JP3909889B2 - 新規核酸断片から成るプライマーを用いた非ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ型肝炎ウイルスの検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規核酸断片、それから成るプライマー及びそれを用いた非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出方法並びに非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルス（本明細書及び図面において「ＨＧＶ」又は「ＧＢＶ」と呼ぶことがある）の分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、肝炎ウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型及びＦ型が知られている。最近、これらのいずれの型にも属さない新規な型の肝炎ウイルスが発見され、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）又はＧＢウイルス（ＧＢＶ）と呼ばれている。本明細書では、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型及びＦ型のいずれの型にも属さない肝炎ウイルス（ＨＧＶ及びＧＢＶと呼ばれているものも包含する）を非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスと呼ぶ。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来までに知られていない新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを見出して、その分類に有用な特徴的な領域の塩基配列を決定し、かつそれに基づいて非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出に有用なプライマー及びそれを用いた非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、世界中から肝炎患者の血液サンプルを集めて研究した結果、多数の新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのサブタイプを見出し、かつ、これらの非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスが５’非翻訳領域の塩基配列に基づいて分類できることを見出し、かつそれらの塩基配列を決定することにより本発明を完成した。さらに、本願発明者らは、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのＮＳ５ｂ領域及びＮＳ３領域の塩基配列をも決定し、これらの領域を増幅するために適したプライマーをも見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１５８で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５４で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５５で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号３５６で示される塩基配列から成るプライマー、配列表の配列番号３５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号３５８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに本発明は、配列表の配列番号３５９で示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａ領域検出用プローブを提供する。さらにまた、本発明は、配列表の配列番号３６０ないし３６２のいずれかで示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域検出用プローブを提供する。さらにまた、本発明は、配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いて増幅された、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域由来の断片について、下記基準により１、２、３ａ、３ｂの４種類に分類する、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの分類方法を提供する。
１は、
ＳｃｒＦＩで切断され、約１０８、４０及び３４ｂｐの断片を生じ、約１０８又は４０ｂｐの断片を検出する。
２は、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断され１５７、２６ｂｐの断片を検出する。
３ａは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断せず、かつ、ＢｓｍＡＩで切断され約７５、５５、５３ｂｐの断片を生じ、７５または５３ｂｐの断片を検出する。
３ｂは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。ＢｓｍＦＩで切断せず、ＢｓｍＡＩで切断しないか、または、切断され約１２８、５５ｂｐの断片を検出する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上述のように、本願発明者らは、世界中から肝炎患者の血液サンプルを集めて研究した結果、多数の新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのサブタイプを見出し、それらの５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の塩基配列を決定した。これらの決定された新規な塩基配列を配列表の配列番号１〜１４４及び１６２ないし３５５に示す。なお、配列番号１〜４５及び１８９〜２０７及び２８１〜３２１及び３３１〜３４２が５’非翻訳領域、配列番号４６〜９２及び２５３〜２７０及び２７７〜２７８がＮＳ３領域、配列番号９３〜１４４及び１６２〜１８８及び２０８〜２５２及び２７１〜２７６及び２７９〜２８０及び３２２〜３３０及び３４３〜３５５がＮＳ５ｂ領域の塩基配列を示すものである。なお、ウイルスゲノム中の５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の位置は公知であり、例えば文献：MUERHOFF,AS ら、Journal of Virology (1995), 69, 5621-5630 に記載されている。
【０００８】
上記の新たに見出された塩基配列は、該塩基配列中の一部又は全部の領域とハイブリダイズする核酸断片をＰＣＲ用プライマー又はプローブとして用いることにより特異的に検出することができる。核酸断片はＤＮＡ断片であることが好ましいがＲＮＡ断片も使用可能である。プライマー又はプローブとして用いられる核酸断片の塩基数は１０以上が好ましく、１５以上がさらに好ましい。プライマーの場合、核酸断片の塩基数は１５〜５０程度が特に好ましい。プライマーは、ビオチン、ジオキシゲニン、放射標識、酵素標識、蛍光標識等の標識を付したものであってもよい。プローブの場合にはこのような標識が必要である。
【０００９】
なお、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の方法自体、及びプローブを用いた検出方法自体は周知である。また、これらを用いて、周知の方法により、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ等により非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出及び／又は分類を行うことができる。
【００１０】
本願発明者らは、また、ＰＣＲ用のプライマーとして、特に検出感度の高いものを見出した。それらの塩基配列を配列表の配列番号１４５〜１６１及び３５６〜３５８に示す。なお、これらのうち、配列番号１４５〜１５３のものが５’非翻訳領域増幅用プライマー、配列番号１５４〜１５６がＮＳ５ｂ領域増幅用プライマー、３５６〜３５８がＮＳ５Ａ領域増幅用プライマー、配列番号１５７〜１６１がＮＳ３領域増幅用プライマーである。これらのプライマーに付された名称、配列番号及び増幅領域の関係を下記表１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
ＰＣＲで標的核酸を増幅する場合には、少なくとも一対のプライマーが必要である。本願発明者らは、検出感度が特に優れたプライマーのセットも見出した。これらのプライマーセットの名称及び用いるプライマー名称（表１参照）を下記に示す。
【００１３】
プライマーセットＡ１
MUGR1
MUGF1
プライマーセットＡ２
MUGR2
MUGF1
プライマーセットＢ１
5gr4AD
5gf2-2
プライマーセットＢ２
5gr4AD
5gf3
プライマーセットＣ１
ＭＧ５ＢＦ３
ＭＵＮＳ５Ｒ１
プライマーセットＣ２
ＭＧ５ＢＦ４
ＭＵＮＳ５Ｒ１
プライマーセットＤ
５ＡＦ
５ＡＲＨ
５ＡＲＧ
【００１４】
本願発明者らは、ＰＣＲを行う際に、用いるプライマーにより増幅される他の核酸断片（コンペティター）の既知量を試料中に含ませておき、かつ、増幅産物の大きさが標的核酸とコンペティターで異なるようにしておけば、増幅されたコンペティターのバンドの太さと増幅された標的核酸の太さを比較することにより、標的核酸の量を推定したり、また、プライマーと標的核酸の僅かな塩基配列の相違が存在するか否か（すなわち偽陽性か否か）等を知ることができることを見出した。この方法の一例は下記実施例に記載されている。
【００１５】
すなわち、試料中の検出したい遺伝子の増幅用プライマー配列を持ち、検出したい遺伝子配列と異なる遺伝子（配列）をプライマーの配列に挟まれて持つコンペティター（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を作成する。本法は、コンペティターが持ち、検出したい遺伝子の増幅産物が持たない塩基配列を持つプローブで、コンペティターの増幅産物量を定量的に検出することで、相対的に目的の遺伝子を定量する方法である。ｃＤＮＡ合成時、又はＰＣＲ時に、一定量のコンペティターを同時にサンプルと共に加えることにより、目的とする遺伝子の量が増加（減少）すると、コンペティターの検出される量が減少（増加）する。
【００１６】
ＲＮＡウイルス等の変異の多い遺伝子の定量測定をする場合、プローブとして用いる配列部分に検出又は、定量したい遺伝子の配列に変異を生じている場合がある。プローブの配列と定量したい遺伝子のプローブと相補的な遺伝子領域の塩基配列が１塩基でも違っていれば、ハイブリダイゼーションの効率が低下し、検出値が実際の値より低値となることが予測される。従って、増幅されるウイルス自身をプローブでとらえるより、外来の特定の遺伝子をコンペティターとして用いコンペティターを定量的に測定し、相対的に正確に定量することが可能となる。
【００１７】
本願発明者らは、新たに見出した非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスサブタイプの５’非翻訳領域を詳細に検討した結果、制限酵素消化後の断片長のパターンにより、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを４種類に分類することができることを見出した。これは、常法であるＲＦＬＰ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰにより行うことができる。
【００１８】
４つの型は１、２、３ａ、３ｂであり、分類の基準は次の通りである。
【００１９】
１は、ＳｃｒＦＩで切断され、約１０８、４０、３４ｂｐの断片を生じ、約１０８または４０の断片を検出する。
【００２０】
２は、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断され１５７、２６ｂｐの断片を検出する。
【００２１】
３ａは、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断せず、かつ、ＢｓｍＡＩで切断され約７５、５５、５３ｂｐの断片を生じ、７５または５３ｂｐの断片を検出する。
【００２２】
３ｂは、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。ＢｓｍＦＩで切断せず。
ＢｓｍＡＩで切断しないか、または、切断され約１２８、５５ｂｐの断片を検出する。
【００２３】
ただし、これらの制限酵素に限定されない。同一配列を認識する、異なる制限酵素が存在するので、このような異なる制限酵素を用いることもできる。例えば、ＢｓｍＦ１とＦｉｎＩは同じ制限酵素部位を認識するので、ＢｓｍＦＩに代えてＦｉｎＩを用いることができる。
【００２４】
より詳細には、各制限酵素部位近傍の配列と、各型の関係は次のとおりである。型判定の方法は、これらの型特異的配列を検出する方法であればよく、制限酵素に限定されず、例えば、プローブや、型特異的プライマーを用いてもよい。
【００２５】
ＳｃｒＦＩ認識部位
【００２６】
ＢｓｍＦ１認識配列
【００２７】
ＢｓｍＡＩの認識部位
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの塩基配列の決定
下記実施例１１に記載した方法により、各国の患者から採取した血液中に含まれる非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の塩基配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１〜３５５で示す塩基配列が決定された。また、系統学的解析の結果、図７、８、９のように分類できた。また、相同性は表１４のようになった。
【表１４】
【００３０】
実施例２ 高感度検出系
既存プライマーとの比較
既存プライマーの文献；
M.Yoshiba,et al,Detection of GBV-C hepatitis vorus genome in serum from patients with fulminant hepatitis of unknown aetiology,The Lancet,28,1131-1132,1995).
