CN102181575A - 用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法。本发明提供了用于乙型肝炎病毒耐药突变位点检测的4对PCR引物，以这4对PCR引物扩增乙型肝炎病毒基因组DNA，获得的4个片段以重叠的方式覆盖整个乙型肝炎病毒逆转录酶基因序列。本发明将4段PCR片段以等摩尔比混合制成逆转录酶基因文库，经454高通量测序和生物信息学分析，能够检测乙型肝炎患者血清样本中的乙型肝炎病毒是否含有耐药性突变位点。本发明能够检测到患者血清中占1%以上的乙型肝炎病毒耐药突变，具有敏感性高、操作简单、通量大等优点，一次测序可以进行多个样本耐药突变位点的分析。

Description

用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测，尤其是一种利用454测序技术对乙型肝炎病毒耐药突变位点进行检测，属于医学检测技术领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科。根据目前所知，乙肝病毒只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙型肝炎病毒成颗粒状，直径为42纳米，是英国科学家Dane于1970年首先发现，故又称Dane颗粒(丹氏颗粒)。Dane颗粒由外膜和内核两部分组成，外膜厚7纳米，由蛋白质和膜脂质组成，称作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的直径约28纳米，为病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg)，病毒基因组DNA和合成病毒基因组的DNA多聚酶。乙肝病毒基因组编码四个基因，分别是表面抗原基因(S、PreS1及PreS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基因(C及PreC基因)。乙肝病毒感染是一个严重的公共卫生问题。全球60亿人口中,约20亿人曾感染过乙肝病毒，其中3.5～4亿人为慢性乙肝病毒感染，约占全球人口6％。在这3.5～4亿慢性乙肝病毒感染者中，约15％～25％最终将死于与乙肝病毒感染相关的肝病。而我国属于高流行区，根据2002年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国一般人群中HBsAg流行率为9.09％，估计约1.2～1.3亿人为慢性乙肝病毒感染，占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全国每年死于与乙肝相关肝病约30万例。

目前广泛应用于临床乙肝病毒抗病毒治疗的药物是核苷类似物药物。由于乙型肝炎病毒（HBV）在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格的校正机制，复制过程中自发突变率达10-5，导致乙型肝炎病毒的基因极易发生突变。当基因突变是发生在HBV逆转录酶（reverse transcriptase，RT）基因的特定位点的特定种类的突变，就会产生对核苷类似物药物的耐药。目前已经鉴定的与耐药相关的逆转录酶基因突变为：L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181TV，T184S/A/I/L/F/G，A194T，S202G/I，M204V/I/S，N236T，M250V，Q215S，V84M，S85A和 V214A。数字代表突变在逆转录酶基因上的位置。慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中发生病毒耐药突变是限制核苷类似药物治疗的一个主要障碍，随着治疗时间的延长，抗病毒药物治疗的患者体内可出现变异株，从而发生病毒学突破，导致治疗失败。 一些病毒发生的耐药变异已被证实可以引起对几种药物的交叉耐药，这就限制了对患者的进一步长期有效地治疗。 因此在治疗中早期检测出这些变异，对选择药物、指导远期治疗非常必要，对大幅度提高抗病毒治疗的疗效具有重要的意义。

目前用于检测HBV耐药突变位点的方法主要有以下三种：

（1）聚合酶链扩增产物直接测序（Sanger测序）：聚合酶链扩增（PCR）产物直接测序被认为是药物治疗过程中耐药检测的首选方法。该方法简明，易操作，但是灵敏性不高，只有当变异株超过HBV准种池(quasispecies pool)的20%以上直接测序才能检测到。

（2）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）：通过PCR扩增出目标基因片段，然后用给定的限制性内切酶进行酶切，根据酶切图谱进行突变位点的分析。该方法可以检测到病毒准种池中5%的变异株，但只能检测单位点变异，仅适用于少数耐药突变位点的检测。

（3）反向杂交线性探针技术（LiPA）：将一系列寡聚核苷酸探针固定在一条杂交膜上，将地高辛标记的PCR产物与相应的探针结合，通过碱性磷酸酶检测系统来观察杂交结果。该方法可以检测到病毒准种池中5%的变异株，但对新出现的变异都要设计新的探针，迫使该技术要定期进行更新。另外由于核苷酸序列上基因型的不同，为了检测一个氨基酸置换通常需要许多个探针来检测。

Roche 公司的454测序技术是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量测序系统。依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。与其他高通量测序方法相比，454测序技术具有测序速度快，单个序列读长长，准确度高，一致性好的优点，目前被广泛应用于基因组及转录组的测序中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：第一个目的是提供一种用于乙型肝炎病毒耐药突变位点检测的引物。第二个目的是用上述引物检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，该方法操作简单，一次测序可以进行多个样本耐药突变位点的分析。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的四对引物：

