CN110592287A

CN110592287A - 柯萨奇b组病毒实时荧光定量pcr标准品

Info

Publication number: CN110592287A
Application number: CN201911010550.0A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞珍; 虞勇; 虞莹; 王兴冈; 邹云增; 葛均波
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明公开了一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将SEQ ID NO:1连接在T载体上得到的重组质粒。该重组质粒具有较高的稳定性和重复性，作为标准品绘制的RT PCR标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系，通过实时荧光定量PCR方法可以对生物样品中柯萨奇B组病毒载量进行绝对值定量，为心肌炎的诊疗工作提供参考。

Description

柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说，涉及一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品、其制备方法及其应用。

背景技术

国内自1993年起运用RT PCR方法检测人外周血中肠道病毒核酸(李延文，杨英珍，韩琴琴，等。上海医科大学学报，1993,20(6):472)，并将其用于临床常规检测中，为临床诊疗工作提供了有力的支持。但是，常规RT PCR检测方法只能进行定性检测，即针对肠道病毒基因组序列5’端非编码保守区设计引物，通过样本RNA提取、逆转录、PCR扩增、凝胶电泳等步骤对样本进行检测，但该方法的缺点是，无法动态连续反映样本中病毒拷贝数量，对于患者体内病毒载量变化及抗病毒药物疗效评估均无法作出精准评判；其次，以往PCR扩增引物针对肠道病毒基因组序列5’端非编码保守区设计，检测的阳性范围涵盖肠道病毒，包括柯萨奇A组病毒、柯萨奇B组病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒等，目前普遍认为柯萨奇B组病毒3型(CVB3)是致心肌炎的最主要病毒(杨英珍，金佩英，郭棋，等。中华传染病杂志，1989,7(1):4-7。Hingorani AD.Post infections myocarditis.BMJ,1992,304:1676-1678。RemesJ,Helin M,Vaino P,et al.Clinical outcome and left ventricular function 23years after acute coxsackie virus myopericarditis.Eur Heart J,1990,11:182-188)。因此，原先临床检测人外周血中肠道病毒核酸的RT PCR方法对临床诊疗工作的帮助存在局限性。

近几年来，采用实时荧光定量PCR对病毒进行检测的技术快速发展，但是其在柯萨奇B组病毒3型(CVB3)的定量检测方面存在一个掣肘的缺陷，就是目前市场上缺少一种能够通过廉价方法大量获得、质量稳定、准确反映病毒CVB3存在及数量的标准对照样品。

发明内容

为了促进实时荧光定量PCR检测柯萨奇B组病毒技术的推广应用，以低生产成本大量提供稳定性高、可重复性好的CVB3标准品或称CVB3检测参照品，发明人对于柯萨奇B组病毒的结构和组成进行了研究，发现其全长基因组中某些区域具有高度保守性(即稳定性)和特征代表性(或称特异性)，这一发现构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括以下技术方案。

一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将与SEQ ID NO:1有90％以上、优选95％以上、更优选98％、更优选99％以上同源性的基因片段克隆连接在T载体质粒上所构建得到的重组质粒。其中，SEQ ID NO:1的碱基序列为：

CGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACTCCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCATGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCCAGTAACACCATAGAGGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGACCAGGCCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG(SEQ ID NO:1)。

上述基因片段优选是SEQ ID NO:1。

优选地，上述T载体可以是pTA2载体质粒。

本发明的第二个方面提供了一种制备上述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的方法，其包括如下步骤：

1)用柯萨奇B3病毒CVB3感染动物细胞，培养CVB3病毒株；

2)提取细胞总RNA，例如待细胞病变达到70％时，提取细胞总RNA，并通过逆转录合成cDNA；

3)针对柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列，设计合成特异性引物；

4)以步骤2)中得到的cDNA为模板，用步骤3)中得到的特异性引物进行PCR扩增，克隆得到CVB3 VP1保守区序列基因片段；

5)将步骤4)中得到的CVB3 VP1保守区序列基因片段连接到T载体上，构建得到CVB3 VP1重组质粒；

6)将步骤5)中得到的CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌感受态细胞中，并对转化子进行培养增殖；

