KR20130113208A

KR20130113208A - 만성 ｂ형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법

Info

Publication number: KR20130113208A
Application number: KR1020120035603A
Authority: KR
Inventors: 천지용; 신수경; 유왕돈; 김수옥; 홍선표; 김석준; 박영민
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2013-10-15
Also published as: KR101402608B1

Abstract

본 발명은 만성 B형 간질환 환자에 대해 처방하는 피리미딘계 항바이러스 제제에 대한 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus, HBV) 내성 발생을 예측하는 방법으로, 국내 만성 B형 간질환 (CHB) 환자 중 피리미딘계 항바이러스 제제를 복용하는 환자군인 약제감수성군과 피리미딘계 항바이러스 제제를 복용하는 환자에서 피리미딘계 항바이러스 제제 내성이 생긴 환자군인 약제내성군 사이의 차이를 이용하여, 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 HBV의 발생을 예측하는 기술을 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

만성 Ｂ형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법{Composition for anticipating drug resistance against therapeutic agent of chronic Hepatitis B and method thereof}

B형 간염 바이러스(HBV)는 만성 간염, 간경변 그리고 간암 등의 만성 간질환을 유발 하는 비세포병변성(non-cytopathic) DNA 바이러스로 전세계 인구의 약 5%가 감염되어 있으며, HBV 감염 환자 가운데 75%에 달하는 인구가 아시아 태평양 지역에서 발생되고 있고, 그 중 우리나라에서는 약 3.7%가 만성 B형 간염에 감염되어 있다. (한국 국민건강영양조사 2007; 277p) HBV의 감염 후 임상 경과는 다양하여 바이러스의 효과적인 제거가 일어날 수도 있고, 만성화나 전격성 간염으로의 이행이 일어날 수도 있다. 특히 더욱 병변이 진행되어 간암을 유발시킬 수 있는 원인으로, HBV에 의한 만성 B형 간질환 환자에서 간암이 발생될 위험성은 일반인보다 70~200배 높은 것으로 보고되고 있다. 미국과 우리나라는 전체 간암의 약 50%, 약 75 ~78%가 각각 HBV에 의해 유발된다고 알려져 있다.

만성 B형간염의 치료제인 경구용 항바이러스제는 인터페론 등과 비교하여 부작용이 적고, 복용이 간편하기 때문에 널리 사용되고 있다. 이러한 경구용 항바이러스제 중 하나인 라미부딘은 2‘3’-dideoxy-3'-thiacytidine구조를 갖는 뉴클레오사이드 유도체 (nucleoside analogue) 로서 HBV 역전사 효소에 경쟁적으로 작용하여 DNA 합성을 단절시킴으로써 바이러스의 증식을 억제한다.

라미부딘은 HBV 복제를 억제하는 효과가 우수하며 성별, 연령, 감염 경로, 다른 항바이러스제 치료 유무, HBV DNA 수치, 간질환의 정도 등 치료 전 환자 상태에 크게 영향을 받지 않는 등의 여러 가지 장점을 가지고 있다.

그러나 핵산유사체라는 특성상 바이러스를 완전히 제거하지 못하기 때문에 약제를 지속적으로 복용해야 하고, 이에 따르는 약제내성 바이러스의 출현을 피할 수 없다는 문제점 역시 존재한다. 라미부딘 내성 바이러스는 돌연변이를 통해 Pol 활성부위의 주요 아미노산 잔기인 YMDD motif (아미노산 549-552) 점 돌연변이로 인하여 바뀌는 것인데, 이런 변화는 라미부딘이 중합효소과의 결합을 방해하게 되고 따라서 중합반응의 기질로 사용되지 못하게 된다. B형 간염 바이러스는 자생적으로 돌연변이가 매우 잘 발생하지만, 이들은 야생형 바이러스에 비해 증식력이 약하기 때문에 항바이러스제를 투여하지 않는 조건에서는 상대적으로 우월하게 생존하기 힘들다. 그러나 장기간 항바이러스제를 투여할 시 해당 약제에 내성을 지닌 돌연변이가 선택적으로 생존하기 유리한 환경이 조성되고, 약제가 바이러스를 완벽하게 억제하지 못하게 되어 점차 증식, 바이러스 돌파현상(breakthrough)이 나타날 수 있다. (Lee CH et al. Gastroenterology 2006;130:1144-1152.)

라미부딘은 투여 후 1~4년 동안 24~70% 정도의 내성 발생율을 보인다. (Lai CL et al. Clin Infect Dis 2003; 36:687-696.) 이렇게 높은 내성 발생률로 인해 최근 일부 가이드라인에서는 일차 약제로 라미부딘 이외의 약제를 선호하고 있는 실정이다. 그러나 우리나라는 보험 급여 여건으로 인해 다년간 초치료 약제로 라미부딘을 사용해 오고 있으며, 최근 들어 약제 선택 범위가 다양해지고 있으나 아직도 라미부딘이 초치료의 주종을 이루고 있다.

이러한 현상들은 앞으로도 라미부딘 내성 환자들의 점진적 증가를 예고하고 있으며, 라미부딘 내성 환자에 대한 대비 및 치료가 중요한 이슈로 대두되고 있다.

따라서 본 발명에서는 HBV 돌연변이가 라미부딘 내성 유발에 연관성이 높은 마커를 검증하여 제시하고자 하며, 향후 만성 B형 간질환 환자에의 치료 지침을 세우는데 중요한 근거를 제시할 수 있을 것으로 기대한다.

