CN103305636B - 一种高灵敏度检测人肠道病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测与手足口病相关的人肠道病毒的方法。该方法通过一种检测试剂盒来实现，所述试剂盒中包含SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.75的多核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测与手足口病相关的人肠道病毒的方法。
背景技术
人肠道病毒(HEV)属于微小核糖核酸病毒科，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组和B组（CVA和CVB）、埃可病毒（E）、新型肠道病毒等，目前有100多个型。人肠道病毒可引起脊髓灰质炎、手足口病、疱疹性咽峡炎、急性出血性结膜炎等。
手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）是一种世界范围广泛流行的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。重症病例死亡率较高。我国于2008年将其纳入法定传染病进行管理。手足口病由肠道病毒引起，引发手足口病的肠道病毒主要包括柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型，柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型，埃可病毒1、4、7、19、25型等，其中以柯萨奇病毒A16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71）最为常见。肠道病毒71型感染往往伴随着严重的并发症，如无菌性脑膜炎，脑炎，急性弛缓性麻痹，甚至导致死亡。而柯萨奇病毒A16型引起的手足口病的症状往往较轻。同时，肠道病毒的多重感染也是其临床症状较重的一个因素。因此及时检测并鉴定引起手足口病的病原体，对临床治疗及患者预后的判断有极为重要的价值。
人肠道病毒的检测方法目前多采用特定类型的抗血清的中和试验或反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法。现有方法的局限性主要有几个方面：缺乏全面的同时检测多种人肠道病毒的方法；反转录聚合酶链反应方法依赖于测序且特异性不好；灵敏度较低易发生假阴性等。
发明内容
本发明提供了一种高灵敏度高通量可同时检测21种人肠道病毒基因型的方法。
本发明检测的21种人肠道病毒包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。检测部位为编码病毒衣壳蛋白的晚期编码区VP1区和HEV各基因型最保守的5’端非编码区序列5’UTR，设计HEV基因型特异引物和通用引物。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
1、引物设计：涵盖2013年2月之前公开发表的21种人肠道病毒，包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。根据待测人肠道病毒全序列，获取VP1基因区，选择每种病毒的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种人肠道病毒的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种人肠道病毒扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
2、PCR反应:在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：使未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
4、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，
5、树脂脱盐：纯化延伸反应产物。
6、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人肠道病毒类型，软件自动处理报告每种病毒的检测结果和可信程度。
本发明的检测方法，优选的包括以下步骤：
(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区中的保守序列设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；
（2）第一次PCR扩增反应，将dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
（3）用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；
（4）第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da；
（5）采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；
（6）纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人肠道病毒的类型。
其中所述步骤（1）引物设计中每一种待测人肠道病毒，采用一种衣壳蛋白晚期转录区VP1基因区。引物序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.46，探针序列为SEQ ID NO.51至SEQID NO.73。
所述步骤（1）中，采用肠道病毒5’UTR区和RNA酶P基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.47至SEQ ID NO.50，探针序列为SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75。
优选的在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水。
本发明的方法，检测浓度低至1拷贝/ul。
表1
| 序列编号 | 引物序列 | 人肠道病毒 |
| SEQ ID NO.1 | ACGTTGGATGGGGAGCAAGTTCTAATGCTA | CVA2正向引物 |
| SEQ ID NO.2 | ACGTTGGATGCATTGACCCCGTTTCGMTTC | CVA2反向引物 |
| SEQ ID NO.3 | ACGTTGGATGTGGAGATTGCGGAGGTATTC | CVA4正向引物 |