7)从培养后的重组大肠杆菌细胞中提取质粒，对重组质粒进行酶切、测序验证正确，得到作为柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的目标CVB3 VP1重组质粒。

在确定了SEQ ID NO:1作为CVB3 VP1保守区序列基因片段特征的特异性和稳定性后，可以省去筛选CVB3 VP1保守区序列基因片段、以及测序验证的步骤。即，作为一种简单的大量制备上述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的方法，其包括如下步骤：

5-1)将SEQ ID NO:1连接到T载体例如pTA2载体质粒上，构建得到CVB3 VP1重组质粒；并且/或者

6-1)将步骤5-1)中得到的CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌感受态细胞中，并对转化子进行培养增殖；

7-1)从培养后的重组大肠杆菌细胞中提取质粒，得到作为柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的CVB3 VP1重组质粒。

在一种实施方式中，上述“测序验证正确”是指重组质粒cDNA序列和GenBank中提供的CVB3 VP1保守区基因序列比如GenBank ID:U57056.1第64-377位比对有99％以上的同源性、且与引物设计的起始位点及终止位点一致。

上述动物细胞优选是Vero细胞。

其中，步骤3)中所述特异性引物包括正向引物SEQ ID NO:2，和反向引物SEQ IDNO:3，即

CVB3-VP1-qF：5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’(SEQ ID NO:2)；

CVB3-VP1-qR：5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)。

上述步骤5)中可以通过热激法、电转导或者化学转导法将CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌中。

优选地，上述大肠杆菌是DH5α。

本发明的第三个方面提供了上述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品在建立柯萨奇B组病毒载量(病毒拷贝数)标准曲线中的应用。

上述标准曲线可以用作生物样品中柯萨奇B组病毒载量(病毒拷贝数)的对比曲线。

上述生物样品可以是人/动物外周血及组织样品。

本发明的第四个方面提供了一种用于实时荧光定量PCR检测柯萨奇B组病毒的试剂盒，其特征在于，包括上述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品。

优选地，上述试剂盒还可以包括正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:3。

在优选的实施方式中，上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如电脑光盘、U盘等。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒的使用说明书中还包括用于建立标准曲线、用于与标准曲线进行比对以便计算确定单位体积样品中柯萨奇B组病毒载量(病毒拷贝数)的计算机程序及安装使用说明。

本发明构建的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品能够大量生产，用以建立的RT PCR标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.32，R²＝0.99)；熔解曲线分析提示，83℃的PCR产物是CVB3 VP1基因序列特异性产物，该标准品具有柯萨奇B组病毒特异性；该标准品具有较大的检测范围(6.6×10¹～6.6×10¹⁰拷贝/μL)，每个稀释梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；3次独立实验的变异系数CV<1.5％，提示CVB3 VP1重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。实验证明，以本发明构建的CVB3 VP1重组质粒为标准品建立的实时荧光定量PCR方法可以对生物样品中柯萨奇B组病毒载量进行绝对值定量，能够动态连续反映样本中病毒拷贝数量，对于患者体内病毒载量变化及抗病毒药物疗效评估作出精准评判，为临床相关疾病比如心肌炎的诊疗工作提供帮助。

附图说明

图1显示了PCR扩增得到的CVB3 VP1基因片段的琼脂糖凝胶电泳照片。其中，M表示marker(100bp～5000bp)。

图2显示了CVB3 VP1重组质粒的酶切产物凝胶电泳。其中，泳道M为marker，由1号泳道可见插入的314bp的目的基因片段和约3Kbp的载体片段。

图3显示了重组质粒cDNA序列和GenBank中提供的CVB3 VP1保守区基因序列(GenBank:U57056.1的第64-377位)的BLAST比对结果。

图4显示了本发明构建的CVB3 VP1重组质粒图谱。

图5是本发明构建的CVB3 VP1重组质粒经10^-3～10^-10梯度稀释后进行荧光定量PCR扩增建立的标准曲线。

图6显示了按照标准曲线测定的荧光定量PCR不同循环数的扩增曲线。

图7显示了不同引物浓度的扩增产物熔解曲线。

具体实施方式

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

众所周知，逆转录聚合酶链反应(RT PCR)具有灵敏、特异、快速等巨大优势，在病原微生物检测方面已经得到广泛应用。如果RT PCR能够用于人/动物外周血及组织样品中柯萨奇B组病毒含量的定量检测，可以为对于相关疾病比如心肌炎的诊疗提供极大地便利。

