KR101948816B1 - B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물 - Google Patents

B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101948816B1
KR101948816B1 KR1020140150448A KR20140150448A KR101948816B1 KR 101948816 B1 KR101948816 B1 KR 101948816B1 KR 1020140150448 A KR1020140150448 A KR 1020140150448A KR 20140150448 A KR20140150448 A KR 20140150448A KR 101948816 B1 KR101948816 B1 KR 101948816B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hbv
lamivudine
seq
resistant
probe
Prior art date
Application number
KR1020140150448A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160051061A (ko
Inventor
지승일
강진석
이동환
Original Assignee
에스케이텔레콤 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에스케이텔레콤 주식회사 filed Critical 에스케이텔레콤 주식회사
Priority to KR1020140150448A priority Critical patent/KR101948816B1/ko
Publication of KR20160051061A publication Critical patent/KR20160051061A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101948816B1 publication Critical patent/KR101948816B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 HBV 유전자 및 라미부딘 내성 HBV 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 포함하는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출하기 위한 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 검출 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 특정 DNA 프라이머 및 프로브와 PNA 프로브를 이용하여 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출할 수 있는바, 만성 B형 간염 환자를 정확히 진단하고, 조기에 약물 전환을 권고할 수 있는 정보를 제공하여 환자의 치료 비용을 줄이고, 환자를 추적 관찰하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스(HBV) 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물{COMPOSITION FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) AND LAMIVUDINE-RESISTANT HBV}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물에 관한 것으로서, HBV 유전자 및 라미부딘 내성 HBV 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 포함하는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출하기 위한 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 검출 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 바이러스성 질병인 B형 간염을 유발하는 원인 바이러스로서, 전 세계적으로, 특히 열대 아프리카, 동남아시아와 극동아시아에 널리 퍼져 있다. HBV로 인한 간염 환자는 전 세계적으로 약 20억명 정도로 추정되고 있는데, 이들 중 약 3억 5천만 명 정도가 만성 간염환자로 파악되고, 상당수가 간경화 또는 간암으로 진행되고 있는 것으로 알려져 있다.
HBV 감염의 진단법으로서는, 검체 중에 존재하는 HBV에 대한 항체를 검출하는 항체 검출법, HBV의 항원을 검출하는 항원 검출법, 또는 HBV의 유전자를 검출하는 방법이 있다. HBV 항원 검출법은 흔히 HBV 표면항원(HBV Surface Antigen, HBsAg)이나 HBV e 항원(HBeAg) 등을 진단 마커로 활용하여 혈액 내 존재 유무를 판별한다. 하지만, 상기 방법들은 바이러스의 라이프사이클에 따라 조기진단이 어려우며, HBV 감염환자의 혈액내에 HBsAg나 HBeAg 등이 줄어들거나 존재하지 않는 경우 HBV 감염 여부를 정확히 진단하지 못하는 문제가 있다. 이에, 핵산 증폭법(Nucleic acid amplification technique)의 한 방법으로 PCR이 HBV 감염 진단에 널리 사용되고 있다.
한편, B형 간염의 치료제로서 라미부딘(lamivudine, (-)-β-L-2',3'-dideoxy-3', thiacytidine, 3TC)이 사용되어 왔다. 라미부딘은 사이토신 뉴클레오사이드 유사체(cytosine nucleoside analogue)로서 처음에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 역전사효소를 억제하는 약물로 알려졌으나 HBV의 역전사효소(Reverse trancriptase; RT)에도 강력한 억제작용이 있는 것이 밝혀져 B형 간염의 치료제로서 사용되고 있다. 그러나 6개월 이상 장기간 라미부딘 치료를 받은 만성 B형 간염 환자에서 라미부딘에 내성을 갖는 HBV가 보고되었다. 이러한 내성은 HBV 역전사효소(RT) 내의 YMDD 모티프(rt203-206)의 점 돌연변이가 그 원인으로 밝혀져 있는데, 대표적인 돌연변이로서 204번째 아미노산(rt204)인 메티오닌이 이소류신으로 치환된 YIDD 변이형과 메티오닌이 발린으로 치환된 YVDD 변이형이 있다. 이와 더불어 rt180의 돌연변이 역시 중요한 돌연변이로 라미부딘에 내성을 갖는 것으로 밝혀져 있고, 류신이 트레오닌으로 치환된 변이형이 내성을 갖는 것으로 밝혀져 있다.