第一对是F1片段的引物F1f和F1r，其中：

F1f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

F1r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG

第二对是F2片段的引物F2f和F2r，其中：

F2f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG

F2r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA

第三对是F3片段的引物F3f和F3r，其中：

F3f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC

F3r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG

第四对是F4片段的引物F4f和F4r，其中：

F4f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT

F4r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。

本发明提供的用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，该方法是：采用上述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用454测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位点。

上述方法可以按下列步骤顺序进行：

a. 提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；

b. PCR反应：

以步骤a中提取的DNA为模版，分别用F1片段的引物F1f和F1r，F2片段的引物F2f和F2r，F3片段的引物F3f和F3r，F4片段的引物F4f和F4r进行PCR，

在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1 uL，浓度为20umol/L PCR引物f 1uL，浓度为20umol/L PCR引物r 1uL，高保真DNA聚合酶0.5 uL，DNA模板 2 uL和超纯水39uL，

将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的目标基因片段；

c. 获取样本库：

对步骤b中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒回收目的片段，其中F1片段大小为480bp，F2片段大小为466bp，F3片段大小为457bp，F4片段大小为383bp；用Nanadrop紫外分光光度计检测回收到的片段的浓度，将四种片段以等摩尔比混合构成样本的逆转录酶基因文库；

d. 测序：

采用454测序技术对逆转录酶基因文库进行测序，检测是否存在15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变的一种或者几种，这15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变分别是：L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181T/V，T184S/A/I/L/F/G，A194T，S202G/I，M204V/I/S，N236T，M250V，Q215S，V84M，S85A和V214A。

所述步骤b包含b1～b7七个扩增反应的步骤，这些扩增反应步骤的工艺条件分别是：b1.94℃ 5分钟；b2. 94℃ 30秒； b3. 57℃ 30秒； b4. 72℃ 30秒； b5.重复29次步骤b2～b4；b6. 72℃ 10分钟；b7.降温至4℃。

本发明和现有技术相比具有以下主要的优点：

其一.与PCR产物直接进行Sanger测序的方法比较，本方法具有更高的灵敏性，能够检测到HBV准种池中占1%以上的突变。

其二.操作简单，检测过程中的样本RNA提取过程及PCR反应为实验室和医院检验科常用技术。

其三.通量大，一次测序可以获得80—100万条DNA测序结果，可以进行30-40个样本耐药突变位点的分析。

附图说明

图1是利用四对PCR引物经PCR反应后扩增出的片断，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测到的PCR产物示意图。其中M代表DNA Marker。每个片段的结果1代表目的片段，结果2代表阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明基于454测序技术对乙型肝炎病毒耐药突变位点进行检测。首先根据乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计4对引物，扩增获得的4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将PCR扩增获得的DNA等摩尔比混合构建逆转录酶基因的DNA文库，再用454测序技术进行测序，监测样本中是否含有耐药性突变位点。相比于现有的乙型肝炎耐药突变位点的检测技术，

下面结合实施实例及附图对本发明作进一步说明。

一.基于454测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物

根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下用454测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的四对引物：

第一对是扩增第1个片段F1的正向引物F1f、反向引物F1r，

正向引物F1f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

反向引物F1r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG

第二对是扩增第2个片段F2片段的正向引物F2f、反向引物F2r，其中：

正向引物F2f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG

反向引物F2r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA

第三对是扩增第3个片段F3片段的正向引物F3f、反向引物F3r，其中：

正向引物F3f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC

反向引物F3r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG

第四对是扩增第4个片段F4片段的正向引物F4f、反向引物F4r，其中：

正向引物F4f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT

反向引物F4r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。

上述四对引物中，每条引物由下述三部分组成：

第一部分为5`末端的通用引物序列，是基于454测序方法本身的要求，其中，正向引物的通用序列为：CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG；反向引物的通用序列为：CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG；

第二部分是样本的识别码，是引物中的可变部分，其用下划线表示，根据测序样本的数量由6-10个核苷酸以不同的方式排列组合构成，用于在454测序结果中将不同样本的数据区分开；因为454测序获得的数据量较大，在测序的过程中可以将多个样本的PCR产物混合在一起在同一个反应中同时测序，测序获得的DNA序列通过识别码归为相应样本。

第三部分是针对乙型肝炎病毒设计的特异性引物，用来在PCR反应的过程中和乙型肝炎病毒基因组配对，扩增目的DNA片段。

二.用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法

1. 检测方法：

该方法是：采用上述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用454测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位点。

上述方法可以按下列步骤顺序进行：

a. 用乙型肝炎病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本血清中的乙型肝炎病毒基因组DNA。

b. PCR扩增和样本库的构建：

以步骤a中提取的DNA为模版，分别用F1片段的引物F1f和F1r，F2片段的引物F2f和F2r，F3片段的引物F3f和F3r，F4片段的引物F4f和F4r进行PCR扩增；

在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1 uL，浓度为20umol/L PCR引物f 1uL，浓度为20umol/L PCR引物r 1uL，高保真DNA聚合酶0.5 uL，DNA模板 2 uL和超纯水39uL；

