74 番目 (配列番号 1 の 2 8番目）の核酸 Tが Cに、 16 79番目（配列番号 1 の 3 3 番目）の Aが Gに変化しているが、ラミプジンの効果のない群（非効果群）ではそのような変化は見られない。

またラミブジンの治療効果を奏した群では、塩基番号で 1 7 0 1 〜 1 7 2 1 番目の領域（配列番号 3 ) に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に 1 Ί 0 3番目（配列番号 1 の 5 7 番目）の核酸 Aが C または Gに、 1 7 1 9番目（配列番号 1 の 7 3 番目）の Tが Gに変化しているが、ラミブジンの治療効果を奏さなかった非効果群ではそのような変化は見られない。

同様に、効果群では塩基番号で 1 7 3 6 〜 1 Ί 6 1番目の領域（配列番号 4 ) に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に 1 7 5 2 番目（配列番号 1 の 1 0 6番目）の核酸 Aが T または C または Gに、 1 Ί 5 3番目（配列番号 1 の 1 0 7 番目）の Tが Gまたは Cに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。

さらに、効果群では塩基番号で 1 7 9 9 〜 1 8 1 7 の領域（配列番号 5 ) に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多く、 1 8 0 2 番目、 1 8 0 3番目、 1 8 0 9 番目、 1 8 1 0番目、 1 8 1 1 番目、 1 8 1 2番目、 1 8 1 4番目に変化が見られるが、非効果群ではそのような変化は見られない。さらに効果群では 1 8 4 3 — 1 8 6 0 番目の領域（配列番号 6 ) に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に 1 8 4 6番目（配列番号 1 の 2 0 0 番目）の核酸 Aが T または Cに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。効果群では 1 8 9 3 — 1 9 0 2 番目の領域（配列番号 7 ) に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に 1 8 9 6 番目（配列番号 1 の 2 5 0番目）の核酸 Gが Aに、 1 8 9 9 番目（配列番号 1 の 2 5 3 番目）の Gが Aに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。

<実施例 3 >コアプロモ一夕一領域の遺伝子変異による解析 ( A ) 遺伝子変異部位による統計的解析さらに効果のあった患者 9 人および効果の無かった患者 2検体のコアプロモー夕一領域を実施例 1 の方法に従って配列決定し、合計 5 3検体についてラミブジンの治療効果と核酸配列の変化（変異）関係を調べ、 Fishe rの直接法で有意差を検定した。表 2 に有意差のあった変異と、陽性群には見られず、陰性化群に見られた変異を示す。表 2

C1653T 16 3 0.3340

T1674C 11 0 0.0474

A1703G/C 7 0 0.1737

T1719G 8 0 0.1764

A1752T/C/G 5 0 0.3174

T1753C/G 9 0 0.0924

A1846T/C 18 0 0.0021

G1S96A 18 0 0.0021

G1899A 8 0 0.1764 表 2 の陰性化群（ n = 40) はラミブジン治療の効果のある群、陽性群（ n=13) はラミプジン治療の効果のない群である。このようにいくつかのボイントで有意差があることが示された。尚、コアプロモ一夕一変異（A1762T, G1764A)については、陰性化群、陽性群でそれそれ 82.5%, 84.6%にみられ、有意差はなかった。

( B ) コアプロモーター領域全体における変異の統計的解析表 2 に示した核酸の変化が見られる検体と全く見られない検体で、ラミブジンの治療効果の予測ができるかについて、 Fisher の直接法で有意差を検定した。表 3 1つも変化なし 1つは変化あり計

6ヶ月後のウィルス陽性 10 3 13 陰性 5 35 40

„ 計 15 38 53

P<0.0001

いずれかの変化が見られる患者は 53人中 38人でそのうち 35 人はラミブジン治療の効果が認められた。また一箇所も変化が見られなかった患者は 15人で、そのうち 10人は治療効果が見られなかった。このことはこのコアプロモー夕一領域の核酸配列の変化がラミブジン治療の効果に顕著な閧連があることを示している。ラミブジンは R N A依存性 D N Aポリメラ一ゼ阻害効果を有しており、それが HBVの増殖抑制に閧与していると考えられる。

本発明の効果

本発明によれば、ウィルス側の遺伝子変異を治療前または治療中に検出することにより、ラミプジンに代表される H B V治療の効果を予測でき、治療成績を向上させる、または耐性株や肝炎再燃をおさえるなどの効果が期待できる。

