CN103911446A - 一种基于胃液多重实时pcr检测的幽门螺杆菌（hp）个体化治疗辅助诊断方法 - Google Patents

一种基于胃液多重实时pcr检测的幽门螺杆菌（hp）个体化治疗辅助诊断方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于胃液多重实时PCR检测的幽门螺杆菌（HP）个体化治疗辅助诊断方法。本发明所述方法能从10-500μl胃液标本中同时检测出HP的特异基因、HP克拉霉素耐药突变位点A2143G和A2142G、以及相应患者CYP2C19基因位点（CYP2C19*2（G681A）、CYP2C19*3（G636A））多态性，选取人上皮细胞核糖核酸酶P（Rnase P）作为内参基因。该检测方法快速准确、样品需求量小，可在一次试验中从10-500μl胃液标本中检测出是否存在HP的感染、并报告HP对克拉霉素耐药情况及患者CYP2C19的基因类型，为HP感染的个体化根除治疗提供用药指导。

Description

一种基于胃液多重实时PCR检测的幽门螺杆菌(HP)个体化治疗辅助诊断方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于胃液的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称H.pylori或HP）感染个体化治疗辅助诊断多重实时（Real-Time）PCR检测方法。
背景技术
HP能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的原核生物中唯一的I类致癌因子。以质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）结合阿莫西林和克拉霉素（或者甲硝唑）等抗生素的三联疗法或四联治疗等，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。然而，由于克拉霉素的耐药率的不断上升，这种疗法的成功率正在逐渐的下降。另一个影响这种三联用药的成功率的是人类的细胞色素P450的同工酶CYP2C19基因的多态性，其基因类型决定了PPI在人体内降解的速度。因此，在使用三联疗法治疗HP感染之前，如果能提供准确的克拉霉素药敏结果和CYP2C19基因类型，进行针对性的选择药物，能够很好地保证治疗的成功率。然而，传统的培养和药敏试验以及其他快速检测方法，并不能满足这一要求。我们设想通过实时PCR方法在一次实验中能够从尽可能少量的胃液标本中检测HP感染，评价克拉霉素耐药情况，并提供患者CYP2C19基因类型。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种基于胃液的HP感染个体化治疗多重实时PCR检测方法，仅需待检者提供10-500μl胃液，即可在一次试验中从胃液标本中检测到是否存在HP感染、评价其克拉霉素耐药情况，同时完成患者CYP2C19的基因类型检测。
一种基于胃液的幽门螺杆菌个体化治疗多重实时PCR检测方法，包括：
a)用胃液中脱落上皮细胞的核糖核酸酶P（Rnase P）内参基因、幽门螺杆菌特异基因cagH、HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点A2143G和A2142G、CYP2C19基因（CYP2C19*2（G681A）、CYP2C19*3（G636A））分型检测的引物和探针及荧光标记；
b)胃液的预处理方法；
c)检测所需胃液量；
d)多重实时PCR分管组合、反应体系及反应条件；
e)检测结果判读标准；
f)阳性对照、阴性对照。
所谓的基于胃液的幽门螺杆菌个体化治疗多重实时PCR检测方法是指通过提取患者胃液中的核酸，能同时检测HP特异基因cagH（提示患者是否感染HP）、HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点（评价HP克拉霉素耐药情况）及CYP2C19基因多态性（提示CYP2C19酶代谢类型）。
所谓的内参基因（Rnase P）是为了保证试验中模板提取的正确性和初步估计模板的浓度。
本发明通过分析我国HP流行菌株cagPAI上的一段保守区cagH及HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点和人类CYP2C19PPI代谢相关基因，分别设计了不同的引物和荧光标记探针，建立了包括胃液预处理方法、检测所需最小胃液量及多重实时PCR检测技术在内的综合方案。
本发明所述方法仅需要待检者提供胃液，属于非侵入性检测，患者依从性好，检测所需胃液量小（为10-500μl）。所述的检测所需最少胃液量指的是每次试验仅需患者提供10-500μl胃液进行预处理后再进行核酸的提取，即可满足后续包括检测到HP的感染、评价其克拉霉素耐药情况，同时完成患者CYP2C19的基因类型检测。
为避免胃液中的离子浓度、pH值影响核酸的质量从而影响PCR的扩增效率，本发明提供了一种胃液预处理方法，即将新鲜（或融化的冻存）的胃液标本进行涡旋震荡至均匀，取出10-500μl胃液标本，加入等量的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4），振荡均匀，室温放置2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。后续步骤按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。所述的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4）的配制方法如下：取81.16g Tris至800ml dd H2O中，滴加浓盐酸至pH7.4，加入ddH2O定容至1L。