本发明构建柯萨奇B组病毒标准品的方法主要包括：针对柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列设计合成特异性引物，PCR扩增得到的产物是CVB3 VP1基因序列特异性产物，其具有柯萨奇B组病毒特异性从而可以用作柯萨奇B组病毒标准品。

采用本发明构建的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品建立标准曲线后，能够使得柯萨奇B组病毒的RT PCR检测实现定量化，从而使得该方法成为实时荧光定量PCR。柯萨奇B组病毒定量化的原理是，根据CVB3 VP1和T载体的分子量可以计算得到CVB3VP1重组质粒的分子量及摩尔数，根据阿伏伽德罗常数可以计算得到重组质粒所含的(病毒)颗粒数，以重组质粒为标准品建立标准曲线进行荧光PCR扩增，即可计算得到不同稀释度时CT值相对应的病毒拷贝值。

用于实时荧光定量PCR时，该CVB3 VP1重组质粒具有较大的检测范围(6.6×10¹～6.6×10¹⁰拷贝/μL)，每个稀释梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；以该重组质粒为标准曲线进行3次独立实验的变异系数CV<1.5％，提示CVB3 VP1重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。因此，以CVB3 VP1重组质粒为标准品建立的实时荧光定量PCR方法可以对样本中柯萨奇B组病毒载量进行绝对值定量，能够动态连续反映样本中病毒拷贝数量，对于患者体内病毒载量变化及抗病毒药物疗效评估作出精准评判。

在本发明中，术语“柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品”、“PCR标准品”和“标准品”表示相同的意义，可以互换使用，是指在通过实时荧光定量PCR方法检测人/动物外周血及组织样品中柯萨奇B组病毒载量(病毒拷贝数)时用于建立标准曲线的标准品，尤其是指CVB3 VP1重组质粒或称CVB3重组质粒。

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

实验材料

Hela细胞株和Vero细胞株(购自美国菌种保藏中心ATCC)；柯萨奇B3病毒Nancy株(复旦大学附属中山医院心病毒室)；DMEM低糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(GIBCO公司)，2×PCR Master(ThermoFisher公司)，RT Reagent Kit逆转录试剂盒、SYBR Green RealtimePCR Master Mix(购自日本TaKaRa公司)；pTA2载体、T4DNA连接试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、EcoRI酶切试剂盒、DH5α感受态大肠杆菌(购自上海碧云天生物技术有限公司)。

实验仪器

伯乐CFX Connect实时荧光定量PCR仪，伯乐ChemiDoc凝胶成像系统，伯乐电泳系统，奥林巴斯相差倒置显微镜，Thermo细胞培养箱，Thermo台式低温高速离心机。

实施例1柯萨奇B3病毒复制与毒力滴定

参照文献(杨英珍，《病毒性心脏病》，上海科学技术出版社，2001,305-315)描述的实验方法，采用Vero细胞株进行柯萨奇B3病毒(Nancy株)复制，并且使用Hela细胞以微量法滴定CVB3毒株组织半数致死量(TCID₅₀)。

实施例2病毒RNA提取和cDNA逆转录

2.1待实施例1中接种了柯萨奇B3病毒(CVB3)的Vero细胞病变达到70％时，即Vero细胞的感染率达到70％时，采用Trizol法提取细胞总RNA，溶解于25μl的DEPC水中，测定总RNA吸光度并计算浓度。

