CN107236788B - 一种非诊断目的的检测幽门螺杆菌基因及药物代谢型的Miseq测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测幽门螺杆菌基因及药物代谢型的Miseq测序方法，其包括以下几步：设计覆盖UreB、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，形成Primer Pool；提取宿主和幽门螺杆菌基因组进行扩增：二次扩增进行文库制备、纯化、定量；Miseq高通量测序和分析；计算出耐药比例和药物代谢酶类型。本发明利用多重PCR技术将待测片段在一个反应中实现扩增，结合Miseq测序和分析，即可获得幽门螺杆菌感染情况、耐药情况及宿主药物代谢酶CYP2C19基因多态性类型，有利于指导临床关于幽门螺杆菌的检测和根除。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种基于Miseq高通量测序技术同时检测幽门螺杆菌特异性基因、幽门螺杆菌耐药基因和宿主药物代谢酶CYP2C19基因的方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种螺旋形弯曲、微需氧的革兰氏阴性菌，被广泛证实为多种上消化道疾病的致病因子，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的最主要病因，也是胃癌发生的重要诱因之一。
临床上根除幽门螺杆菌的常用方法为两种抗生素加上一种质子泵抑制剂(PPI)的三联疗法或者加上铋剂的四联疗法。幽门螺杆菌对抗生素耐药的分子机制已被广泛研究，其中较为重要的两种抗生素克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药机制已被研究的较为清晰。研究表明超过90％的克拉霉素耐药的幽门螺杆菌都有23SrRNA的2142和2143位点发生突变，常见的突变有A2142G、A2143G、A2143C三种，也有一些其他的突变，如T2182C、C2245T、T2289C等，但都是集中在23SrRNA核酸可变区V区。国内的一项研究也显示，超过80％的喹诺酮类药物耐药的幽门螺杆菌都有gyrA基因发生突变，其中常见的突变有四种Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr、Ala97Val，Asp86Asn较为少见，87和91突变在所有的耐药菌株中发现，并且与高耐药性相关，但都是集中在喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)发生突变。
而PPI高度依赖刚脏细胞色素CYP450酶系进行代谢。CYP450酶是临床药物代谢研究的重要对象，涉及药物代谢的CYP450主要为CYP1、CYP2、CYP3家族中的7种重要的亚型，其中CYP2家族是CYP450酶系中最大的家族，包括CYP2A，CYP2B，CYP2C，CYP2D，CYP2E亚家族。CYP2C19基因位于人第10号染色体上，包含9个外显子和5个内含子。目前，共鉴定了35个等位基因突变和一系列的亚突变体。
在分子水平上通过检测幽门螺杆菌对上述两种抗生素的耐药情况和药物代谢酶的基因多态性情况，可以明确药物代谢酶类型和幽门螺杆菌耐药性，从而针对性指导幽门螺杆菌感染用药，并为避免药物不良反应和新药研发提供科学参考依据。
Miseq高通量测序技术，又称大规模平行测序技术，将DNA(cDNA)随机片段化后、加接头、制备文库测序，通过对文库中数以万计的克隆继续可逆延伸反应，荧光信号采集和信号转化，最终获得DNA序列。通过扩增子建库结合Miseq测序也已被广泛运用科学和临床研究，最典型的运用为16SrRNA测序进行细菌种属鉴定。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种准确、快速、检测流程简单的方法，可以同时检测幽门螺杆菌特异性、耐药基因和宿主CYP2C19基因多态性位点，并能够更加科学、安全、快速、准确指导幽门螺杆菌感染患者的用药。
为实现以上目的，设计覆盖UreB、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，扩增产物在360-460bp。
进一步的，将各正向引物的5’端加上TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-特异引物，各反向引物5’端加上GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-特异引物。
进一步的，将5对引物按照特定的比例合并，形成PrimerPool。
进一步的，裂解胃黏膜组织样本，同时提取宿主和幽门螺杆菌基因组。
进一步的，利用Primer Pool扩增出待测样本耐药区域的扩增产物，并进行磁珠纯化。
进一步的，使用index引物对纯化的扩增子进行第二次扩增，每个样本带上不同的index，此时样本建库完成。
进一步的，通过对文库的定量和质控，合格后进行Miseq双端测序；对测序结果进行质控和分析，滤去接头等序列，比对耐药区域和药物代谢酶基因多态性位点，根据突变reads/未突变reads，计算出耐药比例和药物代谢酶类型。
