JP5845489B2 - Ｂ型肝炎ウイルス群を検出し、遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセット、並びにそれを用いた方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス群を検出し、遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセット、およびそれを用いたＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するための方法に関する。

現在、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界でおよそ３億人が感染しているとの報告がある。Ｂ型肝炎ウイルスの感染は急性および慢性の肝炎（Ｂ型肝炎）を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌を引き起こすことが知られている。また、毎年３０万人がＢ型肝炎関連疾患で死亡していると報告されている。

このＢ型肝炎ウイルスには多様な遺伝子型（ジェノタイプ）が存在する。提唱されている基準では、ウイルスゲノム全体（約３２００塩基長）の８％（約２５０塩基）以上の塩基に相違が認められる場合、これを別の遺伝子型としており、現在までに、主にＡ〜Ｈまでの８種類の遺伝子型が定義されている。個々のＢ型肝炎ウイルスのゲノム配列と、これら異なる遺伝子型間の近縁関係は、ウイルスゲノムもしくはゲノム上の同一領域の塩基配列間の進化距離を計算することにより定量的に、あるいは、遺伝子系統樹を作成することにより視覚的に確認することが可能である。

一方、このようなＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型や、遺伝子の多様性に関連して、以下のような調査や、医療への応用が行われている。まず、世界中の国々において各地域の人々に感染しているＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型とその分布を調べることによって、人々の過去の移動や共通の祖先を推定することがなされている。また、ヒトからヒトへのＢ型肝炎ウイルス感染が疑われた場合に、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性に基づいた感染経路の推定が行われている。具体的には、親子関係にある２名の被験者間において、各被験者が有するＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性が異なる場合には第三者からの感染（水平感染）を推定、遺伝子多様性が同じ若しくは近縁種であれば当該２名間での感染（垂直感染、家族内感染）を推定することができる。水平感染の場合、各被験者の有するＢ型感染ウイルス間の進化距離を計算することにより、共通する感染源からの感染後の経過時間を推定することも行われている。さらに、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の相違によって、感染患者における肝疾患の進行速度が異なることが知られており、感染したＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型や感染後の変異に基づいて予測される病理経過を治療方針情報とすることができる。また、感染したＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型に応じた、Ｂ型肝炎ウイルス関連疾患を対象とした薬剤の効果が調査されており、投薬方針情報とすることができる。

以上のように、被験者におけるＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を簡易的且つ迅速に評価することができれば、Ｂ型肝炎ウイルス感染経路の推定、関連疾患の診断、治療方針の検討の上で極めて有益となり、その社会的、医学的意義は極めて大きい。

このようなＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型を塩基配列に基づき評価する方法としては、例えば、特許文献１〜５における方法として、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を特徴付ける核酸領域を含む広範な領域を対象として遺伝子を増幅し、遺伝子型に影響されずに、Ｂ型肝炎ウイルスの感染を確実に探知することを目的とし、さらに必要な場合は、増幅した塩基配列を調査することにより、遺伝子型を評価可能とする方法が発明されている。また、特許文献６における方法として、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を判別可能な各遺伝子型に特異的な核酸プローブを整備し、プローブのターゲット領域を全て含む広範な領域を増幅して、プローブとのハイブリにより遺伝子型を判定する方法が発明されている。さらに、特許文献７における方法として、Ｂ型肝炎ウイルスの其々の遺伝子型と特異的に増幅可能なプライマーのセットにより遺伝子型を判定する方法が発明されている。

国際公開公報第ＷＯ／１９９４／００８０３２号（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９３／００９２３３号） 特許第２８１１３２１号 特許第４５７１８５７号 特許第４４６３８２６号 特許第２８１１３２１号 特開第２０１１−１２０５５６号 特許第４６３３５２３号

上述した特許文献１〜７のように、現在までにＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型を評価可能な方法、および、決定するための手法が発明され報告されている。しかしながら、特許文献１〜５においては、未知の遺伝子型を含めた遺伝子型の評価が可能であり、Ｂ型肝炎ウイルスに関する新しい知見やウイルスの進化に対応して、将来にわたり応用可能な手法であるが、遺伝子型の評価に利用する塩基配列の領域及び特定手段が明確に定義されていないため、得られた遺伝子型の情報を異なる作業者の間で相互利用することができない、という問題がある。

