CN103525950B - 一种用于鉴别cva6和非cva6肠道病毒的rt-pcr引物对及其应用 - Google Patents

一种用于鉴别cva6和非cva6肠道病毒的rt-pcr引物对及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，包括：上游引物序列为：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；下游引物序列为：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；其中R为A或G，M为A或C。本发明还提供了一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物，包括权利要求1所述的RT-PCR引物对以及肠道病毒通用引物。应用本发明提供的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，能够实现一次性完成CVA6型与非CVA6型肠道病毒相关基因的扩增，显著提高CVA6型与非CVA6型手足口病的检测效率，敏感性好、特异性高。

Description

一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对及其应用
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，特别涉及一种用于单管二重一步法鉴别手足口病病原CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，还涉及该利用该引物的应用。
背景技术
手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生于3岁以下儿童，临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹。2012中国疾病控制中心公布全国共发生手足口病2198442例，死亡709人。引起手足口病的肠道病毒有多种，如柯萨奇病毒A组的16、4、6、10、12，柯萨奇病毒B组的2、3、5，埃可病毒的4、19、30，以及肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）等。在我国，根据以往的流行病学监视，EV71和CVA16是引起手足口病爆发的主要病原，在不同年份、不同地点循环反复出现，但2011年9-12月其他肠道病毒构成明显增加。Yang F等对中国不同地区手足口病进行研究，发现CVA6（柯萨奇病毒A6型）和其他肠道病毒感染有增加趋势。Lu QB等人发现肠道病毒CVA6和CVA10可能成为中国手足口病新的流行病原。2012年8-12月江西九江市爆发手足口病，本实验室在九江共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子标本和200份病人血清，通过RT-PCR检测咽拭子标本，测序证实CVA6感染512份。我国CVA6引起的手足口病正在逐年增多，病情复杂，而且在我国九江地区已出现爆发流行。由于其他地区的人群缺少CVA6的抗体，再加上不同地区的人员流动大，很可能会向其他地区扩散。CVA6已逐渐成为引起手足口病爆发的主要病原之一。
CVA6感染和其他肠道病毒感染在临床症状上差别较大，CVA6感染患者分布部位广，均出现手足口和臀部密集的大疱状皮疹，还可伴指甲脱落和指端皮肤表层脱皮，此外呼吸道症状、消化道症状、肝功能受损较EV71、CVA16型多，但是心血管和神经系统的损害较少、较轻。早期、快速、简便、准确地鉴别CVA6型和非CVA6型手足口病，对于积极的临床救治和疫情防控具有重要意义。
传统的病原学诊断采用细胞培养分离和鉴定病毒的手段，耗时且操作复杂，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊断技术，特别是PCR技术，由于其具有检测材料用量少、快速、灵敏度高、特异性好等特点，在病毒感染的诊断中发挥越来越重要的作用。RT-PCR技术已成为手足口病病原体快速诊断的重要手段，市场上已有EV71、CVA16和肠道病毒（EV）的商业化PCR试剂盒，但特异性诊断CVA6的PCR试剂盒尚未出现。此外，只检测一种病原的RT-PCR，很容易造成其它病原体的漏诊；若要同时检测多种病原，则每个检测都要单独进行，要使用多个PCR管，繁琐费时、试剂消耗大、操作步骤多、容易造成实验失败和PCR污染。如能建立一种特异性好、灵敏度高的单管二重一步法RT-PCR，鉴别CVA6型和非CVA6型手足口病，将具有广泛的应用前景。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物。
本发明的第二目的在于提供上述引物在单管二重一步法检测CVA6和非CVA6肠道病毒中的应用。
技术方案：本发明提供的一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，包括：
上游引物序列为：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；
下游引物序列为：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；
其中R为A或G，M为A或C。
本发明还提供了一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物，包括权利要求1所述的RT-PCR引物对以及肠道病毒通用引物。
其中，所述肠道病毒通用引物为：
引物F序列为：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’；
引物R序列为：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’；
其中，W为A或T。
本发明还提供了上述用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对在CVA6和非CVA6肠道病毒检测中的应用。
本发明还提供了一种包括权利要求1所述的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对的试剂盒。
有益效果：应用本发明提供的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，能够实现一次性完成CVA6型与非CVA6型肠道病毒相关基因的扩增，显著提高CVA6型与非CVA6型手足口病的检测效率，敏感性好、特异性高。
利用本发明提供的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物，可以对CVA6感染患者的临床标本扩增出CVA6VP1区域的685bp和肠道病毒5’UTR基因区域的306bp两条目的片段，而对非CVA6的其它肠道病毒感染患者的临床标本只能扩增出肠道病毒5’UTR基因区域的306bp一条目的片段，从而能够特异性的一次性鉴别出CVA6和非CVA6肠道病毒。
具体而言，本发明相对于现有技术具有以下突出的优势：
（1）本发明提供的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对完全是人工设计的简并碱基和序列，能够扩增出来自不同病人、不同标本中CVA6或/和EV，检测灵敏度高，特异性好；
（2）本发明提供的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物由两对引物对组成，反应同时在一个PCR管内进行，RNA逆转录和DNA扩增同在一个PCR管完成，快速简便，且工作量比一次性普通RT-PCR少，减少各种操作失误发生的可能，提高检测的成功率；可早期有效鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒引起的手足口病；