| SEQ ID NO.4 | ACGTTGGATGACCAACAAGCCCATTTCCAC | CVA4反向引物 |
| SEQ ID NO.5 | ACGTTGGATGAGCTGACCTTTGWGATCACG | CVA5正向引物 |
| SEQ ID NO.6 | ACGTTGGATGGATTTGATGRGTGAGCACTG | CVA5反向引物 |
| SEQ ID NO.7 | ACGTTGGATGGGTTAGCATCATWACDATGCC | CVA6正向引物 |
| SEQ ID NO.8 | ACGTTGGATGGCTGAGCATATCCCATCAAG | CVA6反向引物 |
| SEQ ID NO.9 | ACGTTGGATGTCTCTMTCTTGAGGWTTGGG | CVA8正向引物 |
| SEQ ID NO.10 | ACGTTGGATGCGAGTTCACATTTGTGTCC | CVA8反向引物 |
| SEQ ID NO.11 | ACGTTGGATGCCATGCAGACTAGACATGTG | CVA9正向引物 |
| SEQ ID NO.12 | ACGTTGGATGGAAAACACACGCTGATCTGG | CVA9反向引物 |
| SEQ ID NO.13 | ACGTTGGATGAGATTTGGACCTGCGAGCGG | CVA10正向引物 |
| SEQ ID NO.14 | ACGTTGGATGTGAGCGGCTGTCTCCACAAG | CVA10反向引物 |
| SEQ ID NO.15 | ACGTTGGATGTACGGACATGGTGRGAAGAG | CVA12正向引物 |
| SEQ ID NO.16 | ACGTTGGATGTGCTCCYCAGTTWGGATTAG | CVA12反向引物 |
| SEQ ID NO.17 | ACGTTGGATGACGCGCAAATGCGTAGAAAG | CVA16A亚型正向引物 |
| SEQ ID NO.18 | ACGTTGGATGGGGTGTGCACGCRACRAAAG | CVA16A亚型反向引物 |
| SEQ ID NO.19 | ACGTTGGATAGTCTACCATCTCGAACCCAG | CVA16B亚型正向引物1 |
| SEQ ID NO.20 | ACGTTGGATGTGCCAACTGTAATCATCGAC | CVA16B亚型反向引物1 |
| SEQ ID NO.21 | ACGTTGGATGAGTGAGTGAGACTAGTGTGG | CVA16B亚型正向引物2 |
| SEQ ID NO.22 | ACGTTGGATGTTGTTMGTAGCTGTWGCATC | CVA16B亚型正向引物2 |
| SEQ ID NO.23 | ACGTTGGATGGGCATGTTGTCAASCAMCAC | CVB3正向引物 |
| SEQ ID NO.24 | ACGTTGGATGTCTTTTGTGCCATACAMGTC | CVB3反向引物 |
| SEQ ID NO.25 | ACGTTGGATGTACAGGGTTSACCAAWTGGG | CVB4正向引物 |
| SEQ ID NO.26 | ACGTTGGATGGTGAACTCTGCWTTSAARCG | CVB4反向引物 |
| SEQ ID NO.27 | ACGTTGGATGGACTAGATGTGTGTTGAACC | CVB5正向引物 |
| SEQ ID NO.28 | ACGTTGGATGCGGCACGGCTAAAGAAATTC | CVB5反向引物 |
| SEQ ID NO.29 | ACGTTGGATGTGAARCGBTATGCRGARTGG | EV71A亚型正向引物 |
| SEQ ID NO.30 | ACGTTGGATGGCTCCATGTCACARCGAATG | EV71A亚型反向引物 |
| SEQ ID NO.31 | ACGTTGGATGAACCCAAGYATCTTSTGGAC | EV71B亚型正向引物 |
| SEQ ID NO.32 | ACGTTGGATGCCATCCGTCSTAGAAATTAC | EV71B亚型反向引物 |
| SEQ ID NO.33 | ACGTTGGATGGATTGAGACTCGGTGTGTTC | EV71C亚型正向引物1 |
| SEQ ID NO.34 | ACGTTGGAGTTATCTCCCCAACTAAGCCTG | EV71C亚型反向引物1 |
| SEQ ID NO.35 | ACGTTGGATGAGTAGAGCAGGTTTSGTAGG | EV71C亚型正向引物2 |
| SEQ ID NO.36 | ACGTTGGATGGCATYTGYGCSTAMCCAGTT | EV71C亚型反向引物2 |
| SEQ ID NO.37 | ACGTTGGATGGGCACAACWAACCCRAATG | E1正向引物 |
| SEQ ID NO.38 | ACGTTGGATGTCTACGCATKTGCGCSTAAC | E1反向引物 |
| SEQ ID NO.39 | ACGTTGGATGTCACCTACATGCGGTTTGAC | E4正向引物 |
| SEQ ID NO.40 | ACGTTGGATGTGTCTTGGGCAATGCTAGTC | E4反向引物 |
| SEQ ID NO.41 | ACGTTGGATGCACTTCTAATGCCACAGATG | E7正向引物 |
| SEQ ID NO.42 | ACGTTGGATGGGTTTCCAACACTCCATTTC | E7反向引物 |
| SEQ ID NO.43 | ACGTTGGATGTGTATTCGCATGGTRTCAGG | E19正向引物 |
| SEQ ID NO.44 | ACGTTGGATGAGGCACGCACMTGCTTCAAT | E19反向引物 |
| SEQ ID NO.45 | ACGTTGGATGGGGTTCTCAAACTGGGATAT | E25正向引物 |
| SEQ ID NO.46 | ACGTTGGATGGTGAATGCCTCAAGCTTACG | E25反向引物 |
| SEQ ID NO.47 | ACGTTGGATGGGAGGARTAYAARACCACAG | EV_5UTR正向引物 |
| SEQ ID NO.48 | ACGTTGGATGAGCTTYCTRCGCATYTGCAC | EV_5UTR反向引物 |
| SEQ ID NO.49 | ACGTTGGATGCCGAGTCAACCATAGAGAAC | RNA酶P正向引物 |
| SEQ ID NO.50 | ACGTTGGATGATACCCATTCAGCATACCGC | RNA酶P反向引物 |
表2.