관련특허로 대한민국 특허공개번호 제1020110014599호는 다양한 약제에 대한 내성 B형 간염 바이러스를 동시에 검출 하기 위한 방법에 관한 것으로, 1) 다약제 내성 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 표적 프로브와 2) 야생형과 변이종 바이러스에 대한 상대적인 양적 분석 및 비특이적 교차 혼성화반응에 의한 배경 측정으로 양성과 위양성 결정이 가능한 음성조절 프로브, 3) 마이크로어레이의 품질 관리를 위한 QC 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 다약제 내성 B형 간염 바이러스의 검출 방법 및 진단 키트를 제공하고, 다양한 약제에 의한 다수의 다양한 부위의 내성 변이들을 조기에 신속, 정확하고 간편하게 감지하고 임상에 유용한 검출 및 진단 방법을 제공한다고 기재되어 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 국내 만성 B형 간질환 (CHB) 환자 중 라미부딘을 복용하는 환자에서, 약제감수성군과 라미부딘 내성 HBV가 생긴 약제내성군 사이의 유전적 차이를 찾아내어, 통계학적인 분석을 통해 HBV precore 지역의 돌연변이에 따라 라미부딘 내성 발병 위험이 유의미하게 변하는 것은 확인하였으며, 이를 라미부딘 내성 예측 마커로 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

그러므로 본 발명의 목적은 HBV DNA로부터 라미부딘 내성 발생 예측 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 라미부딘 내성 마커를 검출하는 방법 및 이로써 내성 발생에 대한 감수성을 예측하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 상기 라미부딘 내성 예측에 필요한 정보를 제공할 수 있는 HBV DNA의 라미부딘 예측 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBV X/precore 유전자 지역의 돌연변이로서 1753번째 티민 염기가 아데닌, 시토신, 또는 구아닌 염기로 치환된 유전자 또는 1846번째 아데닌 염기가 시토신, 구아닌, 또는 티민 염기로 치환된 유전자 및 이들의 조합을 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 마커 조성물은 1753번째 티민 염기의 변이형 유전자, 또는 1846번째 아데닌 염기의 야생형 유전자인 경우에 라미부딘 내성으로 예측되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HBV 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열 중 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및/또는 전좌 등의 돌연변이에 의하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 가지는 염기서열을 가지는 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다.

또 본 발명은 HBV X 유전자에 의해 코딩 되는 X 단백질을 구성하는 127번째 아미노산이 아이소류신(I)에서 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T)으로 변형된 펩타이드를 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HBV X 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열 중 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및/또는 전좌 등의 돌연변이에 의하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 가지는 아미노산서열을 가지는 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명은 서열번호 9 내지 10의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 내지 12의 프라이머쌍 또는 이들의 조합인 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 프라이머 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 (a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;(b) 프라이머를 사용하여 상기 DNA의 X/precore 유전자 지역의 T1753V, 및 A1846B 지역 중 어느 하나 이상의 돌연변이를 함께 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 DNA 서열을 분석하여 HBV DNA에서 변이지역 중 1753번째, 또는 1846번째 지역의 염기가 무엇인지 판별하는 단계를 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측 마커 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예 상기 프라이머는 제6항의 프라이머 조성물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 키트를 제공한다. 이들 키트에는 이들 프라이머쌍 이외에도 PCR에 필요한 Polymerase, 버퍼, NTP 등을 포함할 수 있다.

비록 본 발명의 일 실시예에서는 라미부딘에 대한 내성을 살펴보았지만, 피리미딘계 항바이러스 제제인 텔미부딘, 클레부딘은 모두 라미부딘과 거의 유사한 구조체로서, 동일한 기작에 따라 약물 반응 및 내성 변이에 따른 내성 획득을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 rtM204V/I변이는 텔비부딘, 클레부딘에서도 교차내성을 보이며, rtA181T 변이 역시 공통적으로 감수성이 저하된다. (Yim HJ. The Korean Journal of Hepatology 2008 ; 14 : 446 - 464.) 따라서 통상적으로 피리미딘계 항바이러스 제제들 중 어느 한 종류에 대해 새로운 약물 반응 기전 및 내성 변이의 발견은 다른 피리미딘계 항바이러스 제제들에 대해서도 동일한 기전을 가지는 것으로 인식되고 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 HBV DNA에서 선택되는 하나 이상의 점돌연변이로 이루어지는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 마커를 제공한다.

또한 본 발명은 HBV DNA에서 T1753V, A1846B 변이를 포함하는 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는, RFMP (Restriction fragment mass polymorphism)를 위한 프라이머쌍과 시퀀싱을 위한 프라이머쌍을 포함한다.

또한 본 발명에서는 본 발명에 따른 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 조성물을 포함하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 키트를 제공한다.

나아가 본 발명은, 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 RFMP 분석법 또는 염기서열 분석을 통하여, HBV DNA에서 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 마커인 T1753V, A1846B 변이를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염기서열 분석은 RFMP 분석, 시퀀싱 분석, TaqMan 기법, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 실시간 PCR(real-time PCR) 및 유사 분자유전학적 방식에 따른 분석법을 통해 수행할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 야생형이라 함은 정상형을 의미하며 자연계에서 다수 발견되는 유전자를 말한다. 또한 변이형이라 함은 유전자 상에 변화가 생겨 야생형과 다른 유전자를 말한다.

