CN109762877A

CN109762877A - 从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN109762877A
Application number: CN201910054548.7A
Authority: CN
Inventors: 宋志强; 周丽雅
Original assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2019-01-21
Filing date: 2019-01-21
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2039-01-21
Also published as: CN109762877B

Abstract

本发明涉及一种从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒，所述方法利用磁珠偶联探针来富集粪便样本中的相关基因组DNA，并进一步利用巢式PCR来进行胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因片段的扩增，此基因片段可用于下游单碱基突变的荧光定量PCR检测或者膜芯片检测。本方法及试剂盒能够从组成成分复杂、PCR抑制剂较多的粪便中富集目标片段，为下一步的检测提供了纯度和质量较高的模板DNA，实现了对胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因检测的无创、无痛化，有利于彻底改变Hp感染的诊治模式，具有很好的创新价值和科研意义。

Description

从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及无创富集及检测胃幽门螺杆菌技术领域，具体涉及从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒。

背景技术

幽门螺旋杆菌，英文名Helicobacter pylori，简称Hp。是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内。它会引起胃黏膜轻微的慢性发炎，甚或导致胃及十二指肠溃疡与胃癌。世界卫生组织(WHO)癌症协会规定幽门螺杆菌是细菌中唯一的I类致癌因子。幽门螺旋杆菌国际共识会议(Maastricht IV)、WHO-IARC《根除Hp可作为预防胃癌策略》、《Hp胃炎京都共识》均认为Hp感染者应给予根除治疗。《2016年欧美儿童/青少年(＜18岁)Hp感染处理相关指南》强烈推荐基于Hp药物敏感试验结果制定根除方案。

我国是幽门螺旋杆菌感染重灾区，感染率高达到40％-60％，由于生活环境和习惯，使得许多人在儿童时期就感染了幽门螺旋杆菌。在中国，共餐制使得儿童更容易受到Hp的感染，大部分成人Hp感染在儿童期获得，大多发生在儿童早期，感染后一般难以自发清除而导致终生感染。

目前我国面临的核心问题是Hp菌株对抗生素耐药性显著升高，各种经验性根除方案的疗效明显下降。实现Hp感染个体化根除治疗临床广泛应用的目标需要克服两个关键的瓶颈问题：1)建立简便、舒适、无侵入性、价廉的待检标本取材方式；2)建立简便、快速、准确、价廉的相关基因检测技术，而前者是解决儿童Hp感染个体化根除治疗以及临床广泛应用的前提和基础，并且其也是后者实现的基础。因此，提高胃幽门罗杆菌的根除率，降低其感染率的首要就是要推广个体化治疗，而推广个体化治疗的前提就是要实现其简便、舒适以及无侵入性。

已有相关研究结果显示，对胃黏膜和胃液标本进行Hp菌株克拉霉素或左氧氟沙星耐药基因突变以及人宿主CYP2C19基因多态性检测是切实可行的，但需借助胃镜或胃管置入获得检测标本，患者痛苦性大、花费较贵、设备和技术要求较高，难以临床广泛应用，尤其是在儿童和老年患者中。而粪便标本取材简便、舒适性好、价格低廉、无侵入性，适用于各种人群，适合于各级医疗卫生条件的地区和单位，是实现Hp感染个体化根除治疗在临床上广泛开展的重要途径。

但是粪便的组成成分复杂，有：胃肠黏膜细胞、Hp以及各种胃肠道菌群、食物残渣、蛋白、脂肪、色素等，这些使得粪便基因组DNA的提取难度很大，提取DNA质量不高甚至粪便中的一些成分会对后期PCR反应有抑制作用。商业化的粪便基因组DNA提取试剂盒良莠不齐，即使能够提取出基因组DNA的，幽门螺杆菌的DNA丰度也非常低。这些情况都阻碍对幽门螺杆菌个体化治疗的推广和应用，特别是在儿童和老人人群中，幽门螺杆菌个体化治疗就更难以实现。

本发明针对粪便样本，利用磁珠技术偶联探针，有目的的钓取幽门螺杆菌基因片段并且利用巢式PCR技术对目的基因片段进行进一步富集，为后续胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的检测提供了高纯度、高质量的DNA模板片段，可以实现儿童、老年人幽门螺杆菌个体化治疗，有利于幽门螺杆菌个体化治疗的推广和根除。