라미부딘 내성 HBV를 갖는 B형 간염 환자의 경우에는 다른 약물로의 전환을 고려하여야 하기 때문에, 라미부딘 내성 HBV를 검출하는 것은 매우 중요하다. 하지만, 종래의 HBV 유전자 검출법은 라미부딘 내성 HBV를 검출할 수 없는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 특정 프라이머 및 프로브를 이용하여 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 동시에 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 유전자를 동시에 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍; (2) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍; (3) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브들; (4) HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 10 및 11로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍; 및 (5) 라미부딘 내성 HBV의 돌연변이된 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 12 및 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍을 포함하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물을 제공한다.
다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 조성물을 이용하여, 분리된 생물학적 시료로부터 HBV 유전자 및 라비부딘 내성 HBV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HBV 및 라비부딘 내성 HBV의 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 특정 DNA 프라이머 및 프로브와 PNA 프로브를 이용하여 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출할 수 있는바, 만성 B형 간염 환자를 정확히 진단하고, 조기에 약물 전환을 권고할 수 있는 정보를 제공하여 환자의 치료 비용을 줄이고, 환자를 추적 관찰하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PCR 클램핑(clamping) 기술에서의 PNA 프로브의 기능을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR을 나타낸 모식도이다.
도 3은 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물를 이용한 라미부딘 내성과 HBV 양의 예측 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물을 이용하여 HBV 및 라미부딘 내성 HBV를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 (1) B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍; (2) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍; (3) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브들; (4) HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 10 및 11로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍; 및 (5) 라미부딘 내성 HBV의 돌연변이된 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 12 및 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍을 포함하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본원에서 용어, "B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)"는 주로 혈액을 통하여 전염되는 간염을 유발하는 바이러스이다.
HBV의 외피유전자는 preS1과 preS2로 이루어지는 preS; 및 S 부위로 구성되고, 외피유전자 전체가 전사(transcription)된 후, 3개의 다른 위치에서 번역(translation)이 일어나는 대체번역(alternate translation)에 의하여 3개의 외피단백질(L 단백질, M 단백질 및 S 단백질)이 생산된다. L 단백질은 preS1 에서 번역이 시작되어 preS1 도메인, preS2 도메인 및 S 도메인을 모두 포함하는 약 400 아미노산으로 구성된다. M 단백질은 preS2에서 번역이 시작되어 preS2 도메인 및 S 도메인을 포함하는 약 281개의 아미노산으로 구성된다. S 단백질은 S 도메인만을 포함하는 약 226개의 아미노산으로 구성되며 가장 많은 양이 생산되어 바이러스 입자의 주 구성성분을 이룬다. 이들 외피단백질의 S 도메인 부위가 서로 결합하여 입자를 형성함으로써 S 항원을 이룬다. M 단백질과 L 단백질에 포함된 preS1 및 preS2 도메인은 입자의 바깥쪽에 위치하며, 높은 면역반응을 유도하는 preS 항원으로 작용한다.
또한 HBV를 위한 많은 약물들의 표적이 되는 역전사효소(reverse transcriptase; RT) 단백질은 HBV의 RNA 의존적 DNA 중합효소로서 344개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 변이에 의해 약물, 특히 라미부딘 내성 HBV가 유도된다.