2.2按照逆转录试剂盒操作说明书要求，对实施例2.1中提取得到的细胞总RNA进行逆转录，合成cDNA。

RT试剂盒为TaKaRa RT Reagent Kit，RT反应体系为：

①5×PrimeScript Buffer 2μl，

②primeScript RT Enzyme MixI 0.5μl，

③Oligo dT Primer 0.5μl，

④Random 6mers 0.5μl，

⑤RNA 500ng，

⑥R Nase Free dH₂O至总体积10μl。

RT反应条件：25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min；终止反应。

反应完成后，置于-80℃冰箱保存备用。

实施例3柯萨奇B组病毒特异性引物设计

针对柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列设计合成特异性引物，从GenBank网站下载柯萨奇B3病毒Nancy株VP1基因相关序列，录入数据库，比较同源性，选定序列一致的GenBank ID:U57056.1。

对于该基因片段，采用Primer Primier5.0软件进行引物设计，CVB3引物序列为：

CVB3-VP1-qF：5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’(SEQ ID NO:2)；

CVB3-VP1-qR：5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)。

实施例4 CVB3病毒VP1基因片段克隆和纯化

采用常规PCR反应试剂盒，以实施例2中逆转录得到的cDNA为模板，用实施例2中设计的引物对进行PCR扩增。PCR扩增产物加入r-Taq酶，在基因片段两端加上碱基A用于载体连接。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：0.5×TBE，100V 20min。采用凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化，操作过程按试剂盒说明书进行。

PCR反应体系如下：

TakaRa Taq(5U/μl)0.25μl，

10PCR buffer(含Mg2+)5.0μl，

dNTP Mixture(2.5mM)4.0μl，

上游引物(10μm/μl)1.0μl，

下游引物(10μm/μl)1.0μl，

模板DNA 2.0μl，

灭菌双蒸水加至50μl。

PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃，保持。

电泳照片见图1，证实了扩增产物为目的基因片段。

实施例5 T载体克隆

采用T4DNA连接试剂盒，将实施例4中回收纯化的目的基因片段与pTA2载体质粒连接，插入的目的基因片段控制在0.1～0.3pmol，按表1方法建立连接反应，具体操作按试剂盒说明书进行。

按以下公式计算连接反应中需要的PCR产物量：

[加入载体量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体摩尔比＝插入片段量(ng)

表1、T载体连接反应体系

反应	标准反应	阳性对照	背景对照
				2×快速连接缓冲液	5μl	5μl	5μl
pGEM-T Easy载体(50ng)	1μl	1μl	1μl
				PCR产物	1μl	-	-
插入DNA对照	-	2μl	-
				T4连接酶(3Weiss单位/μl)	1μl	1μl	1μl
灭菌水	2μl	1μl	3μl

将连接产物置于恒温培养箱中，16℃连接12小时。采用热激法将连接产物导入DH5α感受态细菌中(氨苄抗性)，37℃摇床200转/分钟转速振摇1小时。将菌液涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养箱内培养12小时。以上连接和感受态细菌转化操作均按照相关试剂盒说明书要求操作。

实施例6重组质粒提取及阳性克隆的酶切鉴定

6.1在实施例5中培养的LB平板上挑取菌落，37℃扩大培养12小时。取4ml菌液，用质粒提取试剂盒提取质粒(小量抽提，操作按试剂盒说明书进行)，溶解于40μl的ddH₂O中，然后测定质粒吸光度并计算浓度。

6.2鉴于所用pTA2载体是通过在其序列的第60位采用EcoR V酶切线性化，并在两个3’末端添加碱基T形成。在插入片段的上游52位和下游70位有EcoR I酶切位点，依据这两个酶切位点用酶切试剂盒对重组质粒进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，参见图2，由1号泳道可见插入的314bp的目的基因片段和约3Kbp的载体片段。

6.3将显示酶切结果为阳性的重组质粒样品进行测序(上海吉满生物科技有限公司)，其序列为：

其中第1-20位碱基与正向引物SEQ ID NO:2相同，末尾18bp的第297-314位碱基序列为GGCTGCGTTGGCGGCCTG(SEQ ID NO:4)与反向引物SEQ ID NO:3互补。