（3）利用该引物鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒所需耗材和试剂用量显著少于传统PCR扩增方法，成本低廉；同时仅需采用普通RT-PCR仪，无需昂贵设备，易于推广。
附图说明
图1不同引物和模板的一步法的RT-PCR的电泳图。其中，1-5为以CVA6-037为模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R一步法RT-PCR；6-10为以肠道病毒CVA16型为模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R一步法RT-PCR；11-15为以肠道病毒EV71型为模板依次采用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R一步法RT-PCR。
图2不同引物与肠道病毒通用引物（EV F+R）的组合两步法以及不同引物一步法的RT-PCR的电泳图。其中，1为引物(1108)F+(1124)R和EV F+R的组合；2为引物(1108)F+(1124)R；3为引物(1124)F+(1108)R和EV F+R；4为引物(1124)F+(1108)R；5为引物(1124)F+(1124)R和EV F+R；6为引物(1124)F+(1124)R。
图3为单管二重一步法RT-PCR引物的敏感性检验电泳图。其中，1-4分别为以(1108)F+(1124)R为引物，用浓度依次1、0.1、0.01、0.001TCID50/mL CVA6-037病毒液检测单管二重一步法RT-PCR引物的敏感性；5-8分别为以(1108)F+(1124)R和EV F+R为引物，用浓度依次1、0.1、0.01、0.001TCID50/mL CVA6-037病毒液检测单管二重一步法RT-PCR引物的敏感性。
图4考察引物(1108)F+(1124)R和EV F+R的不同配比的单管二重一步法电泳图。其中，1为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.125，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；2为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.25，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；3为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.5，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；4为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.125，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；5为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.25，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；6为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.5，CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL；7为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.125，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；8为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.25，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；9为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.5，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；10为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.125，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；11为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.25，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；12为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.5，CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL；
图5单管二重一步法不同退火时间的电泳图。其中，1为54℃；2为56℃；3为58℃；4为60℃。
图6为CVA6-037株7种不同浓度的病毒培养上清核酸单管二重一步法的敏感性，即100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001TCID50/mL。1-7依次为浓度为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001TCID50/mL的CVA6-037病毒培养上清。
图7为鉴别CVA6和非CVA6型肠道病毒单管二重一步法RT-PCR检测手足口病患者的临床咽拭子标本的扩增结果。其中，5、6、8、10、11为CVA6病毒感染；1、2、4为其他肠道病毒感染；3、7、9为阴性标本。
具体实施方式
以下实施有利于用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
病毒株来源：本发明涉及到的毒株EV71-1001、EV71-1002、CA16-1001、CVA6-037、CVA6-039、CA16-1004均来自南京市儿童医院感染科手足口病患儿和江西九江市第三人民医院急传科手足口病患儿临床标本中分离得到，并经间接免疫荧光检测、EV71和CVA16荧光定量检测核酸等方法鉴定。
咽拭子标本的准备方法如下：
采集发病一周内的患儿咽拭子标本，用专用采样棉签时，在咽后壁和两侧扁桃体部位适度拭抹后将棉签装入2mL病毒保存液中，充分震荡混匀后取100μL悬液，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒RNA。
病毒液标本的采集方法如下：
将EV71、CVA16和CVA6病毒液接种至单层人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞上，36℃、5%vt CO2培养，逐日观察细胞病变效应(CPE)，当CPE达80%以上后收获病毒，冻融三次后12000rpm离心后取140μL上清，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒RNA，其中EV71-1001、EV71-1002、CA16-1001、CVA6-037、CVA6-039、CA16-1004通过微量细胞培养法计算病毒滴度，使用DMEM培养基将病毒进行梯度稀释，得到不同体积的病毒液用于单对引物RT-PCR和单管二重一步法RT-PCR敏感性检测。