本方法只需要简单的对胃黏膜样本进行裂解处理，即可获得幽门螺杆菌和宿主的全基因组。设计出幽门螺杆菌的特异性、耐药和宿主药物代谢酶CYP2C19基因，利用多重PCR技术将这些待测片段在一个PCR反应中实现扩增，结合index引物的扩增实现待测样本的文库构建，一次测序即可获得幽门螺杆菌感染情况、耐药情况及宿主药物代谢酶CYP2C19基因多态性类型。该方法设计合理、操作流程简单、检测结果快速、准确、通量极高，可以满足不同科研和临床的检测需求，有利于指导临床关于幽门螺杆菌的检测和根除，为幽门螺杆菌感染治疗提供分子基础。
此外，本发明的方法配合使用Illumina测序平台的Miseq测序仪，即可完成文库测序。此款测序仪相比较于其他测序仪具有更加简单、快速、经济、灵活的优势，整个建库流程1天即可，测序也只需要在2天内即可完成，相对于其他测序平台更加快捷，而且Miseq测序的准确度目前来说是最准确的。
附图说明
图1是文库构建示意图。①第一步PCR扩增，靶基因的特异扩增和接头添加。X：接头和测序序列；Y：特异引物序列；F：正向特异引物；R：反向特异引物。②第二步PCR完成测序文库构建。FC：与测序芯片Flow Cell配对的序列；B：不同样本的index序列；F：正向index引物；R：反向index引物。
图2是Agilent 2100 DNA1000 Kit文库检测图
具体实施方式
为了使相关领域的科研人员和临床工作人员能够更好的理解本发明方案，下面结合实施方式和附图予以详细说明。但本发明并不限于以下实施方式。
实施例1
设计覆盖UreB、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，扩增产物在360-460bp，具体见表1。
表1 基因待测区域的特异性引物
在上述各正向引物的5’端加上TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG接头序列，各反向引物5’端加上GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG接头序列，具体见表2。
表2 含接头序列的引物
将上述引物分别稀释至10μM后进行混合，Primer Pool中这些引物的混合比例为：A-23S∶A-CYP2C19*2∶A-CYP2C19*3∶A-gyrA∶A-UreB＝2∶0.5∶0.5∶1∶1。
合成illumina公司的二次扩增index引物，稀释至10uM。目前常用的引物为20条，其中N70X系列12条，S50Y系列8条，总共可以有96种引物组合，一般可以满足样本需求，具体引物序列见表3。
表3 二次扩增index引物
| 引物名称 | index引物序列(5’-3’) |
| N701 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG |
| N702 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGG |
| N703 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGG |
| N704 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGG |
| N705 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGG |
| N706 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGG |
| N707 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGG |
| N708 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGG |
| N709 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGG |
| N710 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGG |
| N711 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGG |
| N712 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGG |
| S501 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC |
| S502 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTC |
| S503 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTTCGTCGGCAGCGTC |
| S504 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGATCGTCGGCAGCGTC |
| S505 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGTCGTCGGCAGCGTC |
| S506 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATATCGTCGGCAGCGTC |
| S507 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTATCGTCGGCAGCGTC |
| S508 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTTCGTCGGCAGCGTC |
实施例2
提取胃黏膜中的基因组
(1)在无菌的2ml圆底EP管中，加入100μl组织裂解液和一个直径3mm的无菌钢珠；
(2)将胃黏膜组织从样本保存液中取出，转移至含有裂解液和钢珠的2ml圆底EP管中；
(3)组织研磨仪研磨样本，参数为室温条件下50Hz，60s，直至无组织块；
(4)充分研磨后，短暂离心，将匀浆液体转移至新的无菌1.5ml EP管中；
(5)将含有匀浆组织的1.5ml EP管置于95℃金属浴中孵育10分钟，中间可颠倒数次；
(6)迅速将EP置于4℃冰箱中孵育30分钟；
(7)冰箱中取出EP管，12000转离心，5分钟，收集上清到新的EP管中，即可得到宿主和细菌的全基因组。
实施例3
目的片段的扩增和纯化
(1)用按照比例混合好的PCR引物配制如下反应体系：反应总体系25μl，其中2*Phusion HF Buffer PCR Master mix 12.5μl，模板3.5μl，混合引物Primer Pool 2μl，ddH2O 7μl。反应条件为95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20个循环；循环结束后72℃延伸5分钟；10℃保存。
(2)在25μL扩增产物中加入20μl Agencourt AMPure XP beads磁珠，吹打混匀，室温放置5min；放入磁架上，2-5min后待液体变清，吸弃上清，缓慢加入新鲜配制的200μl80％乙醇洗涤，30s后吸弃乙醇，并重复一次；静置磁架5-8min挥发乙醇；待磁珠中心开始干裂即加入32.5μl水进行洗脱；从磁架上移下来，反复吹吸均匀后室温静置5min；放入磁架，2-5min后待液体变清，吸取30μl上清至新的洁净离心管中，即得到纯化后的PCR产物。
文库建库参考示意图参考图1
实施例4
测序文库的构建、纯化、定量、质控
(1)利用PCR的方法完成文库构建，反应总体系25μl，包括2*Phusion HF BufferPCR Master mix 12.5μl，纯化后的扩增产物4μl，引物N70X 1μl，引物S50Y 1μl，ddH2O 6.5μl，反应条件为95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，15个循环；循环结束后72℃延伸5分钟，10℃保存。
(2)取以上反应中25μl扩增产物加入25μl Agencourt AMPure XPbeads磁珠，吹打混匀，室温放置5min；放入磁架上，2-5min后待液体变清，吸弃上清，缓慢加入新鲜配制的200μl 80％乙醇洗涤，30s后吸弃乙醇，并重复一次；静置磁架5-8min挥发乙醇；待磁珠中心开始干裂即加入52.5μl水进行洗脱；从磁架上移下来，反复吹吸均匀后室温静置5min；放入磁架，2-5min后待液体变清，吸取50μl上清至新的洁净离心管中，即可得到已纯化的文库。
(3)文库定量和质控质控，配套使用Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪和Qubit2.0浓度测定仪，Qubit 2.0检测文库浓度，Agilent 2100检测文库大小以及浓度。本方法使用Agilent DNA 1000 Kit进行浓度和大小测定，具体如下：
1)将DNA 1000 Kit试剂盒中的染料(蓝色盖子)和胶(红色盖子)冰箱中取出，进行室温避光平衡30min，；
2)将染料混合均匀后，取25μl染料加入500μl胶中，涡旋10s混匀；
3)转移染料-胶混合物至试剂盒中的离心柱，室温离心2240g，15min；
4)吸取9μl染料-胶混合物加入至DNA 1000芯片的最右侧第三个孔(有标记)，避免在移液过程中产生气泡；
5)挤压注射器，从1ml位置至DNA位置的卡槽，60s后松开注射器卡槽，注射器会自然上升，5s后松开底座的DNA芯片；
6)分别吸取9μl染料-胶混合物至DNA 1000芯片最右侧第一、二孔(有标记)，避免气泡产生；
7)再剩余的13个孔中，分别加入5μl DNA marker(绿色盖子)；
8)吸取1μl DNA ladder(黄色盖子)至最右侧第四个孔；
9)将待测样本加入到芯片的前3列，每个样本吸取1μl；
10)在摇床中，固定好DNA芯片，2240rpm，混合60s；
11)根据芯片类型，设定好Agilent 2100 Bioanalyzer参数，即可进行浓度的测定。
Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 kit文库质控检测图参考图2。