本发明根据HP克拉霉素耐药相关突变的流行状况，结合HP特异基因及CYP2C19等位基因特点，进行了多重实时PCR方法的构建。选择人上皮细胞中核糖核酸酶P（Rnase P）为内参，合成一条标记HEX的TaqMan探针；从中国CDC传染病诊断室测序的全国各地来源的74株HP的cag致病岛（cagPAI）中选择一段保守基因，作为HP检测特异基因，合成一条标记FAM的TaqMan探针；将HP23SrRNA基因的野生型、A2143G和A2142G作为HP克拉霉素耐药监测的位点，合成三条LNA-TaqMan探针，分别标记FAM和/或HEX；选择人CYP2C19第五外显子G681A和第四外显子G636A为参照，分别针对这两处设计两对LNA-TaqMan探针，并标记FAM和HEX。以上探针经过特异性验证和条件优化，然后将Rnase P和HP特异探针、三条HP23S rRNA基因探针、CYP2C19基因的两对探针进行组合，对组合探针进行验证和优化。本发明所合成探针都有良好的特异性，并可实现组合检测。通过以上实验成功构建了多重实时PCR方法，能够在一次实时PCR试验中，通过四个反应体系，实现HP感染诊断、HP克拉霉素耐药评价、CYP2C19等位基因分析三个目的。
引物、探针序列和多重组合如表1所示，其中FAM、HEX为不同波长的荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。
表1多重实时PCR检测方法引物和探针序列
分管组合如下：①cagH探针+RnaseP探针；②HP23S rDNA野生型探针+A2143G探针+A2142G探针；③CYP2C192*G探针+CYP2C192*A探针；④CYP2C193*G探针+CYP2C193*A探针。
本发明所述方法还包括在每一反应体系中提供相应的阳性对照和阴性对照。
本发明的多重实时PCR扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：
在本发明的一种优选的实施方式中，本发明的多重实时PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，58℃45s，45个循环，读板。
阳性对照、阴性对照包括九种阳性对照和一种大肠杆菌阴性对照，其中九种阳性对照分别为含有cag H、RNase P、HP23S rDNA-AA、HP23S rDNA-GA、HP23S rDNA-AG、CYP2C19-2A、CYP2C19-2G、CYP2C19-3A、CYP2C19-3G目的基因的质粒。以上对照浓度均为1×106copies/μl。
对有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中的阳性对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
1.组合①中绿色曲线起峰，表示DNA标本提取正确。在此基础上，其他结果判定有效。如果没有绿色曲线扩增，表示DNA提取失败，其他结果均不可信。
2.组合①中蓝色曲线起峰，表示有HP感染，Ct值应小于38。
3.组合②中蓝色曲线起峰，表示HP23S rRNA基因为野生型。
4.组合②中绿色曲线起峰，表示HP23S rRNA基因为A2143G或A2142G突变型。
5.组合②中蓝色和绿色曲线起峰，表示患者被两株（或三株）HP感染，一株为HP23S rRNA基因野生型，一株为突变型。
6.组合①中绿色曲线，而组合②中蓝色或绿色曲线起峰，Ct值小于38表示被cagH缺失的HP感染。
7.组合③中蓝色曲线先起峰表示CYP2C19*3为G型；绿色起峰，表示CYP2C19*3为A型。
8.组合④中蓝色曲线先起峰表示CYP2C19*2为G型；绿色起峰，表示CYP2C19*2为A型。
附图说明
图1为构建质粒RNase P的测序及比对结果；
图2为构建质粒cag H的测序及比对结果；
图3为组合①中RNase P探针对不同浓度模板扩增标准曲线；
图4为组合①中cag H探针对不同浓度模板扩增标准曲线；
图5为组合①中RNase P探针对不同浓度模板的扩增结果；
图6为组合①中cag H探针对不同浓度模板的扩增结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1胃液标本的预处理及核酸的提取
1.胃液标本的预处理
取10μl-500μl的胃液加入1.5ml的离心管中，加入等量的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4），振荡均匀，室温放置2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。
2.核酸提取的具体操作步骤按照QIAGEN DNA提取试剂盒51306说明并改进。具体方法如下：
①.在沉淀中加入180μl ATL和20μl蛋白酶K，振荡混匀。将离心管置于金属浴或空气摇床中，56℃振荡2h。
②.从金属浴或空气摇床中取出离心管，进行短暂离心。在离心管中加入200μl AL，振荡混匀。
③.离心管置于金属浴中，70℃振荡10min，将离心管短暂离心。
④.在离心管中加入200μl新鲜的无水乙醇，振荡混匀，短暂离心。
⑤.将离心管中的液体全部转入到Qiagen柱中。8000rpm离心1min，弃去废液，保留柱子。