これらの方法においては、増幅する塩基配列の全長を遺伝子型判定領域であると定義することも可能であるが、プライマーの設計において増幅領域の全塩基配列を決定することを前提とした設計が行われていないため、増幅領域全般にわたり、安定した塩基配列の解読が可能かどうかの検証がされておらず、また、増幅領域の塩基配列が長いため配列決定にコストがかかり現実的でない。また、特許文献６、７の方法では、遺伝子型の特定方法および得られる情報が明確であり、情報を異なる作業者の間で容易に相互利用することは可能であるが、既知の少数の遺伝子型にしか対応していない、という問題がある。

こうした問題は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスに関連した疾患の様態や薬剤の効果の研究において、現在の遺伝子型の定義よりもより詳細な遺伝子情報、すなわち遺伝子の多様性との関連を研究する上で大きな障害となる。

本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、簡便かつ迅速に、かつ、明確に、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を特定することを可能にするオリゴヌクレオチドのセットを提供することを目的とする。また本発明は、このオリゴヌクレオチドのセットを用いることにより、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するための方法を提供することを目的とする。

本発明の第一の主要な観点によれば、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、当該オリゴヌクレオチドのセットは、以下の組み合わせ：（ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、（ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、から選択されるものであり、前記配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドの上流配列であり、前記配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドの下流配列である、オリゴヌクレオチドのセット、が提供される。

このような構成によれば、配列番号２〜５の各塩基配列に対応するＢ型肝炎ウイルスゲノムの各塩基配列領域が、遺伝子型の違いに関わらず、比較的変異の少ない塩基配列領域であることが確認済みであることから、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型によらず、感染したＢ型肝炎ウイルスを検出する方法を提供することができる。

さらにこのような構成によれば、前記オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１であらわされるＢ型肝炎ウイルスゲノム配列において、（ａ）２５４塩基長、（ｂ）２５７塩基長というサイズの領域（目的領域）を増幅するように設計したものであり、すなわち、目的領域の塩基配列長が、ＤＮＡ濃度などのサンプル条件にばらつきがあっても同じプロトコルで目的通り増幅が可能でありかつワンパスでほぼ１００％の精度で配列決定できるなど、塩基配列決定に用いられる様々な装置・手法において容易に全長を解読することが可能な短いサイズの塩基配列でありかつ当該全長塩基配列が安定して決定可能であることを確認済みであることから、より長いサイズの塩基配列の決定において必要となる逆鎖の配列決定による精度向上を必要とせず、目的領域の全塩基配列により遺伝子多様性を評価する方法を提供することができる。

さらにこのような構成によれば、前記目的領域は、多様な遺伝子型における塩基配列の多様性を十分に包含していることを確認済みであり、未知のものも含めて、遺伝子多様性を評価可能な方法を提供することができる。

さらにこのような構成によれば、前記目的領域は、被験者の違い、検出・解読作業者の違い、作業日時の違いに関わらず、Ｂ型肝炎ウイルスゲノム上のほぼ同一領域となり、相互に比較可能となる。例えば、遺伝子多様性を評価する方法の応用により、Ｂ型肝炎ウイルス感染者間における保有ウイルスの進化距離の計算を行う方法や、１感染者におけるウイルス進化の度合いやその経時変化の観測を行う方法を提供することができる。

さらにこのような構成によれば、解読した前記目的領域の塩基配列をコンピュータに蓄積してデータベース化し、遺伝子多様性比較のための情報源とすることが可能である。例えば、遺伝子多様性を評価する方法の応用により、データベース化された塩基配列と被験者より得たＢ型肝炎ウイルスの当該目的領域の塩基配列から遺伝子系統樹を作成し、遺伝子系統樹上における位置関係を評価することにより、当該被験者における保有ウイルスの遺伝子多様性の詳細、感染時期、感染経路などを推定する方法を提供することができる。