보다 구체적으로는, 야생형과 다른 유전형을 가지는 변이형 각각을 돌연변이라 하며, 돌연변이를 표현할 때에는 야생형, 유전자부위, 변이형 순서로 표현한다. 즉, T1753V(A, C, G)의 경우 이 부위는 1753번째 bp이며, 야생형은 T, 변이형은 A, C, G라는 뜻이다. 또한 상기 T1753V에서 "V"는 염기 A, C, G 중 어느 변이형도 나타날 수 있다는 의미다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 HBV 유전자 상의 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 마커라 함은 HBV 유전자상의 X 및 precore/core 유전자 내 돌연변이 지역을 포괄하는 것으로, 그 중에서도 T1753V, A1846B 돌연변이를 포함한다. 또한 상기 A1846B 에서 "B"는 염기 C, G, T 중 어느 변이형도 나타날 수 있다는 의미다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 약제감수성군이라 함은 국내 만성 B형 간질환 환자 중 피리미딘계 항바이러스 제제를 복용하면서 피리미딘계 항바이러스 제제 내성이 없는 환자군을 뜻한다. 또한 약제내성군이란 국내 만성 B형 간질환 환자 중 피리미딘계 항바이러스 제제를 복용하면서 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 HBV가 생긴 환자군을 말한다.

보다 구체적으로는, 본 발명에서 모든 환자에 대해서는 임상적, 생화학적, 유전학적 검사 소견을 종합하여 판단하였다. 만성 간염(CHB)은 임상적으로 6개월 이상 HBsAg 양성인 환자 중에서 HBV DNA 농도 10⁵copy/ml 이상이고, 간염수치 (AST, ALT)가 60 IU/L 이상인 경우로 정의하였다. 또한 라미부딘 내성 환자는 한국, 미국의 일반 진료 기준인, 치료기간 동안 1차 치료 반응은 있었으나, 투여 순응도가 확인된 환자가 HBV DNA 최저점(nadir)과 비교해서 두 번의 연속 검사에서 최소 1 log₁₀ copies/mL (또는 >1.0 log₁₀ IU/mL)이상 증가하는 결과가 나오는 바이러스 돌파현상(virologic breakthrough)을 경험하는 환자로 정의한다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 로지스틱 회귀 분석 (multivariate logistic regression analysis)라 함은 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 부위 돌연변이의 변수 하나와의 관계를 분석하여, 독립변수를 통한 종속변수의 예측이 가능한 공식을 확립할 수 있도록 하는 통계 분석 방법을 의미하며, 이는 SAS System version 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA)을 통해 시행하나 이에 국한되지 않으며, 분석을 할 수 있는 모든 분석 프로그램을 포함한다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 라미부딘 내성 위험군이라 함은 내성이 발생되지 않았으나, 로지스틱 회귀 분석을 통해 도출된 종속변수인 내성/비내성과 독립변수인 HBV 유전자 부위 돌연변이와의 관계를 이용하여 라미부딘 내성 위험이 예측되는 환자 전체를 뜻한다.

또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 라미부딘 내성 발생 예측 검사 방법이라 함은 로지스틱 회귀 분석을 통해, 각 환자들의 HBV 유전자 상의 라미부딘 내성 마커를 통해 환자들의 라미부딘 내성 HBV 발생 위험을 예측할 수 있는 방법 전체를 뜻한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명자들은 라미부딘 내성과 관련된 예측 마커를 검토하던 중, 라미부딘 내성 환자에게서 특이적으로 많은 HBV DNA상의 변이가 존재한다는 것을 확인하고 국내 만성 B형 간질환 환자 중 라미부딘을 복용하는 환자군과 라미부딘을 복용하는 환자에서 라미부딘 내성이 생긴 환자군 사이의 HBV DNA 변이를 비교하여 확인하고, 이들 변이를 분석함으로써 이를 라미부딘 내성 예측을 위한 마커로 사용할 수 있음을 예상하였다.

이에 본 발명자들은 HBV DNA 중 X/precore 유전자 지역의 발현 양상을 약제감수성군과 약제내성군을 대상으로 비교한 결과, 약제내성군에서 T1753V의 변이형, A1846B의 야생형이 통계학적으로 유의한 수준으로 약제감수성군보다 많다는 것을 규명하였으며, 나아가 라미부딘 내성 예측 마커로 입증하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 약제감수성군과 약제내성군 간의 HBV DNA의 X/precore 유전자 지역의 돌연변이 차이를 분석하기 위해 약제감수성군과 약제내성군의 혈청 샘플을 대상으로 DNA를 추출한 다음 X/precore 유전자 지역을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 이를 통해 본 발명자들은 8개의 돌연변이를 발굴하였는데, 즉 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 약제감수성군 및 약제내성군으로부터 수득한 DNA에 대해 X/precore 지역을 포함하는 프라이머를 사용하여 이 지역을 증폭하였고 RFMP 또는 시퀀싱 분석을 통해 변이를 분석한 후, 통계학적 분석을 통해 이들 돌연변이를 조사하였다.

그 결과, 8개의 돌연변이 중 T1753V, A1846B가 각각 약제내성군과 약제감수성군에서 높은 비율로 존재한다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 T1753V, A1846B를 라미부딘 내성 예측을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 HBV DNA 상의 돌연변이와 그 중에서도 특히 T1753V, A1846B 돌연변이를 포함하는 DNA 라미부딘 내성 예측 마커를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 라미부딘 내성 예측 마커의 경우, 상기 마커를 조합한 일배체형 마커를 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 라미부딘 내성 예측 마커는 라미부딘 내성과의 새로운 상관관계를 밝힘으로써, 라미부딘 내성에 대한 감수성을 조기에 검출하고 라미부딘 투여 환자에 대한 예후, 진단을 보조하는데 사용될 수 있다.