⑥.将柱子转入到一个新的废液收集管中，加AW1500μl。8000rpm离心1min，弃去废液，保留柱子。
⑦.将柱子转入到一个新的废液收集管，加AW2500μl。13000rpm离心3min,弃去废液，保留柱子。
⑧.将柱子转入到一个新的废液收集管中，最高转速离心1min。将柱子转入到一个新的1.5ml离心管，在生物安全柜中打开盖，晾2min。
⑨.在柱子中加入100μl buffer AE，盖盖放置5min。8000rpm离心1min，收集洗脱出的液体（含目标DNA）。
⑩.将收集的含DNA液体重新加入柱子中，盖上盖子放置5min。8000rpm离心1min，收集DNA，弃去柱子。
.将收集到的DNA分装出2份，每份25μl。将提取到的DNA置-80℃冷冻保存。
实施例2多重实时PCR体系及反应条件优化
本发明通过对体系中Mg2+浓度、退火温度以及探针组合进行优化验证，得到最优反应条件如下：95℃10min；95℃10s，58℃45s，45个循环，读板。多重PCR体系中最佳Mg2+浓度为2.0mM。最优多重探针组合如下：①cagH探针+RnaseP探针；②HP23S rDNA野生型探针+A2143G探针+A2142G探针；③CYP2C192*G探针+CYP2C192*A探针；④CYP2C193*G探针+CYP2C193*A探针。通过以上实验成功构建了多重实时PCR方法，能够在一次实时PCR试验中，通过四个反应体系，实现HP感染诊断、HP克拉霉素耐药评价、CYP2C19等位基因分析三个目的。
实施例3胃液初始量的优化
将融化的胃液标本涡旋震荡至均匀，分别取500μl、100μl、10μl的胃液标本，按照实施例1中的操作提取核酸。取2μl加入每管PCR体系中。组合①对随机选取的106例胃液标本(其中快速尿素酶阳性标本99份，阴性标本7份)进行检测，结果见表2、3、4。阳性预测值（positive predictive value，PPV）是指试验结果阳性者中真病例的概率。阴性预测值（negative predictive value，NPV）是指试验结果阴性中确未患病的概率。
表2初始胃液量分别为500μl时，多重实时PCR检测结果
PPV=94.29%，NPV=100%
表3初始胃液量分别为100μl时，多重实时PCR检测结果
PPV=96.12%，NPV=100%
表4初始胃液量分别为10μl时，多重实时PCR检测结果
PPV=97.06%，NPV=100%
实施例4标准品的构建
1.目的基因的扩增以标准菌株HP26695为模板进行cagH基因的扩增，以胃液标本0983为模板进行Rnase P基因的扩增。PCR体系和热循环参数如下：
表5反应体系（50μl）    表6热循环参数
2.目的产物的纯化
使用天根DNA纯化回收试剂盒进行回收，需要注意的是，因目的片段较小，溶胶时应按胶的三倍体积加溶胶液。
3.连接
1μl PMD18-T 载体（50ng/μl）中加入0.3pmol Insert DNA，加入等量的solution I，16℃过夜连接。
4.转化
（1）取10μl连接产物加入50μl感受态细胞DH5α中，冰中放置30min。
（2）42℃加热45s后，再在冰中放置1min。
（3）加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60min。
（4）在含有Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
（5）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
5.增菌
PCR法鉴定阳性者进行增菌，接种至含100ng/μl Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养8h。
6.测序
部分测序结果如下：
质粒RNase P测序及比对结果如图1所示。
质粒cag H测序及比对结果如图2所示。
7.将以上测序结果正确的质粒进行浓度测定，分别稀释至1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μl，冻存至-80℃。拷贝数计算公式如下：
N=[X×10-9/(Y×660)]×6.02×1023
（其中X为质粒初始浓度（ng/μl），Y为碱基数目）
实施例5体系标准曲线的制作
以标准浓度模板的log值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，分别绘制HP cag H及RNase P体系的实时PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在1×109copies/μl—1×101copies/μl时，这个范围内时，其对数值与Ct值具有非常好的相关性（HP cag H R2=0.996；RNase PR2=0.997）。标准曲线见图3、4。
实施例6HP个体化治疗多重实时PCR检测体系的灵敏度、特异性及检出限评价
1.灵敏度评价
灵敏度，又称真阳性率，即真正的HP阳性样本按照该检测方法的标准被正确地判断为幽门螺杆菌的百分比。以组合①为例，用优化了的HP cag H、RNase P多重实时PCR检测体系的1株ATCC标准株（HP26695）和实验室保存的99株HP临床分离株DNA。结果，除NTC对照外，所有99株HP cagH、RNase P多重实时PCR检测体系检测结果呈阳性。
2.特异性评价