本発明の第二の主要な観点によれば、被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するための方法であって、前記被験者由来の生物学的試料又は生物学的試料から得られた核酸調製物を鋳型として、前記オリゴヌクレオチドのセットの組み合わせ：（ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、（ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、から選択されるオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により当該生物学的試料又は核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルス核酸の目的領域を増幅させる工程と、前記増幅させた産物を検出する工程と、前記検出した増幅産物の塩基配列を決定する工程と、前記決定した塩基配列を、予め用意された前記目的領域の塩基配列もしくは塩基配列群と共に系統解析することにより、前記１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価する工程とを有し、前記決定する工程は前記オリゴヌクレオチドのセットを用いるものである、ことを特徴とする、方法、が提供される。

本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記評価する工程は、前記予め用意された前記目的領域の塩基配列群と、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの目的領域の塩基配列とで進化距離を算出し、与えられた閾値に基づいて、近縁関係にある塩基配列の有無および近縁関係にある塩基配列の由来を特定し、これにより、前記被験者のＢ型肝炎ウイルス感染経路を推定するものである。

また、本発明の他の実施形態によれば、このような方法において、前記評価する工程は、前記予め用意された前記目的領域の塩基配列群と、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの目的領域の塩基配列とによって遺伝子系統樹を作成し、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの塩基配列の当該遺伝子系統樹における相対的位置により、前記被験者の１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルス感染経路を表現するものである。

本発明の第三の主要な観点によれば、生物学的試料又は生物学的試料から得られた核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルス核酸の目的領域を増幅させ、塩基配列を決定するためのキットであって、以下の組み合わせ：（ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、（ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、から選択される１若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドのセットを有するものであることを特徴とする、キット、が提供される。

なお、上述した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

図１は、本発明の一実施形態に係る、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した患者およびその家族構成を示す模式図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る、Ｂ型肝炎ウイルスの感染経路を推定するための解析結果を示す図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る、Ｂ型肝炎ウイルスの感染経路を推定するための遺伝子系統樹である。 図４は、本発明の一実施形態に係る、Ｂ型肝炎ウイルスの感染経路を推定するための遺伝子系統樹で、家族内感染を示唆する結果を得た例である。

上述したように、本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスを検出し、遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、当該オリゴヌクレオチドのセットは、以下の組み合わせ：（ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、（ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、から選択されるものであり、前記配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドの上流配列であり、前記配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドの下流配列である、オリゴヌクレオチドのセット、が提供される。

また、このオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして利用することで、Ｂ型肝炎ウイルスの感染を検出し、遺伝子多様性を簡便且つ迅速に評価することができる。

本発明において、「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）」とは、ヘパドナウイルス科、オルトヘパドナウイルス属に属するＤＮＡウイルスであり、細胞外においては直径４２ｎｍの球状粒子で、その構造は内部にＨＢｃ抗原と部分的に一本鎖である二本鎖環状ＤＮＡが存在し、それを包むＨＢｓ抗原（Ｓ抗原）を有する外被により構成される。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの全長は長鎖においては約３０２０〜３３２０塩基長、短鎖においては１７００〜２８００塩基長である。また、殆どのＢ型肝炎ウイルスは、感染後増殖が盛んな時期に可溶性蛋白質であるＨＢｅ抗原を分泌する。

本明細書において使用するＢ型肝炎ウイルスは、任意の遺伝子型、遺伝子亜型、いずれかのサブタイプ、株、またはバリアントであっても良い（例えば、遺伝子型Ａ−Ｈ、遺伝子亜型Ａａ、Ａｅ、Ｂａ、Ｂｊ、Ｓ抗原によるサブタイプａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗなど）。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの例としては、配列ＩＤ番号１で示す配列を有するものがある。