| 序列编号 | 病毒型别 | 碱基延伸探针序列 | 延伸碱基 |
| SEQ ID NO.51 | CVA2 | GTGAGAACCTCATTGAGAC | T |
| SEQ ID NO.52 | CVA4 | CGACAGTATACCAACAACAC | G |
| SEQ ID NO.53 | CVA5 | AGTGAATCCTGGCCTTGTAT | A |
| SEQ ID NO.54 | CVA6 | AGATGGTTATGTTAATTGGG | A |
| SEQ ID NO.55 | CVA8 | ATACATGTACTGCAACATCAC | G |
| SEQ ID NO.55 | CVA9 | TCGGCAATTGTAGATTCTGACC | T |
| SEQ ID NO.57 | CVA10 | CCGCGCAGAGCCTT | G |
| SEQ ID NO.58 | CVA12 | AGCCGCATTCAGGG | C |
| SEQ ID NO.59 | CVA16A | ACCTACATGCGCTTTG | A |
| SEQ ID NO.60 | CVA16B1 | GTTTGGTGCGTCAAAAC | A |
| SEQ ID NO.61 | CVA16B2 | CGTGGAATACTTCTTCTCT | C |
| SEQ ID NO.62 | CVB3 | CAGATATAGAGAATTTTCTGAG | C |
| SEQ ID NO.63 | CVB4 | ATGTTCGAGCAGGAAATTGGAG | A |
| SEQ ID NO.64 | CVB5 | CCCAATGGCTGTCTC | G |
| SEQ ID NO.65 | EV71A | TCCAATGTAGGTGAACATT | T |
| SEQ ID NO.66 | EV71B | CATACCACACCTAGGATGTC | C |
| SEQ ID NO.67 | EV71C_1 | GGACTATCAAGGGTGGTTTC | T |
| SEQ ID NO.68 | EV71C_2 | TATTGCGTAACCAGTTATGTC | T |
| SEQ ID NO.69 | E1 | GCGCGTAACCTGTTAT | T |
| SEQ ID NO.70 | E4 | CAGCACATTTGTCATCAC | C |
| SEQ ID NO.71 | E7 | TCCATTTCTGTTAACCACA | G |
| SEQ ID NO.72 | E19 | CACGGTCACATCCTTAC | G |
| SEQ ID NO.73 | E25 | TGTGACATTATGGCGTT | T |
| SEQ ID NO.74 | EV_5UTR | TCCAAGACCACAGATAATGATAC | C |
| SEQ ID NO.75 | RnaseP | GGAATTCCTATGTAGGTCAGCA | T |
表1，表2中列出的合成的多核苷酸，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。
与现有检测人肠道病毒的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了PCR-质谱联用检测病毒基因型的优势，对大于10重以上PCR反应产物，作一次性质谱检测，不需要荧光染料标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行，使试剂耗材成本与检测PCR重数成反比，从而实现以多种基因型探针，两孔反应同时检测21种人肠道病毒的目标。首轮PCR扩增区域为60-120bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环,最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成的假阴性问题。同时采用UNG酶技术和基因型特异性片段扩增设计技术，彻底排除了PCR产物污染和同源序列探针错配引起的假阳性问题。为人肠道病毒致病机理研究提供了可靠的实验方法。
根据本发明的检测方法，本发明人还设计了一种检测试剂盒，以期用于临床样品的检测，本发明的试剂盒，可以包括一种或多种如表1，表2的合成的多核苷酸试剂。
优选的，本发明试剂盒包括以下试剂：
合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为21种人肠道病毒（HEV）的正向和反向引物序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.48；
碱基延伸探针序列SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.73；
质控引物序列为SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50，探针序列SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75。
根据需要，本发明的试剂盒中还可以包括有利于实验室操作的试剂如：溶剂，缓冲溶剂，辅助材料等。
本发明的试剂盒，可以包括以上组分制备而成的试剂，试剂的配制方法均为常规技术，只需要将各种原材料在常温下混合均匀即可，无需特殊设备和条件。
本发明的试剂盒，可以将不同试剂分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作。
附图说明
图1a、人肠道病毒碱基延伸探针质谱峰图
图1b、人肠道病毒碱基延伸探针质谱峰图
具体实施方式
本发明包括同时检测21种已知人肠道病毒中的一种或多种，每种基因型采用VP1基因区作检测。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施方式提供的高灵敏度检测和/或鉴定人类肠道病毒的方法，待检测21种人肠道病毒包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。。包括如下步骤:
（1）根据待测人肠道病毒全序列，获取VP1基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种人肠道病毒基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区，设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少30Da。各种人肠道病毒V探针引物序列见表2。
（2）通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
PCR反应体系配制见表3.
表3
| 试剂 | 最终浓度 | 体积(1×) |
| Water,HPLC grade | N/A | 0.3μL |
| 10X Buffer w/20mM MgCl2 | 2mM MgCl2 | 0.5μL |
| 25mM MgCl2 | 2mM | 0.4μL |
| 25mM dUTP/dNTP Mix | 500mM | 0.1μL |
| UNG Enzyme（1U/ul） | 0.5U | 0.5μL |
| 0.5mM Primer mix | 0.1mM | 1.0μL |
| 5U/ml PCR enzymea | 1Unit | 0.2μL |
| Template DNA(5-20ng/μL) | 2.0μL | |
| Total | 5.0μL |
先用37°C-50°C2分钟，进行dUTP的消化，然后94°C4分钟灭活，（同时这一步也达到预变性的效果），随后作PCR扩增。反应条件为95°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分钟，共45个循环；最终72°C延伸5分钟，完成后恒温于4°C。
（3）通过虾碱性磷酸酶（SAP）处理，使未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表4。
表4
| 试剂 | 体积/反应 |
| Water,HPLC grade | 1.53μL |
| 10×SAP buffer | 0.17μL |
| SAP enzyme(1.7U/ml) | 0.3μL |
| Total | 2.0μL |
反应条件为37°C孵育40分钟，去除剩余dNTPs；然后用85°C5分钟使SAP酶失活。
（4）通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表5。
表5
| 试剂 | 体积/反应 |
| Water,HPLC grade | 0.619μL |
| 10×iPLEXbuffer plus | 0.2μL |
| iPLEX terminator mix | 0.2μL |
| Primer mix* | 0.94μL |
| iPLEX enzyme | 0.041μL |
| Total | 2.0μL |
*延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为8-15M，最终浓度约为0.84-1.57M。
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94°C变性30秒，随后在94°C5秒，52°C退火5秒，80°C延伸5秒，共40个循环中，每个插入退火和延伸5个小循环；最终72°C延伸3分钟。
（5）采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
（6）将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人肠道病毒类别。图1中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检出型别拷贝数大于10，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用TYPE4.0软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一种人肠道病毒和内参HBB的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子量峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，有相应人肠道病毒感染，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样品，在必要时可作重复性验证试验。
Claims (1)
1.一种可同时检测多种人肠道病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.75所述的多核苷酸，
其中，SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.46为人肠道病毒的正向和反向引物序列；SEQ ID NO.51- SEQ ID NO.73为碱基延伸探针序列；SEQ ID NO.47 - SEQ ID NO.50为质控引物序列；SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75为探针序列，
其中，所述人肠道病毒包括：柯萨奇病毒A组2、4、5、6、8、9、10、12、16A亚型、16B亚型，柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71A亚型、肠道病毒71B亚型、肠道病毒71C亚型,埃可病毒1、4、7、19、25型。
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