B형 간염은 크게 급성과 만성으로 구분된다. 급성의 경우, 증상은 A형 또는 C형 간염과 비슷하며, 대부분 아무런 증상 없이 지나가고 독감과 같은 증상이 나타나기도 하는데 별도의 치료 없이 호전되기도 한다. 만성의 증상도 C형 간염과 유사한데, 쉽게 피곤하거나 열이 나며, 구역질, 근육통 또는 관절통 증상이 나타난다. B형 간염은 증세가 장기간 지속되면 간경화증이나 간암으로 발전할 가능성이 높으므로 지속적인 검사가 필요한 질병으로서, 진단 방법으로는 PCR을 이용한 방법 등이 있으나, 기존 PCR을 이용한 진단 방법은 HBV의 정량/정성적 분석만이 가능하여, 약물에 내성을 갖는 변이형을 검출할 수 없으므로, 약물전환 권고를 위한 정보를 제공하지 못한다.
이에 반해, 본 발명은 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하는 동시에 라미부딘 내성 HBV의 돌연변이된 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브, 및 PNA 프로브를 사용하여 하나의 반응에 의해 HBV와 라미부딘 내성 HBV를 간편하게 정확하게 증폭 및 검출할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에 따른 HBV 검출용 조성물에 포함되는 프라이머는, HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합가능한 프라이머 쌍 및 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합가능한 프라이머 쌍이다. 상기 프라이머는 HBV PreS2 단백질 부위 또는 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합 가능한 7 내지 50개의 염기서열, 보다 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍으로 이루어진다. 구체적으로, 본 발명에 따른 HBV 검출용 조성물에 포함되는 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머(forward primer; 'HBV qPCR F 프라이머'라 함) 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 역방향 프라이머(reverse primer; 'HBV qPCR R 프라이머'라 함); 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 정방향 프라이머('LAM-R F 프라이머'라 함) 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 역방향 프라이머('LAM-R R 프라이머'라 함)로 구성된다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍에 의하여 PreS2 단백질을 코딩하는 유전자가 특이적으로 증폭될 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의하여 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자가 특이적으로 증폭될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머의 염기서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단, 예를 들어 메틸화, 캡화 등을 이용하여 변형될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴, FAM, BHQ-1, 2, MGB, Quasar 670 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브들을 포함한다.
PNA는 천연 핵산의 골격이 폴리아마이드로 대체된 인공 핵산으로서 DNA 또는 RNA와 상보적 결합력이 탁월하며, 물리학적으로 매우 안정하다. PNA는 천연 핵산과는 달리 화학구조가 전기적 중성이어서 상보적인 핵산과 결합할 때 전기적 반발력이 적은 것으로 알려져 있다. 또한, PNA는 상보적인 핵산과의 결합 반응이 매우 빠르게 일어나, 염기 개수 및 서열에 따라 정도의 차이는 있지만, PNA-DNA 결합의 경우 DNA-DNA결합보다 100배 내지 5,000배 정도 빠르다. 나아가, PNA는 중합효소에 의해 효소 분해가 되지 않아 PCR 상에서 PNA가 결합된 DNA는 증폭이 억제되는 반면, 돌연변이가 일어난 DNA는 증폭되어 PCR 클램핑(clamping) 기술에 널리 사용되고 있다.
본 발명에서, RT 단백질의 180번째 아미노산과 204번째 아미노산의 유전형에 따라 DNA 프로브와 PNA 프로브는 경쟁적으로 HBV 유전자와 결합한다. 즉, PNA와 상보적인 HBV 유전자가 있으면 DNA 프로브는 결합하지 못하여 DNA 프로브에서 형광 신호가 나오지 않지만, PNA와 상보적이지 않은 HBV 유전자가 있으면 PNA는 결합하지 못하고 DNA 프로브가 결합하여 형광신호가 나오게 된다(도 1 참조).
본 발명에 사용된 PNA 프로브는 특정 HBV 유전자를 억제하기 위한 목적으로 사용된다. 구체적으로, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브('S180L PNA 프로브'라 함)는 RT 단백질에서 야생형 류신인 180번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드를 억제하기 위한 목적으로 사용되며, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브('AS204I PNA 프로브'라 함)는 RT 단백질에서 메티오닌이 이소류신으로 돌연변이된 204번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드를 억제하기 위한 목적으로 사용되고, 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브('AS204V PNA 프로브'라 함)는 RT 단백질에서 메티오닌이 발린으로 돌연변이된 204번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드를 억제하기 위한 목적으로 사용된다.