本明細書において、「Ｂ型肝炎ウイルス感染」とは、前記Ｂ型肝炎ウイルスの生体への感染の事実、感染の様態、および、感染によって引き起こされる症状の全てを指すものである。 なお、本明細書において単に「被験者」と表現した場合は、前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染が可能である、ヒトおよびチンパンジーなどのサルを含む全ての生体を指すものである。感染の様態としては、不顕性感染、一過性感染、キャリア、無症候キャリア（ウイルスの立場からはセロコンバージョン）などが挙げられる。感染によって引き起こされる症状の具体例としては、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。Ｂ型肝炎は、慢性肝炎、急性肝炎、劇症肝炎等に分類することができ、また、これらの各々の肝炎におけるウイルス血症もＢ型肝炎ウイルス感染症に含まれる。生体がＢ型肝炎ウイルス感染症であるか否かは、例えば、血清中のＢ型肝炎ウイルス抗体量の測定、血清中のＢ型肝炎ウイルスのコア抗原の検出および血清中のＢ型肝炎ウイルスのＲＮＡの検出、ならびにこれらの組み合わせにより判断することができる。

また、本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、特定の配列を増幅するためのプライマーや、特定の配列を検出するためのプローブとして使用することのできる塩基配列をいう。本願発明において、オリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドのものであり、また好ましくは１００ヌクレオチド以下、より好ましくは４０ヌクレオチド以下のものである。

本明細書において、「プライマー」とは、任意の標的配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドであって、標的配列にハイブリダイズした後に、オリゴヌクレオチドの伸長が行われるものである。なお、オリゴヌクレオチドがプローブとして機能する場合には、そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列を検出するために使用される。本願明細書においては、本願明細書において開示されるすべてのオリゴヌクレオチドが、Ｂ型肝炎ウイルスの増幅、検出または定量のために使用可能である。

本願発明において、上述した配列ＩＤ番号２〜５のオリゴヌクレオチドは、（ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、（ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、のいずれかのセットでプライマーとして使用されることが好ましい。また、本願発明においては、これらのオリゴヌクレオチドのセットを組み合わせたキットを提供することも可能である。

また、本願発明において、配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１で表されるＢ型肝炎ウイルスゲノム配列上において、配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドの重複領域を含む上流配列となるものである。また、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１で表されるＢ型肝炎ウイルスゲノム配列上において、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドの重複領域を含む下流配列となるものである。

本願発明において、上述したオリゴヌクレオチドのセットを用いることにより、被験者由来の生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルスの有無を検出し、遺伝子多様性を評価、特定、及び／若しくは判定することができる。また、同一の被験者が異なる遺伝子多様性の複数のＢ型肝炎に感染する場合や、Ｂ型肝炎ウイルスが被験者体内において進化的に多様化して複数の遺伝子多様性のＢ型肝炎ウイルスが同時に存在する場合など、があるため、本明細書において単に「Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を特定」、「Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価」等と表現した場合には、１若しくはそれ以上の種類のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価等することを指す。なお、本明細書において単に「Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性」等と表現した場合は、Ｂ型肝炎ウイルスにおいて提唱されている遺伝子型分類の基準（ウイルスゲノムの全塩基配列の８％以上の塩基に相違があるものをＡ−Ｈに分類）に加え、限定されたゲノム領域における塩基配列の相違や、より小さな割合の相違に基づく遺伝子の多様性が定義される可能性を含むものである。

また、本明細書において、「生物学的試料」または「生物学的試料から得られた核酸調製物」とは、被験者から得られる試料であって、本願発明に係るオリゴヌクレオチドのセットを用いてＢ型肝炎ウイルス核酸の所定の領域を増幅させることができるものであれば良い。例えば、これらに限られるものではないが、尿、血液（全血、末梢血を含む）、血清、血漿を含む体液、ＬＣＲまたは肝臓バイオプシーのような組織が含まれる。

また、本明細書において、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の所定の領域を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が用いられる。ＰＣＲとしては、分子生物学又は医学分野において通常用いられるものであって、Ｂ型肝炎ウイルスを迅速にかつ正確に検出できるものであれば特に制限されることなく、公知の方法、種類や条件を同様に使用できる。また、ＰＣＲは、変性段階ならびにアニーリング及び伸張段階よりなる２段階ＰＣＲであることが好ましい。例えば、本願発明においては、通常のＰＣＲに加えて、リアルタイムＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲ、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）−ＰＣＲ等を使用しても良い。また、本願発明に係る方法を実施するためには、好ましくはＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲが用いられる。また、ＰＣＲの条件としては、目的領域を適切に増幅させるために当業者が適宜設定可能である。