【００３１】
試料
【００３２】
方法
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Biotex Lab社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上生を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００３３】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名；Life Technologies,Inc.) ２μｌ、0.1M DTT 1μｌ、10mM dNTP 1 μｌ、Random Primer （商品名;Life TechnologiesInc.9O.D.260nm)0.1μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名;Life Technologies Inc. ）５０units 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名；宝酒造）２０units 、DEPC処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７℃で１時間インンキュベートした。
【００３４】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマーセットＡ１を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Saiki ら、Science 239,481-491,1988) した。反応液は、１０ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3),1.5mM MgCl2,50mM KCl,800μＭ dNTP,1.25 単位のAmpliTaq DNA polymerase （商品名；日本ROCHE)で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４℃、２０秒、アニール５０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。さらにこの増幅産物を、プライマーセットＡ２でそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４℃、２０秒、アニール６０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。
公知プライマーを用いた実験は、M.Yoshiba らの文献のNew viruses(GBV-A,B,C)の増幅プライマーを用いた。RNA 精製、ｃＤＮＡ合成は上記と同様に行いＰＣＲは、文献と同様に行った。
【００３５】
４）電気泳動
増幅産物を、アガロース（トリスーボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ一定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。プライマーセットＡ１、２の増幅産物は、DNA サイズマーカーを参考に約１７０ｂｐの増幅バンドを確認した。
【００３６】
結果
以下の３カ国で肝疾患ではプライマーセットＡ１，２は、既知法に比べ検出率が高かった（表２）。
新規プライマーを用いた増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をdye terminator法（ABI PRISM Dye terminator Cycle Sequencing Ready reaction kit；商品名；パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名；パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。その結果、表１３のように、ＨＧＶに７６．３〜９３．２％、ＧＢＶーＣと７０．３〜８０．５％一致し高い相同性を確認した。したがって、特異性も高いと考えられた。
【００３７】
【表２】
【表１３】
【００３８】
実施例３ 各国、各地域における陽性率について
肝疾患例６８６例について、プライマーセットＡ１、２で、実施例１と同様にＧ型肝炎ウイルスの検出をおこなった。平均２０％の陽性率であった（表３）。
【００３９】
【表３】
【００４０】
実施例４
モンゴル人２２９例におけるプライマーセットＡ１、２で実施例１と同様に検出を行った。検出結果は、表４のようになった。肝硬変で検出率が最も高かった。また、健常人では検出されなかった。したがって、疾患の進行度が進むにつれてＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃの検出率が上昇することが明らかとなった。本発明のGBV-C/HGV RNA 検出法はこれらの例に示されるように従来法に比べ、高い検出率をもち、また、肝炎の予防予後に有用であると考えられた。また、ＨＢＶにくらべＨＣＶでの重複感染が高いことが判明した。
【００４１】
【表４】
表４ モンゴルにおける、疾患別 HGV/GBV-C 陽性率
【００４２】
実施例５
中国人２１５例における検出例。検出法は実施例１と同様。
結果は、表５に示す。ＩＶＤＵで検出率が高く６１％で、すべてＨＣＶ抗体陽性者であった。一方供血者では検出されず、肝臓ガンで比較的高い陽性率を示した。本発明のプライマーセットＡ１，２を用いることで、各実にHGV/GBV-C を検出することができる。
【００４３】
【表５】
【００４４】
実施例６
HGV/GBV-C の定量法
competitive-PCR （CRT-PCR ）法を用いてHGV/GBV-C のＲＮＡ量を定量した。
【００４５】
方法；
1)コンペティター（competitor）の作成
プライマー5gr4sp6,5gf3T7を用い、ｐＧＥＮ- ３Ｚｆ（＋）ベクター（商品名；プロメガ）の位置３から８６を含む、１５２ｂｐをＰＣＲ増幅した。増幅産物を、クイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。ＯＤ260nm からcopy数/ μｌを算出した。
【００４６】
2)基準ＲＮＡの調整。
日本人肝疾患患者血清より、実施例１と同様、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成を行い、プライマーセットＢ１で１回目のＰＣＲ、プライマーセットＢ２で２回目のＰＣＲを行い、１８３ｂｐの増幅産物をｐＧＥＮＴベクターにクローン化しｐＭＭ３４５６を得た。ｐＭＭ３４５６、１０μｌを制限酵素ＮｏｔＩ（商品名；ベーリンガーマンハイム）、１００ｕｎｉｔｓで、３７℃、３時間で切断後、フェノール・クロロフォルム抽出し、イソプロパノールで精製した。これをＤＥＰＣ処理水５μｌに溶解し、ＲＮase inhibitor 存在下、Ｔ７ ＲＮＡ polymeraseでクローン化したHGV/GBV-C のｃＤＮＡのＲＮＡを合成した。さらに、ＲＮＡｚｏｌＢで得られたＲＮＡを精製した。精製産物のＯＤ260nm からcopy数/ μｌを算出した。
【００４７】
3)先に作成した１０倍ずつ濃度の違う基準ＲＮＡを１μｌと、１０倍ずつ濃度の違うcompetitor１μｌをプライマーセットＢ２で増幅した。図１に電気泳動泳動パターン例を示す。基準ＲＮＡと同程度の増幅を示したチューブに入った、competitor量が一致した。
【００４８】
実施例２と同様にインターフェロンアルファ（ＩＦＮ）を投与した日本人慢性肝炎患者血清からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡの１μｌを先に作成した１０００から１００００００００ｃｏｐｙまで１０倍ずつ濃度の違うcompetitorにそれぞれ別のチューブ中に加え、プライマーセットＢでＰＣＲで遺伝子増幅を行った。ＰＣＲ条件は９６℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、２０秒、５０回で行った。増幅後、図１に示すように電気泳動パターンで患者血清由来ｃＤＮＡと同程度の増幅を示したチューブに入った、competitor量を、患者のHGV/GBV-C ＲＮＡ量と判定した。同様に、患者ｃＤＮＡ１μｌを各プライマーセットＢ１で１回目、プライマーセットＢ２で２回目のＰＣＲを行いHGV/GBV-C RNA の存在を確認した。ＤＮＡサイズマーカーを参考に１８３ｂｐの増幅バンドを検出した。
【００４９】
図２に示すように、ＩＦＮ投与前でのHGV/GBV-C RNA 量は１０6 copy/ml であったが、ＩＦＮ投与後速やかに陰性となり、投与終了後、再び、ＨＣＶ−ＲＮＡに遅れて、上昇し１０6.5 copy/ml となりその後持続陽性となりＧＰＴの推移と一致した。このことは、本発明によりＨＣＶとHGV/GBV-C の重複感染を検出することができるようになり、かつ独立してそのＲＮＡを定量する事ができるので、ＨＣＶ肝炎との重複感染においてHGV/GBV-C RNA の関与、その治療、予防に本発明は有用であることがわかった。
【００５０】
実施例７
コンペティターの作成と基準ＲＮＡの調製は実施例６と同様に行った。先に作成した１０倍ずつ濃度の違う１００から１０００００００コピーの基準ＲＮＡと、１００００コピーのコンペティターを含む溶液と、実施例１と同様にヒト血清から調製したＲＮＡをプライマー５ｇｆ３Ｂ、５ｇｒ４ＡＤで実施例１と同様にＰＣＲで増幅した。さらに、ＰＣＲ増幅産物５μｌに０．０５Ｎ ＮａＯＨを５μｌ加え攪拌した。さらに、０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ６．８）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、２０％ ポリエチレングリコール8000、50 ng/mlの５’末端ジゴキシゲニン標識プローブ(PGM3Dig: 5'-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGA-3'; ５’−ジゴキシゲニン標識）を２００μｌ加え攪拌した。３７℃、３０分放置後、その１００μｌを、ビオチンを吸着させた９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、商品名：マキソープ）に移し、３０分間放置した。さらに、ＰＣＲ ＥＬＩＳＡキット（ベーリンガーマンハイム、商品名）で発色を吸光度計で４０５ｎｍ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｉｌｔｅｒ ４９２ ｎｍ）を測定した。陰性コントロールとして、ＤＥＰＣ処理水を用い同時に同様に測定しその測定値を０とした。基準ＲＮＡの測定値から、試料の定量値を算出した。
【００５１】
定量値に基づき、１、２及び３型に分類した。地域別に分類すると下記表１２のようになった。
【００５２】
【表１２】
【００５３】
各国のまた、ジェノタイプ別のＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の定量値を図３に示した。各国ともＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の定量値の平均値が１０６ コピー／ｍｌ付近となったが、ジェノタイプ１のアフリカでは、１０４．５ コピー／ｍｌ以下の症例はなく比較的高値で、また、日本、モンゴル等のジェノタイプ２では、１００コピー／ｍｌの低値を示す症例が存在した。
【００５４】
実施例８