나아가, 본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 위음성 반응을 확인하기 위한 내부 대조군으로, 사람 및 HBV 유전자에는 존재하지 않는 유전자에 특이적인 프라이머인, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머('IC F 프라이머'라 함) 및 서열번호 9으로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머('IC R 프라이머'라 함)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 서열번호 1 및 2의 DNA 프라이머쌍을 이용한 PCR에 의해 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있고, 이와 동시에 서열번호 3 및 4의 DNA 프라이머쌍, 및 서열번호 5, 6 및 7의 PNA 프로브쌍을 이용한 PCR에 의해 HBV의 돌연변이된 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있으므로, 종래의 HBV만을 검출하는 PCR 방법과 비교하여 HBV와 라미부딘 내성 HBV를 동시에 검출할 수 있다는 점에서 매우 유익하다. 상기 라미부딘 내성은 라미부딘에 대한 감수성(susceptibility)이 낮은 것으로 의미하며, 본 발명에 따른 조성물은 HBV 감염 여부, HBV 역학 조사, 라미부딘의 유효성 및 위해도 조사 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 전술한 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 핵산을 검출하기 위한 프로브(probe) 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드, 즉 본원에서 전술한 프라이머쌍에 의해 증폭된 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자 및 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 발명에 따른 HBV 검출용 조성물에 포함되는 프로브는 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합가능한 프로브 및 HBV RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합가능한 프로브이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 HBV 검출용 조성물에 포함되는 프로브는 서열번호 10으로 표시되는 HBV 유전자형들의 PreS2 단백질 부위 내의 공통 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브('HBV qPCR 프로브'라 함) 및 서열번호 11로 표시되는 HBV 유전자형 B의 PreS2 단백질 부위 내의 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브('HBV B 특이적 qPCR 프로브'라 함); 및 서열번호 12로 표시되는 HBV RT 단백질 내의 180번째 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프로브('LAM-R-S180M 프로브'라 함) 및 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 HBV RT 단백질 내의 204번째 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프로브('LAM-R-AS204M MGB 프로브'라 함)로 구성된다.
본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 위음성 반응을 확인하기 위한 내부 대조군으로, 사람 및 HBV 유전자에는 존재하지 않는 유전자에 특이적인 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브('IC 프로브'라 함)를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물은 내부 대조군으로서 서열번호 8 및 9로 각각 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍, 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 프로브는 형광성, 방사성 또는 발광성 물질로 표지될 수 있다. 바람직한 하나의 양태로서 본 발명에 따른 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광 물질로 표지될 수 있다. 하나의 바람직한 양태로서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되어 있고, 5' 말단에 표지된 형광 물질(reporter)과 3' 말단에 표지된 형광물질(quencher)은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 PreS2 단백질 혹은 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 결합된 상태에서는 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광 물질은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색 반응을 하게 된다. 이와 같은 상기 발색 반응에 의하여 시료로부터 HBV의 존부 및 라미부딘 내성 HBV의 존부 및 유형을 판단할 수 있게 된다. 상기 5' 말단의 형광 물질의 예로는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM(5-carboxy fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar670(Quasar670 Carboxylic Acid phosphoramidite) 또는 Cy5(cyanine-5)를 들 수 있으며, 상기 3' 말단의 형광물질의 예로는 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), 또는 BHQ 1, 2 및 3(black hole quencher 1, 2, 3)을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 검출을 위한 프라이머 및 프로브 외에도 완충용액, KCl, MgCl2, 또는 dNTP 등을 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 전술한 조성물을 이용하여, 분리된 생물학적 시료로부터 HBV 유전자 및 라비부딘 내성 HBV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HBV 및 라비부딘 내성 HBV의 동시 검출 방법을 제공한다.