本明細書において、「目的領域」とは、本願発明に係るオリゴヌクレオチドのセットを用いることによって増幅することのできる、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するために適切なＢ型肝炎ウイルスゲノムにおける塩基配列領域である。本願発明においては、目的領域の塩基配列の相違に基づいてＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を決定する。また、本願明細書において、「目的領域」と表現した場合には、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムにおける特定の領域を示すものであるが、異なるプライマーセットを用いることによりその領域と配列長は若干異なるものとなる。

本明細書において、増幅産物の検出は、これに限定されるものではないが、例えば核酸プローブを用いて検出することができる。核酸プローブは、本願発明に係るオリゴヌクレオチドのセットにより増幅される領域を特異的に検出するプローブであればよい。核酸プローブは、上記目的領域の増幅産物に相補的であり、且つ相互の交差反応性がより低い核酸プローブを用い、増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせ、それぞれの核酸プローブに結合した増幅産物を検出する。好ましくは、本願発明に係る一実施形態において、増幅産物の検出は、目的領域を増幅させるために用いたオリゴヌクレオチドのセットが用いられる。また、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行うことができる。適切な条件は、特に制限されるものではなく、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なり、当業者が適宜設定可能である。

また、検出には、任意の基体に固定化したプローブと増幅産物とがハイブリダイズした２本鎖核酸を用いることができる。この２本鎖核酸は、例えば、これらに限定されるものではないが、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アクリジウムエステル、ビオチン及びナタ豆ウレアーゼ（ｊａｃｋ ｂｅａｎ ｕｒｅａｓｅ）等によって標識されたプローブを用いて検出することもできる。また、増幅産物を、電気泳動後に染料により視覚化することによって検出してもよい。

また、本願発明に係る一実施形態において、本願発明に係るオリゴヌクレオチドのセットを用いて上記目的領域を増幅させた後、当該領域に係る核酸の塩基配列の決定は、分子生物学や医学の分野において周知の任意の手段を用いることができる。

本願発明に係る一実施形態において、被験者より得た生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物より増幅させた目的領域の塩基配列を、予め用意した目的領域の塩基配列群と共に系統解析することにより、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価することができる。この場合、予め用意した目的領域の塩基配列群と、被験者より得た生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物由来の目的領域の塩基配列とで、相互の目的領域間の塩基配列の差異に基づき、進化距離を計算することによって、遺伝子多様性の評価を行うが、この進化距離の計算は種々の方法によって行われる。例えば、本願発明における一実施形態において、系統解析を行う際のデータ解析手法としてはクラスタ解析や各種解析ソフトウェアや解析アルゴリズム等の分子遺伝学、分子生物学又は生命情報科学等の分野で用いられる任意の解析手段を用いることができる。より具体的には、例えば、予め用意した目的領域の塩基配列群と、被験者における目的領域の塩基配列とを対象に、解析ソフトウェア「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」を用いてマルチプルアライメントを実施した後、解析アルゴリズム「Ｇｏｊｏｂｏｒｉ’ｓ ６ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ法」により塩基配列間の進化距離の推定を行うことができる。

また、本願発明に係る一実施形態において、被験者より得た生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物より増幅させた目的領域の塩基配列と、予め用意した目的領域の塩基配列群とによって遺伝子系統樹を作成することもできる。本願発明においては、遺伝子系統樹は、近隣接合法（ＮＪ法）やＵＰＧＭＡ法等の任意の手法によって作成可能である。

また、本願発明においては、予め用意された目的領域の塩基配列群や当該配列群に関連する各種データを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び各種解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、被験者より得た生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物より増幅させた目的領域の塩基配列データと比較するだけで、被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性をいつでも簡便に評価することができる。

また、本願発明においては、上述のようにして求めた進化距離や、遺伝子系統樹上における相対的な位置により、親子関係にある２名の被験者が感染したＢ型感染ウイルスが、水平感染によるものか、或いは垂直感染によるものなのかを推定することができる。例えば、式１によって求められるＰの値によって、垂直感染、すなわち家族内感染を推定できる。より具体的には、式１によって求められるＰの値が１０ｅ（−１５）以上である場合、家族内感染を推定できる。