또한 본 발명에서 라미부딘 내성 예측을 위해 사용할 수 있는 마커는 상기 기술된 바와 같이 본 발명에 규명한 X/precore 유전자 지역의 돌연변이를 포함하는 DNA이외에도 상기 돌연변이에 의해 코딩되는 단백질을 사용할 수 있다. 구체적으로 X 유전자에 의해 코딩 되는 X 단백질을 구성하는 127번째 아미노산이 아이소류신(I)에서 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T)으로 변형되는 것을 포함하는 단백질을 라미부딘 예측용 마커로 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 X/precore 유전자 지역의 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 라미부딘 내성 예측용 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 조성물은 특히 T1753V, A1846B 지역을 포함하는 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 라미부딘 내성 예측용 조성물을 포함하는 라미부딘 내성 예측 키트를 제공할 수 있다.

상기 라미부딘 내성 예측용 키트에는 본 발명의 돌연변이 마커뿐 아니라 중합반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종 중합효소 등등을 포함할 수 있다.

상기 증폭할 수 있는 프라이머란 적절한 조건 (예를 들면, 온도, 버퍼 농도 등) 하에서 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가락 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10~30개의 뉴클레오티드(nucleotide)이다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 돌연변이 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 증폭을 개시한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 서열번호 1~12로 이루어진 쌍이 바람직하나 이에 국한되지 않고 라미부딘 내성 예측 마커를 포함하여 증폭시킬 수 있는 모든 프라이머를 말한다.

나아가 본 발명은 라미부딘 내성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 라미부딘 예측 마커를 검출하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 검출 방법은 생물학적 샘플 중 본 발명의 마커 DNA의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 염기서열 분석은 RFMP 분석, 시퀀싱(sequencing) 분석, TaqMan 기법, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 그 외 유사 분자유전학적 방식에 따른 분석법을 통해 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 본 발명의 라미부딘 내성 예측 마커를 검출하는 방법은,

(a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;

(b) DNA의 X/precore 유전자 지역의 돌연변이, 그 중에서도 특히 상기 T1753V, A1846B 지역 어느 하나 이상의 돌연변이를 함께 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭된 DNA 서열을 분석하여 HBV DNA에서 변이지역의 염기, 그 중에서도 특히 T1753V, A1846B 지역의 염기가 무엇인지 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명은 상기 본 발명에 따른 라미부딘 내성 예측 마커를 검출하는 방법을 통해 상기 변이지역의 염기를 판별함으로써 라미부딘 내성 위험을 예측 및 판단할 수 있다.

상기에서 (a)단계의 검체로부터 DNA를 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 (b)단계의 변이 지역을 증폭하는 단계는 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외에 유사 분자유전학적 방식을 통한 증폭 방법이 사용될 수 있다. 또한 상기 (c)단계의 판별은 RFMP 분석, 시퀀싱 분석, TaqMan 기법, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 그 외 기타 분자유전학적 방식에 따른 분석법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명은 국내 만성 B형 간질환 (CHB) 환자 중 라미부딘를 복용하는 환자군을 대상으로 X/precore 지역에서 8개의 유전학적 변이를 동정하였다. 이들에 대해 통계학적 분석을 통해 두 개의 변이인 T1753V, A1846B 그리고 이들을 조합한 HT2, HT3이 라미부딘 내성 발생 및 내성 발생 기간과 연관되어 있음을 밝혔다. 만성 B형 간질환 (CHB) 환자 중 라미부딘을 복용하는 환자에서 라미부딘 내성 발생 및 복용으로부터 내성 발생 유발과의 통계학적으로 유의미한 연관성을 포함하는 본 발명의 결과들은 라미부딘 내성 발생을 예측하는 마커 및 방법으로써 환자의 특성(HBV 유전자 상의 라미부딘 내성 마커)에 따라서 개별적으로 사전에 예측함으로써 환자 개인별 치료지침을 보다 효율적으로 판단할 수 있도록 할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3'배향으로 기록된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위해 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

실시예1 : DNA 시료 준비

1) 대상환자

HBV 라미부딘 내성 발생 관련 마커를 발굴하기 위해 분당제생병원에서 HBsAg (hepatitis B surface antigen) 양성인 환자를 무작위로 추출하였으며 HBV 감염 환자 특이적인 증상 진행 여부를 보다 정확하게 조사하기 위하여, 알코올성 간질환이 합병된 경우, C형 간질환을 동반하는 환자는 배제하였다. 이렇게 추출한 국내 만성 B형 간질환 (CHB) 환자 중 라미부딘 복용 환자만을 정렬하였으며, 이들 중 바이러스 돌파현상과 라미부딘약제 바이러스감소 발생 유무에 따라 라미부딘을 복용하는 약제감수성군 42명과 라미부딘을 복용하는 환자에서 라미부딘 내성이 생긴 약제내성군 53명을 포함하는 총 95명 HBV 감염환자를 최종적으로 선정하였다

2) 임상 데이터 조사

상기 환자들에 대하여 혈액을 채취한 후 기본적인 혈청 생화학적 검사를 시행하였다. 첫 내원 시 HBsAg 양성인 경우, 항-HBs, e항원 (HBeAg), 항-HBe, HBV-DNA, 알파태아단백(alpha-fetopretein, AFP) 검사 및 CBC 및 LFT 검사를 하고 남은 혈액은 -80℃에서 냉동 보관하였다. 혈청 HBV DNA의 정량은 real-time PCR (Applied Biosystems) 을 이용하였으며, 이 검사의 HBV DNA 검출한계는 500 Copies/mL이다. 95명의 환자에 대한 임상 프로파일은 표 1과 같다.