日本人慢性肝炎患者ＩＦＮ治療を行った３４例の患者血清よりプライマーセットＢ１、２でHGV/GBV-C RNA を検出した。３例が陽性であった。３例ともＩＦＮ投与前、終了後はHCV 、HGV/GBV-C RNA が陽性であり、症例１では、再々投与終了時点でも、HCV 、HGV/GBV-C RNA が共に陽性であった。従って、ＨＣＶとHGV/GBV-C RNA との重複感染ではＩＦＮ治療抵抗性を示すことが予測された。従って、HGV/GBV-C RNA が検出されれば、ＩＦＮ治療に抵抗性を示すことが予測でき、本発明は、ＨＣＶ肝炎との重複感染においてHGV/GBV-C RNA の関与、その治療、予防に本発明は有用であることがわかった。
【００５５】
【表６】
【００５６】
実施例９ プライマーセットＡ、Ｂ，Ｃの検出率比較。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成は実施例１と同様に行った。プライマーセットA1、2 のＰＣＲ条件は実施例１と同様に行った。プライマーセットB1、2 、プライマーセットB3、4 、プライマーセットC1、2 は、１回目のＰＣＲを９４℃、２０秒、５０℃、２０秒、７２℃、２０秒で、３５回実施。２回目のＰＣＲは９４℃、２０秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、３５回で実施した。以下のように、プライマーセットＢ１およびＢ２が最も検出率が高かった。
【００５７】
【表７】
【００５８】
実施例１０
日本人、各慢性疾患における血清HGV/GBV-C RNA の検出をおこなった。慢性肝疾患患者１９７例、及び、肝機能正常者とその他の疾患患者１２例、合計２０９例についてＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡを検出した。方法は実施例８と同様に行い、プライマーセットＡ１、２、Ｂ１、２、Ｃ１、２の組合せで、いずれかのプライマーセットの増幅バンドが検出された場合陽性とした。
【００５９】
表８、９に示すように、Ｂ型に比べＣ型肝硬変、肝臓癌でＨＧＶ／ＧＢＶ−ＣＲＮＡは比較的高率に検出された。また、肝機能正常者では検出されなかった。
【００６０】
【表８】
Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス別のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ−ＲＮＡ陽性率（日本人）
【００６１】
【表９】
表９ 各種慢性肝疾患別の血清ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ ＲＮＡ陽性率（日本人）
【００６２】
実施例１１
プライマーセットＡ１、２とＢ１、２の検出率比較を行った。
中国人、各慢性疾患における血清HGV/GBV-C RNA の検出を行った。慢性肝疾患患者８０例、及びＩＶＤＵ８５例、供血者５０例、合計２１５例についてHGV/GBV-C RNA を検出した。方法は実施例８と同様に行い、プライマーセットＡ１、２又はＢ１、２の組合せで、増幅バンドが検出された場合陽性とした。
【００６３】
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成は実施例２と同様に行った。
１）プライマーセットＡ１、２は実施例２と同様に行った。
２）プライマーセットＢ１、２は以下のように行った。
【００６４】
ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成は実施例８と同様に行った。１回目のＰＣＲはプライマーセットＢ１を９４℃、２０秒、５０℃、２０秒、７２℃、２０秒で、３５回実施。２回目のＰＣＲはプライマーセットＢ２を用い、９４℃、２０秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、３５回で実施した。実施例２と同様、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡサイズマーカーと比較し１７６ｂｐ（１７７ｂｐ）の特異バンドを確認した。
【００６５】
表１０、表１１に示すように、全てにおいてプライマーセットＢ１、２が高検出率であった。また、供血者よりHGV/GBV-C RNA 陽性例がプライマーセットＢ１、２で検出されたため、供血者においてもスクリーニングに使用できる。従って、特に、プライマーＢ１、２はHGV/GBV-C に対する、予防に有効であることが明らかとなった。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
【表１１】
【００６８】
実施例１２ ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による分類
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂ社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４゜Ｃで５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃで１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃ、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃで５分間遠心し上清を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００６９】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） ２μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １ μｌ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ （商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）０．１μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． ）５０ｕｎｉｔｓ 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名；宝酒造）２０ｕｎｉｔｓ 、ＤＥＰＣ処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７゜Ｃで１時間インンキュベートした。
【００７０】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマー５ｇｆ３、５ｇｒ６を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Ｓａｉｋｉ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８１−４９１，１９８８） した。反応液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，８００μＭｄＮＴＰ，１．２５ 単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （商品名；日本ＲＯＣＨＥ）で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４゜Ｃ、２０秒、アニール５０゜Ｃ、４５秒、伸長７２゜Ｃ、４５秒で行った。さらにこの増幅産物を、プライマーセット５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤで２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４゜Ｃ、２０秒、アニール５５゜Ｃ、４５秒、伸長７２゜Ｃ、６０秒で行った。
【００７１】
４）制限酵素の切断
３）の増幅産物の５μｌを下記の制限酵素それぞれ別々に、１０ｕｎｉｔｓ 用い、１時間処理した。
制限酵素 処理温度 処理溶液
ＢｓｍＦ１ ６５゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４
ＢｓｍＡＩ ５５゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ＢｓｍＡＩ
ＳｃｒＦＩ ３７゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４
（商品名；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社製）
【００７２】
５）電気泳動
増幅産物を、アガロース（トリスーボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ一定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。フライマー ５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤの増幅産物は、ＤＮＡサイズマーカーを参考に制限酵素処理をしないものは約１８３ｂｐの増幅バンドを確認した。制限酵素処理したものの電気泳動パターンを図４〜６に示す。
【００７３】
１）ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の５’ＵＴＲ の塩基配列決定。
実施例１と同様に、血清よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。
プライマー５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤを用いた増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；商品名；パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名；パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。
【００７４】
各地域別の結果を下記表１６に示す。
【００７５】
実施例１３ ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＮＳ５Ｂ領域の遺伝子型判定
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂ社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上清を捨てた。この操作を更に２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００７６】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）２μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｏ．Ｄ． ２６０ ｎｍ） ０．１μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）５０ｕｎｉｔｓ 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名：宝酒造）２０ｕｎｉｔｓ 、ＤＥＰＣ処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７７】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマーＭＧ５ＢＦ３、ＭＵＮＳ５Ｒ１を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Ｓａｉｋｉ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８１−４９１， １９８８） した。反応液は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５０ｍＭ ＫＣｌ、８００μＭ ｄＮＴＰ、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （商品名：日本ＲＯＣＨＥ）で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４℃、２０秒、アニール５０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。さらにこの増幅産物をプライマーＭＧ５ＢＦ４、ＭＵＮＳ５Ｒ１でそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４℃、２０秒、アニール５５℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。