发明内容

本发明的目的是提供一种从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒，所述试剂盒包括胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因捕获探针，通过捕获探针可特异性的从粪便中获得目标基因组片段，再结合巢式PCR扩增目标基因片段，获得的产物可用于下一步检测胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因型。

进一步地，所述试剂盒中包括磁珠、捕获探针、巢式PCR引物对、PCR反应液。

进一步地，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23S rRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针，以及靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(Rnase P)基因组DNA的捕获探针。

其中，所述Rnase P探针为体系内参，其可在后续检测过程中监测DNA提取是否成功。

进一步地，所述捕获探针的5′端标记生物素；所述磁珠为链霉亲和素磁珠。

进一步地，所述巢式PCR引物对用于扩增幽门螺杆菌23S rRNA、gyrA、ureH基因片段和人CYP2C19、Rnase P基因片段。

进一步优选地，所述捕获探针如下：

人CYP2C19基因组DNA序列设计的捕获探针A与B：

探针A序列为：

探针B序列为：Hp菌的23S rRNA基因组DNA序列设计的捕获探针C与D：

探针C序列为：

探针D序列为：Hp菌的gyrA基因组DNA序列设计的捕获探针E与F：

探针E序列为：

探针F序列为：Hp菌的ureH基因组DNA序列设计的捕获探针G与H：

探针G序列为：

探针H序列为：人Rnase P基因组DNA序列设计的探针I与J：

探针I序列为：

探针J序列为：

优选地，所述巢式PCR引物对如下：

进一步地，本发明目的是提供一种基因组DNA富集方法，其特征在于，所述方法适用于从粪便样本中富集胃幽门螺杆菌基因组DNA，所述方法步骤如下：(1)利用磁珠技术偶联捕获探针从粪便样品中提取富集基因组DNA；(2)巢式PCR扩增富集目标基因；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23S rRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针。

进一步优选地，所述捕获探针还包括靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(Rnase P)基因组DNA的捕获探针。

进一步地，本发明目的是提供一组捕获探针，所述捕获探针能够与磁珠技术配合使用从而当以粪便为样本时可特异性提取、富集胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因片段。

进一步地，本发明目的是提供一组巢式PCR引物，所述引物能够特异性扩增、富集胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因片段。

本领域公知，可依据多种现有技术对基因片段进行检测，包括但不限于：测序、SNP单突变检测、基因芯片、熔解曲线分析等。

有益效果

本发明试剂盒能够从组成成分复杂、PCR抑制剂较多的粪便中获得目标片段；并且能够富集目标片段，为下一步的单碱基突变的检测提供纯度和质量较高的模板DNA，解决了在胃幽门螺杆菌个体化药物根除相关基因的检测中必须以胃粘膜为样本，从粪便中很难获得相关的基因片段的问题，从根本上实现了对胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因检测的无创、无痛化，有利于彻底改变Hp感染的诊治模式，具有很好的创新价值和科研意义。

附图说明

图1粪便标本DNA提取后PCR产物电泳检测和芯片检测结果

(A)电泳检测23S rRNA、gyrA和CYP2C19基因PCR扩增产物，E1为国外某商品化粪便DNA提取试剂盒PCR扩增产物，E2为国内某商品化粪便DNA提取试剂盒PCR扩增产物，E3为本方法提取的PCR扩增产物；

(B)基因芯片检测CYP2C19基因型为CYP2C19＊2/＊2(慢代谢)；

(C)基因芯片检测患者粪便中Hp 23rRNA基因型为2143A→G；

(D)基因芯片检测患者粪便中Hp gyrA基因型272A→G。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：试剂盒检测方法

本发明的捕获探针由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1、Buffer I的配制：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1M NaCl，0.01％～0.1％Tween-20；