상기 HBV 및 라비부딘 내성 HBV의 동시 검출 방법은 상기의 프라이머 및 프로브를 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 이런 방법에는 특정한 가닥의 프라이머를 프로브로 사용하여 이를 검출하는 HBV DNA의 직접 확인법이 있고, 서던 블럿팅(southern blotting), 도트 블럿팅(dot blotting) 및 FISH(filter in situ hybridization) 등을 예로 들 수 있다. 다른 방법으로는 프라이머 쌍을 사용하여 HBV DNA의 증폭을 이용하는 방법이 있고, 유전형-특이적 PCR(polymerase chain reaction), 일반화된-프라이머(general-primer) PCR 등을 그 예로 들 수 있다. 보다 바람직하게는 PCR이며, 더욱 바람직하게는 실시간 PCR(real-time PCR)이다.
본 발명은 만성 B형 환자에게 PCR 결과만으로 HBV 유전자 검출과 라미부딘 내성 HBV 유전자 검출을 위한 DNA 프라이머, 프로브 및 PNA 프로브를 를 제공하는데 의의가 있다. 본 발명에 사용되는 프라이머 및 프로브들은 타당도(validity)와 신뢰도(reliability)가 높아 결과에 대한 신뢰도를 높여준다.
본 발명에 따른 HBV 유전자를 검출하는 방법은 (1) B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍, HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍, 및 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브들을 이용한 실시간 다중 PCR에 의해 HBV PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (2) 상기 증폭된 PCR 산물을 HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 10 및 11로 기재된 염기서열을 가지는 프로브 쌍, 및 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 12 및 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍과 반응시켜 HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 유전자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브의 제작
<1-1> DNA 프라이머 및 프로브의 제작
HBV의 유전자(AF068756)를 hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석하여 HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍(HBV qPCR F 프라이머 및 HBV qPCR R 프라이머), HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍(LAM-R F 프라이머 및 LAM-R R 프라이머), 및 상기 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 프로브들의 염기서열을 결정하였다. 상기 결정된 염기서열을 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 상기 결정된 염기서열이 각각 HBV의 PreS2 단백질 및 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
상기 결정된 염기서열을 바탕으로, 메타비온사(metabion, 독일)에 의뢰하여 프라이머 및 프로브를 합성하였다.
또한, 위음성 반응을 확인하기 위한 내부 대조군으로, 사람 및 HBV 유전자에는 존재하지 않는 유전자에 특이적인 센스 프라이머(IC F 프라이머) 및 안티센스 프라이머(IC R 프라이머)도 함께 합성하였다.
<1-2> PNA 프로브의 제작
HBV의 역전사효소(RT) 유전자에서 라미부딘 내성과 연관되어 있다고 알려진 180번째 염기 변이, 204번째 염기 변이를 검출할 수 있는 프로브를 제작하였다. HBV의 유전자(AF068756)를 hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석하여 HBV의 RT 단백질 부위 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브들의 염기서열을 결정하였다. 상기 결정된 염기서열을 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 상기 결정된 염기서열이 각각 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
상기 결정된 염기서열을 바탕으로, 메타비온사(metabion, 독일)에 의뢰하여 프라이머 및 프로브를 합성하였다. 구체적으로, 180번째 야생형 아미노산인 류신을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5의 프로브, 메티오닌이 이소류신으로 치환된 204번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 6의 프로브 및 메티오닌이 발린으로 치환된 204번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 메타비온사(metabion, 독일)에 의뢰하여 합성하였다.
<1-3> DNA 프로브의 제작
HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 쌍과 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 쌍을 제작하였다.
HBV의 유전자(AF068756)를 hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석하여 HBV의 RT 단백질 부위 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 프로브들의 염기서열을 결정하였다. 상기 결정된 염기서열을 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 상기 결정된 염기서열이 각각 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 결합할 수 있는 서열번호 10 및 11으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍(HBV qPCR 프로브 및 HBV B 특이적 qPCR 프로브) 및 HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 12 및 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍(LAM-R-S180M 프로브 및 LAM-R-AS204M MGB 프로브)를 메타비온사(metabion, 독일)에 의뢰하여 합성하였다.