将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的4种目标基因片段；

进行扩增反应的条件是：b1. 94℃ 5分钟； b2. 94℃ 30秒； b3. 57℃ 30秒； b4. 72℃ 30秒； b5.重复29次步骤b2～b4；b6. 72℃ 10分钟；b7.降温至4℃。

c. 获取样本库：

对步骤b中获得的PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收4种目的基因片段，其中F1片段大小为480bp，F2片段大小为466bp，F3片段大小为457bp，F4片段大小为383bp。

用Nanadrop紫外分光光度计检测回收到的4种目的基因片段的浓度，再将它们以等摩尔比混合构成样本的逆转录酶基因文库。

d. 测序及分析：

经上海众信生物技术有限公司采用454测序技术对逆转录酶基因文库进行检测及分析，确定样本中是否含有15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变中的一种或几种，这15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变分别是：L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181T/V，T184S/A/I/L/F/G，A194T，S202G/I，M204V/I/S，N236T，M250V，Q215S，V84M，S85A和V214A。

共检测临床样本39例，其中部分样本的测序结果与Sanger测序结果比较，结果见表1。

2. 相关试剂：

胶回收试剂盒购自OMEGA生物技术公司（货号：D2500-02）；高保真DNA聚合酶、dNTP及10xbuffer购自Roch公司（货号：04 738 292 001）；乙型肝炎病毒基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen生物技术公司（货号：51104）。实验操作严格按厂家提供的说明书进行。

3.所用仪器：

PCR扩增仪型号：Biometra T personal，454测序仪型号：GS-FLX，Nanodrop紫外分光光度计型号：ND-1000

4.结论：

乙型肝炎病毒耐药突变的产生是核苷酸类似物药物治疗乙型肝炎治疗过程中的一个主要障碍。在治疗中早期检测出耐药突变位点的出现，对选择药物、指导远期治疗非常必要，对大幅度提高抗病毒治疗的疗效具有重要的意义。在我们的方法中，设计4对PCR引物，通过PCR获得整个逆转录酶基因的DNA文库，将文库进行454高通量测序，通过生物信息学分析检测乙型肝炎病毒感染者血清中乙型肝炎病毒耐药突变位点的出现。

与PCR产物直接进行Sanger测序的方法比较，本方法具有更高的灵敏性，能够检测到HBV准种池中占1%以上的突变。

附表：

表1：部分血清样本耐药突变位点检测结果（NA为在该方法下未检测到耐药性突变位点）

样本编号	Sanger测序检测到的突变位点	454测序检测到的突变位点及在HBV准种库中的比例
			1	NA	T184L(3.4%)，M204I(3.1%)
2	NA	L80V(1.1%)，T184L(3.2%)，M204I(1.2%)
			3	NA	T184L(2.9%)，M204I(3.7%)
4	NA	A181T(1.4%)，T184L(3.5%)，M204I(2.2%)
			5	NA	T184L(3.1%)
6	NA	T184L(4.4%)，M204I(1.6%)
			7	NA	T184L(1.7%)，M204I(3.0%)
8	NA	L80V(2.3%)，T184L(3.0%)，M204I(1.1%)
			9	NA	T184L(2.7%)，M204I(1.1%)

Claims (4)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物，其特征是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下四对引物：

第一对是F1片段的引物F1f和F1r，其中：

F1f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

F1r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG

第二对是F2片段的引物F2f和F2r，其中： 

F2f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG

F2r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA

第三对是F3片段的引物F3f和F3r，其中：

F3f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC

F3r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG

第四对是F4片段的引物F4f和F4r，其中：

F4f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT

F4r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。

2.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，其特征是采用权利要求1所述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用454测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是按下列步骤顺序进行：

a. 提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；

b. PCR反应：

以步骤a中提取的DNA为模版，分别用F1片段的引物F1f和F1r，F2片段的引物F2f和F2r，F3片段的引物F3f和F3r，F4片段的引物F4f和F4r进行PCR，

在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1 uL，浓度为20umol/L PCR引物f 1uL，浓度为20umol/L PCR引物r 1uL，高保真DNA聚合酶0.5 uL，DNA模板 2 uL和超纯水39uL，

将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的目标基因片段；

c. 获取样本库：

对步骤b中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒回收目的片段，其中F1片段大小为480bp，F2片段大小为466bp，F3片段大小为457bp，F4片段大小为383bp；用Nanadrop紫外分光光度计检测回收到的片段的浓度，将四种片段以等摩尔比混合构成样本的逆转录酶基因文库；

d. 测序：

采用454测序技术对逆转录酶基因文库进行测序，检测是否存在15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变的一种或者几种，这15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变分别是：L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181T/V，T184S/A/I/L/F/G，A194T，S202G/I，M204V/I/S，N236T，M250V，Q215S，V84M，S85A和V214A。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤b中，进行扩增反应的条件是：b1. 94℃ 5分钟； b2. 94℃ 30秒； b3. 57℃ 30秒； b4. 72℃ 30秒； b5.重复29次步骤b2～b4；b6. 72℃ 10分钟；b7.降温至4℃。

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