次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によって容易になされることが理解されるであろう。

以下に、本実施形態による実施例を、図面を参照して詳細に説明する。

後述する実施例は、以下に記載する実験方法および実験材料を用いて実験を行った。なお、ここで説明する実験方法および実験材料は例示的なものであり、当業者であれば、本願発明を実施するため、ここで説明する実験方法および実験材料と同等のその他の実験方法および実験材料を採用することができる。

実験概要および結果
以下の実施例においては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した１０家族の合計２３人の被験者を対象としている。各家族における家族構成と被験者の関係を図１に示す。図中の各ダイアグラムのタイトル（ＦＭ１〜ＦＭ１０）が家族ＩＤ、各ダイアグラム中の数字（１〜２３）が被験者ＩＤである。各ダイアグラムのノードである丸および四角は女性および男性を表し、ノードとエッジの組み合わせで家族の関係を表している。すなわち、各ダイアグラムにおいて上段下段で親子を表し、１本の直線であるエッジで繋がれた２つのノードが両親であることを表している。

各被験者の血清より抽出したＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルスの目的領域を、配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および、配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドとのセットを用いて、ネステッドＰＣＲ法により増幅し、配列決定を行った。

また、本実施例においては、前記予め用意されたＢ型肝炎ウイルスの目的領域の塩基配列群として、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＶＤＢ、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｓ２ａｓ０２．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）より情報を収集した。収集した塩基配列群はＡ〜Ｈの遺伝子型に属す９７の塩基配列である（表２）。予め用意した目的領域の塩基配列群と、前記被験者より取得したＢ型肝炎ウイルスの目的領域の塩基配列とを対象に、解析ソフトウェア「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」を用いてマルチプルアライメントを実施した後、解析アルゴリズム「Ｇｏｊｏｂｏｒｉ’ｓ ６ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ法」により進化距離を算出し、また、ＮＪ法により遺伝子系統樹を作成した。

評価の結果、９つの家族に属する全被験者由来の塩基配列は遺伝子型Ｃであり、各家族に属する被験者由来の塩基配列は、それぞれ遺伝子系統樹において１つのクラスタに位置した。しかしながら、４名の被験者からなる残り１家族（図１における家族ＦＭ２）については、３名（被験者ＩＤ３、４、５）由来の塩基配列は、同じクラスタの極近傍に集中しているのに対して、残り１名（被験者ＩＤ６）由来の塩基配列は他の被験者由来の塩基配列と異なるクラスタに位置しており、この被験者のみ、感染経路が異なっていることが示唆された（図３）。

実験方法及び実験材料
（患者）
表１に、本実施例において用いた１０家族の合計２３人の被験者に関する情報を示す。

すべての被験者のＢ型肝炎ウイルスへの感染がＨＢｓ抗原ポジティブとして確認されており、また、Ｂ型肝炎ウイルスの家族内感染およびＢ型肝炎ワクチンの接種履歴が記録されている。すべての被験者から血清サンプルを得て、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）、Ｂ型肝炎表面抗体（抗ＨＢｓ）、およびＢ型肝炎コア抗体（抗ＨＢｃ）の確認試験を行なった。確認試験までの間、血清サンプルはアリコートに分け−８０℃で保存した。

（血清学的テスト）
血清は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、及びＨＢｅＡｇに対する抗体（ＨＢｅ抗体）（日本、東京、Ｄｉｎａｂｏｔ）について検査を行なった。ＨＢｃＡｇに対する抗体（抗ＨＢｃ）の診断は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（日本、東京、アボットジャパン）によって検証した。

無症候キャリアの定義は、被験者にＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗体）が存在するにも関わらず、１年間（３ヵ月の間隔で少なくとも４回調査）にわたってＡＬＴレベルが正常であり、且つ、門脈高血圧症の兆候が無い場合とした。