【００７８】
４）ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡのＮＳ５Ｂ領域の塩基配列決定
３）の増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名：ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ； 商品名：パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名：パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。
【００７９】
５）系統解析
Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ （商品名：ＤＮＡ ｓｔａｒ社）のｃｌａｓｔａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ によって系統解析を行った。その結果、表１５及び図１０に示すように、世界的に大きく３つに分類された。
【００８０】
【表１５】
【００８１】
実施例１３ ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ ＮＳ５Ａの検出
実施例１と同様に、日本人肝ガン患者血清１０例からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後、プライマー５ＡＦ、５ＡＲＨ、５ＡＲＧでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃、１５秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、５５回で行った。ＰＣＲ産物はプローブ５ＡＰＤ（配列番号３５９の５’末端をジゴキシゲニンで標識したもの）を用いて実施例７と同様に検出した。４０５ｎｍにおける吸光度が０．５以下を陰性とし、それ以上を陽性とした。また、プライマーセットＡ１、２で同様に検出を行った。検出結果は、プライマーセットＡ１、２での陽性率は２０％（２／１０）で、ＮＳ５Ａでの検出は１０％（１／１０）とやや検出率が低かった。
【００８２】
実施例１４ ジェノタイプ別プローブを用いた５’非翻訳領域の検出
実施例１と同様に、シーケンスによりジェノタイプのわかっているＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ ２０例のＲＮＡと抽出し、ｃＤＮＡ合成後、プライマー５ｇｆ３Ｂと５ｇｒ４ＡＤでＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物１μｌに０．０５ Ｎ ＮａＯＨを５μｌ加え攪拌した。さらに０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、２０％ポリエチレングリコール８０００、５０ ｎｇ／ｍｌのプローブＭＵＡ（１型検出用、配列番号３６０）、ＭＵＦ（２型検出用、配列番号３６１）及びＭＵＡＰ（３型検出用、配列番号３６２）各２００μｌをそれぞれ別々のチューブ内で加え攪拌した。３７℃、３０分放置後、その１００μｌを、ビオチンを吸着させた９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、商品名：マキソープ）に移し、３０分間放置した。さらに、ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ（ベーリンガーマンハイム；商品名）で発色を吸光度計で４０５ｎｍ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｉｌｔｅｒ ４９２ ｎｍ）を測定した。４０５ｎｍにおける吸光度が１以上を陽性とし、各タイププローブでＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ のタイピングを行った。その結果、下記表１６に示すように、シーケンスの結果と一致した。従って、より容易にＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ の型判別が可能となった。
【００８３】
【表１６】
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスサブタイプが見出され、その塩基配列が決定され、かつ、その検出及び分類手段が初めて提供された。従って、本発明は、肝炎の診断に大いに寄与するものと期待される。
【００８５】
【配列表】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【０２２３】
【０２２４】
【０２２５】
【０２２６】
【０２２７】
【０２２８】
【０２２９】
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
【０２３４】
【０２３５】
【０２３６】
【０２３７】
【０２３８】
【０２３９】
【０２４０】
【０２４１】
【０２４２】
【０２４３】
【０２４４】
【０２４５】
【０２４６】
【０２４７】
【０２４８】
【０２４９】
【０２５０】
【０２５１】
【０２５２】
【０２５３】
【０２５４】
【０２５５】
【０２５６】
【０２５７】
【０２５８】
【０２５９】
【０２６０】
【０２６１】
【０２６２】
【０２６３】
【０２６４】
【０２６５】
【０２６６】
【０２６７】
【０２６８】
【０２６９】
【０２７０】
【０２７１】
【０２７２】
【０２７３】
【０２７４】
【０２７５】
【０２７６】
【０２７７】
【０２７８】
【０２７９】
【０２８０】
【０２８１】
【０２８２】
【０２８３】
【０２８４】
【０２８５】
【０２８６】
【０２８７】
【０２８８】
【０２８９】
【０２９０】
【０２９１】
【０２９２】
【０２９３】
【０２９４】
【０２９５】
【０２９６】
【０２９７】
【０２９８】
【０２９９】
【０３００】
【０３０１】
【０３０２】
【０３０３】
【０３０４】
【０３０５】
【０３０６】
【０３０７】
【０３０８】
【０３０９】
【０３１０】
【０３１１】
【０３１２】
【０３１３】
【０３１４】
【０３１５】
【０３１６】
【０３１７】
【０３１８】
【０３１９】
【０３２０】
【０３２１】
【０３２２】
【０３２３】
【０３２４】
【０３２５】
【０３２６】
【０３２７】
【０３２８】
【０３２９】
【０３３０】
【０３３１】
【０３３２】
【０３３３】
【０３３４】
【０３３５】
【０３３６】
【０３３７】
【０３３８】
【０３３９】
【０３４０】
【０３４１】
【０３４２】
【０３４３】
【０３４４】
【０３４５】
【０３４６】
【０３４７】
【０３４８】
【０３４９】
【０３５０】
【０３５１】
【０３５２】
【０３５３】
【０３５４】
【０３５５】
【０３５６】
【０３５７】
【０３５８】
【０３５９】
【０３６０】
【０３６１】
【０３６２】
【０３６３】
【０３６４】
【０３６５】
【０３６６】
【０３６７】
【０３６８】
【０３６９】
【０３７０】
【０３７１】
【０３７２】
【０３７３】
【０３７４】
【０３７５】
【０３７６】
【０３７７】
【０３７８】
【０３７９】
【０３８０】
【０３８１】
【０３８２】
【０３８３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】
【０３９０】
【０３９１】
【０３９２】
【０３９３】
【０３９４】
【０３９５】
【０３９６】
【０３９７】
【０３９８】
【０３９９】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【０４１５】
【０４１６】
【０４１７】
【０４１９】
【０４２０】
【０４２１】
【０４２２】
【０４２３】
【０４２４】
【０４２５】
【０４２６】
【０４２７】
【０４２８】
【０４２９】
【０４３０】
【０４３１】
【０４３２】
【０４３３】
【０４３４】
【０４３５】
【０４３６】
【０４３７】
【０４３８】
【０４３９】
【０４４０】
【０４４１】
【０４４２】
【０４４３】
【０４４４】
【０４４５】
【０４４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプライマーを用いて行った非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型型肝炎ウイルスの定量結果を示す図である。
【図２】肝炎患者のインターフェロン−α−治療前後のＨＣＶ ＲＮＡレベル及び非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型型肝炎ウイルスレベルを示す図である。
【図３】本発明の実施例７の方法により分類した、各地域の肝炎患者のジェノタイプと血清中のHGV/GBV-C RNA のコピー数との関係を示す図である。
【図４】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＢｓｍＦ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図５】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＳｃｒＦ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図６】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＢｓｍＡ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図７】本発明の方法により、５’非翻訳領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図８】本発明の方法により、ＮＳ３領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図９】本発明の方法により、ＮＳ５ｂ領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図１０】本発明の方法により、ＮＳ５Ｂ領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規核酸断片、それから成るプライマー及びそれを用いた非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出方法並びに非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルス（本明細書及び図面において「ＨＧＶ」又は「ＧＢＶ」と呼ぶことがある）の分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、肝炎ウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型及びＦ型が知られている。最近、これらのいずれの型にも属さない新規な型の肝炎ウイルスが発見され、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）又はＧＢウイルス（ＧＢＶ）と呼ばれている。