図面の簡単な説明

第 1 — 1 図は、ラミブジン治療を行った患者の H BVコアプロモ一夕一領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段 3 1検体がラミブジン治療効果のある検体、下段 12検体が治療効果が無かった検体を表す。

第 1一 2 図は、ラミブジン治療を行った患者の HBVコアプロモ —夕一領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段 3 1検体がラミブジン治療効果のある検体、下段 12検体が治療効果が無かった検体を表す。第 1 ― 3 図は、ラミブジン治療を行った患者の H BVコアプロモ一夕一領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段 3 1検体がラミプジン治療効果のある検体、下段 12検体が治療効果が無かった検体を表す。

Claims

請求の範囲

1 . B型肝炎ウィルス（ H B V ) コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、 HB Vの薬剤抵抗性を識別する方法。

2 . B型肝炎ウィルス（ H B V ) の薬剤抵抗性が R N A依存性 D N Aポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤への抵抗性である、請求項 1 に記載の方法。

3 · R N A依存性 D N Aポリメラ一ゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである、請求項 2 に記載の方法。

4 . コアプロモ一夕一領域の核酸配列が配列番号 1 に記載された配列である、請求項 1〜 3 のいずれかに記載の方法。

5 . H B Vコアプロモ一夕一領域の核酸配列内の、配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、または配列番号 7 に示された核酸配列に相当する部分配列の少なくとも 1 の部分における遺伝子変異を確認することからなる、請求項 1 〜 4のいずれかに記載の方法。

6 . 配列番号 1 の 7番目の核酸 C、 2 8番目の核酸！¹、 3 3 番目の核酸 A、 5 7番目の核酸 A、 7 3番目の核酸 T、 1 0 6 番目の核酸 Α、 1 0 7番目の核酸 Τ、 2 0 0番目の核酸 Α、 2 5 0番目の核酸 G、または 2 5 3 番目の核酸 Gのいずれか 1 つもしくはそれ以上の核酸が変化している遺伝子変異を確認する、請求項 1 〜 5 のいずれかに記載の方法。

7 . 配列番号 1 に記載された 7番目の核酸 Cが T に、 2 8番目の核酸 Tが Cに、 3 3 番目の核酸 Αが Gに、 5 7 番目の核酸 Aが G もしくは Cに、 7 3 番目の核酸が Gに、 1 0 6 番目の核酸 Aが T もしくは Cもしくは Gに、 1 0 7 番目の核酸 Tが C もしくは Gに、 2 0 0番目の核酸 Aが T もしくは C に、 2 5 0 番目の核酸 Gが Αに、または 2 5 3 番目の核酸 Gが Aに変化したいずれか 1 つもしくはそれ以上の遺伝子変異を確認する、請求項 6 に記載の方法

8 . 配列番号 1 に記載された 7番目の核酸 C、 2 8番目の核酸！¹、 3 3 番目の核酸 A、 5 7番目の核酸 A、 7 3 番目の核酸 T、 1 0 6 番目の核酸 A、 1 0 7番目の核酸 T、 2 0 0 番目の核酸 Α、 2 5 0 番目の核酸 G、または 2 5 3番目の核酸 Gのいずれか一つもしくはそれ以上の核酸に遺伝子変異を有する Η Β V遺伝子型を同定する方法。

9 . 配列番号 1 に記載された 7番目の核酸 Cが Τ に、 2 8番目の核酸 Τ が Cに、 3 3 番目の核酸 Aが Gに、 5 7 番目の核酸 Aが Gもしくは Cに、 7 3 番目の核酸 Tが Gに、 1 0 6 番目の核酸 Aが T もしくは C もしくは Gに、 1 0 7番目の核酸 Tが C もしくは Gに、 2 0 0番目の核酸 Aが Tもしくは Cに、 2 5 0 番目の核酸 Gが Aに、または 2 5 3 番目の核酸 Gが Aに変化したいずれか一つもしくはそれ以上の遺伝子変異を有する H B V 遺伝子型を同定する方法。

1 0 . 遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定を H B Vの塩基配列を決定することで行う、請求項 1〜 9 のいずれかに記載の方法。

1 1 . 遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定をプローブまたはプライマ一を用いた方法で行う、請求項 1 〜 9 のいずれかに記載の方法。

1 2 . 配列番号 1 〜 7 のいずれかに記載の核酸配列またはその一部からなる核酸を用いた H B V治療薬。