将测序结果与BLAST比对，参见图3。NCBI的Blast结果显示，在314个碱基中有313个碱基是相同的，表明重组质粒cDNA序列和GenBank中提供的CVB3 VP1保守区基因序列GenBank ID:U57056.1第64-377位比对有99％以上的同源性、且与引物设计的起始位点(SEQ ID NO:1中第1位)及终止位点(SEQ ID NO:1中第314位)一致。

由于SEQ ID NO:1具有CVB3 VP1保守区序列基因的特征性，因此该CVB3 VP1重组质粒可以作为柯萨奇B组病毒标准品使用，例如可以用于PCR方法。

本发明构建得到的CVB3 VP1重组质粒图谱见图4。图4中pTA2载体空载长度为2981bp，目的片段长度为314bp，总质粒长度为3295bp。

实施例7实时荧光定量PCR引物浓度优化

7.1按照表2进行引物浓度的优化。

表2、实时荧光定量PCR引物浓度

不同引物浓度的反应体系如表3所示，其中PCR模板为100倍稀释的柯萨奇B组病毒标准品CVB3 VP1重组质粒，即浓度为6.6×10⁹拷贝/μl的重组质粒。

表3、不同引物浓度的反应体系

每个引物浓度设置4个重复。反应条件如下：

第一阶段：UNG酶起作用步骤，95.0℃，15s，50.0℃，2min；

第二阶段：激活Taq酶步骤，95.0℃，10min；

第三阶段：定量PCR循环步骤，95.0℃，15s，60.0℃，1min；

第四阶段：绘制融解曲线步骤，95.0℃，15s，60.0℃，15s。

7.2质粒拷贝数的计算定量

按下述公式计算质粒拷贝数：拷贝数＝(质量÷分子量)×6.0×10²³，质粒质量为10μg，计算值为(10000×6.022×10²³)/(3297×1×10⁹×660)＝2.77×10¹²个。

10μg质粒的总拷贝数为2.77×10¹²个，若质粒浓度为239μg/ml，即每毫升中含239μg质粒，则每毫升中柯萨奇B组病毒拷贝数计算值为2.77×10¹²×239＝6.62×10¹⁴个。

因此，该CVB3 VP1重组质粒可以作为柯萨奇B组病毒标准品用于定量PCR检测。

实施例8 CVB3重组质粒标准品的荧光定量PCR检测

8.1将CVB3 VP1重组质粒标准品进行10倍系列梯度稀释：稀释度为10^-1～10^-6，对应的拷贝数浓度(拷贝数/μl)为6.62×10¹⁰～6.62×10⁵。

8.2配制荧光定量PCR体系，整个过程注意避光。

PCR Master Mix(μl)10.0μl，

上游引物(10μM/μl)0.6μl，

下游引物(10μM/μl)0.6μl，

模板(μl)1.0μl，

灭菌水(μl)7.8μl，

总体积(μl)20.0μl。

8.3将配好的体系加入PCR孔板中，封膜，上机，设定程序，运行程序。

表4、荧光定量PCR反应条件

8.4将标准品进行10^-3～10^-10更低稀释度的稀释后，进行荧光定量PCR扩增，方法同上，重复4次实验，用标准品对应的Ct值与拷贝数制作标准曲线，结果如图5所示。标准曲线方程为：Y＝-3.3266027x+36.847107，r2＝0.99，扩增效率为100.834％。

该实验表明，用CVB3 VP1重组质粒建立的RT PCR标准曲线，可以用于建立CVB3核酸绝对值定量RT PCR检测法，构建的重组质粒作为标准品制备标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.32，R ²＝0.99)。

而且，该标准品具有较大的检测范围(6.6×10¹～6.6×10¹⁰拷贝/μL)，每个稀释梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度。

实施例9 CVB3重组质粒标准品的稳定性和重复性测试

9.1将CVB3 VP1重组质粒以10^-3～10^-10梯度稀释度，按照标准曲线上的数值来测定荧光定量PCR方法的扩增效率，方法同上，得到图6所示的不同稀释度质粒的扩增曲线，表明该重组质粒具有较高的扩增效率。

9.2采用不同的引物(正向SEQ ID NO:2和反向SEQ ID NO:3)浓度(表3)，按上述方法进行荧光定量PCR，绘制熔解曲线，结果如图7所示。由图7可以看出，不同引物浓度的熔解曲线非常接近，熔解曲线峰型唯一无杂峰，Tm为83℃左右，表明引物浓度对熔解曲线影响不大，CVB3重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。熔解曲线分析提示，83℃的PCR产物是CVB3 VP1基因序列特异性产物，该标准品具有柯萨奇B组病毒特异性。

9.3按照表5进行重组质粒标准品稳定性和重复性实验。

表5、重组质粒标准品的稳定性和重复性

拷贝浓度			C<sub>t</sub>值
						拷贝/μl	1	2	3	平均值±标准差	C<sub>V</sub>/％
6.62×10<sup>6</sup>	15.89	15.53	15.81	15.74±0.19	1.20
						6.62×10<sup>5</sup>	12.87	13.15	12.91	12.98±0.15	1.16
6.62×10<sup>4</sup>	9.63	9.58	9.42	9.54±0.11	1.15
						6.62×10<sup>3</sup>	6.10	6.24	6.14	6.16±0.07	1.17

由表5的实验结果可以看出，3次重复实验得到的CV均小于1.5％，提示3次独立实验的变异系数C_V<1.5％。，提示CVB3 VP1重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。

以上实验结果表明，以CVB3 VP1重组质粒为标准品建立的实时荧光定量PCR方法可以对生物样本中柯萨奇B组病毒载量进行绝对值定量，能够动态连续反映样本中病毒拷贝数量。当用于医院临床时，对于患者体内病毒载量变化及抗病毒药物疗效评估能够作出精准评判，为临床相关疾病的诊疗工作提供帮助。

虽然以上实验对本发明的技术方案进行了验证，但是本领域的技术人员显而易见可以理解，在不违背本发明的思想下，在此基础上对本发明做出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品

<130> SHPI1910563

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cggtaccttt gtgcgcctgt tttataaccc ctcccccaac tgtaacttag aagtaacaca 60

ctccgatcaa cagtcagcgt ggcacaccag ccatgttttg atcaagcact tctgttaccc 120

cggactgagt atcaatagac tgctcacgcg gttgaaggag aaagcgttcg ttatccggcc 180

aactacttcg aaaaacccag taacaccata gaggttgcag agtgtttcgc tcagcactac 240

cccagtgtag accaggccga tgagtcaccg cattccccac gggcgaccgt ggcggtggct 300

gcgttggcgg cctg 314

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cggtaccttt gtgcgcctgt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

caggccgcca acgcagcc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggctgcgttg gcggcctg 18

Claims

1.一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将与SEQ ID NO:1有90％以上同源性的基因片段克隆在T载体质粒上所构建得到的重组质粒。

2.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述基因片段是SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述T载体是pTA2载体。

4.一种制备如权利要求1所述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的方法，其包括如下步骤：

1)用柯萨奇B3病毒CVB3感染动物细胞，培养CVB3病毒株；

2)提取细胞总RNA，并通过逆转录合成cDNA；

5)将步骤4)中得到的CVB3 VP1保守区序列基因片段连接到T载体上，构建得到CVB3VP1重组质粒；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是Vero细胞。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述特异性引物包括正向引物SEQID NO:2，和反向引物SEQ ID NO:3，

5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’(SEQ ID NO:2)；

5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤5)中通过热激法、电转导或者化学转导法将CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌中。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是DH5α。

9.如权利要求1至3中任一项所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品在建立柯萨奇B组病毒载量标准曲线中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述标准曲线用作人/动物外周血及组织样品中柯萨奇B组病毒载量的对比曲线。