本明細書では、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型及びＦ型のいずれの型にも属さない肝炎ウイルス（ＨＧＶ及びＧＢＶと呼ばれているものも包含する）を非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスと呼ぶ。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来までに知られていない新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを見出して、その分類に有用な特徴的な領域の塩基配列を決定し、かつそれに基づいて非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出に有用なプライマー及びそれを用いた非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、世界中から肝炎患者の血液サンプルを集めて研究した結果、多数の新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのサブタイプを見出し、かつ、これらの非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスが５’非翻訳領域の塩基配列に基づいて分類できることを見出し、かつそれらの塩基配列を決定することにより本発明を完成した。さらに、本願発明者らは、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのＮＳ５ｂ領域及びＮＳ３領域の塩基配列をも決定し、これらの領域を増幅するために適したプライマーをも見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１５８で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５４で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１５５で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号３５６で示される塩基配列から成るプライマー、配列表の配列番号３５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号３５８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法を提供する。さらに本発明は、配列表の配列番号３５９で示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａ領域検出用プローブを提供する。さらにまた、本発明は、配列表の配列番号３６０ないし３６２のいずれかで示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域検出用プローブを提供する。さらにまた、本発明は、配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いて増幅された、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域由来の断片について、下記基準により１、２、３ａ、３ｂの４種類に分類する、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの分類方法を提供する。
１は、
ＳｃｒＦＩで切断され、約１０８、４０及び３４ｂｐの断片を生じ、約１０８又は４０ｂｐの断片を検出する。
２は、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断され１５７、２６ｂｐの断片を検出する。
３ａは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断せず、かつ、ＢｓｍＡＩで切断され約７５、５５、５３ｂｐの断片を生じ、７５または５３ｂｐの断片を検出する。
３ｂは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。ＢｓｍＦＩで切断せず、ＢｓｍＡＩで切断しないか、または、切断され約１２８、５５ｂｐの断片を検出する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上述のように、本願発明者らは、世界中から肝炎患者の血液サンプルを集めて研究した結果、多数の新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのサブタイプを見出し、それらの５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の塩基配列を決定した。これらの決定された新規な塩基配列を配列表の配列番号１〜１４４及び１６２ないし３５５に示す。なお、配列番号１〜４５及び１８９〜２０７及び２８１〜３２１及び３３１〜３４２が５’非翻訳領域、配列番号４６〜９２及び２５３〜２７０及び２７７〜２７８がＮＳ３領域、配列番号９３〜１４４及び１６２〜１８８及び２０８〜２５２及び２７１〜２７６及び２７９〜２８０及び３２２〜３３０及び３４３〜３５５がＮＳ５ｂ領域の塩基配列を示すものである。なお、ウイルスゲノム中の５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の位置は公知であり、例えば文献：MUERHOFF,AS ら、Journal of Virology (1995), 69, 5621-5630 に記載されている。
【０００８】
上記の新たに見出された塩基配列は、該塩基配列中の一部又は全部の領域とハイブリダイズする核酸断片をＰＣＲ用プライマー又はプローブとして用いることにより特異的に検出することができる。核酸断片はＤＮＡ断片であることが好ましいがＲＮＡ断片も使用可能である。プライマー又はプローブとして用いられる核酸断片の塩基数は１０以上が好ましく、１５以上がさらに好ましい。プライマーの場合、核酸断片の塩基数は１５〜５０程度が特に好ましい。プライマーは、ビオチン、ジオキシゲニン、放射標識、酵素標識、蛍光標識等の標識を付したものであってもよい。プローブの場合にはこのような標識が必要である。
【０００９】
なお、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の方法自体、及びプローブを用いた検出方法自体は周知である。また、これらを用いて、周知の方法により、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ等により非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの検出及び／又は分類を行うことができる。
【００１０】
本願発明者らは、また、ＰＣＲ用のプライマーとして、特に検出感度の高いものを見出した。それらの塩基配列を配列表の配列番号１４５〜１６１及び３５６〜３５８に示す。なお、これらのうち、配列番号１４５〜１５３のものが５’非翻訳領域増幅用プライマー、配列番号１５４〜１５６がＮＳ５ｂ領域増幅用プライマー、３５６〜３５８がＮＳ５Ａ領域増幅用プライマー、配列番号１５７〜１６１がＮＳ３領域増幅用プライマーである。これらのプライマーに付された名称、配列番号及び増幅領域の関係を下記表１に示す。
【００１１】
【表１】
ＰＣＲで標的核酸を増幅する場合には、少なくとも一対のプライマーが必要である。本願発明者らは、検出感度が特に優れたプライマーのセットも見出した。これらのプライマーセットの名称及び用いるプライマー名称（表１参照）を下記に示す。
【００１３】
プライマーセットＡ１
MUGR1
MUGF1
プライマーセットＡ２
MUGR2
MUGF1
プライマーセットＢ１
5gr4AD
5gf2-2
プライマーセットＢ２
5gr4AD
5gf3
プライマーセットＣ１
ＭＧ５ＢＦ３
ＭＵＮＳ５Ｒ１
プライマーセットＣ２
ＭＧ５ＢＦ４
ＭＵＮＳ５Ｒ１
プライマーセットＤ
５ＡＦ
５ＡＲＨ
５ＡＲＧ
【００１４】
本願発明者らは、ＰＣＲを行う際に、用いるプライマーにより増幅される他の核酸断片（コンペティター）の既知量を試料中に含ませておき、かつ、増幅産物の大きさが標的核酸とコンペティターで異なるようにしておけば、増幅されたコンペティターのバンドの太さと増幅された標的核酸の太さを比較することにより、標的核酸の量を推定したり、また、プライマーと標的核酸の僅かな塩基配列の相違が存在するか否か（すなわち偽陽性か否か）等を知ることができることを見出した。この方法の一例は下記実施例に記載されている。
【００１５】
すなわち、試料中の検出したい遺伝子の増幅用プライマー配列を持ち、検出したい遺伝子配列と異なる遺伝子（配列）をプライマーの配列に挟まれて持つコンペティター（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を作成する。本法は、コンペティターが持ち、検出したい遺伝子の増幅産物が持たない塩基配列を持つプローブで、コンペティターの増幅産物量を定量的に検出することで、相対的に目的の遺伝子を定量する方法である。ｃＤＮＡ合成時、又はＰＣＲ時に、一定量のコンペティターを同時にサンプルと共に加えることにより、目的とする遺伝子の量が増加（減少）すると、コンペティターの検出される量が減少（増加）する。
【００１６】
ＲＮＡウイルス等の変異の多い遺伝子の定量測定をする場合、プローブとして用いる配列部分に検出又は、定量したい遺伝子の配列に変異を生じている場合がある。プローブの配列と定量したい遺伝子のプローブと相補的な遺伝子領域の塩基配列が１塩基でも違っていれば、ハイブリダイゼーションの効率が低下し、検出値が実際の値より低値となることが予測される。従って、増幅されるウイルス自身をプローブでとらえるより、外来の特定の遺伝子をコンペティターとして用いコンペティターを定量的に測定し、相対的に正確に定量することが可能となる。
【００１７】
本願発明者らは、新たに見出した非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスサブタイプの５’非翻訳領域を詳細に検討した結果、制限酵素消化後の断片長のパターンにより、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを４種類に分類することができることを見出した。これは、常法であるＲＦＬＰ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰにより行うことができる。
【００１８】
４つの型は１、２、３ａ、３ｂであり、分類の基準は次の通りである。
【００１９】
１は、ＳｃｒＦＩで切断され、約１０８、４０、３４ｂｐの断片を生じ、約１０８または４０の断片を検出する。
【００２０】
２は、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断され１５７、２６ｂｐの断片を検出する。
【００２１】
３ａは、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断せず、かつ、ＢｓｍＡＩで切断され約７５、５５、５３ｂｐの断片を生じ、７５または５３ｂｐの断片を検出する。
【００２２】
３ｂは、ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。ＢｓｍＦＩで切断せず。
ＢｓｍＡＩで切断しないか、または、切断され約１２８、５５ｂｐの断片を検出する。
【００２３】
ただし、これらの制限酵素に限定されない。同一配列を認識する、異なる制限酵素が存在するので、このような異なる制限酵素を用いることもできる。例えば、ＢｓｍＦ１とＦｉｎＩは同じ制限酵素部位を認識するので、ＢｓｍＦＩに代えてＦｉｎＩを用いることができる。
【００２４】