	약제감수성군	약제내성군
피검자수	42	53
연령	50.3(27-72)	50.2(32-73)
성별(M/F)	31/11	39/14
HBeAg양성률(%)	52.3	88.7
HBsAg양성률(%)	100.0	100.0

표 1은 국내 만성 B형 간질환 환자 중 라미부딘을 복용한 약제감수성군과 약제내성군의 임상 프로파일 표이다.

3) DNA 추출

상기 환자들의 각각의 혈액으로부터 QIAamp DNA Blood Mini Kit 250 (Qiagen 51106)을 이용하여 키트 매뉴얼에 기초하여 HBV의 DNA를 분리하였다.

실시예2 : HBV X와 precore 부위의 증폭

상기 실시예 1을 통해 추출한 DNA를 기초로 하여 X/precore 부위를 포함하는 부위(810-bp)를 표적으로 하여 PCR로 증폭한 후, 각각 염기서열을 분석하였다. 염기서열 위치의 기준은 야생형 유전형 C형의 HBV의 전체 게놈 3215-bp (NCBI Reference Sequence: NC_003977.1)으로 하였다. Precore 부위의 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 preC-F1 (5'-CAC TTC GCT TCA CCT CTG CAC-3';서열번호 3,센스 뉴클레오타이드, 1581번째 염기부터 1602번째 염기까지에 해당)과 역방향 프라이머로 preC-R1 (5'-AGG CGA GGG AGT TCT TCT TCT AGG -3';서열번호 4,안티센스 뉴클레오타이드, 2366번째 염기부터 2389번째 염기까지에 해당)를 이용하였다. PCR 조건으로서, 최초 변성(denature) 94℃에서 5분, 40 cycle로 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 수행하고, 최종 신장 (final extension)은 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였다. X 부위의 2nd PCR의 조건으로서, 최초 변성(denature) 94℃에서 5분, 35 cycle로 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 수행하고, 최종 신장 (final extension)은 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였다.

실시예3 : Sequencing 을 통한 마커 조사

상기 실시예2를 통해 증폭된 PCR 산물은 Intron PCR clean-up kit를 이용하여 회수하였고, 이 중 무작위적으로 선택한 30명의 환자에 대해서 X/precore 부위의 상기 PCR 산물에 대한 염기서열 분석을 위한 프라이머 쌍으로는 preC-F1과 preC-R1을 이용하여 양쪽으로 염기서열을 분석하였다.

각 검체 당 X와 precore 부위의 염기서열을 분석하여 돌연변이 여부를 판단하였다. 염기서열 분석은 자동염기서열 분석장치인 Applied Biosystems model 3100 DNA genetic analyser로 수행하였고, 반응은 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit를 이용하여 수행하였다. 주형 DNA로는 30ng의 회수된 PCR 산물을 사용하였고, 프라이머는 X 또는 precore 양쪽 프라이머 중에 한쪽 방향으로만 3 pmol을 BigDye Terminator v3.1 RR-100 mix 0.5㎕에 멸균증류수를 첨가하여 최종 부피 10㎕가 되도록 하여 반응을 수행하였다. 조건은 25 cycle로 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분으로 수행하였다. 이렇게 분석된 염기서열을 사용하여 같은 위치에 한 가지 이상의 돌연변이가 나타나는 경우를 모두 표시하여 총 8개의 지역(G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A, G1899A)을 후보 마커로 선정하였다.

실시예4 : RFMP 를 통한 마커 조사

1) 2nd PCR

상기 실시예2를 통해 증폭된 모든 PCR 산물은 Intron PCR clean-up kit를 이용하여 회수하였고, RFMP 분석을 통해 상기 8가지 지역에 대해 분석하였다. G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A, G1899A 지역의 2nd PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 RFMP1613-F/R 쌍, RFMP1653-F/R 쌍, RFMP1753-F/R 쌍, RFMP1846-F/R 쌍 그리고 RFMP1762-F/1899-R 쌍을 사용하였다 [표 2].

Name	Sequence (5'-3')	Position
RFMP1613-F	TCGCTTCACC ggatg CTGCACGTCGCATGGA(서열번호 5)	1586-1612
RFMP1613-R	AGACTTGGTG ggatg GCGTTCACGGTGGT(서열번호 6)	1638-1614
RFMP1653-F	CCCACCAAGT ggatg TTGCCCAAGGTCTTA(서열번호 7)	1627-1652
RFMP1653-R	CATCGCTGAG ggatg GTCCAAGAGTCCTCTTAT(서열번호 8)	1682-1654
RFMP1753-F	GGGAG ggatg AGTTGGGGGAGGAGA(서열번호 9)	1732-1752
RFMP1753-R	CCTCCTAGTA ggatg AAAAATCATTAACCTA(서열번호 10)	1780-1754
RFMP1846-F	ACTTTTTCAC ggatg TCTGCCTAATCATCTC(서열번호 11)	1819-1845
RFMP1846-R	GGCTTGA ggatg CAGTAGGACATGAACA(서열번호 12)	1873-1850
RFMP1762-F	TGGGGGAGGAGATT ggtag GTTAA(서열번호 13)	1741-1761
RFMP1899-R	ATTCTTTATAGGGTCAATGT ggtag(서열번호 14)	1925-1900

표 2는 RFMP용 프라이머의 염기서열이고, Fok I인식 염기서열은 소문자 표시

PCR 조건으로서, 최초 변성(denature) 94℃에서 5분, 40 cycle로 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 수행하고, 최종 신장 (final extension)은 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였다. 2nd PCR의 조건으로서, 최초 변성(denature) 94℃에서 5분, 35 cycle로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 수행하고, 최종 신장 (final extension)은 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였다.