또한, 위음성 반응을 확인하기 위한 내부 대조군으로, 사람 및 HBV 유전자에는 존재하지 않는 유전자에 특이적인 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브(IC 프로브)를 동일한 방법으로 제작하였다.
상기 실시예 <1-1> 내지 <1-3>에서 합성된 프라이머 및 프로브의 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 또는 프로브명 서열 서열번호
HBV qPCR F 프라이머 ATC GCT GGA TGT GTC TGC 1
HBV qPCR R 프라이머 ACG GGC AAC ATA CCT TGR 2
LAM-R F 프라이머 ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG GC 3
LAM-R R 프라이머 GAG GTA AAA AGG GAC TCA AGA TG 4
S180L PNA 프로브 CGT TTC TCC TG 5
AS204I PNA 프로브 CAC ATC ATC AAT 6
AS204V PNA 프로브 CAC ATC ATC CAC AT 7
IC F 프라이머 CGG CTC AAA TCC GTT GGT ATA G 8
IC R 프라이머 GGA ATC GGA TGC AGA CGA TAA G 9
HBV qPCR 프로브 TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC 10
HBV B 특이적 qPCR 프로브 TTC CTC TGC ATC CTG CTG CTA TGC 11
LAM-R-S180M 프로브 TCC GTT TCT CAT GG 12
LAM-R-AS204M MGB 프로브 ACA TCA TCC ATA T 13
IC 프로브 ATC GAT CAA CCA GCT TCT GGC TCA 14
* 상기 서열번호 2의 서열 중 'R'은 아데닌(A) 또는 구아닌(G)임.
실시예 2: 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 다중 PCR 에 의한 HBV 및 라미부딘 내성 HBV 검출
HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물에서 50IU/ml 이상의 HBV 유전자와 라미부딘 내성 HBV의 검출은 야생형과 돌연변이형에 대해 검출하는 것으로서 rt180에서는 류신과 메티오닌을 검출하고, rt204에서는 메티오닌, 이소류신 및 발린을 검출한다.
이에 따라, 만약 HBV가 혈액 내에서 50 IU/ml 이상이며, RT 단백질에서 rt180이 류신이고, rt204가 메티오닌이라면, 도 3의 첫 번째 그래프(상단으로부터)와 같은 결과가 예측되고, 만약 HBV가 혈액 내에서 50 IU/ml 이상이며, RT 단백질에서 rt180이 류신이고, rt204가 이소류신 또는 발린이라면, 도 3의 두 번째 그래프와 같은 결과가 예측된다. 또한 만약 HBV가 혈액 내에서 50 IU/ml 이상이며, RT 단백질에서 rt180이 메티오닌이고, rt204가 메티오닌이라면, 도 3의 세 번째 그래프와 같은 결과가 예측되고, 만약 HBV가 혈액 내에서 50 IU/ml 이상이며, RT 단백질에서 rt180이 메티오닌이고, rt204가 이소류신 또는 발린이라면, 도 3의 네 번째 그래프와 같은 결과가 예측된다. 다만, 만약 HBV가 혈액 내에서 50IU/ml 이하로 존재하게 되면, 내부 대조군을 제외한 어떠한 것도 검출되지 않는다.
상기 예측 결과에 기초하여, 실제 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR에 의해 HBV 및 라미부딘 내성 HBV 검출하였다.
구체적으로, HBV 감염이 의심되는 환자 혈액으로부터 혈청 또는 EDTA-플라즈마(EDTA-Plasma)를 분리해낸 다음, 퀴아젠(Qiagen)사의 QIAamp MineElute Virus Spin Column과 같은 실리카 막(Silica Membrane) 기반의 스핀 컬럼(Spin Column)을 이용하여 HBV DNA를 추출하였다. 상기 추출된 DNA를 자동염기서열법에 의해 서열을 확인하고 이를 아미노산으로 번역한 결과, RT 단백질의 rt180은 류신이었고, rt204는 메티오닌이었다.