より詳細には、各制限酵素部位近傍の配列と、各型の関係は次のとおりである。型判定の方法は、これらの型特異的配列を検出する方法であればよく、制限酵素に限定されず、例えば、プローブや、型特異的プライマーを用いてもよい。
【００２５】
ＳｃｒＦＩ認識部位
ＢｓｍＦ１認識配列
ＢｓｍＡＩの認識部位
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ 非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの塩基配列の決定
下記実施例１１に記載した方法により、各国の患者から採取した血液中に含まれる非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域、ＮＳ３領域及びＮＳ５ｂ領域の塩基配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１〜３５５で示す塩基配列が決定された。また、系統学的解析の結果、図７、８、９のように分類できた。また、相同性は表１４のようになった。
【表１４】
実施例２ 高感度検出系
既存プライマーとの比較
既存プライマーの文献；
M.Yoshiba,et al,Detection of GBV-C hepatitis vorus genome in serum from patients with fulminant hepatitis of unknown aetiology,The Lancet,28,1131-1132,1995).
【００３１】
試料
方法
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Biotex Lab社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上生を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００３３】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名；Life Technologies,Inc.) ２μｌ、0.1M DTT 1μｌ、10mM dNTP 1 μｌ、Random Primer （商品名;Life TechnologiesInc.9O.D.260nm)0.1μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名;Life Technologies Inc. ）５０units 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名；宝酒造）２０units 、DEPC処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７℃で１時間インンキュベートした。
【００３４】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマーセットＡ１を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Saiki ら、Science 239,481-491,1988) した。反応液は、１０ｍＭ Tris-HCl(pH 8.3),1.5mM MgCl2,50mM KCl,800μＭ dNTP,1.25 単位のAmpliTaq DNA polymerase （商品名；日本ROCHE)で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４℃、２０秒、アニール５０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。さらにこの増幅産物を、プライマーセットＡ２でそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４℃、２０秒、アニール６０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。
公知プライマーを用いた実験は、M.Yoshiba らの文献のNew viruses(GBV-A,B,C)の増幅プライマーを用いた。RNA 精製、ｃＤＮＡ合成は上記と同様に行いＰＣＲは、文献と同様に行った。
【００３５】
４）電気泳動
増幅産物を、アガロース（トリスーボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ一定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。プライマーセットＡ１、２の増幅産物は、DNA サイズマーカーを参考に約１７０ｂｐの増幅バンドを確認した。
【００３６】
結果
以下の３カ国で肝疾患ではプライマーセットＡ１，２は、既知法に比べ検出率が高かった（表２）。
新規プライマーを用いた増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をdye terminator法（ABI PRISM Dye terminator Cycle Sequencing Ready reaction kit；商品名；パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名；パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。その結果、表１３のように、ＨＧＶに７６．３〜９３．２％、ＧＢＶーＣと７０．３〜８０．５％一致し高い相同性を確認した。したがって、特異性も高いと考えられた。
【００３７】
【表２】
実施例３ 各国、各地域における陽性率について
肝疾患例６８６例について、プライマーセットＡ１、２で、実施例１と同様にＧ型肝炎ウイルスの検出をおこなった。平均２０％の陽性率であった（表３）。
【００３９】
【表３】
実施例４
モンゴル人２２９例におけるプライマーセットＡ１、２で実施例１と同様に検出を行った。検出結果は、表４のようになった。肝硬変で検出率が最も高かった。また、健常人では検出されなかった。したがって、疾患の進行度が進むにつれてＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃの検出率が上昇することが明らかとなった。本発明のGBV-C/HGV RNA 検出法はこれらの例に示されるように従来法に比べ、高い検出率をもち、また、肝炎の予防予後に有用であると考えられた。また、ＨＢＶにくらべＨＣＶでの重複感染が高いことが判明した。
【００４１】
【表４】
表４ モンゴルにおける、疾患別 HGV/GBV-C 陽性率
実施例５
中国人２１５例における検出例。検出法は実施例１と同様。
結果は、表５に示す。ＩＶＤＵで検出率が高く６１％で、すべてＨＣＶ抗体陽性者であった。一方供血者では検出されず、肝臓ガンで比較的高い陽性率を示した。本発明のプライマーセットＡ１，２を用いることで、各実にHGV/GBV-C を検出することができる。
【００４３】
【表５】
実施例６
HGV/GBV-C の定量法
competitive-PCR （CRT-PCR ）法を用いてHGV/GBV-C のＲＮＡ量を定量した。
【００４５】
方法；
1)コンペティター（competitor）の作成
プライマー5gr4sp6,5gf3T7を用い、ｐＧＥＮ- ３Ｚｆ（＋）ベクター（商品名；プロメガ）の位置３から８６を含む、１５２ｂｐをＰＣＲ増幅した。増幅産物を、クイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。ＯＤ260nm からcopy数/ μｌを算出した。
【００４６】
2)基準ＲＮＡの調整。
日本人肝疾患患者血清より、実施例１と同様、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成を行い、プライマーセットＢ１で１回目のＰＣＲ、プライマーセットＢ２で２回目のＰＣＲを行い、１８３ｂｐの増幅産物をｐＧＥＮＴベクターにクローン化しｐＭＭ３４５６を得た。ｐＭＭ３４５６、１０μｌを制限酵素ＮｏｔＩ（商品名；ベーリンガーマンハイム）、１００ｕｎｉｔｓで、３７℃、３時間で切断後、フェノール・クロロフォルム抽出し、イソプロパノールで精製した。これをＤＥＰＣ処理水５μｌに溶解し、ＲＮase inhibitor 存在下、Ｔ７ ＲＮＡ polymeraseでクローン化したHGV/GBV-C のｃＤＮＡのＲＮＡを合成した。さらに、ＲＮＡｚｏｌＢで得られたＲＮＡを精製した。精製産物のＯＤ260nm からcopy数/ μｌを算出した。
【００４７】
3)先に作成した１０倍ずつ濃度の違う基準ＲＮＡを１μｌと、１０倍ずつ濃度の違うcompetitor１μｌをプライマーセットＢ２で増幅した。図１に電気泳動泳動パターン例を示す。基準ＲＮＡと同程度の増幅を示したチューブに入った、competitor量が一致した。
【００４８】
実施例２と同様にインターフェロンアルファ（ＩＦＮ）を投与した日本人慢性肝炎患者血清からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡの１μｌを先に作成した１０００から１００００００００ｃｏｐｙまで１０倍ずつ濃度の違うcompetitorにそれぞれ別のチューブ中に加え、プライマーセットＢでＰＣＲで遺伝子増幅を行った。ＰＣＲ条件は９６℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、２０秒、５０回で行った。増幅後、図１に示すように電気泳動パターンで患者血清由来ｃＤＮＡと同程度の増幅を示したチューブに入った、competitor量を、患者のHGV/GBV-C ＲＮＡ量と判定した。同様に、患者ｃＤＮＡ１μｌを各プライマーセットＢ１で１回目、プライマーセットＢ２で２回目のＰＣＲを行いHGV/GBV-C RNA の存在を確認した。ＤＮＡサイズマーカーを参考に１８３ｂｐの増幅バンドを検出した。
【００４９】
図２に示すように、ＩＦＮ投与前でのHGV/GBV-C RNA 量は１０6 copy/ml であったが、ＩＦＮ投与後速やかに陰性となり、投与終了後、再び、ＨＣＶ−ＲＮＡに遅れて、上昇し１０6.5 copy/ml となりその後持続陽性となりＧＰＴの推移と一致した。このことは、本発明によりＨＣＶとHGV/GBV-C の重複感染を検出することができるようになり、かつ独立してそのＲＮＡを定量する事ができるので、ＨＣＶ肝炎との重複感染においてHGV/GBV-C RNA の関与、その治療、予防に本発明は有用であることがわかった。
【００５０】
実施例７
コンペティターの作成と基準ＲＮＡの調製は実施例６と同様に行った。先に作成した１０倍ずつ濃度の違う１００から１０００００００コピーの基準ＲＮＡと、１００００コピーのコンペティターを含む溶液と、実施例１と同様にヒト血清から調製したＲＮＡをプライマー５ｇｆ３Ｂ、５ｇｒ４ＡＤで実施例１と同様にＰＣＲで増幅した。さらに、ＰＣＲ増幅産物５μｌに０．０５Ｎ ＮａＯＨを５μｌ加え攪拌した。さらに、０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ６．８）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、２０％ ポリエチレングリコール8000、50 ng/mlの５’末端ジゴキシゲニン標識プローブ(PGM3Dig: 5'-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGA-3'; ５’−ジゴキシゲニン標識）を２００μｌ加え攪拌した。３７℃、３０分放置後、その１００μｌを、ビオチンを吸着させた９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、商品名：マキソープ）に移し、３０分間放置した。さらに、ＰＣＲ ＥＬＩＳＡキット（ベーリンガーマンハイム、商品名）で発色を吸光度計で４０５ｎｍ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｉｌｔｅｒ ４９２ ｎｍ）を測定した。陰性コントロールとして、ＤＥＰＣ処理水を用い同時に同様に測定しその測定値を０とした。基準ＲＮＡの測定値から、試料の定量値を算出した。