慢性肝炎の定義は、６ヵ月間（隔月で少なくとも３回の調査）にわたって、持続して高いＡＬＴレベル（正常［３５ＩＵ／リットル］の上限の１．５倍以上）である場合とした。

血清中のＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡ濃度は、市販キット（スイス、バーゼル、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｑｍａｎ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ；Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＢＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ）で、２．６〜７．６ ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの検出範囲で数量化した。

（Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出）
血清からのＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出は、２００ｍｌの血清から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カリフォルニア州バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡは、後述するようにＢ型肝炎ウイルスの目的領域の増幅およびダイレクトシークエンシングによる目的領域の塩基配列の取得のために用いた。

（Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ塩基配列の決定）
Ｂ型肝炎ウイルスの目的領域は、配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および、配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドとのセットを用いて、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定した。すなわち、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用の外側セット用のフォワードプライマーが、５’−ＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣ−３’（ＨＢＳ／Ｆ２）（配列ＩＤ番号４）であり、内側セット用のフォワードプライマーが５’−ＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴ−３’（ＨＢＳ／Ｆ１）（配列ＩＤ番号２）である。またＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用の外側セット用のリバースプライマーが５’−ＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡ−３’（ＨＢＳ／Ｒ２）（配列ＩＤ番号５）、及び内側セットのリバースプライマーが用の５’−ＡＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡ−３’（ＨＢＳ／Ｒ１）（配列ＩＤ番号３）である。Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、Ｖｅｒｉｔｉ（カリフォルニア州フォスターシティー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、第１および第２のＰＣＲにおいて上記プライマーによって３５サイクル（９５℃、１５秒；５８℃、３０秒；７２℃、３０秒）で実行した。ＰＣＲ産物は、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲの第２のＰＣＲで使用したプライマーのセットと同じもの（配列ＩＤ番号２及び配列ＩＤ番号３）を用いて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１サイクル・シークエンシング・キット（カリフォルニア州フォスターシティー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、両側でシーケンシング反応を行った。シーケンシング反応産物は、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、塩基配列を得た。得られた配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの各遺伝子型に対応するＧｅｎＢａｎｋの塩基配列と比較した。

（予め用意された目的領域の塩基配列群の整備）
前記予め用意された目的領域の塩基配列群として、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＶＤＢ）よりＢ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子配列を、関連情報を含めて収集した。Ｓ遺伝子配列は前記目的領域を含んでいる。収集した塩基配列により遺伝子系統解析を行い、遺伝子系統的な多様性を代表する塩基配列を選択した。また、代表的なＡ〜Ｈまでの８種類の遺伝子型の情報を加え、予め用意された目的領域の塩基配列群とした。予め用意された目的領域の塩基配列群を構成する塩基配列の内容を表２に示す。

（被験者由来の塩基配列の評価のための計算）
被験者由来のＢ型肝炎ウイルスの目的領域の塩基配列（評価対象配列）は以下のようにして評価した。評価対象配列を上述の予め用意された目的領域の塩基配列群に加え、全体の塩基配列を解析ソフトウェア「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」で解析し、マルチプルアライメントを作成した。ここでは、評価対象配列の質に関係なく、評価対象配列間のダイレクトアライメントを行った場合よりも正確なアライメントが得られた。マルチプルアライメントにおいて全配列に共通する領域だけを使用して、Ｇｏｊｏｂｏｒｉ’ｓ ６ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ法により、塩基配列間の進化距離を計算し、進化距離マトリックスを作成した。最後に、ＮＪ法を用いて進化距離マトリックスから遺伝子系統樹を作成した。

核酸の違いの分布はポアソン分布によって近似されるが、本実施例においては、ＰＣＲ産物における相違部位数の平均は４．６７塩基であった。２つの独立したサンプルが偶然に同じ配列を有している確率は１％未満と推定され、家族内感染のケースでは偽陽性データはほとんど出現しなかった。

前述のとおり、上記方法により１０家族２３被験者の感染経路を決定する分析を行った。１つの家族から得られた２つまたは３つの配列データは、家族ＩＤ：ＦＭ２のケースを除いて、１つのクラスタに分類された（図４）。これらの９つの系統の感染経路は家族内であり、これは、予め被験者より得ていた家族内感染情報を裏付けるものであった。