이후, 하기 표 2와 같은 조성으로 PCR 반응 조성물을 제조하고, 표 3과 같은 조건으로 ABI 7500 real time PCR (Life Technology, 미국)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 실시간으로 반응 산물을 측정하였으며, 반응이 완료된 후 결과를 ABI 7500 소프트웨어 v2.0.6 프로그램을 이용하여 분석하였다.
시약 농도 부피 시약 농도 부피
HBV qPCR F 프라이머
(서열번호 1)		 10uM 0.3 IC 프로브
(서열번호 14)		 10uM 0.3
HBV qPCR R 프라이머
(서열번호 2)		 10uM 0.1 LAM-R-S180M 프로브
(서열번호 12)		 10uM 0.8
IC F 프라이머
(서열번호 8)		 10uM 0.4 LAM-R-AS204M MGB 프로브
(서열번호 13)		 10uM 0.2
IC R 프라이머
(서열번호 9)		 10uM 0.4 S180L PNA 프로브
(서열번호 5)		 20uM 2.0
LAM-R F 프라이머
(서열번호 3)		 10uM 0.3 AS204I PNA 프로브
(서열번호 6)		 20uM 0.5
LAM-R R 프라이머
(서열번호 4)		 10uM 0.2 AS204V PNA 프로브
(서열번호 7)		 20uM 0.2
HBV qPCR 프로브
(서열번호 10)		 10uM 0.2 IC 주형 - 2
HBV B 특이적 qPCR 프로브
(서열번호 11)		 10uM 0.1 주형 - 3
PreMixture 2x 12.5 증류수 - 1.5
* 상기 표에서 PreMixture는 Atpat Taq Premixture(Roche, USA)의 제품을 사용하였고, IC 주형은 사람과 HBV 바이러스에 관련이 없는 유전자를 인위적으로 합성한 내부 대조군 유전자이다.
온도 시간 반복
95℃ 10초 1
95℃ 10초 40
58℃ 10초
72℃ 30초
상기 PCR 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 'HBV'는 HBV 유전자의 검출 결과를 나타낸 것이고, 'S180'은 RT 단백질의 180번째 아미노산을 검출한 결과를 나타낸 것이며, 'ASS204'는 RT 단백질의 204번째 아미노산을 검출한 결과를 나타낸 것이고, 'IC'는 내부 대조군의 그래프이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 감염이 의심된 환자는 HBV에 감염되어 있었고, HBV RT 단백질의 180번째 아미노산은 야생형 류신이었고 204번째 아미노산은 야생형인 메티오닌이었다. 상기 결과는 HBV 서열 확인 결과와 일치하였고, 감염된 HBV는 라미부딘 내성 HBV가 아닌 것으로 확인되었다.
이와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 HBV 유전자를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 라미부딘 내성 HBV 유전자를 검출할 수 있다.