特异性，又称真阴性率，即实际上不是HP而按照该检测方法的标准被正确地判为HP的百分比。用优化了的多重实时PCR检测28种胃粘膜除HP外可能出现的细菌、15种肠道致病菌及人类染色体（表7），以HP为阳性对照。结果除阳性对照外，其余44种非HP模板均为阴性。
表7用于检测HP cagH实时PCR体系特异性模板
ATCC，美国模式培养物集存库
3.检测限的评价
检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。
以1×109copies/μl—1×101copies/μl一系列梯度的HP cag H质粒为模板，每个浓度梯度取2μl，按照优化的反应体系和反应条件进行实时PCR。
当模板浓度为1×109copies/μl—1×101copies/μl时，每个浓度梯度的模板扩增结果均为阳性。所以，组合①中RNase P的检测下限为1×101copies/μl（图5）。组合①中cag H的检测下限为1×101copies/μl（图6）。
实施例7多重实时PCR方法与HP分离培养方法、普通PCR方法对临床标本的实际应用评价比较
HP分离培养是诊断HP感染的金标准，灵敏度虽然稍低，但是其特异性非常高（为100%）。用本发明建立的方法、HP分离培养及普通PCR的方法检测来随机选取的自临床医院的胃液标本64例（快速尿素酶试验阳性）检测结果见表8。
多重实时PCR方法对快速尿素酶试验阳性临床标本检测率为100%，高于HP分离培养的87.50%及普通PCR的89.06%，经统计学计算存在显著性差异(P＜0.05，卡方检验)，说明多重实时PCR方法对于快速尿素酶阳性标本的检测优于HP分离培养及普通PCR。所有HP分离培养阳性的标本，多重实时PCR方法检测均为阳性。
表8胃黏膜分离培养作为金标准，比较胃黏膜普通PCR与胃液多重实时PCR二种检测方法n(%)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于胃液的幽门螺杆菌个体化治疗多重实时PCR检测方法所用的引物和探针组合，其特征在于，
2.包含权利要求1所述的引物和探针的试剂盒。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
其中，胃液预处理方法包括将新鲜（或融化的冻存）的胃液标本进行涡旋震荡至均匀，取出10-500μl胃液标本，加入等量的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4），振荡均匀，室温放置2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。
4.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4）的配制方法如下：取81.16g Tris至800ml ddH2O中，滴加浓盐酸至pH7.4，加入ddH2O定容至1L。
5.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，
还包括在每一反应体系中提供相应的阳性对照和阴性对照。
6.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，
阳性对照、阴性对照包括九种阳性对照和一种大肠杆菌阴性对照，其中九种阳性对照分别为含有cag H、RNase P、HP23S rDNA-AA、HP23S rDNA-GA、HP23S rDNA-AG、CYP2C19-2A、CYP2C19-2G、CYP2C19-3A、CYP2C19-3G目的基因的质粒。
7.前述任一项权利要求所述的试剂盒，对照浓度均为1×106copies/μl。
8.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，
当多重实时PCR扩增反应体系为20μl反应体系时，其优选配置为：
9.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，
多重实时PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，58℃45s，45个循环，读板。
10.前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，
对有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中的阳性对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
（1）.组合①中绿色曲线起峰，表示DNA标本提取正确，在此基础上，其他结果判定有效；如果没有绿色曲线扩增，表示DNA提取失败，其他结果均不可信；
（2）.组合①中蓝色曲线起峰，表示有HP感染，Ct值应小于38；
（3）.组合②中蓝色曲线起峰，表示HP23S rRNA基因为野生型；
（4）.组合②中绿色曲线起峰，表示HP23S rRNA基因为A2143G或A2142G突变型；
（5）.组合②中蓝色和绿色曲线起峰，表示患者被两株（或三株）HP感染，一株为HP23S rRNA基因野生型，一株为突变型；
（6）.组合①中绿色曲线，而组合②中蓝色或绿色曲线起峰，Ct值小于38表示被cagH缺失的HP感染；
（7）.组合③中蓝色曲线先起峰表示CYP2C19*3为G型；绿色起峰，表示CYP2C19*3为A型；
（8）.组合④中蓝色曲线先起峰表示CYP2C19*2为G型；绿色起峰，表示CYP2C19*2为A型。
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