2、TE缓冲液的配制：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)；

3、将捕获探针稀释成工作液

按照厂商提供稀释比例，将各探针稀释至1μM的工作液浓度；

4、粪便样本的准备

①调整患者膳食，减少植物性食物的摄取，以减少粪便标本中多糖类物质，进而避免产生PCR抑制；

②在排便前一天进行药物预处理(如胃黏液溶解剂链霉蛋白酶颗粒去除胃内粘液使Hp菌株易于脱落)，以增加Hp菌株的脱落量；

5、胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因目标基因片段的提取。

①称取200-250毫克粪便样本至2毫升离心管中，向样本中加入1.5毫升BUFFER I缓冲液，间歇涡旋振荡5分钟使样本混匀；

②500rpm离心5分钟，小心移取上层浑浊液体至新的2毫升离心管中；

③70℃孵育5分钟；

④涡旋振荡30秒，12000rpm离心1分钟，转移上清至新的2毫升离心管中；

⑤再次12000rpm离心1分钟，转移1毫升上清至新的2毫升离心管中，加入蛋白酶k(1mg/μL)50微升，56℃孵育10分钟；

⑥加入捕获探针A至探针J各1μL(1μM/μL)，95℃以上孵育10分钟，缓慢恢复至室温；

⑦将链霉亲和素磁珠瓶置于漩涡振荡器上20s，振荡重悬磁珠，取200μL磁珠到新的离心管中，置于磁力架上，1min后移除上清液；

注意：吸取上清液时应该将离心管置于磁力架上，并注意不要触碰或吸入磁珠，尽量将上清液去除干净。

⑧加入1ml Buffer I到步骤⑦的离心管中，盖上离心管盖，涡旋震荡磁珠15s，磁性分离，移去上清液；

⑨将步骤⑥获得的溶液吸取到步骤⑧的磁珠管中，充分振荡重悬磁珠，将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min；

⑩磁性分离，将上清液转移至新的离心管，用Buffer I洗涤磁珠两次；再加入1mlTE缓冲液洗涤磁珠两次，

尽量用吸头去除残留液体，将离心管置于室温放置5-10min以晾干磁珠。

加入至少30μl的TE缓冲液，涡旋或是用移液枪吹打10次充分重悬磁珠，95℃以上孵育10min。

12000rpm离心1分钟，转移上清液至新的离心管中，即获得了含有胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因目标基因片段DNA。

6、巢式PCR扩增目标基因片段。

①将提取分离的上述粪便胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因目标基因片段DNA作为横版，同时加入以下引物对进行多重PCR：

来进行第一轮扩增。

②将上述扩增的PCR产物纯化后稀释1000倍作为第二轮PCR的横版，同时加入以下引物对进行多重PCR：

来进行第二轮扩增。

其中，巢式PCR第一轮的反应体系(50μL)为：

引物组合(含CYP-F1、CYP-R1、23SRNA-F1、23SRNA-R1、

GYRA-F1、GYRA-R1UreH-F1、UreH-R1、RP-F1、RP-R1各10μM/μL) 1.0μL

Taq酶 1.0μL。

巢式PCR第一轮反应条件为：94℃3min，25循环(94℃ 30s，52℃30s，72℃ 90s)，72℃5min。

巢式PCR第二轮反应体系(50μL)为：

引物组合(含CYP-F2、CYP-R2、23SRNA-F2、23SRNA-R2、

GYRA-F2、GYRA-R2、UreH-F2、UreH-R2、RP-F2、RP-R2各10μM/μL) 1.0μL

Taq酶 1.0μL。

巢式PCR第二轮反应条件为：94℃ 3min，35循环(94℃ 30s，58℃30s，72℃ 90s)，72℃5min。

所获得的PCR产物可通过测序或者芯片检测获得该患者是否有Hp侵染(ureH基因检测)以及人CYP2C19、Hp 23rRNA、和gyrA基因型。

实施例2：试剂盒用于患者样本中幽门螺杆菌耐药相关基因片段基因型的检测

选取诊断为幽门螺杆菌阳性患者的粪便样本，利用本发明的试剂盒对幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因进行检测，同时利用国外某商品化粪便DNA提取试剂盒和国内某商品化粪便DNA提取试剂盒PCR进行基因组DNA提取。

具体的，本发明试剂盒依据实施例1的试剂盒的检测方法对患者粪便样本进行检测，以及利用基因芯片进一步检测相关基因的基因型；国外某商品化粪便DNA提取试剂盒及国内某商品化粪便DNA提取试剂盒分别依据试剂盒说明书进行相应的基因组DNA提取，并利用本申请的巢式PCR体系对提取的DNA模板进行扩增。