【００５１】
定量値に基づき、１、２及び３型に分類した。地域別に分類すると下記表１２のようになった。
【００５２】
【表１２】
各国のまた、ジェノタイプ別のＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の定量値を図３に示した。各国ともＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の定量値の平均値が１０６ コピー／ｍｌ付近となったが、ジェノタイプ１のアフリカでは、１０４．５ コピー／ｍｌ以下の症例はなく比較的高値で、また、日本、モンゴル等のジェノタイプ２では、１００コピー／ｍｌの低値を示す症例が存在した。
【００５４】
実施例８
日本人慢性肝炎患者ＩＦＮ治療を行った３４例の患者血清よりプライマーセットＢ１、２でHGV/GBV-C RNA を検出した。３例が陽性であった。３例ともＩＦＮ投与前、終了後はHCV 、HGV/GBV-C RNA が陽性であり、症例１では、再々投与終了時点でも、HCV 、HGV/GBV-C RNA が共に陽性であった。従って、ＨＣＶとHGV/GBV-C RNA との重複感染ではＩＦＮ治療抵抗性を示すことが予測された。従って、HGV/GBV-C RNA が検出されれば、ＩＦＮ治療に抵抗性を示すことが予測でき、本発明は、ＨＣＶ肝炎との重複感染においてHGV/GBV-C RNA の関与、その治療、予防に本発明は有用であることがわかった。
【００５５】
【表６】
実施例９ プライマーセットＡ、Ｂ，Ｃの検出率比較。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成は実施例１と同様に行った。プライマーセットA1、2 のＰＣＲ条件は実施例１と同様に行った。プライマーセットB1、2 、プライマーセットB3、4 、プライマーセットC1、2 は、１回目のＰＣＲを９４℃、２０秒、５０℃、２０秒、７２℃、２０秒で、３５回実施。２回目のＰＣＲは９４℃、２０秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、３５回で実施した。以下のように、プライマーセットＢ１およびＢ２が最も検出率が高かった。
【００５７】
【表７】
実施例１０
日本人、各慢性疾患における血清HGV/GBV-C RNA の検出をおこなった。慢性肝疾患患者１９７例、及び、肝機能正常者とその他の疾患患者１２例、合計２０９例についてＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡを検出した。方法は実施例８と同様に行い、プライマーセットＡ１、２、Ｂ１、２、Ｃ１、２の組合せで、いずれかのプライマーセットの増幅バンドが検出された場合陽性とした。
【００５９】
表８、９に示すように、Ｂ型に比べＣ型肝硬変、肝臓癌でＨＧＶ／ＧＢＶ−ＣＲＮＡは比較的高率に検出された。また、肝機能正常者では検出されなかった。
【００６０】
【表８】
Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス別のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ−ＲＮＡ陽性率（日本人）
【表９】
表９ 各種慢性肝疾患別の血清ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ ＲＮＡ陽性率（日本人）
実施例１１
プライマーセットＡ１、２とＢ１、２の検出率比較を行った。
中国人、各慢性疾患における血清HGV/GBV-C RNA の検出を行った。慢性肝疾患患者８０例、及びＩＶＤＵ８５例、供血者５０例、合計２１５例についてHGV/GBV-C RNA を検出した。方法は実施例８と同様に行い、プライマーセットＡ１、２又はＢ１、２の組合せで、増幅バンドが検出された場合陽性とした。
【００６３】
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成は実施例２と同様に行った。
１）プライマーセットＡ１、２は実施例２と同様に行った。
２）プライマーセットＢ１、２は以下のように行った。
【００６４】
ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成は実施例８と同様に行った。１回目のＰＣＲはプライマーセットＢ１を９４℃、２０秒、５０℃、２０秒、７２℃、２０秒で、３５回実施。２回目のＰＣＲはプライマーセットＢ２を用い、９４℃、２０秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、３５回で実施した。実施例２と同様、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡサイズマーカーと比較し１７６ｂｐ（１７７ｂｐ）の特異バンドを確認した。
【００６５】
表１０、表１１に示すように、全てにおいてプライマーセットＢ１、２が高検出率であった。また、供血者よりHGV/GBV-C RNA 陽性例がプライマーセットＢ１、２で検出されたため、供血者においてもスクリーニングに使用できる。従って、特に、プライマーＢ１、２はHGV/GBV-C に対する、予防に有効であることが明らかとなった。
【００６６】
【表１０】
【表１１】
実施例１２ ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による分類
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂ社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４゜Ｃで５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃで１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃ、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４゜Ｃで５分間遠心し上清を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００６９】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） ２μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １ μｌ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ （商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）０．１μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． ）５０ｕｎｉｔｓ 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名；宝酒造）２０ｕｎｉｔｓ 、ＤＥＰＣ処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７゜Ｃで１時間インンキュベートした。
【００７０】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマー５ｇｆ３、５ｇｒ６を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Ｓａｉｋｉ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８１−４９１，１９８８） した。反応液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，８００μＭｄＮＴＰ，１．２５ 単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （商品名；日本ＲＯＣＨＥ）で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変成９４゜Ｃ、２０秒、アニール５０゜Ｃ、４５秒、伸長７２゜Ｃ、４５秒で行った。さらにこの増幅産物を、プライマーセット５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤで２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４゜Ｃ、２０秒、アニール５５゜Ｃ、４５秒、伸長７２゜Ｃ、６０秒で行った。
【００７１】
４）制限酵素の切断
３）の増幅産物の５μｌを下記の制限酵素それぞれ別々に、１０ｕｎｉｔｓ 用い、１時間処理した。
制限酵素 処理温度 処理溶液
ＢｓｍＦ１ ６５゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４
ＢｓｍＡＩ ５５゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ＢｓｍＡＩ
ＳｃｒＦＩ ３７゜Ｃ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４
（商品名；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社製）
【００７２】
５）電気泳動
増幅産物を、アガロース（トリスーボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ一定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。フライマー ５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤの増幅産物は、ＤＮＡサイズマーカーを参考に制限酵素処理をしないものは約１８３ｂｐの増幅バンドを確認した。制限酵素処理したものの電気泳動パターンを図４〜６に示す。
【００７３】
１）ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ の５’ＵＴＲ の塩基配列決定。
実施例１と同様に、血清よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。
プライマー５ｇｆ３、５ｇｒ４ＡＤを用いた増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；商品名；パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名；パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。
【００７４】
各地域別の結果を下記表１６に示す。
実施例１３ ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＮＳ５Ｂ領域の遺伝子型判定
１）ＲＮＡの精製
血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂ社製）９００μｌ、クロロフォルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置し、１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに、１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上清を捨てた。この操作を更に２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００７６】