实施例5
文库测序、数据分析
(1)质控合格后的文库进行测序前的稀释，具体如下：
1)根据Agilent 2100 Bioanalyzer和Qubit 2.0的检测结果对文库进行稀释，此时用水稀释即可，稀释到2nM，充分混合均匀；
2)用变性剂0.2N的NaOH按1∶1稀释2nM文库，此时文库浓度为1nM，稀释时避免剧烈混合，用移液器吹吸均匀即可；
3)变性剂稀释后室温放置5min；
4)用测序试剂的杂交buffer HT1对变性后的文库进行终浓度稀释，一般在10-15pM均可，充分混合均匀后，放置4℃冰箱保存，使用时取出。
(2)文库稀释到合适的浓度后，即可按照每个样本的数据量需求对不同文库进行混合，本方法要求每个样本的reads数不低于5000条，测序试剂选择Miseq Reagent Kitv2，PE 500-cycles，具体测序操作参考Illumina平台的Miseq使用说明书，简单来说：先对Miseq测序仪的管路进行清洗，测序试剂室温化冻，测序仪参数设置，测序。
(3)测序数据下机后，Miseq测序仪对测序结果进行自动转化，生成fastq格式的文件，通过比对每个样本的测序结果，分析突变情况，得到不同胃黏膜样本的幽门螺杆菌的感染情况、耐药情况以及宿主药物代谢酶类型，深度发掘数据，计算突变菌株和未突变菌株的比例，可得到混合感染中耐药和敏感菌株的比例。
Claims (5)
1.一种非诊断目的的检测幽门螺杆菌基因及药物代谢型的Miseq测序方法，其特征在于，通过二次扩增目的基因，结合Miseq测序仪可检测幽门螺杆菌特异性基因、幽门螺杆菌耐药基因和宿主药物代谢酶CYP2C19基因，包括如下步骤：
(1).设计覆盖UreB、23S rRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，其扩增产物在360-460 bp，引物具体序列为：ATGAATGGCGTAACGAGATG；ACACTCAACTTGCGATTTCC；GATCATAGGGCGCGCTTTACC；AAGTCGCCATCCCTACAGCGA；GCAGGTATAAGTCTAGGAAATG；TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG；CACCCTGTGATCCCACTTTC；CTAATGGGCTTAGAAGCCTG；GTGAGATTGGGCGATACAG；TTACACCGCTTGCAAAAGC；
(2).将上述各正向引物的5’端加上TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，各反向引物5’端加上GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG，将引物按比例混合，形成PrimerPool；
(3).Primer Pool中这些引物的混合比例为：23S rRNA∶CYP2C19*2∶CYP2C19*3∶gyrA∶UreB＝2∶0.5∶0.5∶1∶1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，裂解胃黏膜组织样本，同时提取宿主和幽门螺杆菌基因组，并对基因组进行质控。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Primer Pool扩增出待测样本耐药区域的扩增产物，并进行磁珠纯化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用Index引物对纯化的扩增产物进行第二次扩增，每个样本带上不同的index，即可完成样本建库。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过对文库的定量和质控，合格后进行Miseq双端测序；对测序结果进行质控和分析，滤去接头序列，比对耐药区域和药物代谢酶基因多态性位点，根据突变reads/未突变reads，计算出耐药比例和药物代谢酶类型。
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Denomination of invention: A Miseq sequencing method for detecting Helicobacter pylori genes and drug metabolites for non diagnostic purposes Granted publication date: 20210702 Pledgee: Hangzhou United Rural Commercial Bank Limited by Share Ltd. branch of science and technology Pledgor: HANGZHOU ZHIYUAN MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Registration number: Y2024330002620 |
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