RT-PCR扩增产物的电泳鉴定方法如下：
取RT-PCR扩增产物5μL，加1μL溴酚蓝上样缓冲液，混匀，点样于20g/L琼脂糖凝胶（含0.5μL/mL溴化乙锭），以100bpDNA分子量Marker作为标准分子参照，在5V/cm的电场强度下于1倍的TAE电泳缓冲液电泳40min，凝胶成像系统紫外线下观察结果并拍照。
肠道病毒通用引物（UTR通用引物）为：
引物F：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’；SEQ ID No:3；
引物R：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’；SEQ ID No:4；
其中R为A或G，W为A或T。
实施例1引物的设计和筛选
为获得特异性CVA6引物，从Genbank下载了肠道病毒所有67个血清型的216个基因序列，用DNAMAN软件进行序列比对，依据所有CVA6病毒VP1基因保守序列设计出以下特异性引物：
引物(1108)F：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’ 22bp；SEQ ID No:1；
引物(1108)R：5’-GTGGTTATGCTTGCACGRTCGG-3’ 22bp；SEQ ID No:5；
引物(1124)F：5’-TGCRGGRYTGGTAGGAGTTGTG-3’ 22bp；SEQ ID No:6；
引物(1124)R：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’ 21bp；SEQ ID No:2；
引物(1030)F：5’-TTGGCCCATAGATGTGATGGGC-3’ 22bp；SEQ ID No:7；
引物(1030)R：5’-TGKCCAARYTTACCAYAWGTTC-3’ 22bp；SEQ ID No:8；
引物(1029)F：5’-TCAGTGATAGCACAACGCCCGG-3’ 22bp；SEQ ID No:9；
引物(1029)R：5’-RTTGRGCRGTRGTKGARGAMACC-3’ 23bp；SEQ ID No:10；
其中M为A或C，R为A或G，W为A或T，Y为C或T。
通过肠道病毒通用引物不同组合进行CVA6病毒一步法RT-PCR，通过CVA6特异性引物不同组合进行CVA6病毒RT-PCR，筛选出扩增效率高的引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R。
再用引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R、(1124)F+(1030)R、(1108)F+(1030)R分别以肠道病毒EV71和CVA16病毒的RNA为模板（见图1），筛选出对CVA6特异性好的(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R。
再用三对非常特异性引物(1108)F+(1124)R、(1124)F+(1108)R、(1124)F+(1124)R与肠道病毒通用引物（F+R）配对进行一步法RT-PCR，筛选出一对扩增效率高、特异性好的引物CVA6 (1108)F+(1124)R（见图2）。
再用浓度依次为1、0.1、0.01、0.001 TCID50/mL 的CVA6-JJ037检测CVA6(1108)F+(1124)R引物的RT-PCR的敏感性（见图3）。
实施例2单管二重一步法RT-PCR扩增条件的考察
本发明进行单管二重一步法RT-PCR扩增时，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒RNA，用One-Step RT-PCR Kit (QIAGEN)扩增，扩增体系如下：
1.两对引物对的体积比的考察
采用0.01、0.001TCID50/mL CVA6-037检测的核酸作为模板，引物稀释浓度均为10μmol/L，考察两对引物不同体积配比（见表1），确定两对引物的最佳体积（见图4）。
表1不同的引物体积配比
2.退火温度的考察
然后用1TCID50/mL CVA6-037检测，分别采用54℃、56℃、58℃和60℃退火温度，考察最适合两对引物扩增的退火温度（见图5），最后确定反应体系和扩增的退火温度为56℃，扩增出的目的片段特异性好，敏感度高。
综上所述，本发明单管二重一步法RT-PCR扩增最佳条件为：
（1）引物CVA6(1108)F+(1124)R和肠道病毒通用引物浓度均为10μmol/L，引物CVA6(1108)F+(1124)R的最佳体积为0.25μL，肠道病毒通用引物的最佳体积为0.5μL；
（2）扩增的反应条件为：50℃逆转录45min，95℃变性15min，进入循环：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共50个循环，末次循环后72℃延伸10min。
3.检测限考察
利用上述最佳条件，考察检测限。
用100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001TCID50/mL CVA6-037培养上清检测上述候选二重引物RT-PCR的敏感性，确定选用本发明的二重引物CVA6(1108)F+(1124)R（见图6）。
结果表明本发明方法对CVA6的最低检测限为0.0001TCID50/mL，对非CVA6的最低检测限为0.0001TCID50/mL；同时对所有的CVA6毒株均能扩增出306bp与685pb两条目的条带，而对非CVA6毒株均扩增出一条306bp目的条带。
实施例3临床应用
使用本发明的方法检测704份来源于手足口病患者的咽拭子标本，标本都采集自发病一周内的患儿咽拭子标本。
其中，582份咽拭子标本经九江市第三人民医院用实时荧光定量PCR检测EV71和CVA16，结果有70份标本CVA16阳性（12%），29份标本EV71阳性（5%）。
利用实施例2确定的RT-PCR单管二重一步法条件鉴别CVA6和非CVA6型肠道病毒（部分结果见图7），检测704份标本，CVA6阳性标本512份，非CVA6标本有192份。
从512份CVA6阳性PCR产物中随机选取92份对VP1基因测序，结果表明92份均为CVA6。
随机抽出25份非CVA6阳性标本通过测序，并获得结果为：9份CA16、8份EV71、3份CA10、2份Echo-6、2份Echo-9和1份CB4。
以上结果表明本发明方法的特异性达100%。
结合上述敏感性试验结果，本发明具有敏感性高、特异性好、操作简便、节省成本和时间，只需要普通的PCR仪就可以操作等明显优势。

Claims (2)

1.一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，其特征在于：
上游引物序列为：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；
下游引物序列为：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；
其中R为A或G，M为A或C。
2.一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物，其特征在于：包括权利要求1所述的RT-PCR引物对以及肠道病毒通用引物；所述肠道病毒通用引物为：
引物F序列为：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’；
引物R序列为：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’；
其中，W为A或T。
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