２）ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）２μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｏ．Ｄ． ２６０ ｎｍ） ０．１μｌ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（商品名：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）５０ｕｎｉｔｓ 、リボヌクレアーゼインヒビター（商品名：宝酒造）２０ｕｎｉｔｓ 、ＤＥＰＣ処理水を加え、合計１０μｌで攪拌後、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７７】
３）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、プライマーＭＧ５ＢＦ３、ＭＵＮＳ５Ｒ１を用いて、上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Ｓａｉｋｉ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８１−４９１， １９８８） した。反応液は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５０ｍＭ ＫＣｌ、８００μＭ ｄＮＴＰ、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （商品名：日本ＲＯＣＨＥ）で行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４℃、２０秒、アニール５０℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。さらにこの増幅産物をプライマーＭＧ５ＢＦ４、ＭＵＮＳ５Ｒ１でそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、サイクル３５、変性９４℃、２０秒、アニール５５℃、２０秒、伸長７２℃、２０秒で行った。
【００７８】
４）ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡのＮＳ５Ｂ領域の塩基配列決定
３）の増幅産物をクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名：ベーリンガーマンハイム社製）を用いて精製した。さらに、精製産物をｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ； 商品名：パーキンエルマー社製）を用い、３７７オートシークエンサー（商品名：パーキンエルマー社製）で両方向から決定した。
【００７９】
５）系統解析
Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ （商品名：ＤＮＡ ｓｔａｒ社）のｃｌａｓｔａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ によって系統解析を行った。その結果、表１５及び図１０に示すように、世界的に大きく３つに分類された。
【００８０】
【表１５】
実施例１３ ＨＧＶ／ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ ＮＳ５Ａの検出
実施例１と同様に、日本人肝ガン患者血清１０例からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後、プライマー５ＡＦ、５ＡＲＨ、５ＡＲＧでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃、１５秒、５５℃、４５秒、７２℃、４５秒、５５回で行った。ＰＣＲ産物はプローブ５ＡＰＤ（配列番号３５９の５’末端をジゴキシゲニンで標識したもの）を用いて実施例７と同様に検出した。４０５ｎｍにおける吸光度が０．５以下を陰性とし、それ以上を陽性とした。また、プライマーセットＡ１、２で同様に検出を行った。検出結果は、プライマーセットＡ１、２での陽性率は２０％（２／１０）で、ＮＳ５Ａでの検出は１０％（１／１０）とやや検出率が低かった。
【００８２】
実施例１４ ジェノタイプ別プローブを用いた５’非翻訳領域の検出
実施例１と同様に、シーケンスによりジェノタイプのわかっているＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ ２０例のＲＮＡと抽出し、ｃＤＮＡ合成後、プライマー５ｇｆ３Ｂと５ｇｒ４ＡＤでＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物１μｌに０．０５ Ｎ ＮａＯＨを５μｌ加え攪拌した。さらに０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、２０％ポリエチレングリコール８０００、５０ ｎｇ／ｍｌのプローブＭＵＡ（１型検出用、配列番号３６０）、ＭＵＦ（２型検出用、配列番号３６１）及びＭＵＡＰ（３型検出用、配列番号３６２）各２００μｌをそれぞれ別々のチューブ内で加え攪拌した。３７℃、３０分放置後、その１００μｌを、ビオチンを吸着させた９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、商品名：マキソープ）に移し、３０分間放置した。さらに、ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ（ベーリンガーマンハイム；商品名）で発色を吸光度計で４０５ｎｍ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｉｌｔｅｒ ４９２ ｎｍ）を測定した。４０５ｎｍにおける吸光度が１以上を陽性とし、各タイププローブでＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ のタイピングを行った。その結果、下記表１６に示すように、シーケンスの結果と一致した。従って、より容易にＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ の型判別が可能となった。
【００８３】
【表１６】
【発明の効果】
本発明により、新規な非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスサブタイプが見出され、その塩基配列が決定され、かつ、その検出及び分類手段が初めて提供された。従って、本発明は、肝炎の診断に大いに寄与するものと期待される。
【００８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプライマーを用いて行った非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型型肝炎ウイルスの定量結果を示す図である。
【図２】肝炎患者のインターフェロン−α−治療前後のＨＣＶ ＲＮＡレベル及び非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型型肝炎ウイルスレベルを示す図である。
【図３】本発明の実施例７の方法により分類した、各地域の肝炎患者のジェノタイプと血清中のHGV/GBV-C RNA のコピー数との関係を示す図である。
【図４】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＢｓｍＦ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図５】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＳｃｒＦ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図６】非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスを制限酵素ＢｓｍＡ１で消化した後、電気泳動にかけた場合の、各分類系についてのバンドのパターンを示す図である。
【図７】本発明の方法により、５’非翻訳領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図８】本発明の方法により、ＮＳ３領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図９】本発明の方法により、ＮＳ５ｂ領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
【図１０】本発明の方法により、ＮＳ５Ｂ領域に基づいて分類された非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの系統図である。
Claims (10)
- 配列表の配列番号１５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号１５８で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号１５４で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号１５５で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号１５６で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号３５６で示される塩基配列から成るプライマー、配列表の配列番号３５７で示される塩基配列から成るプライマー及び配列表の配列番号３５８で示される塩基配列から成るプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することから成る、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎の検出方法。
- 配列表の配列番号３５９で示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａ領域検出用プローブ。
- 配列表の配列番号３６０ないし３６２のいずれかで示される塩基配列から成る核酸を標識して成る非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域検出用プローブ。
- 配列番号１５０で示される塩基配列から成るプライマー及び配列番号１４９で示される塩基配列から成るプライマーを用いて増幅された、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの５’非翻訳領域由来の断片について、下記基準により１、２、３ａ、３ｂの４種類に分類する、非Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ型肝炎ウイルスの分類方法。
１は、
ＳｃｒＦＩで切断され、約１０８、４０及び３４ｂｐの断片を生じ、約１０８又は４０ｂｐの断片を検出する。
２は、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断され１５７、２６ｂｐの断片を検出する。
３ａは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。かつ、ＢｓｍＦＩで切断せず、かつ、ＢｓｍＡＩで切断され約７５、５５、５３ｂｐの断片を生じ、７５または５３ｂｐの断片を検出する。
３ｂは、
ＳｃｒＦＩで切断せず、または切断され、約１４９、３４ｂｐの断片を生じ、１８４または１４９ｂｐの断片を検出する。ＢｓｍＦＩで切断せず、ＢｓｍＡＩで切断しないか、または、切断され約１２８、５５ｂｐの断片を検出する。
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