2) PCR 산물의 효소 절단

상기 PCR을 통해 만들어진 PCR 산물들은 효소반응을 위해 제한효소인 FokI 2unit과 FokI 반응 버퍼 (50mM CH3COOK, 20mM Tris-acetate, 10mM (CH3COO)2Mg, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)) 10㎕ 그리고 PCR 산물 10㎕를 혼합하여 37℃에서 2시간, 42℃에서 2시간을 효소반응 시켰다. 이를 통해 표 3과 같은 DNA 절편을 얻을 수 있다.

3) MALDI-TOF를 통한 HBV X/precore 부위의 마커 조사

상기 효소 반응을 통해 구한 DNA 절편들은 순수 분리를 위해 Oasis (Waters) C18 이온 수지 교환 컬럼(C18 reverse phase column chromatography)을 이용했다. 먼저, 상기 효소 반응물에 0.15M 트리 에틸암모늄아세테이트(TEAA, pH 7.6) 70 ㎕를 넣어 1분간 둔다. 컬럼에 100% 아세 토니트릴(ACN; Sigma, USA)과 0.1M TEAA 1 ㎖을 통과시켜 레진(Resin)을 활성화시 킨 후, 상기 효소로 처리한 용액과 0.15M TEAA와의 혼합액 100 ㎕, 0.1M TEAA 2 ㎖ 및 3차 증류수 1 ㎖를 차례로 완전히 통과시켰다. 수집 플레이트(Collection Plate) 위에 상기 컬럼을 위치시키고, 70% ACN 100 ㎕을 넣어 통과시켰다. 용출액 이 수집 플레이트에 모아지면, 상기 수집 플레이트를 120℃에서 60분간 건조시켰다.

말디 매트릭스(MALDI matrix)[22.8 ㎎ 암모늄 시트레이트, 148.5 ㎎ 히드록시피콜린산(hydroxypicolinic acid), 1.12 ㎖ 아세토니트릴, 7.8 ㎖ H₂O] 4㎕를 말디-토프 매스 스펙트로메트리(Biflex IV, Bruker)의 앵커 칩 플레이트(Anchor chipplate)에 미리 점적(dotting)한 후, 정제 및 탈염과정을 거친 수집 플레이트의 샘플에 3차 증류수를 10 ㎕을 넣어 녹여낸 후, 건조된 말디 매트릭스 위에 2 ㎕ 점적하고, 말디 매트릭스를 다시 37℃에서 20분 동안 건조시킨 후, 말디-토프(MALDI-TOF) 매스 스펙트로메트리로 분석한다. 분석방법은 말디-토프매스 스펙트로메트리의 매뉴얼을 따른다.

말디-토프 매스 스텍트로메트리 그래프를 통해서 분자량을 확인하면 하기 표 3의 절편화된 DNA를 토대로 예측한 절편들의 분자량에 따라 8개 유전자 지역의 야생형 또는 변이형을 분석하는 것이 가능하다.

즉, G1613A에 대한 RFMP 분석 결과 분자량이 2867.8, 2785.8이 나왔다면 이는 1613 위치에 나타나는 것은 야생형인 G인 것을 알 수 있다.

유전자 위치	유전자형		유전자형 분석 결정 서열을 포함한 DNA 서열 (3'-5')		분자량
유전자 위치	유전자형		유전자형 분석 결정 서열을 포함한 DNA 서열 (3'-5')		up	down
G1613A	A		GCATGGAAA	GTGGTTTCC	2851.8	2800.8
G1613A	G		GCATGGAGA	GTGGTCTCC	2867.8	2785.8
C1653T	C		GTCTTACATAAG	TCCTCTTATGTA	3724.4	3666.4
C1653T	T		GTCTTATATAAG	TCCTCTTATATA	3739.4	3650.4
T1753V	T		AGGAGATTAG	TAACCTAATC	3196.0	3051.0
	A		AGGAGAATAG	TAACCTATTC	3205.0	3042.0
	C		AGGAGACTAG	TAACCTAGTC	3181.0	3067.0
	G		AGGAGAGTAG	TAACCTACTC	3221.0	3027.0
A1846B	A		TCATCTCATGT	ATGAACATGAG	3362.2	3469.2
	T		TCATCTCTTGT	ATGAACAAGAG	3353.2	3478.2
	G		TCATCTCGTGT	ATGAACACGAG	3378.2	3454.2
	C		TCATCTCCTGT	ATGAACAGGAG	3338.2	3494.2
A1762T G1764A	A	G	TAAAGGT	AAAAACCTTTAAC	2224.4	3990.6
	A	A	TAAAGAT	AAAAATCTTTAAC	2208.4	4005.6
	T	G	TAATGGT	AAAAACCATTAAC	2215.4	3999.6
	T	A	TAATGAT	AAAAATCATTAAC	2199.4	4014.6
G1896A G1899A	G	G	GGTGGCTTTGGGG	CCAAAGC	4157.6	2154.4
	G	A	GGTGGCTTTGGGA	CCAAAGC	4141.6	2154.4
	A	G	GGTGGCTTTAGGG	CTAAAGC	4141.6	2169.4
	A	A	GGTGGCTTTAGGA	CTAAAGC	4125.6	2169.4

표 3은 유전자형 분석 결정 서열을 포함한 DNA 절편서열과 분자량 표이다.

이렇게 분석된 염기서열을 사용하여 총 8개의 지역(G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A, G1899A)의 돌연변이 빈도를 각각 확인하였다. (표 4)

	변이 환자수		변이 비율
	약제감수성군	약제내성군	약제감수성군	약제내성군
G1613A	17	19	0.40	0.36
C1653T	19	15	0.45	0.28
T1753V	11	32	0.26	0.60
A1762T	38	47	0.90	0.89
G1764A	37	48	0.88	0.91
A1846B	14	4	0.33	0.08
G1896A	23	24	0.55	0.45
G1899A	8	5	0.19	0.09

표 4는 국내 만성 B형 간질환 환자의 돌연변이 빈도

실시예5 : 통계학적 분석

상기 실시예3, 4을 통해 정리된 후보 마커들의 변이형과 라미부딘 내성과의 연관성을 분석하기 위해 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis, SAS program 사용)을 통해 OR (Odds ratio)의 신뢰구간 (95%CI)과 P value를 기준으로 OR<0.5 또는 OR>2, p<0.05의 조건을 충족하는 라미부딘 내성 마커를 찾아, HBV X 및 precore 유전자 부위의 T1753V A1846B를 선정하였다. 분석 결과는 다음과 같다. (표 5)

	약제감수성군 변이 비율	약제내성군 변이 비율	OR (95%CI )	P value	Sensitivity (%)	Specificity (%)	PPV (%)	NPV (%)
G1613A	0.40	0.36	0.82(0.33-2.06)	0.68	35.8	59.5	52.8	42.4
C1653T	0.45	0.28	0.48(0.19-1.22)	0.13	28.3	54.8	44.1	37.7
T1753V	0.26	0.60	4.29(1.64-11.47)	0.001	60.4	73.8	74.4	59.6
A1762T	0.90	0.89	0.83(0.18-3.64)	1.00	88.7	9.5	55.3	40.0
G1764A	0.88	0.91	1.30(0.30-5.69)	0.75	90.6	11.9	56.5	50.0
A1846B	0.33	0.08	0.16(0.04-0.61)	0.003	7.5	66.7	22.2	36.4
G1896A	0.55	0.45	0.68(0.29-1.67)	0.41	45.3	45.2	51.1	39.6
G1899A	0.19	0.09	0.44(0.11-1.67)	0.23	9.4	81.0	38.5	41.5

표 5는 국내 만성 B형 간질환 환자의 라미부딘 내성 HBV 발현과 유전자 돌연변이와의 연관성에 관한 로지스틱 회귀 분석 표이다.

OR값은 변수에 따른 대조군 대비 실험군의 발생 위험을 나타는 것이고, p값은 유의수준을 나타내는 것이므로, 이를 통해 T1753V의 변이형일 경우, 그리고 A1846B의 야생형일 경우 라미부딘 내성 발생 위험도가 높아짐을 확인하여 HBV X 및 precore 유전자 부위의 T1753V와 A1846B를 라미부딘 내성 마커로 선정하였다.

이렇게 구한 T1753V와 A1846B 마커를 일배체형 (haplotype, HT)으로 구성하여 라미부딘 내성과의 연관성을 분석하기 위해 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis, SAS program 사용)을 통해 OR (Odds ratio)의 신뢰구간 (95%CI)과 P value를 기준으로 OR<0.5 또는 OR>2, p<0.05의 조건을 충족하는 일배체형 마커를 찾아, HT2, HT3를 선정하였다. 분석 결과는 다음과 같다 (표 6)

	1753	1846	약제감수성군 HT 비율	약제내성군 HT 비율	OR(95% CI )	P value	Sens. (%)	Spec. (%)	PPV (%)	NPV (%)
HT1	0	0	0.50	0.34	0.51(0.21-1.25)	0.15	34.0	50.0	43.9	39.7
HT2	0	1	0.24	0.06	0.19(0.04-0.82)	0.02	5.7	76.1	21.4	41.2
HT3	1	0	0.20	0.58	5.79(2.14-16.06)	0.00	58.5	80.4	77.5	62.7
HT4	1	1	0.07	0.02	0.28(0.01-3.15)	0.34	1.9	93.5	25.0	45.3

표 6은 국내 만성 B형 간질환 환자의 라미부딘 내성 HBV 발현과 유전자 돌연변이의 일배체형과의 연관성에 관한 로지스틱 회귀 분석 표이다.

그 결과 T1753V가 변이형을 가지고 A1846B가 야생형을 가지는 HT3의 경우 OR>2, p<0.05의 조건을 충족하여 라미부딘 내성 위험을 높이는 중요한 요인으로 판단된다. 또한 반대로 T1753V가 야생형을 가지고 A1846B가 변이형을 가지는 HT2는 OR<0.5, p<0.05의 조건을 충족하여 라미부딘 내성 위험을 줄이는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 상기 통계학적 분석을 통해 T1753V, A1846B, 그리고 이들의 조합인 일배체형 HT2, HT3을 최종적으로 라미부딘 내성 예측 마커로 선정하였으며, 이 T1753V의 변이형, A1846B 의 야생형, 그리고 이 두 가지가 합쳐진 HT3를 포함하는 HBV에 감염된 약제감수성군은 내성 위험군으로 정의한다. T1753V 지역과 A1846B는 각각 HBV X 유전자와 precore 유전자 상에 위치하며, 동시에 core promoter 지역이기도 하다. (nt 1742-1849) Core promoter는 HBeAg precursor를 coding하는 precore mRNA의 전사를 조절하는 지역으로, 이 부위에 변이가 발생하면 HBeAg의 생성에 영향을 준다. 따라서 T1753V 및 A1846B 변이는 HBeAg의 발현에 영향을 주는 방식을 통해 라미부딘 내성 발현에 영향을 주는 것이 아닌지 추측할 수 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> Genematrix Inc. <120> Composition for anticipating drug resistance against therapeutic agent of chronic Hepatitis B and method thereof <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3215 <212> DNA <213> Hepatitis B virus, complete genome <400> 1 ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60 tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120 aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180 aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240 acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300 tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360 tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420 atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480 acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540 aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600 tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660 tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720 tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780 gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840 aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900 ggtactttac cgcaggaaca tattgtacaa aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960 gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020 gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080 aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctaaac 1140 ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200 acgggttggg gcttggccat aggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260 ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320 cttatcggaa ccgacaactc agttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380 ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440 ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttgggcc tctaccgtcc ccttcttcat 1500 ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560 tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtagcatg gagaccaccg 1620 tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa 1680 tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac tgggaggagt 1740 tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800 gttcaccagc accatgcaac tttttcccct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860 tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920 agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980 tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040 ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100 tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160 ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat tagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220 ccttactttt ggaagagaaa ctgtccttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280 cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340 tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400 gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460 ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520 ctgattggaa aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580 gtcaacaata tgtgggccct ctgacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640 ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggacaaaggc attaaaccgt 2700 attatcctga atatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760 ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820 catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880 atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940 cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000 tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcatttggtc cagggttcac cccaccacac 3060 ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacact gccagcagca 3120 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180 ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> X protein [Hepatitis B virus] <400> 2 Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu 1 5 10 15 Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly 20 25 30 Pro Phe Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala Val Pro Ala Asp 35 40 45 His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Ser Met Glu 65 70 75 80 Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg 85 90 95 Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe 100 105 110 Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg 115 120 125 Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser 130 135 140 Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Pro Ser Ala 145 150 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacttcgctt cacctctgca c 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aggcgaggga gttcttcttc tagg 24 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcgcttcacc ggatgctgca cgtcgcatgg a 31 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agacttggtg ggatggcgtt cacggtggt 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccaccaagt ggatgttgcc caaggtctta 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 catcgctgag ggatggtcca agagtcctct tat 33 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gggagggatg agttggggga ggaga 25 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cctcctagta ggatgaaaaa tcattaacct a 31 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actttttcac ggatgtctgc ctaatcatct c 31 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcttgagga tgcagtagga catgaaca 28 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgggggagga gattggtagg ttaa 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 attctttata gggtcaatgt ggtag 25

Claims

HBV X/precore 유전자 지역의 돌연변이로서 1753번째 티민 염기가 아데닌, 시토신, 또는 구아닌 염기로 치환된 유전자 또는 1846번째 아데닌 염기가 시토신, 구아닌, 또는 티민 염기로 치환된 유전자 및 이들의 조합을 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서 상기 마커 조성물은 1753번째 티민 염기의 변이형 유전자, 또는 1846번째 아데닌 염기의 야생형 유전자인 경우에 피리미딘계 항바이러스 제제 내성으로 예측되는 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 HBV 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피리미딘계 항바이러스 제제는 라미부딘인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
HBV X 유전자에 의해 코딩 되는 X 단백질을 구성하는 127번째 아미노산이 아이소류신(I)에서 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T)으로 변형된 펩타이드를 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 HBV X 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 피리미딘계 항바이러스 제제는 라미부딘인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 바이오마커 조성물.
서열번호 9 내지 10의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 내지 12의 프라이머쌍 또는 이들의 조합인 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 프라이머 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 피리미딘계 항바이러스 제제는 라미부딘인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 프라이머 조성물.
(a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 프라이머를 사용하여 상기 DNA의 X/precore 유전자 지역의 T1753V, 및 A1846B 지역 중 어느 하나 이상의 돌연변이를 함께 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 DNA 서열을 분석하여 HBV DNA에서 변이지역 중 1753번째, 또는 1846번째 지역의 염기가 무엇인지 판별하는 단계를 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측 마커 검출 방법.
제 10항에 있어서, 상기 프라이머는 제8항의 프라이머 조성물인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측 마커 검출 방법.
제 8항의 프라이머 조성물을 유효성분으로 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 피리미딘계 항바이러스 제제는 라미부딘인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측용 키트.
(a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 프라이머를 사용하여 상기 DNA의 X/precore 유전자 지역의 T1753V, 및 A1846B 지역 중 어느 하나 이상의 돌연변이를 함께 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 DNA 서열을 분석하여 HBV DNA에서 변이지역 중 1753번째, 또는 1846번째 지역의 염기가 무엇인지 판별하여, 1753번째 티민 염기의 변이형 유전자, 또는 1846번째 아데닌 염기의 야생형 유전자인 경우에 피리미딘계 항바이러스 제제 내성으로 예측하는 단계를 포함하는 텔미부딘, 클레부딘 및 라미부딘으로 구성된 군으로부터 선택된 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측 방법.
제 14항에 있어서, 상기 프라이머는 제8항의 프라이머 조성물인 것을 특징으로 하는 피리미딘계 항바이러스 제제 내성 예측 방법.