（家族における多重感染経路のケース）
家族ＩＤ：ＦＭ２のケースの結果は他とは異なる。表１および図１に示すように、この家族には４人のキャリア、すなわち、３姉妹（被験者ＩＤ４、５、６）、及びその姉妹のうちの１人（被験者ＩＤ４）の息子（被験者ＩＤ３）が含まれる。全体の塩基配列を対象に解析ソフトウェア「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」によりマルチプルアライメントを作成し、相違塩基数を算出した（図２）。被験者ＩＤ６由来の塩基配列（図２中でｐｒｏｂｅ３）のみが、他の被験者由来の塩基配列と比較して４塩基異なっていたことを示している。この結果から、被験者ＩＤ３、４、５の間でのＢ型肝炎ウイルスへの感染が垂直感染（家庭内感染）であったことが、また、被験者ＩＤ６への型肝炎ウイルスへの感染が水平感染であったことが推測された。前述の方法により家族ＩＤ：ＦＭ２のケースで遺伝子系統樹を作成すると（図３）、被験者ＩＤ６由来の塩基配列のみが、他のメンバーから遠く離れたクラスタに分類さてており、明らかに感染経路が異なることが示唆された。

その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。

Claims (8)

1. Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、当該オリゴヌクレオチドのセットは、以下の組み合わせ：
   （ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、
   （ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、
   （ｃ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、
   （ｄ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、
   から選択されるものであり、前記配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドの上流配列であり、前記配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドは、前記配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドの下流配列である、オリゴヌクレオチドのセット。
2. 配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドとのセットである、請求項１記載のオリゴヌクレオチドのセット。
3. 配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとのセットである、請求項１記載のオリゴヌクレオチドのセット。
4. 被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価するための方法であって、
   前記被験者由来の生物学的試料又は生物学的試料から得られた核酸調製物を鋳型として、配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチドとを有するオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により当該生物学的試料又は核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルス核酸の目的領域を増幅させる工程と、
   前記増幅させた産物を検出する工程と、
   前記検出した増幅産物の塩基配列を決定する工程と、
   前記決定した塩基配列を、予め用意された前記目的領域の配列群と共に系統解析することにより、前記１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子多様性を評価する工程と
   を有し、前記決定する工程は前記オリゴヌクレオチドのセットを用いるものである、
   ことを特徴とする、方法。
5. 請求項４記載の方法において、
   前記評価する工程は、前記予め用意された前記目的領域の配列群と、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの目的領域との進化距離を算出し、与えられた閾値に基づいて、近縁関係にある配列の有無および近縁関係にある配列の由来を特定し、これにより、前記被験者のＢ型肝炎ウイルス感染経路を特定するものである、
   ことを特徴とする、方法。
6. 請求項４記載の方法において、
   前記評価する工程は、前記予め用意された前記目的領域の配列群と、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの目的領域とによって遺伝子系統樹を作成し、前記被験者が有する１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルスの塩基配列の当該系統樹における相対的位置により、前記被験者の１若しくはそれ以上のＢ型肝炎ウイルス感染経路を表現するものである、
   ことを特徴とする、方法。
7. 請求項４記載の方法において、この方法は、さらに、
   前記被験者由来の生物学的試料又は生物学的試料から得られた核酸調製物を鋳型として、配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとを有するオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により当該生物学的試料又は核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルス核酸の目的領域を増幅させる工程を有するものであり、
   前記増幅させる工程は、前記増幅させた目的領域を鋳型として、配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチド若しくは配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド若しくは配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチドとを有するオリゴヌクレオチドのセットを用いるものである、
   ことを特徴とする、方法。
8. 生物学的試料又は生物学的試料から得られた核酸調製物におけるＢ型肝炎ウイルス核酸の目的領域を増幅させ、塩基配列を決定するためのキットであって、以下の組み合わせ：
   （ａ）配列ＩＤ番号２で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号３で表されるオリゴヌクレオチド、
   （ｂ）配列ＩＤ番号４で表されるオリゴヌクレオチドと、配列ＩＤ番号５で表されるオリゴヌクレオチド、
   から選択される１若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドのセット
   を有するものであることを特徴とする、キット。

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