检测结果显示：本发明的试剂盒能够高效、特异性的富集患者粪便样本中的幽门螺旋杆菌的23SrRNA、gyrA基因片段和人CYP2C19基因片段(图1(A)的E3条带)，而两种商品化的粪便DNA提取试剂盒则不能有效地富集上述基因片段和或不能有效地去除粪便中的PCR抑制成分而导致PCR扩增产较低量(图1(A)的E1-E2条带)。

进一步地，通过基因芯片对扩增片段的基因型进行检测，结果表明，所述患者的CYP2C19基因型为CYP2C19＊2/＊2，患者携带的幽门螺杆菌的23S rRNA基因型为2143A→G、gyrA基因型为272A→G。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

序列表

<110> ***

<120> 从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒

<130> 2016

<141> 2019-01-21

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tcatcctggg ctgtgctc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

aaatacgcaa gcagtcac 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ccctcccgac tgtttacc 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

cagtcaaact acccaccaag 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

accggacgct agagatgg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

cactcgcctt agtcattctg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gggtttgcca gcagagac 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ccaaattcaa ataatgcgta 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

ggtgtttgca gatttgga 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

aacacctcgg cgggcatc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

atctgctcca ttattttc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

gttaacattt taccttctcc 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

cagcactttg ccaactcg 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

gctaacagaa acatcaaggg 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

ggcgtatttt gtatgcga 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

cactcgcctt agtcattctg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

aaacgctttt ttagactttg 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

tgcgtatagc catcaaac 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

tttggacctg cgagcggg 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 20

tctgggagac ctgaccga 18

Claims

1.一种从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括磁珠、捕获探针、巢式PCR引物对、PCR反应液；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23S rRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针，以及靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(Rnase P)基因组DNA的捕获探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的5′端标记有生物素；所述磁珠为链霉亲和素磁珠。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述巢式PCR引物对用于扩增幽门螺杆菌23S rRNA、gyrA、ureH基因片段和人CYP2C19、Rnase P基因片段。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针如下：

人CYP2C19基因组DNA序列设计的捕获探针A与B：

探针A序列为：

5′BIOTIN-TCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCC 3′；

探针B序列为：

5′BIOTIN-GAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC 3′；

Hp菌的23S rRNA基因组DNA序列设计的捕获探针C与D：

探针C序列为：

5′BIOTIN-CGCGATAAGGTGTGCCGCAGCAATG 3′；

探针D序列为：

5′BIOTIN-GATTTCCAACCGCAATGAGCCAACC 3′；

Hp菌的gyrA基因组DNA序列设计的捕获探针E与F：

探针E序列为：

5′BIOTIN-CCGTGCATAGGCGTATTTTGTATGC 3′；

探针F序列为：

5′BIOTIN-CTAAAAGGTTAGGCAGACGGCTTGG 3′；

Hp菌的ureH基因组DNA序列设计的捕获探针G与H：

探针G序列为：

5′BIOTIN-CACTGAAGACGGGTTTGCCAGCAGA 3′；

探针H序列为：

5′BIOTIN-TTTCTTCAATCCATTCTCGCACACC 3′；

人Rnase P基因组DNA序列设计的探针I与J：

探针I序列为：

5′BIOTIN-GACGGTCATGGGACTTCAGCATGGC 3′；

探针J序列为：

5′BIOTIN-AGTAGCTGAACCAGATAACAACCCC 3′。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述巢式PCR引物的核苷酸序列如SEQID NO：1-20所示。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进一步包括测序试剂或突变位点检测芯片。

7.一种基因组DNA富集方法，其特征在于，所述方法适用于从粪便样本中富集胃幽门螺杆菌基因组DNA及特定的人基因组DNA片段，所述方法步骤如下：(1)利用磁珠技术偶联捕获探针从粪便样品中提取并富集基因组DNA；(2)巢式PCR扩增富集目标基因；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23S rRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述捕获探针还进一步包括靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(Rnase P)基因组DNA的捕获探针。

9.权利要求4中所述的捕获探针组。

10.权利要求5中所述的巢式PCR引物组。