<110> SK Telecom Co., Ltd. <120> COMPOSITION FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) AND LAMIVUDINE-RESISTANT HBV <130> FPD/201409-0012 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV qPCR F primer <400> 1 atcgctggat gtgtctgc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV qPCR R primer <400> 2 acgggcaaca taccttgr 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAM-R F primer <400> 3 attcccatcc catcatcctg ggc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAM-R R primer <400> 4 gaggtaaaaa gggactcaag atg 23 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S180L PNA probe <400> 5 cgtttctcct g 11 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS204I PNA probe <400> 6 cacatcatca at 12 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS204V PNA probe <400> 7 cacatcatcc acat 14 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC F primer <400> 8 cggctcaaat ccgttggtat ag 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC R primer <400> 9 ggaatcggat gcagacgata ag 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV qPCR probe <400> 10 ttcctcttca tcctgctgct atgc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV B specific qPCR probe <400> 11 ttcctctgca tcctgctgct atgc 24 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAM-R-S180M probe <400> 12 tccgtttctc atgg 14 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAM-R-AS204M MGB probe <400> 13 acatcatcca tat 13 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC probe <400> 14 atcgatcaac cagcttctgg ctca 24

Claims (9)

  1. (1) B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍;
    (2) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍;
    (3) HBV의 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 염기서열을 갖는 PNA 프로브들;
    (4) HBV의 PreS2 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 10 및 11로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍; 및
    (5) 라미부딘 내성 HBV의 돌연변이된 RT 단백질 부위를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 서열번호 12 및 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브 쌍
    을 포함하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 내부 대조군으로서 서열번호 8 및 9로 각각 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍, 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브가 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 5' 말단의 형광 물질이 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM(5-carboxy fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar670 (Quasar670 Carboxylic Acid phosphoramidite) 및 Cy5(cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 것을 특징으로 하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 3' 말단의 형광물질이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 1, 2 및 3(black hole quencher 1, 2, 3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 것을 특징으로 하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, HBV 및 라미부딘 내성 HBV의 동시 검출용 키트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용하여, 분리된 생물학적 시료로부터 HBV 유전자 및 라비부딘 내성 HBV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HBV 및 라비부딘 내성 HBV의 동시 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출이 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 시료가 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140150448A 2014-10-31 2014-10-31 B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물 KR101948816B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140150448A KR101948816B1 (ko) 2014-10-31 2014-10-31 B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140150448A KR101948816B1 (ko) 2014-10-31 2014-10-31 B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160051061A KR20160051061A (ko) 2016-05-11
KR101948816B1 true KR101948816B1 (ko) 2019-02-15

Family

ID=56025901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140150448A KR101948816B1 (ko) 2014-10-31 2014-10-31 B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101948816B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160051061A (ko) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8945833B2 (en) Method for determining drug resistance mutations in any of the non-structural protein regions NS3 to NS5B of hepatitis C virus (HCV) for genotypes 1 to 6
EP2258878A1 (en) A method for detecting HBV using real time PCR
WO2007084567A2 (en) Detection and discrimination of hepatitis c virus, human immunodeficiency virus type-1 and hepatitis b virus
JP2010504752A (ja) ヌクレオチド変異検出方法
KR101287431B1 (ko) 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 ｐｃｒ 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법
KR101948816B1 (ko) B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물
US11987851B2 (en) Reagents and methods for detecting HCV
US9879330B2 (en) Hepatitis B variants with reduced sensitivity to therapeutic compounds, their detection and uses thereof
Chan et al. A comprehensive HBV array for the detection of HBV mutants and genotype
JP4398379B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法
ŽUsinaite et al. Hepatitis C virus genotypes in Estonia
CN107034312B (zh) 核苷酸组合物、试剂盒及其用途
US20060194217A1 (en) Method of genotyping and phenotyping hepatitis B viruses resistant to antiviral molecules
Mao et al. Study of hepatitis B virus gene mutations with enzymatic colorimetry-based DNA microarray
US8258283B2 (en) Method for detection of HCV at the real time PCR with intercalating dye
US20120141977A1 (en) Hepatitis b virus mutation strain with resistance to adefovir dipivoxil and the uses thereof
KR20130113208A (ko) 만성 ｂ형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법
KR101964697B1 (ko) 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자의 검출방법
Amini-Bavil-Olyaee et al. A novel accurate amplification created restriction site method for determination of the wild type and the precore mutant hepatitis B virus variants
JP6425352B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びｃ型肝炎ウイルスのｎｓ５ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット
JP3909889B2 (ja) 新規核酸断片から成るプライマーを用いた非ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ型肝炎ウイルスの検出方法
Bashiardes et al. An in-house method for the detection and quantification of HCV in serum samples using a TaqMan assay real time PCR approach
KR20190128550A (ko) 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 직접작용제에 내성을 나타내는 c형 간염 바이러스 유전자의 검출방법
CN111808985A (zh) 超敏检测NAs治疗下乙型肝炎病毒DNA的寡核苷酸组合物、试剂盒、方法及用途
KR20120056253A (ko) 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 ｐｃｒ 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant