CN114317832B

CN114317832B - 一种检测hbv核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法

Info

Publication number: CN114317832B
Application number: CN202210108861.6A
Authority: CN
Inventors: 莫佳妮; 颜学兵
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114317832A

Abstract

本发明提供了一种HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，该发明以乙型肝炎病毒基因型序列为基础，以2条特异性PCR引物扩增乙型肝炎病毒C区DNA，获得覆盖整个乙型肝炎病毒核心蛋白的序列。该方法包括提取HBV基因组DNA、PCR扩增、PCR产物混合纯化、上机测序及数据分析等步骤。本发明的方法能够观察核心蛋白是否存在核心蛋白变构调节剂相关耐药突变，实现了多位点，经济，快速的检测，更加贴合临床需求。本发明不仅降低了病人的经济负担，而且为临床诊疗提供了更为全面的参考信息。本发明对实现早期监测，并合理指导临床个体化用药有着重要的意义。

Description

一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法

技术领域

本发明涉及检测乙型肝炎病毒耐药的方法，特别涉及一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法。

背景技术

乙型肝炎(HBV)感染呈世界性流行，据WHO报道，全球约有2.57亿慢性HBV感染者，全球每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病，其中肝硬化占30％，原发性肝细胞癌(HCC)占45％。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV所致者分别为77％和84％。HBV感染及其相关肝脏疾病的治疗一直是热点研究领域，现有的抗HBV治疗药物主要有恩替卡韦和替诺福韦等核苷酸类似物(NAs)以HBV DNA聚合酶为靶点的药物及干扰素。这类药物能抑制病毒复制，但其不能减少共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成，而cccDNA正是病毒持久存在的原因。目前慢性乙型肝炎(CHB)功能性治愈的标准是：血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV DNA持续检测不到，乙型肝炎e抗原(HBeAg)转阴，伴或者不伴HBsAg血清学转换，肝脏炎症缓解和组织病理学改善。长期NAs治疗虽可以降低HBsAg水平，但HBsAg阴转率仅为0-3％，PEG-IFNα单药治疗的阴转率稍高，约为3-7％。因此，需要新的治疗方法来达到CHB的功能性治愈。

核衣壳组装调节剂是一类新型抗HBV药物，该类药物通过变构机制干扰核衣壳，使衣壳组装错误，产生异常、无功能的衣壳粒子，从而有效地降低病毒载量和病毒抗原。核衣壳是由HBV核心蛋白单体经折叠和稳定化后，形成具有四螺旋束的同型二聚体，最终组装而成。核心蛋白变构调节剂(CpAMs)作为新型的抗病毒药物，其抑制HBV作用显著、耐受性好、安全性高，在药物治疗期间未出现病毒学反弹，有望达到功能性治愈，为CHB的治疗提供了新的治疗方向，有望造福更多的CHB患者。

但现已有相关研究发现，HBV不同的核心突变体对CpAMs类药物存在原发耐药。至今为止国内外未见检测HBV对于核心蛋白变构调节剂耐药位点检测的相关文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，该方法可同时对核心蛋白变构调节剂多个耐药位点进行检测，对于将来核心蛋白变构调节剂在国内推广运用筛选合适病人、预测疗效及规避耐药奠定基础，也对优化我国慢性HBV感染患者个体化抗病毒治疗方案具有指导性意义。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，包括以下步骤：

(1)从乙型肝炎病毒阳性的血清中提取HBV DNA基因组；

(2)根据国内外文献报道的HBV核心蛋白变构调节剂代表性药物甲磺酸莫非赛定的耐药氨基酸替换及相应碱基突变，在HBV C区设计引物是：

HBV F1 5’-ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’SEQ NO 1

HBV R1 5’-CTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAG-3’SEQ NO 2

(3)使用引物进行PCR反应扩增靶DNA片段；

(4)1.5％TBE琼脂糖凝胶电泳；

(5)测序及序列分析。

甲磺酸莫非赛定的化学名称为(R，S)-4-(2-溴-4-氟苯基)-6-(甲基吗啉)-2-(2-噻唑基)-1，4-二氢-嘧啶-5-羧酸乙酯。分子式为C₂₁H₂₂BrFN₄O₃S，其化学结构式如下式1：

优选的，步骤(2)关于与核心蛋白变构调节剂相关耐药性突变点分别是：F23Y、F24Y/L、P25G/A/S/V/F/W、D29G/H、L30F、T33S/N/P/Q、L37Q、Y38H/F/C、I105T/V/L/F/W/Y、s106T/N/F/A/G、T109S/A/C/M/N/I/X、F110I、Y118F、v124A/M/I/F/G、w125F、I126A、R127H、T128I、Y132F、R133K、P134T、L140I、S141P。

进一步的，步骤(3)PCR反应的具体步骤为：

A.在PCR管中依次加入下列物质：ddH₂O 9.5Ul、DNA模板2uL、浓度为10umol/L的PCR引物F1 0.5uL、浓度为10umol/L的引物R1 0.5uL、高保真DNA聚合酶Mix 12.5uL；

B.将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的目标基因片段，其序列如序列表SEQ IQ No.3所示。

进一步的，步骤(4)凝胶电泳反应：对步骤(3)中获得的PCR产物进行1.5％TBE琼脂糖凝胶电泳，125V，35min，上样10ul，marker 5ul，所获取的片段大小为639bp。

优选的，进行PCR反应扩增的条件是：a预变性：98℃45s；b变性：98℃10s；c退火：60.3℃30s；d延伸：72℃20s；e.重复35次步骤b—d；f终延伸：72℃5min；g降温至4℃。

进一步的，步骤(5)中的PCR产物上机测序通过一代测序平台进行；数据分析通过对所得测序数据与乙型肝炎病毒的参考序列进行对比，最终确认所测片段中核心蛋白变构调节剂相关的耐药突变位点。

与现有技术相比，本发明提供了一种简便、快捷、灵敏、特异、经济实用型检测技术，实现了同时对核心蛋白变构调节剂多个耐药位点进行检测，对于将来核心蛋白变构调节剂在国内推广运用筛选合适病人、预测疗效及规避耐药奠定基础，也对优化我国慢性HBV感染患者个体化抗病毒治疗方案具有指导性意义。

附图说明

图1是根据本发明方法的流程示意图：

图2是本发明HBV核酸样品及PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细介绍，但不限于此，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由权利要求及其等同物限制。

如图1所示，本实施例具体过程如下：

1.样本来源

慢性乙肝患者血液样本。

2.主要试剂

提取试剂：TIANamp Virus DNA/RNA Kit(TIANGEN)；

PCR试剂：Gloria Nova HS 2X HF Master Mix(ABclonal)；

3.检测流程

将患者血液3000r，10min离心得到血清，从血清中提取HBV DNA模板，PCR扩增HBVC区片段，1.5％TBE琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性，满足测序要求时利用ABI3730xl测序仪进行测序。测序完成后，使用序列分析软件BIOXM将测序序列与HBV参考株序列进行比对，进而确定待分析位点的氨基酸变异情况，确定HBV核心蛋白变构调节剂耐药突变位点。

其中HBV DNA提取以及PCR扩增程序具体如下：

3.1 HBV DNA提取

提取试剂为TIANamp Virus DNA/RNA Kit(TIANGEN)其包括缓冲液体Buffer GB、Buffer GD、Buffer PW、RNase-Free ddH2O、Proteinase K、Carrier RNA以及无水乙醇。

3.1.1试剂准备

所有离心步骤在室温下进行(15-25℃)，平衡样本温度到室温(15-25℃)。

使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入无水乙醇17ml、60ml。

Carrier RNA溶液的配制如下：向装有310μg Carrier RNA冻干粉的管子中加入310μl RNase-Free ddH2O，将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μl的溶液，置于-20℃储存。

Carrier RNA工作液：根据样品的数量计算所需缓冲液GB和Carrier RNA溶液的体积，将缓冲液GB与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡。计算公式如下：

n×0.22ml＝y ml；

y ml×28μl/ml＝zμl

n＝同时提取的样品个数，y＝需要加入缓冲液GB的体积，z＝需要加入CarrierRNA溶液的体积

3.1.2核酸提取步骤：

3.1.2.1用移液器将20μl Proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管中。

3.1.2.2向离心管中加入200μl血浆/血清/淋巴液(样品需平衡至室温)。

注意：如果样本体积小于200μl，可加入0.9％NaCl溶液补充。

3.1.2.3加入200μl Carrier RNA工作液。盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。

注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀。

3.1.2.4在56℃孵育15min。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

3.1.2.5加入250μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温(15-25℃)放置5min。

注意：如果周围环境高于25℃,乙醇需要再在冰上预冷后再加入。

3.1.2.6简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

3.1.2.7仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中。

3.1.2.8小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

3.1.2.9小心打开吸附柱盖子，加入600μl溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

3.1.2.10重复步骤3.1.2.9。

3.1.2.11小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液。

注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。

3.1.2.12将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。

3.1.2.13将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加60μl RNase-FreeddH₂O，盖上盖子，室温放置5min。12,000rpm(～13,400×g)离心1min，即得到HBV DNA样本。

注意：确保洗脱液(RNase-Free ddH₂O)在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小(小于50μl)，为了将膜上的DNA/RNA充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位置。

3.2 PCR扩增

3.2.1引物序列。

HBV F1 5’-ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’SEQ NO 1

HBV R1 5’-CTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAG-3’SEQ NO 2

3.2.2反应体系

25uL体系：ddH2O 9.5uL，DNA模板2uL，PCR引物F1 0.5uL，引物R1 0.5uL,浓度为10umol/L，高保真DNA聚合酶Mix 12.5uL。

扩增条件见下表1：

表1扩增条件

3.3电泳检测分析标准

电泳检测结果标准为：在750bp/500bp处有清晰单一条带；测序后的序列峰图质量满足生物信息分析要求，结果如图2所示，从图2中可以看出，电泳结果750bp/500bp处有清晰明亮的单一条带，可以进行下一步测序工作。部分血清样本耐药突变位点检测结果如下表2所示：

表2部分血清样本耐药突变位点检测结果

从上表2中可看出，本发明检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法是有效的，也从临床角度证明慢性乙型肝炎病毒患者确实存在者预存耐药情况，这对核心蛋白变构调节剂将来在国内推广运用筛选合适病人是有益的。

4实验结果

乙型肝炎病毒耐药突变的产生是核苷酸类似物药物治疗乙型肝炎治疗过程中的一个主要障碍。在患者血清中检测出核心蛋白变构调节剂预存耐药突变位点的出现，对于将来核心蛋白变构调节剂在国内推广运用筛选合适病人、预测疗效及规避耐药奠定基础，也对优化我国慢性HBV感染患者个体化抗病毒治疗方案具有指导性意义。在本发明方法中，设计针对HBV C区基因的PCR引物，通过PCR获得整个C区的DNA文库，通过生物信息学分析检测乙型肝炎病毒患者体内HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药突变位点是一个创新的做法。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaacttt ttcacctctg cctaatc 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaacattga gattcccgag attgag 26

Claims

1.一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从乙型肝炎病毒阳性的血清中提取HBV DNA基因组；

（2）根据国内外文献报道的HBV核心蛋白变构调节剂代表性药物甲磺酸莫非赛定的耐药氨基酸替换及相应碱基突变，在HBV C区设计引物是：

HBV F1 5’-ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’ SEQ NO 1

HBV R1 5’-CTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAG-3’ SEQ NO 2

（3）使用引物进行PCR反应扩增靶DNA片段；

（4）1.5%TBE琼脂糖凝胶电泳；

（5）测序及序列分析；

步骤（2）关于与核心蛋白变构调节剂相关耐药性突变点分别是：F23Y、F24Y/L、P25G/A/S/V/F/W、D29G/H、L30F、T33S/N/P/Q、L37Q、Y38H/F/C、I105T/V/L/F/W/Y、s106T/N/F/A/G、T109S/A/C/M/N/I/X、F110I、Y118F、v124A/M/I/F/G、w125F、I126A、R127H、T128I、Y132F、R133K、P134T、L140I、S141P。

2.根据权利要求1所述的一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，其特征在于，步骤（3）PCR反应的具体步骤为：

A.在PCR管中依次加入下列物质：ddH₂O 9.5Ul、DNA模板2uL、浓度为10umol/L 的PCR引物F1 0.5uL、浓度为10umol/L 的引物R1 0.5uL、高保真DNA聚合酶Mix 12.5uL；

B.将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的目标基因片段。

3.根据权利要求1所述的一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，其特征在于，步骤（4）凝胶电泳反应：对步骤（3）中获得的PCR产物进行1.5%TBE琼脂糖凝胶电泳，125 V，35 min，上样10ul，marker 5ul，所获取的片段大小为639bp。

4.根据权利要求1所述的一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，其特征在于，进行PCR反应扩增的条件是：a预变性：98℃ 45s；b变性：98℃ 10 s；c退火：60.3℃30 s；d延伸：72℃ 20 s； e.重复35次步骤b—d；f终延伸：72℃ 5min；g降温至4℃。

5.根据权利要求1所述的一种检测HBV核心蛋白变构调节剂相关耐药位点的方法，其特征在于，步骤（5）中的PCR产物上机测序通过一代测序平台进行；数据分析通过对所得测序数据与乙型肝炎病毒的参考序列进行对比，最终确认所测片段中核心蛋白变构调节剂相关的耐药突变位点。